BRPI0614809A2 - sensibilização de cánceres de pulmão resistentes a fármaco a inibidores de proteìna cinase - Google Patents

Abstract

SENSIBILIZAçãO DE CáNCERES DE PULMãO RESISTENTES A FáRMACO A INIBIDORES DE PROTEìNA CINASE A presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer de pulmão de célula não pequena com inibidor de FLT-3 cinase tal como PKC412. A invenção também refere-se a uma combinação farmacêutica de um inibidor de FLT-3 cinase e um ativador de permeabilização da membrana exterior mitocondrial, tal como um ativador de BAK. Ela também refere-se ao uso de uma combinação farmacêutica de um ativador de permeabilização da membrana exterior mitocondrial e um inibidor de FLT-3 cinase para o tratamento de câncer de pulmão de célula não pequena e o uso de tal composição farmacêutica para a fabricação de um medicamento para o tratamento do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SENSIBILI-ZAÇÃO DE CÂNCERES DE PULMÃO RESISTENTES A FÁRMACO A I-NIBIDORES DE PROTEÍNA CINASE".

Introdução

O entendimento molecular de vias de transdução de sinal celularregulando sobrevivência, estabilidade genética, atividade metabólica e proli-feração aumentou enormemente durante as últimas décadas. Da mesmamaneira, análises cuidadosas conduzidas em modelos de câncer pré-clínicos e em amostras de tumor conduziram à identificação de específicasdesregulações destes caminhos como fatores contribuintes ou mesmo cau-sadores durante transformação maligna e progressão de câncer (1). Contraeste fundamento, existem esforços para desenvolvimento de terapias quesejam talhadas para específicos alvos separando células de câncer de suascontrapartes não-malignas. A aplicação clínica bem-sucedida do pequenofármaco inibidor de cinase imatinib em Ieucemias positivas BCR-ABL e emtumores estromais gastrointestinais proporcionou impressionantemente pro-va-de-princípio para tal conceito (2). Entretanto, inibidores farmacológicos devias de transdução de sinal aparentemente menos essenciais exibiram so-mente menor atividade clínica em populações de pacientes não-selecio-nados. Ainda, combinação de fármacos citotóxicos com inibidores não-anticorpos até aqui falharam na produção de resultados clínicos aperfeiçoa-dos em câncer de pulmão ou câncer colorretal (3-6).

Baseado nestas observações concluiu-se que morte de célula decâncer induzida por inibidores farmacológicos de cinase é realmente execu-tada através vias moleculares distintos daqueles desencadeados por fárma-cos anticâncer citotóxicas padrão. Alternativamente, ambas as vias podemconvergir em uma etapa comum em transdução de sinal, que então podeconstituir um alvo estratégico para quebra de resistência a fármaco.

Tratamentos citotóxicos para pacientes com câncer de pulmãode célula não pequena (NSCLC) avançado têm somente atividade clínicamoderada. Recentemente, inibidores de receptor de sinalizador de fator decrescimento epidérmico mostraram eficácia em um subgrupo de pacientesNSCLC, e a modulação de vias adicionais de sinalizadores é uma significan-te promessa. Existe uma necessidade de produtos terapêuticos de câncerque alvejem vias moleculares não alvejadas correntemente por fármacosanticâncer existentes.

Sumário da Invenção

Estudou-se a indução de apoptose pelos inibidores específicosde proteína cinase C (PKC) estaurosporina e PKC412 em células de NS-CLC. Interessantemente, verificou-se que linhagens de células resistentes afármacos anticâncer citotóxicos também foram protegidas contra inibidoresespecíficos de PCK. Combinação de inibidores PCK com agentes citotóxicosproduziu resultados variáveis, como citotoxicidade aumentada ou diminuída.Em contraste, alvejamento da via mitocondrial de apoptose através de ex-pressão condicional de inibidores específicos de PKC para NSCLC resisten-te a fármaco sensibilizado confiavelmente com BAK. Em conclusão, alveja-mento terapêutico da família de proteína BCL-2 em combinação com uminibidor específico de PKC tal como PKC412 é uma promissora estratégiapara aperfeiçoar a eficácia de inibidores de cinase no tratamento de câncer.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A-1B são representações gráficas mostrando pa-drões similares de resistência de linhagens de células de NSCLC com fár-macos anticâncer citotóxicos e inibidores específicos de PKC in vitro.

As Figuras 2A-2E são representações gráficas mostrando quecombinação de fármacos anticâncer citotóxicos com inibidores específicosde PKC falhar em resultar em previsível citotoxicidade sinergística in vitro.

As Figuras 3A-3D são representações gráficas e pictóricas mos-trando que linhagens de células de NSCLC resistentes a inibidores específi-cos de PKC exibem liberação retardada de citocromo mitocondrial c, man-têm Δψηι, e falham na ativação de caspases.

As Figuras 4A-4D são representações pictóricas e gráficas mos-trando que expressão condicional de BAK sensibiliza linhagens de células deNSCLC resistentes a fármaco para apoptose.

As Figuras 5A-5D são representações gráficas mostrando quealvejamento de BAK mitocondrial sensibiliza linhagens de células de NSCLCresistentes a fármaco para apoptose induzida por PKC412.Descrição Detalhada

O entendimento molecular de vias de transdução de sinal celularregulando sobrevivência, estabilidade genética, atividade metabólica e proli-feração aumentou vastamente durante as décadas passadas. Da mesmamaneira, análises cuidadosas conduzidas em modelos de câncer pré-clínicos e em amostras de tumor conduziram à identificação de específicasdesregulações destas vias como eventos contribuintes ou mesmo causado-res durante transformação maligna e progressão de câncer (1). Contra estefundo, são feitos esforços para desenvolvimento de terapias que sejam ta-lhadas para alvos específicos separando células de câncer de suas contra-partes não-malignas.

O oncogene BCL2 (OMIM 151430) funciona como um potentesupressor de apoptose sob diversas condições. Verificou-se que a proteínaAssassina-1 Antagonista de Bcl-2 ("BAK1" OMIM 600516), um homólogo deBcl-2 antagoniza Bcl-2, promove a morte da célula e contrabalança a prote-ção de apoptose provida por Bcl-2. Superexpressão de BAK induz rápida eextensiva apoptose de fibroblastos privados de soro, sugerindo que BAKestá diretamente envolvida na ativação do maquinário da morte celular. BAKprimariamente aperfeiçoa morte apoptótica de célula seguindo um apropria-do estímulo. Por isso, moduladores de BAK são úteis em modulação de viasde transdução de sinal apoptótico. A aplicação clínica bem-sucedida do ini-bidor de cinase, o pequeno fármaco imatibe em Ieucemias positivas BCR-ABL e em tumores estromais gastrointestinais proporcionou impressionan-temente prova-de-princípio para tal conceito (2).

Entretanto, inibidores farmacológicos de vias de transdução desinal aparentemente menos essenciais exibiram somente menor atividadeclínica em populações pacientes não selecionadas. Ainda, a combinação defármacos citotóxicos com inibidores não-anticorpos até aqui falhou para pro-dução de aperfeiçoados resultados clínicos em pacientes de câncer de pul-mão ou câncer colorretal (3-6). Com base nessas informações, formulou-sea hipótese que a morte de célula de câncer induzida por inibidores de cinasefarmacológicos é executada através de vias moleculares distintas daquelasdisparadas por fármacos anticâncer citotóxicos padrão. Alternativamente,ambas as vias podem convergir em uma etapa comum em transdução desinal, que então pode constituir um alvo estratégico para quebrar resistênciaa fármaco.

Para isto comparou-se a sensibilidade de um painel de linhagensde células de NSCLC bem-caracterizadas para morte de célula induzida pe-los inibidores específicos de PKC estaurosporina (STS)1 seu derivado apli-cado clinicamente N-benzoil estaurosporina (PKC412, Novartis Pharma), efármacos anticâncer citotóxicos comuns. O modelo de inibição de PKC foiselecionado baseado no papel de PKC como um mediador central de umavariedade de vias de transdução de sinal que é considerada como sendocrítica para crescimento e sobrevivência de tumor (7,8). A despeito desteespectro terapêutico potencialmente amplo, verificou-se que inibidores espe-cíficos de PKC falharam na indução de apoptose em células de NSCLC quetambém foram resistentes a fármacos anticâncer citotóxicos padrão. Disse-ção molecular revelou que defeitos funcionais no nível das proteínas de fa-mília BCL-2 contribuíram criticamente para resistência a apoptose naquelesNSCLC. Alvejamento terapêutico da etapa mitocondrial em transdução desinal apoptótico foi capaz de driblar resistência-cruzada contra inibidores dePKC e fármacos citotóxicos.

Durante a oncogênese e progressão de tumor, células de cânceradquirem uma pletora de defeitos funcionais em vias supressoras de tumor.

Isto é freqüentemente obtido através de inativação mutacional ou perda deexpressão de genes supressivos de tumor, ou através de amplificação gené-tica e desregulação genética de fatores que promovem a sobrevivência ouproliferação. Além disso, foi mostrado que mecanismos epigenéticos contri-buem para os aberrantes padrão de expressão observados em fenótiposmalignos (1). Apoptose é uma das principais vias supressoras de tumor a sersuperada na estrada para transformação cancerosa. Da mesma maneira,inibição de apoptose foi mostrada promover desenvolvimento de tumor emvários modelos pré-clínicos de câncer (20-22), e defeitos em transdução desinal apoptótico são freqüentemente encontrados em cânceres humanos(23,24). Além de promover o desenvolvimento de câncer, defeitos de apop-tose também parecem conferir resistência a terapias citotóxicas comuns(24,25), que ainda são o suporte de tratamento de câncer em oncologia clínica.

Recentemente, novas terapias foram introduzidas na medicinade câncer que têm por alvo especificamente células de tumor via mecanis-mos imunomediados ou via interferência com vias de transdução de sinaldesregulados. Exemplos bem-sucedidos de terapias de câncer imunomedia-das são a transferência de linfócitos T durante ou seguinte a transplante decélula-tronco hematopoiética para leucemia, a administração de anticorposmonoclonais como trastuzumab ou rituximab para pacientes com câncer damama ou Iinfoma de célula B, ou o uso de interferon-alfa em pacientes commelanoma maligno e alto risco de reincidência. Inibidores de transdução desinal que provaram ser clinicamente eficazes incluem imatinib em pacientescom leucemia mielóide crônica e tumores estromais gastrointestinais, beva-cizumab e cetuximab em pacientes com câncer colorretal, erlotinib em paci-entes com câncer de pulmão recorrido, ou sorafinib em pacientes com cân-cer de célula renal metastático. Estes exemplos promoveram a identificaçãode uma ampla faixa de novos compostos e estratégias de tratamento, algu-mas das quais já entraram em desenvolvimento clínico.

Permanece uma questão aberta no campo se estas novas mo-dalidades de fato podem curar cânceres resistentes a terapias citotóxicasconvencionais. Em um modelo de transplante de célula-tronco hematopoiéti-ca alogenéica, recentemente demonstrou-se que inibidores genéticos detransdução de sinal apoptótico pode conferir resistência de célula de câncera linfócitos T citotóxicos, específicos de antígeno in vitro e in vivo (26). Istodemonstra formalmente que fatores de resistência, que protegem células decâncer contra terapias citotóxicas padrão, também podem conduzir a fuga desupressão de tumor imunomediada.

No presente estudo, estendeu-se o conceito de "resistência-cruzada" para inibidores farmacológicos de transdução de sinal. Como mo-delo, usamos NSCLC e inibidores de PKC.

NSCLC é uma malignidade altamente prevalente e líder em mor-tes relacionadas a câncer no mundo ocidental. A maior parte de NSCLC édiagnosticada em estágios avançados da doença, e assim requerem terapiade fármaco e radiação. Atuais terapias padrão para NSCLC não ressecávelobtêm regressões de tumor clinicamente significantes somente em uma me-nor fração de pacientes. A sobrevivência mediana de pacientes com NSCLCavançado tratados em grandes experimentos clínicos varia de 10 a 12 me-ses. Devido a essa alta necessidade médica, novas terapias incluindo inibi-dores de vias de transdução de sinal são muito estudadas em NSCLC. Atéagora, muitos esforços focalizaram os inibidores de sinalização via os recep-tores de fator de crescimento de epiderme (EFGR). Compostos como gefiti-nib e erlotinib foram mostrados resultarem em algum aperfeiçoamento clíni-co, e mesmo produziram uma curta prolongação de sobrevivência medianade pacientes com NSCLC reincidente (27,28). Entretanto, quando estudadosem grandes coortes de pacientes como terapia de primeira linha em combi-nação com regimes de fármaco citotóxico padrão, nenhum destes compos-tos conduziu a um benefício clínico (3-5). Foi verificado que somente pacien-tes com certas mutações ativadoras do EGFR têm uma alta probabilidade deresposta para tratamento com gefinitib (29,30). Infelizmente, a vasta maioriade pacientes de NSCLC falha em exibir tais mutações, o que possui o pro-blema de ampla aplicabilidade clínica de inibidores de cinase altamente es-pecíficos em NSCLC.

Ao contrário, a família de enzimas PKC está envolvida em váriosvias de transdução de sinal que podem contribuir para desenvolvimento decâncer. Estes incluem sinalização mitogênica via o receptor de fator de cres-cimento derivado de plaqueta (PDGF)1 regulação de pontos de verificaçãode ciclo de célula nas fases G1 e G2, e sinalização via os receptores de fatorde crescimento endotelial vascular (VEGF) sobre células endoteliais e célu-Ias de câncer (7). Da mesma maneira, inibidores específicos de PKC, comoSTS ou PKC412 induziram impedimento de ciclo de célula ou apoptose emlinhagens de células de câncer, e exibiram efeitos antitumorais e antiangio-gênicos em um modelo de xenoenxerto murino de câncer de pulmão (8, 31,32). Administração oral de PKC412 mostrou ser segura e exeqüível em umestudo fase I conduzido em pacientes com cânceres avançados (33). Alémdisso, a segurança de combinação de PKC412 com um regime citotóxicopadrão de CDDP/gemcitabine foi estabelecido em um estudo de fase I empacientes com NSCLC avançado (34).

Contra este fundo, verificamos que inibidores específicos dePKC, como STS e PKC412, foram mais eficazes naquelas linhagens de cé-lulas de NSCLC que exibiram uma boa resposta aos fármacos anticâncercitotóxicos padrão. Em contraste, linhagens de células de NSCLC resisten-tes a fármaco, também foram menos sensíveis a apoptose induzida por ini-bição de PKC. Infelizmente, esse padrão de resistência não pode ser supe-rado através de combinação de fármacos anticâncer citotóxicos com inibido-res de PKC. Diferente de outros estudos conduzidos em um número limitadode linhagens de células de NSCLC (32, 35), a presente terapia de combina-ção geralmente não resulta em citotoxicidade sinergística. InesperadamentePKC412 ainda antagonizou a atividade de grupos citotóxicos em alguns mo-delos. Esses resultados devem ser levados em consideração quando dese-nhando estudos de eficácia clínica de inibidores de PKC em combinaçãocom fármacos anticâncer citotóxicos em NSCLC e também em outras doen-ças malignas. Como atualmente, seleção de paciente para tais experimentosé usualmente baseada na classificação histopatológica de tumores. Todasas linhagens de células usadas no presente estudo originaram-se de NS-CLC1 novamente demonstrando que histopatologia sozinha é incapaz dedescobrir heterogeneidade funcional. Além disso, o status funcional do genesupressor de tumor TP53, assim como análises de expressão de vários re-guladores de apoptose falharam em prever a sensibilidade a fármacos anti-câncer citotóxicos assim como a inibidores específicos de PKC in vitro. Emcontraste, análises funcionais de vias de transdução de sinal apoptótico re-velaram defeitos no nível de permeabilização de MOM em linhagens de célu-las de NSCLC resistentes. Alvejamento terapêutico para este defeito atravésde expressão condicional de BAK pró-apoptótica confiavelmente superou aresistência a inibidores de PKC e/ou a fármacos citotóxicos padrão.

Certamente, tais análises bioquímicas extensivas não podem serfacilmente realizadas em biópsias de tumores obtidos de pacientes de cân-cer. Entretanto, nossos resultados podem ter várias implicações sobre o de-senvolvimento de estratégias para a tradução de novos compostos em onco-logia clínica. Em primeiro lugar, a combinação de inibidores de cinase comregimes citotóxicos padrão pode não ser informativa, quando o resultadodeste tratamento combinado não pode ser previsto para a população hetero-gênea de pacientes com cânceres histopatologicamente classificados. Efei-tos positivos da combinação em alguns pacientes podem ser superados porefeitos prejudiciais em outros, resultando, no máximo, em resultados purossimilares seguindo a terapia de combinação (3-6). Em segundo lugar, a efi-cácia de novos fármacos alvejados pode ser impedida pelos mesmos meca-nismos de resistência conduzindo à falha de fármacos anticâncer citotóxicos.No presente estudo, isso foi demonstrado para defeitos em transdução desinal apoptótico. O mesmo pode ser verdadeiro para defeitos em regulaçãode ciclo de célula, ou vias alternativas de morte. Em terceiro lugar, análisesfuncionais cuidadosas conduzidas em modelos de câncer pré-clínicos po-dem identificar alvos moleculares que são estrategicamente colocados emum ponto de convergência de várias vias de morte e sobrevivência.

No nosso presente estudo, a transferência de gene retroviral eexpressão condicional de BAK foram imaginados para modular a modulaçãoterapêutica de um tal alvo. Tradução em realidade clínica mais provavelmen-te requer diferentes estratégias farmacológicas, como moduladores de com-posto pequeno do reostato pró- e antiapoptótico no nível das proteínas defamília BCL-2 (36, 37).

A presente invenção refere-se a um método de tratamento detumores sólidos como, por exemplo, câncer colorretal (CRC) e câncer depulmão de não pequena célula (NSCLC) com inibidor de proteína cinase C.Ela também se refere ao uso de uma combinação farmacêutica de um inibi-dor de FLT-3 cinase e um inibidor de BAK para o tratamento das doenças oumalignidades mencionadas acima e ao uso de uma tal composição farma-cêutica para a fabricação de um medicamento para o tratamento destas do-enças ou malignidades.

Foi agora surpreendentemente verificado que inibidores de FLT-3 cinase em combinação com ativadores de permeabilidade de membranaexterior mitocondrial, tais como ativadores de BAK1 possuem propriedadesterapêuticas que os tornam particularmente úteis para o tratamento de, porexemplo, câncer de pulmão de não pequena célula (NSCLC).

Abreviaturas

ActD - actinomicina D, CDDP - cisplatina, DOX - doxiciclina,DXR - doxorrubicina, EGFP - proteína fluorescente verde aperfeiçoada, EG-FR - receptor de fator de crescimento epidérmico, MOM - membrana exteriormitocondrial, NSCLC - câncer de pulmão de não pequena célula, PDGF -fator de crescimento derivado de plaqueta, PKC - proteína cinase C,PKC412- N-benzoil estaurosporina, STS - estaurosporina, VEGF - fator decrescimento endotelial vascular, VP16 - etoposídeo.Inibidores de FLT-3 Cinase

Inibidores de FLT-3 cinase de particular interesse para uso nacombinação inventiva são derivados de estaurosporina. Preferivelmente, oinibidor de FLT-3 é N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexaidro-10-metóxi-9-metil-1-oxo-9,13-epóxi-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm] pirrol[3,4-j][1,7] benzo diazonin-11 -il]-N-metilbenzamida de fórmula I:

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ou um seu sal, incluindo especialmente um sal farmaceuticamente aceitável.

O composto de fórmula I é também conhecido como MIDOSTAURINA [No-me Não Privado Internacional] ou PKC412. PKC412 é um derivado do alca-lóide da estaurosporina que ocorrendo naturalmente.

Em modalidades alternativas, inibidores de Fit-3 apropriados in-cluem, por exemplo, compostos como mostrados em WO 03/037347, porexemplo, derivados de estaurosporina de fórmula (II) ou (III):

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onde o composto (III) é o derivado parcialmente hidrogenado de composto(II); ou derivados estaurosporina de fórmula (IV) ou (V) ou (VI) ou (VII):

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onde R1 e R2 são, independentemente um do outro, alquila não substituídaou substituída, hidrogênio, halogênio, hidróxi, hidróxi eterificado ou esterifi-cado, amino, amino mono- ou dissubstituído, ciano, nitro, mercapto, mercap-to substituído, carbóxi, carbóxi esterificado, carbamoíla, carbamoíla N-monoou Ν,Ν-dissubstituída, sulfo, sulfonila substituída, aminossulfonila ou ami-nossulfonila N-mono- ou Ν,Ν-dissubstituída;

nem são, independentemente um do outro, um número de 0inclusive a e 4 inclusive;

n' e m' são, independentemente um do outro, um número de 0inclusive a 4 inclusive;

R3, R4, R8 e R-io são, independentemente uns dos outros, hidro-gênio, -O", acila com até 30 átomos de carbono, um radical alifático, carbocí-clico, ou carbocíclico alifático com até 29 átomos de carbono em cada caso,um radical heterocíclico ou heterocíclico alifático com até 20 átomos de car-bono em cada caso, e em cada caso até 9 heteroátomos, uma acila com até30 átomos de carbono, onde R4 também pode estar ausente;

ou se R3 é acila com até 30 átomos de carbono, R4 não é umaacila;

ρ é 0 se R4 está ausente, ou é 1 se R3 e R4 estão, ambos, pre-sentes e em cada caso são um dos radicais mencionados acima;

R5 é hidrogênio, um radical alifático, carbocíclico, carbocíclicoalifático com até 29 átomos de carbono em cada caso, ou um radical hetero-cíclico ou heterocíclico alifático com até 20 átomos de carbono em cada ca-so, e em cada caso até 9 heteroátomos, ou acila com até 30 átomos de car-bono;

R7, R6 e Rg são acila ou —(alquil inferior)-acila, alquila não substi-tuída ou substituída, hidrogênio, halogênio, hidróxi, hidróxi eterificado ou es-terificado, amino, amino mono- ou dissubstituído, ciano, nitro, mercapto,mercapto substituído, carbóxi, carbonila, carbonildióxi, carbóxi esterificado,carbamoíla, carbamoíla N-mono- ou Ν,Ν-dissubstituída, sulfo, sulfonila subs-tituído, aminossulfonila, ou aminossulfonila N-mono- ou Ν,Ν-dissubstituída;

X representa 2 para 1 átomo de hidrogênio e hidróxi; para O; oupara hidrogênio e alcóxi inferior;

Z representa hidrogênio ou alquila inferior;e qualquer de duas ligações caracterizadas por linhas onduladas são ausen-tes no anel A e substituídas por 4 átomos de hidrogênio, e as duas linhasonduladas em cada anel B, juntas com a respectiva ligação paralela, signifi-cam uma ligação dupla;

ou as duas ligações caracterizadas por linhas onduladas estãoausentes no anel B e substituídas por um total de 4 átomos de hidrogênio, eas duas linhas onduladas em cada anel A, juntas com a respectiva ligaçãoparalela, significam uma ligação dupla;

ou ambas no anel A e no anel B todas as 4 ligações onduladasestão ausentes e são substituídas por um total de 8 átomos de hidrogênio;

ou um seu sal, se pelo menos um grupo formador de sal estápresente.

Os termos gerais e definições usados anteriormente e a seguirpreferivelmente têm os significados para os derivados de estaurosporinacomo descritos em WO 03/037347, que é aqui incorporado a título de refe-rência em sua totalidade. Entretanto, onde aparecem discrepâncias entre WO03/037347 e a presente descrição, a presente descrição deve prevalecer.

Por sua natureza, os compostos da invenção podem estar pre-sentes na forma de sais farmaceuticamente, isto é, fisiologicamente, aceitá-veis, contanto que eles contenham grupos formadores de sal. Para isola-mento e purificação, sais farmaceuticamente inaceitáveis também podem serusados. Para uso terapêutico, somente sais farmaceuticamente aceitáveissão usados, e estes sais são preferidos.

Assim, compostos de fórmula I tendo grupos ácidos livres, porexemplo, um grupo sulfo, fosforila ou carboxila livre, podem existir como umsal, preferivelmente como um sal fisiologicamente aceitável com um compo-nente básico de formação de sal. Estes podem ser primariamente sais demetais ou amônio, tais como sais de metais álcali ou alcalinos-terrosos, porexemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou sais de amôniocom amônia ou apropriadas aminas orgânicas, especialmente monoaminasterciárias e bases heterocíclicas, por exemplo, trietilamina, tri-(2-hidróxietil)-amina, N-etilpiperidina ou N,N'-dimetilpiperazina.

Os compostos da invenção tendo um caráter básico tambémpodem existir como sais de adição, especialmente como sais de adição áci-da com ácidos inorgânicos e orgânicos, mas também como sais quaterná-rios. Assim, por exemplo, os compostos que têm um grupo básico, tal comoum grupo amino, como um substituinte, podem formar sais de adição ácidacom ácidos comuns. Ácidos apropriados são, por exemplo, ácidos halídricos,por exemplo, ácido clorídrico, e ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfó-rico, ácido nítrico ou ácido perclórico, ou ácidos sulfônicos ou carboxílicosalifáticos, alicíclicos, aromáticos ou heterocíclicos, tais como ácido fórmico,acético, propiônico, succínico, glicólico, lático, málico, tartárico, cítrico, fumá-rico, maléico, hidroximaléico, oxálico, pirúvico, fenilacético, benzóico, p-aminobenzóico, antranílico, p-hidroxibenzóico, salicílico, ácido p-aminos-salicílico, ácido pamóico, metanossulfônico, etanossulfônico, hidroxietanos-sulfônico, etileno dissulfônico, halobenzenossulfônico, toluenossulfônico,naftalenossulfônico ou ácido sulfanílico, e também metionina, triptofano, Iisi-na ou arginina, assim como ácido ascórbico.

Em vista da relação íntima entre os compostos (especialmentede fórmula I) em forma livre e na forma de seus sais, incluindo aqueles saisque podem ser usados como intermediários, por exemplo, na purificação ouidentificação dos novos compostos, e de seus solvatos, qualquer referênciaanterior e a seguir aos compostos livres é para ser entendida como tambémreferindo-se aos correspondentes sais, e seus solvatos, por exemplo, hidra-tos, quando apropriado e conveniente.

Derivados de estaurosporina e seu método de fabricação foram,especificamente descritos em muitos documentos anteriores, bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.

Compostos de fórmula I e seus métodos de fabricação foramespecificamente descritos na Patente EP N° 0 296 110 publicada em 21 dedezembro de 1988, assim como na Patente US N0 5.093.330 publicada em 3de março de 1992, e a Patente JP N0 2 708 047, cada uma das quais é aquiincorporada a título de referência.

Em cada caso onde citações de pedidos de patente ou publica-ções científicas são dadas em particular para os compostos derivados deestaurosporina, a matéria objeto dos produtos finais, as preparações farma-cêuticas e as reivindicações são assim incorporadas no presente pedido depatente a título de referência a estas publicações.

A estrutura dos agentes ativos identificados por Nos de código,marcas registradas ou genéricas pode ser tirada da edição atual do com-pêndio padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo, Pa-tentes Internacionais (por exemplo, IMS World Publications). O seu conteúdocorrespondente é aqui incorporado a título de referência.

Ativadores de BAK

Moduladores de BAK são úteis na modulação de vias de trans-dução de sinal apoptótico. Ativadores de BAK aperfeiçoam morte de célulaapoptótica e contrabalançam os efeitos antiapoptóticos de BCL2. Ativadoresde BAK incluem, mas não são limitados a, inibidores de BCL-2/BCL-XL. E-xemplos de compostos inibidores de Bcl-2/Bcl-XL incluem, mas não são Iimi-tados a, anticorpos anti-Bcl-2/Bcl-XL, constructos RNAi alvejando Bcl-2 ouBcl-XL, peptídeos hélice BH3 grampeados - hidrocarboneto e inibidoresquímicos como N-{4-[4-(4'-cloro-bifenil-2-ilmetil)-piperazin-1-il]-benzoil}-4-(3-dimetilamino-1-fenilsulfanilmetil-propilamino)-3-nitro-benzenossulfonamida(composto Abbott ABT-737) (36,37). Terapias de apoptose incluindo ativado-res de BAK adicionais foram recentemente revistas (40).

Produtos terapêuticos, medicamentos e métodos de uso

A presente invenção em particular provê um método de trata-mento de câncer de pulmão de não pequena célula (NSCLC), compreen-dendo a administração a um mamífero em necessidade de tal tratamento deuma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de FLT-3 cinase,tanto em forma livre como na forma de um sal ou pró-fármaco farmaceuti-camente aceitável. Um preferido inibidor de FLT-3 cinase é PKC412.

Preferivelmente, a presente invenção proporciona um métodopara tratamento de mamíferos, especialmente seres humanos, sofrendo decâncer de pulmão de não pequena célula (NSCLC) compreendendo a admi-nistração a um mamífero em necessidade de tal tratamento de uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de um inibidor de FLT-3, ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável. Um inibidor preferido de FLT-3 cinaseé PKC412.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ao usode um inibidor de FLT-3 cinase, em forma livre ou na forma de um sal oupró-fármaco farmaceuticamente aceitável, para tratamento de NSCLC. Umpreferido inibidor de FLT-3 cinase é PKC412.

Ainda em uma modalidade, a presente invenção refere-se aouso de um inibidor de FLT-3 cinase, em forma livre ou na forma de um sal oupró-fármaco farmaceuticamente aceitável, para a preparação de uma com-posição farmacêutica para tratamento de NSCLC. Um inibidor de FLT-3 ci-nase preferido é PKC412.

A precisa dosagem do inibidor de FLT-3 cinase e o composto aser empregado para tratamento de doenças e condições aqui mencionadasdepende de vários fatores incluindo o hospedeiro, a natureza e severidadeda condição que está sendo tratada, o modo de administração. Entretanto,em geral, resultados satisfatórios são obtidos quando o inibidor de FLT-3 éadministrado parenteralmente, por exemplo, intraperitonealmente, intraveno-samente, intramuscularmente, subcutaneamente, intratumoralmente, ou re-talmente, ou enteralmente, por exemplo, oralmente, preferivelmente intrave-nosamente ou, preferivelmente oralmente, intravenosamente em uma dosa-gem diária de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 1 a 5 mg/kgde peso corporal. Em experimentos humanos uma dose total de 225 mg/diafoi mais presumivelmente a Dose Máxima Tolerada (MTD). Uma dosagemdiária intravenosa preferida é 0,1 a 10 mg/kg de peso de corpo ou, para mai-oria de primatas maiores, uma dosagem diária de 200-300 mg. Uma dosa-gem intravenosa típica é 3 a 5 mg/kg, três a cinco vezes por semana.

Mais preferivelmente, os inibidores de FLT-3, especialmente Ml-DOSTAURIN, são administrados oralmente, através de formas de dosagemcomo microemulsões, géis macios ou dispersões sólidas em dosagens deaté cerca de 250 mg/dia, em particular 225 mg/dia, administradas uma vez,duas vezes ou três vezes ao dia.

Usualmente, uma dose pequena é inicialmente administrada e adosagem é aumentada gradualmente até a dosagem ótima para o hospedei-ro sob tratamento ser determinada. O limite superior de dosagem é aqueleimposto por efeitos colaterais e pode ser determinado através de experimen-to para o hospedeiro sendo tratado.

Tratamento Combinado

Em um aspecto, a presente invenção também se refere a umacombinação, tal como uma preparação combinada ou uma composição far-macêutica, que compreende (a) um inibidor de FLT-3, especialmente os ini-bidores de FLT-3 especificamente mencionados acima, em particular aque-les mencionados como sendo preferidos, e no tratamento de um NSCLCresistente a fármaco citotóxico, (b) um ativador de permeabilização de mem-brana exterior mitocondrial, tal como um ativador de BAK; ou alternativamen-te no tratamento de um NSCLC sensível ao fármaco citotóxico, (b') um inibi-dor de topoisomerase; onde os ingredientes ativos (a) e (b) ou (b') (daqui pordiante "(b ou b')") estão presentes em cada caso em forma livre ou na formade sal farmaceuticamente aceitável, para uso simultâneo, concorrente, sepa-rado ou seqüencial.

O termo "uma preparação combinada" define especialmente um"kit de partes" no sentido que os parceiros de combinação (a) e (b ou b') co-mo definidos acima podem ser dosados independentemente ou através deuso de diferentes combinações fixadas com quantidades distintas dos par-ceiros de combinação (a) e (b ou b'), isto é, simultaneamente, concorrente-mente, separadamente ou seqüencialmente. As partes do kit de partes entãopodem ser, por exemplo, administradas simultaneamente ou cronologica-mente alternadas, ou seja, em diferentes pontos de tempos e com intervalosde tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes. A razãodas quantidades totais do parceiro de combinação (a) para o parceiro decombinação (b ou b') a serem administradas na preparação combinada podeser variada, por exemplo, de modo a arcar com as necessidades de umasubpopulação de pacientes a ser tratada ou as necessidades de um pacien-te único cujas diferentes necessidades podem ser devidas à particular doen-ça, gravidade da doença, idade, sexo, peso de corpo, etc. dos pacientes.

Estudos clínicos apropriados são, por exemplo, rótulo aberto,estudos de escalação de doses em pacientes com doenças proliferativas.Tais estudos provam em particular o sinergismo dos ingredientes ativos dacombinação da invenção. Os efeitos benéficos sobre NSCLC podem ser de-terminados diretamente através dos resultados destes estudos que são co-nhecidos por aqueles versados na técnica. Tais estudos são, em particular,apropriados para comparação de efeitos de uma monoterapia usando osingredientes ativos e uma combinação da invenção. Preferivelmente, a dosede agente (a) é escalada até a Dosagem Máxima Tolerada ser atingida, eagente (b ou b') é administrado em uma dose fixa. Alternativamente, o agen-te (a) é administrado em uma dose fixa e o agente (b ou b') é escalado. Ca-da paciente recebe a dose do agente (a) tanto diariamente como intermiten-temente. A eficácia do tratamento pode ser determinada em tais estudos, porexemplo, após 12, 18 ou 24 semanas através da avaliação de escores desintoma a cada seis semanas.

A administração de uma combinação farmacêutica da invençãoresulta não somente em um efeito benéfico, por exemplo, um efeito terapêu-tico sinergístico, por exemplo, com relação ao alívio, retardo de progressão,ou inibição de sintomas, mas também ainda em surpreendentes efeitos be-néficos, por exemplo, menos efeitos colaterais, uma aperfeiçoada qualidadede vida ou uma diminuída morbidez, comparada com uma monoterapia apli-cando somente um dos ingredientes farmaceuticamente ativos usados nacombinação da invenção.

Ainda um benefício é que menores doses dos ingredientes ati-vos da combinação da invenção podem ser usadas, por exemplo, que asdosagens não precisam somente ser freqüentemente menores mas tambémaplicadas menos freqüentemente, o que pode diminuir a incidência ou gravi-dade de efeitos colaterais. Isso está de acordo com os desejos e requisitosdos pacientes a serem tratados.

Os termos "co-administração" ou "administração combinada" ousemelhantes como aqui utilizados são pretendidos abrangerem administra-ção dos agentes terapêuticos selecionados para um único paciente, e sãopretendidos incluírem regimes de tratamento nos quais os agentes não sãonecessariamente administrados através da mesma via de administração ouao mesmo tempo.

É um objetivo da invenção proporcionar uma composição farma-cêutica compreendendo uma quantidade, que é conjuntamente terapeutica-mente eficaz em alvejamento ou prevenção de doenças proliferativas deuma combinação da invenção. Nesta composição, agente (a) e agente (b oub') podem ser administrados juntos, um após o outro ou separadamente emuma forma de dosagem unitária combinada ou em duas formas separadasde dosagem unitária. A forma de dosagem unitária também pode ser umacombinação fixada.

As composições farmacêuticas para administração separada deagente (a) e agente (b ou b') ou para a administração em uma combinaçãofixada, isto é, uma composição galênica simples compreendendo pelo me-nos dois parceiros de combinação (a) e (b ou b') de acordo com a invençãopodem ser preparadas em uma maneira conhecida per se e são aquelasapropriadas para administração enteral, tal como oral ou retal e parenteral amamíferos (animais de sangue quente), incluindo seres humanos, compre-endendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um parcei-ro de combinação farmacologicamente ativo sozinho, por exemplo, comoindicado acima, ou em combinação com um ou mais veículos ou diluentesfarmaceuticamente aceitáveis, especialmente apropriados para aplicaçãoenteral ou parenteral.

Composições farmacêuticas adequadas contêm, por exemplo,de cerca de 0,1% a cerca de 99,9%, preferivelmente de cerca de 1% a cercade 60%, do(s) ingrediente(s) ativo(s). Preparações farmacêuticas para a te-rapia de combinação para administração enteral ou parenteral são, por e-xemplo, aquelas em formas de dosagem unitária, como comprimidos reves-tidos com açúcar, cápsulas ou supositórios, ou ampolas. Se não indicado deoutro modo, estas são preparadas em uma maneira conhecida per se, porexemplo, por meio de convencionais processos de mistura, granulação, re-vestimento com açúcar, dissolução ou liofilização. Será apreciado que o teorunitário de um parceiro de combinação contido em uma dose individual decada forma de dosagem não precisa por si próprio constituir uma quantidadeeficaz uma vez que a necessária quantidade eficaz pode ser atingida atravésde administração de uma pluralidade de unidades de dosagem.

Em particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz de cadaum parceiro de combinação da combinação da invenção pode ser adminis-trada simultaneamente ou seqüencialmente e em qualquer ordem, e oscomponentes podem ser administrados separadamente ou como uma com-binação fixa. Por exemplo, o método de prevenção ou tratamento de doen-ças proliferativas de acordo com a invenção pode compreender (i) adminis-tração do primeiro agente (a) em forma de sal farmaceuticamente aceitávelou livre e (ii) administração de um agente (b ou b') em forma de sal farma-ceuticamente aceitável ou livre, simultânea ou seqüencialmente em qualquerordem, em quantidades conjuntamente terapeuticamente eficazes, preferi-velmente em quantidades sinergisticamente eficazes, por exemplo, em do-sagens diárias ou intermitentemente correspondendo às quantidades aquidescritas. Os parceiros de combinação individuais da combinação da inven-ção podem ser administrados separadamente em tempos diferentes duranteo curso de terapia ou simultaneamente em formas de combinação simplesou divididas. Além disso, o termo administração também abrange o uso deuma pró-fármaco de um parceiro de combinação que converte in vivo para oparceiro de combinação como tal. A presente invenção por isso é para ser en-tendida como abrangendo todos tais regimes de tratamento simultâneo ou al-ternante e o termo "administração" é para ser interpretado da mesma maneira.

A dosagem eficaz de cada um dos parceiros de combinaçãoempregada na combinação da invenção pode variar dependendo do particu-lar composto ou composição farmacêutica empregada, o modo de adminis-tração, a condição sendo tratada, a severidade da condição sendo tratada.Assim, o regime de dosagem da combinação da invenção é selecionado deacordo com uma variedade de fatores incluindo a rota de administração e afunção renal e hepática do paciente. Um clínico ou médico versado podefacilmente determinar e prescrever a eficaz quantidade dos ingredientes ati-vos requerida para aliviar, neutralizar ou impedir o progresso da condição.Ótima precisão na obtenção de concentração dos ingredientes ativos dentroda faixa que rende eficácia sem toxidez requer um regime baseado nas ciné-ticas da disponibilidade de ingredientes para sítios alvo.

Dosagens diárias para agente (a) ou (b ou b') irão, é claro, variardependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, o composto esco-lhido, a particular condição a ser tratada e o efeito desejado. Em geral, entre-tanto, resultados satisfatórios são obtidos com administração de agente (a)em taxas de dosagem diária da ordem de aproximadamente 0,03 a 5 mg/kgpor dia, particularmente 0,1 a 5 mg/kg por dia, por exemplo, 0,1 a 2,5 mg/kgpor dia, como uma dose simples ou em doses divididas. Agente (a) e agente(b ou b') podem ser administrados através de qualquer via convencional, emparticular enteralmente, por exemplo, oralmente, na forma de comprimidos,cápsulas, soluções de beber ou parenteralmente, por exemplo, na forma desoluções ou suspensões injetáveis. Formas adequadas de dosagem unitáriapara administração oral compreendem de aproximadamente 0,02 a 50 mg deingrediente ativo, usualmente 0,1 a 30 mg, por exemplo, agente (a) ou (b ou b'),junto com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Agente (b ou b') pode ser administrado a um ser humano emuma faixa de dosagem diária de 0,5 a 1000 mg. Formas de dosagem unitáriaapropriadas para administração oral compreendem de aproximadamente 0,1a 500 mg de ingrediente ativo, junto com um ou mais diluentes ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis.

A administração de uma combinação farmacêutica da invençãoresulta não somente em um efeito benéfico, por exemplo, um efeito terapêu-tico sinergístico, por exemplo, com relação à inibição de proliferação desre-gulada de ou diminuição de progressão de NSCLC, mas também em aindasurpreendentes efeitos benéficos, por exemplo, menos efeitos colaterais,uma aperfeiçoada qualidade de vida ou uma diminuída morbidez, compara-da a uma monoterapia aplicando somente um dos ingredientes farmaceuti-camente ativos usados na combinação da invenção.

Ainda um benefício é que menores doses dos ingredientes ati-vos da combinação da invenção podem ser usadas, por exemplo, que asdosagens não precisam ser somente freqüentemente menores mas tambémsão aplicadas menos freqüentemente, ou podem ser usadas de modo a di-minuir a incidência de efeitos colaterais. Isto está de acordo com os desejose requisitos dos pacientes a serem tratados.

O composto (a) e(b ou b') pode ser combinado com um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, um mais outrosadjuvantes farmacêuticos convencionais e administrados enteralmente, porexemplo, oralmente, na forma de comprimidos, cápsulas, cápsulas peque-nas, etc. ou parenteralmente, por exemplo, intraperitonealmente ou intrave-nosamente, na forma de soluções ou suspensões injetáveis estéreis. Ascomposições enterais e parenterais podem ser preparadas através de meiosconvencionais.

As soluções de infusão de acordo com a presente invenção sãopreferivelmente estéreis. Isto pode ser facilmente realizado, por exemplo,através de filtração através de membranas de filtração estéreis. Formaçãoasséptica de qualquer composição em forma líquida, o enchimento assépticode frascos e/ou combinação de uma composição farmacêutica da presenteinvenção com um apropriado diluente sob condições assépticas são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica.

Os inibidores de FLT-3 podem ser formulados em composiçõesfarmacêuticas enterais e parenterais contendo uma quantidade da substân-cia ativa que é eficaz para o tratamento de doenças e condições nomeadasanteriormente, tais composições em forma de dosagem unitária e tais com-posições compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas descritas compreendem umasolução ou dispersão de compostos de fórmula I como MIDOSTAURIN emum polialquileno glicol glicerídeo saturado, onde o glicol glicerídeo é umamistura de glicerila e polietileno glicol ésteres de um ou mais ácidos graxossaturados C8-18.

Preferivelmente, há pelo menos um efeito benéfico, por exemplo,um aperfeiçoamento mútuo do efeito do primeiro e segundo ingredientesativos, em particular um sinergismo, por exemplo, mais de um efeito aditivo,adicionais efeitos vantajosos, menos efeitos colaterais, um efeito terapêuticocombinado em uma dosagem de outro modo não eficaz de um ou ambos oprimeiro e segundo ingredientes ativos, e especialmente um forte sinergismode ingredientes ativos.

A eficácia de PKC412 para o tratamento de NSCLC é ilustradapelos resultados dos exemplos que se seguem. Estes exemplos ilustram ainvenção sem de qualquer maneira limitar seu escopo.

Exemplos

Exemplo 1: Linhagens de células e vetoresLinhagens de células de NSCLC conhecidas na técnica foramobtidas. A menos que de outro modo especificado, células NSCLC foramdesenvolvidas sobre placas de cultura de tecido (BD Falcon) em meio Eaglemodificado por Dulbecco suplementado com soro fetal bovino 10%, L-glutamina e penicilina/estreptomicina em uma atmosfera umedecida em CO2a 5%. Células NSCLC expressando condicionalmente BAK transgênica fo-ram obtidas usando o sistema vetor BD RevTet-On (BD Clontech). Um frag-mento BamHI codificando o cDNA BAK humano de inteiro comprimento foigerado por PCR1 confirmado por seqüenciamento, e clonado no vetor pRev-TRE. Um vetor de expressão BCL-XL retroviral foi descrito previamente (26).

Virions retrovirais de replicação defeituosa foram produzidos através detransfecção padrão de fosfato de cálcio na linha de células de empacota-mento ampho FNX (um presente de Dr G.P. Nolan, Stanford). Transduçõesforam realizadas usando sobrenadantes filtrados, e populações foram sele-cionadas com higromicina B e puromicina na ausência de tetraciclina, ouforam obtidas através de classificação de células ativadas com fluorescência(CouIter) de células positivas EGFP.

Exemplo 2: Ensaios de apoptose

Quantificação de células com DNA fragmentado, caspases ati-vadas, potencial de transmembrana mitocondrial perdida, e medições dedistribuição de ciclo de célula foram realizadas através de citometria de fluxo(CouIter) como descrito anteriormente (26,38,39). N-benzoil estaurosporina(PKC412) foi obtido de Novartis Pharma, Basel, Suiça, e zVAD-fmkfoi obtidode ICN. Todas os outras fármacos foram adquiridas de Sigma.

Exemplo 3: Imunoblotting

Imunoblotting e fracionamento de células foram realizados comodescrito anteriormente (38, 39) usando anticorpos primários contra caspase-9 (Chemicon), caspase-3, BCL-XL, citocroma c (BD Pharmingen), ΒΑΧ,BAK, PARP (Upstate), AKT, fosfo-AKT, GSK-3beta, fosfo-GSK3beta (CellSignaling), e actina (ICN).

Exemplo 4: Resistência das linhagens de células de NSCLC

Na figura 1A células NSCLC Calu-6 (círculos fechados), e NCI-H1299 deficientes de TP53 (círculos abertos) e NCI-H23 (triângulos fecha-dos) e NCI-H322 mutante TP53 (triângulos abertos) e A549 (caixas fecha-das) e NCI-H460 competentes - TP53 (caixas abertas) foram tratadas cometoposídeo (coluna esquerda), cisplatina (coluna direita, painel de fundo) oudoxorrubicina (coluna direita, painel do alto e de centro) nas doses indica-das. Após 48 horas, a porcentagem de células com teor de DNA subdiplóide(sub-G1) foi medido por citometria de fluxo como um indicador de apoptose.

Na figura 1B as mesmas linhagens de células de NSCLC como na figura 1Aforam tratadas com doses em escalação do inibidor específico de PKCPKC412. As porcentagens de células com teor de DNA subdiplóide foramquantificadas por citometria de fluxo após 48 horas de tratamento. Valoresmédios +/- desvio padrão (SD) de pelo menos três experimentos indepen-dentes são dados. Na figura 1C células NCI-H460 sensíveis a fármaco, ecélulas NCI-H1299 resistentes a fármaco foram pré-tratadas com PKC412 (1a10 μΜ) ou DMSO por 2 horas, seguido por estimulação com PMA (1 μΜ)por 10 minutos. Extratos de células integrais foram analisados através deimnuoblotting usando os anticorpos primários indicados.

Exemplo 5: Análises de sinergia de fármaco

Células NCI-H460 proficientes em TP53 (figura 2A, barras pre-tas), células A549 (figura 2B, barras brancas), e células NCI-H1299 deficien-tes de TP-53 (figura 2C, barras cinzas) foram simultaneamente tratadas cometoposídeo 25 μΜ e doses em escalada de PKC412 (0, 5, 10, 50, 100 μΜ) ecélulas com teor de DNA subdiplóide foram quantificadas após 48 horas.Valores médios + SD de pelo menos três experimentos independentes sãodados. Na figura 2D distribuição de ciclo de célula de NCI-H1299 tratadascom DMSO ou PKC412 50 μΜ por 24 horas. Na figura 2E células A549 eNCI-H1299 foram inicialmente tratadas com etoposídeo 25 μΜ por 24 horas,seguidas pela adição de PKC412 50 μΜ por outras 24 horas (barras pretas).

Alternativamente, células foram tratadas com PKC412 50 μΜ por 24 horasseguidas pela adição de etoposídeo 25 μΜ por outras 24 horas (barras cin-zas). Após 48 horas, a fração de células com teor de DNA subdiplóide (sub-G1) foi quantificado por citometria de fluxo. Células tratadas com DMSO(barras brancas) serviram como controles negativos. Valores médios + SDde pelo menos três experimentos independentes são dados.

Exemplo 6: Função mitocondrial

Na figura 3A células de NSCLC, NCI-H460 (caixas abertas),A549 (caixas fechadas) e NCI-H1299 (círculos abertos) foram tratadas comas doses indicadas de PKC412. Após 48 horas, células foram coloridas como substrato caspase fluorescente FITC-VAD (Oncogene), e a fração de célu-las positivas FITC com caspases ativadas (FITC+) foi medida por citometriade fluxo. Na figura 3B células de NSCLC, NCI-H460 (caixas abertas), A549(caixas fechadas) e NCI-H1299 (círculos abertos) foram tratadas com as do-ses indicadas de PKC412. Após 48 horas, células foram manchadas com ocorante mitocondrial éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE, MolecularProbes), e a fração de células positivas TMRE com potencial de transmem-brana mitocondrial preservada ΔΨηι (TMRE+) foi quantificada por citometriade fluxo. Valores médios +/- SD de pelo menos três experimentos indepen-dentes são dados. Na figura 3C células de NSCLC NCI-H460 e A549 foramtratadas com etoposídeo 25 μΜ, e frações citosólicas foram obtidas nos pon-tos de tempo indicados. A liberação de citocitocromo c mitocondrial no cito-sol foi detectada por imunoblotting usando um anticorpo primário específicode citocromo c. Em figura 3D extratos de células integrais foram preparadosa partir de células NSCLC NCI-H1299 e Calu-6 deficientes de TP53 e NCH-H322 e NCI-H23 mutantes TP53, NCI-H460 e A549 proficientes em TP53. Aexpressão constitutiva de ΒΑΧ, BAK e BCL-XL foi detectada por imunoblotting.

Exemplo 7: Expressão de BAK condicional

Na figura 4A células A549 expressando BAK sob o controle deum promotor regulado por tetraciclina foram crescidas na ausência (-) oupresença (+) de doxiciclina (DOX). Extratos de células integrais foram prepa-rados 24 horas após indução de DOX, e foram analisados para expressãode BAK através de imunoblotting. Extratos de células de células NCI-H460serviram como controle para níveis de expressão endógena de BAK. Na fi-gura 4B, células NSCLC NCI-H1299 e A549, NCI-H460 expressando BAKsob o controle de um promotor regulado com tetraciclina foram crescidas naausência (barras brancas) ou presença (barras pretas) de DOX, e célulascom teor de DNA subdiplóide (sub-G1) foram quantificadas por citometria defluxo após 24 horas. Valores médios + SD de três experimentos independen-tes são mostrados. Na figura 4C, células A549 expressando BAK sob o con-trole de um promotor regulado com tetraciclina foram tratadas com etoposí-deo 25 μΜ na presença de DOX1 e extratos de célula integral foram obtidosnos pontos de tempo indicados. A expressão de BAK1 e a clivagem de cas-pase-9, caspase-3, e o substrato caspase PARP foram detectadas por man-chamento imune. Na figura 4D, células A549 expressando BAK sob o contro-Ie de um promotor regulado por tetraciclina foram transduzidas para expres-sarem BCL-XL (barras pretas) ou um vetor controle (barras brancas) emconjunção com EGFP1 e populações positivas EGFP foram selecionadasatravés da classificação de célula ativada por fluorescência. Expressão deBAK foi induzida pela adição de DOX1 e as frações de células com teor deDNA subdiplóide foram quantificadas por citometria de fluxo após 48 horas.Valores médios + SD de três experimentos independentes são mostrados.

Exemplo 8: Alveiamento de BAK mitocondrial

Células A549 resistentes a fármaco (figura 5A) e NCI-H460 sen-síveis a fármaco (figura 5B) expressando BAK sob o controle de um promo-tor regulado com tetraciclina foram tratadas com doses em escalação dePKC412 na ausência (barras brancas) ou presença (barras pretas) de DOXpara induzir expressão de BAK. Células com teor de DNA subdiplóide (sub-G1) foram quantificadas por citometria de fluxo após 48 horas. Valores mé-dios + SD de pelo menos três experimentos independentes são dados. Nafigura 5C células NCI-H1299 resistentes a fármaco expressando BAK sob ocontrole de um promotor regulado com tetraciclina foram tratadas com dosesem escalação de PKC412 na ausência (barras brancas) ou presença (barrasnegras) de DOX para induzir expressão de BAK. Células que mantiveramΔΨητι (TMRE+) foram quantificadas por coloração com TMRE e citometria defluxo após 48 horas. Valores médios +/- SD de pelo menos três experimen-tos independentes são dados. Na figura 5D, células A540 expressando BAKsob o controle de um promotor regulado com tetraciclina foram tratadas comdoses crescentes de PKC412 (1 a 10 μΜ) na ausência ou presença de DOXpara induzir expressão de BAK. Extratos de célula integral foram obtidos em24 horas, e a clivagem de caspase-9, caspase-3 e o substrato caspasePARP foi detectada por imunoblotting.

Exemplo 9: Padrões similares de resistência parainibidores específicos deproteína cinase C e fármacos anticâncer citotóxicos em NSGLC

Para estudar uma possível contribuição de defeitos no maquiná-rio apoptótico de núcleo para resistência a fármaco em NSCLC, três paresde linhagens de células que são tanto proficientes (A549, NCI-H460), defici-entes (NCI-H1299, calu-6), como mutantes (NCI-H23, NCI-H322) para o ge-ne supressor de tumor TP53, foram analisadas. Usando um painel de fárma-cos anticâncer citotóxicos aplicadas clinicamente incluindo doxorrubicina(DXR)1 cisplatina (CDDP), paclitaxel, actinomicina D (actD) e etoposídeo(VP16), verificamos um similar padrão de resistência destas linhagens decélulas que foi independente do respectivo agente citotóxico (figura 1A, enão mostrado). Estes resultados confirmaram que o status p53 é uma pobreprevisão de sensibilidade para terapias citotóxicas em NSCLC.

Como privação de fator de crescimento pode induzir apoptoseatravés de mecanismos distintos a partir de morte de célula disparada pordano de DNA, concluiu-se que inibidores de sinalização de fator de cresci-mento podem ser capazes de eliminarem células de câncer resistentes a taisterapias citotóxicas. Para este fim, linhagens de células de NSCLC foramtratadas com os inibidores específicos de PKC estaurosporina e seu deriva-do clinicamente aplicado PKC412. Interessantemente, linhagens de célulasque foram protegidas contra apoptose induzida por fármacos citotóxicostambém mostraram reduzida sensibilidade aos inibidores específicos dePKC (figura 1B e não mostrada). Isso não foi explicado por diferenças eminibição de molécula alvo, quando PKC412 efetivamente reduziu a fosforila-ção de alvos a jusante de transdução de sinal PKC (9), tal como proteínacinase B/AKT e glicogênio sintase cinase 3-beta, em linhagens de célulasresistentes a fármaco e sensíveis a fármaco (figura 1C e não mostrado). Por-tanto, resistência a apoptose induzida por fármacos anticâncer citotóxicos einibidores de PKC pareceu ser determinada por um defeito comum no cami-nho de transdução de sinal apoptótico.

Exemplo 10: Combinação de PKC412 com fármacos anticâncer citotóxicosem NSCLC produziu resultados variáveis

Para explorar se efeitos sinergísticos ou aditivos de um trata-mento combinado com PKC412 e fármacos anticâncer citotóxicos podemsuperar resistência a fármaco em NSCLC, mediu-se, inicialmente, a induçãode apoptose seguindo simultânea incubação com uma dose fixa do inibidorde topoisomerase VP16 e doses crescentes de PKC412. Em linhagens decélulas de câncer sensíveis, como NCI-H460, PKC412 não resultou em ne-nhum aumento em apoptose como comparado a VP16 sozinho (figura 2A).Interessantemente, resultados divergentes foram obtidos em linhagens decélulas NSCLC resistentes a fármaco. Enquanto tratamento combinado comPKC412 e VP16 produziu citotoxicidade aditiva em células A549 (figura 2B),tratamento com PKC412 realmente protegeu as células NCI-H1299 contraapoptose induzida por VP16 (figura 2C). Para ainda delinear a influência decronometragem e seqüência da aplicação de PKC412 e VP16, as célulasforam pré-tratadas com VP16 ou PKC412 por 24 horas, seguido pela adiçãodo fármaco alternativo por outras 24 horas. Pré-tratamento com PKC412resultou em um impedimento do ciclo da célula na fase G2/M, que mais pro-vavelmente é explicado pela inibição de atividade de CDK1 (10) (figura 2D).Interessantemente, em células NCI-H1299 este impedimento G2/M reduziu aquantidade de apoptose induzida por VP16 dado subseqüentemente aPKC412 (figura 2E). Em contraste, a quantidade de apoptose encontrada emA549 pré-tratada com PKC412 não difere significantemente daquela obser-vada seguindo pré-tratamento com VP16 (figura 2E).

Exemplo 11: Defeitos na via mitocondrial de ativação de caspase em célulasNSCLC resistentes a PKC412

Apoptose induzida por agentes que danificam o DNA e a retiradade fator de crescimento procede predominantemente através da via mito-condrial de ativação de caspase (11,12). Para ainda dissecar o mecanismode resistência a inibidores específicos de PKC nas linhagens de células NS-CLC1 analisou-se várias etapas desta via de transdução de sinal apoptótico.Linhagens de células NSCLC resistentes mostraram consistentemente redu-zida ativação de caspase e preservado potencial de transmembrana mito-condrial ("ΔΨιτι") seguindo tratamento com inibidores específicos de PKC oufármacos anticâncer citotóxicos (figura 3A, B e não mostrado). Também, aliberação de citocromo c mitocondrial no citoplasma foi retardada e reduzidaem linhagens de células de NSCLC resistentes a fármaco (figura 3C). Essesresultados apontaram um bloco em transdução de sinal apoptótico no níveldas proteínas de família BCL-2. Para este fim, estudou-se a expressão cons-titutiva das proteínas BH1-2-3 pró-apoptóticas essenciais BAX e BAK, e aproteína antiapoptótica BCL-XL em linhagens de células de NSCLC. En-quanto BAX foi consistentemente expressa em todas as 6 linhagens de célu-las, os níveis de proteína de BAK e BCL-XL mostraram algum grau de variação(figura 3D). Entretanto, nenhum destes fatores explicou convincentemente opadrão de resistência observado nas linhagens de células de NSCLC.

Exemplo 12: Expressão induzível de células de NSCLC resistentes sensibili-zadas com BAK para apoptose mediada por PKC412

Baseado em nossos resultados anteriores, concluiu-se que alve-jamento terapêutico de proteínas de família BCL-2 pró-apoptóticas pode sercapaz de superar o bloqueio funcional em ativação de caspase observadoem linhagens de células de NSCLC resistentes a fármaco. Uma etapa cen-tral neste caminho é a permeabilização da membrana exterior mitocondrial(MOM), que é executada pelas proteínas BCL-2 pró-apoptóticas BAX e BAK(13). Estudos de superexpressão mostraram que ambas as moléculas po-dem diretamente induzir permeabilização de MOM e apoptose (14-17). Emum contexto fisiológico, BAX e BAK são reguladas negativamente por prote-ínas BCL-2 antiapoptóticas, como BCL-XL, MCL-1 ou BCL-2. Regulação po-sitiva direta ou indireta de BAX e BAK é obtida pelo grupo de proteínas so-mente BH3, incluindo, mas sem limitação, a BID e BIM, ou PUMA, NOXA,BAD e outras (18,19).

Para estudar a modulação farmacológica de BAK, que é consti-tutivamente alvejada para a mitocôndria, gerou-se um vetor retroviral permi-tindo expressão condicional do cDNA BAK humana. Neste sistema, a ex-pressão de BAK transgênica é induzida no nível transcricional pela adição dedoxiciclina (DOX). As altas eficácias de transdução obtidas neste sistema devetor retroviral nos permitiram avaliar populações de linhagens de células deNSCLC. Esta é uma melhor reflexão de um tratamento farmacológico de umtumor que estudo de clones de células simples. Além disso, os níveis de ex-pressão de BAK transgênica nestas populações não excederam níveis de BAKendógena observados em algumas linhagens de células NSCLC (figura 4A).

Indução de expressão de BAK transgênica resultou em algumgrau de apoptose em linhagens de células de NSCLC resistentes a fármaco(figura 4B). Apoptose facilitada por BAK transgênica foi realizada através declivagem e ativação de caspases e substrato de caspase (figura 4C), perdade ΔΨιτι, e foi inibida pela expressão de BCL-XL ou o inibidor de caspase deamplo espectro zVAD-fmk (figura 4D e não mostrado). Estes resultados con-firmam que BAK transgênica atua como sua contraparte fisiológica nestesistema experimental.

Interessantemente, BAK expressa condicionalmente eficazmentesensibilizou linhagens de células NSCLC resistentes a fármaco para apopto-se induzida por inibidores específicos de PKC ou fármacos anticâncer citotó-xicos (figura 5A, C e não mostrada). Isto foi explicado por ativação de cas-pase seguindo tratamento com inibidores específicos de PKC somente napresença, mas não na ausência de DOX nestas linhagens de células (figura5D). Em contraste, indução de expressão de BAK em células NSCLC sensí-veis a fármaco aumentou somente marginalmente a quantidade de apoptoseobservada após tratamento com inibidores específicos de PKC (figura 5B).Referências

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Claims (25)

1. Método de tratamento ou prevenção de câncer de pulmão decélula não pequena, o método compreende a administração de um inibidorde tirosina cinase compreendendo um derivado de estaurosporina selecio-nado de um composto de fórmula (II) ou (III):<formula>formula see original document page 36</formula> em que o composto (III) é o derivado parcialmente hidrogenado de composto(II); ou derivados de estaurosporina de fórmula (IV) ou (V) ou (VI) ou (VII):<formula>formula see original document page 36</formula> em que Ri e R2 são, independentemente um do outro, alquila não-subs-tituída ou substituída, hidrogênio, halogênio, hidróxi, hidróxi eterificado ouesterificado, amino, amino mono- ou dissubstituído, ciano, nitro, mercapto,mercapto substituído, carbóxi, carbóxi esterificado, carbamoíla, carbamoílaN-mono ou Ν,Ν-dissubstituído, sulfo, sulfonila substituído, aminossulfonila ouaminossulfonila N-mono- ou N,N-dissubstituída;nem são, independentemente um do outro, um número de 0inclusive a 4 incluisive;n' e m' são, independentemente um do outro, um número de 0inclusive a 4 inclusive;R3, R4, Re e R-io são, independentemente uns dos outros, hidro-gênio, -O", acila com até 30 átomos de carbono, um radical alifático, carbocí-clico, ou carbocíclico alifático com até 29 átomos de carbono em cada caso,um radical heterocíclico ou heterocíclico alifático com até 20 átomos de car-bono em cada caso, e em cada caso até 9 heteroátomos, uma acila com até 30 átomos de carbono, em que R4 também pode estar ausente;ou se R3 é acila com até 30 átomos de carbono, R4 não é umaacila;ρ é 0 se R4 está ausente, ou é 1 se R3 e R4 estão, ambos, pre-sentes e em cada caso são um dos radicais mencionados acima;R5 é hidrogênio, um radical alifático, carbocíclico, carbocíclicoalifático com até 29 átomos de carbono em cada caso, ou um radical hetero-cíclico ou heterocíclico alifático com até 20 átomos de carbono em cada ca-so, e em cada caso até 9 heteroátomos, ou acila com até 30 átomos de car-bono;R7, R8 e R9 são acila ou —(alquil inferior)-acila, alquila não substi-tuída ou substituída, hidrogênio, halogênio, hidróxi, hidróxi eterificado ou es-terificado, amino, amino mono- ou dissubstituído, ciano, nitro, mercapto,mercapto substituído, carbóxi, carbonila, carbonildióxi, carbóxi esterificado,carbamoíla, carbamoíla N-mono- ou Ν,Ν-dissubstituída, sulfo, sulfonila subs-tituído, aminossulfonila, ou aminossulfonila N-mono- ou Ν,Ν-dissubstituída;X representa 2 para 1 átomo de hidrogênio e hidróxi; para O; oupara hidrogênio e alcóxi inferior;Z representa hidrogênio ou alquila inferior;e qualquer de duas ligações caracterizada por linhas onduladas são ausen-tes em anel A e substituídas por 4 átomos de hidrogênio, e as duas linhasonduladas em cada anel B, juntas com a respectiva ligação paralela, signifi-cam uma ligação dupla;ou as duas ligações caracterizadas por linhas onduladas estãoausentes no anel B e substituídas por um total de 4 átomos de hidrogênio, eas duas linhas onduladas em cada anel A, juntas com a respectiva ligaçãoparalela, significam uma ligação dupla;ou ambas em anel A e em anel B todas as 4 ligações onduladasestão ausentes e são substituídas por um total de 8 átomos de hidrogênio;ou um sal do mesmo, se pelo menos um grupo formador de salestá presente;em que o inibidor de tirosina cinase trata ou previne câncer de pulmão decélula não pequena.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que câncer depulmão de célula não pequena é sensível a fármacos anticâncer citotóxicos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o tratamentoainda compreende administração de um inibidor de topoisomerase.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidor detopoisomerase é VP16.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer decélula não pequena tem resistência a fármacos anticâncer citotóxicos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o tratamentoainda compreende a administração de um modulador de atividade de BAK.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o moduladoré um ativador de atividade de BAK.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o tratamentoainda compreende a administração de uma composição que aperfeiçoa apermeabilização da membrana exterior mitocondrial.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer depulmão de célula não pequena está associado com uma mutação FLT-3.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidorde tirosina cinase é um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 38</formula> ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

11. Uso de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 39</formula>ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo para a preparação de umacomposição farmacêutica para o tratamento de câncer de pulmão de célulanão-pequena.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, para o tratamento decâncer de pulmão de célula não pequena.

13. Método para o tratamento de mamíferos sofrendo de câncerde pulmão de célula não pequena compreendendo a administração a ummamífero em necessidade de tal tratamento de uma quantidade inibidora detirosina cinase de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 39</formula>ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o mamífe-ro é um ser humano.

15. Preparação farmacêutica para o tratamento de câncer depulmão de célula não pequena compreendendo um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 39</formula>ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

16. Método de tratamento de câncer de pulmão de célula nãopequena em um mamífero, que compreende o tratamento de mamífero emnecessidade de tal tratamento simultaneamente, concorrentemente, separa-damente ou seqüencialmente com quantidades farmaceuticamente eficazesde (a) um inibidor de FLT-3, ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamen-te aceitável, e (b) um modulador de atividade BAK, ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável.

17. Uso de uma combinação de (a) um inibidor de FLT-3, ou umseu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável do mesmo, e (b) ummodulador de atividade BAK, ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceutica-mente aceitável do mesmo, para tratamento de câncer de pulmão de célulanão pequena.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, para o tratamento decâncer de pulmão não pequena célula (NSCLC).

19. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que o inibidor deFLT-3 é N-[(9S, 10R, 11R, 13R)-2,3,10,11,12,13-hexaidro-10-metóxi-9-metil-1 -oxo-9,13-epóxi-1H,9H-diindol[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrol[3,4-]][1,7] benzodiazo-nin-11-ÍI]-N-metilbenzamida da fórmula (I):<formula>formula see original document page 40</formula> ou um sal do mesmo.

20. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que o sal é umsal farmaceuticamente aceitável.

21. Método de indução de sensibilidade a fármaco em uma célu-la de câncer resistente a fármaco, o método compreende indução da via detransdução de sinal apoptótico na célula de câncer.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o métodocompreende a administração de pelo menos um ativador de atividade de BAK.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o métodocompreende a administração de pelo menos um inibidor de atividade Bcl-- 1/Bcl-XL.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a sensibi-lidade induzida na célula de câncer é a um fármaco que compreende umderivado de estaurosporina.

25. Método de tratamento de células de câncer resistentes afármaco, o método compreende a administração a uma célula de câncer deum indutor de apoptose e um derivado de estaurosporina.