BRPI0514413B1 - Sal cristalino de composto de bifenil, sua composição farmacêutica, seus processos de preparação, processo de purificação, usos do referido sal e medicamento. - Google Patents

Abstract

forma cristalina de um composto de bifenil a invenção fornece um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1- [2- (2-cloro-4-{ [(r) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l, 2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-rnetoxifenilcarbamoil) etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste. esta invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo tal sal ou preparado usando tal sal, processos e intermediários para preparar tal sal; e métodos de uso de tal sal para tratar uma disfunção pulmonar.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se a novos sais do ácido

1,2-etanodissulfônico cristalinos de um composto de bifenil que se espera que sejam úteis como agentes terapêuticos para tratar disfunções pulmonares. Esta invenção também se relaciona a composições farmacêuticas compreendendo tais compostos cristalinos ou preparados a partir de tais compostos cristalinos, processos e intermediários para preparar tais compostos cristalinos e métodos de uso de tais compostos cristalinos para tratar disfunções pulmonares.

ESTADO DA TÉCNICA

O Pedido de Patente U. S. comumente cedida de número 10/779.157, depositado em 13 de fevereiro de 2004, divulga novos compostos de bifenil que são úteis como agentes terapêuticos para tratar disfunções pulmonares, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e asma. Particularmente, o composto, éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2- (8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico é especificamente divulgado nestes pedidos como possuindo tanto atividade do antagonista muscarínico quanto atividade do agonista do receptor 32-adrenérgico. A estrutura química do éster 1-[2(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2-dihidro30 quinolin-5-il)etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 8/107

2/91

etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico é

representada pela fórmula I:

Agentes terapêuticos úteis para tratar disfunções pulmonares são vantajosamente administrados diretamente no trato respiratório por inalação. Com relação a isto, vários tipos de dispositivos de inalação farmacêuticos foram desenvolvidos para administração de agentes terapêuticos por inalação incluindo inaladores de pó seco (DPI), inaladores de doses medidas (MDI) e inaladores nebulizadores. Quando se prepara composições farmacêuticas e formulações para uso em tais dispositivos, é altamente desejável possuir uma forma cristalina do agente terapêutico que não seja higroscópico nem deliqüescente e que possua um ponto de fusão relativamente alto (isto é, maior que cerca de 150°C) permitindo assim que o material seja micronizado sem decomposição significante ou perda de cristanilidade.

Nenhuma forma de sal cristalino do composto da fórmula I foi reportada previamente. Conseqüentemente, existe uma necessidade por uma forma de sal cristalino estável, não deliqüescente, do composto da fórmula I que possua um nível aceitável de higroscopicidade e um ponto de fusão

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3/91 relativamente alto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece sais cristalinos do ácido

1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Surpreendentemente, foi descoberto que os tais sais do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino do composto de fórmula I não são deliqüescentes, mesmo quando expostos à umidade atmosférica. Adicionalmente, tais sais cristalinos possuem um nível aceitável de higroscopicidade e um ponto de fusão muito alto, por exemplo, maior que cerca de 215°C. Em uma modalidade particular, um sal cristalino da presente invenção possui um ponto de fusão maior que cerca de 230°C.

Entre outros usos, um sal do ácido 1,2etanodissulfônico cristalino do composto de fórmula I é útil para preparar as composições farmacêuticas que se espera que sejam úteis para tratar disfunções pulmonares. Conseqüentemente, em um outro aspecto da composição, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica desta invenção também compreende um agente antiinflamatório esteroidal, tal como um corticosteróide;

ou um inibidor de fosfodiesterase-4-; ou uma combinação de 24/05/2018, pág. 10/107

4/91 destes.

Em uma outra modalidade, esta invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma solução salina isotônica aquosa compreendendo um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico, onde a solução possui um pH na faixa de cerca de 4 a cerca de 6.

Em ainda uma outra modalidade, esta invenção fornece uma combinação compreendendo:

(a) um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} -5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste; e (b) um agente antiinflamatório esteroidal.

O composto de fórmula I possui ambas as atividades do antagonista muscarínico e do agonista do receptor β2adrenérgico. Conseqüentemente, espera-se que um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico desta invenção seja útil como um agente terapêutico para tratar disfunções pulmonares, tais como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica.

Conseqüentemente, em um de seus aspectos do método, esta invenção fornece um método para tratar uma disfunção pulmonar, o método compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente efetiva de um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] de 24/05/2018, pág. 11/107

5/91 metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Adicionalmente, em um outro de seus aspectos do método, esta invenção fornece um método para produzir broncodilatação em um paciente, o método compreendendo administrar por inalação ao paciente uma quantidade produtora de broncodilatação de um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Esta invenção também fornece um método de tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica ou asma, o método compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente efetiva de um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Esta invenção está também direcionada a processos para preparar um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I. Conseqüentemente, em um outro de seus aspectos do método, esta invenção fornece um processo para preparar um sal do ácido 1,225 etanodissulfônico cristalino do éster 1-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2- (8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste; o processo compreendendo contatar o éster 1-[2-(2-cloro-430 {[(R)-2-hidroxi-2- (8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 12/107

6/91 il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico com o ácido 1,2etanodissulfônico.

Em ainda outros aspectos do método, esta invenção fornece um processo para preparar um sal do ácido 1,2etanodissulfônico cristalino de um composto de Fórmula I, o processo compreendendo:

(a) contatar um composto de Fórmula II:

Π onde R^la, R^lb e R^lc são independentemente selecionados a partir de alquil de C1-4, fenil, alquil de C1-4- (fenil) -, ou um entre R^la, R^lb e R^lc é -O-(alquil de C1-4) ; com o íon fluoreto; e (b) contatar o produto da etapa (b) com o ácido 1,215 etanodissulfônico ou um hidrato deste; para formar um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I, onde a etapa (a) e (b) são conduzidas no mesmo recipiente de reação sem isolamento do produto da etapa

Em outro aspecto do método, esta invenção fornece um processo para preparar um sal do ácido 1,2etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I possuindo um ponto de fusão maior que cerca de 230°C, o

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7/91 processo compreendendo adicionar um cristal de semente de um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I a uma solução compreendendo um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico de um composto de fórmula I dissolvido em um diluente inerte, onde o cristal de semente possui um ponto de fusão maior que cerca de 230°C.

Este processo pode também ser usado para recristalizar um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I para fornecer uma forma cristalina possuindo um ponto de fusão maior que cerca de 230°C. Conseqüentemente, a invenção também fornece um processo para preparar um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I possuindo um ponto de fusão maior que cerca de 230°C, o processo compreendendo:

(a) dissolver um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino de um composto de fórmula I em um diluente inerte a uma primeira temperatura;

(b) resfriar o produto da etapa (a) a uma segunda temperatura; e (c) adicionar um cristal de semente de um sal do ácido

1,2-etanodissulfônico de um composto de fórmula I;

onde o cristal de semente possui um ponto de fusão maior que cerca de 230°C, a primeira temperatura é a temperatura suficiente para dissolver o sal do ácido 1,2etanodissulfônico e a segunda temperatura está abaixo de uma temperatura na qual o cristal de semente dissolve-se completamente quando adicionado ao produto da etapa (b).

Adicionalmente, esta invenção está direcionada a um processo para purificar o éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2de 24/05/2018, pág. 14/107

8/91 hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico; o processo compreendendo formar um sal do 1,2-etanodissulfônico cristalino do o éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico. Esta invenção está também direcionada aos produtos preparados pelos processos descritos aqui.

Esta invenção está também direcionada a um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste para uso em terapia ou como um medicamento.

Adicionalmente, esta invenção está também direcionada ao uso de um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste para a produção de um medicamento; especialmente para a produção de um medicamento para o tratamento de uma disfunção pulmonar.

Esta invenção está também direcionada ao uso de:

(a) um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste; e de 24/05/2018, pág. 15/107

9/91 (b) um agente antiinflamatório esteroidal; na produção de um medicamento para o tratamento de disfunção pulmonar.

Esta invenção está também direcionada a um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino do éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste; na forma micronizada; e a composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um sal do ácido 1,2etanodissulfônico cristalino do éster 1-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste, na forma micronizada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Vários aspectos da presente invenção são ilustrados por referência aos desenhos em anexo.

A Figura 1 mostra um gráfico da calorimetria de escaneamento diferencial (DSC) e um gráfico da análise termogravimétrica (TGA) e a Figura 2 mostra um gráfico de DSC para amostras de um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico desta invenção.

As Figuras 3 e 4 mostram padrões de difração de raio X em pó (PXRD) de amostras de um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxide 24/05/2018, pág. 16/107

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2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico desta invenção.

A Figura 5 mostra um espectro de absorção de 5 infravermelho (IR) para um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico desta invenção.

A Figura 6 mostra um gráfico de absorção de umidade dinâmica (DMS) para um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico desta invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece sais cristalinos do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste. O agente terapêutico ativo nestes sais (isto é, o composto de fórmula I) contém um centro quiral possuindo a configuração (R). Entretanto, será compreendido por aqueles habilitados na técnica, que quantidades menores do estereoisômero (S) podem estar presentes nas composições desta invenção a menos que de outra forma indicado, desde que a utilidade da composição como um todo não seja eliminada pela presença de tal isômero.

O composto de fórmula I foi nomeado usando-se o

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11/91 software AutoNom disponível comercialmente Leandro, California). Adicionalmente, os sais

1,2-etanodissulfônico são também algumas vezes como sais adisilato.

(MDL, San do ácido referidos

DEFINIÇÕES

Quando se descreve os compostos, composições, métodos e processos desta invenção, os seguintes termos possuem os significados a seguir, a menos que de outra forma indicado.

O termo “ponto de fusão” conforme aqui usado significa a temperatura na qual o fluxo de calor endotérmico máximo é observado por calorimetria de escaneamento diferencial.

O termo “forma micronizada” significa uma forma de partículas em que pelo menos cerca de 90% das partículas possuem um diâmetro de menos de cerca de 10 pm.

O termo “solvato” significa um complexo ou agregado formado por uma ou mais moléculas de um soluto, isto é, um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I, e uma ou mais moléculas de um solvente. Tais solvatos tipicamente possuem uma proporção molar substancialmente fixa de soluto e solvente. Este termo também inclui clatratos, incluindo clatratos com água. Solventes representativos incluem por meio de exemplo, água, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético, e etc. Quando o solvente é água, o solvato formado é um hidrato.

O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” significa uma quantidade suficiente para efetuar o tratamento quando administrada a um paciente em necessidade de tratamento.

O termo “tratar” ou “tratamento” conforme usado aqui significa tratar ou o tratamento de uma doença ou condição de 24/05/2018, pág. 18/107

12/91 médica (tal como COPD) em um paciente, tal como um mamífero (particularmente um humano) que inclui:

(a) impedir que a doença ou condição médica ocorra, isto é, tratamento profilático de um paciente;

(b) melhorar a doença ou condição médica, isto é, eliminar ou causar a regressão da doença ou condição médica em um paciente;

(c) suprimir a doença ou condição médica, isto é, retardar ou interromper o desenvolvimento da doença ou condição médica em um paciente; ou (d) aliviar os sintomas da doença ou condição médica em um paciente.

O termo “forma de dosagem unitária” refere-se a uma unidade fisicamente separada adequada para medicamentar por dose um paciente, isto é, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de um sal da invenção calculada para produzir o efeito terapêutico desejado ou sozinho ou em combinação com uma ou mais unidades adicionais. Por exemplo, tais formas de dosagem unitária podem ser cápsulas inaladoras de pó seco, uma dose medida a partir de um inalador de dose medida, cápsulas, comprimidos, pílulas e etc.

Sais do ácido 1,2-etanodissulfônico da invenção

Um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico cristalino do éster 1- [2- (2-cloro-4-{ [ (R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico desta invenção pode ser preparado a partir do éster 1- [2- (2-cloro-4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5de 24/05/2018, pág. 19/107

13/91 metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico e o ácido 1,2-etanodissulfônico ou um hidrato deste.

Um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico desta invenção tipicamente contém entre cerca de 0,90 e cerca de 1,10 equivalentes molares do ácido 1,2-etanodissulfônico por equivalente molar do composto de fórmula I; incluindo entre cerca de 0,95 e cerca de 1,05 equivalentes molares do ácido

1,2-etanodissulfônico por equivalente molar do composto de fórmula I. Em uma modalidade particular, o sal do ácido

1,2-etanodissulfônico desta invenção contém cerca de 1 equivalente molar do ácido 1,2-etanodissulfônico por equivalente molar do composto de fórmula I.

A proporção molar entre o ácido 1,2-etanodissulfônico e o éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico pode ser facilmente determinada por vários métodos disponíveis àqueles habilitados na técnica. Por exemplo, tais proporções molares podem ser facilmente determinadas por ^-H NMR. Alternativamente, a análise elementar e os métodos de HPLC podem ser usados para determinar a relação molar.

O éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico empregado nesta invenção pode ser facilmente preparado a partir de materiais iniciais e reagentes comercialmente disponíveis usando-se os procedimentos descritos nos Exemplos Abaixo; ou usando-se os de 24/05/2018, pág. 20/107

14/91 procedimentos descritos no Pedido de Patente U. S. comumente cedido na seção de Fundamentos deste pedido.

O ácido 1,2-etanodissulfônico está comercialmente disponível a partir, por exemplo, de Alfa Chemicals Ltd., Berkshire, UK. Em uma modalidade, o ácido 1,2etanodissulfônico empregado na preparação dos sais desta invenção é um dihidrato. Em uma modalidade particular, o dihidrato do ácido 1,2-etanodissulfônico possui uma pureza maior ou igual a 97% (conforme determinado por HPLC) . Se desejado, o dihidrato do ácido 1,2-etanodissulfônico empregado nesta invenção pode ser recristalizado a partir de, por exemplo, ácido acético e anidrido acético antes do uso.

Para preparar um sal cristalino desta invenção, o éster 1- [2- (2-cloro-4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico é tipicamente contatado com cerca de 0,75 a cerca de 1,3 equivalente molar do ácido 1,2etanodissulfônico ou um hidrato deste. Geralmente, esta reação é conduzida em um diluente inerte a uma temperatura variando de cerca de 0°C a cerca de 60°C; incluindo cerca de 20°C a cerca de 55°C, tal como cerca de 25°C a cerca de 50°C. Diluentes inertes adequados para esta reação incluem, mas não estão limitados a metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, acetato de etila, diclorometano e etc, opcionalmente contendo água. Em uma modalidade particular, uma solução de dihidrato do ácido 1,2-etanodissulfônico em etanol é adicionada a um volume cerca de 5 vezes maior que o volume do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8de 24/05/2018, pág. 21/107

15/91 hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico em uma mistura de isopropanol e ciclorometano (64:1). Em outras modalidades particulares, a solução de dihidrato do ácido 1,2-etanodissulfônico inclui água e etanol como o diluente e a solução do éster 1-[2-(2-cloro4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico inclui isopropanol ou etanol como diluentes.

Alternativamente, um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico de um composto de fórmula I pode ser preparado contatando-se um derivado protegido com silil do composto de fórmula I (isto é, um composto de fórmula II) com uma fonte de íon fluoreto e então, no mesmo recipiente de reação, contatar o produto com o ácido 1,2etanodissulfônico ou um hidrato deste. Em uma modalidade particular, o grupo protetor de silil é um grupo tercbutildimetilsilil. Outros grupos protetores de silil adequados incluem terc-butildifenilsilil, difenilmetilsilil, di-terc-butilmetilsilil, tercbutoxidifenilsilil e etc. A fonte de íon fluoreto usada neste processo pode ser qualquer reagente contendo ou compreendendo íon fluoreto ou fluoreto de hidrogênio. Em uma modalidade particular, a fonte de íon fluoreto é trihidrofluoreto de trietilamina. Outras fontes adequadas de íon fluoreto incluem fluoreto de tetrabutilamônio, fluoreto de potássio 18-coroa-6, fluoreto de hidrogênio, hidrofluoreto de piridina, e etc.

Geralmente, este processo é conduzido em um diluente

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16/91 inerte a uma temperatura variando de cerca de 0°C a cerca de 50°C; incluindo cerca de 20°C a cerca de 35°C, tal como cerca de 25°C a cerca de 30°C. Diluentes inertes adequados para esta reação incluem, mas não estão limitados a, diclorometano, metanol e misturas destes. Em uma modalidade particular, uma solução de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico é contatada com cerca de 2,5 a cerca de 3,0 equivalentes molares de trihidrofluoreto de trietilamina em diclorometano à temperatura ambiente por cerca de 12 a 24 horas ou até remoção do grupo silil estar substancialmente completa. À solução resultante, sem isolamento do produto de reação, é adicionado cerca de 0,9 a cerca de 1,1 equivalente molar do dihidrato do ácido 1,2etanodissulfônico em metanol e esta mistura é aquecida entre cerca de 25°C e cerca de 35°C por cerca de 2 a cerca de 6 horas. Na finalização da reação, um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico é isolado da mistura reacional por qualquer meio convencional, tal como precipitação, concentração, centrifugação e etc.

Opcionalmente, um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico desta invenção pode ser também purificado por agitação ou misturando-se o sal em isopropanol contendo cerca de 15% a cerca de 25%, incluindo cerca de 20%, de água em volume. Em uma modalidade particular, cerca de 10 mL da mistura de isopropanol/água é empregada por grama do de 24/05/2018, pág. 23/107

17/91 sal do ácido 1,2-etanodissulfônico.

Um processo de preparação de um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico desta invenção pode opcionalmente incluir o uso de um cristal de semente para produzir predominantemente um sal cristalino particular. Por exemplo, utilizando-se um cristal de semente de um sal cristalino de fusão alta (isto é, maior que cerca de 230°C), um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico de um composto de fórmula I pode ser preparado possuindo essencialmente o mesmo ponto de fusão do cristal de semente.

Tais cristais de semente podem ser usados quando se forma inicialmente o sal cristalino ou eles podem ser usados para recristalizar um sal cristalino ou parcialmente cristalino.

Tipicamente, os cristais de semente são preparados em pequena escala por cristalização lenta sem agitação e sem aplicar resfriamento. Por meio de ilustração, para se obter cristais de semente, o sal cristalino é tipicamente dissolvido em um diluente inerte a uma temperatura suficiente para fornecer dissolução. Geralmente, no processo inicial de obtenção dos cristais de semente, uma pequena quantidade, tipicamente menos de 10 g, incluindo menos de 5 g, tal como menos de cerca de 1 g, do sal cristalino é usado. Em uma modalidade particular, metanol contendo cerca de 12% a cerca de 20% d'água, incluindo cerca de 13% a cerca de 15% d'água, é usado como o diluente a uma temperatura variando de cerca de 60°C a cerca de 70°C, tal como cerca de 60°C a cerca de 65°C. A solução é deixada a resfriar à temperatura ambiente. Após cerca de 1 de 24/05/2018, pág. 24/107

18/91 dia a cerca de 3 dias, os cristais resultantes são isolados por filtração ou outros meios convencionais. Alternativamente, os cristais de semente podem ser obtidos a partir de uma preparação prévia de material cristalino.

No processo de recristalização usando-se cristais de semente, um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico desta invenção é dissolvido em um diluente inerte como no processo de obtenção de cristais de semente, tipicamente metanol contendo 15% d'água, a uma temperatura variando de cerca de 60°C a cerca de 65°C. A solução é deixada a resfriar a uma temperatura em que os cristais de semente não se dissolvem, por exemplo, a uma temperatura na faixa de cerca de 30°C a cerca de 40°C, e então os cristais de semente são adicionados. Tipicamente, a relação entre o peso dos cristais de semente e o peso do sal cristalino na solução está entre cerca de 1:5 e cerca de 1:35. A solução é resfriada a uma temperatura em que a cristalização ocorre, por exemplo, a cerca de 20°C e agitada por cerca de horas a cerca de 24 horas. Os cristais resultantes são isolados por meios convencionais. Para se obter cristais de semente suficientes para preparar grandes lotes de material, o processo de recristalização pode ser executado sucessivamente usando-se os cristais obtidos por uma primeira recristalização como os cristais de semente para uma etapa de recristalização subseqüente. Será avaliado que as temperaturas específicas em que as etapas do processo de recristalização são executadas, são selecionadas dependendo do caráter do diluente e de concentração do sal cristalino no diluente. Adicionalmente, o processo de recristalização pode ser conduzido usando-se ou evaporação ou um antide 24/05/2018, pág. 25/107

19/91 solvente, para facilitar a cristalização em vez de resfriamento.

Entre outras vantagens, foi descoberto que a formação de um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I é útil para purificar o composto de fórmula I. Geralmente, um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico desta invenção possui uma pureza maior que 95%; e tipicamente maior que 98%, conforme determinado por cromatografia líquida de alta performance.

O sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico da presente invenção é caracterizado por um ponto de fusão muito alto conforme evidenciado pelos gráficos/traces de calorimetria de escaneamento diferencial (DSC) que exibem um pico no fluxo de calor endotérmico na faixa de cerca de 215°C a cerca de 240°C. Foi observado que a temperatura do ponto de fusão do sal cristalino é dependente do processo pelo qual o sal cristalino foi formado. Os cristais de semente formados por cristalização lenta sem agitação e sem resfriamento aplicado exibiram pontos de fusão mais altos que cerca de 230°C. Os sais cristalinos formados por um processo incluindo a recristalização com tais cristais de semente tipicamente exibiram pontos de fusão na faixa de cerca de 230°C a cerca de 245°C, conforme mostrado, por exemplo, na Figura 1. Os sais cristalinos formados sem um cristal de semente que possuem um ponto de fusão acima de cerca de 230°C, tipicamente exibem pontos de fusão na faixa de cerca de 215°C a cerca de 229°C, conforme mostrado por exemplo na Figura 2. Em modalidades particulares, portanto, a invenção fornece sais cristalinos do ácido 1,2etanodissulfônico do composto de fórmula I possuindo um de 24/05/2018, pág. 26/107

20/91 gráfico de DSC na faixa de temperatura acima de cerca de 200°C que está substancialmente de acordo com o gráfico na Figura 1 ou com aquele mostrado na Figura 2.

Em uma outra modalidade, o sal cristalino do ácido 5 1,2-etanodissulfônico da presente invenção está caracterizado por um padrão de difração de raio X no pó (PXRD) possuindo picos de difração significantes em valores 2Θ de 5,0 ± 0,3, e 15,0 ± 0,3. Diferenças sutis podem ser observadas entre as posições de pico no espectro de PXRD do sal cristalino preparado por recristalização a partir de um cristal de semente de alto ponto de fusão, conforme mostrado na Figura 3 e aquele de um sal preparado sem o uso do tal cristal de semente, conforme mostrado na Figura 4. Conseqüentemente em modalidades separadas, o sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I é caracterizado por um padrão de difração de raio X no pó em que as posições de pico estão substancialmente de acordo com aqueles mostrados na Figura 3 ou com aqueles mostrados na Figura 4.

Em uma outra modalidade, o sal cristalino do ácido

1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I é caracterizado por seu espectro de absorção de infravermelho (IR) que apresenta faixas de absorção significantes em cerca de 704, 748, 768, 841, 900, 1055, 1104, 1166, 1218,

1294, 1408, 1522, 1609, 1655 e 1701 cm^-1, conforme ilustrado na Figura 5.

Um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I foi demonstrado como possuindo um perfil de absorção/dessorção reversível com um nível moderado de higroscopicidade, aceitável, (isto é, menos de

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21/91 cerca de 2,5% de ganho de peso na faixa de umidade de 40% de umidade relativa a 75% de umidade relativa.

Estas propriedades dos sais desta invenção são também ilustradas nos Exemplos abaixo.

COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

O sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I é tipicamente administrado a um paciente na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticas podem ser administradas ao paciente por qualquer rota de administração aceitável incluindo, mas não limitada a modos de administração por inalação, oral, nasal, tópica (incluindo transdermal) e parenteral. Entretanto, será compreendido por aqueles habilitados na técnica que uma vez que o sal cristalino desta invenção foi formulado, ele pode não mais estar na forma cristalina, isto é, o sal pode ser dissolvido em um veículo adequado.

Conseqüentemente, em um outro aspecto da composição, esta invenção está dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável e um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1- [2 - (2-cloro-4-{ [ (R)-2-hidroxi-2- (8-hidroxi-2-oxo-1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil25 2-ilcarbâmico ou um solvato deste. Opcionalmente, tais composições farmacêuticas podem conter outros agentes terapêuticos e/ou de formulação se desejado.

As composições farmacêuticas desta invenção contêm tipicamente uma quantidade terapeuticamente efetiva de um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloroPetição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 28/107

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4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste.

Tipicamente, tais composições farmacêuticas irão conter de 5 cerca de 0,01 a cerca de 95% em peso do agente ativo; incluindo, de cerca de 0,01 a cerca de 30% em peso; tal como de cerca de 0,01 a cerca de 10% em peso do agente ativo.

Qualquer veículo ou excipiente convencional pode ser usado nas composições farmacêuticas desta invenção. A escolha de um veículo ou excipiente particular, ou combinações de veículos ou excipientes, irá depender do modo de administração que está sendo usado para tratar um paciente particular ou tipo de condição médica ou estado da doença. Sob este aspecto, a preparação de uma composição farmacêutica adequada para um modo particular de administração está inserida no escopo daqueles habilitados na técnica farmacêutica. Adicionalmente, os ingredientes para tais composições estão comercialmente disponíveis a partir de, por exemplo, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Por meio de ilustração adicional, técnicas de formulação convencionais estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^a edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); e H.C. Ansel e outros, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Exemplos representativos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados aos seguintes: (1) açúcares, tais como

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23/91 lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais com carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) Agar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de tampão fosfato; (21) gases propelentes comprimidos, tais como clorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos; e (22) outras substâncias compatíveis atóxicas empregadas em composições farmacêuticas.

As composições farmacêuticas desta invenção são tipicamente preparadas misturando-se ou combinando-se completamente e intimamente um sal da invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável um ou mais ingrediente(s) opcional(ais). Se necessário ou desejado, a mistura combinada uniformemente resultante pode então ser moldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas, canísteres, cartuchos, dispensadores e etc., usando-se procedimentos e equipamentos convencionais.

Em uma modalidade, as composições farmacêuticas desta de 24/05/2018, pág. 30/107

24/91 invenção são adequadas para a administração por inalação. Composições farmacêuticas adequadas para administração por inalação estarão tipicamente na forma de um aerossol ou um pó. Tais composições são geralmente administradas usando-se dispositivos bem conhecidos, tais como um inalador nebulizador, um inalador com dose medida (MDI), um inalador de pó seco (DPI) ou um dispositivo de entrega similar.

Em uma modalidade específica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente ativo é administrado por inalação usando-se um inalador nebulizador. Tais dispositivos nebulizadores tipicamente produzem uma corrente de ar de alta velocidade que faz com que a composição farmacêutica compreendendo o agente ativo pulverize-se como uma névoa que é transportada para dentro do trato respiratório do paciente. Conseqüentemente, quando formulado para uso em um inalador nebulizador, o agente ativo é tipicamente dissolvido em um veículo adequado para formar uma solução. Dispositivos nebulizadores adequados são fornecidos comercialmente, por exemplo, por PARI GmbH (Starnberg, German). Outros dispositivos nebulizadores incluem Respimat (Boehringer Ingelheim) e aqueles divulgados, por exemplo, na Patente U. S. de número 6.123.068 e WO 97/12687.

Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador nebulizador compreende uma solução aquosa compreendendo de cerca de 0,05 pg/mL a cerca de 10 mg/mL de um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de formula I ou um solvato deste. Em uma modalidade, a formulação nebulizadora aquosa é isotônica. Em uma modalidade, a formulação nebulizadora aquosa possui um ph

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25/91 na faixa de cerca de 4 a cerca de 6. Em uma modalidade particular, a formulação nebulizadora aquosa é tamponada com tampão citrato a um pH de cerca de 5. Em uma outra modalidade particular, a formulação nebulizadora aquosa contém de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL de equivalentes de base livre do éster 1-[2-(2-cloro-4-{ [(R)2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico.

Em uma outra modalidade específica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente ativo é administrada por inalação usando-se um inalador de pó seco. Tais inaladores de pó seco tipicamente administram o agente ativo como um pó não aglomerado que é disperso em uma corrente de ar do paciente durante a inspiração. A fim de alcançar um pó não aglomerado, o agente ativo é tipicamente formulado com um excipiente adequado, tal como lactose, amido, manitol. Dextrose, ácido poliláctico (PLA) polilactídeo-co-glicolídeo (PLGA) ou combinações destes. Tipicamente, o agente ativo pode ser micronizado e combinado com um veículo adequado para formar uma combinação de partículas micronizadas de tamanho respirável, onde o termo “partículas micronizadas” ou “forma micronizada” significa que pelo menos cerca de 90% das partículas possuem um diâmetro de menos de cerca de 10 pm.

Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador de pó seco compreende lactose que possui um tamanho de partícula entre cerca de 1 pm e cerca de 100 pm e partículas micronizadas de um sal do ácido 1,2de 24/05/2018, pág. 32/107

26/91 etanodissulfônico do composto de fórmula I, ou um solvato deste.

Tal formulação de pó seco pode ser feita, por exemplo, combinando-se a lactose com o agente ativo e então se combinando a seco os componentes. Alternativamente, se desejado o agente ativo pode ser formulado sem um excipiente. A composição farmacêutica é então tipicamente colocada em um distribuidor de pó seco, ou dentro de cartuchos ou cápsulas de inalação para uso com um dispositivo de entrega de pó seco.

Exemplos de dispositivos de entrega de pó seco por inalação incluem Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC) (veja, por exemplo, Patente U. S. de número 5.035.237); Diskus (GlaxoSmithKline) (veja, por exemplo, Patente U. S. de número 6.378.519); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE) (veja, por exemplo, Patente U. S. de número 4.524.769); Rotahaler (GlaxoSmithKline) (veja, por exemplo, Patente U. S. de número 4.353.365) e Handihaler (Boehringer Ingelheim). Exemplos adicionais de dispositivos tipo DPI adequados estão descritos nas Patentes U. S. de números 5.415.162, 5.239.993 e 5.715.810 e referências aqui citadas.

Em ainda uma outra modalidade específica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente ativo é administrada por inalação usando-se um inalador de dose medida. Tais inaladores de dose medida tipicamente descarregam uma quantidade medida do agente ativo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste usando-se gás propelente comprimido. Conseqüentemente, as composições farmacêuticas administradas usando-se um inalador de dose medida de 24/05/2018, pág. 33/107

27/91 tipicamente compreendem uma solução ou suspensão do agente ativo em um propelente liquefeito. Qualquer propelente liquefeito adequado pode ser empregado incluindo clorofluorocarbonos, tal como CCl3F, e hidrofluoroalcanos (HFAs), tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) e 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano (HFA 227). Devido às preocupações com a destruição da camada de ozônio pelos clorofluorocarbonos, as formulações que contêm HFAs são geralmente preferidas. Componentes opcionais adicionais de formulações de HFA incluem co-solventes, tais como etanol ou pentano, e tensoativos, tais como trioleato de sorbitano, ácido oléico, lecitina e glicerina. Veja, por exemplo, a Patente U. S. de número 5.225.183, EP 0717987 A2, e WO 92/22286.

Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador de dose medida compreende de cerca de 0,01% a cerca de 5% em peso de um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do composto de fórmula I, ou um solvato deste, de cerca de 0% a cerca de 20% em peso de etanol, e de cerca de 0 % a cerca de 5% em peso de tensoativo, com o restante sendo um propelente do tipo HFA.

Tais composições são tipicamente preparadas pela adição de hidrofluoroalcano resfriado ou pressurizado a um recipiente adequado contendo o agente ativo, etanol (se presente) e o tensoativo (se presente). Para preparar uma suspensão, o agente ativo é micronizado e então combinado com o propelente. A formulação é então carregada dentro de um caníster de aerossol, que forma uma parte de um dispositivo inalador de dose medida. Exemplos de dispositivos inaladores de dose medida desenvolvidos de 24/05/2018, pág. 34/107

28/91 especificamente para uso com os propelentes de HFA são fornecidos nas Patentes U.S. de números 6.006.745 e

6.143.277. Alternativamente, uma formulação em suspensão pode ser preparada através de secagem por pulverização de uma cobertura de tensoativo sobre partículas micronizadas do agente ativo. Veja, por exemplo, WO 99/53901 e WO 00/61108.

Para exemplos adicionais de processos de preparação de partículas respiráveis, e formulações e dispositivos adequados para dosagem por inalação, veja as Patentes U. S. de números 6.268.533, 5.983.956, 5.874.063 e 6.221.398 e WO

99/55319 e WO 00/30614.

Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas desta invenção são adequadas para a administração oral. Composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pílulas, losangos, pastilhas, drágeas, pós, grânulos; ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou água em óleo; ou como um elixir ou xarope; e etc.; cada uma contendo uma quantidade predeterminada de um sal da presente invenção como um ingrediente ativo.

Quando objetivadas para administração oral em uma forma de dosagem sólida (isto é, como cápsulas, comprimidos, pílulas e etc.), as composições farmacêuticas desta invenção irão compreender tipicamente um sal da presente invenção como o ingrediente ativo e um ou mais veículo(s) farmaceuticamente aceitável(eis), tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio. Opcionalmente ou alternativamente, tais formas de dosagem sólidas podem de 24/05/2018, pág. 35/107

29/91 também compreender: (1) cargas ou diluentes, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico; (2) ligantes, tais como carboximetilcelulose, alginatos, gelatinas, polivinil pirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tal como Agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata e de tapioca, ácido algínico, alguns silicatos e/ou carbonato de sódio; (5) agentes retardantes em solução, tal como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de quaternário de amônio; (7) agentes umectantes, tal como álcool cetílico e/ou monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulim e/ou argila bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e/ou misturas destes; (10) agentes corantes; e (11) agentes de tamponamento.

Agentes de liberação, agentes umectantes, agentes de cobertura, adoçantes, agentes flavorizantes e aromatizantes, preservativos e antioxidantes podem também estar presentes nas composições farmacêuticas desta invenção. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e etc.; (2) antioxidantes solúveis em óleos, tais como palmitato de ascorbil, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e etc., e (3) agentes quelantes metálicos/de metal, tais como ácido cítrico, ácido de 24/05/2018, pág. 36/107

30/91 etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e etc. Agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulas e etc., incluem aqueles usados para revestimentos entéricos, tais como acetato ftalato de celulose (CAP), acetato ftalato de polivinila (PVAP), ftalato de hidroxipropil metilcelulose, copolímeros de ácido metacrílico-éster de ácido metacrílico, trimetilato de acetato de celulose (CAT), carboximetil etil celulose (CMEC), succinato de acetato de hidroxipropil metil celulose (HPMCAs) e etc.

Se desejado, as composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser formuladas para fornecer liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo usandose, por meio de exemplo, hidroxipropil metil celulose em proporções variadas; ou outras matrizes poliméricas tal como ácido poliláctico (PLA) ou polilactíedeo-co-glicolídeo (PLGA), lipossomos e/ou microesferas.

Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem opcionalmente conter agentes opacificantes e podem também ser formuladas de forma que elas liberem o ingrediente ativo apenas, ou preferivelmente, em uma certa parte do trato gastrointestinal, opcionalmente, de uma maneira retardada. Exemplos de composições de embebição que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O ingrediente ativo pode também estar na forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais do(s) excipiente(s) acima descrito(s).

As formas de dosagem líquidas adequadas para administração oral incluem, por meio de ilustração, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões,

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31/91 soluções, suspensões, xaropes e elixires. Tais formas de dosagem líquidas tipicamente compreendem o ingrediente ativo e um diluente inerte, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3butileno glicol, óleos (especialmente, óleos de semente de algodão, nozes trituradas, milho, germe de trigo, oliva, rícino, e gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas destes. Suspensões, além do ingrediente ativo, podem conter agentes de suspensão tais como, por exemplo, álcoois isoestearílico etoxilado, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, Agar-agar e tragacanto, e misturas destes.

Quando objetivadas para administração oral, as composições farmacêuticas desta invenção são preferivelmente embaladas em uma forma de dosagem unitária. Por exemplo, tais formas de dosagem unitárias podem ser cápsulas, comprimidos, pílulas e etc.

Os sais desta invenção podem também ser administrados de forma transdérmica usando-se sistemas e excipientes de entrega transdérmica. Por exemplo, um composto desta invenção pode ser misturado com melhoradores de permeação, tais como propileno glicol, monolaurato de polietileno glicol, azacicloalcan-2-onas e etc., e incorporado em um adesivo ou sistema de entrega similar. Excipientes adicionais incluindo agentes de gelificação, emulsificantes de 24/05/2018, pág. 38/107

32/91 e tampões, podem ser usados em tais composições transdérmicas se desejado.

As composições farmacêuticas desta invenção podem também conter outros agentes terapêuticos que são coadministrados com um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I, ou solvato deste. Por exemplo, as composições farmacêuticas desta invenção podem também compreender um ou mais agentes terapêuticos selecionados a partir de agentes antiinflamatórios (por exemplo, agentes antiinflamatórios esteroidais, tais como corticosteróides; e agentes antiinflamatórios não esteroidais (NSATDs)), inibidores da fosfodiesterase IV, agentes antiinfectivos (por exemplo, antibióticos ou antivirais), antihistamínicos, agonistas do receptor 32-adrenérgico, antagonistas do receptor muscarínico (isto é, agentes anticolinérgicos) e etc. Os outros agentes terapêuticos podem ser usados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos. Adicionalmente, se apropriado, os outros agentes terapêuticos podem ser usados como estereoisômeros oticamente puros.

Se desejado, os sais desta invenção podem também ser administrados em combinação com outro(s) agente(s) terapêutico(s), tais como aqueles aqui descritos. Nesta modalidade, os componentes não são fisicamente misturados juntos, mas não administrados simultaneamente ou seqüencialmente como composições separadas. Por exemplo, um sal desta invenção pode ser administrado por inalação simultaneamente ou seqüencialmente com um agente antiinflamatório esteroidal, tal como um corticosteróide, usando-se um dispositivo de entrega de inalação que emprega de 24/05/2018, pág. 39/107

33/91 compartimentos separados (por exemplo, cartela tipo blíster) para cada agente terapêutico. Alternativamente, a combinação pode ser administrada de dispositivos de entrega múltiplos, isto é, um dispositivo de entrega para cada agente terapêutico.

Agonistas do receptor 32-adrenérgico representativos que podem ser usados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol e etc., ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Outros agonistas do receptor β2adrenérgico que podem ser usados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a, 3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil) fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)benzenossulfonamida e 3(-3-{ [ 7-({ (2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3- (hidroximetil) fenil]etil}amino)heptil]oxi}propil)benzenossulfonamida e compostos relacionados divulgados em WO 02/066422, publicada em 29 de agosto de 2002; 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil) fenil]etil}amino) hexil]-oxi}butil) fenil]imidazolidina-2,4-diona e compostos relacionados divulgados em WO 02/070490, publicada em 12 de setembro de 2002; 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formilamino)-4hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi} butil) benzenossulfonamida, 3-(4-{ [6-({ (2S)-2-[3-(formilamino) - 4hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi} butil)benzenossulfonamida, 3-(4-{ [6-({ (2R/S)-2-[3-(formilamino)30 4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi} butil)

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34/91 benzenossulfonamida, N- (terc-butil)-3-(4-{ [6-({ (2R)-2-[3(formilamino) -4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi} butil) benzenossulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6({(2S)-2-[3- (formilamino)-4-hidroxifenil]-2 -hidroxietil} amino)hexil]oxi}butil)benzenossulfonamida, N- (terc-butil)3-(4-{ [6-({ (2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil] -2hidroxietil} amino)hexil]oxi}butil)benzenossulfonamida e compostos relacionados divulgados em WO 02/076933, publicada em 3 de outubro de 2002; 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6diclorobenzil)oxi] etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2(hidroximetil)fenol e compostos relacionados divulgados em WO 03/024439, publicada em 27 de março de 2003; N-{2-[4( (R) -2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi2-(3-formamido-4-hidroxifenil)etilamina e compostos relacionados divulgados na Patente U. S. de número 6.576.793 B1, emitida em 10 de junho de 2003; N-{2-[4-(3fenil-4-metoxifenil)aminofenil] hidroxi-2(1H) -quinolinon-5-il) relacionados divulgados na Patente U. S. de número 6.653.323 B2, emitida em 25 de novembro de 2003; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Em uma modalidade particular, o agonista do 32-adrenoreceptor é um sal do tipo monohidrocloreto cristalino de N-{2-[4-((R)-2hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}- (R)-2-hidroxi-2-(3formamido-4-hidroxifenil)etilamina. Quando empregado, o agonista do 32-adrenoreceptor estará presente na composição farmacêutica em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Tipicamente, o agonista do 32-adrenoreceptor estará presente em uma quantidade suficiente para fornecer de cerca de 0,05 pg a cerca de 500 pg por dose.

etil}-(R)-2-hidroxi-2-(8etilamina e compostos de 24/05/2018, pág. 41/107

35/91

Agentes anti-inflamatórios esteroidais representativos que podem ser usados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a metil prednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometil do ácido 6,9-difluoro-17[(2-furanilcarbonil)oxi]-11-hidroxi-16-metil-3-oxoandrosta1,4-dieno-17-carbotióico, éster S-(2-oxotetrahidrofuran-3Sil) do ácido 6,9-difluoro-11-hidroxi-16-metil-3-oxo-17propioniloxi-androsta-1,4-dieno-l7-carbotióico, ésteres de beclometasona (por exemplo, o éster 17-propionato ou o éster 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres mometasona (por exemplo, o éster furoato), triamcinolona acetonida, rofleponida, ciclesonida, butixocort propionato, RPR-106541, ST-126 e etc., ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Em uma modalidade particular, o agente anti-inflamatório esteroidal é éster S-fluorometil do ácido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi] -11β -hidroxi16α-metil-3-oxoandrosta-1,4-dieno-17β-carbotióico ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste. Quando empregado, o agente antiinflamatório esteroidal estará presente na composição farmacêutica em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Tipicamente, o agente antiinflamatório esteroidal estará presente em uma quantidade suficiente para fornecer de cerca de 0,05 pg a cerca de 500 pg por dose.

Outras combinações adequadas incluem, por exemplo, outros agentes anti-inflamatórios, por exemplo, NSAIDs (tais como cromoglicato de sódio; nedocromil sódio; inibidores de fosfodiesterase (PDE) (por exemplo, teofilina, inibidores de PDE4 ou inibidores de PDE3/PDE4

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36/91 misturados); antagonistas de leucotrieno (por exemplo, montelukast); inibidores da síntese de leucotrieno; inibidores de iNOS; inibidores de protease, tais como inibidores de triptase e elastase; antagonistas de beta-2 integrina e agonistas e antagonistas do receptor de adenosina (por exemplo, agonistas de adenosina 2a) ; antagonistas de citoquina (por exemplo, antagonistas de quimoquina tal como, um anticorpo de interleucina (anticorpo de IL), especificamente uma terapia de IL-4, uma terapia de IL-13, ou uma combinação destes); ou inibidores de síntese de citoquina.

Por exemplo, inibidores de fosfodiesterase-4 (PDE4) ou inibidores de PDE3/PDE4 misturados representativos que podem ser usados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados ao ácido cis 4ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan -1carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona; cis-[4-ciano-4-(3 -ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan -1-ol];

ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4metoxifenil]ciclohexano-1-carboxílico e etc., ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Outros inibidores de PDE4 ou PDE4/PDE3 misturados representativos incluem AWD12-281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience and

Schering-Plough); CI-1018 ou PD-168787 (Pfizer); compostos benzodioxol divulgados em WO099/16766 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko) ; V-l 1294A (Napp) ; roflumilast (Byk-Gulden) ; compostos ftalazinona divulgados em WO99/47505 (BykGulden) ; Pumafentrine (Byk-Gulden, agora Altana); arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440

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37/91 (Tanabe Seiyaku); e T2585 (Tanabe Seiyaku).

Antagonistas muscarínicos representativos (isto é, agentes anticolinérgicos) que podem ser usados em combinação com, e em adição a, os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a atropina, sulfato de atropina, óxido de atropina, nitrato de metilatropina, hidrobrometo de homatropina, hidrobrometo de hiosciamina (d, l), hidrobrometo de scopolamina, brometo de ipratrópio, brometo de oxitrópio, brometo de tiotrópio, metantelina, brometo de propantelina, brometo de metil anisotropina, brometo de clidínio, copirrolato (Robinul), iodeto de isopropamida, brometo de mepenzolato, cloreto de tridihexetila (Pathilone), metilsulfato de hexocíclio, hidrocloreto de ciclopentolato, tropicamida, hidrocloreto de trihexifenidil, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 e metoctramina e etc., ou um sal farmaceuticamente aceitável destes; ou, para aqueles compostos listados como um sal, um sal farmaceuticamente aceitável alternativo deste.

Anti-histaminas representativas (isto é, antagonistas do receptor H1) que podem ser usados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a etanolaminas, tais como maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, hidrocloreto de defenilhidramina, tal como maleato de pirilamina, hidrocloreto de tripelenamina e citrato de clorfeniramina hidrocloreto hidrocloreto

tripelenamina; alquilaminas,	tais como tal como
e	acrivastina; piperazinas,
de	hidrozina,	pamoato	de	hidrozina,
de	ciclizina,	lactato	de	ciclizina,
e meclizina e	hidrocloreto	de	cetirizina;

como astemizol, hidrocloreto de piperidinas, tais de 24/05/2018, pág. 44/107

38/91 levocabastina, loratidina ou seu análogo de descarboetoxi, terfenadina e hidrocloreto de fexofenadina; hidrocloreto de azelastina; e etc., ou um sal farmaceuticamente aceitável destes; ou, para aqueles compostos listados como um sal, um sal farmaceuticamente aceitável alternativo deste.

Doses adequadas para os outros agentes terapêuticos administrados em combinação com um composto da invenção estão na faixa de cerca de 0,05 pg/dia a cerca de 100 mg/dia.

As seguintes formulações ilustram composições farmacêuticas representativas da presente invenção:

Exemplo A - Formulação

Um pó seco para administração por inalação é preparado como segue:

Ingredientes Quantidade

Sal da Invenção 0,2 mg

Lactose 25 mg

Procedimento Representativo: O composto da invenção é micronizado e então combinado com lactose. Esta mistura combinada é então carregada em um cartucho de inalação de gelatina. Os conteúdos do cartucho são administrados usando-se um inalador de pó.

Exemplo B - Formulação

Uma formulação de pó seco para uso em um dispositivo de inalação de pó seco é preparada como segue:

Procedimento Representativo: Uma composição farmacêutica é preparada possuindo uma proporção de volume da formulação entre o sal micronizado da invenção e lactose de 1:200. A composição é colocada em um dispositivo de inalação de pó seco capaz de entregar entre cerca de 10 pg de 24/05/2018, pág. 45/107

39/91 e cerca de 100 pg do composto da invenção por dose.

Exemplo C - Formulação

Um pó seco para administração por inalação em um inalador de dose medida é preparado como segue:

Procedimento Representativo: Uma suspensão contendo 5% em peso de um sal da invenção e 0,1% de lecitina é preparada dispersando-se 10 gramas do composto da invenção como partículas micronizadas com tamanho médio menor que 10 pm em uma solução formada a partir de 0,2 grama de lecitina dissolvido em 200 mL de água desmineralizada. A suspensão é seca por pulverização e o material resultante é micronizado a partículas possuindo um diâmetro médio menor que 1,5 pm. As partículas são carregadas em cartuchos com 1,1,1,2tetrafluoroetano pressurizado.

Exemplo D - Formulação

Uma composição farmacêutica para uso em um inalador de dose medida é preparada como segue:

Procedimento Representativo: Uma suspensão contendo 5% do sal da invenção, 0,5% de lecitina e 0,5% de trealose é preparada dispersando-se 5 gramas do ingrediente ativo como partículas micronizadas com tamanho médio menor que 10 m em uma solução coloidal formada a partir de 0,5 grama de trealose e 0,5 grama de lecitina dissolvidos em 100 mL de água desmineralizada. A suspensão é seca por pulverização e o material resultante é micronizado a partículas possuindo um diâmetro médio menor que 1,5 pm. As partículas são carregadas em canísteres com 1,1,1,2-tetrafluoroetano pressurizado.

Exemplo E - Formulação

Uma composição farmacêutica para uso em um inalador de 24/05/2018, pág. 46/107

40/91 nebulizador é preparada como segue:

Procedimento Representativo: Uma formulação em aerossol aquosa para uso em um nebulizador é preparada dissolvendo-se 0,5 mg do sal da invenção em 1 mL de uma solução de cloreto de sódio a 0,9% acidificada com ácido cítrico. A mistura é agitada e sonicada até que o ingrediente ativo seja dissolvido. O pH da solução é ajustado a um valor de cerca de 5 pela adição lenta de

NaOH.

Exemplo F - Formulação

Cápsulas de gelatina rígidas para administração oral são preparadas como segue:

Ingredientes Quantidade

50 mg 2 00 mg 10 mg ingredientes são

Sal da invenção

Lactose (seca por pulverização)

Estearato de Magnésio

Procedimento Representativo: Os completamente combinados e então carregados em uma cápsula de gelatina rígida (460 mg da composição por cápsula).

Exemplo G - Formulação

Uma suspensão para administração oral é preparada como segue:

Ingredientes Quantidade

Sal da	invenção	1,0	g
Ácido	fumárico	0,5	g
Cloreto	de sódio	2,0	g
Metil	parabeno	0, 15	g
Propil	parabeno	0, 05	g
Açúcar	granulado	25, 5	g
)itol (solução a 70%)	12,85	g

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41/91

1,0 g

0,035 mL 0,5 mg

q.s. para 100 mL

Os ingredientes são

Veegum k (Vanderbilt Co.)

Flavorizante

Corantes Água destilada

Procedimento Representativo:

misturados para formar uma suspensão contendo 100 mg de ingrediente ativo por 10 mL de suspensão.

Exemplo H - Formulação

Uma formulação injetável é preparada como segue:

Ingredientes Quantidade

0,2 g

2,0 mL

q.s. para pH 4 q.s. para 20 mL

Sal da Invenção Solução tampão de acetato de sódio (0,4 M)

HCl (0,5N) ou NaOH (0,5N)

Água (destilada, estéril)

Procedimento Representativo: Os ingredientes acima são combinados e o pH é ajustado a 4 ± 0,5 usando-se HCl 0,5 N ou NaOH 0,5 N.

UTILIDADE

O composto de fórmula I possui tanto atividade do agonista do receptor 32-adrenérgico quanto do antagonista do receptor muscarínico e portanto, espera-se que um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do composto de fórmula I da presente invenção seja útil como um agente terapêutico para tratar condições médicas mediadas pelos receptores β2adrenérgicos ou receptores muscarínicos, isto é, condições médicas que são melhoradas pelo tratamento com o agonista do receptor β2-adrenérgico ou um antagonista do receptor muscarínico. Tais condições médicas incluem, por meio de

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42/91 exemplo, disfunções ou doenças pulmonares incluindo aquelas associadas com obstrução das vias aéreas reversível, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (por exemplo, bronquite crônica e chiante e enfisema), asma, fibrose pulmonar, rinite alérgica, rinorréia, e etc. Outras condições que podem ser tratadas incluem parto prematuro, depressão, falha congestiva do coração, doenças de pele (por exemplo, doenças inflamatórias, alérgicas, psoriáticas e doenças de pele proliferativas, condições onde a diminuição da acidez péptica é desejável (por exemplo, ulceração péptica e gástrica) e doença de perda muscular.

Conseqüentemente, em uma modalidade, esta invenção está dirigida a um método para tratar uma disfunção pulmonar, o método compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente efetiva de um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste. Quando usado para tratar uma disfunção pulmonar, o sal desta invenção será tipicamente administrado pela inalação em múltiplas doses por dia, em uma única dose diária ou em uma única dose semanal. Geralmente, a dose para tratar uma disfunção pulmonar irá variar de cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia.

Quando administrados por inalação, os compostos desta invenção tipicamente possuem o efeito de fornecer broncodilatação. Conseqüentemente, em um outro de seus aspectos do método, esta invenção está direcionada a um de 24/05/2018, pág. 49/107

43/91 método para fornecer broncodilatação em um paciente em necessidade de broncodilatação, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade produtora de broncodilatação de um sal do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1- [2-(2-cloro-4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico ou um solvato deste. Geralmente, a dose para fornecer broncodilatação irá variar de cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia.

Em uma modalidade, esta invenção está dirigida a um método de tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica ou asma, o método compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente efetiva de um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste. Quando usado para tratar uma COPD ou asma, o sal desta invenção será tipicamente administrado por inalação em múltiplas doses por dia, em uma única dose diária. Geralmente, a dose para tratar uma COPD ou asma irá variar de cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia. Conforme aqui usado, a COPD inclui bronquite obstrutiva crônica e enfisema (veja, por exemplo, Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N. Engl. J. Med. 2000: 343:269-78).

Quando usado para tratar uma disfunção pulmonar, o sal desta invenção é opcionalmente administrado em combinação com outros agentes terapêuticos. Conseqüentemente, em uma de 24/05/2018, pág. 50/107

44/91 modalidade particular, a composição farmacêutica e os métodos desta invenção também compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de um agente anti-inflamatório esteroidal. As propriedades e utilidade dos sais do ácido

1,2-etanodissulfônico desta invenção podem ser demonstrados usando-se vários ensaios in vitro e in vivo bem conhecidos daqueles habilitados na técnica. Por exemplo, ensaios representativos estão descritos em detalhes adicionais nos Exemplos a seguir.

EXEMPLOS

As Preparações e Exemplos a seguir são fornecidas para ilustrar modalidades específicas desta invenção. Estas modalidades específicas, entretanto, não são objetivadas para limitar o escopo desta invenção de qualquer forma a menos que especificamente indicado.

As seguintes abreviações possuem os seguintes significados a menos que de outra forma indicado e quaisquer outras abreviações aqui usadas e não definidas possuem seu significado padrão:

AC adenilil ciclase

Ach acetilcolina

ATCC American Type Culture Collection

BSA albumina bovina sérica cAMP 3',5'-monofosfato de adenosina cíclica

CHO ovário de hamster Chinês cMs Receptor M5 de chimpanzé clonado

DCM diclorometano (isto é, cloreto de metileno)

DIPEA N,N-diisopropiletilamina dPBS solução salina tamponada com fosfato de

Dulbecco

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DMEM	Meio de Eagle modificado com Dulbecco
DMSO	dimetil sulfóxido
EDTA	ácido etilenodiaminotetraacético
Emax	eficácia máxima
EtOAc	acetato de etila
EtOH	etanol
FBS	soro bovino fetal
FLIPR	Leitor de placa de imagem fluorométrico
Gly	glicina
HATU	Haxafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1
il-N,N,N',N'-	-tetrametilurônio
HBSS	Solução salina tamponada de Hank
HEK	células de rim embriônicas humanas
HEPES	Ácido 4-(2-hidroxietil)-1

piperazinaetanossulfônico

hM1	receptor M1 humano clonado
hM2	receptor M2 humano clonado
hM3	receptor M3 humano clonado
hM4	receptor M4 humano clonado
hM5	receptor M5 humano clonado
HPLC	cromatografia líquida de alta performance
IBMX	3-isobutil-1-metilxantina
%Eff	% de eficácia
PBS	solução salina tamponada com fosfato
PyBOP	hexafluorofosfato de benzotriazol-1

iloxitripirrolidinofosfônio

Rpm	rotações por minuto
TFA	ácido trifluoroacético
THF	tetrahidrofurano
Tris	tris(hidroximetil)aminometano

de 24/05/2018, pág. 52/107

46/91

A menos que notado em contrário, reagentes, materiais iniciais e solventes foram adquiridos a partir de fornecedores comerciais (como Aldrich, Fluka, Sigma e similares) e foram utilizados sem purificação adicional.

Nos exemplos descritos abaixo, a análise por HPLC foi conduzida utilizando-se um instrumento Agilent (Palo Alto, CA) série 1100 equipado com colunas Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm fornecida por Agilent, (uma coluna C14) possuindo um tamanho de partícula de 3,5 micra. A detecção foi feita por absorbância UV a 214 nm. Os dados de HPLC 10-70 foram obtidos com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/minuto de 10%-70% B durante 6 minutos. A fase móvel A era de 2% - 98% - 0,1% de ACN-H2O-TFA; e a fase móvel B era de 90% - 10% - 0,1% de

ACN-H2O-TFA. Usando-se as fases móveis A e B descritas acima, os dados de HPLC 5-35 e os dados de HPLC 10-90 foram obtidos com um gradiente de 5 minutos.

Dados de cromatografia líquida de espectrometria de massa (LCMS) foram obtidos com um instrumento da Applied Biosystems (Foster City, CA) Modelo API-150EX. Os dados de

LCMS 10-90 foram obtidos utilizando-se 10% - 90 % de uma

Fase Móvel B durante um gradiente de 5 minutos.

Uma purificação em pequena escala foi conduzida utilizando-se um sistema API 150EX Prep WorkStation da Applied Biosystems. A fase móvel era A: água + 0,05% v/v de TFA; e B: acetonitrila + 0,05% v/v de TFA. Para séries (tipicamente cerca de 3 a 50 mg de tamanho de amostra recuperada) as seguintes condições foram utilizadas: taxa de fluxo de 20 mL/min; 15 minutos de gradiente e uma coluna Prism RP de 20 mm x 50 mm com partículas de 5 micra (Thenno Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA) . Para purificações de de 24/05/2018, pág. 53/107

47/91 grande escala (tipicamente maiores que 100 mg de amostra crua), as seguintes condições foram utilizadas: taxa de fluxo de 60 mL/min; 30 minutos de gradiente e uma coluna Microsorb BDS de 41,4 mm x 250 mm com partículas de 10 micra (Varian, Palo Alto, CA).

A rotação específica para os compostos quirais (indicada como [a:]²⁰D) foi medida usando-se um polarímetro

Jasco Polarimeter (Model P-1010) com uma fonte de luz de halogênio de tungstênio e um filtro de 589 nm a 20°C. As amostras dos compostos de teste foram tipicamente medidas a mg/mL d'água.

Preparação 1

4-amino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metila

A uma	solução	de	ácido	4-amido-5-cloro-2-
15 metoxibenzóico	(1,008 g,	5,	0 mmol)	em uma mistura de
tolueno (9 mL)	e metanol	,	(1 mL) a	0°C foi adicionado
(trimetilsilil)diazometano	(2	, 0 M em	hexano, 3,0 mL, 6,0

mmol) gota a gota. A mistura reacional foi então aquecida à temperatura ambiente e agitada por 16 horas.

(Trimetilsilil)diazometano em excesso foi temperado adicionando-se ácido acético até que a cor amarelo brilhante da mistura reacional desaparecesse. A mistura foi então concentrada a vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco gelo, que foi usado sem purificação adicional.

Preparação 2

4-acriloilamino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metila

O produto bruto da Preparação 2 foi adicionado diclorometano (10 mL, 0,5 M) e trietilamina (2,1 mL, 15 mmol) . Esta mistura foi resfriada a 0°C e cloreto de

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48/91 acriloíla (812 pL, 10 mmol) foi adicionado gota a gota com agitação. Após 2 horas, a reação foi temperada adicionandose metanol (cerca de 2 mL) a 0°C e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 15 minutos e então concentrada a vácuo. Diclorometano (30 mL) e água (30 mL) foram adicionados ao resíduo e esta mistura foi misturada completamente. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (20 mL) . As camadas orgânicas foram combinadas, secas (Na2SO4), filtradas e o solvente foi removido a vácuo para fornecer o composto do título como um sólido espumoso marrom, que foi usado sem purificação adicional.

Preparação 3

Éster Piperidin-4-il do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico

Bifenil-2-isocianato (97,5 g, 521 mmol) e 4-hidroxi-1benzilpiperidina (105 g, 549 mmol), ambos disponíveis comercialmente a partir de Aldrich, Milwaukee, WI, foram aquecidos juntos a 70°C por 12 horas, durante este tempo a formação do éster 1-benzilpiperidin-4-il do ácido bifenil2-ilcarbâmico foi monitorada por LCMS. A mistura de reação foi então resfriada a 50°C e foi adicionado etanol (1 L) e depois foi adicionado ácido hidroclórico 6M (191 mL) lentamente. A mistura reacional foi então resfriada à temperatura ambiente e formato de amônio (98,5 g, 1,56 mol) foi adicionado e gás nitrogênio foi borbulhado através da solução vigorosamente por 20 minutos. Paládio (10% em peso (base seca) em carvão ativo) (20 g) foi então adicionado. A mistura reacional foi aquecida a 40°C por 12 horas e então filtrada através de um absorvente de Celite. O solvente foi então removido sob pressão reduzida e ácido hidroclórico 1M de 24/05/2018, pág. 55/107

49/91 (40 mL) foi adicionado ao resíduo bruto. Hidróxido de sódio (10 N) foi então adicionada para ajustar o pH a 12. A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 150 mL) e seca (sulfato de magnésio), e então o solvente foi removido sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (155 g, 100%). HPLC (10-70) Rt = 2,52; MS m/z: [M + H+] calculado para C18H20N2O2 = 297,15; encontrado, 297,3.

Preparação 4

4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1 -il] propionilamino}-5-cloro-2-metoxibenzoato de metila

Ao produto bruto da Preparação 2 foi adicionado o produto da Preparação 3 (1,33 g, 4,5 mmol) e uma mistura de THF (22,5 mL) e metanol (2,5 mL) . Esta mistura foi aquecida a 50°C com agitação por 16 horas e então o solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi analisado por cromatografia (sílica gel; EtOAc) para fornecer o composto do título (0,82 g, Rf = 0.4, 29% de rendimento em 3 etapas) como um sólido espumoso branco gelo. MS m/z 566,4 (M+H, esperado 565, 20 para C3ÜH32CIN3O6).

0 Preparação 5

Éster 1- [2-(2-Cloro-4-hidroximetil-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2ilcarbâmico

	A uma	solução do produto da	Preparação	4 (0,82	mg,
25 1,45	mmol)	em uma mistura de THF	(4,5 mL) e	metanol	(0,5
mL)	a 0°C	foi adicionado borohidreto de lítio	(32 mg,	1,45

mmol). A mistura reacional foi deixada a aquecer à temperatura ambiente e foi agitada por 41 horas. A reação foi então temperada adicionando-se ácido hidroclórico aquoso 1N a 0°C até que nenhuma bolha fosse observada e

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50/91 esta mistura foi agitada por 10 minutos. O solvente foi removido a vácuo e o resíduo foi dissolvido em acetonitrila (cerca de 2 mL) . Esta solução foi purificada por prep-RPHPLC (gradiente: 2 a 50% de acetonitrla em água com 0,05% de TFA) . As frações apropriadas foram coletadas e combinadas e liofilizadas para fornecer o composto do título como um sal trifluoroacetato. Este sal foi tratado com acetato de isopropila (10 mL) e hidróxido de sódio aquoso 1N (10 mL) e a camada orgânica foi coletada, seca (Na2SO4), filtrada e o solvente foi removido a vácuo para fornecer o composto do título (161 mg, 21% de rendimento) como um sólido espumoso branco. MS m/z 538,4 (M+H, esperado

537,20 para C29H32CIN3O5).

Preparação 6

Éster 1- [2-(2-Cloro-4-formil-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidin-4-il do ácido bifenil-2ilcarbâmico

A uma solução do produto da Preparação 5 (161 mg, 0,3 mmol) em diclorometano (3 mL) foram adicionados dimetil sulfóxido (213 pL, 3,0 mmol) e diisopropiletilamina (261 pL, 1,5 mmol) . Esta mistura foi resfriada a -20°C e o complexo de trióxido de enxofre-piridina (238 mg, 1,5 mmol) foi adicionado lentamente. Após 30 minutos, a mistura reacional foi temperada adicionando-se água (cerca de 3 mL). As camadas foram separadas e a camada orgânica foi seca (Na2SO4), filtrada e o solvente foi removida a vácuo para fornecer o composto do título como um sólido amarelo claro. MS m/z 536, 3 (M+H, esperado 535, 19 para C29H3üC1N3O5) .

Preparação 7

8-Benziloxi-5-(2-bromoacetil)-1H-quinolin-2-ona de 24/05/2018, pág. 57/107

51/91 (a) 8-Acetoxi-1H-quinolin-1-ona

8-hidroxiquinolina-N-óxido (160 gramas, 1,0 mol) disponível comercialmente a partir de Aldrich, Milwaukee, WI, e anidrido acético (800 mL, 8,4 mol) foram aquecidos a 100°C por 3 horas e então resfriados em gelo. O produto foi coletado em um funil de Buchner, lavado com anidrido acético (2 x 100 mL) e seco sob pressão reduzida para fornecer 8-acetoxi-1H-quinolin-2-ona (144 g) como um sólido.

(b) 5-acetil-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona

Uma mistura semifluida de cloreto de alumínio (85,7 gramas, 640 mmol) em 1,2-dicloroetano (280 mL) foi resfriada em gelo, e o produto da etapa (a) (56,8 gramas,

280 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida à temperatura ambiente, e então aquecida a 85°C. Após 30 minutos, cloreto de acetila (1,5 mL, 21 mmol) foram adicionados e a mistura foi aquecida por 60 minutos adicionais. A mistura reacional foi então resfriada e adicionada a ácido hidroclórico 1 N (3 L) a 0°C com boa agitação. Após agitação por 2 horas, os sólidos foram coletados em um funil de Buchner, lavados com água (3 x 250 mL) e secos sob pressão reduzida. O produto bruto isolado de vários lotes (135 g) foi combinado e triturado com diclorometano (4 L) por 6 horas. O sólido resultante foi coletado em um funil de Buchner e seco sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (121 g).

(c) 5-acetil-8-benziloxi-1H-quinolin-2-ona

Ao produto da etapa (b) (37,7 g, 186 mmol) foram adicionados Ν,Ν-dimetilformamida (200 mL) e carbonato de potássio (34,5 gramas, 250 mmol) seguidos por brometo de de 24/05/2018, pág. 58/107

52/91 benzila (31,8 gramas, 186 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2,25 horas e então vertida em cloreto de sódio saturado (3,5 L) a 0°C e agitada por 1 hora. O produto foi coletado e seco em um funil de Buchner por 1 hora, e os sólidos resultantes foram dissolvidos em diclorometano (2 L) e esta mistura foi seca sobre sulfato de sódio. A solução foi filtrada através de um absorvente de Celite que foi então lavada com diclorometano (5 x 200 mL). O filtrado combinado foi então concentrado à secura e os sólidos resultantes foram triturados com éter (500 mL) por 2 horas. O produto foi coletado em um funil de Buchner, lavado com éter (2 x 250 mL) e seco sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (44 g) como um pó.

(d) 8-Benziloxi-5-(2-bromoacetil)-1H-quinolin-2-ona

O produto da etapa (c) (20,0 gramas, 68,2 mmol) foi dissolvido em diclorometano (200 mL) e resfriado a 0°C. dietil eterato de trifluoreto de boro (10,4 mL, 82,0 mmol) foi adicionado através de uma seringa e a mistura foi aquecida à temperatura ambiente para fornecer uma suspensão espessa. A suspensão foi aquecida a 45°C (banho de óleo) e uma solução de bromo (11,5 gramas, 72,0 mmol) em diclorometano (100 mL) foi adicionada durante 40 minutos. A mistura foi mantida a 45°C por 15 minutos adicionais e então resfriada à temperatura ambiente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e então triturada com carbonato de sódio aquoso 10% (200 mL) por 1 hora. Os sólidos foram coletados em um funil de Buchner, lavados com água (4 x 100 mL) e secos sob pressão reduzida. Os produtos de duas execuções foram combinados para purificação. O produto bruto (52 gramas) foi triturado com 50% de metanol

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53/91 em clorofórmio (500 mL) por 1 hora. O produto foi coletado em um funil de Buchner e lavado com 50% de metanol em clorofórmio (2 x 50 mL) e metanol (2 x 50 mL). O sólido foi seco sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (34,1 g) como um pó.

Preparação 8

8-Benziloxi-5-[(R)-2-bromo-1- (terc-butildimetil silaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona (a) 8-Benziloxi-5-((R)-2-bromo-1-hidroxietil)-1Hquinolin-2-ona (R)-(+)-a,a-difenilprolinol (30,0 gramas, 117 mmol) e trimetilboroxina (11,1 mL, 78 mmol) foram combinados em tolueno (300 mL) e agitados à temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura foi colocada em um banho de óleo a 150°C e o líquido foi destilado. Adicionou-se tolueno em alíquotas de 20 mL e a destilação prosseguiu por 4 h. Um total de 300 mL de tolueno foi adicionado. A mistura foi então resfriada à temperatura ambiente. Uma alíquota de 500 pL foi evaporada até secar e pesada (246 mg) para determinar que a concentração do catalisador era de 1,8 M.

Colocou-se 8-benziloxi 5-(2-bromoacetil)-1H-quinolin2-ona (90,0 g, 243 mmol) sob nitrogênio e adicionou-se tetrahidrofurano (900 mL), seguido pelo catalisador descrito acima (1,8 M em tolueno, 15 mL, 27 mmol) . A suspensão foi resfriada a -10 ± 5°C em um banho de gelo/isopropanol. Adicionou-se borano (1,0 M em THF, 294 mL, 294 mmol) ao longo de 4 h. A reação foi então agitada por mais 45 minutos a -10°C e então foi adicionado metanol (250 mL) lentamente. A mistura foi concentrada sob vácuo e o resíduo foi dissolvido em acetonitrila em ebulição (1,3 de 24/05/2018, pág. 60/107

54/91

L) , filtrado enquanto quente e então resfriado à temperatura ambiente. Os cristais foram filtrados, lavados com acetonitrila e secos sob vácuo para fornecer o composto do título (72,5 g, 196 mmol, rendimento de 81%, 95% ee, 95% puro por HPLC).

(b) 8-Benziloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(terc-butildimetil silaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

Ao produto a etapa (b) (70,2 g, 189 mmol) adicionou-se N,N-dimetilformamida (260 mL) e esta mistura foi resfriada em um banho de gelo sob nitrogênio. Adicionou-se 2,6lutidina (40,3 g, 376 mmol) por 5 minutos e em seguida adicionou-se lentamente trifluorometanosulfonato de tercbutildimetilsilil (99,8 g, 378 mmol) enquanto a temperatura era mantida abaixo de 20°C. A mistura foi deixada para aquecer à temperatura ambiente por 45 minutos. Adicionou-se metanol (45 mL) à mistura, gota a gota, por 10 minutos e a mistura foi dividida entre acetato de etila/ciclohexano (1: 1, 500 mL) e água/salmoura (1:1, 500 mL) . Os orgânicos foram lavados duas vezes mais com água/salmoura (1:1, 500 mL cada).

Os orgânicos combinados foram evaporados sob pressão reduzida para fornecer um óleo amarelo claro. Duas porções separadas de ciclohexano (400 mL) foram adicionadas ao óleo e a destilação continuada até que uma mistura semifluida branca espessa fosse formada. Adicionou-se ciclohexano (300 mL) à mistura semifluida e os cristais brancos resultantes foram filtrados, lavados com ciclohexano (300 mL) e secos sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (75,4 g, 151 mmol, 80% de rendimento, 98,6% ee).

Preparação 9 A de 24/05/2018, pág. 61/107

55/91

8-benziloxi-5-[(R)-2-(N-benzilamino)-1- (tercbutildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

Uma solução agitada do produto da Preparação 8 (1,00 g, 2,05 mmol) e benzilamina (493 pL, 4,51 mmol) em DMSO (1,7 mL) foi aquecida a 105°C por 4 h. A mistura de reação foi deixada resfriar e foi então diluída com EtOAc (10 mL) e a camada orgânica foi lavada com solução de cloreto de amônia aquosa saturada (5 mL) e hidróxido de sódio 1 N (5 mL), seco (MgSO4) e o solvente removido sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (50%, EtOAc/hexanos) para fornecer o composto do título (700 mg, 67%) . MS m/z: [M + H+] calculado para C31H38N2O3Si 515,27; encontrado 515,5.

Preparação 9B

8-benziloxi-5-[(R)-2-(N-benzilamino)-1- (tercbutildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

A um frasco de 500 mL de três gargalos de fundo arredondado adicionou-se 8-benziloxi-5-[(R)-2-bromo-1(terc-butildimetil silaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona (43 g, 0,124 mol, cerca de 95% de pureza quiral), 1-metil-2pirrolidinona (210 mL) e benzilamina (28,3 g, 0,37 mol). A mistura resultante foi lavada com nitrogênio e depois agitada a 90°C por 6 horas. A mistura foi então resfriada á temperatura ambiente e foram adicionados água (300 mL) e acetato de etila (300 mL) . As camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com água (200 mL) , uma mistura 1:1 de água e solução de cloreto de sódio aquosa saturada (200 mL), e água (200 mL). A camada orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um

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56/91 óleo laranja.

Ao óleo laranja adicionou-se heptano (200 mL) e acetato de etila (200 mL) e a mistura resultante foi aquecida a 65°C para produzir uma solução clara. Esta solução foi resfriada à temperatura ambiente e deixada em repouso durante a noite (cerca de 16 horas), tempo em que se formou um precipitado. O precipitado foi coletado por filtração para fornecer um composto do título estereoquimicamente impuro (8,85 g, 79,6% ee) . O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título (38,6 g, 99,4% ee) . Este material foi combinado com um lote anterior de material (19,2 g, 99,5% ee) e foram adicionados heptano (250 mL) e acetato de etila (100 mL). Esta mistura foi aquecida a 80°C (solução turva a clara) e depois resfriada à temperatura ambiente e deixada em repouso durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração para proporcionar o composto do título como um sólido branco (36,8 g, 98,4% ee, 99,9% de pureza química). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em heptano (100 mL). Os sólidos resultantes foram coletados para fornecer o composto do título como um sólido bege (24 g, 100% de pureza quiral, 95% de pureza química).

Preparação 10A

5-[(R) -2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8hidroxi-1H-quinolin-2-ona

Uma solução agitada do produto da preparação 9 A (3,16 g, 6,15 mmol) e paládio (10% em peso (base seca) em carvão ativado) (1,58 g) em etanol (62 mL) foram colocados sob uma atmosfera de hidrogênio por 24 h. A mistura de reação foi de 24/05/2018, pág. 63/107

57/91 filtrada através de Celite, lavada com metanol (15 mL) e depois o solvente foi purificado sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido (1,52 g, 4,55 mmol, 74%).

Preparação 10B

Sal de Ácido Acético de 5-[(R)-2-amino-1-(tercbutildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona

8-benziloxi-5-[(R)-2-(N-benzilamino)-1-(tercbutildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona (100 g, 194 mmol) e ácido acético (17,5 mL, 291 mmol) foram dissolvidos em metanol (1 L). A solução clara foi removida com nitrogênio e então adicionou-se hidróxido de paládio em carbono (20 g, 10% em peso Pd (base seca), úmido (cerca de 50% de água)). Gás hidrogênio foi borbulhado através da solução agitada à temperatura ambiente por 6 horas, durante as quais se formou uma mistura semifluida espessa. A mistura de reação foi então purificada com nitrogênio e foi adicionado metanol (1 L). A mistura resultante foi agitada por cerca de 30 minutos (para dissolver o produto) e então a mistura foi filtrada através de uma placa de Celite. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a um volume de cerca de 500 mL e, à mistura semifluida resultante, adicionou-se etanol (500 mL) . A mistura resultante foi novamente concentrada sob pressão reduzida até um volume de cerca de 500 mL e o precipitado resultante foi coletado por filtração e seco para fornecer o composto do título como um sólido amarelo/branco (65 g, 85% de rendimento, > 98% de pureza).

Preparação 11

Éster 1-[2-(4-{ [ (R) -2-(terc-butildimetilsilaniloxi) de 24/05/2018, pág. 64/107

58/91

2(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-2-cloro-5-metoxi-fenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Ao produto da Preparação 6, em uma mistura de 5 diclorometano (0,5 mL) e metanol (0,5 mL) adicionou-se o produto da Preparação 10A (124,1 mg, 3,1 mmol) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 h. Adicionou-se triacetoxiborohidreto (190,7 mg, 0,9 mmol) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por

15 h. A reação foi resfriada adicionando-se água (cerca de

0,2 mL) e a mistura foi concentrada in vacuo para fornecer o composto do título, o qual foi utilizado sem purificação posterior. MS m/z 854,5 (M+H, esperado 853,36 para

C46H56ClN5O7Si) .

Preparação 12

Éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilca rbâmi co

Adicionou-se trihidrofluoreto de trietilamina (245 pL,

1,5 mmol) a uma suspensão do produto da Preparação 11 em diclorometano (1,0 mL, 0,3 M). Esta mistura foi agitada à temperatura ambiente por 45 h e então a mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura de DMF (0,5 mL), acetonitrila/água (1:1, com 0,1% TFA, 0,6 mL), TFA (0,3 mL) e acetonitrila (cerca de 1 mL) e esta mistura foi purificada por prep-RP-HPLC (graduação: 2% a 50% de acetonitrila em água com 0,05% de TFA). As frações apropriadas foram coletadas e combinadas e liofilizadas para fornecerem o sal de ditrifluoracetato do composto do

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59/91 título (100 mg, 34% de rendimento, 98,7% puro por HPLC) como um sólido branco gelo. MS m/z 740,5 (M+H, esperado

739, 28 para CoH42ClN5O7) .

EXEMPLO 1

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de Éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo- 1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilca rbâmi co

Uma solução de dihidrato de ácido 1,2etanodissulfônico (3,8 mg, 0,02 mmol) em etanol (0,2 mL) foi lentamente adicionada a uma solução do produto da Preparação 12 (14,3 mg, 0,02 mmol) em uma mistura 64:1 v/v de isopropanol e diclorometano (1 mL) A solução resultante foi aquecida entre 45°C e 50°C por cerca de 30 minutos. A mistura foi então lentamente resfriada à temperatura ambiente em cujo tempo a solução se tornou ligeiramente turva. A solução foi deixada repousar à temperatura ambiente sob uma leve corrente de nitrogênio durante a noite. O precipitado resultante foi coletado por filtração e seco para fornecer o composto do título como um sólido cristalino branco (13 mg, 72% de rendimento).

Exemplo 2

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de Éster 1-[2-(225 cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilca rbâmi co

Uma solução de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi30 2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino]

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60/91 metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico (26,8 mg, 0,0362 mmol) foi preparada em etanol (5,36 mL) e agitada à temperatura ambiente até a completa dissolução ter sido obtida (5 minutos). Uma solução de dihidrato de ácido 1,2-etanodissulfônico (8,2 mg, 0,0362 mmol) em etanol (0,2 mL) foi lentamente adicionada à primeira solução durante aproximadamente um minuto. A suspensão resultante foi agitada por cinco minutos e então isolada por filtração sob nitrogênio. O precipitado resultante foi seco para fornecer o composto do título como um sólido branco (28,5 mg, 85% de rendimento).

Exemplo 3

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de Éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,215 dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilca rbâmi co

Éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-520 metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilcarbâmico (5 g, 6,75 mmol, >99% puro) foi dissolvido em isopropanol (100 mL), seguido pela adição de dihidrato de ácido etanodissulfônico (1,525 mg, 6.75 mmol) dissolvido em água (20 mL). A mistura semifluida resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora e então a cerca de 30°C durante a noite. O composto título (6,0 g) foi isolado como um pó branco. O produto foi aquecido em 20% de água em isopropanol (100 mL) a 30°C por 48 horas. Após resfriamento à temperatura ambiente, o precipitado resultante foi isolado por filtração em ar seco por 2 horas para produzir

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61/91 o composto do título (5,4 g).

Preparação 13

Metil 4-acriloilamino-5-cloro-2-metoxibenzoato

Adicionou-se 4-amino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metila (44,2 g, 200 mmol), diclorometano (500 mL) e diisopropiletilamina (104,5 mL, 600 mmol) a um frasco de fundo redondo e três gargalos, de 1 litro, equipado com agitador, controle de temperatura e funil de adição. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então a mistura foi resfriada a 0°C. Adicionou-se então cloreto de acriloil (16,25 mL, 200 mmol) gota a gota enquanto se mantinha a temperatura de reação interna abaixo de 10°C. O tempo total para adição era de cerca de 30 minutos. A mistura de reação foi então lentamente aquecida de 0°C até a temperatura ambiente durante um período de cerca de 2 horas. Uma solução aquosa de bicarbonato de sódio saturada (200 mL) e diclorometano (200 mL) foram então adicionados e esta mistura foi agitada por 15 minutos e depois as camadas foram separadas. A camada de diclorometano foi lavada com ácido hidroclórico 1 M (200 mL) e então concentrada sob pressão reduzida a cerca de um terço de seu volume original resultando em uma mistura semifluida espessa. A mistura semifluida foi filtrada e a crosta do filtro foi lavada com diclorometano (100 mL) e seca para fornecer o composto do título como um sólido branco gelo (36 g, 67% de rendimento, >98% de pureza por HPLC).

Preparação 14

4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi) piperidin-1-il] propionilamino}-5-cloro-2-metoxibenzoato de metila de 24/05/2018, pág. 68/107

62/91

Adicionou-se o éster de piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico (36,3 g, 122 mmol), diclorometano (500 mL) e isopropanol (100 mL) a um frasco de fundo redondo e três gargalos, de 1 litro, equipado com agitador, controle de temperatura e condensador de refluxo. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então o produto da Preparação 10 (30 g, 111,5 mmol) foi adicionado. A agitação continuou à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e a mistura foi assim aquecida sobre refluxo (50°C a 55°C) por 18 horas. A mistura de reação foi então resfriada à temperatura ambiente e etanol (200 mL) foi adicionado. Esta mistura foi concentrada sob pressão reduzida até um volume de cerca de 150 mL, resultando em uma mistura semifluida espessa. A mistura semifluida foi filtrada e a crosta do filtro foi lavada com etanol (50 mL) e seca para fornecer o composto do título como um sólido branco (58 g, 92% de rendimento, >99,5% de pureza por HPLC).

Preparação 15

Éster 1-[2-(2-cloro-4-hidroximetil-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2ilcarbâmico

Adicionou-se a um frasco de fundo redondo de 2 litros o produto da Preparação 14 (40 g, 70,8 mmol) e THF (400 mL). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então o frasco foi purificado com nitrogênio por 5 minutos. A mistura foi então resfriada a 0°C (temperatura interna) e uma solução de hidreto de lítio e alumínio 1 M em THF (106 de 24/05/2018, pág. 69/107

63/91 mL, 106 mmol) foi adicionada gota a gota através de um funil de adição enquanto a temperatura interna de mistura de reação era mantida abaixo de 10°C. O tempo de adição total foi de cerca de 40 minutos. A mistura de reação foi então agitada por 1 hora a 0°C e então hidróxido de sódio 1 M (200 mL) foi adicionado enquanto a se mantinha a temperatura interna de mistura de reação abaixo de 15°C. As camadas foram então separadas e a camada de THF foi lavada com solução aquosa de cloreto de sódio saturada (100 mL), seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido branco (38 g, 100% de rendimento, 94% de pureza por HPLC).

Preparação 16

Éster 1-[2-(2-cloro-4-formil-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2ilcarbâmico

Adicionou-se a um frasco de fundo redondo de 1 litro o produto da Preparação 15 (28 g, 52 mmol) e diclorometano (500 mL) . A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então foi adicionado óxido de manganês ativado (IV) (45 g, 520 mmol) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio por 12 horas e depois filtrada através de uma placa de Celite. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi seco durante a noite sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido amarelo (26 g, 93% de rendimento, cerca de 93% de pureza por HPLC).

Preparação 17

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 70/107

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Ester 1- [2- (4-{ [(R)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-2-cloro-5-metoxi-fenilcarbamoil)etil]piperidin-4 -il de Ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Adicionou-se a um frasco de fundo redondo de 500 mL o produto da Preparação 16 (6 g, 11,2 mmol) e diclorometano (50 mL). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então o produto da Preparação 7 (6 g, 15,0 mmol) e metanol seco (50 mL) foram adicionados. Esta mistura foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio por 2 horas (solução amarelo claro a laranja) e então a mistura foi resfriada entre 0°C e 5°C. Adicionou-se triacetoxiborohidreto de sódio sólido (7,2 g, 34 mmol) em porções durante um período de 10 minutos e depois a mistura de reação foi lentamente aquecida de 0°C à temperatura ambiente durante um período de cerca de 2 horas. A mistura foi então resfriada a 0°C e foram adicionados solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (50 mL) e diclorometano (150 mL) . A mistura foi agitada completamente e então as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com solução aquosa de cloreto de sódio saturada (50 mL), filtrada, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o composto do título como um sólido amarelo (10,1 g, 100% de rendimento, 87% de pureza por HPLC).

Exemplo 4

Sal de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil30 2-ilcarbâmico

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 71/107

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Adicionou-se a um frasco de fundo redondo de 50 mL o produto da Preparação 17 (2,0 g, 2,5 mmol) e diclorometano (10 mL). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente até que os ingredientes se dissolvessem e então adicionou-se trihidrofluoreto de trietilamina (1,2 mL, 7,5 mmol) e a mistura resultante foi agitada a 25°C por 20 horas. Uma solução de dihidrato de ácido 1,2etanodissulfônico (0,56 g, 2,5 mmol) em metanol (10 mL) foi então adicionada e esta mistura agitada a 30 °C por 2 horas, em cujo período uma mistura semifluida espessa se formou. A mistura semifluida foi filtrada lentamente e a crosta do filtro foi lavada com metanol (10 mL), seca ao ar por 2 horas e então seca durante a noite sob vácuo para fornecer o composto do título como um pó branco fino (1,5 g, >98% de pureza por HPLC).

Exemplo 5

Purificação de Sal de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Ao sal de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilcarbâmico, preparado de acordo com o Exemplo 4 (80 g), adicionou-se uma solução de 20% de água em isopropanol por volume (800 mL). A mistura semifluida resultante foi deixada à temperatura ambiente durante a noite e então filtrada para fornecer o composto do título possuindo cristalinidade e pureza melhoradas (74 g).

Preparação 18 de 24/05/2018, pág. 72/107

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Cristais de semente de sal de ácido 1,2etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico

Etapa (a)

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-510 metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilcarbâmico, preparado de acordo com o Exemplo 4 (100 mg) foi dissolvido em 13% de água em metanol (20 mL) a -60°C. A solução clara resultante foi deixada resfriar à temperatura ambiente em um recipiente fechado. Após 48 horas, os cristais resultantes em forma de placa foram isolados por filtração.

Etapa (b)

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,220 dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilcarbâmico, preparado de acordo com o Exemplo 4 (1,0 g), foi dissolvido em 15% de água em metanol (100 mL) entre 60 e 65°C. A solução clara agitada foi deixada para resfriar a

30°C e então o produto cristalino da Etapa (a) (4,2 mg) foi adicionado. A solução foi resfriada a 20°C e agitada por 2 horas. O precipitado resultante foi isolado por filtração e seco ao ar por 1 hora para fornecer o composto do título (680 mg).

Etapa (c)

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 73/107

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O procedimento da Etapa (b) foi repetido, substituindo-se o produto da Etapa (b) (20 mg) pelo produto da Etapa (a), para fornecer o composto do título (690 mg).

Etapa (d)

Sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo -1,2dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilcarbâmico, preparado de acordo com o Exemplo 4 (10 g), foi dissolvido em 15% de água em metanol (1 L) entre 60 e 65°C. A solução clara agitada foi deixada para resfriar a 30°C e então o produto cristalino da Etapa (c) (4,2 mg) foi adicionado. A solução foi resfriada a 20°C e agitada por 18 horas. O precipitado resultante foi isolado por filtração e seco ao ar por 2 horas para fornecer o composto do título (5,5 g).

Exemplo 6

Recristalização de sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-220 oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil2-ilca rbâmi co

Utilizando Cristais de Semente

Adicionou-se a um frasco de fundo redondo de 12 L o produto do Exemplo 5 (60 g, 64,5 mmol), água (0,9 L) e metanol (5,1 L). A mistura resultante foi aquecida de 25°C até 61°C a 65°C, com agitação até que os ingredientes se dissolvessem e agitada por 20 minutos adicionais entre 60°C e 65°C. A mistura foi deixada para resfriar a 30°C e então o produto da Preparação 18 (2 g, 2,15 mmol) foi adicionado.

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 74/107

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Esta mistura foi lentamente resfriada a 20°C e a mistura semifluida resultante foi agitada por 2 horas adicionais a 30°C. O produto foi filtrado com metanol (500 mL) e seco ao ar por 2 horas e então in vacuo entre 25°C e 30 °C por 18 horas para fornecer o composto do título (43 g, 72% de rendimento, 99,2% de pureza).

Exemplo 7

Análise Térmica

Calorimetria diferencial de varredura (DSC) foi executada utilizando-se um módulo TA Instruments Modelo Q10 com um controlador Analítico Térmico. Os dados foram coletados e analisados utilizando-se o software Thermal

Solutions da TA Instruments. Uma amostra de cerca de 1 mg foi precisamente pesada em um recipiente de alumínio com tampa. A amostra foi avaliada utilizando-se uma rampa de aquecimento linear de 5°C/minuto, da temperatura ambiente até aproximadamente 300°C. A célula de DSC foi purificada com nitrogênio seco durante o uso. Um gráfico de DSC característico para uma amostra de um sal de ácido 1,2etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino do Exemplo 6 é mostrado na Figura 1 e um gráfico de DSC característico para uma amostra do Exemplo 2 é mostrado na Figura 2.

Foi realizada uma análise termogravimétrica (TGA) utilizando-se um módulo TA Instruments Modelo Q-50 equipado com capacidade de alta resolução. Os dados foram coletados e analisados utilizando-se o software Thermal Solutions da

TA Instruments. Uma amostra pesando cerca de 10 mg foi de 24/05/2018, pág. 75/107

69/91 colocada sobre um recipiente de platina e varrida com uma taxa de aquecimento de alta resolução da temperatura ambiente até 300°C. As câmaras de equilíbrio e fornalha foram purificadas com fluxos de nitrogênio durante o uso.

Um gráfico de DSC característico para uma amostra de um sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino do Exemplo 6 é mostrado na Figura 1. Os gráficos de DSC demonstram que um sal de ácido 1,2-etanodissulfônico da presente invenção possui excelente estabilidade térmica com pontos de fusão de cerca de 239°C e cerca de 219°C, respectivamente, e nenhuma decomposição térmica abaixo de 200°C.

Exemplo 8

Difração de Raios-X em Pó

Foram obtidos padrões de difração de raios-X de pó com um refratômetro de raios-X Thermo ARL Modelo X'TRA (Thermo

ARL As, Suíça), utilizando-se radiação Cu Ka a 1,542 A (45 kV, 40 mA) com um detetor de estado sólido de Si(Li) . A análise foi executada tipicamente a uma taxa de varredura de 2°/minuto com um tamanho de passo de 0,03° por ponto sobre uma faixa de 2 a 30° em ângulo 2 teta. Amostras, conforme recebida ou moídas em um pó fino, foram gentilmente compactadas em uma inserção de pequeno volume personalizada, projetada para se ajustar ao recipiente de carregamento superior do instrumento para análise. O instrumento foi calibrado semanalmente até um padrão de metal silício, em ângulo 2 teta ± 0,02°. Um gráfico de

PXRD característico para uma amostra de um sal de ácido

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 76/107

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1,2-etanodissulfônico de éster 3-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin -5-il) etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino do Exemplo 6 é mostrado na Figura 3 e o padrão para uma amostra do Exemplo 2 é mostrado na Figura 4.

Exemplo 9

Análise Infravermelha

O espectro de absorção infravermelho (IR) foi determinado sobre uma faixa de freqüência de 4.000 a 675 cm^-1 utilizando-se um espectrômetro Avatar 360 FT-IR equipado com um suporte de amostra de reflexão total atenuada (ATR) Nicolet. Um espectro de absorção de IR característico para uma amostra de um sal de ácido 1,2etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino para uma amostra do Exemplo 6 possuía bandas de absorção significativas a 704±1, 748±1, 768±1, 841±1, 900±1, 1055±1, 1104±1, 1166±1,

1218±1, 1294±1, 1408±1, 1522±1,1609±1,1655±1, e 1701±1, conforme ilustrado na Figura 5.

Exemplo 10

Avaliação de Absorção de Umidade Dinâmica

Uma avaliação de absorção de umidade dinâmica (DMS) (também conhecida como perfil de absorção-dessorção de umidade) foi executada para uma amostra moída à mão de um sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 1-[2-(2-cloro4-{ [ (R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidinPetição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 77/107

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4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino da

Preparação 18 utilizando um sistema SGA-100 de microequilíbrio atmosférico VTI (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Um tamanho de amostra de aproximadamente 10 mg foi utilizado e a umidade foi definida ao valor ambiente no início da análise. Uma análise DMS típica consistiu de três varreduras: ambiente a 2% de umidade relativa (RH), 2% de

RH a 90% de RH, 90% de RH a 5% de RH a uma taxa de varredura de 5% de RH/passo. A massa foi medida a cada dois minutos e a RH foi alterada para o próximo valor (+/- 5% de RH) quando a massa da amostra estava estável até 0,01% para 5 pontos consecutivos. Um gráfico de DMS característico é mostrado na Figura 6.

O gráfico de DMS demonstra que um sal de ácido 1,215 etanodissulfônico da presente invenção possui um perfil de absorção/dessorção reversível com higroscopicidade moderada (< 9%) . O sal possui menos que 2,5% em ganho de peso na faixa de umidade de 40% de RH a 75% de RH. O perfil de absorção/dessorção de umidade reversível demonstra que um sal cristalino da presente invenção possui uma higroscopicidade aceitável e não é deliqüescente.

Exemplo 11

Análise Elementar e Razão de Contra-íon

Os seguintes percentuais elementares de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre de uma amostra de um sal de ácido 1,2-etanodissulfônico de éster 3-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2- (8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil] piperidin4-il de ácido bifenil-2-ilcarbâmico cristalino do Exemplo 6 foram determinados por análise de combustão utilizando-se

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 78/107

72/91 um Analisador Elementar Flash EA 1112 (CE Elantech, Lakewood, NJ): carbono 52,95%, hidrogênio 5,43%, nitrogênio 6,83% e enxofre 6,87%. O percentual de peso de ácido 1,2etanodissulfônico na amostra cristalina, calculado a partir do percentual de peso de enxofre medido, é de 20,4%, o que é igual ao percentual de peso teórico de 20,4%, fornecendo uma razão de contra-íon de 1:1.

Preparação A

Cultura de Célula e Preparação de Membrana a partir de Células Expressando Receptores Supra-renais βι, β2 ou β3

Humanos

Linhas celulares ovarianas de hamsters chineses (CHO) expressando de forma estável receptores β1, β2 e β3Adrenérgicos humanos clonados, respectivamente, foram desenvolvidos até sua quase confluência em meio Hams F-12 com 10% de FBS na presença de 500 pg/mL de Geneticina. A monocamada celular foi erguida com EDTA em PBS 2 mM. As células foram peletizadas por centrifugação a 1.000 rpm, e as pelotas de célula foram ou armazenadas congeladas a 80°C ou as membranas foram preparadas imediatamente para uso. Para preparação de membranas que expressam receptor β1 e β2, pelotas de célula foram postas novamente em suspensão em tampão de lise (HEPES/HCl 10 mM. EDTA 10 mM, pH 7,4 a 4°C) e homogeneizada utilizando-se um homogeneizador de vidro Dounce (30 golpes) de encaixe firme em gelo. Para as membranas expressando receptor β3 mais sensíveis à protease, as pelotas celulares foram homogeneizadas em tampão de lise (Tris/HCl 10 mM, pH 7,4) suplementadas com um tablete de “Tabletes de Coquetel Inibidor de Protease Completos com EDTA 2 mM” por 50 mL de tampão (Catálogo de 24/05/2018, pág. 79/107

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Roche, n° 1697498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). O homogenato foi centrifugado a 20.000 x g, a pelota resultante foi lavada uma vez com tampão de lise por ressuspensão e centrifugação conforme acima. A pelota final foi então ressuspensa em tampão de ensaio de ligação gelado (Tris/HCl 75 mM, pH 7,4, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM) . A concentração de proteína da suspensão de membrana foi determinada pelos métodos descritos em Lowry e outros, 1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265; e

Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Todas as membranas foram armazenadas congeladas em alíquotas a 80°C ou utilizadas imediatamente.

Preparação B

Cultura Celular e Preparação de Membrana de Células 15 Expressando Receptores Muscarínicos M1, M2, M3 e M4

Linhas de célula CHO que expressam de forma estável os subtipos do receptor muscarínico hM1, hM2, hM3 e hM4 humano clonados, respectivamente, foram desenvolvidas até quase confluência em meio de HAM's F-12 suplementado com FBS 10% e 250 pg/mL de Geneticina. As células foram desenvolvidas em um incubador de CO2 a 5% a 37°C e suspensas com EDTA em dPBS 2 mM. As células foram coletadas por 5 minutos de centrifugação a 650 x g, e as pelotas de célula foram armazenadas congeladas a -80°C ou as membranas foram preparadas imediatamente para uso. Para a preparação da membrana, as pelotas de célula foram ressuspensas em tampão de lise e homogeneizadas com um desruptor de tecido Polytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 rupturas). As membranas brutas foram centrifugadas a 40.000 x g por 15 minutos a 4°C. A pelota de membrana foi então ressuspensa

Petição 870180043838, de 24/05/2018, pág. 80/107

74/91 com tampão de ressuspensão e homogeneizada novamente com o desruptor de tecido Polytron. A concentração de proteína da suspensão de membrana foi determinada pelos métodos descritos em Lowry e outros, 1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265. Todas as membranas foram armazenadas congeladas em alíquotas a -80°C ou utilizadas imediatamente. Alíquotas de receptor hM5 preparadas foram adquiridas diretamente de Perkin Elmer e armazenadas a 80°C até seu uso.

Procedimento de Teste de Ensaio A

Ensaio de Ligação Radioligante para Receptores βι, β2 e β3-Adrenérgicos

Ensaios de ligação foram executados em placas de microtitulação de 96 cavidades em um volume de ensaio total de 100 pL com 10 a 15 pg de proteína de membrana contendo os receptores β1, β2 e e3-adrenérgicos humanos em tampão de ensaio (Tris/HCl 75 mM, pH7,4, a 25°C, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1mM, BSA a 0,2%) . Estudos de ligação de saturação para determinação de valores de Kd do radioligante foram executados utilizando-se [³H]-dihidroalprenolol (NET-720, 100 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) para os receptores β1 e β2 e [¹²⁵I]-(-)-iodocianopindolol (NEX-189, 220 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc.,

Boston, MA) em 10 ou 11 diferentes concentrações variando de 0,01 nM a 20 nM. Ensaios de deslocamento para determinação de valores Ki de compostos de teste foram executados com [³H]-dihidroalprenolol a 1 nM e [¹²⁵I]-(-)iodocianopindolol a 0,5 nM em 10 ou 11 diferentes concentrações de composto de teste variando de 10 pM a 10 pM. A ligação não específica foi determinada na presença de de 24/05/2018, pág. 81/107

75/91 μΜ de propanolol. Os ensaios foram encubados por 1 hora a 37°C e então reações de ligação foram terminadas por filtração rápida sobre GF/B para os receptores β1 e β2 ou placas de filtro de fibra de vidro GF/C para os receptores β3 (Packard BioScience Co., Meriden, CT), pré-umedecidos em polietilenoimina 0,3%. As placas de filtro foram lavadas três vezes com tampão de filtração (Tris/HCl 75 mM, pH 7,4 a 4°C, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM) para remover radioatividade não ligada. As placas foram então secas e 50 μύ de fluido de cintilação líquida Microscint-20 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) foi adicionado e as placas foram contadas em um contador de cintilação líquida Topcount Packard (Packard BioScience Co., Meriden, CT) . Os dados de ligação foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo de 3 parâmetros para competição de sítio único. O mínimo da curva foi fixado ao valor para ligação não específica, conforme determinado na presença de propanolol 10 μM. Os valores de Ki para os compostos de teste foram calculados a partir de valores de IC50 observados e o valor de Ki do radioligante, usando-se a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff W. H. Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108).

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que o composto de teste possui uma afinidade de ligação maior para o receptor testado. Quando testado neste ensaio, descobriu-se que o composto da fórmula I possui um valor de Ki de menos que 10 nM para o receptor p2-adrenérgico.

Procedimento B de Teste de Análise de 24/05/2018, pág. 82/107

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Ensaio de Ligação de Radioligante para Receptores

Muscarínicos

Os ensaios de ligação de radioligante para receptores muscarínicos humanos clonados foram executados em placas de microtitulação de 96 cavidades em um volume de ensaio total de 100 pL. Membranas de célula CHO que expressam de forma estável o subtipo do receptor muscarínico hMi, hM2, hM3, hM4 ou hM5 foram diluídas em tampão de ensaio às seguintes concentrações de proteína alvo especificadas (pg/cavidade):

10 pg para hMi, de 10 a 15 pg para hM2, de 10 a 20 pg para hM3, de 10 a 2 0 pg para hM4, e de 10 a 12 pg para hM5 para se obter sinais similares (cpm). As membranas foram rapidamente homogeneizadas usando-se um disruptor de tecido Polytron (10 segundos) antes da adição da placa de ensaio.

Os estudos de ligação de saturação para determinar os valores de Kd do radioligante foram executados usando-se cloreto de L-[N-metil-³H]scopolamina metila ([³H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech,

Buckinghamshire, England) a concentrações variando de 0,001 nM a 20 nM. Os ensaios de deslocamento para determinação dos valores de Ki dos compostos de teste foram executados com [³H]-NMS a 1 nM e onze diferentes concentrações de composto de teste. Os compostos de teste foram inicialmente dissolvidos a uma concentração de 400 pM em tampão de diluição e então diluído serialmente 5 vezes com tampão de diluição a concentrações finais variando de 10 pM a 100 pM. A ordem de adição e os volumes para as placas de ensaio foram como segue: 25 pL de radioligante, 25 pL de composto de teste diluído e 50 pL de membranas. As placas de ensaio foram incubadas por 60 minutos à 37°C. As reações de

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77/91 ligação foram finalizadas por rápida filtração sobre placas de filtro de fibra de vidro GF/B (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) pré-tratadas com BSA 1%. As placas de filtro foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (HEPES 10 mM) para remover a radioatividade não ligada. As placas foram então secas ao ar e 50 pL de fluido de cintilação líquido Microscint-20 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) foram adicionados a cada cavidade. As placas foram então contadas em um contador de cintilação líquida PerkinElmer

Topcount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) . Os dados de ligação foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote de software GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo de competição de sítio único. Os valores de Ki para os compostos de teste foram calculados a partir de valores de IC50 observados e o valor de Kd do radioligante, usando-se a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff W. H. (1973) Biochemical Pharmacology, 22(23) :3099-108) . Os valores de Ki foram convertidos a valores de pKi para determinar a média geométrica e intervalos de 95% de segurança. Esta estatística concisa foi então convertida de volta a valores de Ki para comunicação de dados.

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que o composto de teste possui uma afinidade de ligação maior para o receptor testado. Quando testado neste ensaio, descobriu-se que o composto de fórmula I possui um valor de Ki de menos de cerca de 10 nM para os receptores muscarínicos M2 e M3 humanos.

Procedimento C de Teste de Análise

Ensaio Flashplate de cAMP de célula integral em linhas

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78/91 de célula CHO expressando de Forma heteróloga os receptores β2, β2 e β3-adrenérgicos humanos

Os ensaios de cAMP foram executados em um formado de radioimunoensaio usando-se o “Flashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System” com [¹²⁵I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as instruções dos fabricantes. Para a determinação da potência do agonista do receptor β (EC50), linhas de célula CHO-K1 expressando estavelmente os receptores β2, β2 e β3adrenérgicos humanos clonados foram desenvolvidas até quase confluência em meio F-12 de HAM suplementado com FBS 10% e Geneticin (250 pg/mL). As células foram rinsadas com PBS e separadas em dPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, sem CaCl2 e MgCl2) contendo EDTA 2 mM ou solução de Tripsina-EDTA (tripsina 0,05%/EDTA 0,53 mM) . Após contagem das células em um contador de célula Coulter, as células foram peletizadas por centrifugação a 1.000 rpm e ressuspensas em tampão de estimulação contendo IBMX (PerkinElmer Kit) pré-aquecido à temperatura ambiente a uma concentração de 1,6 x 10⁶ a 2,8 x 10⁶ células/mL. Cerca de 60.000 a 80.000 células por cavidade foram usados deste ensaio. Os compostos de teste (10 mM em DMSO) foram diluídos em PBS contendo BSA 0,1% em Beckman Biomek-2000 e testados em 11 diferentes concentrações variando de 100 pM a 1 pM. As reações foram incubadas por 10 minutos a 37°C e interrompidas adicionando-se 100 pL de tampão de detecção frio contendo [¹²⁵I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). A quantidade de cAMP produzida (pmol/cavidade) foi calculada com base nas contagens observadas para as amostras e padrões de cAMP, conforme de 24/05/2018, pág. 85/107

79/91 descrito no manual do usuário do fabricante. Os dados foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote de software GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) com a equação sigmoidal. A equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y, and Prusoff WH., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108) foi usada para calcular os valores de EC50.

Neste ensaio, um valor de EC50 menor indica que o composto de teste possui uma atividade funcional maior no receptor testado. Quando testado neste ensaio, descobriu-se que o composto de fórmula I possui um valor de EC50 de menos de 10 nM para o receptor 32-adrenérgico.

Procedimento D de Teste de Análise

Ensaios funcionais de Antagonismo para os Subtipos do Receptor Muscarínico

A. Bloqueio de Ligação [³⁵S]GTPyS Mediada por Agonista

A potencia funcional de um composto de teste foi determinada medindo-se a capacidade do composto de bloquear a ligação de [³⁵S]GTPyS estimulada por oxotremorina em células CHO-K1 expressando o receptor hM2.

No momento do uso, membranas congeladas foram descongeladas e então diluídas em tampão de ensaio como uma concentração de tecido final de 5-10 pg de proteína por cavidade. As membranas foram rapidamente homogeneizadas usando-se um disruptor de tecido Polytron PT-2100 e então adicionadas às placas de ensaio.

O valor de EC90 (concentração efetiva para resposta máxima de 90%) para estímulo de ligação de [³⁵S]GTPyS pela oxotremorina agonista foi determinado em cada experimento.

Para determinar a capacidade de um composto de teste de 24/05/2018, pág. 86/107

80/91 em inibir a ligação de [³⁵S]GTPyS estimulada por oxotremorina, o seguinte foi adicionado a cada cavidade das placas de 96 cavidades: 25 pL de tampão de ensaio com [³⁵S]GTPyS (0,4 nM), 25 pL de oxotremorina (EC90) e GDP (3 pM) , 25 pL de composto de teste diluído e 25 pL de membranas de célula CHO expressando o receptor hM2. As placas de ensaio foram então incubadas a 37°C por 60 minutos. As placas de ensaio foram filtradas sobre filtros GF/B pré-tratados com 1% de BSA usando-se um coletor de 96 cavidades PerkinElmer. As placas foram rinsadas com tampão de lavagem resfriado com gelo por 3 vezes durante 3 segundos e então foram secas a ar ou a vácuo. Líquido de cintilação Microscint-20 (50 pL) foi adicionado a cada cavidade, e cada placa foi selada e a radioatividade foi contada em um Top Counter (PerkinElmer). Os dados foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote de software GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo de regressão não linear, equação de competição de sítio único. A equação de Cheng-Prusoff foi usada para calcular o Ki, usando-se os valores de IC50 da curva de resposta de concentração para o composto de teste e a concentração de oxotremorina no ensaio como o Kd e [L] , concentração de ligante, respectivamente.

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que o composto de teste possui uma atividade funcional maior no receptor testado. Quando testados neste ensaio, descobriuse que o composto de fórmula I possui um valor de Ki menor que cerca de 10 nM para bloqueio de ligação de [³⁵S]GTPyS estimulada por oxotremorina em células CHO-K1 expressando o de 24/05/2018, pág. 87/107

81/91 receptor hM2.

B. Bloqueio de Liberação de Cálcio Mediada por Agonista através de Ensaios de FLIPR

Os subtipos do receptor muscarínico (receptores M1, M3 e M5) , que se ligam às proteínas Gq, ativam a rota da fosfolipase C (PLC) na ligação do agonista ao receptor. Como um resultado, a PLC ativada hidrolisa o difosfato de fosfatilinositol (PIP2) a diacilglicerol (DAG) e fosfatidil-1,4,5-trifosfato (IP3), que sucessivamente gera liberação de cálcio a partir de provisões intracelulares, isto é, retículo endoplásmico e sarcoplásmico. O ensaio de FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) se beneficia deste aumento em cálcio intracelular pelo uso de um corante sensível a cálcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) que fluoresce quando liga-se a cálcio livre. Este evento de fluorescência é medido em tempo real por FLIPR, que detecta a mudança em fluorescência de uma monocamada de células clonadas com M1 e M3 humano, e receptores M5 de chimpanzés. A potência do antagonista pode ser determinada pela capacidade dos antagonistas em inibir os aumentos mediados pelo agonista no cálcio intracelular.

Para os ensaios de estimulação de cálcio de FLIPR, células CHO que expressam de forma estável os receptores hM1, hM3 e cM5 foram semeadas em placas de FLIPR de 96 cavidades na noite antes do ensaio ter sido feito. As células semeadas são lavadas duas vezes por Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) com tampão FLIPR (10 mm HEPES, pH = 7,4, cloreto de cálcio 2 mM, probenecid 2,5 mN em solução salina tamponada de Hank (HBSS) sem cálcio e magnésio) para remover o meio de crescimento e deixar 50 pL/cavidade de de 24/05/2018, pág. 88/107

82/91 tampão FLIPR. As células foram então incubadas com 50 pL/cavidade de 4 pM FLUO-4AM (uma solução 2X foi feita) por 40 minutos a 37°C, 5% de dióxido de carbono. Seguindo-se o período de incubação do corante, as células foram lavadas duas vezes com tampão FLIPR, deixando um volume final de 50 pL/cavidade.

Para se determinar a potência do antagonista, o estímulo dependente de dose de liberação de Ca²+ intracelular para oxotremorina foi primeiro determinado de forma que a potência do antagonista possa ser posteriormente medida contra o estímulo de oxotremorina a uma concentração de EC90. As células foram primeiro incubadas com tampão de diluição de composto por 20 minutos, seguido pela adição de agonista, que foi executada por FLIPR. Um valor de EC90 para oxotremorina foi gerado de acordo com o método detalhado na medição de FLIPR e a seção de redução de dados abaixo, em conjunto com a fórmula ECf = ((F/100-F)^A1/H) * EC50. Uma concentração de oxotremoriana de 3 x ECf foi preparada em placas de estimulação de forma que uma concentração de EC90 de oxotremorina foi adicionada a cada cavidade nas placas de ensaio de inibição de antagonista.

Os parâmetros usados para FLIPR foram: duração de exposição de 0,4 segundo, força do laser de 0,5 watts, comprimento de onde da excitação de 488 nm, e comprimento de onda de emissão de 550 nm. A linha base foi determinada medindo-se a mudança na florescência por 10 segundos antes a adição de agonista. Depois da estimulação do agonista, o FLIPR mediu continuamente a mudança de fluorescência a cada

0,5 a 1 segundo por 1,5 minuto para capturar a mudança de

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83/91 fluorescência máxima.

A mudança de fluorescência foi expressa como fluorescência máxima menos a fluorescência da linha de base para cada cavidade. Os dados brutos foram analisados contra o logaritmo da concentração de droga por regressão não linear com GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o modelo construído para resposta de dose sigmoidal. Os valores de Ki do antagonista foram determinados por Prism usando-se o valor EC50 de oxotremorina como o Kd e EC90 de oxotremorina para a concentração de ligante de acordo com a equação de ChengPrusoff (Cheng & Prusoff, 1973).

Neste ensaio, um valor de Ki menor indica que o composto de teste possui uma atividade funcional maior no receptor testado. Quando testados neste ensaio, descobriuse que o composto de fórmula I possui um valor de Ki menor que cerca de 10 nM para bloqueio da liberação de cálcio mediada por agonista em células CHO expressando de forma estável os receptores hM1, hM1 e cM5.

Procedimento E de Teste de Análise

Ensaio Flashplate de cAMP de célula integral com uma linha de célula epitelial de pulmão expressando de forma endógena o receptor P2-adrenérgico humano

Para a determinação das potências do agonista e eficácias (atividades intrínsecas) em uma linha de célula que expressa os níveis endógenos do receptor β2adrenérgico, uma linha de célula epitelial de pulmão humano (BEAS-2B) foi usada (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B, e outros, Brítísh Journal of Pharmacology, 1998, 123, 4, 701-11). As células de 24/05/2018, pág. 90/107

84/91 foram desenvolvidas a 75-90% de confluência em meio livre de soro integral (Meio LHC-9 contendo Epinefrina e Ácido Retinóico, cat # 181-500, Biosource International,

Camarillo, CA) . No dia anterior ao ensaio, o meio foi trocado por LHC-8 (nenhuma epinefrina ou ácido retinóico, cat # 141-500, Biosource International, Camarillo, CA).

Os ensaios de cAMP foram executados em um formado de radioimunoensaio usando-se o “Flashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System” com [¹²⁵I]-cAMP (NEN SMP004,

PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as instruções dos fabricantes.

No dia do ensaio, as células foram rinsadas com PBS, suspensas através de fragmentação com EDTA 5 mM em PBS, e contadas. As células foram peletizadas por centrifugação a

1000 rpm e ressuspensas em tampão de estimulação préaquecido a 37°C a uma concentração final de 600.000 células/mL. As células foram usadas a uma concentração final de 100.000 células/cavidade neste ensaio. Os compostos de teste foram serialmente diluídos em tampão de ensaio ((75 mM Tris/HCl pH 7,4 a 25°C, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,2%) em Beckman Biomek-2000. Os compostos foram testados no ensaio com 11 diferentes concentrações, variando de 10 pM a 10 pM. As reações foram incubadas por 10 minutos a 37°C e interrompidas por adição de 100 pL de tampão de detecção resfriado com gelo. As placas foram seladas, incubadas durante a noite a 4°C e contadas na manhã seguinte em um contador de cintilação Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT). A quantidade de cAMP produzida por mL de reação foi calculada com base nas contagens observadas para as amostras e padrões de cAMP,

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85/91 conforme descrito no manual do usuário do fabricante. Os dados foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote do software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando-se o 5 modelo de 4 parâmetros para resposta de dose sigmoidal.

Neste ensaio, um valor de EC50 menor indica que o composto de teste possui uma atividade funcional maior no receptor testado. Quando testado neste ensaio, descobriu-se que o composto de fórmula I possui um valor de EC50 de menos de cerca de 10 nM para o receptor 32-adrenérgico.

Procedimento F de Teste de Análise

Duração da Broncoproteção em Modelos de Porco da Índia de Broncoconstricção induzida por acetilcolina ou histamina

Estes ensaios ín vivo foram usados para avaliar os 15 efeitos broncoprotetores dos compostos de teste que exibem tanto atividade do antagonista do receptor muscarínico quanto atividade do agonista do receptor 32-adrenérgico. Para isolar a atividade do antagonista muscarínico no modelos de broncoconstricção induzido por acetilcolina, aos animais foram administradas propanolol, um composto que bloqueia a atividade do receptor β, antes da administração da acetilcolina. A duração da broncoproteção no modelo de broncoconstricção induzida por histamina reflete a atividade do agonista do receptor β2-adrenérgico.

Grupos de seis porquinhos da índia machos (DuncanHartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) pesando entre 250 e 350 gramas foram individualmente identificados por cartões de gaiola. Por todo o estudo os animais foram deixados acessar comida e água ad líbítum.

Os compostos de teste foram administrados através de

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86/91 inalação durante 10 minutos em uma câmara de dosagem de exposição de corpo inteiro (R & S Molds, San Carlos, CA) . As câmaras de dosagem foram dispostas de forma que um aerossol fosse simultaneamente entregue a 6 câmaras individuais a partir de um distribuidor central. Os porquinhos da índia foram expostos a um aerossol de um composto de teste ou veículo (WFI). Estes aerossóis foram gerados a partir de soluções aquosas usando=se um Conjunto Nebulizador LC Star (Model 22F51, PARI Respiratory

Equipment, Inc. Midlothian, VA) acionado por uma mistura de gases (CO2 = 5%, O2 = 21% e N2 = 74%) a uma pressão de 151,68 kPa. O fluxo de gás através do nebulizador nesta pressão de operação era de aproximadamente 3 L/minuto. Os aerossóis gerados foram direcionados para dentro das câmaras por pressão positiva. Nenhum ar de diluição foi usado durante a entrega das soluções aerossolizadas. Durante os 10 minutos de nebulização, aproximadamente 1,8 mL de solução foram nebulizados. Este valor foi medido gravimetricamente comparando-se os pesos antes e depois da nebulização do nebulizador carregado.

Os efeitos broncoprotetores dos compostos de teste administrados através de inalação foram avaliados usando-se pletismografia de corpo inteiro a 1,5, 24, 48 e 72 horas após a dose.

Quarenta e cinco minutos antes do início da avaliação pulmonar, cada porquinho-da-índia foi anestesiado com uma injeção intramuscular de cetamina (43,75 mg/kg), xilazina (3,50 mg/kg) e acepromazina (1,05 mg/kg). Depois o local da cirurgia foi raspado e limpo com álcool 70%, uma incisão de linha central de 2 a 3 cm do aspecto ventral do pescoço foi

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87/91 feita. Então, a veia jugular foi isolada e canulada com um cateter de polietileno cheio de solução salina (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD) para permitir as infusões intravenosas de acetilcolina (Ach) ou histamina em solução salina. A traquéia foi então dissecada livremente e canulada com um tubo de teflon 14G (#NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL) . Se exigido, a anestesia foi mantida por injeções adicionais intramusculares da mistura anestésica supracitada. A profundidade da anestesia foi monitorada e ajustada se o animal respondesse ao aperto de suas patas ou se a taxa de respiração fosse maior que 100 respirações/minuto.

Uma vez que as canulações estavam completas, o animal foi colocado dentro de um pletismógrafo (#PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) e uma cânula de pressão esofageal (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) foi inserida para medir a pressão pulmonar (pressão). O tubo traqueal de teflon foi fixado à abertura do pletismógrafo para permitir que o porquinho-da-índia respirasse ar do ambiente de fora da câmara. A câmara foi então selada. Uma lâmpada de aquecimento foi usada para manter a temperatura corporal e os pulmões do porquinho-da-índia foram inflados 3 vezes com 4 mL de ar usando-se uma seringa de calibração de 10 mL (Série #5520 Hans Rudolph, Kansas City, MO) para assegurar que as vias aéreas inferiores não tinham sofrido colapso e que o animal não sofria de hiperventilação.

Uma vez que foi determinado que os valores de referência estavam dentro da faixa de 0,3 a 0,9 mL/cm H2O para compatibilidade e dentro da faixa de 0,1 a 0,199 cm

H2O/mL por segundo para resistência, a avaliação pulmonar de 24/05/2018, pág. 94/107

88/91 foi iniciada. Um programa de computador de medição pulmonar Buxco permitiu a coleta e derivação dos valores pulmonares.

Iniciando-se este programa, iniciou-se o protocolo experimental e a coleta de dados. As mudanças em volume durante o tempo que ocorreram dentro do pletismógrafo com cada respiração foram medidas através de um transdutor de pressão Buxco. Integrando-se este sinal over time, uma medição de fluxo foi calculada para cada respiração. Este sinal, junto com as mudanças de pressão pulmonar, que foram coletadas usando-se um transdutor de pressão Sensym (#TRD4100), foi conectado através de um preamplificador Buxco (MAX 2270) a uma interface de coleta de dados (#SFT3400 e SFT3813). Todos os outros parâmetros pulmonares foram derivados a partir destas duas entradas.

Os valores de referência foram coletados por 5 minutos, após este tempo os porquinhos-da-índia foram atacados com Ach ou histamina. Quando se avalia os efeitos do antagonista muscarínico, propanolol (5 mg/kg, iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi administrado 15 minutos antes de serem atacados com Ach. A ACh (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0,1 mg/mL) foi infundida de forma intravenosa por 1 minuto a partir de uma seringa (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) nas seguintes doses e tempos de prescrição a partir do início do experimento: 1,9 pg/minuto em 5 minutos, 3,8 pg/minuto em 10 minutos, 7,5 pg/minuto em 15 minutos, 15,0 pg/minuto em 20 minutos, 30 pg/minuto em 25 minutos e 60 pg/minuto em 30 minutos. Alternativamente, a broncoproteção dos compostos de teste foi avaliada no modelo de ataque com acetilcolina sem pré-tratamento com um composto beta-bloqueador.

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Quando se avalia os efeitos do receptor 32-adrenérgico dos compostos de teste, a histamina (25 pg/mL) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) foi infundida de forma intravenosa por 1 minuto de uma seringa nas seguintes doses e tempos prescritos a partir do início do experimento: 0,5 pg/minuto em 5 minutos, 0,9 pg/minuto em 10 minutos, 1,9 pg/minuto em 15 minutos, 3,8 pg/minuto em 20 minutos, 7,5 pg/minuto em 25 minutos e 15 pg/minuto em 30 minutos. Se a resistência ou compatibilidade não retornaram aos valores de referência em 3 minutos após cada dose de Ach ou histamina, os pulmões dos porquinhos da índia foram inflados 3 vezes com 4 mL de ar a partir de uma seringa de calibração de 10mL. Os parâmetros pulmonares registrados incluíam a freqüência de respiração (respirações/minuto), compatibilidade (mL/cm

H2O) e resistência pulmonar (cm H2O/mL por segundo). Uma vez que as medições da função pulmonar foram completadas em 35 minutos deste protocolo, o porquinho-da-índia foi removido do pletismógrafo e sofreram eutanásia por asfixia com dióxido de carbono.

Os dados foram avaliados de uma das duas maneiras:

(a) a resistência pulmonar (Rl, cm H2O/mL por segundo) foi calculada a partir da relação entre “mudança de pressão” e “mudança no fluxo”. A resposta Rl à Ach (60 pg/minuto, IH) foi computada para o veículo e os grupos do 25 composto de teste. A resposta à Ach média em animais tratados com veículo, em cada momento de pré-tratamento, foi calculada e usada para computar o í resposta à Ach, no momento do correspondente, em cada dose do composto de teste. As curvas de resposta à dose de inibição para “Rl” foram de inibição da pré-tratamento

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90/91 ajustadas a uma equação logística de 4 parâmetros usando-se GraphPad Prism, versão 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) para estimar a ID50 broncoprotetora (dose exigida para inibir a resposta broncoconstrictora da Ach (60 pg/minuto) em 50%). A equação usada era como segue:

Y = Min + (Max - Min) / (1 +10^((log ^ID50-X) * inclinação de Hill)) onde X é o logaritmo da dose, Y é a resposta (% de inibição de aumento induzido por ACh em Rl) . Y inicia no

Min e aproxima-se assintóticamente de Max com uma forma sigmoidal.

(b) A quantidade de PD2, que é definida como a quantidade de ACh ou histamina necessária para dobrar a resistência pulmonar de referencia, foi calculada usando-se os valores de resistência pulmonar derivados do fluxo e da pressão sobre uma faixa de ataques com ACh ou histamina usando-se a seguinte equação (derivada de uma equação usada para calcular os valores de PC20 na clínica (veja, Am. Thoracic Soc, 2000):

20	(PD2 = antilog {log C1 +	[ (log C2	. log Ci) (2Ro - Ri)/(R2-Ri)]}
	onde:
	Ci = concentração	de	ACh ou	histamina	precedendo C2
	C2 = Concentração	de	Ach ou	histamina	resultando em um

aumento de pelo menos 2 vezes na resistência pulmonar (Rl)

R0 = Valor de RL de referência

Ri - valor de Rl após Ci R2 - valor de Rl após C2

Análise estatística dos dados foi executada usando-se um two-tailed Students T-test. Um valor P < 0,05 foi considerado significante.

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Quando testado neste ensaio, o composto de fórmula I produziram um efeito broncoprotetor dependente da dose contra a broncoconstricção induzida por MCh e broncoconstricção induzida por His. Adicionalmente, o composto de fórmula I tinha uma duração (PD T1/2) da atividade broncoprotetora de pelo menos cerca de 24 horas neste ensaio.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência aos aspectos específicos ou modalidades desta, deve ser compreendido por aqueles habilitados na técnica que várias mudanças podem ser feitas ou equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Adicionalmente, à extensão permitida por estatutos e regulamentações de patente aplicáveis, todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados estão desta forma incorporados por referencia em sua totalidade à extensão como se cada documento estivesse individualmente aqui incorporado por referência.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Sal cristalino, caracterizado pelo fato de ser originado do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R) -2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqui5 nolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste, em que o composto tem como característica um padrão de difração de raio X em pó possuindo picos de difração em valores 2Θ de 5,0 ± 0,3 e 15,0 ± 0,3. 5, e em que o

2/5

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,

3/5 onde R^1a, R^1b e R^1c são independentemente selecionados a partir de alquil C1-4, fenil, alquil Ci-4-(fenil)-, ou um entre R^1a, R^1b e R^1c é -O-(alquil C1-4); com o íon fluoreto; e (b) contatar o produto da etapa (b) com o ácido 1,25 etanodissulfônico ou um hidrato deste; para formar um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1,

20 caracterizado pelo fato de que o composto tem como característica um gráfico de calorimetria de escaneamento diferencial que apresenta um fluxo de calor endotérmico máximo na faixa de 215°C a 229°C.

4/5 (a) dissolver um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1,

25 caracterizado pelo fato de que o composto tem como característica um gráfico de calorimetria de escaneamento diferencial que apresenta um fluxo de calor endotérmico máximo na faixa de 230°C a 240°C.

5 solvato deste conforme definido na reivindicação 1.

5/5 sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um

5 bifenil-2-ilcarbâmico em um diluente inerte, a uma primeira temperatura variando de 60°C a 65°C;

(b) resfriar o produto da etapa (a) a uma segunda temperatura variando de 30°C a 40°C; e (c) adicionar um cristal de semente do sal do ácido

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1,

30 caracterizado pelo fato de estar na forma micronizada.

Petição 870190008351, de 25/01/2019, pág. 7/11

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

5

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração por inalação.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de estar na forma

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o veículo é lactose, amido, manitol, dextrose, ácido poliláctico, polilactídeo-co-glicolídeo ou uma combinação destes.

10 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico;

onde o cristal de semente possui um ponto de fusão

10 deste, onde a etapa (a) e (b) são conduzidas no mesmo recipiente de reação sem isolamento do produto da etapa (a).

10 micronizada.

10 composto possui espectro de absorção de infravermelho com faixas de absorção significantes em 704, 748, 768, 841, 900, 1055, 1104, 1166, 1218, 1294, 1408, 1522, 1609, 1655, e 17 01 cm^-1.

11. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:

(a) contatar um composto de Fórmula II:

Petição 870190008351, de 25/01/2019, pág. 8/11

12. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 1 com um ponto de fusão maior que 230°C, o

13. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 1 com um ponto de fusão maior que 230 °C,

30 o processo caracterizado pelo fato de compreender:

Petição 870190008351, de 25/01/2019, pág. 9/11

14. Processo para purificar o éster 1-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico, caracterizado pelo

20 fato de compreender a formação de um composto como definido na reivindicação 1.

15. Uso de um sal cristalino originado do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]

25 metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença pulmonar obstrutiva crônica ou asma.

30

16. Medicamento, caracterizado pelo fato de conter um

Petição 870190008351, de 25/01/2019, pág. 10/11

15 maior que 230°C.

15 processo caracterizado pelo fato de compreender adicionar um cristal de semente de um sal cristalino do ácido 1,2etanodissulfônico cristalino do éster 1-[2-(2-cloro-4{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqui-nolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]-piperidin20 4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste a uma solução compreendendo um sal do ácido 1,2etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin25 4-il do ácido bifenil-2-ilcarbâmico ou um solvato deste dissolvido em um diluente inerte, onde o cristal de semente possui um ponto de fusão maior que 230 °C.

15 10. Processo para preparar um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender contatar o éster 1-[2-(2-cloro-4-{ [ (R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-l,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} -5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil20 2-ilcarbâmico com o ácido 1,2-etanodissulfônico ou um hidrato deste.

15 caracterizado pelo fato de que o composto tem como característica um gráfico de calorimetria de escaneamento diferencial que apresenta um fluxo de calor endotérmico máximo na faixa de 215°C a 240°C.

17. Uso de:

(a) um sal cristalino do ácido 1,2-etanodissulfônico do éster 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxife10 nilcarbamoil)etil]piperidin-4-il do ácido bifenil-2ilcarbâmico ou um solvato deste conforme definido na reivindicação 1; e (b) um agente anti-inflamatório esteroidal;

caracterizado pelo fato de ser na produção de um 15 medicamento para o crônica ou asma. tratamento de doença pulmonar obstrutiva 18. Uso, de acordo com a reivindicação 17,

caracterizado pelo fato de que o agente anti-inflamatório esteroidal é o éster S-fluorometil do ácido 6α,9α20 difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-1 1β -hidroxi-16ametil-3-oxoandrosta-1,4-dieno-17β-carbotióico ou solvato deste.