BRPI0611892A2 - método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos de teor de fósforo reduzido - Google Patents
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Abstract
METODO PARA PRODUZIR ALQUIL éSTERES DE áCIDOS GRAXOS DE TEOR DE FóSFORO REDUZIDO A invenção aqui presente refere-se a um método para aprodução de alquil ésteres de ácidos graxos, como metil ésteres de ácidos graxos (FAN'IE) e etil ésteres de ácidos graxos com baixos níveis de impurezas como fosfolipídeos. Método de invenção é simplificado pela combinação de duas etapas em um único processo e então é economicamente mais barato. Método inclui misturar água, álcool, triglicerídeo e/ou ácidosgraxos livres, uma enzima lipolítica e uma fosfolipase. Subseqtientemente a fase aquosa, que contém glicerina, enzima residual e a maior parte dos fosfolipídeos hidrolisados, é separada da fase não aquosa, o teor defosfolipídeos na fase não aquosa é reduzido.
Description
"MÉTODO PARA PRODUZIR ALQUIL ESTERES DE ÁCIDOS GRAXOSDE TEOR DE FÓSFORO REDUZIDO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção presente refere-se a um método simplificado paraproduzir alquil ésteres de ácidos graxos degomados i.e. alquil ésteres deácidos graxos onde o teor de impurezas como fosfolipídeos foi reduzido. Ométodo compreende a conversão de gorduras e óleos para alquil ésteres deácidos graxos pelo uso de uma ou mais enzimas lipolíticas e uma ou maisfosfolipases em uma solução.
ESTADO DA TÉCNICA
Biodiesel, geralmente classificado como alquil ésteres deácidos graxos originados de gorduras ou óleos animais ou vegetais, tornou-se recentemente mais atrativo devido aos seus benefícios ambientais.Apesar de o biodiesel ser no momento produzido quimicamente comsucesso por transesterificação (utilizando e.g. NaOH e/ou metóxido desódio como catalisadores), existem diversos problemas associados pararestringir seu desenvolvimento, como o pré-processamento de óleo devidoao alto teor e ácidos graxos livres, a remoção dos catalisadores químicosdas fases éster e glicerol, a remoção de sais inorgânicos durante arecuperação do glicerol e redução do teor de fosfolipídeos que antecede aetapa de transesterificação.
As desvantagens causadas pelos catalisadores químicos sãoprevenidas usualmente pelo uso de enzimas lipolíticas com catalisadoras e emanos recentes desenvolveu-se interesse pelo uso de lipases com ou semimobilização na transesterificação para a produção de biodiesel.
Esterases de fungos podem ser utilizadas na produçãoenzimática de ésteres, onde elas podem substituir catalisadores como ácidosminerais (e.g. ácido sulfürico, ácido clorídrico, e ácido clorossulfônico),hidróxidos anfotéricos dos grupos metais I, II, III, e IV, e outros. O uso deenzimas para a síntese de ésteres vem sido descrito no conhecimentoprecedente, em particular enzimas classificadas em EC 3.1.1 hidrolases deéster carboxílico de acordo com Nomenclatura de Enzimas (Recomendaçõesdo Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e BiologiaMolecular, 1992 ou depois).
WO 88/02775 refere-se às lipases A e B de Candidaantarctica. Esse documenta que a lipase B de C. antarctica (CALB) é maisefetiva para a síntese de ésteres.
Cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar osubstrato cutina. Cutinases são conhecidas de diversos fungos (P.E.Kolattukudy em "Lipases", Ed. B. Bõrgstrom and H.L. Brockman, Elsevier1984, 471-504). A seqüência de aminoácidos de uma cutinase de Humicolainsolens foi publicada (US 5.827.719).
Muitos pesquisadores relataram que um alto rendimento dealquil ésteres pode ser alcançado na presença de solventes orgânicos, porémdevido à toxicidade e inflamabilidade de solventes orgânicos, a alcoólisecatalisada por lipases em meio livre de solvente é mais desejada. Foimostrado que a metanólise catalisada por lipases acontece em um sistemacontendo água e livre de solventes orgânicos. Em tais sistemas, lipases quesão menos sensíveis a metanol são vantajosas (Kaieda et al. J. Biosci. Bioeng.2001, 91:12-15). É bem sabido que álcoois de cadeia curta em excesso, comoo metanol, podem inativar a lipase seriamente. Entretanto, pelo menos trêsequivalentes molar são requeridos para a conversão completa do óleo para oseu metil éster. Du et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 38:103-106)estudaram o efeito da razão molar de óleo/metanol comparativamente duranteoperações em batelada contínuas e não contínuas.
Para evitar a inativação de lipases, a concentração de metanolvem sida mantida baixa pela da adição de metanol durante a reação (Shimadaet al. J. Mol. Ctalysis Enzymatic, 2002, 17:133-142; Xu et al. 2004, Biocat.Biotransform. 22:45-48).
Lipases de fungo, como definidas em EC3.1.1.3, podem serutilizadas em alcoólise de triglicerídeos e substituir catalisadores químicosalcalinos como metóxido de sódio ou hidróxido de potássio. Boutur et al. (J.Biotechnol. 1995, 42:23-33) relataram uma lipase de Candida deformans queé capaz de catalisar ambos a alcoólise de triglicerídeos (TG) e a esterificaçãode ácidos graxos livres (FFA), mas não sob as mesmas condições de reação.
Nas condições descritas por Boutur et al. apenas a esterificação foi catalisada.
De modo a obter uma produção mais econômica de alquilésteres de ácidos graxos para biodiesel, há uma necessidade de um processomais simples e integrado, resultando em uma conversão mais rápida de ácidosgraxos e óleos nos seus metil e etil ésteres correspondentes e um maiorrendimento na conversão e minimizando o investimento capital necessáriopara as unidades do processo. Além disso, gorduras e óleos obtidos deprocessos de produção usuais, através da compressão de materiais queliberam óleo ou extraindo óleo de materiais e removendo o solvente deextração, contém impurezas como lipídeos polares principalmente compostospor fosfolipídeos, assim com ácidos graxos, pigmentos, componentes de odoretc. É necessário remover essas impurezas por um processo de refinamento, oqual pode requerer uma etapa de degomação. Diversos métodos físicos equímicos são utilizados para degomar óleo (como descrito por Bochisch, M.em "Fats and Oils Handbook", AOC Press, 1998, p428-433), nessa atividadeo uso de fosfolipases para a degomação de óleos consumíveis é conhecido(US 5,264,367; JP-A2153997; e EP 622446) para reduzir o teor de fósforonos óleos degomados em água. Condições enzimáticas de degomação sãodescritas por Clausen, K em Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103 (2001), 333-340.
As etapas chave são o tratamento com ácido cítrico, ajuste do pH paraaproximadamente 5,0, a adição de enzima e mistura utilizando um misturadorde alto cisalhamento.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção em questão refere-se a um método para a produçãode alquil ésteres de ácidos graxos, como metil ésteres de ácidos graxos(FAME) e etil ésteres de ácidos graxos com um baixo nível de impurezascomo fosfolipídeos. O método da invenção é simplificado pela combinação deduas etapas do processo em um única etapa e é por conseqüênciaeconomicamente mais barato. O método inclui a mistura de água, álcool,triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, e uma ou mais enzima lipolíticas e umaou mais fosfolipases selecionadas dos tipos Al, A2, B e liso-fosfolipases.Subseqüentemente, a fase aquosa que contém glicerina, enzima residual e amaior parte dos fosfolipídeos hidrolisados, é separada da fase não aquosa, eentão o teor de fosfolipídeos na fase não aquosa é reduzido.
A combinação de enzimas lipolíticas e fosfolipases na mesmamistura permite um rendimento de produção de alquil ésteres de ácidosgraxos com teor de fósforo reduzido a partir de triglicerídeos e/ou ácidosgraxos livres rápido, simples e alto. A mistura do método da invenção emquestão possui uma concentração de álcool relativamente alta na fase aquosa.Isso é vantajoso para a transesterificação executada pelas lípases, comodescrito acima. Anteriormente nessa atividade, fosfolipases microbianas vemsido relatado serem relativamente instáveis em altas concentrações desolventes orgânicos (veja Song et ai., Biochemica et Biophysica Acta, 1547(2001) 370-378). Então é surpreendente que a etapa de degomação enzimática(hidrólise enzimática de fosfolipídeos por fosfolipases) no método dainvenção em questão, acontece nas mesmas condições que natransesterficação executada pelas lipases.
Além disso, a invenção refere-se a um processo em bateladaou um processo de estágios contínuos para produzir alquil ésteres de ácidosgraxos de teor de fósforo reduzido utilizando enzimas lipolíticas efosfolipases como descrito acima, onde o álcool é adicionado continuamenteou em etapas determinadas e onde as enzimas são recicladas e utilizadassomente uma vez. As enzimas podem também ser imobilizadas em esferas desílica ou livres em solução.
E enfatizado que os alquil ésteres de ácidos graxos produzidospelo método da invenção não são exclusivamente para biodiesel, mas podemtambém ser utilizados com óleos-químicos básicos em processo subseqüentesna indústria óleo-química.
Teor de fósforo reduzido
A frase "teor de fósforo reduzido" significa que o teor decomponentes que contém fósforo, como fosfolipídeos, foi reduzido.Fosfolipídeos não hidratáveis na fase não aquosa estão sendo hidrolisadospela fosfolipase e convertidos em fosfolipídeos hidratáveis, que são entãoextraídos da fase óleo para a fase aquosa. O teor de fósforo na fase de gorduraé medido pelo método descrito em Clausen, K em Eur. J. Lipid Sci Technol.103 (2001), 333-340. De acordo com o exemplo aqui citado esse é o valor deP depois de 24 horas de tempo de reação.
Em acordo, os alquil ésteres de ácidos graxos de teor defósforo reduzido da invenção em questão contém não mais que 500 ppm defósforo, de preferência não mais que 200 ppm de fósforo, mais de preferêncianão mais que 100 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 75 ppmde fósforo, mais de preferência não mais que 50 ppm de fósforo, mais depreferência não mais que 40 ppm de fósforo, mais de preferência não maisque 30 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 25 ppm de fósforo,mais de preferência não mais que 20 ppm de fósforo mais de preferência nãomais que 15 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 10 ppm defósforo, ainda mais de preferência não mais que 5 ppm de fósforo, a maiorpreferência não mais que 1 ppm de fósforo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção em questão refere-se a um método para a produçãode alquil ésteres de ácidos graxos, como metil ésteres de ácidos graxos(FAME) e etil ésteres de ácidos graxos com um baixo nível de impurezascomo fosfolipídeos. O método da invenção é simplificado pela combinação deduas etapas do processo em uma única etapa e é por conseqüênciaeconomicamente mais barato. O método inclui a mistura de água, álcool,triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, e uma ou mais enzimas lipolíticas euma ou mais fosfolipases selecionadas dos tipos Al, A2, B e liso-fosfolipases.
Subseqüentemente, a fase aquosa que contém glicerina, enzima residual e amaior parte dos fosfolipídeos hidrolisados, é separada da fase não aquosaatravés de sedimentação, filtração ou centrifiigação, e então o teor defosfolipídeos na fase não aquosa é reduzido.
Substratos Substratos utilizáveis para a produção dealquil ésteres de ácidos graxos de acordo com a invenção em questão são umaampla variedade de óleos e gorduras vegetais, óleos de colza e soja são maiscomumente utilizados, apesar de outras plantas como mostarda, girassol,canola, coco, erva, óleo de palmeira e até algas mostram promessa. Osubstrato pode ser de qualidade crua ou degomada em água ou ainda maisprocessado (refinado, alvejado e desodorizado). Também gorduras animaisincluindo sebo, banha, óleos marinhos, de aves domésticos, assim como óleosvegetais e animais de descarte, comumente conhecidos como graxa amarela emarrom podem ser utilizadas. As gorduras e óleos adequados podem sertriglicerídeos puros ou uma mistura de triglicerídeos e ácidos graxos livres,comumente vistos em gorduras animais e óleo vegetal de descarte. Osubstrato pode ser obtido de destilados desodorantes de óleos vegetais. O tipode ácidos graxos no substrato abrange aqueles que ocorrem naturalmentecomo glicerídeos em gorduras e óleos vegetais e animais. Esses incluem oácido oléico, o ácido linoleico, ácido linolênico, ácido palmítico e ácidoláurico para citar alguns. Constituintes minoritários em óleos vegetais crussão tipicamente fosfolipídeos, ácidos graxos livres, e glicerídeos parciais i. e.mono e diglicerídeos. Quando utilizada aqui, a frase "resíduos de ácidosgraxos" refere-se a ácidos graxos, tanto livres ou esterificados como emtriglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos ou alquil ésteres de ácidosgraxos.
O teor de fosfatídeo em um óleo cru pode variar de 0,5-3%peso/peso correspondendo ao teor de fósforo na faixa de 200-10000 ppm,mais preferencialmente na faixa de 250-1200 ppm. Fora os fosfatídeos, o óleocru também contém concentrações pequenas de carboidratos, compostos deaçúcar e complexos ácidos meta/fosfatídeo de CA, Mg e Fe.
Biodiesel Alquil ésteres de ácidos graxos, como os metilésteres de ácidos graxos (FAME) e etil ésteres de ácidos graxos são tambémchamados biodiesel, porque são utilizados como aditivo em diesel fóssil.Biodiesel constitui um aditivo cada vez mais importante ou substituto paracombustíveis diesel baseados em óleo fóssil por ser produzido de fontesrenováveis.
Álcool O álcool utilizado no método do invento épreferencialmente um álcool menor possuindo 1 a 5 átomos de carbono (Ci-C5). Os álcoois preferidos são metanol e etanol.
Enzima lipolítica A enzima lipolítica do método dainvenção em questão pode ser uma escolhida do grupo de enzimas lipolíticase variantes de enzimas lipolíticas de Candida Antarctica, Hyphozyma sp.Candida parapsilosis, Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotricumeandidum, Rhizomucur miehei, Crytoeoceus spp. S-2, Candida parapsilosis,Humieola insolens e Thermomyees lanuginosus (originalmente Humieold). Asditas enzimas lipolíticas incluem lipases, cutinases e acil transferases e podemser 60% idênticas a uma enzima lipolítica selecionada do grupo das espéciescitadas acima. Preferencialmente, a enzima lipolítica do método da invençãoem questão é 70% idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo dasespécies citadas acima, mais preferencialmente 75% idêntica, maispreferencialmente 80% idêntica, mais preferencialmente 85% idêntica, maispreferencialmente 90% idêntica, mais preferencialmente 95% idêntica, aindamais preferencialmente 97 ou 98% idêntica ou mais preferencialmente 99%idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo das espécies citadasacima. As enzimas lipolíticas preferidas são variantes de lípases deThermomyces lanuginosus (originalmente Humieola) de acordo com WO00/60063, a lipase do parente Thermomyees lanuginosus e a Lipase B deCandida Antaretiea.
Em outro aspecto, a invenção em questão inclui duasdiferentes enzimas lipolíticas onde a primeira enzima lipolítica é caracterizadaem exibir atividade contra triglicerídeos mais alta do que contra ácidos graxoslivres, enquanto a segunda enzima lipolítica exibe atividade mais alta contraácidos graxos livres que contra triglicerídeos. Em acordo, a primeira enzimalipolítica é definida como uma tendo uma proporção de atividade sobretriglicerídeo (medida como conversão de triglicerídeos para ácidos graxosalquil éster) pela atividade sobre FFA (medida como conversão de FFA paraalquil ésteres de ácidos graxos) abaixo de 0,2. A segunda enzima lipolítica édefinida como uma tendo uma proporção de atividade sobre triglicerídeo(medida como conversão de triglicerídeos para ácidos graxos alquil éster) pelaatividade sobre FFA (medida como conversão de FFA para alquil ésteres deácidos graxos) acima de 0,5.
Fosfolipases Preferencialmente, uma fosfolipase (PL)utilizada no método da invenção é uma fosfolipase obtida de ummicroorganismo, preferencialmente um fungo filamentoso, uma levedura, ouuma bactéria e selecionada dos tipos de fosfolipase Ai, A2, B e Iiso-fosfolipases.
Para o propósito da invenção em questão o termo "obtido de",como utilizado aqui em conexão com uma fonte microbiana específica,significa que a enzima e conseqüentemente a seqüência de DNA codificandoa dita enzima é produzida pela fonte específica.
A enzima é obtida da dita fonte específica por métodos padrãoconhecidos, possibilitando a pessoa com habilidades obter uma amostracompreendendo a enzima capaz de ser utilizada em um processo da invenção.
Os ditos métodos padrão podem ser a purificação direta das ditas fontesespecíficas ou clonagem da seqüência de DNA codificando a enzima seguidada expressão recombinante tanto na mesma fonte (expressão porrecombinação homóloga) ou em uma fonte diferente (expressão porrecombinação heteróloga).
Mais preferencialmente, uma fosfolipase utilizada em umprocesso da invenção é obtida de uma espécie de fungo filamentoso dentro dogênero Fusarium, como uma cepa de F. culmorum, F.heterosporum, F.solani, ou em particular uma cepa de F. oxysporum; ou uma espécie de fungofilamentoso dentro do gênero Aspergillus, como uma cepa de Aspergillusawamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou emparticular Aspergillus oryzae.
Exemplos de fosfolipases de Fusarium adequadas são descritas em:
1) Tsun-Che et al. (Phytopathological notes 58:1437-38 (1968)) (umafosfolipase de Fusarium solani)·, e
2) Pedido de patente EP No. 97610056.0 descrevendo uma PL de F.culmorum adequada (veja exemplo 18 no dito doe.) e uma PL de F.oxysporum adequada (veja exemplo 1-17).
Fosfolipases de Aspergillus adequadas são descritas em
3) EP 575133 descrevendo fosfolipases de numerosos diferentes Aspergillus(veja reivindicação 14) e em particular a PL de A. oryzae (reivindicação 17 ou18) e a PL de A. niger (reivindicação 19); e
4) DE 19527274 Al descreve uma preparação adequada (veja exemplos).Além disso, a preparação comercialmente disponível Degomma VOD(Roehm, Alemanha), que se acredita ser uma fosfolipase de Aspergillus éadequada para ser utilizada em um processo da invenção. As fosfolipasespreferidas são as variações de fosfolipases de Thermomyces lanuginosuscomo descritas em WO 00/327558, Exemplo 5, e o produto comercialLecitase® Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca).
As enzimas podem ser aplicadas como pó liofilizado,imobilizadas ou em solução aquosa.
Para propósitos da invenção em questão, o grau de identidadepode ser adequadamente determinado de acordo com o método descrito emNeedleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-45, com as seguintes calibrações para comparação de seqüência depolipeptídeos: penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensãode GAP de 0,1. A determinação pode ser feita por meios de um programa decomputador conhecido como GAP fornecido no pacote de programas GCG(Manual de programas para o pacote Wisconsin, Versão 8, Agosto de 1994,Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Winsconsin, EUA53711).
Duas dadas seqüências podem ser alinhadas de acordo com ométodo descrito em Neddleman (acima citado) utilizando-se os mesmosparâmetros. Isso pode ser feito por meios do programa GAP (acima citado).
Ainda, a invenção refere-se a um processo em batelada e/ouum processo contínuo, dividido em estágios para produzir alquil ésteres deácidos graxos utilizando uma primeira e uma segunda enzima lipolítica comodescrito acima, onde um álcool é adicionado continuamente ou dividido emestágios, e onde as enzimas são recicladas e utilizadas apenas uma vez. Se asenzimas são utilizadas em uma fase aquosa, essa fase pode ser separada dafase graxa por um decantador, um sedimentador ou por centrifugação. Noprocesso contínuo as duas fases, oleosa e aquosa, respectivamente, podem serprocessadas em contra-corrente. Kosugi, Y.; Tanaka, H. e Tomizuka, (1990),Biotechnology and Bioengineering5 vol 36, 617-622, descrevem um processocontínuo, que utiliza contra-corrente para hidrolisar óleos vegetais por umalipase imobilizada.
Descrição geral da preparação de ácidos graxos alquil éster de teor de fósfororeduzido
O substrato compreendendo triglicerídeo e/ou ácidos graxos émisturado com álcool, preferencialmente metanol ou etanol e aquecido a 30-70°C, preferencialmente aproximadamente 50°C em um banho agitadorrecíproco de água (200 rpm). De preferência a água é adicionada e a solução émisturada vigorosamente e deixada no banho agitador recíproco de água natemperatura desejada, preferencialmente 5O0C e 200 rpm para reagir. As fasesda mistura da reação podem ser misturadas pelo uso de misturadores de altocisalhamento, como os tipos da Silverson ou DCA Labortechnik, comoutilizado na degomação enzimática de óleos vegetais (Clausen, K. (2001),European Journal of Lipid Science and Technology, vol. 103, 333-340).
Tipicamente uma degomação enzimática acontece a pH 3-7.Na intenção de otimizar o processo, o pH usualmente necessita ser ajustadopara se adequar às outras condições do processo, incluindo o tipo de substratoe a concentração dos reagentes quelantes. Preferencialmente o pH é 4-5.
A razão molar [metanol]/[resíduo de ácido graxo] deve serpelo menos 0,1 e no máximo 10, preferencialmente entre 0,3-5, maispreferencialmente 0,4-2. O álcool pode ser adicionado em estágios definidos àreação ao longo do tempo. A água pode ser adicionada separadamente ou emuma solução aquosa de enzima. A concentração final de água na mistura dereação pode ser 0-50% (peso/peso), preferencialmente 5-40%, maispreferencialmente 5-30%. O substrato compreende 1-99% (peso/peso) detriglicerídeo, preferencialmente na faixa de 70-95%. Além disso, o substratopode possuir ácidos graxos livres chegando a 0,01-95% (peso/peso),preferencialmente na faixa de 0,01-30%. Também, mono e diglicerídeos efosfolipídeos podem estar presentes.
O curso da reação pode ser seguido pela remoção de amostrasda mistura de reação após um certo período do tempo de reação. As amostrassão centrifugadas por 14 minutos a 14000 rpm. A camada superior consisteem material graxo insolúvel na fase aquosa e essa é analisada por 1H RMN(utilizando-se CDCI3 como solvente). O tratamento enzimático é seguido pelaseparação da fase aquosa e a fase oleosa. Essa separação pode ser realizadapor meios convencionais, e.g. centrifiigação, decantação ou sedimentação.
O montante de enzima lipolítica adicionado pode serdeterminado nos termos de atividade lipolítica sobre tributirina (LU). Umsubstrato para enzimas lipolíticas é preparadas pela emulsificação detributirina (tributirato de glicerina) utilizando goma Arábica comoemulsificador. A hidrólise de tributirina a 3 O0C a pH 7 é seguida por umexperimento "titulação em pH-stat". Uma unidade de atividade de lípase (1LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μηιοί de ácidobutírico/min em condições padrão.
O teor de fósforo na fase graxa após 24 h de tempo de reação édeterminado como descrito por Clausen, K. Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103(2001), 333-340.
O método da presente invenção pode ser ainda mais otimizadopela adição de agentes quelantes, que quelam componentes metálicos namistura de reação assim aumentando a quantidade de fosfolipídeos hidratáveisna fase aquosa. Agentes quelantes com ácido cítrico ou ácidoetilenodiaminatetracético (EDTA) podem ser adicionados numa faixa de 0,01-1% peso/peso baseados no teor de óleo. Quantidades preferidas são 0,04-0,1%.
Após a remoção de compostos contendo fósforo da faseaquosa descarregada, as enzimas presentes na fase aquosa podem sercompletamente ou parcialmente recicladas misturando-se novamente a faseaquosa na mistura de reação incluindo substrato novo.
O teor de componentes contendo fósforo na fase graxa damistura de reação pode ser ainda reduzido por tratamento com sílica, queabsorve os fosfolipídeos entre outros.
Clonando uma seqüência de DNA codificando uma enzima lipolítica ou umafosfolipase
A seqüência de DNA codificando uma enzima lipolíticaparente ou uma fosfolipase pode ser isolada de qualquer célula oumicroorganismo produzindo a enzima em questão, utilizando diversosmétodos bem conhecidos no meio. Primeiro, um DNA genômico e/ou umabiblioteca de cDNA pode ser construída utilizando DNA cromossômico ouRNA mensageiro do organismo que produz a enzima a ser estudada. Então, sea seqüência de aminoácidos da enzima lipolítica ou fosfolipase é conhecida,sondas marcadas de oligonucleotídeos podem ser sintetizadas e utilizadas paraidentificar clones codificando enzimas lipolíticas ou fosfolipases de umabiblioteca genômica preparada do organismo em questão. Alternativamente,uma sonda marcada de oligonucleotídeo contendo seqüências homólogas aoutros genes de enzimas lipolíticas ou fosfolipases conhecidos pode serutilizada como sonda para identificar clones codificando enzimas relevantes,utilizando hibridização e condições de lavagem de menor estringência.
Ainda outro método para identificar clones codificandoenzimas lipolíticas ou fosfolipases pode envolver inserir fragmentos de DNAgenômico em um vetor de expressão, como um plasmídeo, transformandobactérias cutinase negativas com a biblioteca de DNA genômico resultante, eentão plaqueando a bactéria transformada em Agar contendo um substratopara enzimas lipolíticas ou fosfolipases (i.e. triglicerídeo), assim permitindoos clones a expressarem a enzima lipolítica a ser identificada.
Alternativamente, a seqüência de DNA codificando a enzimapode ser preparada sinteticamente por métodos padrões estabelecidos, e.g. ométodo "fosforoamidita" descrito por S.L. Beaucage and M.H. Caruthers(1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, ou o método descrito porMatthes et al., (1984), EMBO J. 3, p.801-805. No método "fosforoamidita",oligonucleotídeos são sintetizados, e.g. em um sintetizador automático deDNA, purificado, anelado, ligado e clonado em vetores apropriados.
Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origemmisturada genômica e sintética, origem misturada sintética e de cDNA ouorigem misturada genômica e cDNA, preparados por fragmentos se ligantesde origem sintética, genômica ou cDNA (como apropriado, os fragmentoscorrespondendo a várias partes da seqüência de DNA inteira), em acordo comtécnicas padrão. A seqüência de DNA pode também ser preparada por reaçãode polimerização de múltiplas cadeias (PCR) utilizando iniciadoresespecíficos, por exemplo, como descrito em US 4,683,202 ou R.K. Saiki etal., (1988), Science 239, 1988, p. 487-491.
Vetor de expressão
O vetor recombinante de expressão carreando a seqüência deDNA aue codifica uma enzima linolítica ou uma fosfolipase do método dainvenção pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente sersubmetido a procedimentos de recombinação de DNA, e a escolha do vetorvai também depender da célula hospedeira no qual este vai ser introduzido. Ovetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, éintegrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s)cromossomo(s) no qual ele foi integrado. Exemplos de vetores de expressãoadequados incluem pMT838.
O vetor de expressão da invenção pode também conter umterminador de transcrição adequado e, em eucariotos, seqüências depoliadenilação operáveis conectadas a seqüência de DNA codificando aenzima lipolítica ou fosfolipase do método da invenção. Seqüências determinação e poliadenilação podem ser adequadamente serem derivadas dasmesmas fontes do promotor.
O vetor pode conter uma seqüência de DNA que permita ovetor a replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüênciassão as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBllO,pE194, ρAMBl epIJ702.
O vetor pode ter ainda um marcador selecionável, e.g. um genecujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, como os genesdal de B. subtilis ou B. Iicheniformis, ou um que confira resistência aantibióticos como resistência a ampicilina, canamicina, clorofenicol outetraciclina. Ainda mais, o vetor pode conter marcadores selecionáveis deAspergillus como amdS, ergB, niaD e sC, um marcador dando origem àresistência à higromicina, ou a seleção pode ser feita por co-transformação,e.g. como descrito em WO 91/17243.
Os procedimentos utilizados para ligar o construto de DNA dainvenção codificando uma variante de cutinase, o promotor, terminador eoutros elementos, respectivamente, e inseri-los em vetores adequadoscontendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos porpessoas treinadas na área (cf., como exemplo, Sambrook et ai., MolecularCloning: A Laboratoiy Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).Promotor
No vetor, a seqüência de DNA pode ser operavelmenteconectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode serqualquer seqüência de DNA que mostre atividade transcricional na célulahospedeira de escolha e pode ser derivada de genes codificando proteínasambas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira.
Exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição da seqüência de DNA codificando uma enzima lipolitica oufosfolipase, especialmente em hospedeiro bacteriano, são os promotores dooperon Iac de E.coli, os promotores do gene de agarase dagA de Streptomycescoeliclolor, os promotores do gene de alfa-amilase (amyL) do BacillusIieheniformis, os promotores do gene da amilase maltogênica (amyM) deBacillus stearothermophilus, os promotores do gene da alfa amilase (amyQ)de Bacillus amyloliquefaeiens, os promotores dos genes xylA e xylB deBacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos depromotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica a TAK amilasede A. oryzae, o promotor TPI (triose fosfato isomerase) de S. eerevisae (Alberet ai. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, p.419-434), proteinase aspártica deRhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa-amilase estável de A.niger, glicoaminase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, proteasealcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A oryzae, ou acetamidase deA. nidulans.
Células hospedeiras
Uma célula hospedeira para a produção de enzimas utilizadasno método da invenção, tanto contendo um construto de DNA ou um vetor deexpressão da invenção como definido acima, é vantajosamente utilizada comocélula hosoedeira na oroducão recombinante de uma enzima lipolítica ou umafosfolipase. A célula pode ser transformada com um construto de DNAcodificando uma enzima lipolítica ou uma fosfolipase, convenientemente pelaintegração do construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo dohospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem jáque a seqüência de DNA é mais provavelmente mantida de forma estável nacélula. A integração de construtos de DNA no cromossomo hospedeiro podeser realizada de acordo com métodos convencionais, e.g. por recombinaçãohomóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformadacom um vetor de expressão como descrito acima em conexão com diferentestipos de células hospedeiras.
A célula hospedeira pode ser uma célula de um organismosuperior como um mamífero ou um inseto, particularmente uma célulamicrobiana e.g. uma célula bacteriana ou fungica (incluindo leveduras).
Exemplos de bactérias utilizáveis são bactérias Gram positivascomo Bacillus subtilis, Bacillus Ueheniformis, Baellus lentus, Baeillus brevis,Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaeiens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus,Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Streptomyces lividans ouStreptomyces murinus, ou bactérias Gram negativas como E. coli. Atransformação da bactéria pode, por exemplo, ser efetuada por transformaçãode protoplasto ou utilizando células competentes de maneira conhecida per se.
A levedura pode ser selecionada favoravelmente de umaespécie de Saecharomyces ou Schizosaccharomyces, e.g. Saccharomycescerevisiae.
A célula hospedeira pode também ser um fungo filamentosoe.g. uma cepa pertencendo a uma espécie de Aspergillus, particularmenteAspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou uma cepa de Fusarium, comouma cepa de Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (em estadonerfeito chamado de Gibberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinonimode Giberella roseum e Gibberella roseum f. sp. cerealis), ou Fusariumsulphureum (em estado perfeito chamado Gibberella puricaris, sinônimo comFusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucinum,Fusarium roseum, e Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis(sinônimo com Fusarium crokkwellense), ou Fusarium venenatum.
Em um exemplo concreto particular a célula hospedeira é cepadeficiente de protease ou de menos protease. Esta pode, por exemplo, ser acepa deficiente em protease de Aspergillus oryzae Jal 125 tendo o gene deprotease alcalina chamado "alp" deletado. Essa cepa é descrita em WO97/35956 (Novo Nordisk).
Células de fungo filamentoso podem ser transformadas por umprocesso envolvendo a formação de protoplasto e transformação doprotoplasto seguida pela regeneração da parede celular em uma maneiraconhecida per se. O uso de Aspergillus como microorganismo hospedeiro édescrito em EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), o teor do qual é aquiincorporado como referência.
Produção de enzimas lipolíticas ou fosfolipases pelo cultivo do transformante
As enzimas utilizadas no método da invenção podem serproduzidas por um método compreendendo cultivar uma célula hospedeirasob condições que conduzam à produção das enzimas e recuperação dasenzimas das células ou do meio de cultura.
O meio utilizado para cultivar as células pode ser qualquermeio convencional adequável para crescer a célula hospedeira emquestão e obter expressão da enzima lipolítica da invenção. Meiosadequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com receitas publicadas (e.g. como descrito emcatálogos da American Type Culture Collection). As enzimas lipolíticase fosfolipases secretadas das células hospedeiras podem serconvenientemente recuoeradas do meio de cultura por procedimentosbem conhecidos, incluindo separação das células do meio porcentrifugação ou filtração, e precipitando os componentes protéicos domeio por meio de sais como sulfato de amônio, seguido deprocedimentos cromatográficos como cromatografia de troca iônica,cromatografia de afinidade, ou similares.
EXEMPLO
Transesterificação e degomação de óleo cru de colza
A formação de metil ésteres de ácidos graxos de teor defósforo reduzido de óleo de colza cru utiliza uma enzima lipolítica e umafosfolipase.
Enzima lipolítica: A variante da fosfolipase de Thermomyceslanuginosus de acordo com WO 00/32758, Exemplo 5 (atividade 10.000LU/g), dosando: 30 ppm ou 100 ppm (correspondendo a 300 e 1000 LU/kg deóleo, respectivamente). Substrato: Óleo de colza 100% cru, 8 gramas. Teor demetanol: 1,5 equivalente molar baseado em óleo, 1,72 ml. 30% de H2Obaseado no peso de óleo. Tempo de amostragem: 3 e 24 horas. Temperaturade reação: 5O0C.
A mistura substrato-metanol é aquecida a 5O0C em umbanho agitador recíproco (200 rpm). Agua desmineralizada é adicionada(o volume dependendo do volume de enzima adicionado; quantidadetotal de água: 2,40 ml incluindo a água da adição de enzima),correspondendo a 30% peso/peso do óleo. A mistura é aquecida a 5O0C.Então as enzimas (lípase e fosfolipase) são adicionadas à mistura emisturadas em um misturador de alto cisalhamento (Ultra Turrax® T25,IKA Janke e Kunkel, Alemanha) por 30 segundos, e deixadas em umbanho agitador de água por 24 horas (agitamento recíproco, 5O0C e 200rpm).
Amostras são removidas da mistura de reação após 3 e 24horas de tempo de reação, respectivamente e centrifugadas por 14 minutosa 14000 rpm. A camada superior consiste de material graxo não solúvel nafase aquosa e essa é analisada por 1H RMN (utilizando CDCI3 comosolvente) espectrômetro Varian 400 MHz (Varian Inc. CA, EUA). Aconversão dos resíduos de ácidos graxos em ácido graxo metil éster édeterminada pela razão de sinais de metil dos metil ésteres de ácidosgraxos, -COOCH3 (3,70 ppm) e CH3CH2- (1,0-0,9 ppm) dos resíduos deácidos graxos.
Nenhuma formação de metil éster foi encontrada nosexperimentos sem lípase e fosfolipase nem nos experimentos com somentefosfolipase. O teor de fósforo na fase graxa após 24 h de tempo de reação foideterminado como descrito em Clausen, K. Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103(2001), 333-340.Tabela 1. Teor de fósforo e formação de metil éster após tratamentoenzimático
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Está evidente que a combinação de uma enzima lipolítica euma fosfolipase resulta em uma alta conversão de triglicerídeo para metilésteres e em um teor baixo de componentes contendo fósforo em um métodode única etapa.
Claims (17)
1. Método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos de teorde fósforo reduzido, caracterizado pelo fato de compreender misturar umálcool, um substrato compreendendo triglicerídeo e/ou ácidos graxos, comuma ou mais enzimas lipolíticas e uma ou mais fosfolipases e água.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o teor de fósforo de alquil ésteres de ácidos graxos é reduzido anão mais que 50 ppm, preferencialmente não mais que 40 ppm,preferencialmente não mais que 30 ppm, preferencialmente não mais que 25ppm, preferencialmente não mais que 20 ppm, mais preferencialmente nãomais que 15 ppm, preferencialmente não mais que 10 ppm, ainda maispreferencialmente não mais que 5 ppm, mais preferencialmente não mais que 1 ppm.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de que o substrato ainda compreende ácidos graxoslivres, preferencialmente na faixa de 0,01-95% em peso de ácidos graxoslivres.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o triglicerídeo é derivado de uma ou mais cargade alimentação de óleo vegetal, óleo de colza, óleo de soja, óleo de mostarda,óleo de girassol, óleo de canola, óleo de coco, óleo de cânhamo, óleo depalma, talóleo, gorduras animais incluindo sebo, banha, óleo de peixe e deaves domésticas, em que os óleos e gorduras podem ser crus, degomados emágua, de qualidade refinada ou de descarte.
5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a razão molar entre álcool e resíduos de ácidograxo é pelo menos 0,1 e no máximo 10, preferencialmente na faixa de 0,3-5,mais preferencialmente 0,4-2.
6. Método de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizadopelo fato de que o álcool é metanol ou etanol.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação compreendeágua até 50% (peso/peso).
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a temperatura é 30-70°C,preferencialmente aproximadamente 50°C.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a enzima lipolítica é 60% idênticaà enzima selecionada do grupo consistindo as enzimas lipolíticas de CandidaAntarctica, Hyphozyma sp., Candida parapsilosis, Candida rugosa,Pseudomonas cepacia, Geotricum eandidum, Rhizomueor miehei,Crytoeoceus spp. S-2, Candida parapsilosis e Thermomyees lanuginosus.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a fosfolipase é 60% idêntica auma fosfolipase do grupo consistindo as fosfolipases de Fusarium1A.KnermIIus e Thermnmynes.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a fosfolipase é selecionada de um grupo consistindo asfosfolipases de uma cepa de Fusarium culmorum, Fusarium heterosporum,Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Aspergillus awamori, Aspergillusfoetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae eThermomyces lanuginosus.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o agente quelante é adicionado nafaixa de 0,01-1% peso/peso, preferencialmente 0,04-0,1 % peso/peso baseadono teor de óleo.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o processo é procedido em ummodo de batelada.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o método é procedido em modocontínuo.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as fases da solução da mistura dereação são misturadas em um misturador de alto cisalhamento.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o método é conduzido em ummodo de contra-corrente.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa incluindo asenzimas é reciclada totalmente ou parcialmente na mistura de reação, na quala mistura de reação também contém substrato novo.
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