BRPI0602351B1

BRPI0602351B1 - método de separação das proteínas fibrinogênio, fator xiii e cola biológica de uma fração plasmática solubilizada e de preparação de concentrados liofilizados das ditas proteínas, e, concentrado liofilizado

Info

Publication number: BRPI0602351B1
Application number: BRPI0602351A
Authority: BR
Inventors: Nogre Michel; Tellier Michel; Porte Pierre
Original assignee: Lab Francais Du Fractionnement
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2019-01-02
Also published as: US9320779B2; JP5177966B2; DK1739093T3; EP1739093B8; BRPI0602351A; IL176406A; EP1739093B1; JP2007008934A; PL1739093T3; EP2772499A1; US20080207878A1; US20140154231A1; IL241864A0; JP2013047273A; EP1739093A1; CA2551345C; CA2551345A1; FR2887883B1; ES2491215T3; JP5662988B2

Abstract

"método de separação das proteínas fibrinogênio, fator xiii e cola biológica de uma fração plasmática solubilizada e de preparação de concentrados liofilizados das ditas proteínas". a presente invenção se refere a um método de separação das proteínas fibrinogênio, fator xiii e cola biológica de uma fração plasmática solubilizada e para a preparação de concentrados liofilizados das ditas proteinas compreendendo as etapas de: purificação cromatográfica compreendendo as etapas de carregar um trocador de ânions do tipo base fraca com a dita fração solubilizada, previamente equilibrada com um tampão de uma força iônica pré-determinada de ph alcalino, que permite reter a cola biológica, a eluição da cola biológica através do aumento da força iônica do dito tampão, e separação do fxiii do fibrinogênio através da adição a ao menos uma parte do eluato da cola biológica de ao menos um agente químico de precipitação do fxiii, e a recuperação do fibrinogênio purificado resultante contendo a solução sobrenadante, e diafiltração das soluções de fibrinogênio, da cola biológica e do fxiii ressolubilizadas, seguida por uma liofilização das ditas soluções. refere-se também aos concentrados liofilizados das ditas proteínas capazes de serem obtidos pela condução do processo.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de invenção para: “MÉTODO DE SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS FIBRINOGÊNIO, FATOR XIII E COLA BIOLÓGICA DE UMA FRAÇÃO PLASMÁTICA SOLUBILIZADA E DE PREPARAÇÃO DE CONCENTRADOS LIOFILIZADOS DAS DITAS PROTEÍNAS, E, CONCENTRADO LIOFILIZADO”.

[001] A presente invenção se refere a um método de separação das proteínas de fibrinogênio, Fator XIII e cola biológica, e para a preparação de concentrados liofilizados das ditas proteínas, altamente purificados, e se refere também aos ditos concentrados liofilizados capazes de serem obtidos pelo método.

[002] O fibrinogênio é uma proteína essencial para a coagulação sanguínea devido a sua polimerização à fibrina insolúvel, que é formada no final da cascata das reações que governam a coagulação, conduz a formação de um coágulo, bloqueando a brecha vascular, responsável pelo sangramento. A formação do coágulo é essencial para parar o sangramento. Além disso, a fibrina formada no nível do ferimento forma uma rede fibrilar que assegura o reparo do tecido (cicatrização).

[003] As deficiências congênitas de fibrinogênio podem conduzir a doenças sérias. Para tratar essas deficiências, é necessário que os concentrados de fibrinogênio, possam ser administrados aos pacientes em tratamento, estejam disponíveis. Outras patologias podem também ser tratadas pela administração do fibrinogênio, especialmente em casos de perda massiva de sangue (cirurgias, traumas, etc.), ou segundo uma síndrome da coagulação intravascular disseminada (CIVD).

[004] Além disso, as colas biológicas, ativadas pela trombina, contendo o fibrinogênio como o principal componente, e o Fator XIII (FXIII), são eficazmente usados no reparo de tecidos em clínicas, tais como o transplante de pele, estruturas nervosas e arteriais, conforme descritas, por exemplo, nas patentes EP 0 305 243, FR 2 448 900 e FR 2 448 901. A presença do Fator XIII ou transglutaminase nesses produtos contribuem para a estabilização da fibrina pela formação de ligações covalentes intercatenárias que o tomam insolúvel. Em

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2/14 alguns casos, esses produtos são obtidos segundo os métodos de produção do fibrinogênio bastante complexos, que requerem uma fonte externa do Fator XIII purificado, para ser capaz de desempenhar sua função terapêutica.

[005] Consequentemente, a produção de fibrinogênio, das colas biológicas e concentrados do Fator XIII, especialmente para usos terapêuticos, requerem técnicas de purificação que conduzem a esses produtos, que não são suficientemente livres de vários contaminantes, tais como as proteínas que acompanham e co-precipitadas, anticorpos ou proteases, mas, em adição, sua segurança viral é aumentada.

[006] O isolamento das frações enriquecidas em fibrinogênio, possivelmente contendo o FXIII, a partir do plasma, é bem conhecido e descrito inicialmente por Cohn e Nitschmann (Cohn e colaboradores, J. Am. Chem. Soe., 68, 459, 1946 e Kistler e colaboradores, Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Métodos mais recentes combinam técnicas de precipitação de diferentes fontes de plasma e de técnicas de filtração, de cromatografia, de inativação viral, etc. Pode-se citar, a título de exemplo, as seguintes patentes e pedidos de patente podem ser citadas como exemplos: EP 0 359 593, US 5 099 003, EP 0 305 243, FR 2 448 900 e FR 2 448 901.

[007] Contudo, são realizados métodos diferentes que fornecem concentrados ou composições de fibrinogênio, conforme descritos no pedido de patente EP 1 457 497, ou de cola biológica, por exemplo, de acordo com a patente EP 0 771 324, ou enriquecido em fibrinogênio contendo ainda proteínas associadas tais como FXIII, Fator VIII, fibronectina, Fator von Willebrand etc., (especialmente US 6 121 232).

[008] Esses métodos, contudo, envolvem o uso de cadeias de produção distintas usando, consequentemente, métodos diferentes para a produção das proteínas consideradas com o emprego de diversas fontes de matérias-primas a cada vez. Além disso, dependendo do caso, esses métodos podem envolver substratos cromatográficos caros, tais como géis de afinidade a base de metais quelados (WO 2004/007533) responsáveis pela liberação de metais residuais nos eluatos, que pode conduzir a reações não desejadas com as proteínas (por exemplo, oxidação). Isto cria problemas de lentidão para a aplicação em escala

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3/14 industrial, quando esses três princípios ativos purificados são necessários juntos.

Esses problemas são ainda acentuados quando as diferentes proteínas obtidas são submetidas a um tratamento para a inativação viral e/ou eliminação viral e outros contaminantes indesejáveis, tais como os príons.

[009] Para este efeito, alguns tratamentos para inativação viral clássicos consistem em um tratamento térmico, tal como a pasteurização a 60 °C, por 20 horas, na presença de estabilizantes protetores, e um tratamento químico, tal como solvente-detergente, destinado para remover os concentrados acima compatíveis com o uso terapêutico, não permitindo uma completa inativação do vírus, especialmente o vírus não envolvido (parvovírus BI9, hepatite A e B, etc.). [010] Para remediar este incoveniente, se recorre habitualmente aos métodos para a inativação viral mais eficazes, tal como o tratamento por calor seco sob condições severas (80 °C, 72 h). Esta etapa requer a incorporação de uma formulação estabilizante adequada que oferece condições tal como, por exemplo, a estabilização do fibrinogênio nesta etapa, enquanto que os vírus são destruídos. Tal formulação é a matéria requerida de um pedido de patente FR 04 02001 depositada pelo requerente. Contudo, esta formulação pode ser aplicada à estabilização de uma proteína definida e não das proteínas acompanhamentes, cujas características são diferentes do fibrinogênio.

[011] As técnicas de filtração, especialmente a nanofiltração que usa filtros com uma porosidade de 35 nm, e mesmo menos, também foi conduzida para remover o vírus. Contudo, esta técnica não pode ser eficazmente usada sem o controle dos parâmetros físico-químicos que influenciam o rendimento da recuperação dos compostos à filtrar, e este por evitar a obstrução do filtro e a passagem de vários vírus e contaminantes. Estes parâmetros, tais como força iônica, o pH da solução, e as condições do processo de filtração, impõem as condições específicas do processo que dependem também da natureza do(s) composto(s) contido(s) na solução a ser filtrada. Embora os pedidos de patentes EP 1 348 445 Al, EP 1 161 958 Al e WO 99/23111 divulguem a remoção total dos vírus não envelopado de pequeno tamanho presente nas soluções de proteína, tais como a hepatite A, pela nanofiltração, que faz uso de filtros de 15 nm, reside no entanto sempre um risco de transmissão de vírus indesejáveis ou de príons.

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4/14 [012] Para remediar este risco, emprega-se uma dupla, ou mesmo tripla, inativação viral e/ou a remoção combinando ao menos duas das técnicas mencionadas acima, conforme descrito, por exemplo, no pedido de patente WO 2004/007533. Quando os ditos tratamentos são combinados, é essencial escolher, dependendo do método de inativação viral, os excipientes virucidas e/ou estabilizantes protetores que não exerçam um efeito deletério simultâneo, como por exemplo, nos parâmetros fisico-químicos mencionados acima que governam a nanofiltração.

[013] Dessa forma, o requerente investigou o desenvolvimento de um método para a separação do fibrogênio, do Fator XIII e da cola biológica ativada pela trombina encontrando um objetivo duplo. De um lado, o desenvolvimento de um método único que permite obter os concentrados juntos das ditas proteínas liofilizadas e de elevada pureza, a partir de uma única matéria-prima plasmática contendo o fibrinogênio e o Fator XIII, e, por outro lado, este método deve ser compatível com ao menos um tratamento para a inativação viral e/ou de remoção viral e outros contaminantes indesejáveis (polímeros, agregados, príons).

[014] Dessa forma, a presente invenção se refere a um método para a separação das proteínas fibrinogênio, Fator XIII e cola biológica de uma fração plasmática solubilizada, a base de fibrinogênio e do Fator XIII, e para a preparação de concentrados liofilizados das ditas proteínas compreendendo as etapas de:

a) purificação cromatográfica que compreende as etapas de:

i. carregamento de um trocador de ânion do tipo base fraca com a dita fração solubilizada, o dito trocador sendo previamente equilibrado com um tampão que tem uma força iônica pré-determinada de um pH alcalino, permitindo então a retenção da cola biológica, ii. eluição da cola biológica através do aumento da força iônica do dito tampão,

b) separação do FXIII a partir do fibrinogênio através da adição de ao menos uma parte do eluato da cola biológica de ao menos um agente químico que precipita o FXIII, e a recuperação da solução sobrenadante resultante do fibrinogênio purificado, e

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c) diafiltração do fibrinogênio, da cola biológica e as soluções de FXIII ressolubilizadas, seguida por uma liofilização das ditas soluções.

[015] Então, o requerente encontrou que era possível obter em escala industrial os concentrados de fibrinogênio, do Fator XIII e da cola biológica liofilizados, altamente purificados, livre das proteínas co-precipitadas e dos contaminantes indesejáveis, por meios de um único método flexível que permite, dependendo da necessidade, ajustar o melhor possível a produção de cada composto considerados, assegurando ao mesmo tempo uma lucratividade da matéria-prima. Um método simples, rápido e barato é fácil de ser conduzido em escala industrial, e fornece uma otimização aumentada de vários esquemas de produção.

[016] Além disso, dependendo da matéria-prima usada e da aplicação pretendida, acrescenta-se etapas suplementares à este método de tratamento para a inativação e/ou de remoção viral conduzindo aos três concentrados de interesse, apropriado para os usos terapêuticos.

[017] De acordo com a invenção, se pode utilizar várias fontes de matérias-primas que contém o fibrinogênio e o Fator XIII. Assim, estas frações plasmáticas são obtidas pelo fracionamento do plasma coletado em condições desfavoráveis para a manutenção de uma taxa suficiente do Fator VIII, que é uma proteína lábil, segundo o método de Cohn que usa álcool resfriado. É também possível aplicar o fracionamento mencionado acima a um crioprecipitado previamente solubilizado, até que a extração do Fator VIII não seja verificada, por exemplo, no caso de um crioprecipitado com uma meia-vida terminada ou não encontrando os requerimentos de conformidade do teor mínimo do Fator VIII, ou ao plasma desprovido de crioprecipitado. Assim, estas diferentes fontes de fibrinogênios constituem um precipitado da fração I de Cohn que, após a lavagem é dissolvida em qualquer tampão adequado de pH neutro, conhecido pelo versado na técnica. Por exemplo, um tampão é à base de cloreto de sódio, de citrato trissódico e de L-arginina, com um pH de cerca de 7,4, contendo cada componente em uma concentração preferivelmente de 0,12 M, 0,01 M e 0,05 M, respectivamente.

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6/14 [018] Então, a flexibilidade do método da invenção é também referente a uma variedade de matérias-primas responsáveis por conter o fibrinogênio extraível, cuja purificação conduz aos três concentrados considerados, para os usos terapêutico alvejados.

[019] O processo pode incluir também, antes da etapa a), uma etapa de inicial de purificação da fração plasmática solubilizada através de um prétratamento clássico com hidróxido de alumínio e/ou através de uma precipitação em temperatura baixa. A adição do hidróxido de alumínio assegura a remoção das proteínas não desejadas, tais como os Fatores II (FII), VII, IX e X (FX). Esta fração pré-purificada pode ser congelada até que seja usada para conduzir as etapas seguintes do método da invenção.

[020] A purificação cromatográfica da fração plasmática solubilizada é conduzida em qualquer matriz à base de um polímero natural ou sintético, resina ou gel, no qual estão enxertados os grupos dos trocadores de ânions do tipo base fraca, tal como o DEAE. Os suportes cromatográficos clássicos deste tipo estão disponíveis sob as marcas DEAE-Sepharose® CL-6B, DEAE-Trisacril LS, Fragtogel, TSK-DEAE 650 M ou S, DEAE-Macroprep (Bio-Rad, França), etc.

[021] O tampão de equilíbrio do trocador de ânions apresenta uma força iônica pré-determinada e seu valor de pH tem que ser na faixa alcalina.

[022] O tampão de equilíbrio do trocador de ânions apresenta uma força iônica pré-determinada e seu valor tem que estar na faixa alcalina.

[023] O tampão de equilíbrio do trocador de ânions tem uma força iônica tipicamente inferior a 0,2 e, preferivelmente, está na faixa de valores de 0,06 a 0,2. Mais particularmente, a força iônica está na faixa de valores de 0,08 a 0,15. É preferivelmente ajustada pela adição de sais inorgânicos de metais alcalinos ou alcalinos terrosos ou suas misturas, mais preferivelmente, de sais inorgânicos de metais alcalinos, particularmente de cloreto de sódio.

[024] O valor máximo de pH do tampão de equilíbrio é escolhido de forma a evitar qualquer desnaturação dos produtos considerados, que é de cerca de 10. Vantajosamente, o pH está na faixa de valores superiores a 7 até 9, preferivelmente de 7,5 a 8,2. Por exemplo, este tampão contém uma concentração de 0,06 M de cloreto de sódio com um pH de 7,9-8,1, e mais

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7/14 preferivelmente pode compreender o citrato trissódico em uma concentração preferida de 0,011 M. Pode ser usado também qualquer outro tampão, à base de cloreto de sódio ou em sais inorgânicos de metais alcalinos e alcalinos terrosos, que compreendem os compostos biologicamente ativos que são compatíveis e não desnaturam os produtos de interesse.

[025] Quando a solução acima foi aplicada ao trocador de ânions, a cola biológica é retida no suporte. O processo pode incluir, antes da etapa de eluição da cola biológica, uma etapa de lavagem com o dito tampão de equilíbrio do trocador de ânions até que as proteínas não retidas e os contaminantes sejam removidos. Esta etapa de lavagem permite, através da percolação deste tampão no suporte, a passagem no filtrado das proteínas não retidas ou fracamente retidas, no trocador, presentes na solução que contém o fibrinogênio, como as imunoglobulinas G (IgG), A (IgA) e M (IgM) e a albumina, e os contaminantes, como os agentes químicos de inativação viral. O período de tempo de lavagem é determinado pela medição da densidade óptica (DO) do filtrado em um comprimento de onda de 280 nm. Certamente, um valor da DO que corresponde àquele da linha de base é uma boa indicação que os compostos mencionados acima foram eficazmente eliminados.

[026] Após o retomo da linha de base, a eluição da cola biológica é conduzida pelo aumento da força iônica do tampão de equilíbrio e de lavagem, o pH que é preferivelmente ajustado a um valor de 7,4-7,6. O valor desta força iônica é selecionado com o objetivo de obter uma eluição eficaz da cola biológica, certificando-se de que este valor não altere as propriedades do produto considerado. Vantajosamente, o valor da força iônica está na faixa de 0,5 e 1,3, particularmente entre 0,9 a 1,1. Este aumento da força iônica é conduzido através da adição de qualquer sal ou misturas de sais definidas aqui acima, especialmente de cloreto de sódio. Além disso, o tampão de eluição pode conter ainda excipientes, tais como uma mistura de componentes denominada de mistura A, que compreende citrato de sódio (10 a 12 g/L), lisina (1 a 5g/L), glicina (1 a 5 g/L), sal Tris (2 a 5 g/L), arginina (25 a 50 g/L) e isoleucina (5 a 15 g/L). A concentração da proteína no eluato é de cerca de 4 g/L.

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8/14 [027] Ao menos uma parte da quantidade removida do eluato de cola biológica é submetida a um tratamento para separar o FXIII que acompanha o fibrinogênio. Esta separação é conduzida por precipitação do FXIII pela adição, no eluato a ser tratado, de um agente químico de precipitação, que pode estar presente na forma de uma solução aquosa em uma concentração que permite alcançar o efeito desejado. É dada preferência às soluções aquosas á base de sais de citrato 1 M, como, por exemplo, citrato de sódio e, especialmente, o citrato de trissódico. Então, um precipitado de FXIII e um sobrenadante altamente enriquecido em fibrinogênio são separados. Uma recuperação muito eficaz do precipitado de FXIII pode ser obtida por filtração em filtros de 5 pm.

[028] O precipitado assim recuperado é ressolubilizado, preferivelmente, em água ou em um tampão. Em particular, é dissolvido em um tampão da mistura A, ajustado a um pH de 6,9-7,1, de modo que sua concentração corresponda a uma atividade a cerca de 100 vezes superior a do plasma normal. Como tal, o precipitado de FXIII pode ser, por exemplo, solubilizado de uma maneira que sua concentração seja de cerca de 1 a 5 g de proteínas totais/L.

[029] De acordo com a invenção, as soluções da cola biológica (eluato de cola biológica) e do fibrinogênio (sobrenadante enriquecido em fibrinogênio) podem ser concentradas por ultrafiltração, até conterem tipicamente entre 15 e 25 g de proteínas totais/L determinada pelos métodos clássicos de medição conhecidos por aqueles versados na técnica.

[030] As três soluções de fibrinogênio, do Fator XIII e da cola biológica obtidas, opcionalmente concentradas, foram submetidas a uma etapa de diafiltração. Esta etapa é destinada a remoção do possível excesso, por um lado, do sal inorgânico usado para obter as soluções com uma força iônica tão alta quanto 0,2 M, e, e por outro lado, do agente de precipitação presente no precipitado ressolubilizado. Dever ser notado que a presença de quantidades importantes do sal inorgânico, necessária para a eluição da cola biológica, pode ter um efeito deletério na eficácia do processo de liofilização e também na inativação viral por calor seco, e na capacidade de retenção do vírus de um nanofiltro adequado. Esta etapa pode ser também necessária para incorporar, se necessário for, os excipiente adequados, os estabilizadores e os agentes de

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9/14 proteção, que devem permitir, por um lado, o aquecimento a seco do fibrinogênio, do FXIII, e da cola biológica, evitando o risco de desnaturação, e, por outro lado, a solubilização rápida dos produtos liofilizados, tipicamente em um período de tempo de 3 a 8 minutos. O tampão de diafiltração preferido contém a mistura A, e tem um pH na faixa de 6,9-7,1 em referência ao pedido de patente FR 04 02001 depositado pelo requerente.

[031] Deve ser notado que uma outra vantagem da invenção é que, de acordo com outras modalidades preferidas do método, o tampão de diafiltração que compreende uma mistura A pode já estar presente como um componente do tampão de eluição da cola biológica. Então, a realização da diafiltração encontrase, por conseguinte, simplificada e otimizada.

[032] Os tampões de diafiltração de composições diferentes também podem ser usados, dependendo da necessidade, contanto que se encontrem com as exigências acima mencionadas.

[033] A etapa de ultrafiltração aqui acima mencionada também pode ser realizada sob as mesmas condições neste estágio do método.

[034] As respectivas soluções, opcionalmente diafiltradas, opcionalmente concentradas, são liofilizadas pelos métodos clássicos sob condições habituais, que é em uma temperatura na faixa entre -40 °C e -30 °C, por cerca de 48 horas. [035] Além disso, o método pode incluir ao menos uma etapa de tratamento para a inativação viral e/ou remoção viral e dos contaminantes mencionados acima, tal como os príons. Este tratamento pode ser selecionado de grupos que consistem do tratamento químico para a inativação viral, a nanofiltração e tratamento por calor seco para a inativação viral.

[036] Assim, esta etapa pode ser realizada por um tratamento químico clássico para a inativação viral, preferivelmente consistindo de um tratamento por solvente/detergente, de acordo com o método descrito na patente EP 0 131 740. Preferivelmente, os agentes químicos para a inativação viral são uma mistura de Tween®-TnBP, mais preferivelmente, a mistura de Triton® (octoxinol)-TnBP, cujas concentrações típicas são de 0,3 % (v/v) e 1 % (p/V) respectivamente. Esta inativação viral pode ser integrada em qualquer estágio do método, mas pode ser realizada antes da etapa a) da etapa de purificação

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10/14 cromatográfica. Assim, contribuirá para uma remoção eficaz dos agentes de inativação.

[037] Em uma modalidade preferida do método, uma etapa de nanofiltração também pode ser fornecida para, para remover o vírus, especialmente o vírus não envolvido e outros contaminantes exógenos, completando o tratamento químico para a inativação viral precedente. Filtros de 35 nm podem ser usados eficazmente, embora outros filtros nanométricos possam ser usados na medida onde a filtração e a eficácia da retenção viral são otimizadas. A nanofiltração é realizada com o eluato obtido na etapa a) ou, se o caso provir, com as soluções de fibrinogênio, da cola biológica e do FXIII ressolubilizadas diafiltradas, antes da liofilização. A escolha dos parâmetros químicos de purificação cromatográfica, e aqueles de diafiltração permitem uma flexibilidade de realização da nanofiltração sem alterar seu desempenho.

[038] Finalmente, o tratamento por calor seco para a inativação viral pode ser realizado no fibrinogênio liofilizado dos produtos, na cola biológica e no FXIII em condições clássicas, em 80 °C, por 72 horas, para inativar o vírus não envolvido, que não seria inativado e/ou removido em ao menos uma das etapas prévias de inativação viral e/ou remoção.

[039] Além disso, os produtos liofilizados por calor seco podem ser reconstituídos em uma solução aquosa adequada para o uso clínico, preferivelmente em água purificada para injeção (PPI), e usados diretamente para a injeção intravenosa.

[040] Além disso, o método da invenção pode compreender ao menos uma etapa de filtração clarificante para remover as partículas insolúveis, e ao menos uma etapa de esterilização, sendo estas realizadas em uma maneira habitual usando filtros, por exemplo, de 0,8 a 0,1 pm. Particularmente, são relacionados à fração plasmática solubilizada pré-purificada, o eluato da cola biológica obtido na etapa b) e/ou as soluções diafiltradas dos três compostos de interesse.

[041] A realização do método fornece liofilizados de concentrados de cola biológica e de fibrinogênio altamente purificados, cujo teor respectivo de fibrinogênio, em relação ao teor de proteínas totais, é de cerca de 90 %. Além

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11/14 disso, as atividades do Fator XIII nos concentrados da cola biológica e de fibrinogênio são respectivamente de cerca de 5 U/mL e de cerca de 1,5 U/mL. [042] O concentrado do Fator XIII obtido é desprovido de proteínas contaminantes, e apresenta uma atividade, se necessário for, na faixa de valores de cerca de 30 U/mL a cerca de 70 U/mL, preferivelmente de 100 U/mL a 400 U/mL, dependendo da concentração obtida pela ressolubilização do precipitado FXIII e/ou após a ultrafiltração.

[043] A invenção é também relacionada aos concentrados liofilizados de fibrinogênio, de cola biológica e do Fator XIII, obtidos pelo desempenho do método acima, caracterizado por compreender a mistura de componentes do tampão de diafiltração (mistura A). Além disso, os ditos concentrados podem ser de qualidade terapêutica graças a integração no método da invenção de ao menos uma etapa de tratamento para a inativação viral e/ou de remoção viral e de contaminantes.

[044] O seguinte exemplo ilustra uma modalidade da presente invenção sem limitar seu escopo.

Exemplo [045] São usados 1200 L de plasma humano crioprecipitado-depletado.

Este plasma é submetido a uma precipitação com etanol de acordo com o método de Cohn, sob as condições conhecidas pelo versado na técnica, em uma tal maneira que a concentração de etanol considerada no plasma seja de 8 % (v/v) e a temperatura da mistura obtida seja de 3 °C.

[046] Além disso, o sobrenadante e o precipitado são submetidos a uma centrifugação. São obtidos 10 kg de precipitado, que é a fração I de Cohn impura. [047] A fração I de Cohn impura (10 kg) é suspendida e lavada com 300

L de tampão «Blombach», que compreende a mistura de glicina 1 M, de citrato de trissódico 0,055 M e de etanol 6,5 % (v/v), em um pH de 6,8.

[048] Após a centrifugação, são recuperados 8 kg da pasta do precipitado purificado (a fração I de Cohn impura) dissolvidos em uma temperatura de 37 °C, em 60 L de tampão constituído de uma mistura de cloreto de sódio 0,12 M, de citrato de trissódico 0,010 M e de arginina 0,05 M, de pH 7,4.

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12/14 [049] A solução do precipitado obtido é submetida a um tratamento de pré-purificação com gel de alumina, a uma fração de 108 g por 1 kg da pasta de precipitado, a uma temperatura de 25 °C, e um pH de 6,9-7,1.

[050] Assim que o tratamento de purificação é alcançado, a solução é submetida a filtrações lenticulares clarificantes, por meio de filtros de fibras celulósicas (Seitz, tipo K700) de 0,65 pm e filtrações estéreis com filtros de 0,2 pm.

[051] Esta solução purificada é submetida a um primeiro tratamento para a inativação viral por solvente-detergentes na presença de Tween®-TnBP, de concentrações relativamente de 0,3 % (v/v) e 1 % (p/v), de acordo com o método descrito na EP 0 131 740.

[052] A solução purificada assim tratada é diluída a 50 % através da adição do volume requerido da solução de citrato de trissódico aquoso 0,010 M.

[053] A solução purificada obtida contém além disso, além do fibrinogênio e do Fator XIII que acompanha, as proteínas indesejáveis, como as imunoglobulinas G e a albumina, e os contaminantes, como o Tween®-TnBP. Sua remoção eficaz é realizada por meio de uma etapa cromatográfica.

[054] Para esta finalidade, a solução purificada é injetada em uma coluna cromatográfica depositada com um gel trocador de ânions DEAE Macroprep (Bio-Rad, França) previamente equilibrado com um tampão constituído por cloreto de sódio 0,06 M e citrato de trissódico 0,011 M, ajustado a um pH 8,0, com uma osmolaridade de 130-150 mosmolkg'¹. Nestas condições, o fibrinogênio e o Fator XIII, que constitui a cola biológica, são retidos no suporte. As proteínas fracamente retidas e não retidas no suporte são removidas no filtrado, e o Tween e o TnBP também, por diversas lavagens subsequentes com o mesmo tampão.

[055] Quando a DO, medida em 280 nm, retoma à linha de base, a eluição do fibrinogênio e o Fator XIII, que constitui a cola biológica, é realizada por meios de um tampão de eluição contendo o cloreto de sódio 1 M e uma mistura A’ constituída de citrato trissódico (11,2 g/L), lisina (2,0 g/L), glicina (2,0 g/L), sal Tris (2,40 g/L), arginina (40 g/L) e isoleucina (10 g/L), ajustado a um pH de 7,5, com uma osmolaridade > 2000 mosmolkg'¹.

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13/14 [056] O eluato da cola biológica purificado recuperado é tratado através da nanofiltração em filtros PLANO VA (Asahi, Japão) de 35 nm, com uma superfície de 1 m², para remover o vírus que não seria inativado pelo tratamento solvente-detergente prévio. O teor de proteínas totais, neste estágio do método, é de cerca de 4,0 g/L de solução.

[057] São isolados 50 % do volume do eluato da cola biológica e uma solução do citrato trissódico 1 M é adicionado ao restante do volume do eluato para precipitar o Fator XIII. Após se certificar que a quantidade completa do Fator XIII foi precipitada, foram realizados o isolamento e a recuperação por filtração nos filtros Satorpure (Sartorius - França) de 5 pm.

[058] O precipitado do FXIII recuperado é solubilizado em água purificada para injeção, com uma taxa de cerca de 1 g/L.

[059] As soluções de cola biológica (eluato) e de fibrinogênio são concentradas por ultrafiltração em filtros da Biomax Millipore de 100 kDa com uma superfície de 5 m² em uma maneira que o teor da proteína de cada solução alcance 15 g/L.

[060] As soluções aqui acima concentradas e a solução do FXIII são submetidas a uma diafiltração nos mesmos filtros, aqueles usados para a diafiltração contra a mistura A’ definida acima, com um pH 6,9-7,1, uma osmolaridade de 590-610 mosmolkg'¹, permitindo também remover o cloreto de sódio.

[061] Após realizar uma filtração em filtros de 0,45-0,2 pm, 100 mL de cada solução diafiltrada foi tomada e foram colocadas em frascos de vidro para realizar a liofilização em uma temperatura entre -40 °C e -30 °C por cerca de 48 horas.

[062] Os liofilizados de fibrinogênio, de cola biológica e do Fator XIII obtidos são submetidos a uma última etapa de inativação viral por calor seco a 80 °C por 72 horas, e armazenados antes de serem usados na terapia.

[063] Os resultados dos controles de qualidade executados em 3 lotes consecutivos são apresentados na tabela a seguir.

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Proteínas	FXIII^a	Cola biológica	Fibrinogênio
Rendimento (%)	-	87 ±3	93 ±4
FXIII: Ag (U/mL)	31,1 ± 2,1	9,3 ± 0,4	2,6 ± 0,9
Atividade do FXIII (U/mL)	33,3 ± 1,5	5,2 ± 0,4	1,3 ±0,6
Fibronectina (mg/mL)	0,16 ±0,03	1,10 ±0,04	1,10 ±0,02
IgM (pg/mL)	35 ± 0,4	209 ± 46	183 ±31
IgG (pg/mL)	6±2	29 ±6	29 ±5
IgA (pg/mL)	< 12 ±3	55 ±2	40 ±4
FII:Ag	3 ±0,2 (Mg/L)	1,9 ±0,6 (mU/mL)	1,2 ±0,2 (mU/mL)
Atividade do FX (mU/mL)		< 1,3 ±0,04	< 1,3 ±0,03
Plasminogênio (pg/mL)		73 ±4	73 ±7

a: concentração de 1,2 g/L de proteínas totais.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a separação de proteínas fibrinogênio, Fator XIII e cola biológica de uma fração plasmática solubilizada, à base de fibrinogênio e do Fator XIII, e para a preparação de concentrados liofilizados das ditas proteínas caracterizado por compreender as etapas de:

a) purificação cromatográfica que compreende as etapas de:

i) carregamento de um trocador de ânion do tipo base fraca com a dita fração solubilizada, o dito trocador sendo previamente equilibrado com um tampão que tem uma força iônica de menos que 0,2 e um pH alcalino na faixa de valores maiores que 7 até 9, permitindo então a retenção da cola biológica, ii) eluição da cola biológica através do aumento da força iônica do dito tampão, em que a força iônica está em uma faixa entre 0,5 e 1,3, o pH que é ajustado a um valor de 7,4 - 7,6,

b) separação do FXIII do fibrinogênio através da adição de ao menos uma parte do eluato da cola biológica de ao menos um agente químico que precipita o FXIII presente na forma de uma solução aquosa com base nos sais 1M de citrato, e a recuperação da solução sobrenadante resultante do fibrinogênio purificado, e

c) diafiltração das soluções de fibrinogênio, da cola biológica e do FXIII ressolubilizadas, seguida por uma liofilização das ditas soluções.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tampão de equilíbrio estar na faixa dos valores de 0,06 a 0,2.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o pH do tampão de equilíbrio estar na faixa dos valores de 7,5 a 8,2.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por o método incluir, antes da etapa da eluição da cola biológica, uma etapa de lavagem com o dito tampão de equilíbrio, do trocador de ânion até que sejam removidos as proteínas não retidas e os contaminantes.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a eluição da cola biológica ser realizada com um tampão

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2/3 de equilíbrio cuja força iônica é compreendida em uma faixa entre 0,9 e 1,1, e por o pH ser ajustado a um valor de 7,4-7,6.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o tampão de eluição conter uma mistura de 10 a 12 g/L de citrato trissódico, de 1 a 5 g/L de lisina, de 1 a 5 g/L de glicina, de 2 a 5 g/L de Tris, de 25 a 50 g/L de arginina e de 5 a 15 g/L de isoleucina.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por o precipitado do FXIII ser ressolubilizado em água ou em um tampão contendo uma mistura de 10 a 12 g/L de citrato trissódico, de 1 a 5 g/L de lisina, de 1 a 5 g/L de glicina, de 2 a 5 g/L de Tris, de 25 a 50 g/L de arginina e de 5 a 15 g/L de isoleucina, em um pH entre 6,9 e 7,1.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por a diafiltração ser realizada contra o tampão definido na reivindicação 7.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por incluir ao menos uma etapa de tratamento para a inativação viral e/ou de remoção dos contaminantes, selecionados do grupo consistindo do tratamento químico para a inativação viral, a nanofiltração e tratamento por calor seco para a inativação viral.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o tratamento químico para a inativação viral ser realizado antes da etapa a).
11. Método de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizado por o tratamento químico para a inativação viral consistir de um tratamento por solvente-detergente realizado por agentes químicos para inativação viral que são uma mistura de Tween®-TnBP ou Triton®-TnBP.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 all, caracterizado por a nanofiltração ser realizada no eluato obtido na etapa a) ou nas soluções de fibrinogênio, da cola biológica e do FXIII ressolubilizadas diafiltradas, antes da liofilização.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, caracterizado por o tratamento por calor seco para inativação viral ser realizado nos produtos liofilizados de fibrinogênio, da cola biológica e do FXIII.

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14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado por uma etapa de ultrafiltração de concentração ser realizada antes da etapa de diafiltração ou seguida da dita etapa, antes da liofilização.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado por incluir, antes da etapa a), uma etapa inicial de prépurificação da fração plasmática solubilizada através de um pré-tratamento clássico com hidróxido de alumínio e/ou por uma precipitação a baixa temperatura.
16. Concentrado liofilizado de fibrinogênio obtenível a partir de uma fração de plasma solubilizado pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o processo compreender a mistura dos componentes do tampão da diafiltração como definido na reivindicação 7.
17. Concentrado liofilizado da cola biológica obtenível a partir de uma fração de plasma solubilizado pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender a mistura dos componentes do tampão da diafiltração como definido na reivindicação 7.
18. Concentrado liofilizado do FXIII obtenível a partir de uma fração de plasma solubilizado pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender a mistura dos componentes do tampão da diafiltração como definido na reivindicação 7.
19. Concentrado liofilizado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, de qualidade terapêutica caracterizado por ser obtido através da realização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13.