BRPI0611194B1 - Moléculas de ligação anti-cd16 - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD16. A presente invenção se refere a moléculas de ligação que se ligam especificamente ao receptor Fc gama humano expressão sobre a superfície de células assassinas naturais (NK) e macrófagos (isto é, FcyRIIIA) e, em particular, moléculas de ligação que se ligam especificamente à forma A de FcyRIII, mas não se ligam à forma B de FcyRIII, bem como ao uso de tais moléculas de ligação no diagnóstico e tratamento de doenças. A invenção ainda se estende a polinucleotídeos que codificam tais moléculas de inibição, células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos e métodos de produção de moléculas de ligação da invenção usando tais células hospedeiras.

Description

A presente invenção se refere a moléculas de ligação que se ligam especificamente ao receptor Fc gama III humano expresso sobre a superfície de células assassinas naturais (NK) e macrófagos (isto é, FcyRIIIA) e, em particular, moléculas de ligação que se ligam especificamente à forma A de FcyRIII, mas não se ligam à forma B de FcyRIII, bem como ao uso de tais moléculas de ligação no diagnóstico e tratamento de doenças. A invenção ainda se estende a polinucleotídeos que codificam tais moléculas de ligação, células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos e métodos de produção de moléculas de ligação da invenção usando tais células hospedeiras.

CD16 (também conhecido como FcyRIII) , um receptor de baixa afinidade pela porção Fc de algumas IgGs conhecido por estar envolvido em citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC), é o receptor de membrana melhor caracterizado responsável por disparar a lise de células alvo por células NK (Mandelboim et al., 1999, PNAS 96: 5640-5644). Células NK humanas compreendem aproximadamente 15% de todos os linfócitos e são definidas fenotipicamente por sua expressão de CD56 e falta de expressão de CD3 (Robertson e Ritz, 1990, Blood 76: 2421-2438). A maioria (aproximadamente 90%) das células NK humanas expressam CD56 em baixa densidade (CD56dira) e FcyRIII (CDlβ) em urn alto nível (Cooper et al., 2001, Trends Immunol. 22: 633-640). FcyRIII humano existe como duas isoformas, FcyRIIIA e FcyRIIIB, que compartilham 96% de identidade de sequência em suas regiões de ligação de imunoglobulina extracelulares (van de Winkel e Capei, 1993, Immunol. Today 14(5): 215221) .

FcyRIIIA é expresso sobre macrófagos, mastócitos e células NK como um receptor transmembrana. Sobre células NK, a cadeia alfa do FcyRIIIA se associa com o motivo de ativação de imunoreceptores baseados em tirosina (ITAM) contendo uma cadeia y de FcεRI e/ou a cadeia Ç do receptor de células T (TCR)/CD3 para mediar a sinalização (Wirthmueller et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1381-1390). A interação de FcyRIIIA com diferentes combinações de homo- e hetero-dímeros das cadeias y e Ç foi observada em células NK, oferecendo a possibilidade de diferentes vias de sinalização através de variações do complexo de FcyRIIIA em células NK (Anderson et al., 1990, PNAS 87(6): 2274-2278; Ackerly et al., 1992, Int. J. Cancer Suppl. 7: 11-14).

FcyRIIIB está presente sobre granulócitos polimorfonucleares (PMN) como um receptor ancorado em glicosil-fosfatidilinositol (GPI) (isoforma FcyRIIIB), a qual não pode disparar a morte de células tumorais (van de Winkel e Capel, 1993, supra) . Além disso, FcyRIIIB existe 5 como um receptor solúvel no soro e, quando ligado a anticorpos, pode disparar efeitos colaterais através da formação de complexos imunes in vivo.

Foi mostrado que células efetoras expressando FcyR estão envolvidas na destruição de células tumorais via 10 ADCC. Isso levou ao desenvolvimento de várias abordagens imunoterapêuticas à terapia do câncer, as quais envolvem o uso de atividades de FcyR, por exemplo, anticorpos monoclonais específicos a tumores podem mediar a destruição de células tumorais através de ADCC induzida via ligação 15 aos FcyRs, e moléculas biespecíficas com uma especificidade por células tumorais e a outra especificidade por ou um FcyRI sobre granulócitos ou FcyRIII sobre células NK também foram desenvolvidas em esforços para melhorar o recrutamento de células efetoras (van Spriel et al., 2000 20 Immunol. Today, 21: 391-397).

Como mediadores celulares de imunidade inata, células NK são assassinas celulares profissionais e, diferente das células T, tendem a existir em estados constitutivamente ativados não requerendo (pré)estimulação adicional. Em contraste, células T citotóxicas em repouso requerem ativação através da ligação de um complexo de antígeno-MHC e subsequente co-estimulação via CD28. Assim, dentre as células efetoras imunes, a célula NK é um dos candidatos mais atraentes para uso em imunoterapia e anticorpos biespecíficos com especificidade pelo CD16 (FcyRIII) e HER- 2/neu ou CD16 e CD3 0 foram desenvolvidos (Arndt et al., 1999 Blood 94: 2562-2568; McCall et al. , 2001 J. Immunol. 166: 6112-6117).

A maioria dos anticorpos anti-CD16 que têm sido produzidos até o momento são incapazes de distinguir entre as duas isoformas de CD16, FcyRIIIA e FcyRlIIB, com as exceções sendo anticorpo monoclonal (MAb) 1D3, o qual se liga apenas à forma de CD16 expressa sobre neutrófilos, isto é, FcyRlIIB, e os anticorpos monoclonais os quais reconhecem diferentes formas alotípicas de FcyRlIIB (Ory et al., 1989, J. Clin. Invest. 83: 1676-81; Huizinga et al., 1990 Blood 75: 213-7; Tamm & Schmidt 1996, J. Immunol. 1996, 157: 1576-1581). Contudo, até o momento, não existem exemplos de moléculas que se ligam especificamente ao FcyRIIIA, a forma expressa sobre células NK, e não ao FcyRlIIB.

Um anticorpo específico para FcyRIIIA, contudo, seria particularmente útil como um componente de uma molécula de ligação bi ou multiespecífica que é dirigida contra células associadas à doença, uma vez que ele recrutaria principalmente células NK e não se ligaria ao FcyRIIIB solúvel em circulação ou divergiria da ligação à célula NK para ligação a neutrófilos ou eosinófilos ativados. Para mediar eficazmente a morte por células NK, o anticorpo FcyRIIIA-específico deve não apenas se ligar à células NK, mas também ativar as mesmas quando ligado a elas.

Nós identificamos vários novos scFvs anti-CD16, os quais exibem essa propriedade útil, isto é, eles têm especificidade pelo FcyRIIIA, eles não se ligam com especificidade ao FcyRIIIB e eles também são capazes de ativar células NK quando ligados a elas.

Sabe-se também que FcyRIIIA exibe vários polimorfismos alélicos, em particular nas posições 48 e 158 do domínio de ligação à IgG. Foi mostrado que anticorpos anti-CD16 previamente descritos se ligam com diferentes afinidades às diferentes formas polimórficas de FcyRIIIA e o trabalho de Koene et al. (1997, Blood 90: 1109-1114) atribui a diferença na ligação de alguns desses anticorpos ao polimorfismo na posição 158. Uma vez que as frequências genéticas do alelo FcyRIIIA158F e do alelo FcyRIIIA1S8V são de aproximadamente 0,6 e 0,4, respectivamente, seria vantajoso para qualquer anticorpo anti-CD16A reconhecer ambas as formas alélicas, para assegurar que, em qualquer dado paciente, o anticorpo anti-CD16A seria capaz de se ligar e ativar a população de células NK.

É descrito aqui um scFv anti-CD16A o qual reconhece ambos FcyRIIIA158P e FcyRIIIA1587 com afinidade aproximadamente igual, mas o qual não se liga ao FcyRIIIB.

Os novos scFvs descritos aqui podem, assim, ser usados para produzir novas moléculas de ligação, as quais podem ser usadas como agentes terapêuticos. O termo "molécula de ligação", conforme usado aqui, abrange anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno se ligam específica e seletivamente ao FcyRIIIA e não se ligam com especificidade do FcyRIIIB, bem como proteínas de fusão de tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno e conjugados de proteína compreendendo tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno.

Assim, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é proporcionada uma molécula de ligação com especificidade por pelo menos um antígeno, em que o pelo menos um antígeno é um FcyRIIIA e em que a molécula de ligação não se liga especificamente ao FcyRlIIB.

Em uma modalidade preferida, a especificidade pelo FcyRIIIA é proporcionada por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Consequentemente, moléculas de ligação da invenção podem compreender ou, em determinadas modalidades, consistir de pelo menos um anticorpo (ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo) o qual tem especificidade pelo FcyRIIIA, mas não pelo FcyRlIIB.

Anticorpos que conferem especificidade pelo FcyRIIIA podem ser anticorpos de ocorrência natural ou eles podem ser anticorpos recombinantes. Anticorpos da invenção podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, por exemplo, eles podem ser um anticorpo de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. De preferência, o anticorpo será um anticorpo de IgG. Fragmentos de ligação a antígeno adequados para uso na invenção podem ser de ocorrência natural ou recombinantes e incluem cadeias leves de imunoglobulina, cadeias pesadas de imunoglobulina, domínios VH, domínios VL, Fvs, anticorpos com cadeia simples (incluindo scFvs), Fabs, di-Fabs, Fab's, F(ab')2s e CDRs. Aqueles habilitados na técnica estarão muito familiarizados com tais fragmentos de ligação a antígeno e seu preparo. Para evitar dúvida, o termo anticorpo com cadeia simples, conforme usado aqui, se refere a uma molécula com cadeia simples geneticamente modificada compreendendo a região variável de uma cadeia leve e a região variável de uma cadeia pesada ligadas por um ligante polipeptídico flexível adequado. Exemplos de anticorpos com cadeia simples incluem um scFv e um dianticorpo.

Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a anticorpo que confere especificidade para FcyRIIIA compreenderá pelo menos uma CDR humana, de preferência selecionada das CDRs descritas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Sequências de aminoácido de CDRs humanas de cadeias leves e pesadas a partir de scFvs que se ligam seletiva e especificamente ao FcyRIIIA e não se ligam com 15 especificidade ao FcyRIIIB

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, com exceção das CDRs simples, em geral compreendem três CDRs de cadeia leve e/ou três CDRs de cadeia pesada . Conseqüentemente, em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com especificidade pelo FcyRIIIA compreende três CDRs humanas de cadeia leve e/ou três CDRs humanas de cadeia pesada. De preferência, a CDR 1 humana de cadeia leve terá uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 33 e SEQ ID NO 34, a CDR 2 humana de cadeia leve terá uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 31 e SEQ ID NO 35 e a CDR 3 humana de cadeia leve terá uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28 e SEQ ID NO 32. De preferência, a CDR1 humana de cadeia pesada terá a sequência de aminoácido de SEQ ID NO 17, a CDR2 humana de cadeia pesada terá a sequência de aminoácido de SEQ ID NO 18 e a CDR3 humana de cadeia pesada terá a sequência de aminoácido de SEQ ID NO 19.

Onde o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende ou consiste do domínio variável de uma cadeia leve, ele pode ter uma das seguintes sequências de aminoácido: SEQ ID NO 10: SYELMQPPSVSVSSGQTASIPCSGDKLEEKYVSWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 11: SYELTQPLSESVAQGQTARITCGGNNIESRNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNNRPSGIPE RFSGSNSGNMATLTISRAQAGDAADYYCQVWDNYTVLFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 12: SYELTQPPSVAVAPGKTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADFYCQVWDNYIVLFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 13: QAVLTQPPSVSVAPGQTARIPCEGNNIGSKNVHWYRQKPGQVPVLVMYDDSDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 14: QPVLTQPLSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSSRPSGIPE RLSGSNSGDTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDDYIWFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 15: SYELTQPPSVSVTPGQTATITCGANDIGKRNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL; SEQ ID NO 16: QPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL.

Onde o anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno compreende ou consiste do domínio variável de uma cadeia pesada, ele pode ter a seguinte sequência de aminoácido (SEQ ID NO 9): EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTS YAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTV SS.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que proporciona especificidade pelo FcyRIIIA será totalmente humano.

Em outras modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção será capaz de ativar células humanas expressando FcyRIIIA quando ligado ao FcyRIIIA expresso sobre tais células, isto é, a molécula de ligação será capaz ou estimulará uma resposta biológica, em particular uma resposta de sinalização, quando ligado ao FcyRIIIA. De preferência, a molécula de ligação também será capaz de disparar a morte celular de uma maneira análoga à citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), em virtude de sua ligação a tais células.

De forma a testar se as moléculas de ligação da invenção são capazes de ativar células humanas expressando FcyRIIIA, elas podem ser testadas com relação à sua capacidade de estimular a mobilização de cálcio em células NK de sangue periférico, por exemplo, conforme descrito aqui nos Exemplos. A capacidade de moléculas de ligação da invenção de disparar citotoxicidade mediada por células NK também pode ser testada conforme descrito aqui nos Exemplos usando, por exemplo, um ensaio de liberação de calceina para detectar lise celular redirecionada usando células NK recentemente isoladas.

A presente invenção também proporciona moléculas de ligação que não só têm especificidade pelo FcyRIIIA enquanto carece de especificidade pelo FcyRIIIB, mas as quais também têm especificidade por um ou mais antígenos adicionais. Assim, as moléculas de ligação da invenção podem ser multiespecíficas. O termo multiespecíficas, conforme usado aqui, significa que uma molécula de ligação da invenção, embora carece de especificidade pelo FcyRIIIB, tem pelo menos duas especificidades, uma das quais é pelo FcyRIIIA. Moléculas de ligação multiespecíficas da invenção, portanto, abrangem pelo menos moléculas biespecíficas, triespecíficas e tetraespecíficas tais como, por exemplo, anticorpos biespecíficos, incluindo dianticorpos com cadeia simples, (scFv)2, dianticorpos aleatórios (TandAbs); trianticorpos (anticorpo triespecífico); tetraanticorpos (anticorpo tetraespecífico); e flexianticorpos (veja Le Gall et al., 1999 FEBS Letts 453: 164-168 e WO 03/025018).

Em virtude de sua multi-especificidade, as moléculas de ligação de acordo com este aspecto da invenção podem ter como alvos macrófagos ou células NK ao invés de outros antígenos ou mesmo de células que trazem tais antígenos, de modo que o antígeno ou célula trazendo o antígeno possam ser erradicados via fagocitose ou morte celular mediada por células NK. Por exemplo, uma molécula de ligação da invenção pode ter especificidade adicional por um ou mais antígenos específicos de um tumor e pode, assim, ter como alvo as células NK ao invés da célula tumoral. Ativação da célula NK causada pela ligação da molécula de ligação ao FcyRIIIA levará à morte das células tumorais. Desta maneira, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas para tratar e/ou eliminar células doentes e agentes infecciosos (tais como, por exemplo, bactérias, fungos, 5 micoplasmas, vírus, parasitas, prions), dependendo da especificidade ou especificidades adicionais da molécula de ligação. Assim, em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula de ligação conforme descrito aqui antes, em que a 10 molécula de ligação tem especificidade por pelo menos um antígeno adicional. Em uma modalidade, o pelo menos um antígeno adicional é um antígeno na superfície celular. Exemplos dos antígenos na superfície celular pelos quais as moléculas de ligação de acordo com essa modalidade da 15 invenção exibem especificidade são CD19, CD20, CD30, a proteína precursora do receptor de laminina (também conhecida como o receptor de laminina imaturo de antígeno onco-fetal OFA-iLR), EGFR1 (também conhecido como HER-1, ErbBl), EGFR2 (também conhecido como HER-2, ErbB2, neu) , 20 EGFR3 (também conhecido como HER-3), Ep-CAM, PLAP (fosfatase alcalina placentária), antígeno de Thomsen- Friedenreich (TF), MUC-1 (mucina), IGFR, IL4-R alfa, IL13- R, FcεRI e CD5.

Em outra modalidade, o pelo menos um antígeno adicional é um antígeno de um agente infeccioso, por exemplo, o antígeno pode ser secretado de ou expresso sobre a superfície externa de uma célula hospedeira, célula infectada, bactéria, fungo, micoplasma, parasita ou vírus, ou pode ser liberado quando ocorre a lise de tal agente infeccioso. Por exemplo, uma molécula de ligação da invenção pode ter especificidade adicional por uma proteína virai, tal como gp34 ou gp68, sobre a superfície de células infectadas com CMV ou pela hemaglutinina na presença do vírus da influenza e pode, assim, ter como alvo uma célula viralmente infectada ou o vírus diretamente. Alternativamente, onde o agente infeccioso é um prion, a proteína de prion per se pode ser o antígeno.

Em outra modalidade, o pelo menos um antígeno adicional é um alérgeno ou uma molécula envolvida na resposta do corpo a um alérgeno tal como, por exemplo, igE em circulação ou o receptor de FcεRI sobre mastócitos (em particular).

De preferência, nas moléculas de ligação de acordo com esse aspecto da invenção, a especificidade por pelo menos um antígeno adicional é proporcionada por um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Conforme descrito acima, aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados com os tipos de anticorpos (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) e com fragmentos de ligação a antígeno derivados de tais anticorpos (por exemplo, cadeias leves de imunoglobulina, cadeias pesadas de imunoglobulina, domínios VH, domínios VL, Fvs, scFvs, Fabs, di-Fabs, Fab's, F(ab')2s e CDRs), os quais podem também ser usados nesse aspecto da invenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo será um anticorpo de IgG.

Moléculas de ligação multiespecíficas e, em particular, biespecíficas da invenção podem, assim, ter qualquer um dos seguintes formatos: IgGs biespecíficas, IgG-scFv2, (scFv)4-IgG, (Fab")2, (scFv)2, (dsFv)2, proteínas de fusão de Fab-scFv, (Fab-scFv)2, (scFv)2-Fab, (scFv-CH2- CH3-scFv)2, bicorpo, tricorpo, dianticorpo biespecífico, dianticorpo dissulfeto-estabilizado (ds), dianticorpo 'knob-into-whole', dianticorpo com cadeia simples (scDb), dianticorpo aleatório (TandAb), flexicorpo, mini-anticorpo DiBi, [ (scFv) 2-FC]2, (scDb-CH3)2, (scDb-Fc)2, Di- dianticorpo, Tandemab (revisto em Kipriyanov & Le Gall, 2004, Curr. Opin. Drug Discov. Devei., 7; 233-242 e Marvin e Zhu, 2005, Acta Pharmacol. Sin., 26: 649-658). Em modalidades preferidas, a molécula de ligação será TandAb ou Flexianticorpo. Diferente de muitos outros formatos de anticorpos biespecíficos, o TandAb é um homodímero compreendendo apenas domínios variáveis de anticorpo e sua formação é determinada pela associação de domínios VH e VL complementares localizados sobre diferentes cadeias polipeptídicas. O TandAb tem duas vezes o tamanho do dianticorpo e do (scFv)2, é capaz de se ligar bivalentemente às células efetoras e alvo e possui características farmacocinêticas aperfeiçoadas com relação ao dianticorpo e ao (scFv)2, por exemplo, ele tem maior estabilidade e atividade biológica intensificada tanto in vitro quanto in vivo (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293: 41-56; Cochlovius et al., 2000, Cancer Res., 60: 4336-4341; Reusch et al., 2004, Int. J. Cancer, 112: 509-518). 0 emparelhamento entre cadeias dos domínios VH e VL cognatos da mesma especificidade poderia também ser usado para a formação de moléculas aleatórias de scFv0- diabody^-scFv® bi-específ icas, os assim denominados ’ f lexicorpos1 (A e B podem ter a mesma ou uma especificidade diferente). Dependendo da fixação de associação de domínios complementares envolvidos no emparelhamento entre cadeias e do comprimento do ligante que separa as mesmas, dímeros, trímeros e mesmo tetrâmeros de moléculas com cadeia simples biespecíficas podem ser formados.

Exemplos de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno os quais podem ser usados nesse aspecto da invenção e os quais exibem especificidade pelo CD19, CD20, CD3 0, a proteína precursora do receptor de laminina, EGFR1, EGFR2, EGFR3, Ep-CAM, PLAP, antígeno de Thomsen- Friedenreich (TF), MUC-1 (mucina), IGFR, CDS, IL4-R alfa, IL13-R, FcεRI e IgE, são descritos na técnica, assim como anticorpos para agentes infecciosos (veja, por exemplo, EP- A-1314741, Reff et al., 1994 Blood 83: 435-445, EP-A- 1005870, WO 01/92340, US 6.033.876, WO 86/03223, Buto et al., 1931 Int. J. Biol. Markers 12: 1-5, US 6.699.473, WO 98/50433, US 5.770.195, EP-A-0502812, Carter et al. , 1992 PNAS 89: 4285-4289, US 5.968.511, WO 04/106383, Nouri et al., 2000 BJU Int. 86: 894-900, EP-A-0429242, Ravn et al., 2004 J. Mol. Biol. 343: 985-996, Dahlenborg et al. , 1997 Int. J. Cancer 70: 63-71, WO 88/05054, WO 02/053596, WO 04/071529, Studnicka et al., 1994 Protein Eng. 7: 805-814, Presta et al., 1993 J. Immunol. 151: 2623-2632). Onde essas citações proporcionam sequências de aminoácido ou sequências de ácido nucléico que codificam tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, aqueles habilitados na técnica podem utilizar tais sequências diretamente na produção de moléculas de ligação da invenção. Onde essas citações descrevem hibridomas ou linhagens de célula que produzem tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, aqueles habilitados na técnica serão capazes de obter as seqüências de ácido nucléico que codificam o anticorpo desejado ou fragmento de ligação a antígeno do hibridoma ou linhagem de célula apropriada usando técnicas de biologia molecular padrões e, uma vez obtidas, as seqüências de ácido nucléico podem ser usadas na construção de moléculas de ligação da invenção.

Um outro aspecto da invenção proporciona uma molécula de ligação de acordo com qualquer um dos aspectos ou modalidades antes aqui descritas, a qual é capaz de se ligar ao alelo FcyRIIIA158F e ao alelo FcyRIIIA158V com aproximadamente a mesma afinidade, isto é, a afinidade da molécula de ligação pelos dois alelos 158 do FcyRIIIA difere em não mais do que duas vezes. Em modalidades preferidas de acordo com esse aspecto da invenção, a especificidade pelo FcyRIIIA será proporcionada por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno derivado do scFv 4-LS21 descrito aqui. Em modalidades particularmente preferidas, as moléculas de ligação de acordo com esse aspecto da invenção estarão em um formato TandAb e compreenderão fragmentos de ligação a antígeno derivados do scFv 4-LS21 descrito aqui, bem como fragmentos de ligação a antígeno tendo especificidade pelo CD19 ou CD30.

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, onde é pretendido que as moléculas de ligação da invenção sejam usadas no tratamento e/ou terapia de seres humanos, a imunogenicidade potencial da molécula de ligação deverá ser 5 minimizada. Consequentemente, onde a especificidade pelo FcyRIIIA e/ou o(s) antígeno(s) adicional(is) é proporcionada por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, é preferido que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno seja quimérico, CDR-enxertado, 10 humanizado ou totalmente humano. Mais preferivelmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno será humanizado ou totalmente humano. O uso de técnicas de biologia molecular padrões para realizar a humanização de anticorpos é agora rotina na técnica e proporcionada com 15 uma sequência de anticorpo não-humana, aqueles habilitados na técnica serão prontamente capazes de produzir uma versão humanizada de tal anticorpo. O termo "totalmente humano", conforme usado aqui, na medida em que ele se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, significa que 20 as sequências de aminoácido do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno são derivadas de (isto é, originárias ou podem ser encontradas em) seres humanos.

Outra técnica a qual pode ser empregada como uma alternativa, ou adicionalmente, aos métodos descritos acima para redução de imunogenicidade é aquela de desimunização.

Tecnologia de desimunização envolve a identificação remoção de epítopos de células T auxiliares (Th) assim identificados são eliminados da sequência de proteína através de substituições de aminoácido. Isto pode ser alcançado através de uso de técnicas de biologia molecular padrões tal como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida para alterar a seqüência de ácido nucléico que codifica o epítopo de células Th na proteína terapêutica. Dessa forma, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode ser modificado de modo que a(s) resposta(s) HAMA (antigênica anti camundongo humana) e/ou anti-idiotípicas seja(m) reduzida(s) ou evitada(s) (Bander et al., 2003, Semin. Oncol., 30: 667-676; Nanus et al., 2003, J. Urol., 170: S84-S89). Assim, em outras modalidades, as moléculas de ligação da invenção são modificadas para remover quaisquer epítopos de células Th presentes em sua seqüência. Tais moléculas de ligação são referidas aqui como moléculas de ligação desimunizadas.

Em outro aspecto, as moléculas de ligação da invenção compreendem um outro domínio funcional. Esse domínio funcional pode conferir propriedades efetoras sobre a molécula de ligação, por exemplo, o domínio funcional pode ser um peptídeo de ligação a FcR ou o domínio Fc de um anticorpo o qual, através de sua capacidade de se ligar a receptores de Fc, confere propriedades efetoras sobre a molécula de ligação. Alternativamente, o domínio funcional pode ser uma enzima que é capaz de converter um pró-fármaco em um fármaco ativo. Dessa forma, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas em terapia com pró-fármaco enzimático anticorpo-dependente (ADEPT). Em uma outra modalidade, o domínio funcional é uma proteína ou peptídeo que confere uma meia-vida aumentada no soro sobre a molécula de ligação. Um exemplo de tal proteína é albumina no soro ou a porção Fc de IgG, a qual pode aumentar a meia- vida no soro da molécula de ligação em virtude de sua capacidade de se ligar ao FcyRn (o receptor de Fc neonatal). Em outra modalidade, o domínio funcional pode ser uma citocina.

Em outro aspecto, as moléculas de ligação da invenção podem ser conjugadas a uma molécula de marcação ou uma toxina. Onde a molécula de marcação ou toxina é uma proteína, a conjugação à molécula de ligação pode ocorrer através de uma ligação peptídica ou através de conjugação química. Assim, uma molécula de ligação de acordo com esse aspecto da invenção pode estar na forma de uma proteína de fusão onde a molécula de marcação ou toxina é ligada à molécula de ligação através de uma ligação peptídica, de preferência através de um ligante peptídico, ou pode estar na forma de um conjugado químico. Para evitar dúvida, o termo conjugação é usado aqui para significar que dois componentes são fisicamente ligados juntos via uma ligação química, a qual inclui uma ligação peptídica (assim, conjugados incluem proteínas de fusão), ligação de éster ou ligação em ponte de dissulfeto.

Conjugação de uma molécula de ligação da invenção a uma molécula de marcação, tal como um radio-marcador ou um 5 marcador fluorescente ou luminescente (incluindo quimioluminescente) permite que a molécula de ligação seja usada como um reagente de coloração imunológico. Tal reagente pode ser usado na detecção, por exemplo, de células NK que se infiltram em tecidos, macrófagos ou 10 mastócitos expressando FcyRIIIA ou, onde a molécula de ligação exibe especificidade por um antígeno adicional, na detecção de complexos de antígeno adicional-molécula de ligação-célula NK. Detecção do último pode ser particularmente útil no diagnóstico de doenças ou no 15 monitoramento de progressão ou remissão de doenças. . Onde uma molécula de ligação da invenção é conjugada a uma molécula de toxina, tal como uma ribosil transferase, protease de serina, ativador de guanilciclase, adenilciclase calmodulina-dependente, ribonuclease, agente 20 de alquilação de DNA ou inibidor de mitose (por exemplo, doxorubicina) e semelhantes, ela pode ser usada para ter como alvo e matar células NK e macrófagos. Tal molécula de ligação, assim, pode ser usada como um agente imunossupressivo. Aqueles habilitados apreciarão que, nesse aspecto da invenção, é preferido que a moléculas de ligação exibam especificidade por apenas um antígeno, isto é, FcyRIIIA. Supressão do sistema imune também pode ser alcançada usando moléculas de ligação compreendendo ou consistindo de um fragmento de ligação a antígeno monovalente o qual se liga seletiva e especificamente ao FcyRIIIA. Tais moléculas de ligação monovalentes são preferidas, uma vez que elas atuarão como moléculas que bloqueiam o receptor FcyRIIIA, não se ligarão cruzadamente e, assim, não ativarão a célula NK ou macrófago. Fragmentos de ligação a antígeno anti-FcyRIIIA monovalentes preferidos incluem scFv, Fab, VH, VL e uma CDR.

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, como uma alternativa a ser marcada com uma molécula de marcação ou toxina via conjugação química, marcadores peptídicos ou toxinas peptídicas podem também ser usadas. Por exemplo, a molécula de ligação da invenção pode ser expressa como uma proteína de fusão com uma etiqueta peptídica N- ou C- terminal, tal como uma etiqueta de tetra-, penta- ou hexa- histidina, uma etiqueta de c-myc ou semelhante.

As moléculas de ligação da invenção podem ser produzidas através de expressão de ácidos nucléicos que codificam as mesmas em qualquer sistema de expressão de proteína adequado. Assim, em um outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação da invenção. Polinucleotídeos que são particularmente adequados para uso nesse aspecto da invenção codificarão as CDRs descritas na Tabela 1 acima. Em particular, aqueles habilitados, armados com a seqüência de aminoácido das CDRs de cadeia leve e pesada da tabela 1, serão capazes de derivar seqüências de polinucleotídeo que codificam as várias CDRs de cadeia leve e pesada a partir das seguintes seqüências de ácido nucléico: SEQ ID NO 1: gaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaaggt ttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagc tacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacgagcacagt ctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagag gtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtc tcctca; SEQ ID NO 2: tcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcaggacagacagccagcat cccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggtatcaacagaggccag gccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgag cgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggc gatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcg íT gagg gac caagc tgacc g t c c t a. SEQ ID NO 3: tcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccagggacagacggccaggat tacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggtaccagcagaagccag 5 gccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccctctgggatccctgag cgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatcagcagagcccaagc cggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacactgtgctattcggcg gagggaccaagctgaccgtccta SEQ ID NO 4: 10 tcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccaggaaagacggccaggat tacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccag gccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaccggccctctgggatccctgag cgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatcagcagagcccaagc cggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatattgtgctgttcggcg 15 gagggaccaagctgaccgtcctg SEQ ID NO 5: caggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccaggacagacggccaggat tccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggtatcggcagaagccag gccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgag 20 cgattctGtggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggc gatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcg gagggaccaagctgaccgtccta SEQ ID NO 5; cagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccgggacagacggccaggat tacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaagccag gccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccctctgggatccctgag cgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatcagcagagcccaggc cggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacattgtggtcttcggcg gagggaccaagctgaccgtccta SEQ ID NO 7: tcctatgagetgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccaggacagacggccacgat tacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggtaccaacagaggccag gccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgag cgattctctggαtccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggc gatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcg gagggaccaagctgaccgtccta SEQ ID NO 8: cagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccaggacagacggccacgat ctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggtaccagcagaggccag gccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccctcagggatccctgag cgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggc gatggatgaggαtgactactattgtcaggtgtgggacaattacagtgtgctattcggcg gagggaccaagctgaccgtccta SEQ ID NO 1 codifica a região variável de cadeia pesada de um scFv humano que se liga seletiva e especificamente ao FcyRIIIA, mas o qual não se liga com especificidade ao FcyRlIIB. SEQ ID NOs 2-8 codificam regiões variáveis de cadeia leve de scFvs humanos que se ligam seletiva e especificamente ao FcyRIIIA, mas os quais não se ligam com especificidade ao FcyRIIIB. Consequentemente, SEQ ID NOs 1 a 8 também são exemplos de polinucleotídeos da invenção e podem ser usadas na produção de outras moléculas de ligação da invenção.

Polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação multiespecíficas da invenção, em particular moléculas de ligação biespecífica, podem ser construídos conforme descrito no WO 03/025018, usando ácidos nucléicos que codificam os domínios VH e VL de um anticorpo o qual se liga seletiva e especificamente ao FcyRIIIA, mas o qual não se liga especificamente ao FcyRIIIB, em combinação com ácidos nucléicos que codificam os domínios VH e VL de um anticorpo tendo especificidade pelo antígeno adicional.

De forma que uma molécula de ligação seja expressa em um sistema de expressão de proteína adequado, o polinucleotídeo que codifica a proteína de ligação será operavelmente ligado a um promotor adequado e, opcionalmente, um terminador de transcrição adequado. Isso pode ser alcançado através da introdução de um polinucleotídeo da invenção no genoma de um hospedeiro e utilizando um promotor presente dentro do genoma para acionar a expressão do polinucleotídeo. Alternativamente, um polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido em células hospedeiras sobre um vetor compreendendo o polinucleotídeo operavelmente ligado ao promotor e opcionalmente uma região terminadora. Tais vetores formam ainda outro aspecto da invenção.

Em geral, o promotor ao qual o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação está operavelmente ligado no vetor será qualquer promotor capaz de acionar a expressão da molécula de ligação na célula hospedeira na qual o polinucleotídeo e o vetor têm de ser introduzidos. Assim, se é desejado que a molécula de ligação seja expressa em uma célula bacteriana, o promotor será operável nessa célula bacteriana. Similarmente, se é desejado que a molécula de ligação seja expressa em um sistema de expressão fúngico, o promotor será operável em uma célula fúngica e a mesma lógica prevalece se a estrutura tem de ser introduzida em um sistema de expressão de cultura de células de mamífero, um sistema de expressão de célula de inseto ou um sistema de expressão de planta. Onde os polinucleotídeos da invenção são operavelmente ligados a uma região terminadora de transcrição adequada, essa será uma que media o término de transcrição na célula hospedeira na qual a molécula de ligação da invenção tem de ser expressa. Regiões terminadoras de transcrição adequadas para essa finalidade são descritas na técnica.

Em modalidades preferidas, o polinucleotídeo da invenção também será operaveImente ligado a uma sequência 5 sinalizadora a qual é capaz de dirigir a expressão da molécula de ligação a uma localização celular ou extracelular desejada. Por exemplo, em algumas modalidades, pode ser desejável secretar a molécula de ligação da célula hospedeira na qual ela é expressa. Onde esse é o caso, a 10 seqüência sinalizadora codificará um sinal de secreção.

Sinais de secreção bacterianos adequados são descritos na técnica e um de tais exemplos é a seqüência líder PelB. Em outras modalidades, por exemplo, aquelas envolvendo expressão em eucariotas, pode ser desejável reter a 15 expressão da molécula de ligação no retículo endoplásmico (ER). Nesse caso, a seqüência sinalizadora compreenderá uma seqüência de retenção no ER que codifica o motivo "KDEL" (SEQ ID NO 54) e, em particular, que codifica a seqüência "SEKDEL" (SEQ ID NO 55). 20 Polinucleotídeos da invenção também podem ter o códon otimizado de acordo com métodos prontamente disponíveis na técnica, com as tendências de códon sendo alteradas para se adequar ao hospedeiro de expressão escolhido em particular.

Polinucleotídeos e vetores da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras usando qualquer metodologia apropriada. Em células eucariotas, tais técnicas incluem transfecção com fosfato de cálcio, DEAE- Dextrina, eletroporação, bombardeamento de partícula, 5 transfecção ou transdução mediada por lipossoma usando retrovirus, adenovirus ou outros vírus, tais como varíola ou, para células de inseto, baculovírus. Em células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, eletroporação ou transfecção usando 10 bacteriófago. Em células de planta, técnicas adequadas incluem transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação, microinjeção de células de planta e protoplastas, bombardeamento de microprojétil, bombardeamento bacteriano, em particular o método em 15 "fibra" ou "whisker", dependendo da espécie de planta que está sendo transformada em particular. Assim, em um outro aspecto, a invenção proporciona células hospedeiras compreendendo polinucleotídeos ou vetores da invenção. Células hospedeiras dos organismos descritos abaixo e as 20 quais compreendem polinucleotídeos ou vetores da invenção são, assim, consideradas como modalidades específicas desse aspecto.

Sistemas de expressão adequados para expressão das moléculas de ligação da invenção incluem sistemas de expressão microbianos, tais como sistemas bacterianos (por exemplo, sistemas de expressão de E. coli, Bacillus') e fúngicos, por exemplo, levedos (tais como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, espécies de Pichia, espécies de Hanensula) e outros sistemas de expressão fúngicos (por exemplo, sistemas de expressão de fungos filamentosos derivados de espécies de Aspergillus, Trichoderma reesei e Neurospora crassa); sistemas de expressão de mamíferos, por exemplo, células CHO, células NSO, células HEK 293; sistemas de expressão de células de insetos e sistemas de expressão de plantas. Açafrão é particularmente preferido como um sistema de expressão de planta. Aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados com esses sistemas de expressão, os quais são totalmente descritos na técnica.

A presente invenção também proporciona métodos para a produção de moléculas de ligação da invenção. Assim, em outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de uma molécula de ligação conforme descrito aqui, em que o referido método compreende introdução, em uma célula hospedeira, de um polinucleotídeo ou vetor da invenção e cultivar a referida célula hospedeira sob condições pelas quais a molécula de ligação é expressa. Condições para o crescimento e manutenção de células hospedeiras e para mediação da expressão de moléculas de ligação da invenção a partir de tais células hospedeiras são totalmente descritas na técnica. Em uma modalidade, o método ainda compreenderá o isolamento e opcionalmente outra purificação da molécula de ligação.

Onde a molécula de ligação da invenção compreende uma molécula de marcação ou uma molécula de toxina que tenha sido quimicamente conjugada ã molécula de ligação, a molécula de ligação conjugada pode ser produzida através da introdução de um polinucleotídeo ou vetor da invenção em uma célula hospedeira, do cultivo da célula hospedeira sob condições pelas quais uma molécula de ligação da invenção é expressa, do isolamento da molécula de ligação expressa e da conjugação da molécula de ligação isolada com um marcador ou toxina apropriada. Tipicamente, a etapa de conjugação envolverá o uso de agentes heterobifuncionais os quais resultam em ligações de dissulfeto ou tioéter, conforme descrito na técnica (veja, por exemplo, Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, Londres, 1996, para metodologias padrões referentes ao uso de reagentes de ligação cruzada).

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, com algumas modalidades da invenção, pode ser desejável aumentar a meia-vida circulatória da molécula de ligação no corpo. Isso pode ser alcançado de várias formas, por exemplo, através de construção da molécula de ligação como uma proteína de fusão, por exemplo, com albumina, conforme descrito aqui antes. Outros métodos de aumento da meia-vida no soro de uma molécula são bem conhecidos e incluem, por exemplo, peguilação, sialilação e glicosilação. Conseqüentemente, a presente invenção abrange moléculas de ligação conforme descrito aqui, as quais tenham sido peguiladas, sialiladas ou glicosiladas.

A presente invenção também compreende composições compreendendo uma molécula de ligação e pelo menos um componente adicional. Por exemplo, aqueles habilitados na técnica apreciarão que, no isolamento de moléculas de ligação de células hospedeiras pós-expressão, podem ser obtidas composições as quais compreendem a molécula de ligação substancialmente purificada, mas as quais também contêm uma impureza, um diluente, um tampão ou semelhante. Tais composições intermediárias podem ser diretamente adequadas para outro uso ou a molécula de ligação pode ser ainda purificada das mesmas.

As composições da invenção também podem compreender uma molécula de ligação da invenção em combinação com qualquer veículo, excipiente, diluente e/ou estabilizante farmaceuticamente aceitável adequado. Aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados com tais componentes, os quais estão descritos na arte. De preferência, tal composição estará em qualquer forma adequada para administração a um paciente, em particular em uma forma adequada para administração parenteral, por exemplo, através de injeção ou infusão.

Onde a composição é para injeção ou infusão, ela pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, a molécula de ligação ou composição pode estar em uma forma seca, para reconstituição antes de uso com um líquido estéril apropriado.

Moléculas de ligação e composições da invenção, em particular moléculas de ligação multiespecíficas e composições contendo as mesmas, podem ser usadas no diagnóstico e/ou tratamento de doenças tais como, por exemplo, doença autoimune, doença inflamatória, doença infecciosa (incluindo doença enxerto-versus-hospedeiro), alergia ou câncer (por exemplo, linfoma não-Hodgkin; leucemia linfocítica crônica; linfoma/doença de Hodgkin; tumores sólidos, por exemplo, aqueles que ocorrem em câncer de mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer do rim ou < câncer do duto biliar; doença residual mínima; tumores metastáticos, por exemplo, aqueles que sofrem metãstase para os pulmões, ossos, fígado ou cérebro).

Moléculas de ligação muitiespecíficas da invenção em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação ao antígeno CD19 ou CD20 podem ser de uso particular no tratamento de linfoma não-Hodgkin.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação ao EGFR1 podem sex* de uso particular no tratamento de cânceres em que expressão de EGFR1 é super-regulada ou alterada, por exemplo, em cânceres da mama, bexiga, cabeça e pescoço, próstata, rim, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer cólon-retal e glioma.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação ao antígeno TF podem ser particularmente úteis no tratamento de câncer de mama ou cólon e/ou metástases hepáticas.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação CD30 podem ser particularmente úteis no tratamento de doença de Hodgkin.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação à cadeia alfa do receptor de IL4 (IL4R alfa) podem ser particularmente úteis no tratamento de tumores sólidos, em particular carcinomas da mama, ovários, sistema renal, cabeça e pescoço, melanoma maligno e sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação EGFR3/HER3 e/ou EGFR2/neu podem ser particularmente úteis no tratamento de câncer de mama.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação IGFR podem ser particularmente úteis no tratamento de câncer de próstata, câncer cólon-retal, câncer ovariano ou câncer de mama.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação CD5 podem ser particularmente úteis no tratamento de leucemia linfocítica crônica.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação MUC-1 podem ser particularmente úteis no tratamento de câncer gástrico e câncer ovariano.

Moléculas de ligação multiespecíficas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação EpCAM podem ser particularmente úteis no tratamento de carcinomas do cólon, rim e mama.

Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação PLAP podem ser de uso particular no tratamento de câncer ovariano ou testicular.

Moléculas de ligação multiespecificas em que a pelo menos uma especificidade adicional é com relação OFA-iLR podem ser particularmente úteis no tratamento de tumores metastáticos .■

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de uma molécula de ligação, conforme aqui descrito, na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença autoimune, doença inflamatória, doença infecciosa, alergia ou câncer (por exemplo, linfoma não-Hodgkin; leucemia linfocítica crônica; linfoma de Hodgkin; tumores sólidos, por exemplo, aqueles que ocorrem em câncer de mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer do rim ou câncer do duto biliar; doença residual mínima; tumores metastáticos, por exemplo, aqueles que sofrem metástase para os pulmões, ossos, fígado ou cérebro). Onde moléculas de ligação multiespecifica especificadas foram descritas acima como tendo utilidade particular no tratamento de uma doença especificada, essas moléculas de ligação podem também ser usadas na fabricação de um medicamento para essa doença especificada.

Em ainda outro aspecto, as moléculas de ligação da invenção podem ser usadas como um reagente para corar células expressando FcyRIIIA. Onde a molécula de ligação tem especificidade por pelo menos um outro antígeno, elas podem ser usadas como o reagente pelo qual o complexo de antígeno-molécula de ligação-célula expressando FcyRIIIA pode ser identificado. Moléculas de ligação da invenção também podem ser usadas para analisar e tipificar amostras de pacientes ex vivo, como um biomarcador e para isolar células NK para terapia ex vivo.

Assim, em outro aspecto, é proporcionado um kit compreendendo uma molécula de ligação, conforme descrito aqui antes, e meios para detecção da molécula de ligação quando ligada ao FcyRIIIA. Onde a molécula de ligação é marcada radioativamente ou marcada com um marcador quimioluminescente, o meio de detecção pode compreender um filme sensível ao marcador radioativo ou quimioluminescente. Onde a molécula de ligação é marcada com uma etiqueta de histidina ou c-myc, o kit pode compreender um anticorpo o qual reconhece a etiqueta.

Vários aspectos e modalidades da presente invenção serão agora ilustrados em maiores detalhes a guisa de exemplo. Será apreciado que modificação de detalhes pode ser feita sem se desviar do escopo da invenção e aqueles habilitados na técnica apreciarão que outros anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno para uso na invenção podem ser obtidos conforme descrito aqui no Exemplo 2, e suas propriedades com relação à ligação à diferentes isoformas de FcyRIII e mesmo a diferentes formas alélicas de FcyRIIIA, podem ser testadas conforme descrito aqui nos Exemplos.

Para evitar dúvidas, os termos "FcyRIII", "FcylIIA" e "FcyRIIIB" são usados aqui permutavelmente com os termos "CD16", "CD16A" (denotando a isoforma A de CD16) e "CD16B" (denotando a isoforma B de CD16), respectivamente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Resultados de ELISA demonstrando a ligação de scFv 50NI à CD16-Fc capturada em estreptavidina Placas para ELISA foram revestidas com 500 ng de estreptavidina e 300 ng de IgG humana (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) por poço em 100 mM de NaHCO3, pH 8,6. Subsequentemente, 300 ng de CD16A-Fc biotinilada foram absorvidos durante 30 min em temperatura ambiente em PBS. CDIGA-Fc capturada em estreptavidina, estreptavidina e IgG humana foram incubados com 1 μg/mL de MAb A9 de murino ou 5 0 μl de extrato periplásmico bruto do clone 50NI em PBS/TWEEN a 0,1%/leite em pó desnatado a 2%. A ligação de MAb A9 foi detectada com um conjugado de HRP-anticorpo anti-camundongo de cabra. A ligação de scFv 5ONI foi detectada usando o conjugado HRP-anticorpo anti-Penta His. A absorbância a 450 nm do HRP-substrato tetrametil benzidina (TMB) foi medida após término da reação com 50 μl de ácido sulfürico a 0,5M.

Figura 2: scFv anti-CD16 humano maturado por afinidade se liga a transfectantes celulares expressando CD16A, mas não a células expressando CD16B. Células BW de murino e células BW estavelmente transfectadas com CD16A (BW/CD16A) , células HEK-293 e células HEK-293 transfectadas com CD16B (293/CD16B), CD16A (293/CD16A) ou NKp46 (293/NKp46) foram coradas com 10 μg/mL do MAb A9 (anti-CD16) ou MAb 195314 (anti-NKp46), seguido por 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC. 0 scFv anti-CD16 foi usado em uma concentração de 5 0 μg/mL e foi detectado com 10 μg/mL de MAb 13/45/31-2 (anti-Hexa His), seguido por IgG anti- camundongo de cabra conjugada com FITC. As intensidades médias de fluorescência obtidas a partir de análise por citometria de fluxo foram corrigidas subtraindo-se os valores de fluorescência de colorações de células apenas com reagentes e plotados no diagrama.

Figura 3: ELISA sobre CDlδA-Fc e CD16B recombinantes. Proteínas CD16A-Fc e CD16B recombinantes foram revestidas a 80 nM em 0,1 M de NaHCO3, pH de 8,8. Os poços foram bloqueados com PBS, leite desnatado a 2%. A ligação do scFv às proteínas recombinantes e à gp34-Fc (controle negativo) foi detectada usando um conjugado anti-c-Myc-HRP (10 μg/ml) . Incubação com MAb A9 anti-CD16 (1 μg/mL) foi seguida por um conjugado HRP IgG anti-camundongo de cabra (0,5 μg/mL). CD16B recombinante revestida foi diretamente detectada através da coloração com um anti-His-HRP (1 μg/mL) e o revestimento das proteínas de fusão-Fc foi testado por um conjugado HRP-IgG anti-humano (0,5 μg/mL). Como HRP-substrato, 50 μL de TMB foram usados. Após término da reação com 50 μL de H2SO4 a 0,5 M, a absorbância foi medida a 450 nm.

Figura 4: Disparo de citotoxicidade redirecionada em células NK recentemente isoladas através do scFv anti-CD16 humano maturado por afinidade. Células NK foram isoladas e enriquecidas a partir de sangue periférico de um doador saudável e usadas como células efetoras em um ensaio de citotoxicidade com P815 marcado com calceína como células alvo. Células efetoras (E) e alvo (T) foram incubadas durante 3 horas em uma proporção de E:T de 10:1 na presença de 1 μg/mL dos anticorpos indicados. 0 percentual de lise específica foi calculado a partir das contagens de fluorescência tnedida da calceína liberada no sobrenadante. Os valores médios e desvios padrões a partir de triplicates 5 foram plotados.

Figura 5: Análise por citometria de fluxo de scFv anti-CD16 maturado por afinidade sobre PMN e células NK. Células polimorfonucleares (PMN) e células assassinas naturais (NK) foram isoladas de sangue periférico de um doador saudável e 10 usadas para coloração e análise por citometria de fluxo. As células foram coradas com 10 μg/mL do MAb A9 anti-CD16 e MAb B159 anti-CD56, seguido por 15 μg/mL de IgG anti- camundongo de cabra conjugado com FITC. Todos os scFvs foram usados em uma concentração de 5 0 μg/mL e foram 15 detectados com 10 μg/mL de anti-(His)6, seguido por 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugado com FITC. As intensidades médias de fluorescência obtidas a partir de análise de citometria de fluxo foram corrigidas subtraindose os valores de fluorescência das colorações de células 20 obtidos usando apenas os reagentes secundários e foram plotados no diagrama.

Figura 6: Alinhamento de seqüência de aminoácido de variantes alélicas das isoformas CD16A e CD16B. Os peptídeos sinalizadores são mostrados como sombreado. Asteriscos e o texto em itálico marcam as diferenças dentro das variantes alélicas de CD16B. Variações entre as isoformas CD16A e CD16B são mostradas em negrito e sublinhado. A posição do polimorfismo Val/Phe 158 na CD16A é indicado pela caixa.

Figura 7s ELISA sobre diferentes isoformas de CD16. Poços de uma placa Maxisorp™ foram revestidas com 100 mM de NaHCO3 contendo 200 ng de CD16A-Fc48R/158V, CD16A-Fc48R/1S8F, CD16B-FcSíl, CD16B-FcNA1, CDISB-Fc^2 e NKp46-Fc. Todos os antígenos foram incubados com [A] o scFv 4-LS21 seguido por um conjugado HRP anticorpo anti-His ou [B] com o MAb A9 seguido por um conjugado HRP anti-camundongo de cabra (reatividade cruzada mínima com IgG humana). Um scFv anti- NKp46 usado como um anticorpo primário atuou como um controle negativo.

Figura 8: Morte alvo-específica através de células NK TandAb-ativadas. 1 x IO4 da L540CY marcada com calceína indicada (resultados mostrados no painel [A] ) ou células alvo JOK-1 (resultados mostrados no painel [B] ) foram incubados durante 3 horas com 1 x 105 células NK na presença das concentrações indicadas de TandAb CD30xCD16 (losangos cheios) ou TandAb CD19xCD16 (losangos abertos). Como um controle, células alvo foram incubadas com células NK sem anticorpo (quadrado cheio). A lise específica percentual foi calculada a partir das contagens de fluorescência medida da calceína liberada e analisada através de regressão não-linear usando o software GraphPadPrism.

EXEMPLOS

Exemplo li Expressão transitória e purificação de uma proteína de fusão CD16A-FC humana Uma forma solúvel secretada da proteína de fusão CD16A-FC foi produzida em células HEK-293 após transfecção transitória com plasmídeo pCDM-CD16-Fc que codifica CD16A humana fundida à porção Fc da IgGl humana (MandeIboim et al. , 1999, supra) .

Células HEK-293 (número de acesso ATCC CRL-1573) foram cultivadas em meio DMEM completo (meio DMEM suplementado com soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 10% (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica e 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina; todos da Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Transfecção mediada por fosfato de cálcio dessas células foi realizada como segue.

Um dia antes da transfecção, 1,5 x 106 células HEK-293 foram usadas para cultivar 10 mL de meio DMEM completo em uma placa de cultura de células de 10 cm de diâmetro. 10 μg de DNA de plasmídeo foram misturados com 50 0 μL de CaCl2 a 250 mM, o qual foi, então, adicionado gota a gota a 500 μL de tampão de 2xHEBS (280 mM de NaCl, 1,5 m de Na2HPO4, 50 mM de HEPES, pH 7,05) e incubados durante 15 min em temperatura ambiente. 9 mL de meio DMEM completo foram adicionados a esse coquetel de transfecção, misturados e transferidos para um disco de células HEK-293, das quais o meio de cultura tinha sido removido. No dia seguinte, o meio de transfecção foi trocado por meio DMEM isento de soro (meio DMEM suplementado com 2 mM de L-glutamina , 100 U/mL de penicilina G sódica e 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 1 x suplemento de Insulina-Transferrina- Selênio-A (todos da Invitrogen). Os sobrenadantes contendo a proteína de fusão CD16A-Fc secretada foram coletados duas vezes em um período de dois a seis dias após transfecção, dependendo da viabilidade das células. Após cada coleta, meio fresco isento de soro foi adicionado às células. Sobrenadantes coletados foram centrifugados para remover células ou restos celulares e armazenados a -8 0 °C até usados para purificação da proteína de fusão. Transfecções foram repetidas até ser coletado aproximadamente 1,2 L de sobrenadante contendo proteínas de fusão CD16A-Fc.

Purificação da proteína de fusão CD16A-Fc recombinante foi realizada sobre uma coluna de Proteína A de 2 mL (Protein A Sepharose™ Fast Flow, Amersham Pharmacia). A coluna foi equilibrada com dez volumes de DMEM, pH 7 (Invitrogen; suplementada com 100 μg/mL de Estreptomicina, 100 u/ml de Penicilina, 1 x Insulina-Transferrina-Selênio-A e 2 mM de L-glutamina). Antes do carregamento do 5 sobrenadante de cultura de célula (1200 ml) sobre a coluna, ele foi passado através de um filtro estéril de 0,2 μm e ajustado para pH 7 através da adição de 0,1 M de glicina/HCl, pH 2,7. A coluna foi operada através de fluxo por gravidade a 4 °C. Subsequentemente, a coluna foi lavada 10 com 10 volumes de DMEM, pH 7. Eluição foi realizada com 6 volumes de 0,1 M de glicina/HCl, pH 2,7. Frações de 1 ml foram coletadas diretamente em 55 μl de Tris/HCl a 1 M, pH de 8,8.

Análise das frações número 1-10 em um gel de PAA a 12% 15 mostrou que a vasta maioria da proteína de fusão está nas frações 2-7. Essas frações foram reunidas e submetidas à diálise contra 5 L de PBS, pH 7,0. A determinação da concentração de proteína de acordo.com Bradford (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254) revelou um rendimento 20 total de 21 mg de proteína de fusão-Fc CD16A, isto é, 17,5 mg de proteína de fusão foram produzidos por litro de sobrenadante de cultura. Exemplo 2: Identificação e isolamento de um anticorpo específico a CD16-A

A proteína de fusão CD16A-Fc foi usada para fazer uma varredura de uma grande biblioteca de "Phage Display" de scFv derivada de IgM humana, a qual tinha sido produzida usando métodos similares àqueles descritos anteriormente (Dôrsam et al., 1997 FEBS Letts 414: 7-13, Little et al., 1999 J. Immunol. Methods 231: 3-9, Schwarz et al., FASEB J. 18: 1704-6). Os clones nessa biblioteca continham seqüências de nucleotídeo entre a seqüência de codificação de scFv e o gene pill do fago M13, o qual codificava uma etiqueta de hexa-histidina, um códon terminal âmbar e um epítopo de c-myc. 500 μg de proteína de fusão-Fc CD16A foram biotinilados usando o módulo de biotinilação de proteína ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e usados nos três ciclos de seleção contra a biblioteca de "Phage Display". Antes da seleção, a biblioteca foi consecutivamente pré-adsorvida a poliestireno revestido de estreptavidina e à IgG humana (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) de forma a remover ligantes potenciais a essas proteínas. Aproximadamente 1012 fagos da biblioteca foram resuspensos em PBS, Tween a 0,1%, leite desnatado a 2%, foram incubados com proteína de fusão-Fc CD16A biotinilada solúvel. Complexos de fago/antígeno foram capturados por glóbulos magnéticos revestidos de estreptavidina usando um separador magnético (Dynal, Oslo, Norway). Fagos que não se ligaram especificamente ao antígeno alvo foram removidos através de dez etapas de lavagem com PBS, Tween a 0,1%. As entidades ligadas foram eluídas usando glicina-HCl, pH 2,2 e, após neutralização com 2 M de Tris/HCl, pH 8,0, o eluato foi usado para injeção de células de E. coli XL1 Blue recentemente crescidas na fase exponencial mediana (OD60O de 0,2-0,5). Células que tinham sido transformadas com sucesso com fagemídeos que codificam os scFvs humanos foram selecionados com relação à resistência à ampicilina e foram subsequentemente infectadas com fago auxiliar M13K07 para gerar a prole de fago mostrando scFv para a próxima seleção in vitro. Após o 3o ciclo de seleção, colônias individuais foram crescidas em meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina a 30°C em um PP- Masterblock de 2 mL (Greiner, Frickenhausen, Alemanha) . As células foram coletadas através de centrifugação e resuspensas em 200 μL de Tris-HCl a 200 mM, pH 7,5, sacarose a 20%, 1 mM de EDTA. Durante uma incubação de 1 hora sobre gelo, a membrana externa foi destruída e as proteínas periplásmicas solúveis, incluindo o scFv, foram liberadas no meio de cultura. Após eliminação de esferoplastos e restos celulares através de centrifugação, os extratos periplásmicos brutos foram testados em ELISA com relação à ligação de scFv à proteína de fusão CD16A-Fc. Um clone (50NI) foi encontrado em três ocasiões distintas.

Uma vez que a seleção por afinidade desse clone a partir da biblioteca de "Phage Display" foi realizada sobre uma proteína de fusão-Fc humana, foi necessário demonstrar especificidade do clone 50NI pela porção CD16 da molécula.

Um extrato periplásmico do clone 5ONI foi preparado conforme descrito acima e foi testado em ELISA com relação à sua capacidade de se ligar à proteína de fusão CD16A-Fc e à IgG humana. Anticorpo monoclonal de murino anti-CD16 A9 (Hornbach et al., 1993 Int. J. Cancer 55: 830-836) foi usado como um controle. Uma placa para ELISA Maxisorb™ foi pré- revestida com 500 ng de Estreptavidina e 300 ng de IgG humana (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) por poço em 100 mM de NaHCO3, pH 8,6. Subsequentemente, 3 00 ng de CD16A-Fc biotinilada foram capturados durante 30 min em temperatura ambiente em PBS. CDlβA-Fc capturada em estreptavidina, estreptavidina e IgG humana foram incubadas com 1 μg/mL de MAb A9 ou 50 μl de extrato periplásmico bruto do clone 50NI em PBS/TWEEN a 0,1%/leite desnatado em pó a 2%. Ligação de MAb A9 foi detectada com um conjugado HRP-anti-camundongo de cabra (0,5 μg/mL, Dianova, Hamburg, Alemanha), enquanto que a ligação de scFv 50NI foi detectada por um conjugado HRP anti-Penta His (1 μg/mL, Qiagen, Hilden, Alemanha). 50 μL de TMB (KPL, Maryland, EUA) foram usados como um substrato HRP e a cor deixada revelar. A reação foi cessada com 50 μL 5 de H2SO4 a 0,5M e a absorbância foi medida a 450 nm.

Os resultados são ilustrados na Figura 1. 0 MAb A9 e o scFv 5ONI reconhece claramente a proteína de fusão CDlôA-Fc capturada por estreptavidina biotinilada. O scFv 50NI não revela um sinal sobre a IgG humana e nem sobre a 10 estreptavidina sozinha. O conjugado HRP anti-Penta His usado como um reagente secundário não revelou ligação não- específica aos antígenos. Contudo, o conjugado HRP anti- camundongo de cabra usado como um reagente secundário para detecção do MAb A9 causou alguma coloração de base em 15 virtude de reatividade cruzada com a porção Fc humana da proteína de fusão de CD16 usada como um controle negativo.

Esses resultados são fortemente indicativos de que o scFv 50NI exibe especificidade pela porção CD16A da proteína de fusão e não pela porção Fc.

Exemplo 3: Testagem de scFv 50NI em FACS sobre diferentes linhagens de células expressando estavelmente as isoformas CD16, PBMC humana e granulócitos

Para determinar se o scFv 5 0NI revela ligação à proteína de CD16A nativo sobre a superfície celular, um extrato periplásmico bruto do scFv foi testado através de citometria de fluxo sobre duas linhagens de células diferentes expressando CD16A ou CD16B, respectivamente. Para essa finalidade, a linhagem de células BW/CD16A 5 expressando CD16A (Mandelboim et al., 2001, Nature 409: 1055-1060) e a linhagem de células 293-CD16 (células HEK- 293 estavelmente transfectada com um plasmídeo que codifica o alelo NA-2 da isoforma CD16B humana) foram usadas.

Para avaliar se o scFv 50NI tinha a capacidade de se ligar ao CD16A expresso sobre a superfície de células assassinas naturais (NK) e/ou ao CD16B presente sobre a superfície de granulócitos neutrofílicos (van de Winkel e Capei, 1993, supra; van Spriel et al., 2000, Immunol. Today 21(8): 391-397), ele foi testado com relação à ligação à células mononucleares de sangue periférico recentemente isoladas (PBMCs) consistindo de 10-20% de células NK e sobre células polimorfonucleares (PMN) representando mais de 95% de granulócitos neutrofílicos CD16B-positivos, usando citometria de fluxo. MAb A9 de murino e um extrato periplásmico do clone SCFV18 de murino A9 (um scFv derivado do MAb A9) foram usados como controles.

3.1 Crescimento de linhagens de células e isolamento de PBMC e PMN

Células BW/CD16A foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro de bezerro fetal inativado pelo calor a 10% (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina, aminoácidos não essenciais a 1% e 5 mg/mL de G418. As células 293/CD16B foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro de bezerro fetal inativado pelo calor a 10% (FCS), 2 mM de L- glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 0,5 mg/mL de G418. As linhagens de células precursoras não transfectadas BW e 293 foram cultivadas conforme descrito acima para os transformantes estáveis, mas em meio carecendo de G418. PBMC e PMN foram isoladas de sangue periférico heparinizado de um doador saudável através de centrifugação com gradiente de densidade. O sangue foi diluído duas vezes com PBS, colocado em camadas sobre uma camada dupla consistindo de 12 mL de Histopaque-1119™ (Sigma-Aldrich) e uma camada superior de 12 mL de Histopaque-1077. Centrifugação foi realizada a 800 g durante 25 min. PBMCs localizadas sobre a camada de Histopaque-1077™ (Sigma- Aldrich) superior e a PMN localizada sobre o chumaço de Histopaque-1119 ™ foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBS antes do uso.

3.2 Isolamento de extratos periplásmicos contendo scFv

Extratos periplásmicos brutos contendo scFvs foram isolados de 5 mL de culturas bacterianas. As bactérias recentemente inoculadas foram crescidas durante a noite a 37°C em meio LB contendo 50 mM de glicose, 100 μg/mL de ampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina. As culturas noturnas foram diluídas para uma ODsoonm = 0/1 em meio LB com ampiailina e tetraciclina e ainda crescidas a 37°C até uma ODeoonm = 0,8. As bactérias foram coletadas através de centrifugação e resuspensas em meio LB contendo 0,1 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), 100 μg/mL de ampicilina e 20 μg/mL de tetraciclina. Após incubação durante a noite de bactérias induzidas a 21°C, 300 μL de extratos periplásmicos foram isolados conforme descrito para ELISA. Antes do uso em análise por FACS, os extratos periplásmicos foram submetidos à diálise contra PBS durante a noite.

3.3 Citometria de fluxo

Para a análise por citometria de fluxo, 1 x 106 células BW, BW/CD16A, HEK-293, 293/CD16B, PBMC e PMN foram coradas com o anticorpo monoclonal A9 ou um extrato periplásmico contendo scFVi8A9 e 50NI. 1 x 106 células foram incubadas com 100 μL dos extratos periplásmicos submetidos à diálise ou com MAb A9 (10 μg/mL) durante 45 min sobre gelo. Incubações de anticorpo/scFv com PBMC e PMN foram suplementadas com IgG policlonal humana a Img/mL para bloquear receptores Fc sobre a superfície das sub-populações de PBMC e PMN. Após lavagem com tampão FACS (PBS suplementado com FCS inativado pelo calor a 2% e azida de sódio a 0,1%) e as células foram incubadas sobre gelo durante 45 minutos com 0,1 mL de 0,01 mg/mL de MAb 13/45/31-2 anti-(His)6 de camundongo (Dianova, Hamburg, Alemanha) no mesmo tampão. Após um segundo ciclo de lavagem, as células foram incubadas com 0,1 mL de 0,015 mg/mL de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra conjugados com FITC (Dianova, Hamburg, Alemanha) sob as mesmas condições. As células foram, então, novamente lavadas e resuspensas em 0,5 mL de tampão FACS contendo 2 μg/mL de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) para excluir as células mortas. A fluorescência de 1 x 104 células coradas foi medida usando um citômetro de fluxo Beckman-Coulter Epics XL. As intensidades médias de fluorescência foram calculadas usando os softwares System-II e Expo32 (Beckman- Coulter, Krefeld, Alemanha). A fluorescência causada pela coloração de base das células com os agentes secundários sozinhos foi subtraída dos resultados e histogramas plotados (não mostrados) para auxiliar na análise.

3.4 Resultados

O anticorpo monoclonal anti-CD16 de murino A9 e o scFvis anti-CD16 derivado de A9 serviram como controles positivos e revelaram ligação clara à BW/CD16A em comparação com as células precursoras não transfeetadas 5 (BW). 0 scFv 5 ONI também mostrou coloração inequívoca das células BW/CD16A em nível comparável ao A9.

Ambos os anticorpos monoclonais A9 e scFv18 A9 exibiram forte ligação aos transfectantes 293/CD16B, os quais expressam a isoforma CD16B sobre sua superfície, 10 enquanto que o 50 NI não se liga a essa linhagem de célula.

O anticorpo monoclonal A9 e o scFv18 A9 revelaram uma coloração clara de uma pequena sub-população das PBMCs, representando a fração de células NK. O scFv 50NI, similarmente, exibiu ligação a essa sub-população.

Em contraste ao A9 e ao scFv derivado de A9, ambos os quais mostraram um forte sinal sobre os granulócitos purificados, o scFv 50NI falhou em se ligar à PMN.

Esses dados indicam que o scFv 50NI se liga especificamente à isoforma CD16A e não se liga à isoforma 2 0 CD16B. O scFv 50NI também reconhece não apenas CD16A recombinante, mas também o antígeno nativo, conforme expresso sobre a superfície de células NK.

Exemplo 4: Ligação de scFv 50NI anti-CD16A humano às células NK enriquecidas

Para demonstrar que a sub-população de PBMC que foi reconhecida pelo 50NI conforme mostrado no Exemplo 3 compreende células assassinas naturais (NK), uma população enriquecida de células NK foi isolada de PBMC e analisada com relação à ligação ao scFv 50NI através de citometria de fluxo.

PBMCs foram isoladas de sangue periférico heparinizado de um doador saudável através de centrifugação em gradiente de densidade. A amostra de sangue foi diluída duas vezes com PBS, colocada em camadas sobre uma camada de Histopaque-1077™ (Sigma-Aldrich) e centrifugada a 800 g durante 25 min. PBMCs localizadas na interface foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBS. Para isolamento de células NK, as PBMCs foram resuspensas em FCS/PBS a 2% e foram submetidas a um ciclo de seleção negativa usando o kit de enriquecimento de células NK EasySEP™ negativo (CellSystems) de acordo com as instruções dos fabricantes. Coloração das PBMC e células NK e análise por citometria de fluxo foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 3 acima: 1 x 106 das células foram coradas com 10 μg/mL do MAb A9 ou do anticorpo monoclonal anti-CD56 MAb B159 (BD Biosciences/Pharmingen) , seguido por 15 μL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC. O SCFVI8 A9 de murino e o scFv 50NI humano foram usados para coloração em uma concentração de 50 μg/mL e o scFv ligado à célula foi detectado com 10 μg/mL de MAb anti“(His)g, seguido por 15 μL de IgG ant i - camundongo de cabra conjugada com FITC. Todas as colorações foram realizadas na presença de 1 mg/mL de IgG humana policlonal. Células mortas foram excluídas através de coloração com iodeto de propídio conforme descrito acima. Análise dos dados foi realizada conforme descrito no Exemplo 3 acima.

4.1 Resultados

Coloração de PBMC com os anticorpos anti-CD56 e anti- CD16 identificou claramente uma sub-população representando a fração de células NK. O scFv 50NI também reconheceu uma pequena população de células, indicando ligação às células NK.

Após enriquecimento negativo das células NK, todos os quatro anticorpos/scFvs revelaram coloração inequívoca. Enquanto que o MAb anti CD56 exibiu ligação a toda a população de células NK, uma pequena fração das células não foi corada usando os anticorpos dirigidos contra CD16. Esse poderia refletir a presença de algumas células com um fenotipo CD15-negativo. Exemplo 5: Medição do fluxo de Ca2+ após ligação ao scFv 50NI CD15A, o receptor de baixa afinidade pela IgG, é expresso sobre a maioria das células NK do sangue periférico em associação com o motivo de ativação de imunoreceptores baseados em tirosina (ITAM) contendo a cadeia y do FcεRI ou a cadeia C do complexo TCR/CD3.

Ligação de CD16A a anticorpos ou complexos imunes dispara a citotoxicidade de células NK e secreção de citocina. A ativação envolve fosforilação da cadeia y ou da cadeia Ç, respectivamente, e subseqüente transdução de sinal intracelular, tal como mobilização de Ca2+.

Para testar se o scFv anti-CD16 50NI humano possui propriedades de ativação de NK, medições do fluxo Ca2+ com células NK recentemente isoladas foram realizadas após ligação de receptores de superfície com anticorpos monoclonais anti-CD16 ou scFv. Uma vez que alguns 15 anticorpos anti-CD16 precisam de ligação cruzada através de reagentes secundários para evidenciar um claro aumento de cálcio intracelular, anti-c-myc e anti-(His)6 em combinação com IgG anti-camundongo foram usados para ligar cruzadamente os anticorpos anti-CD16 ligados à célula. 20 Para preparo de NK, PBMCs foram isoladas de sangue periférico heparinizado de um doador saudável através de centrifugação com gradiente de densidade. A amostra de sangue foi diluída duas vezes com PBS, colocada em camadas sobre uma camada de Histopaque-1077™ e centrifugada a 800 g durante 25 min. PBMCs localizadas na interface foram coletadas e lavadas três vezes com PBS. Para isolamento das células NK, as PBMCs foram resuspensas em FCS/PBS a 2% e submetidas a um ciclo de seleção negativa usando o kit de enriquecimento de células NK EasySEP™ negativo de acordo com as instruções do fabricante (Cell Systems) . As células NK foram lavadas uma vez com HBSS e, então, marcadas com o indicador de cálcio Fluo-4-acetóximetil (AM) éster (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos) em uma concentração de 2 μM durante 30 min em temperatura ambiente no escuro. Após lavagem com HBSS, as células foram incubadas durante mais 20 min em HBSS para permitir desesterificação completa de ésteres AM intracelulares e lavadas novamente com HBSS. Para análise por citometria de fluxo de alterações de cálcio intracelular, alíquotas de células NK marcadas foram primeiramente medidas sem qualquer anticorpo sobre um citômetro de fluxo Beckman-Coulter Epics XL para determinar a fluorescência de base. Após aproximadamente 60 seg, anticorpos anti-CD16 (2 μg de MAb A9 ou 5 μg de scFvl8 A9 ou 5 μg de scFv 50NI) foram adicionados e a medição foi continuada. A 180 seg após o início, 20 μg de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra policlonais (GAM) foram adicionados à amostra de MAb A9 para se ligarem cruzadamente ao A9 ligado ao CD16 sobre a superfície de células NK. Para ligar cruzadamente os scFvs, 2,5 μg de MAb 13/45/31-2 anti-(His)« de camundongo e 2,5 μg de MAb 9E10 anti-c-myc foram aplicados antes de continuar a 5 medição. No caso das amostras com os scFvs, 20 μg de anticorpos IgG anti-camundongo de cabra policlonais foram adicionados em pontos de tempo posteriores para ainda ligar cruzadamente MAbs anti-(His)ε e/ou anti-c-myc ligados ao scFv. As intensidades médias de fluorescência de intervalos 10 de tempo curtos foram determinadas usando o software Expo32 (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemanha) e plotados contra o tempo (não mostrado).

Os traços de fluorometria obtidos com as células NK recentemente isoladas mostraram claramente que o MAb A9 15 evidencia um forte aumento na concentração de cálcio intracelular quando ligado cruzadamente com anticorpos IgG anti-camundongo, o que é refletido por maiores sinais de fluorescência. Em contraste ao MAb A9, o scFv derivado de A9 (scFv18 A9) induziu pouco ou nenhum aumento de cálcio 20 intracelular mesmo após ligação cruzada com anticorpos IgG anti-(His)6, anti-c-myc e anti-camundongo. O scFv 50NI humano, contudo, evidenciou um claro sinal de fluorescência (embora ligeiramente fraco) após ligação do scFv ligado à superfície celular com anticorpos de ligação cruzada. Isso demonstra que o scFv 50NI humano possui características de ligação que são adequadas para disparar atividade de células NK via CD16A. Exemplo 6: Maturação por afinidade do scFv 50NI através de 5 embaralhamento de cadeia leve

Para obter scFvs anti-CD16 com afinidade aumentada, uma biblioteca de cadeia embaralhada baseada no clone 50NI foi gerada através do rearranjo da cadeia VH do 50NI com um repertório de gene VL. 10 Os repertórios de gene VA e VK foram excisados do DNA de pEXHAMl originário de uma grande biblioteca de scFv naive humana previamente descrita (Schwarz et al., supra, 2004) . Esse repertório reflete aproximadamente 105 cadeias VA, e VK individuais cada. O rearranjo com a cadeia pesada 15 do 50NI através de clonagem nos sítios MluT e Notl do pEXHAMl e a transformação de 1 μg em E. coli XL1 blue (1,8 kV, cubeta com largura de 0,1 cm, 25μF, 200 fi) resultou em uma biblioteca com 2,6 x 10Ê (VK) e 2,2 x 106 (VJ elementos.

Análise de seqüência de 32 clones aleatoriamente escolhidos após transformação mostrou que cada clone continha uma cadeia leve individual e 24 clones revelaram expressão de scFvs de comprimento total detectável por um anticorpo anti-His (Qiagen, Hilden, Alemanha) em uma Western Blot.

Quatro ciclos de seleção foram realizados sobre uma proteína de fusão CD16A-Fc biotinilada conforme descrito no Exemplo 2. Pressão de seleção favorecendo ligações de alta afinidade foram criadas limitando-se sucessivamente à concentração de antígeno (Io ciclo 20 nM, 2o ciclo 1 nM, 3o ciclo 0,1 nM, 4o ciclo 0,01 nM) . As bibliotecas K- e X rearranjadas foram mantidas separadamente.

Aproximadamente 108 fagos de cada biblioteca resuspensa em PBS/TWEEN a 0,1%/leite desnatado a 2% foram incubados com a proteína de fusão CDISA-Fc biotinilada. Complexos de fago/antígeno foram resgatados através da adição de glóbulos magnéticos revestidos com estreptavidina e fagos de ligação não específica a antígeno foram removidos através de dez etapas de lavagem com PBS/TWEEN a 0,1%. Em uma primeira etapa, as entidades ligadas foram eluídas usando glicina-HCl, pH 2,2. Após neutralização com Tris/HCl a 2 M, pH 8, E. coli XL1 Blue recentemente crescida (fase exponencial mediana OD600 de 0,2-0,5) foram adicionados de forma a recuperar fagos os quais não puderam ser removidos pelo baixo pH. As células que eluíram através de eluição ácida também foram misturadas com células hospedeiras XL1 em crescimento exponencial.

Células transduzidas com sucesso com fagemldeo, que codifica um scFv humano, foram selecionadas com relação à resistência à ampicilina e subsequentemente infectadas com o fago auxiliar M13K07 para gerar um fago apresentando scFv 5 para seleção posterior in vitro. Em ciclos subsequentes de seleção, o fago recuperado através de eluição ácida e infecção de XL1 blue foram manualmente separados. Após os 3 o e 4 o ciclos de seleção por afinidade, as colônias individuais foram testadas em ELISA conforme descrito no 10 Exemplo 2.

Nenhum dos clones testados da K-biblioteca rearranjada mostrou sinais significativos acima daquele do clone 50NI precursor crescido como referência no mesmo bloco mestre. Contudo, vários clones foram seqüenciados e provaram ser 15 idênticos ao clone precursor, indicando que nenhuma K- cadeia adequada foi encontrada a qual aperfeiçoou as propriedades de ligação.

Em contraste, análise de clones derivados da X- biblioteca rearranjada revelou numerosos clones gerando 20 sinais até cinco vezes mais com relação à referência. 30 clones foram selecionados para seqüenciamento após o 3o e 34 clones foram selecionados para seqüenciamento após o 4o ciclo de "bio panning". Seqüenciamento foi realizado com o

Long Read Tower (Visible Genetics, Toronto, Canadá) usando o Deaza Kit (Visible Genetics, Toronto, Canadá) seguindo as diretrizes dos fabricantes. Eluição ácida de partículas de fago ligadas ou infecção direta das células hospedeiras não 5 teve efeito óbvio sobre a distribuição posterior dos clones. Cinco diferentes grupos de clones enriquecidos e vários individuais foram identificados. A Tabela 2 proporciona uma visão geral dos diferentes grupos. Tabela 2. Designações de clones que representam um 10 determinado grupo em subsequentes exemplos são realçadas em negrito

Clones que formam o grupo A representam o clone precursor 50NI, o qual também estava presente na biblioteca embaralhada em virtude do vetor precursor re-ligado ou não cortado ou em virtude do rearranjo durante a construção da 5 biblioteca. Essa descoberta se correlaciona com o fato de que os clones desses grupos proporcionaram os sinais mais fracos por ELISA.

Todos os outros grupos contêm cadeias leves recentemente rearranjadas, revelando sinais aumentados por ELISA, comparados com o clone precursor. Clones dos grupos C e D foram encontrados em números comparáveis após os 3o e 4o ciclos de seleção.

Análise das seqüências usando um software de alinhamento de V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) revelou que todas as novas cadeias Vx pertencem à família VL3, bem como a cadeia VL do clone precursor.

As seqüências de aminoácido da cadeia VH comum compartilhada por todos os clones é fornecida aqui como SEQ ID NO 9 e a cadeia VL específica para os clones 50NI, 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 são fornecidas aqui como SEQ ID NOs 10-16, respectivamente. A seqüência de ácido nucléico que codifica a cadeia VH comum é fornecida — 15 aqui como SEQ ID NO 1 e as seqüências de ácido nucléico que codificam as cadeias VL individuais para os clones 50NI, 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 são fornecidas aqui como SEQ ID NOs 2-8, respectivamente. As seqüências de aminoácido das CDRs de cadeia pesada e leve individuais são 20 fornecidas na Tabela 1, com as CDRs de cadeia pesada comuns mostradas como a primeira entrada na tabela, seguido pelas CDRs de cadeia leve para 50NI, 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 (mostradas como entradas 2-8, respectivamente) Exemplo 7: Análise por FACS de scFv maturado por afinidade sobre linhagens de célula transfectadas com CD16A e CD16B

Uma análise por FACS preliminar com extratos periplásmicos brutos de todos os clones individuais mostrou que todos os scFvs com cadeia embaralhada retinham sua capacidade de se ligar ao CD16A. Para esse teste, células HEK-293 transitoriamente transfectadas com CD16A foram usadas (dados não mostrados). Baseado nesse teste, os clones 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 foram selecionados para outra caracterização.

Ácidos nucléicos que codificam esses scFvs foram subclonados no vetor de expressão pSKK2, onde eles foram clonados "in-frame" com uma sequência líder N-terminal PelB e etiquetas de hexa-histidina e c-myc C-terminais. As seqüências de nucleotídeos desses sub-clones são como segue: PSKK2-50NI (SEQ ID NO 36) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtatcctatgagctgatgcagccaccctcagtgtccgtgtcctcagga cagacagccagcatcccctgctctggagataaattggaggaaaaatatgtttcctggta tcaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccct 5 cagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatc agcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacag tgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa 10 pSKK2-3-LB3 (SEQ ID NO 37) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag 15 cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccactctcagagtcagtggcccaggga 20 cagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattgaaagtagaaatgttcactggta ccagcagaagccaggccaggcccctgtgttggtcatctatagggataacaaccggccct ctgggatccctgagcgattctctggctccaattcggggaacatggccaccctgaccatc agcagagcccaagccggggatgcagctgactattactgtcaggtgtgggacaactacac tgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa pSKK2-3-LB5 (SEQ ID NO 38) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcagtggcagtggccccagga aagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggta ccagcagaagccaggccaggcccctgtgctggtcatctatagggatagcaaαcggccct ctgggatccctgagcgattctctggctccaactcggggaacacggccaccctgaccatc agcagagcccaagccggggatgaggctgacttttattgtcaggtgtgggacaactatat tgtgctgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctgggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa PSKK2-3-LB6 (SEQ ID NO 39) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag n° cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtacaggctgtgctgactcagccgccctcagtgtcagtggccccagga cagacggccaggattccctgtgagggaaacaacattggaagtaaaaatgtccactggta tcggcagaagccaggccaggtccctgtcctggtcatgtatgatgatagcgaccggccct cagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatc agcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacag tgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa PSKK2-3-LS49 (SEQ ID NO 40) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccactctcagtgtcagtggccccggga cagacggccaggattacctgtgggggaaacaacattggaagtaaaaatgtgcactggta ccagcagaagccaggccaggcccctgtactggtcatctatagggacagcagccggccct /'/ I ctgggatccctgagcgactctctggctccaactcgggggacacggccaccctgaccatc agcagagcccaggccggggatgaggctgactattactgtcaggtgtgggacgactacat tgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgcccccc cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa pSKK2-4-LS14 (SEQ ID NO 41) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtatcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgaccccagga cagacggccacgattacctgcggggcaaacgacattggaaaaagaaatgtccactggta ccaacagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccct ca99gatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatc a9c9gSacccag9cga.tggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacag tgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa PSKK2-4-LS21 (SEQ ID NO 42) atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctggcagctcagccggc ia catggcggaggtccagctggtacagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctc tgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtg cgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtag cacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgacccgggacacgtccacga 5 gcacagtctacatggagcttagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gctagaggtagtgcttattactacgattttgctgactactggggccagggaaccctggt caccgtctcctcagggagtgcatccgccccaacccttaagcttgaagaaggtgaatttt cagaagcacgcgtacagcctgtgctgactcagccatcctcggtgtcagtggccccagga cagacggccacgatctcctgtgggggacacaacattgggagtaaaaatgtgcactggta 10 ccagcagaggccaggccagtcccctgtgttggtcatttatcaggataataagcggccct cagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatc agcgggacccaggcgatggatgaggctgactactattgtcaggtgtgggacaattacag tgtgctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccct cggtcactctgttcccgccgtccgcggccgctggatccgaacaaaagctgatctcagaa 15 gaagacctaaactcacatcaccatcaccatcactaa

A seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência líder PelB é atgaaatacctattgcctacggcagccgctggcttgctgctgctgg cagctcagccggccatggcg (SEQ ID NO 43).

A seqüência de nucleotídeos que codifica a região 20 ligante entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada de cada scFv é gaagaaggtgaattttcagaagca (SEQ ID NO 44) .

A seqüência de nucleotídeos do c-myc e da etiqueta de hexa-histidina são gaacaaaagctgatctcagaagaagaccta (SEQ ID NO 45) e catcaccatcaccatcac (SEQ ID NO 46) , respectivamente.

Os vetores compreendendo os sub-clones foram transformados em E. coll RV308, expresso em culturas em frasco de agitação de 2 litros e purificados através de cromatografia de afinidade com ions metálicos imobilizados (IMAC) de acordo com Le Gall et al. (2 004, J. Immunol. Methods 285: 111-127).

Para avaliar se o scFv com cadeia embaralhada retinha sua especificidade pelo CD16A conforme indicado para 50NI no Exemplo 3, linhagens de célula transfectadas expressando CD16A ou CD16B foram testadas com scFv purificado por IMAC. Para análise por citometria de fluxo, as seguintes linhagens de célula foram usadas: transfectantes BW e BW/CD16A foram cultivados conforme descrito anteriormente. Células 293 e transfectantes 293-CD16B foram manipuladas conforme descrito anteriormente. 293-CD16A e 293-NKp46 foram gerados através de transfecção transitória de células 293 com plasmídeos que codificam os domínios extracelulares de CD16A ou NKp46, respectivamente, fundidos aos domínios transmembrana e citoplásmico da cadeia CD3Ç humana (pcDNA3- CD16A-zeta e pcDNA3-NKp46~zeta, obtidos do Dr. O. Mandelboim, University of Jerusalem, Israel). As transfecções transitórias foram realizadas usando o método Z/y com fosfato de cálcio, conforme descrito no Exemplo 1, e foram usadas para coloração e análise por citometria de fluxo dois dias após transfecção transitória. Coloração e análise por citometria de fluxo foram realizadas conforme 5 essencialmente descrito acima. 1 x 106 das células indicadas foram coradas com 50 μg/mL do scFv purificado, seguido por 10 μg/mL de MAb 13/45/31-2 (anti-hexa His) e 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC.

Para demonstrar que as células transfectadas expressam 10 os antígenos correspondentes sobre sua superfície, células foram coradas em paralelo com 10 μg/mL de MAb A9 e monoclonal anti-NKp46, MAb 195314 (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha). MAbs A9 e 195314 foram detectados com 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugada com FITC. As 15 intensidades médias de fluorescência obtidas a partir de análise por citometria de fluxo foram corrigidas subtraindo-se os valores de fluorescência de colorações com os reagentes secundários sozinhos e os resultados são mostrados na Figura 2. 20 O MAb A9, usado como um controle positivo, cora, conforme esperado, para todas as linhagens de células transfectadas com CD16, a despeito da isoforma. Nenhuma ligação aos transfectantes NKp46 foi observada, enquanto que coloração com MAb 195314 dirigido contra NKp46 mostrou claramente que as células foram transfectadas com sucesso com o plasmídeo de controle que codifica NKp46.

O scFv 50NI anti-CD16 humano precursor usado como uma referência revelou fraca coloração das duas linhagens de célula expressando CD16A sobre sua superfície (as células BW/CD16 A e 293/CD16A). Em contraste, o scFv recentemente isolado com cadeias leves rearranjadas exibiu ligação altamente aperfeiçoada a essas células. Nenhuma das novas variantes se ligou às células 293 estavelmente transfectadas com CD16B, demonstrando especificidade pela isoforma A de CD16.

Exemplo 8: Testagem de fragmentos de scFv maturados por afinidade sobre células NK enriquecidas e PMN recentemente isoladas

Para avaliar se o scFv aperfeiçoado retinha sua capacidade de se ligar especificamente ao CD16A expresso sobre leucócitos, PMN recentemente isoladas e células NK enriquecidas de sangue de doador foram coradas conforme descrito anteriormente usando scFv purificado por IMAC. Enriquecimento de células NK foi realizado através de seleção negativa, conforme descrito acima. As intensidades médias de fluorescência obtidas a partir de análise por citometria de fluxo são mostradas na Figura 5.

Coloração da população de leucócitos enriquecida com um MAb A9 anti-CDlδ e MAb B159 anti-CD56 demonstra claramente que a população consiste de células NK de sangue periférico CD16+/CD56+. O MAb A9 e o scFv de murino derivado de A9 corou a fração de células NK CD16A~positivas e mostrou um sinal ainda mais forte sobre granulócitos CD16B-positivos. MAb A9 reconheceu uma sub-população (18,5%) de PBMCs correspondendo às células NK CD16-positivas. Forte ligação foi observada sob células NK enriquecidas e granulócitos isolados (dados não mostrados).

O clone 50NI precursor revelou ligação fraca, mas clara, às células NK enriquecidas, enquanto que nenhuma coloração dos granulócitos era visível. As variantes maturadas por afinidade 3-LB3, 3-LB5, 3-LB6, 3-LS49, 4-LS14 e 4-LS21 revelaram padrões de coloração semelhantes àquele do 50NI, mas com sinais de ligação aperfeiçoados. Esses dados proporcionam suporte adicional para o fato de que os scFvs maturados por afinidade são capazes de distinguir especificamente entre as duas isoformas de CD16 e se ligam especificamente ao CD16A. Exemplo 9: ELISA sobre CDISA-Fc e CD16B recombinantes

De forma a gerar dados adicionais que sustentam a especificidade dos scFvs por CD16A, um ELISA foi realizado usando a proteína de fusão CD16A-Fc (Exemplo 1) e CD16B-Fc recombinante comercialmente disponível (Alelo NA-2; BSA free; RD Systems). Uma proteína de fusão gp34-Fc foi usada como um controle negativo. As proteínas recombinantes foram revestidas durante a noite em uma concentração de 80 nM em 5 100 mM de NaHC03 em um pH de 8,8.

Detecção do scFv ligado às proteínas recombinantes foi realizada usando um conjugado anti-c-myc-HRP (10 μg/ml). O controle positivo compreendia MAb A9 (1 μg/mL), seguido por um conjugado de igG-HRP anti-camundongo de cabra (0,5 10 μg/mL). Ligação ao CD16B recombinante foi testada através de coloração direta com anti-His-HRP (1 μg/mL) e ligação às proteínas de fusão de Fc foi testada através de um conjugado de IgG-HRP anti-humano (0,15 μg/mL).

Todos os scFv mostraram forte ligação ao CD16A-FC, 15 enquanto que nenhuma ligação ao CD16B foi observada (Figura 3) . Uma ligação de base ligeiramente aumentada foi percebida com gp34-Fc. Isso foi provavelmente em virtude de uma pequena quantidade de ligação não especifica à gp34-Fc, uma vez que todos os anticorpos secundários testados 20 sozinhos também revelaram sinais de base ligeiramente aumentados sobre essa proteína.

Conforme esperado, A9 reconheceu fortemente CD16A-Fc. Contudo, deve ser considerado que o anticorpo conjugado ao HRP anti-camundongo de cabra secundário mostra reatividade cruzada significativa com a fusão de Fc humana (veja controle com HRP anti-camundongo de cabra sozinho). Reprodução desse ensaio usando um conjugado de IgG-HRP anti-camundongo de cabra pré-adsorvido com reatividade cruzada mínima à IgG humana (dados não mostrados) não revelou redução significativa na ligação de base. MAb A9 mostrou um sinal claro sobre CD16B, a qual não foi influenciada pelo reagente secundário. Exemplo 10: Western Blot sobre CD16A-Fc recombinante sob condições de redução e não redução

Para caracterização adicional, todos os scFvs anti- CD16A foram testados com relação à ligação em Western Blot sobre CD16A-Fc e NKp46-Fc recombinantes. CD16A-Fc e NKp46-Fc, servindo como um controle negativo, foram separados através de SDS-gel a 12% sob condições de redução e sobre um gel a 8% sob condições de não redução. As proteínas foram transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose através de eletroblotting. Após coloração com Ponceau S, a membrana foi cortada em tiras de 5 mm de largura. Cada tira de nitrocelulose foi individualmente incubada com scFv (4 μg/ml) em PBS, Tween a 0,1%, leite desnatado a 2%. Detecção foi realizada com o conjugado HRP anti-Penta His (1 μg/mL) usando diaminobenzidina (DAB) como um substrato de peroxidase. /O I

Tiras de controle foram incubadas com A9 (1 μg/mL) ou anti- NKp46 195314, seguido por um conjugado HRP IgG anti- camundongo de cabra (0,2 μg/mL, reatividade cruzada mínima). Como um controle positivo adicional, um conjugado HRP IgG anti-humano de cabra (0,16 μg/mL) foi usado para detecção da porção Fc das proteínas de fusão.

Os anticorpos monoclonais A9 e 195314 reconheceram seu antígeno sob condições de redução, bem como de não redução. O conjugado HRP-anti-camundongo de cabra usado como um reagente secundário para o MAb A9 revelou ligeira reatividade cruzada com a porção Fc da proteína de fusão CD16A-Fc. Em contraste, a ligação dos scFvs anti-CD16 foi observada apenas sob condições de não redução, indicando que uma estrutura secundária estabilizada por ligações em ponte de dissulfeto é requerida para reconhecimento. O clone precursor 50NI mostra sinais mais fracos comparado com os scFvs maturados por afinidade. Nenhuma ligação do scFv 3-LB6 pôde ser detectada e nenhum dos scFvs revelou reatividade cruzada com a proteína de controle NKp46-Fc, confirmando a especificidade por CD16. Exemplo 11: Análise do scFv através de cromatografia por exclusão de tamanho sobre uma coluna Superdex 200

Para determinar se as maiores afinidades das variantes de scFv são primariamente em virtude de ligação monovalente aperfeiçoada, os preparados de proteína foram analisados com relação à sua composição oligomérica sobre uma coluna de gel filtração Superdex 200. 0 LMW Gel Filtration

Calibration Kit (Amersham Pharmacia Biosciences, Freiburg, 5 Alemanha) serviu como um padrão. A Tabela 3 proporciona um sumário das formas moleculares presentes nos preparados de proteína individuais. Tabela 3. Formas moleculares de scFvs presentes em preparados de proteína individuais. 3-LB5 não foi analisado 10 em virtude da baixa concentração de proteína.

Cromatografia por exclusão de tamanho demonstrou claramente que os scFvs 3-LB6 e 4-LS21 eram unicamente monoméricos.

Em contraste, o 3-LS49, 3-LB3 e 4-LS14 revelaram 15 proporções significativas de moléculas diméricas, indicando que as propriedades de ligação aperfeiçoada dessas moléculas pode não ser apenas em virtude de maior afinidade, conforme para 3-LB6 e 4-LS21, mas também refletem um efeito de avidez em virtude da formação de dímero. Exemplo 12: Determinação de afinidade do soFv através de 5 ressonância plasmônica de superfície (SPR)

As constantes de afinidade (valores de KD) do scFv foram determinadas através de SPR usando o sistema biosensor BIAcore 2000 (Amersham-Pharmacia). A proteína de fusão CD16A-FC e BSA, usada como um controle negativo, 10 foram imobilizados sobre um "chip" sensor revestido com carbóximetildextrana CM5 usando química convencional com NHS/EDC para o procedimento de acoplamento de amina (BIAcore). scFvs purificados foram diluídos em tampão HBS- EP (BIAcore, Uppsala, Suécia). Os dados de ligação foram 15 gerados passando vãrias concentrações dos anticorpos scFv (100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM e 1600 nM) sobre o antígeno imobilizado. 0 MAb A9 anti-CD16 serviu como um controle positivo. Todas as medições por SPR foram realizadas em uma taxa de fluxo constante de 20 μL/min em tampão HBS-EP a 20 25° C. Cada amostra injetada (100 μl) ficou em contato com antígeno durante 5 minutos. A dissociação foi acompanhada durante 30 minutos. Após cada ciclo, a superfície do "chip" sensor foi submetida a fluxo com tampão HBS-EP. Os sinais do canal de controle revestido com BSA foram automaticamente subtraídos. As constantes cinéticas foram calculadas de acordo com o modelo de ligação de Langmuir 1/1 usando o software BIAevaluation versão 3.0 (BIAcore). As constantes de taxa "off" e "on" calculadas e respectivos 5 valores de KD são resumidos na Tabela 3. Para o MAb A9, usado como um controle, uma KD de 1,75 x 10'9 M foi calculada, com o valor de 1,55 x 10’9 M descrito na literatura (Renner et al., 2001 Cancer Immunol. Immunother. 50: 102-108). Adicionalmente, as constantes de dissociação 10 em equilíbrio foram deduzidas a partir de análise em estado uniforme para os scFvs 50NI, 4-LS21 e 3-LB6 a partir dos dados de SPR. Tabela 4. Dados para a cinética de ligação de scFvs individuais

As constantes cinéticas calculadas independentemente através desses dois métodos se correlacionam bem e comparação direta com o clone precursor 50NI revelou um aperfeiçoamento de mais de vinte vezes na afinidade através de embaralhamento de cadeia leve. Todos os três scFvs formam somente populações de proteína monomérica (comparar Tabela 3, Exemplo 11) , indicando que as propriedades de ligação aperfeiçoadas são em virtude de maior afinidade baseado em otimização da interface antígeno/scFv e não por efeitos de avidez.

Os scFvs 3-LS49, 3-LB-3 e 3-LS14 revelam valores de KD comparáveis, mas mostram uma população de moléculas não homogênea compreendendo percentuais significativos de moléculas diméricas (comparar tabela 2, exemplo 13). Assim, as afinidades aperfeiçoadas desses anticorpos podem ser, pelo menos parcialmente, em virtude de ligação multivalente. Exemplo 13: Indução de fluxo de Ca2+ em células NK através 5 de ligação do scFv anti-CD16 maturado por afinidade

Para avaliar se o scFv maturado por afinidade retinha sua capacidade de evidenciar a mobilização de Ca2" em células NK de sangue periférico, conforme mostrado para o scFv 50NI anti-CD16 precursor, células NK foram isoladas e 10 enriquecidas a partir do sangue periférico e usadas para medições do fluxo de Ca2+ através de citometria de fluxo, conforme descrito acima no Exemplo 5.

Os resultados demonstram claramente que a adição do MAb anti-(His)s, seguido pelos anticorpos IgG policlonais 15 anti-camundongo de cabra (GAM) sozinhos, não induz ã alterações significativas na concentração de cálcio intracelular em células NK recentemente isoladas. Contudo, um aumento claro no sinal de fluorescência foi observado quando scFv 50NI foi adicionado e ligado cruzadamente pelo 20 MAb anti-(His)6, seguido por GAM, conforme já mostrado no Exemplo 5. Quando o scFv anti-CD16 maturado por afinidade (3-LS49 ou 4-LS21, usados como exemplos ilustrativos) foi aplicado, o aumento no sinal induzido após ligação cruzada pelo anti- (His) e, seguido por GAM, foi pelo menos tão forte quanto o sinal disparado pelo 50NI. Assim, pode ser concluído que todos os scFvs que são derivados do scFv 50NI humano através de embaralhamento de cadeia retêm sua capacidade de ativar células NK e disparar uma mobilização de cálcio intracelular através de ligação ao CD16A.

Exemplo 14: Disparo de atividade citolítica em células NK recentemente isoladas CD16A está envolvido em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) mediada por células NK. In vitro, foi mostrado que a ativação de anticorpos monoclonais do isotipo IgG específico para CD16 pode disparar a morte de linhagens de células alvo FcR- positivas. Para determinar se o scFv anti-CD16A maturado por afinidade, que induz ã mobilização de cálcio em células NK, também é capaz de mediar a citotoxicidade por NK, esses scFvs foram testados em um ensaio de morte redirecionada com células NK recentemente isoladas contra células P815 FcR-positivas de murino. Uma vez que o scFv carece da porção Fc da IgG, eles foram usados junto com um anticorpo monoclonal anti-(His)6 de murino. A lise celular redirecionada foi medida em um ensaio de liberação de calceína. Células NK foram isoladas e enriquecidas a partir de PBMC de um doador saudável, conforme descrito acima. Análise por citometria de fluxo demonstrou que a população de NK consiste de 81% de células CD16-positivas e 94% de células CD56-positivas; células CD3-positivas ou CD19- positivas não puderam ser detectadas em quantidades significativas (dados não mostrados). A linhagem de células P815 de murino (gentilmente fornecida pelo Dr. G. Moldenhauer, DKFZ, Heidelberg, Alemanha) foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 10% (FCS) , 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 50 μM de β-mercaptoetanol. Para o ensaio, as células alvo P815 foram marcadas com Calceína AM a 10 μM (Molecular Probes) em meio RPMI 1640 sem FCS durante 30 min a 37°C. Após lavar duas vezes com meio RPMI 164 0, as células P815 marcadas foram resuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com FCS inativado pelo calor a 10%, 2 mM de L- glutamina, 100 U/mL de penicilina G sódica, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina, para uma densidade de 1 x 106/mL. A partir dessa suspensão, 50 μL, correspondendo a 1 x 104 células, foram cultivados em poços individuais de uma placa de microtitulação de fundo redondo com 96 poços. 1 x 10s células NK recentemente isoladas foram adicionadas em 50 μL aos poços, proporcionando uma proporção de efetor- para-alvo de 10:1. Anticorpos anti-CD16 e anticorpos de controle foram adicionados aos poços até uma concentração final de 1 μg/mL e, onde indicado, 1 μg/mL de MAb 13/45/312 anti-(His)6 de camundongo foi aplicado. Anticorpos monoclonais OKT3 (um MAb anti-CD3), A9 e 13/45/31-2 anti- (His)g foram uma cortesia do Dr. G. Moldenhauer, DKFZ, Heidelberg, Alemanha. O anticorpo B159 anti-CD56 foi adquirido da BD Biosciences/Pharmingen (Heidelberg, Alemanha) e 195314 anti-NKp46 da R&D Systems (Wiesbaden, Alemanha). As placas foram incubadas durante 3 horas a 37 °C em uma atmosfera umidifiçada com 5% de CO2. A alguns poços, Triton X 100 a 1% foi adicionado (Roth, Karlsruhe, Alemanha) para proporcionar lise máxima de células alvo. A liberação espontânea de calceína foi determinada através da incubação das células alvo sem células efetoras e sem anticorpos. Após incubação, as placas de microtitulação foram centrifugadas a 500 g durante 5 min e 100 μL do sobrenadante foram coletados para medir a fluorescência (F) da calceína liberada com um leitor Multilabel a 520 nm (Victor3, Perkin Elmer, Rodgau, Alemanha). O percentual de lise foi calculado de acordo com a fórmula: (F(amostra) -F(eapontânea) ] / [^(máxima) "^'(espontânea) 1 5C1 θθ% • OS ValorβS médios e desvios padrões foram determinados a partir de amostras em triplicate e plotados na Figura 4.

Conforme previsto, os MAbs OKT3 anti-CD3, B159 anti- CD56 e anti-(His)5 que foram usados como anticorpos de controle induziram apenas à morte de base similar àquela de amostras sem qualquer anticorpo. Isso demonstra que a 5 ligação de um anticorpo a um receptor de não-ativação, tal como CD56, não é suficiente para induzir à citotoxicidade de células NK. Além disso, os anticorpos de controle excluíram efeitos citotóxicos das IgGs que se ligam a receptores Fc sobre células alvo P815, mas não às moléculas 10 efetoras sobre células NK. Em contraste, o MAb 195314 (anti-NKp46) e A9 (anti-CD16), ambos objetivando a ativação de receptores NK, dispararam uma forte lise dos alvos P815 que estava na faixa de 35% e 65%, respectivamente. A lise das células alvo na presença do scFv anti-CD16 estava entre 15 1,8% e 11,5%, indicando que o scFv sozinho não poderia ativar células NK. Contudo, a adição do MAb anti-(His) 6, que facilita a ligação cruzada e a ligação às células alvo P815 FcR-positivas disparou uma forte lise em todas as amostras. No caso do scFv 4-LS21 maturado por afinidade, 20 quase 60% das células alvo foram submetidas à lise. Em comparação, o scFv 50NI anti-CD16 parental, em combinação com MAb anti-(His)6, induziu apenas a uma leve intensificação da morte redirecionada de alvos P815 por células NK.

Os resultados do ensaio de citotoxicidade redirecionada com o scFv anti-CD16 maturado por afinidade demonstram claramente que o scFv anti-CD16A não apenas evidencia a mobilização de cálcio em células NK, mas também disparam a citotoxicidade de NK. Exemplo 15: Geração de seqüências de ácido nucleico que codificam a variante CD16A-FC48R/1S8F humana e as três diferentes variantes alélicas de CD16B-Fc humana FcyRIII humano existe como duas isoformas, FcyRIIIA (proteína transmembrana) e FcyRIIIB (GPI-ancorada), que compartilham 96% de identidade de seqüência em suas regiões extracelulares de ligação à imunoglobulina (van de Winkel e Capei, 1993, Immunol. Today 14(5): 215-221). Para essa duas isoformas, diferentes variantes alélicas foram descritas (Koene et al., 1997 Blood 90: 1109-1114; Koene et al., 1998 Blood 91: 673-679). A Figura 6 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácido das variantes alélicas das isoformas A e B.

A proteína de fusão CD16A-Fc solúvel produzida em células HEK-293 após transfecção transitória com o plasmídeo pCDM-CD16-Fc e descrita no Exemplo 1, é a CD16A- FC48R/I58V humana (Mandelboim et al., 1999, supra). Na posição 158 dessa isoforma, um polimorfismo bi-alélico (FcyRIII-A 158Val/Phe) , ocorre em seres humanos, o qual influencia a afinidade do receptor FcyRIII-A de células assassinas naturais pela IgG. Para FcyRIII-A 158 Vai, uma maior afinidade pela IgG é descrita em comparação com a 5 forma alélica 158 Phe (Koene et al., 1997 supra).

Para demonstrar a ligação do scFv 4-LS21 à variante de Phe, mutagênese sítio-dirigida do pCDM-CD16A-Fc48R/15av foi realizada para criar o pCDM-CD16A-Fc48R/158F. 10 ng do plasmídeo pCDM-CD16A-Fc48R/158V foram incubados com 125 ng 10 dos primers P41, 5' CTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTG 3' (SEQ ID NO 47) e P42, 5' CACATTTTTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCAG 3' (SEQ ID NO 48), 25 mM de cada dNTP e 2,5 unidades da DNA polimerase Pfuültra HF (Stratagene). A reação foi realizada durante 3 0 seg a 95°C, seguida por 16 ciclos com 3 0 seg a ““h 15 95°C, 60 seg a 66°C e 318 seg a 68°C. O produto foi digerido através da enzima de restrição Dpnl durante 3 horas e a reação foi cessada, finalmente, através de incubação a 80°C durante 20 min. Células TOP10/P3 quimiocompetentes (Invitrogen) foram transformadas com 2 μl 2 0 da mistura de reação e 150 μl dispersos sobre placas LB contendo 10 μg/ml de tetraciclina e 25 μg/ml de ampicilina. A sequência de ácido nucléico que codifica o pCDM-CD16A- pc48R/i58F fOi confirmada através de seqüenciamento. CD16A- pc4βR/i5βF expresso e purificado conforme descrito no

Exemplo 1.

O receptor FcyRlIIB é expresso em seres humanos como três diferentes variantes alélicas designadas NA1, NA2 e SH, respectivamente (Koene et al., 1997 supra; Koene et al., 1998 supra). Três genes sintéticos que codificam o domínio extracelular humano das formas alélicas de CD16B foram sintetizados pela Geneart (Regensburg, Alemanha). As seqüências de ácido nucléico foram clonadas como um fragmento HindiII/BamHI no plasmídeo pSEC contendo a seqüência de ácido nucléico da região Fc do receptor. CD16B-FcNA1' CD16B-FCKA2 e CD16B-Fc3H foram expressos e purificados conforme descrito no Exemplo 1. Exemplo 16: Western-blot sobre diferentes variantes alélicas de CD16 humana

Para demonstrar a especificidade do scFv 4-LS21 pela isoforma CD16A, análise de Western-Blot foi realizada sobre as diferentes variantes alélicas de CD16A e CD16B. 750 ng de cada de CD16A-Fc49R/158V, CD16A-FC48R/158F, CD16B-FCSH, CD16B- FCNA1, CD16B-FCNA2 e NKp46-Fc (controle negativo) foram carregados sobre um gel de SDS a 8% sob condições de não- redução e blotted sobre uma membrana.

O scFv A9 anti-CD16, o scFv 4-LS21 anti-CD16A e o scFv anti-NKp46 (controle negativo) foram incubados a 4 μg/ml com a mancha. Detecção de scFv ligado às proteínas recombinantes foi realizada usando um conjugado anti-His- HRP (1 μg/mL) . Como controles, conjugado HRP IgG anti- humano e conjugado anti-His-HRP (1 μg/mL) foram usados. 5 O scFv 4-LS21 revelou forte ligação às formas alélicas de CD16A apenas t nenhuma ligação aos alelos de CD16B foi observada. Isso demonstrou claramente a especificidade do scFv 4-LS21 humano pela isoforma A de CD16 e que o 4-LS21 reconhecia ambas as variantes alélicas de CD16A. Em 10 contraste, o scFv A9 anti-CD16 de murino mostrou ligação uniforme a todas as variantes alélicas de CD16A e CD16B. Exemplo 17: ELISA sobre diferentes variantes alélicas de CD16 humana Para demonstrar ainda a especificidade do scFv 4-LS21 15 pela isoforma CD16A, um ELISA foi realizado usando as diferentes variantes alélicas. Poços de uma placa Maxisorp™ foram revestidos com 100 mM de NaHCO3 contendo 200 ng de CD16A-Fc48R/158V, CD16A-FC48R/158F, CD16B-FCSH, CD16B-FCNA1, CD16B-FCNA2 OU NKp46-Fc (controle negativo), 20 respectivamente.

O scFv 4-LS21 anti-CD16A e o scFv anti-NKp46 foram incubados com a placa em uma concentração de 4 μg/ml. Detecção de scFv ligado às proteínas recombinantes foi realizada usando um conjugado anti-His-HRP (1 μg/ml). 0 scFv 4-LS21 mostrou forte ligação a ambas as formas alélicas de CD16A, enquanto que nenhuma ligação aos alelos de CD16B foi observada (Figura 7A) , assim, demonstrando clara especificidade do scFv 4-LS21 pela isoforma CD16A.

Em um ensaio paralelo (Figura 7B), MAb A9 anti-CD16 (1 μg/ml) foi avaliado contra uma placa identicamente revestida. A incubação do MAb A9 (1 μg/mL) foi seguida por um conjugado de HPR IgG anti-camundongo de cabra a 0,5 μg/ml (reatividade cruzada mínima ao Fc humano). MAb A9 se ligou fortemente a todas as variantes alélicas (CD16A e CD16B).

Exemplo 18: Comparação da afinidade do scFv 4-LS21 e do Ab A9 monoclonal com diferentes formas alélicas de CD16 humana através de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

As constantes de afinidade (valores de KD) do scFv 4- LS21 e MAb A9 foram determinadas através de SPR para as variantes alélicas CD16A-FC48R/1S8V, CD16A-FC48R/158F, CD16B- FcSH, CD16B-FCNA1 e CD16B-FCNA2 usando o sistema de biosensor BIAcore 2000 (Amersham-Pharmacia) de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 12. As constantes de taxa "off" e "on" e os respectivos valores de KD são resumidos abaixo na Tabela 5.

Conforme esperado para o MAb A9 (usado como um controle) , uma KD na faixa de 4-6 x 10‘9 M foi calculada para todas as variantes alélicas, demonstrando ligação promíscua do MAb A9 a todos os alelos de todas as formas. Em contraste, o scFv 4-LS21 novamente provou ser altamente específico para a isoforma CD16A. 0 scFv 4-LS21 exibiu uma 5 KD na região de 6 x 10‘8M para CD16A-FC48R/158V e na região de x 10’θM para CD16A-FC48R/158F, indicando que o scFv 4-LS21 se liga a todas as formas alélicas de CD16A com uma afinidade aproximadamente igual. Em contraste, o 4-LS21 não exibiu ligação a qualquer uma das formas alélicas de CD16B. 10 Tabela 5: Dados para a cinética de ligação do scFv 4-LS21 e do MAb A9 às variantes alélicas das isoformas CD16A e CD16B.

Exemplo 19s Construção do plasmídeo pSKK3 TandAb CD30xCD16 LS21/ (G2S) 3 para expressão de molécula de TandAb em bactérias

Os genes que codificam os domínios variáveis VH e VL dos anticorpos anti-CD30 e anti-CD16A foram derivados do 5 hibridoma HRS-3 ou da biblioteca de scFv humana, respectivamente, usando os plasmídeos pHOG_scFv(G2s>3 aCD3 0 (HRS-3) e pSKK2_scFv αCDlδA (LS21). 0 VH do CCCD16LS21 foi amplificado através de reação em cadeia de polimerase com os primers P34, 5' 10 CATCACGATATCAGAACCACCGGAGCCGCCGCTACCACCTGAGGACACGGTGACCAGGG TTCCC 3' (SEQ ID NO 49) e P36, 5' CCGGCCATGGCGCAGGTC CAGCTGGTACAGTCTGG 3' (SEQ ID NO 50), para introduzir a seqüência de ácido nucléico que codifica o ligante de 9 aminoácidos (GlyGlySer)3 (SEQ ID NO 51) na extremidade 3' do produto de PCR. O fragmento de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição Nco T/Eco RV e clonado no Nco I/Eco RV pHOG_scFv(G2S)3αCD30 (HRS-3) para criar o plasmídeo híbrido pHOG_VHαCD16LS21(G2s)3VLαCD30(G2s)3VHαCD3 0.

O VL do anticorpo anti~CD16A 4-LS21 foi amplificado através de reação em cadeia de polimerase com os primers P35, 5' GGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTAGCGGCGGCTC CGGTGGTTCTTCCTATG TGCTGACTCAGCCATCCTC 3' (SEQ ID NO 52) e P37, 5' CCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGATCCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC 3' (SEQ ID NO 53), para introduzir a seqüência de ácido nucléico que codifica o ligante de 9 aminoácidos (GlyGlySer)3 (SEQ ID NO 52) na extremidade 5' do produto de PCR. O fragmento de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição Bsm Bl/Xba I e foi clonado no plasmídeo híbrido digerido com Bsm BI/Xba I linearizado pHOGJVHαCD16LS2\G2s)3VLαCD30(G2S)3VHαCD30, resultando no plasmídeo pHOG TandAb CDSOxCDlδ1^21/ (G2S) 3. Esse plasmídeo foi cortado por Ncol/Xbal e ligado no plasmídeo NcoT/Xbal linearizado, pSKK3. Exemplo 20: Construção dos plasmídeos pSKK3 TandAb CDlSxCDlδ1,321/ (G2S)3 para expressão de moléculas de TandAb em bactérias

Os genes que codificam os domínios variáveis VH e VL do anticorpo anti CD19 foram derivados do hibridoma HD37 5 usando o plasmideo pSKK3_scFv{G2S) 3 αCD19 (HD37) . 0 plasmideo pSKK3_scFv(G2S)3 αCD19 (HD3 7) foi cortado por Neo 1/Bsm BI e o insert© foi purificado sobre um gel de agarose. 0 fragmento purificado foi, então, digerido com a enzima de restrição Eco RV. O fragmento digerido com Eco 10 RV/ Bsm BI foi clonado no plasmideo Eco RV/ Bsm BI linearizado pHOG TandAb CD3 0xCD16LS21/(G2S) 3, resultando no plasmideo pHOG TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3. 0 plasmideo pHOG TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 foi cortado por Ncol/Xbal e ligado no plasmideo NcoT/Xbal linearizado, pSKK3. O II 15 plasmideo resultante é pSKK3 TandAb CD19xCD16ALS21/(G2S) 3 que codifica o TandAb anti CD19 x anti CD16A. Exemplo 21: Expressão e purificação das moléculas de TandAb CD30xCD16LS21/(GjS) 3 e TandAb CD19XCD161*321/(G2S) 3 em bactérias

Amostras de E. coli K12 cepa RV3 08 (Maurer et al., 20 1980, J. Mol. Biol. 139: 147-161) transformadas com os plasmídeos de expressão pSKK3 TandAb CD30xCD16LS21/(G2S) 3 e pSKK3 TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3 foram crescidas durante a noite em meio 2xYT com 50 μg/ml de ampicilina e 100 mM de glicose (2xYT0A) a 28°C. Diluições (1:50) das culturas noturnas em 2xYTGA foram crescidas como culturas em frascos a 28°C com agitação a 200 rpm. Quando as culturas atingiram uma ODεoo de 0,8, as bactérias foram sedimentadas através de 5 centrifugação a 9500 g durante 15 min e 20°C e resuspensas no mesmo volume de meio YTBS fresco (2xYT contendo 1 M de sorbitol e 2,5 mM de betaína de glicina; Blacwell & Horgan, 1991, FEBS Letters 295: 10-12) suplementado com 50 μg/ml de ampicilina. IPTG foi adicionado até uma concentração final 10 de 0,2 mM e o crescimento foi continuado a 21°C durante 18- 20 h. As células foram coletadas através de centrifugação a 14000 g durante 20 min a 4°C. Para isolar as proteínas periplásmicas solúveis, as bactérias sedimentadas foram resuspensas em 5% do volume inicial de 200 mM de Tris-HCl 15 gelado, sacarose a 20%, 1 mM de EDTA, pH 8,0. Após uma incubação de 1 hora sobre gelo com agitação ocasional, os esferoplastos foram centrifugados a 14000 g durante 60 min a 4°C, deixando o extrato periplãsmico solúvel no sobrenadante e os esferoplastos bem como o material 20 periplãsmico insolúvel no precipitado. As frações periplásmicas foram submetidas à diálise contra tampão de iniciação (50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 50 mM de imidazol, pH 7,0) a 4°C, A solução submetida à diálise contendo produto recombinante foi centrifugada a 14000 g durante 3 0 min a 4°C. Cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) foi realizada a 4°C usando uma coluna de 1 ml Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare 5 Biosciences, Freiburg, Alemanha) carregada com Cu2+ e equilibrada com 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, pH 7,0 I (tampão de iniciação). A amostra foi carregada passando a amostra sobre a coluna. Ela foi, então, lavada com vinte volumes de coluna de tampão de iniciação, seguido por 10 tampão de iniciação contendo 50 mM de imidazol, até que a absorbância (280 nm) do efluente fosse mínima (cerca de trinta volumes de coluna). Material absorvido foi eluído com 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 300 mM de imidazol, pH 7,0. As frações eluídas contendo as moléculas de TandAb I 15 foram identificadas através de análise de Western-blot usando um Anticorpo Penta His™ sem BSA (Qiagen, Hilden, Alemanha) , seguido por uma IgG anti-camundongo de cabra marcada com peroxidase de armorácia (Dianova, Hamburg, Alemanha), 20 As frações positivas foram juntadas e submetidas à troca de tampão com 50 mM de imidazol, 50 mM de NaCl (pH 6,0) ou 50 mM de MES, 50 mM de NaCl (pH 5,5) usando PD-10 pré-empacotada (GE Healthcare Biosciences, Freiburg, Alemanha) (TandAb CD30xCD16LS21/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/(G2S)j/ respectivamente). A turvação da solução de proteína foi clarificada através de centrifugação. A purificação final foi obtida através de cromatografia de troca iônica sobre uma coluna MonoS HR5/5 (GE Healthcare 5 Biosciences, Freiburg, Alemanha) em 50 mM de imidazol, 50 mM de NaCl (pH 6,0) ou 50 mM de MES, 50 mM de NaCl (pH 5,5) (TandAb CD3 0xCD16LS21/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16LS21/ (G2S) 3, respectivamente), com um gradiente linear de NaCl de 0-1 M. As frações eluídas contendo as moléculas de TandAb foram 10 identificadas através de SDS-PAGE de redução a 15%, seguido por coloração com Coomassie. As frações positivas foram coletadas e o tampão trocado por PBS contendo 50 mM de imidazol e 10 mM de trealose (pH 6,0 ou 7,0) (TandAb CD30XCD16LS27 (G2S) 3 e TandAb CDlSxCDlδ1,821/ (G2S) 3, 15 respectivamente) usando PD-10 pré-empacotada (GE Healthcare Biosciences, Freiburg, Alemanha). Exemplo 22: Caracterização das moléculas de TandAb CD30XCD16 t821/ (G2S) 3 e TandAb CD19xCD16 LS21/(G2S) 3 através de citometria de fluxo 20 Para medir a ligação ao CD16A, células HEK-293 foram transitoriamente transfectadas usando o método com fosfato de cálcio com o plasmídeo pcDNA3-CD16A-zeta (Dr. O. Mandelboim, University of Jerusalem, Israel) e coletadas 40 horas depois para citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 7. A linhagem de células de leucemia de células pilosas JOK-1 (Schwartz-Albiez R, Darken B, Manner DA, Moldenhauer G, (1991) Int Immunol 3: 623, uma cortesia do Dr. G. Moldenhauer, DKFZ, Heidelberg) foi usada para 5 determinar a ligação ao CD19. Para testagem da reatividade com CD30, coloração foi realizada com a linhagem de células de Hodgkin humana L540CY (gentilmente fornecida pelo Dr. V. Diehl, University of Cologne, Alemanha; Kapp U, Wolf J, von Kalle C, Tawadros S, Rottgen A, Engert A, Fonatsch C, Stein 10 H, Diehl V. (1992) Ann Oncol. 3 de Set; Supl 4: 21-3). A coloração e análise de células foram realizadas essencialmente conforme descrito supra. Todos os anticorpos recombinantes foram detectados por 10 μg/mL de MAb anti- hexa His 13/45/31-2 (Dianova, Hamburg, Alemanha), seguido 15 por 15 μg/mL de IgG anti-camundongo de cabra conjugado a FITC (Dianova).

As análises por citrometria de fluxo demonstraram forte ligação dos anticorpos TandAb CD30xCD16LS21 e TandAb CD19xCD16LS21 às células expressando o antígeno 20 correspondente. Ambos os anticorpos TandAb se ligaram às células expressando CD16A com afinidade aproximadamente igual. Exemplo 23: Medições de afinidade

Determinação dos valores de KD do scFv 4-LS21 sobre as variantes alélicas 48R/158V e 48R/158F do antígeno CD16A revelou valores de KD comparáveis de cerca de 5 x 10'8M, conforme medido através de ressonância plasmônica de superfície, indicando que ambas as variantes alélicas são 5 reconhecidas com aproximadamente a mesma afinidade (veja Exemplo 12) . Essa descoberta foi confirmada com o TandAb I CD3 0xCD16LS2i derivado de 4-LS21, o qual também mostrou se I ligar a ambas as variantes alélicas de CD16A com afinidades quase idênticas. Em comparação com o scFv 4-LS21, um 10 aperfeiçoamento na afinidade de um fator de mais de 10 foi observado com o anticorpo TandAb em virtude da avidez aumentada. Exemplo 24: Caracterização de moléculas de TandAb CD30xCD16L221/(G2S) 3 e TandAb CD19xCD16L321/(G2S) 3 através de , 15 ensaios de citotoxicidade

Para determinar se os anticorpos TandAb CD3 0xCD16LS21 e CD19xCD16LS21 poderiam mediar a citotoxicidade celular in vitro através de recrutamento de células NK às células alvo e ativação de células NK através de ligação cruzada a 20 receptores de ativação, ensaios de citotoxicidade não- radioativos foram realizados essencialmente conforme descrito por T. Dreier et al. (2002, Int J Cancer 100: 690- 697) . Células NK que foram usadas como células efetoras foram enriquecidas a partir do PBMC conforme descrito previamente. A pureza e expressão de antígeno das células NK enriquecidas foram verificadas através de citometria de fluxo em cada caso (dados não mostrados). Células alvo L540CY CD30+ ou JOK-1 CD19+ ou células 5 alvo de Raji foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, 2 mM de L-glutamina, 100 IU/mL I de penicilina G sódica e 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina (aqui referido como meio RPMI; todos os componentes da Invitrogen). Para o ensaio de 10 citotoxicidade, as células foram marcadas com calceína AM a 10 μM (Molecular Probes/Invitrogen) durante 30 min em meio RPMI a 37 °C. Após ligeira lavagem, as células marcadas foram resuspensas em meio RPMI para uma densidade de 1 x 105/mL. 1 x 104 células alvo foram, então, cultivadas junto 15 com 1 x 10s células NK enriquecidas com o TandAb CD3 0XCD16LS21 OU O TandAb CD19xCD16ALS21 em poços individuais de uma placa de microtitulação com 96 poços de fundo redondo em um volume total de 200 μL/popo. Após centrifugação durante 2 min a 200 g, o ensaio foi incubado 20 durante 3 horas a 37°C em uma atmosfera umidifiçada com 5% de C02. 15 minutos antes do final da incubação, 20 μL de Triton X-100 a 10% em meio RPMI foram adicionados aos poços contendo apenas as células alvo. 20 μL de meio RPMI foram fib adicionados a todos os outros poços. 100 μL de sobrenadante da cultura celular foram coletados de cada poço após uma centrifugação adicional durante 5 min a 500 g e a fluorescência da calceína liberada foi medida a 520 nm 5 usando um leitor de placa de fluorescência (Victor 3, Perkin Elmer) . Com base nas contagens medidas, a lise celular específica foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [fluorescência (amostra) - fluorescência (espontânea)]/[fluorescência (máxima) - fluorescência 10 (espontânea)] x 100%. A fluorescência (espontânea) representa as contagens de fluorescência das células alvo na ausência de células efetoras e anticorpos e a fluorescência (máxima) representa a lise celular total induzida pela adição de Triton X-100. Curvas sigmoidais de 15 dose-resposta foram plotadas usando o software Prism (GraphPad Software); veja Figura 8.

Os resultados demonstram a lise específica de células alvo por células NK ativadas por TandAb. Em contraste, TandAb CD19XCD16IJS21 não media a lise de células alvo CD19 20 L540CY e vice-versa, o TandAb CD3 0xCD16LS21 não ativa células NK para matar células CD30" JOK-1. Na ausência de células NK, nem o TandAb CD3 0xCD16LS21, nem o TandAb CD19xCD16LS21, mostraram qualquer atividade citotóxica

Claims (43)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que possui especificidade por pelo menos um antígeno caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antígeno é FCYRIIIA e em que a molécula de ligação não se liga especificamente ao FCYRIIIB, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) seis CDRs, em que a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 17, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 18 e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 19, a sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 20, 23, 26, 29, 33 e 34, a sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 21, 24, 27, 30, 31 e 35; e a sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 22, 25, 28 e 32.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, di-Fab, Fab’, F(ab')2 e scFv.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é totalmente humano.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é capaz de ativar células humanas expressando FCYRIIIA.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é capaz de induzir à morte celular mediada por células NK.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que inibe a ativação de células humanas expressando FcyRIIIA.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ligação tem especificidade por pelo menos um antígeno adicional.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um antígeno adicional é um antígeno na superfície celular.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o antígeno na superfície celular é selecionado do grupo consistindo de CD19, CD20, CD30, o Precursor do Receptor de Laminina, EGFR1, EGFR2, EGFR3, Ep-CAM, PLAP, antígeno de Thomsen-Friedenreich, MUC-1, IL4-R alfa, ILl3-R, IGFR, FcyRI e CD5.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno possui especificidade por (i)CD19 e FCYRIIIA, (ii) CD30 e FCYRIIIA ou (iii) EGFR1 e FCYRIIIA.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a especificidade por FcyRIIIA é fornecida por um domínio de cadeia pesada variável conforme estabelecida na SEQ ID NO: 9 e um domínio de cadeia leve variável conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o pelo menos um antígeno adicional é de um agente infeccioso.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o agente infeccioso é um vírus, uma bactéria, um fungo, um micoplasma, um parasita ou um príon.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a especificidade pelo antígeno adicional é proporcionada por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo quimérico, um anticorpo CRD-enxertado, um anticorpo humanizado e um anticorpo totalmente humanizado.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, di-Fab, Fab', F(ab')2 e scFv.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um diacorpo ou um TandAb.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ainda compreende um domínio funcional.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio funcional é um domínio Fc de anticorpo, uma enzima para uso na terapia de pró-fármaco com enzima anticorpo-dependente, um peptídeo capaz de ligação a receptores Fc, uma proteína ou peptídeo para aumento da meia- vida no soro da molécula de ligação.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é capaz de ligar a variante alélica FCYRIIIA158F com aproximadamente a mesma afinidade com a qual ela se liga à variante alélica FCYRIIIA158V .

21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é conjugado a uma molécula de marcação ou uma toxina.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a molécula de marcação é um radio-marcador, um marcador fluorescente ou um marcador luminescente.

23. Composição caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e pelo menos um componente adicional.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de compreender um veículo, excipiente, diluente e/ou estabilizante farmacêutico.

25. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de codificar um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que possui especificidade por FCYRIIIA e que compreende: a) uma região variável de cadeia leve humana codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2 a 8 e/ou; b) uma região variável de cadeia pesada humana codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

26. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica: uma primeira região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2 a 8, uma primeira região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, uma segunda região variável de cadeia leve e uma segunda região variável de cadeia pesada, em que as referidas segundas regiões variáveis de cadeia leve e pesada terem afinidades pelo CD19.

27. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica: uma primeira região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2 a 8, uma primeira região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, uma segunda região variável de cadeia leve e uma segunda região variável de cadeia pesada, em que as referidas segundas regiões variáveis de cadeia leve e pesada terem afinidades pelo CD30.

28. Vetor caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 25, operavelmente ligado a uma região promotora e opcionalmente uma região de término de transcrição.

29. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo ser operavelmente ligado a uma região promotora e a uma sequência sinalizadora.

30. Célula hospedeira microbiana caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 25 ou um vetor conforme definido na reivindicação 28.

31. Célula hospedeira microbiana, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo de uma célula bacteriana e uma célula fúngica.

32. Método para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que compreende introduzir, em uma célula hospedeira, um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 25 ou um vetor conforme definido na reivindicação 28 e cultivar a célula hospedeira sob condições pelas quais a molécula de ligação é expressa.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que ainda compreende isolar e opcionalmente ainda purificar a molécula de ligação.

34. Método para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido na reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender: (a) introduzir, em uma célula hospedeira, um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 25 ou um vetor conforme definido na reivindicação 28, (b) cultivar a célula hospedeira sob condições pelas quais o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, é expresso, (c) isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno expresso na etapa (b) e (d) conjugar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno isolado da etapa (b) com um marcador ou uma toxina.

35. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, ou uma composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que é para uso no diagnóstico ou tratamento de uma doença autoimune, doença inflamatória, doença infecciosa, alergia ou câncer.

36. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ou composição, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo de linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, doença de Hodgkin, tumor sólido, doença residual mínima e tumor metastático.

37. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido na reivindicação 1 ou de uma composição conforme definida na reivindicação 23 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, doença de Hodgkin, tumor sólido, doença residual mínima e tumor metastático.

38. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser para uso como reagente para: coloração de células expressando FCYRIIIA, análise de perfis de células de pacientes ex-vivo ou isolamento de células NK para terapia ex-vivo.

39. Kit caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido na reivindicação 1 e meios para detecção do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno quando ligado ao FcyRIIIA.

40. Uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender ainda: analisar os perfis celulares de pacientes ex-vivo com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que possui especificidade para pelo menos um antígeno, em que o pelo menos um antígeno é FcyRIIIA, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno não se liga especificamente a FcyRIIIB, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é conjugado a uma molécula marcadora ou uma toxina.

41. Uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: isolar células NK para terapia ex-vivo com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que possui especificidade por pelo menos um antígeno, em que o pelo menos um antígeno é FCYRIIIA, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno não se liga especificamente a FcyRIIIB, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é conjugado a uma molécula marcadora ou uma toxina.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que é para uso em diagnóstico ou tratamento de uma doença autoimune, doença inflamatória, doença infecciosa, alergia ou câncer.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo de linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, doença de Hodgkin, tumor sólido, doença residual mínima e tumor metastático.

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