ES2338605T3 - Monoconjugados especificos de sitio de g-csf. - Google Patents
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Abstract
Derivado monoconjugado, específico de sitio del G-CSF humano, o análogo y/o derivado del mismo, caracterizado porque un residuo de glutamina en una posición que oscila desde 132 hasta 137 de la secuencia de la cadena de polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo está unido covalentemente a un polímero hidrófilo no inmunogénico.
Description
Monoconjugados específicos de sitio de
G-CSF.
En el presente documento se describen
monoconjugados específicos de sitio novedosos del factor estimulante
de colonias de granulocitos (G-CSF), con análogos y
derivados de los mismos, que estimulan la proliferación y
diferenciación de células progenitoras en neutrófilos maduros. Estos
conjugados se han obtenido usando transglutaminasa para unir
covalentemente y de manera específica de sitio, un polímero
hidrófilo, no inmunogénico a un único residuo de glutamina de la
secuencia de polipéptido del G-CSF humano nativo y
análogos del mismo. Estos derivados monoconjugados específicos de
sitio novedosos se recomiendan para uso terapéutico puesto que son
estables en disolución y presentan actividad biológica in
vitro significativa y una semivida en el torrente sanguíneo más
larga, con una actividad farmacológica prolongada en consecuencia,
en comparación con la proteína no conjugada.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor estimulante de colonias de
granulocitos humano (h-G-CSF) es una
glicoproteína de 20 kDa, producida de manera natural por las
células del estroma, macrófagos, fibroblastos y monocitos. Su
producción aumenta con la exposición a endotoxinas y durante la
infección. El G-CSF actúa en la médula ósea, en la
que se une con alta afinidad a los receptores del
G-CSF (G-CSFR), expresados en las
células precursoras de neutrófilos, mediante la inducción de su
proliferación y diferenciación en neutrófilos antiinfecciosos
maduros, pero sin efectos hematopoyéticos significativos sobre
otras líneas celulares hemáticas.
La principal isoforma del G-CSF
nativo es un polipéptido de 174 aminoácidos que tiene cuatro
residuos de cisteína empleados en dos enlaces disulfuro, un residuo
de cisteína libre en la posición 17 y un sitio de glicosilación en
el oxígeno (glicosilación con enlace a O) de la cadena lateral del
residuo de treonina en la posición 133. Se ha notificado que aunque
la glicosilación no es necesaria para establecer un enlace a
receptor eficaz o para la actividad biológica del
G-CSF (N.A. Nicola, "Hemopoietic Cell Growth
Factors and their Receptors", Ann. Rev. Biochem., 58,
45-77, 1989), la presencia de la cadena
O-glicosídica sola mejora la estabilidad física y
enzimática del G-CSF (M. Oh-eda
et al., "O-linked Sugar Chain of Human
Granulocyte Stimulating Factor Protects it against Polymerization
and Denaturation Allowing it to Retain its Biological Activity",
J. Biol. Chem., 265, 11432-11435, 1990;
C.R.D. Carter et al., "Human Serum Inactivates
Non-Glycosylated but not Glycosylated Granulocyte
Colony Stimulating Factor by a Protease Dependent Mechanism:
Significance of Carbohydrates on the Glycosylated Molecule",
Biologicals, 32, 37-47, 2004). La producción
del G-CSF humano mediante técnicas de ingeniería
genética ha conducido al desarrollo de nuevas terapias para tratar
varias clases de neutropenia, tanto primaria como secundaria. En
particular, los compuestos del G-CSF recombinante
se prescriben en el entorno hospitalario para las siguientes
terapias:
- -
- acortamiento de neutropenia y fenómenos infecciosos y febriles relacionados, en pacientes de alto riesgo que se están tratando con fármacos antitumorales mielotóxicos o mieloablación seguida por trasplante de médula ósea;
- -
- movilización de células progenitoras de sangre periférica que van a emplearse en el trasplante de células autólogas, en pacientes sometidos a mielosupresión o mieloablación, seguido posiblemente por trasplante de médula ósea;
- -
- tratamiento de pacientes que presentan neutropenia congénita o idiopática, que muestran una grave reducción de la concentración plasmática de neutrófilos, así como infecciones y fiebre;
- -
- tratamiento de neutropenia e infecciones bacterianas, que se desarrollan en pacientes con infección por VIH en estadio tardío.
\vskip1.000000\baselineskip
El interés particular mostrado en el tratamiento
de pacientes afectados por diferentes tipos de neutropenia con
G-CSF, ha estimulado el desarrollo de compuestos
recombinantes, producidos en sistemas celulares tanto de mamífero
como bacterianos.
De hecho, al menos tres variantes del
G-CSF recombinante se encuentran disponibles en
varios países para su uso terapéutico:
- -
- una forma glicosilada, denominada lenograstim, expresada en células de mamífero y modificada mediante ingeniería como una cadena de polipéptido de 174 aminoácidos idéntica a la cadena de polipéptido de la proteína nativa y que incluye un resto de oligosacárido con enlace a O en el residuo de treonina en la posición 133;
- -
- una forma no glicosilada, denominada filgrastim, expresada en células bacterianas como una cadena de polipéptido de 175 aminoácidos idéntica a la proteína nativa excepto por un residuo de metionilo adicional en el extremo N-terminal (met-G-CSF);
- -
- una forma no glicosilada, denominada nartograstim, expresada en células bacterianas como una cadena de polipéptido de 175 aminoácidos (met-G-CSF) que difiere de la cadena de polipéptido de la proteína nativa en el residuo de metionilo adicional en el extremo N-terminal, así como la sustitución de los residuos Thr 2, Leu 4, Gly 5, Pro 6 y Cys 18 por, respectivamente, residuos de Ala, Thr, Tyr, Arg y Ser.
\vskip1.000000\baselineskip
Un límite, bien conocido en la aplicación
clínica de los diversos derivados del G-CSF
recombinante, es la corta permanencia en circulación en el torrente
sanguíneo tras la administración parenteral, con una semivida
farmacocinética (t_{1/2}) de 3-4 horas. Como
consecuencia, la dosificación de G-CSF recombinante
prescrita, por ejemplo, para reducir el desarrollo de infecciones
en pacientes que tienen tumores no mieloides y que se someten a
quimioterapia mielosupresora, consiste en la administración diaria
de inyecciones subcutáneas de 5 microgramos/kg/día de
G-CSF para la duración del ciclo de quimioterapia,
lo que asciende a 10-14 inyecciones por ciclo.
El perfil farmacocinético del
G-CSF, como con la mayoría de citocinas, está
regulado por un mecanismo de aclaramiento renal no específico y no
saturable (y, en un menor grado, aclaramiento hepático), además de
un mecanismo específico y saturable de internalización y
degradación parcial mediado por células que expresan el receptor de
G-CSF.
Puesto que el aclaramiento renal está
relacionado con el tamaño de la molécula de proteína, una manera de
reducir la ultrafiltración renal consiste en aumentar el tamaño
molecular y/o el volumen hidrodinámico.
Este es un problema muy común en el campo de las
proteínas terapéuticas y se han propuesto varias soluciones, tales
como la fusión de la proteína terapéutica con proteínas
transportadoras (por ejemplo, inmunoglobulinas o albúmina); la
incorporación del principio activo en nano y microesferas de
polímero de liberación retardada; y la conjugación de proteínas
mediante enlace covalente con polímeros de alto peso molecular,
biocompatibles.
En particular, en el área de la conjugación
covalente de proteína-polímero, se ha empleado
extensamente la denominada reacción de pegilación, en la que se une
covalentemente la proteína elegida a una o más cadenas de
poli(etilenglicol) (PEG) lineales o ramificadas, que tienen
un peso molecular que oscila desde 1.000-2.000 Da
hasta 20.000-40.000 Da o incluso superior. En
general, las proteínas pegiladas muestran menores tasas de
aclaramiento renal, así como mayor estabilidad e inmunogenicidad
reducida. Cuando PEG se une adecuadamente a un polipéptido, se
modifican su volumen hidrodinámico y sus propiedades
físico-químicas, mientras que las funciones
biológicas fundamentales, tales como actividad in
vitro o reconocimiento de receptores, pueden permanecer sin
cambios, experimentar una ligera reducción o, en algunos casos,
suprimirse por completo. La conjugación con PEG enmascara la
superficie de la proteína y aumenta su tamaño molecular, de ese modo
disminuyendo la ultrafiltración renal, impidiendo la unión de
anticuerpos o células procesadoras de antígenos y reduciendo la
degradación por enzimas proteolíticas. Finalmente, la conjugación
con PEG confiere las propiedades físico-químicas de
PEG y, por tanto, se modifican de manera similar la biodistribución
y solubilidad de fármacos peptídicos y no peptídicos. Como
alternativa a PEG para la conjugación de la proteína, pueden
emplearse otros polímeros biocompatibles lineales o ramificados,
tales como dextrano, poli(vinilpirrolidona),
poli(acriloilmorfolina) o polisacáridos.
Para un estudio de las técnicas de pegilación
químicas empleadas comúnmente y sus resultados, se hace referencia
a lo siguiente:
- -
- S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995;
- -
- F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito la conjugación covalente del
G-CSF con polímeros biocompatibles, de alto peso
molecular, por ejemplo, en varios artículos científicos y patentes,
algunos de los cuales se resumen brevemente a continuación.
El documento WO 89/06546 describe una variante
genética del G-CSF, conjugada químicamente a cadenas
poliméricas de poli(etilenglicol) o
poli(propilenglicol) que mantiene la actividad biológica y
muestra una semivida en el torrente sanguíneo aumentada.
El documento WO 90/06952 describe una
modificación del G-CSF con cadenas de PEG, mediante
la unión química de los grupos amino y carboxilo de las cadenas
laterales de aminoácidos para producir un conjugado
PEG-G-CSF de semivida larga.
El documento WO 00/44785 describe derivados del
G-CSF, unidos químicamente a 1-15
cadenas poliméricas de PEG en los que se mejoran la estabilidad,
solubilidad y circulación en el torrente sanguíneo tras la
administración in vivo.
El documento EP 0335423 describe conjugados
químicos PEG-G-CSF que muestran
diferentes propiedades estructurales,
físico-químicas y biológicas.
Mientras que los conjugados mencionados
anteriormente, obtenidos principalmente mediante la conjugación no
selectiva con grupos amino o carboxilo del G-CSF,
normalmente son mezclas de isoformas conjugadas, se han
desarrollado conjugados químicos del G-CSF, para
producir derivados de monoconjugados esencialmente específicos de
sitio, tal como se notifica a continuación.
El documento US5985265 describe un método para
la conjugación de compuestos poliméricos con el grupo
\alpha-amino del residuo de aminoácido
N-terminal de una cadena de polipéptido, que puede
obtenerse tanto mediante un enlace amida entre el polímero y la
proteína, como, preferiblemente, mediante un enlace amida entre el
polímero y la proteína a través de una reacción de alquilación
reductora (O. Kinstler et al.,
Mono-N-terminal Poly-(Ethylen
Glycol)-Protein Conjugates, Adv. Drug Deliv.
Rev., 54, 477-485, 2002). Por tanto, la
aplicación de esta tecnología ha permitido el desarrollo de un
met-G-CSF conjugado con un PEG
lineal de 20 kDa en el grupo \alpha-amino del
metionilo N-terminal mediante una reacción de
alquilación reductora a pH 5 con una cadena de
monometoxi-PEG funcionalizada con propionaldehído;
este producto se ha comercializado con la denominación común
internacional de PEG-filgrastim y el nombre de
marca registrada Neulasta® (O. Kinstler et al.,
Characterization and Stability of N-terminally
PEGylated rhG-CSF, Pharmac. Res., 13,
996-1002, 1996).
Otro residuo de proteína, que potencialmente
puede dar lugar a conjugados específicos de sitio, es el grupo tiol
de cisteína, un resto altamente reactivo con moléculas de PEG
funcionalizadas con residuos que forma un enlace covalente con el
radical tiol (M.J. Roberts et al., Chemistry for Peptide and
Protein PEGylation, Adv. Drug Deliv. Rev., 54,
459-476, 2002). Puesto que la mayoría de proteínas
no tienen un residuo de cisteína libre (es decir, no implicado en
un enlace disulfuro), es posible conjugar el polímero y la proteína
de manera específica de sitio mediante la inserción en la cadena de
polipéptido, a través de mutagénesis específica de sitio, un
residuo de cisteína que entonces permitirá la reacción con el
polímero funcionalizado con el grupo reactivo tiol de cisteína, tal
como se describe para una serie de mutantes de G-CSF
(M.S. Rosendahl et al., Site-specific
Protein PEGylation. Application to Cysteine Analogs of Recombinant
Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor,
BioProcess Internat., 3(4), 52-60,
2005). Según un enfoque parcialmente alternativo, el documento WO
2005/099769A2 describe la conjugación de
r-h-G-CSF en el
grupo tiol de cisteína nativo no implicado en enlaces disulfuro
(Cis^{17}), tras la desnaturalización parcial de la proteína, de
modo que el resto -SH libre, de otro modo enmascarado en una cavidad
hidrófoba, queda expuesto al
disolvente.
disolvente.
Así como las diversas técnicas de conjugación
química mencionadas anteriormente, se han descrito procedimientos
enzimáticos, para unir el polímero y la proteína. Éstos se basan en
el empleo de enzimas transglutaminasas, tanto procariotas como
eucariotas, para catalizar la transferencia de un polímero,
funcionalizado con un grupo amino primario, a los grupos acilo de
los residuos de glutamina, presentes de manera natural en la cadena
de polipéptido de interés o insertado mediante reacciones de
mutagénesis específicas de sitio (H. Sato, Enzymatic Procedure for
Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug
Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002).
Por tanto, por ejemplo, ambos documentos
EP785276 y US6010871 describen el uso de una transglutaminasa
microbiana (MTG) para insertar cadenas poliméricas en péptidos y
proteínas con al menos un residuo de glutamina en sus secuencias de
aminoácidos. En estas patentes, aunque se dan ejemplos de la
monosustitución en algunas proteínas modelo, no está claro si las
sustituciones también son específicas de sitio, es decir, si
producen una única forma molecular o una mezcla de isómeros de
posición en la que, aunque monosustituidas, las cadenas poliméricas
se unen a diferentes glutaminas.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de la presente invención se refiere
a derivados de monoconjugado específicos de sitio novedosos del
G-CSF humano y análogos de los mismos para uso
terapéutico, diseñados para superar desventajas comunes
relacionadas con las proteínas farmacéuticamente activas, tales como
altas tasas de aclaramiento y, en consecuencia, semivida en sangre
reducida, susceptibilidad a degradación proteolítica y posibles
respuestas inmunogénicas.
Los derivados monoconjugados específicos de
sitio del G-CSF, objeto de la presente invención, se
han diseñado para minimizar las modificaciones estructurales y
conformacionales en la proteína de modo que se obtiene un derivado
conjugado que presenta un perfil físico-químico
homogéneo y un comportamiento farmacocinético y farmacodinámico
óptimo. Los derivados de monoconjugado específicos de sitio
novedosos, que presentan las propiedades mencionadas anteriormente,
pueden emplearse como equivalentes de larga duración de los
compuestos terapéuticos utilizados normalmente, pero con una
administración menos frecuente (por ejemplo, semanal en lugar de
diaria).
Como consecuencia de este enfoque, los aspectos
para cumplir con los requisitos de los derivados de conjugado de
G-CSF novedosos, objeto de la presente invención
son:
- -
- empleo de una proteína en la reacción de conjugación que tiene una cadena de polipéptido que corresponde a uno de los derivados del G-CSF ya empleado en terapia, puesto que no es necesario introducir mutaciones en la cadena de polipéptido y/o recurrir a la desnaturalización parcial o completa de la cadena de polipéptido;
\newpage
- -
- conjugación con un polímero soluble en agua, lineal o ramificado, biocompatible con un peso molecular que oscila desde 5 kDa hasta 60 kDa;
- -
- empleo de una técnica de conjugación para unir el G-CSF a una única cadena polimérica en un único y específico residuo de aminoácido que a) no es uno de los residuos implicados en la interacción con el receptor, o está próximo a uno, y b) está situado en la cadena de polipéptido en una posición junto a o cerca del residuo de treonina en la posición 133 que, en el G-CSF humano nativo de 174 aminoácidos, está conjugado con una cadena de oligosacárido, o con el residuo de treonina-134 equivalente del derivado de metionil-G-CSF de 175 aminoácidos, o el residuo de treonina equivalente en análogos de G-CSF.
El G-CSF explica sus funciones
tras la interacción con su receptor específico
(G-CSFR), que se expresa principalmente en la
membrana de las células precursoras de neutrófilos, de los
neutrófilos y de algunas líneas celulares de leucemia. La unión del
G-CSF a su receptor (que se produce
estequiométricamente como dos moléculas de G-CSF
por cada dos moléculas del G-CSFR) induce la
dimerización del receptor y activa una cadena de reacciones
intracelulares que estimulan la proliferación celular y la
diferenciación no proliferativa. Hay dos sitios de enlace
principales en las moléculas de G-CSF implicados en
la dimerización del receptor; se han identificado los residuos
implicados en los enlaces con el receptor: residuos de aminoácidos
Lys 40, Phe 144, Val 48 y Leu 49 que pertenecen al sitio de unión 1
y residuos de aminoácidos Glu 9, Leu 15, Asp 112 y Leu 124 que
pertenecen al sitio de unión 2 (J.F. Reidhaar-Olson
et al., Identification of Residues Critical to the Activity
of Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor,
Biochemistry, 35, 9034-9041, 1996; D.C. Young
et al., Characterization of the Receptor Binding
Determinants of Granulocyte Colony Stimulating Factor, Prot.
Sci., 6, 1228-1236, 1997).
En proteínas, los grupos reactivos más empleados
para la conjugación química con cadenas poliméricas son los grupos
\varepsilon-amino de lisina y los grupos
\alpha-amino del aminoácido con
N-terminal de la cadena de polipéptido. En efecto,
aparecen en cada secuencia de proteína con un mayor o menor
porcentaje. En lo que se refiere al G-CSF, hay
varios artículos y patentes que describen la conjugación de PEG
mediante enlace químico con los grupos amino (extremo NH_{2}
terminal y NH_{2} de lisina). Por ejemplo, el documento WO
00/44785 describe conjugados del
G-CSF-PEG con cadenas de PEG unidas
a lisina o al residuo amino N-terminal. Esta
conjugación es posible en el G-CSF puesto que hay
cuatro lisinas (Lys 16, Lys 23, Lys 34, Lys 40) así como un grupo
\alpha-amino libre en el extremo
N-terminal de la cadena de polipéptido y, además,
estos grupos funcionales cargados, normalmente son accesibles para
el disolvente acuoso.
En el caso del G-CSF, el
producto de conjugación química es una mezcla de varios conjugados
que tienen 1-4 cadenas de PEG unidas en diferentes
posiciones, que para poderse elegir para terapia, deben separarse
para aislar el isómero o los isómeros que presentan los mejores
perfiles de actividad, farmacocinéticos y de toxicidad.
Tal como se mencionó anteriormente, existen
técnicas de conjugación química bien conocidas que conducen a la
formación de un único conjugado a través de la denominada
conjugación específica de sitio, que solamente es posible, no
obstante, en el grupo \alpha-amino del aminoácido
N-terminal, en el residuo de cisteína libre de la
molécula del G-CSF nativo, o en los residuos de
cisteína insertados en la cadena de polipéptido mediante
mutagénesis específica de sitio. En el primer caso (tal como se
describe en el documento US5985265 y el compuesto
PEG-filgrastim mencionado anteriormente), la
selectividad de reacción del grupo amino N-terminal
se mejora llevando a cabo la reacción química a un valor pH de
aproximadamente 5: en estas condiciones, los grupos
\varepsilon-amino de lisina sólo son ligeramente
nucleófilos (pKa de aproximadamente 9,5), mientras que el grupo
\alpha-N-terminal todavía es
reactivo y tiene un valor de pKa
inferior.
inferior.
En la conjugación con cisteína mencionada
anteriormente, es necesario modificar la secuencia primaria del
G-CSF mediante la inserción de residuos de cisteína
usando reacciones de mutagénesis específica de sitio (como, por
ejemplo, en M.S. Rosendahl et al., 2005) o recurrir a la
desnaturalización del G-CSF para exponer y hacer
reaccionar la Cys 17 del G-CSF nativo (tal como se
hace referencia a ello, por ejemplo, en el documento WO
2005/099769A2).
En consecuencia, puede suponerse que los
procedimientos de conjugación química convencionales no son
adecuados para preparar derivados monoconjugados específicos de
sitio que presentan las características descritas en la presente
invención.
Para preparar derivados de monoconjugado
específicos de sitio del G-CSF mediante reacciones
de conjugación enzimática catalizadas por transglutaminasa, un
análisis preliminar verificará qué enzimas son de uso potencial y
las propiedades de las mismas, especialmente con respecto a la
especificidad de sustrato.
En mamíferos, las transglutaminasas (TGasas)
están codificadas por una familia de genes, cuyos productos se
agrupan como nueve isoenzimas correlacionadas estructural y
funcionalmente (desde TG-1 hasta
TG-7; factor XIIIA; banda 4,2) expresadas en
diversos tejidos (en particular en tejidos epiteliales, sangre y la
glándula prostática). Catalizan, en presencia de iones Ca^{2+},
reacciones de modificación postraduccional de proteínas
fisiológicas y patológicas (M. Griffin et al.,
Transglutaminases: Nature's Biological Glues, Biochem.
J., 368, 377-396, 2002).
Recientemente, se han descrito TGasas
microbianas aisladas de diferentes microorganismos, que pertenecen
en particular al genero Streptoverticillium spp y
Bacillus spp, ubicándose estas enzimas, respectivamente, a
nivel extracelular y en esporas. Las TGasas microbianas, en
contraposición a las enzimas eucariotas correspondientes, no
requieren la activación de iones Ca^{2+}. Además, las TGasas
microbianas, derivadas de Streptoverticillium spp y
designadas comúnmente como MTG (transglutaminasas microbianas),
también han encontrado aplicaciones en la industria alimentaria
para mejorar la textura de la carne, el queso y sus derivados (P.M.
Nielsen, Reactions and Potential Industrial Applications of
Transglutaminase. Review of Literature and Patent, Food
Biotechnol., 9, 119-156,
1995).
1995).
Tanto las TGasas de mamífero como las
microbianas actúan específicamente sobre los grupos
\gamma-carboxamida aceptores de acilo de los
residuos de glutamina de la cadena de polipéptido. Aunque hasta la
fecha, no se han identificado sitios consenso específicos,
comúnmente se cree que las TGasas microbianas y de mamífero
solamente reconocen residuos de glutamina ubicados en sitios
flexibles y accesibles para el disolvente de la cadena de
polipéptido. Sin embargo, hay indicaciones de que la presencia de
residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales cargadas
positivamente o estéricamente voluminosas, que preceden o siguen a
un residuo de glutamina, pueden influir positivamente en el
reconocimiento de la enzima (P. Cousson et al., Factors that
Govern the Specificity of Transglutaminase-Catalysed
Modification of Proteins and Peptides, Biochem. J., 282,
929-930, 1992; T. Ohtsuka et al., Comparison
of Substrate Specificities of Transglutaminase Using Synthetic
Peptides as Acyl Donors, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64,
2608-2613, 2000). Con respecto al resto donador de
acilo, tanto las TGasas microbianas como de mamífero no son
selectivas. De hecho, no solamente pueden reaccionar con los grupos
\varepsilon-amino de residuos de lisina en las
cadenas de proteína, sino también con aminas genéricas o
alquilaminas alifáticas primarias, con una selectividad específica
por aminas alifáticas primarias en una cadena lineal de al menos
cuatro átomos de carbono (T. Ohtsuka et al., Substrate
Specificities of Microbial Transglutaminase for Primary Amines,
J. Agric. Food Chem., 48, 6230-6233,
2000).
2000).
La transglutaminasa de Streptoverticillium
mobaraense, que puede considerarse un prototipo de las
transglutaminasas microbianas (MTG), es más pequeña que las TGasas
de mamífero. La determinación de la secuencia primaria y la
estructura terciaria de la transglutaminasa anterior (T. Kashiwagi
et al., Crystal Structure of Microbial Transglutaminase from
Streptoverticillium mobaraense, J. Biol. Chem., 277,
44252-44260, 2002) enfatiza las diferentes
estructuras de los aminoácidos alrededor del sitio activo,
deduciéndose que las TGasas microbianas no son tan específicas como
las de mamífero. Basándose en estos estudios estructurales, se ha
supuesto que la especificidad de la transglutaminasa microbiana,
con respecto a los residuos del sustrato de glutamina, es menos
rigurosa que la especificidad de la transglutaminasa de mamífero,
debido a la mayor flexibilidad de la estructura de la proteína que
forma la hendidura del sitio activo. Además, el ser más pequeño
probablemente facilita la interacción de las transglutaminasas
microbianas con el residuo del sustrato de glutamina de la proteína
diana.
En conclusión, según los métodos convencionales
mencionados anteriormente, el requisito principal para los residuos
de glutamina en la cadena de polipéptido de la proteína para ser
posibles sustratos de transglutaminasa microbiana o de mamífero, es
estar ubicados en los dominios de la proteína flexibles y accesibles
para el disolvente o en cadenas de polipéptido expuestas.
Aproximadamente uno de cada diez aminoácidos en la cadena de
polipéptido del G-CSF es una glutamina, para un
total de 17 residuos. Todos estos pueden considerarse supuestos
sustratos de transglutaminasa, aunque, la estructura tridimensional
de la proteína desempeña un papel fundamental en hacer que
solamente algunos de los residuos de glutamina sean accesibles a la
enzima.
Basándose en la estructura tridimensional del
G-CSF, tal como se determinó mediante cristalografía
de rayos X (C.P. Hill et al., The Structure of Granulocyte
Colony-Stimulating Factor and its Relationship to
Other Growth Factors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
5167-5171, 1993), se ha calculado la accesibilidad
para el disolvente en la superficie de la cadena lateral de cada
uno de los 17 residuos de glutamina del G-CSF
empleando una técnica de acoplamiento molecular.
Tal como se muestra en la tabla 1 (en la que la
numeración de los residuos de Gln se refiere al
G-CSF nativo de 174 aminoácidos), seis residuos de
glutamina, en particular, los residuos de Gln en la posición 70,
173, 131, 119, 90 y 11, tienen al menos un 40% de la superficie de
la cadena lateral accesible para el disolvente y pueden, por tanto,
considerarse como los sustratos de transglutaminasa más
probables.
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La secuencia de aminoácidos alrededor de los
sustratos de glutamina (en particular, residuos cargados
positivamente y polares) se ha considerado como un contribuyente en
la determinación del sitio de derivatización (H. Sato, Enzymatic
Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins,
Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002).
Por ejemplo, la pegilación enzimática de IL-2 tiene
lugar de manera selectiva en la posición 74 (-VLNLAQ^{74}SK-). En
el G-CSF, el residuo de Gln 145 (-SAFQ^{145}RRAG),
que es relativamente pequeño, pero todavía una superficie accesible
para el disolvente significativa, puede incluirse en esos criterios
y considerarse otro posible sustrato de TGasa.
En general, el número relativamente alto de
glutaminas que se comportan potencialmente como supuestos sustratos
de TGasa microbiana en la estructura del G-CSF
complicaría la reacción catalizada por TGasa, lo que conduce a un
derivado específico de sitio monoconjugado con un polímero
funcionalizado con grupo amino primario.
Actualmente, se ha descubierto
sorprendentemente, y es el objeto específico de la presente
invención, que cuando el
metionil-G-CSF experimenta una
reacción de conjugación, catalizada por una transglutaminasa
microbiana, con
monometoxi-PEG-amina de 20 kDa, se
obtiene un alto rendimiento del
metionil-G-CSF-PEG20kDa
monoconjugado de manera específica de sitio en el residuo de
glutamina 135.
Los derivados del G-CSF
monoconjugados, biológicamente activos novedosos, se describen en el
presente documento y son uno de los objetos de la presente
invención, en el que una cadena lineal o ramificada de un polímero
hidrófilo no inmunogénico funcionalizado con un grupo amino primario
(por ejemplo, derivados de
monometoxi-PEG-alquil-amina
o monometoxi-PEG-amina o análogos
de los mismos) se une de manera específica de sitio, mediante una
reacción catalizada por la enzima transglutaminasa, a través de un
enlace amida covalente, al resto acilo del único residuo de
glutamina adyacente al residuo de treonina que, en el
G-CSF nativo, está conjugado con una cadena de
oligosacárido.
En particular, los derivados monoconjugados
preparados según la presente invención, se caracterizan por tener
un residuo de glutamina, en una posición que oscila desde 132 hasta
137 y, preferiblemente, desde 132 hasta 134 de la cadena de
polipéptido del G-CSF humano nativo de 174
aminoácidos, unido covalentemente a un polímero hidrófilo no
inmunogénico. Más preferiblemente, el residuo de glutamina en el
G-CSF humano nativo de 174 aminoácidos está
representado por el residuo Gln^{134}, en el
metionil-G-CSF de 175 aminoácidos
está representado por el residuo Gln^{135} y, en el caso de los
mutantes de G-CSF biológicamente activos, están
representados por el residuo de glutamina en una posición
correspondiente en la cadena de polipéptido.
Según una realización de la presente invención,
el polímero soluble en agua se selecciona de
poli(etilenglicoles), poli(oxipropilenos),
copolímeros de bloque de
poli(oxietileno)-poli(oxipropileno),
poli(vinilpirrolidonas), poli(acriloilmorfolinas),
poli(sacáridos) o
aminocarbamil-poli(etilenglicoles) lineales o
ramificados.
Según otra realización de la presente invención,
el polímero hidrófilo es un
monometoxi-polietilenglicol-amina
lineal o ramificado con un peso molecular que oscila desde 5 kDa
hasta 40 kDa, preferiblemente desde 15 kDa hasta 25 kDa, e incluso
más preferiblemente es un
monometoxi-polietilenglicol-amina
lineal con un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. Por
ejemplo, puede ser un
monometoxi-polietilenglicol-amina
lineal de fórmula:
NH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{3}
en la que n oscila desde
aproximadamente 112 hasta 907, preferiblemente desde aproximadamente
339 hasta 566 y, más preferiblemente, es de aproximadamente
453.
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Según otra realización, el polímero hidrófilo es
un aminocarbamil-polietilenglicol con un peso
molecular que oscila desde 5 kDa hasta 40 kDa, preferiblemente
entre 15 y 25 kDa y, más preferiblemente, es de 20 kDa. Por
ejemplo, puede ser un
O-[metil-poli(etilenglicol)]-N-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]-etilcarbamato
de fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
en la que n oscila desde
aproximadamente 109 hasta 904, preferiblemente desde aproximadamente
336 hasta 563, y, más preferiblemente, es de
450.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la presente invención son las
moléculas de G-CSF que presentan una actividad
estimulante sobre la proliferación y diferenciación de células
progenitoras en neutrófilos maduros derivatizados mediante la
reacción enzimática del monoconjugado específico de sitio descrita
en el párrafo anterior y que puede emplearse para el propósito de
la presente invención, incluyendo la molécula de
G-CSF humano nativo de 174 aminoácidos, el
met-G-CSF de 175 aminoácidos, con un
residuo de metionilo adicional en el extremo
N-terminal (filgrastim), u otras variantes análogas
del G-CSF humano, en las que, en comparación con la
secuencia del G-CSF nativo, se han sustituido,
eliminado o añadido de 1 a 15 residuos de aminoácido.
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(Secuencia pasa a página
sigueinte)
\newpage
A continuación se facilitan dos ejemplos de las
secuencias de aminoácidos del G-CSF que pueden
usarse para preparar monoconjugados específicos de sitio según la
presente invención:
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en la que n = 0 ó 1 se refiere,
respectivamente, al G-CSF nativo de 174 aminoácidos
y al met-G-CSF de 175 aminoácidos,
y el residuo de glutamina unido covalentemente al polímero esta en
negrita y
subrayado.
En particular, cuando n = 0, la secuencia es SEQ
ID N.º 1, es decir, la secuencia del G-CSF humano
nativo de 174 aminoácidos; cuando n = 1, la secuencia es SEQ ID N.º
2, es decir el met-G-CSF de 175
aminoácidos con un residuo de metionilo adicional en el extremo
N-terminal que corresponde a filgrastim.
El procedimiento de conjugación enzimática, que
emplea una tranglutaminasa microbiana (por ejemplo, enzima MTG de
Streptoverticillium mobaraense) incluye las siguientes
etapas, mencionadas en el presente documento como ejemplos
ilustrativos:
- A)
- disolución del G-CSF, o análogos o derivados del mismo, en una disolución tampón con un pH que oscila desde 6 hasta 8;
- B)
- adición del polímero hidrófilo, que presenta al menos una función amino primaria (por ejemplo, un metoxi-PEG-amina);
- C)
- adición de la MTG y reacción durante 1-24 horas a una temperatura que oscila entre 15 y 35ºC, preferiblemente 25ºC;
- D)
- purificación de manera opcional del G-CSF monoconjugado específico de sitio, preferiblemente mediante cromatografía en columna.
Según una realización, la enzima se usa en
cantidades que varían entre 1 y 300 mU/mg de G-CSF,
preferiblemente en cantidades de aproximadamente 250 mU/mg, y la
reacción se lleva a cabo durante 1-6 horas.
Según otra realización, la enzima se usa en
cantidades que varían entre 1 y 20 mU/mg de G-CSF,
preferiblemente en cantidades de aproximadamente 10 mU/mg, y la
reacción se lleva a cabo durante 12-24 horas.
La disolución de la proteína puede llevarse a
cabo en un tampón fosfato u otro tampón de pH 6-8, y
preferiblemente a pH 7,4. La reacción puede llevarse a cabo en
presencia de aditivos, tales como NaCl u otras sales inorgánicas u
orgánicas (a una concentración entre 1 y 200 mM) o tensioactivos a
una concentración entre el 0,001 y el 2%.
Cuando se lleva a cabo la reacción usando el
G-CSF de 174 aminoácidos y
PEG-amina-20kDa (tal como se
notifica a continuación en el ejemplo 1) el rendimiento del
derivado monopegilado G-CSF-PEG20kDa
fue superior al
80%.
80%.
La caracterización del derivado conjugado se
llevó a cabo según el análisis de mapeo del péptido. La
secuenciación de los péptidos resultantes confirmó que la
conjugación del G-CSF nativo con el PEG
funcionalizado con un grupo amino tiene lugar de manera selectiva
en el residuo de Gln 134 y produce un monoconjugado específico de
sitio. El derivado del G-CSF, monoconjugado de
manera selectiva en la glutamina 134 tenía una actividad biológica
in vitro significativa y demostrada, en comparación con el
G-CSF nativo y una actividad farmacológica
prolongada tras la administración in vivo.
Además, el
met-G-CSF, monoconjugado de manera
selectiva en la glutamina 135
(met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa)
en comparación con el producto de referencia comercializado
Neulasta® (producido mediante
met-G-CSF monopegilado obtenido
mediante pegilación química en el metionilo
amino-terminal), demostró una mayor actividad
biológica in vitro y un perfil farmacocinético
equivalente.
La especificidad y selectividad de la reacción
de monopegilación, catalizada por la transglutaminasa microbiana,
por el residuo de Gln 134 del G-CSF nativo de 174
aminoácidos o por el residuo de Gln 135 del
metionil-G-CSF de 175 aminoácidos o
por el residuo de Gln correspondiente de los análogos del
G-CSF, se confirmó mediante los estudios de
pegilación llevados a cabo en mutantes de
met-G-CSF, en los que uno o más
residuos de glutamina se habían sustituido a través de mutagénesis
específica de sitio por residuos de asparagina. Los mutantes
expresados en E. coli, purificados hasta al menos el 95%,
mantuvieron la conformación estructural correcta, tal como se
demostró mediante una prueba de actividad biológica in vitro
en comparación con la proteína de referencia no mutada.
La conjugación de PEG, en las mismas condiciones
de reacción, con met-G-CSF y dos
mutantes de los mismos (Gln159Asn y Gln135Asn/Gln159Asn), cuyos
perfiles se muestran en la figura 11, ha confirmado que solamente la
glutamina 135 se comporta como un sustrato de transglutaminasa,
puesto que la sustitución por un residuo de asparagina inhibe
esencialmente la reacción de pegilación de
met-G-CSF.
Además, tanto el G-CSF como los
derivados del mismo, obtenidos mediante conjugación química (por
ejemplo, pegilado), cuando se almacenan en una disolución acuosa,
originan fácilmente agregados solubles o insolubles y, en el caso
de los derivados conjugados, aumenta la inestabilidad en función de
las técnicas de posición y conjugación, de la concentración de la
proteína y las condiciones de almacenamiento (M.J. Treuheit et
al., Inverse Relationship of Protein Concentration and
Aggregation, Pharmac. Res., 19, 511-516,
2002; R.S. Rajan et al., Modulation of Protein Aggregation
by Polyethylene Glycol Conjugation: G-CSF a Case
Study, Prot. Sci., 15, 1063-1075, 2006). Los
nuevos derivados conjugados descritos en la presente invención (por
ejemplo, el derivado pegilado en la Gln 134 del
G-CSF nativo de 174 aminoácidos) se mantuvieron
estables frente a la agregación, tanto a concentraciones de 5 mg/ml
como a 10 mg/ml, en presencia y ausencia de un tensioactivo.
Otro objeto de la presente invención incluye las
formulaciones farmacéuticas de los derivados del
G-CSF, y análogos de los mismos, monoconjugados en
un único y específico residuo de glutamina en polímeros hidrófilos
no inmunogénicos, que puede incluir una disolución estéril lista
para usar o un polvo liofilizado estéril que ha de reconstituirse
para su uso con un disolvente apropiado.
En el primer caso (disolución estéril lista para
usar), así como los derivados conjugados del G-CSF
(por ejemplo, el derivado mono-pegilado conjugado
con Gln^{134} del G-CSF nativo) a una
concentración que oscila desde 1 hasta 10 mg/ml, preferiblemente
desde 5 hasta 10 mg/ml, también puede incluirse un agente isotónico
seleccionado, por ejemplo, de azúcares tales como sacarosa,
lactosa, manitol o sorbitol y un agente de tamponamiento adecuado,
para controlar el pH de la disolución hasta 4 ó 5 (preferiblemente
5). Otro componente de esta formulación puede ser opcionalmente un
tensioactivo no iónico, tal como Tween 20 o Tween 80.
En el caso de una formulación de polvo
liofilizado estéril que ha de reconstituirse para su uso, uno de
estos componentes puede ser un agente de carga tal como manitol,
trehalosa, sorbitol o glicina y, si es necesario, un crioprotector,
tal como trehalosa o manitol. El disolvente para la reconstitución
puede ser agua para compuestos inyectables, con o sin una sal de
tamponamiento para controlar el pH hasta de 4 a 5.
Para los propósitos de la presente
invención:
- -
- la expresión "homólogo del G-CSF" se refiere a cualquier proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos del G-CSF humano nativo de 174 aminoácidos. Las variaciones de la secuencia de aminoácidos de los homólogos del G-CSF pueden deberse a la adición, sustracción, sustitución o modificación química de uno o más aminoácidos de la secuencia humana nativa de 174 aminoácidos;
- -
- la expresión "análogo del G-CSF humano" se refiere a un polipéptido que presenta la actividad del G-CSF humano nativo para estimular la proliferación y diferenciación de células progenitoras en neutrófilos maduros, cuya secuencia de aminoácidos es según la SEQ ID N.º 1, pero en la que se han eliminado desde 1 hasta 15 aminoácidos o se han sustituido por otros aminoácidos;
- -
- la expresión "derivado del G-CSF humano" se refiere a un polipéptido que presenta la actividad del G-CSF humano nativo para estimular la proliferación y diferenciación de células progenitoras en neutrófilos maduros, cuya secuencia de aminoácidos se notifica en la SEQ ID N.º 2, pero en la que uno o más aminoácidos de la secuencia están unidos a otras moléculas; ejemplos representativos de los derivados del G-CSF son el G-CSF glicosilado, filgrastim, específicamente el polipéptido en la SEQ ID N.º 2 que tiene un residuo de metionilo en el extremo N-terminal; las expresiones mencionadas anteriormente no son mutuamente excluyentes puesto que los análogos del G-CSF, en los que uno o más aminoácidos están unidos a otras moléculas, también pueden emplearse para los propósitos de la presente invención;
- -
- la expresión "no inmunogénico" se refiere a los polímeros empleados para la reacción de conjugación enzimática e implica que los mismos polímeros, cuando se administran a través de la vía sistémica no inducen la activación del sistema inmunitario, ni producen significativamente anticuerpos anti-polímero específicos.
Las realizaciones preferidas de la presente
invención se ilustran a continuación mediante, pero sin limitarse a
los siguientes ejemplos.
Se disolvió
rec-G-CSF no glicosilado, expresado
en E.coli, en tampón dihidrogenofosfato de potasio 10 mM a
pH 7,4 hasta una concentración de 1 mg/ml de proteína, que
corresponde a aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras añadir transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) a una concentración de 0,024 U/ml
de disolución de reacción, se incubó la disolución de proteína
durante 16 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Tras
completar la reacción, se diluyó la disolución usando tampón
acetato de sodio 20 mM a pH 4,0 y se purificó mediante cromatografía
en columna (CM Sepharose), eluyendo con una gradiente lineal (NaCl
desde 0 hasta 500 mM en 15 volúmenes de columna). Un conjunto de las
fracciones que contienen el G-CSF monopegilado se
concentró y se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex
G-25, eluida usando tampón acetato de sodio 20 mM a
pH 4,0.
Al final del procedimiento, se obtuvo un
derivado monopegilado de manera selectiva en el residuo Gln 134
(rec-h-G-CSF-Gln^{134}-PEG20kDa)
a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, en tampón acetato
de sodio 20 mM a pH 4,0.
En cada etapa de preparación y purificación, se
analizó una muestra en una columna de SE-HPLC para
determinar el rendimiento de la reacción, el grado de purificación
y la concentración de proteína. Los cromatogramas de la mezcla de
reacción al inicio, tras 16 horas de incubación a temperatura
ambiente y del derivado purificado, monopegilado en la posición
134, se muestran respectivamente en las figuras 1, 2 y 3.
Se hidrolizó un compuesto
rec-h-G-CSF-Gln^{134}-PEG20kDa
purificado enzimáticamente usando la endoproteinasa GluC. Se incubó
a pH 8,8 durante 18 horas a una temperatura de 37ºC en tampón
NH_{4}HCO_{3} 120 mM.
Tras la digestión, se analizó la mezcla de
péptidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, que
separó tres bandas electroforéticas (véase la figura 4): (I) la
migración que corresponde a las proteínas con un peso molecular
menor que 4.000 Da; (II) la migración que corresponde a las
proteínas con un peso molecular de aproximadamente 40.000 Da; (III)
la migración que corresponde a las proteínas con un peso molecular
de aproximadamente 60.000 Da. La última es el residuo de la
proteína pegilada no hidrolizada, que tiene un peso molecular
calculado de 38.798 Da (20.000 + 18.798). Su migración hasta un peso
molecular mayor debe atribuirse al impedimento de PEG20kDa, que
corresponde a una proteína globular de tamaño doble (40 kDa). La
banda II presenta una reacción positiva fuerte tras el tratamiento
con yoduro de bario, indicando así la presencia de péptidos
pegilados.
La banda II se sometió a inmunotransferencia de
tipo Western sobre una membrana de PVDF y se analizó usando la
degradación de Edman automática para determinar la secuencia de
aminoácidos (véase la tabla 2).
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A partir de los resultados mostrados
anteriormente, puede deducirse sin lugar a dudas que la pegilación
se produce específicamente en los péptidos Leu^{124} -
Ala^{141} que resultan de la hidrólisis con endoproteinasa GluC
y, más específicamente, en el residuo Gln^{134}, que corresponde
al 11º aminoácido de la secuencia N-terminal de
péptidos Leu^{124} - Ala^{141}.
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Se disolvió cada mutante no glicosilado,
expresado en E.coli, en una disolución de dihidrogenofosfato
de potasio 10 mM a pH 7,4 y a una concentración de 1 mg de
proteína/ml, que corresponde a aproximadamente 53 \muM. Después
se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras añadir transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) a una concentración de 0,024 U/ml
de disolución de reacción, la disolución de proteína se incubó
durante 16 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se
analizó una alícuota de la mezcla de reacción en una columna de
SE-HPLC al comienzo y al final de la reacción para
determinar el rendimiento y la concentración de proteína.
El hecho de que el mutante doble
Gln159Asn/Gln135Asn no produjera ningún producto pegilado, a
diferencia del mutante simple Gln159Asn, significa que la
conjugación se lleva a cabo específicamente en la glutamina en la
posición 135 y confirma los datos de secuencia de aminoácidos
mostrados anteriormente. Los cromatogramas de la mezcla de reacción
al inicio y tras 16 horas de incubación a temperatura ambiente se
muestran respectivamente en las figuras
5 y 6.
5 y 6.
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Se disolvió
rec-G-CSF no glicosilado, expresado
en E.coli, en tampón Tris 100 mM a pH 7,5 hasta una
concentración de 1 mg de proteína/ml, que corresponde a
aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras la adición de la
transglutaminasa de cobaya (Sigma) hasta una concentración de 0,3
U/ml de disolución de reacción y CaCl_{2} 10 mM, se incubó la
disolución de proteína durante 16 horas a temperatura ambiente con
agitación suave. Se analizaron las muestras de la mezcla de reacción
en una columna de SE-HPLC al comienzo y al final de
la reacción para determinar el rendimiento y la concentración de
proteína.
Tal como se esperaba, esta enzima no produjo
ningún conjugado de PEG.
Los cromatogramas de la mezcla de reacción al
inicio y tras 16 horas de incubación a temperatura ambiente se
muestran respectivamente en las figuras 7 y 8.
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Se disolvió
rec-G-CSF no glicosilado, expresado
en E.coli, en tampón Tris 100 mM a pH 7,5 a una concentración
de 0,5 mg de proteína/ml, que corresponde a aproximadamente 26,5
\muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras la adición de la
transglutaminasa de queratinocito humano (transglutaminasa de
queratinocito humano recombinante, N-Zyme) hasta
una concentración de 0,5 U/ml de disolución de reacción y CaCl_{2}
10 mM, se incubó la disolución de proteína durante 16 horas a
temperatura ambiente con agitación suave. Se analizó una alícuota
de la mezcla de reacción en una columna de SE-HPLC
al comienzo y al final de la reacción para determinar el
rendimiento y la concentración de proteína.
Tal como se esperaba, esta enzima no produjo
ningún conjugado de PEG.
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Se sometió a prueba in vitro la actividad
biológica de
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa
con un ensayo de proliferación que empleaba la línea celular
mieloblástica murina M-NFS60, que aumenta su
actividad de proliferación en presencia de G-CSF
(N. Shirafuji et al., A New Bioassay for Human Granulocyte
Colony-Stimulating Factor Using Murine Myeloblastic
NFS-60 Cells as Targets and Estimation of Its Level
in Sera from Normal Healthy Persons and Patients with Infectious
and Haematological Disorders, Exp. Hematol., 17,
116-119, 1989).
Se distribuyeron las células
M-NFS60 en placas de 96 pocillos a una concentración
de 10^{4} células/pocillo en 200 \mul de medio de cultivo (RPMI
1640, FBS al 10%) que contienen concentraciones crecientes de
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa
(1-30 ng/ml), G-CSF convencional
(0,001-5 ng/ml) y
met-G-CSF pegilado de manera
N-terminal
(1-30 ng/ml).
(1-30 ng/ml).
Se incubaron las placas a 37ºC en una atmósfera
de CO_{2} al 5%. Tras 48 horas, se añadieron 20 \mul del
reactivo WST1 y la incubación continuó durante 4 horas más en las
mismas condiciones.
Se midió la adsorbancia de las muestras en el
intervalo de longitud de onda de 420-480 nm frente a
un fondo (blanco) usando un lector de microplacas de ELISA. Se
calculó la actividad biológica de las muestras sometidas a prueba
usando curvas de proliferación patrón y se expresó como un valor de
CE_{50} (concentración que estimula el 50% del crecimiento
máximo).
Los resultados del ensayo se muestran en la
tabla 3 y en la figura 9.
Los resultados demostraron que el derivado
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa,
monoconjugado con glutamina 135, tenía una actividad residual in
vitro de aproximadamente el 20% de la proteína nativa,
ligeramente mayor que la del
h-G-CSF pegilado de manera
N-terminal
(met-G-CSF-NH-PEG20kDa).
Este experimento examinó el efecto de larga
duración de
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa,
monopegilado de manera selectiva en glutamina 135, administrado por
vía subcutánea a ratas, mediante la evaluación del tiempo de los
niveles séricos de proteína.
Se les inyectaron por vía subcutánea en el lomo
a tres grupos de 4 ratas macho Sprague-Dawley, con
300-350 g de peso, G-CSF nativo,
G-CSF pegilado de manera N-terminal
(met-G-CSF-NH-PEG20kDa)
y
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa.
Cada uno de los cuatro animales en el primer
grupo recibió una dosis de 0,1 mg/kg de G-CSF,
disuelto en una solución salina tamponada a pH 5 que contiene
tampón acetato 10 mM.
A cada uno de los cuatro animales en el segundo
grupo, se le administró
met-G-CSF-NH-PEG20kDa
(disuelto en una solución salina tamponada a pH 5 que contiene
tampón acetato 10 mM) en la dosis de 0,1 mg/kg, calculado como
equivalente de G-CSF.
A cada uno de los cuatro animales en el tercer
grupo, se le administró
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa
(disuelto en una solución salina tamponada a pH 5 que contiene
tampón acetato 10 mM) en la dosis de 0,1 mg/kg, calculado como
equivalente de G-CSF.
Inmediatamente, tras la administración y tras 1,
2, 4, 8, 24, 32, 48 y 72 horas, se tomaron muestras de sangre de
0,5 ml. Se procesó la muestra de sangre para obtener sueros que se
sometieron a prueba con un ensayo inmunitario de proteína ELISA
(Kit ELISA: kit de ensayo del G-CFS humano; cód.
JP27131; IBL Co. Ltd.), usando
h-G-CSF como patrón para los sueros
obtenidos de ratas a las que se les había administrado
h-G-CSF,
met-G-CSF-NH-PEG20kDa
como patrón para los sueros obtenidos de las ratas en el segundo
grupo y
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa
como patrón para la dosificación de sueros de ratas para las ratas
tratadas con
met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa.
Usando los valores de concentración en suero, se
calcularon los perfiles farmacocinéticos tal como se notifica en la
figura 10, y se determinaron el AUC (área bajo la curva), T_{máx}
y C_{máx} (tiempo y concentración máximos) y T_{1/2}
(semivida). Los resultados se muestran en la tabla 4.
Se disolvió
rec-met-G-CSF
(filgrastim) no glicosilado, expresado en E.coli, en
dihidrogenofosfato de potasio 10 mM a pH 7,4 hasta una
concentración de 1 mg de proteína/ml, que corresponde a
aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras añadir transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) hasta una concentración de 0,024
U/ml de disolución de reacción, se incubó la disolución de proteína
durante 16 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Al
final de la reacción, se diluyó la disolución con tampón acetato de
sodio 20 mM a pH 4,0 y se purificó mediante cromatografía en columna
(CM Sepharose), eluyendo con una gradiente lineal (NaCl desde 0
hasta 500 mM en 15 volúmenes de columna). Un conjunto de las
fracciones que contienen G-CSF monopegilado se
concentró y se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex
G-25, eluyendo con un tampón acetato de sodio 20 mM
a pH 4,0.
Al final del procedimiento, se monopegiló el
derivado de manera selectiva en el residuo Gln 135
(rec-h-met-G-CSF-Gln^{135}-PEG20kDa)
a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en tampón acetato de
sodio 20 mM a pH 4,0.
Se analizaron las muestras en cada etapa de la
preparación y purificación, en una columna de
SE-HPLC para determinar el rendimiento de la
reacción, el factor de purificación y la concentración. Los
cromatogramas de la mezcla de reacción al inicio, tras 16 horas de
incubación a temperatura ambiente y del derivado purificado,
monopegilado en la posición 135 (Glu135), se muestran
respectivamente en las figuras 12, 13 y 14.
Se disolvió el mutante de
met-G-CSF Gln135Asn no glicosilado,
expresado en E.coli, en tampón dihidrogenofosfato de potasio
10 mM a pH 7,4 hasta una concentración de 1 mg de proteína/ml, que
corresponde a aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras añadir transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) hasta una concentración de 0,024
U/ml de disolución de reacción, se incubó la disolución de proteína
durante 16 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se
analizaron las muestras de la mezcla de reacción en una columna de
SE-HPLC al comienzo y al final de la reacción para
determinar el rendimiento y la concentración de proteína.
Los cromatogramas registrados antes del inicio
de la reacción (figura 15) y aquellos registrados tras 16 horas
(figura 16) se caracterizaron porque tienen un pico con un tiempo de
retención que corresponde a la proteína no conjugada: por tanto, el
mutante Gln135Asn no se pegiló.
Se disolvió el mutante
Gln135Asn-Thr134Gln no glicosilado, expresado en
E.coli, en tampón dihidrogenofosfato de potasio 10 mM a pH
7,4 hasta una concentración de 1 mg de proteína/ml, que corresponde
a aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Tras añadir transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) hasta una concentración de 0,024
U/ml de disolución de reacción, se incubó la disolución de proteína
durante 16 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se
analizaron las muestras de la mezcla de reacción en una columna de
SE-HPLC al comienzo y al final de la reacción para
determinar el rendimiento y la concentración de proteína. El
rendimiento de pegilación calculado para el mutante
met-G-CSF-Gln134-PEG20kDa
es del 60%.
Los cromatogramas para las muestras tomadas
antes de iniciar la reacción (figura 17) presentaron un solo pico
que corresponde a la proteína. Tras 16 horas de incubación a 25ºC se
observó un nuevo pico que tenía un tiempo de reacción más corto
(por tanto mayor PM), tal como se muestra mediante el cromatograma
para una muestra tomada al final de la reacción (figura 18).
Este ejemplo muestra que es posible obtener de
manera cuantitativa la pegilación de filgrastim tras solamente 2
horas de tiempo de reacción, usando MTGasa en una razón de 250 mU de
MTGasa/mg de filgrastim.
Se disolvió
rec-met-G-CSF no
glicosilado (filgrastim), expresado en E.coli, en tampón
dihidrogenofosfato de potasio 10 mM a pH 7,4 hasta una
concentración de 1 mg de proteína/ml, que corresponde a
aproximadamente 53 \muM. Después se añadió
monometoxi-poli(etilenglicol)-amina
de 20 kDa (metoxipoli(etilenglicol)-amina
20000, Fluka) a la disolución de proteína hasta una razón molar de
PEG:G-CSF 10:1. Después se añadió transglutaminasa
microbiana (Activa WM, Ajinomoto) a la mezcla de reacción a una
concentración de 0,25 U/ml de disolución de reacción. La reacción
se llevó a cabo con agitación suave durante 2 horas a temperatura
ambiente. Las muestras se tomaron y se analizaron en una columna de
SE-HPLC para determinar el rendimiento de la
reacción. Los cromatogramas de la mezcla de reacción al inicio y
tras 2 horas a temperatura ambiente se muestran respectivamente en
las figuras 19 y 20.
Figura 1: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y G-CSF en
presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Figura 2: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y G-CSF en
presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tras 16 horas a
temperatura ambiente.
Figura 3: Cromatograma SE-HPLC
de G-CSF pegilado en Gln^{134} tras la
purificación.
Figura 4: Electroforesis en gel de
G-CSF hidrolizado con V8 pegilado en Gln^{134} con
PEG20kDa.
Figura 5: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF (Gln
135 \rightarrow Asn 135) en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
135 \rightarrow Asn 135) en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Figura 6: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF (Gln
135 \rightarrow Asn 135) en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tras 16 horas a temperatura ambiente.
135 \rightarrow Asn 135) en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tras 16 horas a temperatura ambiente.
Figura 7: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y G-CSF en
presencia de transglutaminasa no microbiana (de cobaya y
queratinocitos humanos), tiempo = 0.
Figura 8: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y G-CSF en
presencia de transglutaminasa no microbiana (de cobaya y
queratinocitos humanos), tras 16 horas a temperatura ambiente.
Figura 9: Actividad biológica in vitro:
curvas de proliferación de las células M-NFS60.
Figura 10: Perfiles farmacocinéticos en
ratas.
Figura 11: Cinética pegilada de
met-G-CSF,
met-G-CSF Gln159Asn y
met-G-CSF Gln159Asn/Gln135Asn.
Figura 12: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y
met-G-CSF (filgrastim) en presencia
de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Figura 13: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y
met-G-CSF (filgrastim) en presencia
de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 16 horas.
Figura 14: Cromatograma SE-HPLC
de
met-G-CSF-Gln135-PEG20kDa
(filgrastim-Gln135-PEG20kDa) tras la
purificación.
Figura 15: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF
Gln135Asn en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Gln135Asn en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Figura 16: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF
Gln135Asn en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 16 horas.
Gln135Asn en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 16 horas.
Figura 17: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF
Gln135Asn-Thr134Gln en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Gln135Asn-Thr134Gln en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 0.
Figura 18: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y el mutante de
met-G-CSF
Gln135Asn-Thr134Gln en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 16 horas.
Gln135Asn-Thr134Gln en presencia de transglutaminasa microbiana (MTG), tiempo = 16 horas.
Figura 19: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y
met-G-CSF (filgrastim) en presencia
de transglutaminasa microbiana (250 mU/mg de proteína), tiempo =
0.
Figura 20: Cromatograma SE-HPLC
de la mezcla de reacción de PEG20kDa y
met-G-CSF (filgrastim) en presencia
de transglutaminasa microbiana (250 mU/mg de proteína), tiempo = 2
horas.
<110> BIO-KER SRL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Monoconjugados específicos de sitio
de G-CSF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 071g40e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> MI2006A001624
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 11/08/2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mamífero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
metionil-G-CSF de 175 aminoácidos
con un residuo metionilo adicional en el extremo
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (24)
1. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF humano, o análogo y/o derivado del mismo,
caracterizado porque un residuo de glutamina en una posición
que oscila desde 132 hasta 137 de la secuencia de la cadena de
polipéptido del G-CSF de 174 aminoácidos humano
nativo está unido covalentemente a un polímero hidrófilo no
inmunogénico.
2. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF humano según la reivindicación 1,
caracterizado porque el residuo de glutamina está en una
posición que oscila desde 132 hasta 134 de la cadena de polipéptido
del G-CSF de 174 aminoácidos humano nativo o en una
posición que oscila desde 133 hasta 135 de la cadena de polipéptido
del derivado Met-G-CSF de 175
aminoácidos o en una posición correspondiente de una cadena de
polipéptido homóloga del G-CSF.
3. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF humano según la reivindicación 1,
caracterizado porque el residuo de glutamina está en la
posición 134 de la cadena de polipéptido del G-CSF
de 174 aminoácidos humano nativo o en la posición 135 de la cadena
de polipéptido del derivado
Met-G-CSF de 175 aminoácidos o en
una posición correspondiente de una cadena de polipéptido homóloga
del G-CSF.
4. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero hidrófilo de conjugación
está funcionalizado con al menos un grupo amino.
5. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero hidrófilo se selecciona
entre polietilenglicoles, polioxipropilenos, copolímeros de bloque
polioxietileno-polioxipropileno,
polivinilpirrolidonas, poliacriloilmorfolinas, polisacáridos,
polietilenglicoles de aminocarbamilo lineales o ramificados.
6. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero hidrófilo es una
monometoxi-polietilenglicol-amina
lineal o ramificada que tiene un peso molecular que oscila desde 5
kDa hasta 40 kDa, preferiblemente desde 15 kDa hasta 25 kDa, más
preferiblemente de aproximadamente
20 kDa.
20 kDa.
7. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polímero hidrófilo es un
aminocarbamil-polietilenglicol que tiene un peso
molecular que oscila desde 5 kDa hasta 40 kDa, preferiblemente
desde 15 kDa hasta 25 kDa.
8. Derivado monoconjugado, específico de sitio
del G-CSF humano según la reivindicación 1,
caracterizado por tener una secuencia de aminoácidos que
corresponde a SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 2.
9. Formulación que contiene al menos un derivado
monoconjugado específico de sitio del G-CSF humano
y/o un análogo y/o un derivado del mismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, junto con coadyuvantes y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables.
10. Formulación según la reivindicación 9,
caracterizada por estar en disolución o como polvo
liofilizado.
11. Formulación según la reivindicación 9,
caracterizada por poder administrarse por vía parenteral.
12. Uso de al menos un derivado monoconjugado
específico de sitio según las reivindicaciones 1 a 8, para la
preparación de una formulación farmacéutica para tratar y/o
prevenir la neutropenia y/o para movilizar células progenitoras
hematopoyéticas de sangre periférica de mamífero.
13. Procedimiento para la preparación de un
derivado monoconjugado, específico de sitio según las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende
conseguir una reacción de enlace amida entre el residuo de glutamina
y el polímero hidrófilo no inmunogénico en presencia de una enzima
de actividad transglutaminasa.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha enzima es de origen
bacteriano.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque dicha enzima es la transglutaminasa de
Streptoverticillium mobaraense.
16. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo en una
solución salina tamponada a un pH que oscila entre 6 y 8,
preferiblemente a aproximadamente 7,4.
17. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo durante 1
- 24 horas.
\newpage
18. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha enzima se usa en cantidades que
varían entre 1 y 300 mU/mg de G-CSF o análogo y/o
derivado del mismo, preferiblemente en cantidades de aproximadamente
250 mU/mg, y porque dicha reacción se lleva a cabo durante 1 - 6
horas.
19. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha enzima se usa en cantidades que
varían entre 1 y 20 mU/mg de G-CSF o análogo y/o
derivado del mismo, preferiblemente en cantidades de aproximadamente
10 mU/mg, y porque dicha reacción se lleva a cabo durante 12 - 24
horas.
20. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo a una
temperatura que oscila desde 15 hasta 35ºC, preferiblemente a
aproximadamente 25ºC.
21. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo en
presencia de sales inorgánicas u orgánicas y/o en presencia de
tensioactivos.
22. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque dichas sales inorgánicas y/u orgánicas
están presentes en una concentración que varía entre 0 y 200 mM y
dichos tensioactivos están presentes en una concentración que varía
entre el 0 y el 2%.
23. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque dicha sal inorgánica es NaCl.
24. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha enzima y/o dicho
G-CSF o un análogo y/o derivado del mismo son de
origen recombinante.
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