CN106591209A - 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 - Google Patents

重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106591209A
CN106591209A CN201611248603.9A CN201611248603A CN106591209A CN 106591209 A CN106591209 A CN 106591209A CN 201611248603 A CN201611248603 A CN 201611248603A CN 106591209 A CN106591209 A CN 106591209A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
threonine
recombinant bacterial
pntab
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611248603.9A
Other languages
English (en)
Inventor
程江红
张捧
康培
刁刘洋
毛贤军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Original Assignee
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd filed Critical Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority to CN201611248603.9A priority Critical patent/CN106591209A/zh
Publication of CN106591209A publication Critical patent/CN106591209A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/01—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.6.1)
    • C12Y106/01001—NAD(P)+ transhydrogenase (B-specific) (1.6.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L‑苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。本发明重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％，无质粒负担，构建方法简便。

Description

重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸(Thr)是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素-单酰胺菌素的原料。
目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。2016年梅花集团申请的中国专利201610119758.6中，通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。本发明提供的重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组菌株，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。
作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。
在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。
在本发明提供的一实施例中，重组菌株的保藏编号为CGMCC No.13402。
本发明还提供了一种重组菌株的构建方法，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。
作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。
在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。
作为优选，改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。
本发明还提供了一种生产L-苏氨酸的方法，采用本发明的重组菌株或本发明构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。
作为优选，生产L-苏氨酸的方法为：将重组菌株进行活化，接种到种子培养基进行种子培养，然后接种到发酵培养基进行发酵培养。
作为优选，种子培养基包括：
作为优选，发酵培养基包括：
作为优选，活化的温度为37℃，时间为18～24h。
作为优选，种子培养的温度为37℃，转速为90rpm，时间为4.5～5.5h，OD650控制在2。
作为优选，发酵培养的温度为37℃。
本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。本发明至少具有如下有益效果之一：
1、本发明将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子，敲除iclR基因，得到重组菌株，经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％。
2、本发明得到的重组菌株无质粒负担，构建方法简便。
3、本发明构建得到的重组菌株在发酵培养过程中无副产物乙酸形成。
生物保藏说明
分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13402。
具体实施方式
本发明公开了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢途径，本发明以野生型W3110为出发菌株，在其基因组上进行相关改造，对苏氨酸末端代谢途径中关键基因进行修饰，如：解除天冬氨酸激酶的反馈抑制，强化thrA*BC增强了L-苏氨酸末端合成途径、敲除tdh阻断了L-苏氨酸降解产物甘氨酸的形成，获得的基因工程菌株命名为MHZ-0213-3，其可有效积累苏氨酸，且无需添加氨基酸及无质粒负担。
本发明在MHZ-0213-3菌株的基础上进行相关改造工作。
很多工业上有用的化合物的生物合成都需要辅因子NADPH，如大肠杆菌(E.coli)生物合成番茄红素(Alper,H.等,(2005)Metab.Eng.7,155-164)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)高产赖氨酸(Ikeda.J Ind Microbiol Biotechnol.2006,33:610-615)。苏氨酸在大肠杆菌中的代谢积累同样需要足够的还原力供应。
已知pntAB编码的吡啶核苷酸转氢酶利用电化学质子梯度作为驱动力，通过将NADH氧化为NAD+而把NADP+还原为NADPH，可以理解为通过强化pntAB可以提高胞内的NADPH水平。
乙醛酸途径中iclR基因，其编码转录调节蛋白IclR可负调节编码异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶的aceBA基因的表达。
大肠杆菌W3110突变菌株的构建工作，利用了Jiang Y等报道的文献中CRISPR-Cas9方法(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)进行大肠杆菌基因组上的遗传操作。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。
以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为W3110，属于埃希氏菌属(Escherichia)。实施例中使用引物序列见下表。
表1引物序列
名称 SEQ ID No. 序列
gRNApntABup-f1 1 aatactagtgaagggaatatcatgcgaatgttttagagctagaaatagc
gRNApntABdn-r1 2 cgccccggcacgaatcactattcaaaaaaagcaccgactcgg
pntABup-f1 3 tagtgattcgtgccggggcg
Ptac-pntABup-r1 4 tgattaattgtcaacagctcgatattcccttccatcggtttta
Ptac-pntABdn-f1 5 gagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaa
Ptac-pntABdn-f2 6 attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcgatgcgaattggcataccaagag
pntABdn-r1 7 aactgcagtcgccatcgagcttagtgcg
pntAB-up 8 tatcacattccttaagccaa
pntAB-dn 9 cccatactttgaacttgttc
gRNAiclRup-f1 10 aatactagtccattagattgcgcaggatagttttagagctagaaatagc
gRNAiclRdn-r1 11 tttaaacatcaaaccacttaattatttcaaaaaaagcaccgactcgg
iclRup-f1 12 ataattaagtggtttgatgttt
iclRup-r1 13 gactgtcatggtcgcacccgcagcgtgtattttcgatgag
iclRdn-f1 14 ctcatcgaaaatacacgctgcgggtgcgaccatgacagtc
iclRdn-r1 15 aactgcagtcgataactctggatcatgg
iclR-up 16 aatttaatatgattacaact
iclR-dn 17 cgatcacttccggtttactg
本发明中涉及的基因名称解释如下：
thrA：天冬氨酸激酶及Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶；
thrB：高丝氨酸激酶；
thrC：苏氨酸合成酶；
tdh：L-苏氨酸脱氢酶；
pntAB：吡啶核苷酸转氢酶；
iclR：异柠檬酸裂解酶/苹果酸合酶负调节因子；
SgRNA(single guide RNA简称)：是CRISPR基因敲除敲入***中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由两部分组成—tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切；
Trc(Ptac)启动子：是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：制备强化pntAB基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)
(1)构建pTargetT-Ptac-pntAB质粒
引物对gRNApntABup-f1/gRNApntABdn-r1以pTargetT质粒为模板扩增出pntAB的sgRNA片段，引物对pntABup-f1/Ptac-pntABup-r1以W3110基因组为模板扩增出Ptac-pntAB左半段，引物对Ptac-pntABdn-f1/pntABdn-r1以W3110基因组为模板扩增出Ptac-pntAB右半段1，引物对Ptac-pntABdn-f2/pntABdn-r1以Ptac-pntAB右半段1为模板扩增出Ptac-pntAB右半段2，对3个片段进行OE-PCR扩增得到gRNA-Ptac-pntAB片段(全长0.9kb)，以speI/PstI进行酶切，***到质粒pTargetT的相同酶切位点中，获得pTargetT-Ptac-pntAB质粒。
(2)感受态细胞制备及电转pTargetT-Ptac-pntAB质粒
将pCas质粒转化入MHZ-0213-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)，挑取MHZ-0213-3(pCas)单菌落于5ml含卡那霉素和终浓度为10mM***糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
将pTargetT-Ptac-pntAB质粒电转入MHZ-0213-3(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
(3)重组验证：利用pntAB-up/pntAB-dn引物进行菌落PCR验证(阳性片段约0.9kb)，验证正确后进一步测序验证。
(4)构建相关质粒丢失：挑取测序验证正确的单菌落接种于5ml含卡那霉素及终浓度为0.5mMIPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养后挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetT-Ptac-pntAB质粒已丢失。挑取pTargetT-Ptac-pntAB质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上；若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)菌株。
实施例2：制备敲除iclR基因的菌株MHZ-0213-3(ΔiclR)
(1)构建pTargetT-iclR质粒
引物对gRNA-iclRup-f1/gRNA-iclRdn-r1以pTargetT质粒为模板扩增出iclR的sgRNA片段；引物对iclRup-f1/iclRup-r1以W3110基因组为模板扩增出iclR敲除左半段；引物对iclRdn-f1/iclRdn-r1以W3110基因组为模板扩增出iclR敲除右半段；对三个片段OE-PCR扩增得到gRNA-iclR敲除片段(全长1.0kb)，以speI/PstI进行酶切，***到质粒pTargetT的相同酶切位点中，获得pTargetT-iclR质粒。
(2)感受态细胞制备及电转pTargetT-iclR质粒
将pCas质粒转化入MHZ-0213-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)，挑取MHZ-0213-3(pCas)单菌落于5ml含卡那霉素和终浓度为10mM***糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
将pTargetT-iclR质粒电转入MHZ-0213-3(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
(3)重组验证：利用iclR-up/iclR-dn引物进行菌落PCR验证(阳性片段约1.0kb)，验证正确后进一步测序验证。
(4)构建相关质粒丢失：pTargetT-iclR、pCas质粒丢失方法同实施例1，得到MHZ-0213-3(ΔiclR)菌株。
实施例3：制备敲除iclR基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，ΔiclR)
将实施例1中获得的MHZ-0213-4(pCas)菌株制备成电转感受态细胞，然后用电转化方法将实施例2获得的质粒pTargetT-iclR转入感受态细胞(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，鉴定方法同实施例2，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，ΔiclR)菌株。
实施例1-3所获得的产苏氨酸基因改造菌株如下表2所示。
表2本发明构建的基因工程菌
实施例4：产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证
从冻存管中取菌株MHZ-0213-3、MHZ-0213-4、MHZ-0214-1、MHZ-0214-2，共4株，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表2)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，OD650控制在2；将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表3)的摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵终了测样品OD650，并用HPLC的方法测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定耗糖情况，产酸及转化率结果见表4。
表3种子培养基(g/L)
成分 浓度
葡萄糖 25
玉米浆 25
豆粕水解液 7.7
酵母膏 2.5
KH2PO4 1.4
七水硫酸镁 0.5
FeSO4、MnSO4 20mg/L
pH 7.0
表4发酵培养基(g/L)
成分 浓度
甘油 30
玉米浆 6
豆粕水解液 7.7
七水硫酸镁 0.5
KH2PO4 1.0
天冬氨酸 10
FeSO4、MnSO4 30mg/L
生物素 50μg
硫胺素 500μg
pH 7.2
表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较
由表5可知，出发菌MHZ-0213-3转化率为8.8％，而强化pntAB的改造菌MHZ-0213-4转化率9.5％，提高了0.7个百分点；敲除出发菌的iclR基因后转化率提高至12.2％，提高了2.7个百分点；对于强化pntAB同时敲除iclR的改造菌株MHZ-0214-2产苏氨酸15.3g/L、转化率18.5％，转化率提高了9.5个百分点，具有极显著效果；说明增强还原力供应的同时增强乙醛酸途径具有协同增强苏氨酸转化率提升的作用。本发明所述新型大肠杆菌，无质粒负担，构建方法简便且L-苏氨酸产量高于对照菌株，表明其可以应用于L-苏氨酸发酵及后续研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法
<130> MP1623788
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatactagtg aagggaatat catgcgaatg ttttagagct agaaatagc 49
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgccccggca cgaatcacta ttcaaaaaaa gcaccgactc gg 42
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagtgattcg tgccggggcg 20
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgattaattg tcaacagctc gatattccct tccatcggtt tta 43
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaa 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagcgatg cgaattggca taccaagag 59
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aactgcagtc gccatcgagc ttagtgcg 28
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatcacattc cttaagccaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccatacttt gaacttgttc 20
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aatactagtc cattagattg cgcaggatag ttttagagct agaaatagc 49
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tttaaacatc aaaccactta attatttcaa aaaaagcacc gactcgg 47
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ataattaagt ggtttgatgt tt 22
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gactgtcatg gtcgcacccg cagcgtgtat tttcgatgag 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctcatcgaaa atacacgctg cgggtgcgac catgacagtc 40
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aactgcagtc gataactctg gatcatgg 28
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatttaatat gattacaact 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgatcacttc cggtttactg 20

Claims (10)

1.一种重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的保藏编号为CGMCC No.13402。
5.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。
7.一种生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，采用如权利要求1至4中任一项所述的重组菌株或如权利要求5或6所述构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生产L-苏氨酸的方法为：将重组菌株进行活化，接种到种子培养基进行种子培养，然后接种到发酵培养基进行发酵培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：
所述发酵培养基包括：
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述活化的温度为37℃，时间为18～24h；
所述种子培养的温度为37℃，转速为90rpm，时间为4.5～5.5h，OD650控制在2；
所述发酵培养的温度为37℃。
CN201611248603.9A 2016-12-29 2016-12-29 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 Pending CN106591209A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611248603.9A CN106591209A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611248603.9A CN106591209A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106591209A true CN106591209A (zh) 2017-04-26

Family

ID=58603932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611248603.9A Pending CN106591209A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106591209A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
CN113174356A (zh) * 2021-05-08 2021-07-27 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种生产苏氨酸的重组细菌及其应用
CN114015632A (zh) * 2020-12-01 2022-02-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114317389A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 南京工业大学 一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产l-苏氨酸的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273054A (zh) * 2005-09-27 2008-09-24 味之素株式会社 产生l-氨基酸的细菌和用于产生l-氨基酸的方法
US20090239268A1 (en) * 2006-10-10 2009-09-24 Satoshi Okutani method for producing an l-amino acid
CN102906272A (zh) * 2010-10-20 2013-01-30 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法
CN105543156A (zh) * 2016-03-02 2016-05-04 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273054A (zh) * 2005-09-27 2008-09-24 味之素株式会社 产生l-氨基酸的细菌和用于产生l-氨基酸的方法
US20090239268A1 (en) * 2006-10-10 2009-09-24 Satoshi Okutani method for producing an l-amino acid
CN102906272A (zh) * 2010-10-20 2013-01-30 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法
CN105543156A (zh) * 2016-03-02 2016-05-04 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴梧桐: "《现代生化药学》", 31 January 2002, 中国医药科技出版社 *
周茜等: "增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成 L-苏氨酸的影响", 《现代食品科技》 *
陈胜杰等: "敲除 iclR 基因对大肠杆菌发酵 L–色氨酸的影响", 《天津科技大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
CN114015632A (zh) * 2020-12-01 2022-02-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN113174356A (zh) * 2021-05-08 2021-07-27 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种生产苏氨酸的重组细菌及其应用
CN114317389A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 南京工业大学 一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产l-苏氨酸的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110607268B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法
CN100529057C (zh) 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法
CN100379851C (zh) 生成l-苏氨酸的微生物、生产其的方法、及使用其生产l-苏氨酸的方法
CN110468092B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
WO2019085445A1 (zh) 生产l-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及l-赖氨酸的生产方法
CN111433366B (zh) 具有增加的甘氨酸生产能力的微生物和利用其生产发酵组合物的方法
CN102191247B (zh) 增强的启动子以及使用该启动子产生l-赖氨酸的方法
CN105543156A (zh) 重组菌株及其制备方法、用途
CN110241061B (zh) 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
CN106591209A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法
CN102453691A (zh) 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌
CN103224964A (zh) 同时生产l-氨基酸及核黄素的微生物及使用其生产l-氨基酸及核黄素的方法
CN110184230A (zh) 一株高产l-组氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109536428A (zh) 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104878034A (zh) L-赖氨酸基因工程生产菌
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN114015632A (zh) 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN106635945A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法
CN106701648A (zh) 一株高产l‑异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN109666617B (zh) 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN109456987A (zh) 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用
CN113846132A (zh) 苏氨酸生产菌种的构建及生产苏氨酸的方法
US20210324391A1 (en) Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10
CN111607608A (zh) 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用
CN110387344A (zh) 生产l-亮氨酸的重组菌、其构建方法及l-亮氨酸的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170426

RJ01 Rejection of invention patent application after publication