BRPI0306644B1

BRPI0306644B1 - Método para produzir um peptídeo modificado

Info

Publication number: BRPI0306644B1
Application number: BRPI0306644-4A
Authority: BR
Inventors: Minamitake Yoshiharu; Matsumoto Masaru; Makino Tomohiro
Original assignee: Kangawa, Kenji
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2003-04-10
Publication date: 2018-02-14
Also published as: AU2003236080B8; EP1493747A1; BRPI0306644B8; CN100491395C; CA2472235A1; US7138489B2; ES2400703T3; US20050131208A1; IL162780A0; AU2003236080A1; WO2003084983A1; KR101036524B1; KR20050012717A; CA2472235C; EP1493747B1; AU2003236080B2; EP1493747A4; CN1612891A; IL162780A; BR0306644A

Abstract

"método para produzir um peptídeo modificado". a presente invenção refere-se a um método para produzir um peptídeo ou uma proteína nos quais uma cadeia lateral contém um resíduo de aminoácido modificado, o qual compreende produzir quimicamente um fragmento de peptídeo contendo um resíduo de aminoácido apresentando uma cadeia lateral modificada utilizando uma resina de clivagem em ácido fraco, produzir um fragmento de peptídeo não contendo resíduos de aminoácidos apresentando uma cadeia lateral modificada utilizando um método de recombinação genética ou/e um método enzimático, e condensar os dois tipos de fragmentos de peptídeo resultantes e, de acordo com a presente invenção, podem ser efetivamente obtidos um peptídeo ou uma proteína contendo modificações tais como acilação, glicosilação e fosforilação de alta qualidade.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA PRODUZIR UM PEPTÍDEO MODIFICADO (51) Int.CI.: C07K 1/04; C07K 1/06; C07K 14/46; C07K 14/465; C07K 9/00 (30) Prioridade Unionista: 11/04/2002 JP 2002-109761 (73) Titular(es): KANGAWA, KENJI. DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED (72) Inventor(es): MINAMITAKE, YOSHIHARU; MATSUMOTO, MASARU; MAKINO, TOMOHIRO

1/113 /5-4 i

MÉTODO PARA PRODUZIR UM PEPTÍDEO MODIFICADO

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um método para 5 produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, e a um método para produzir um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados, o qual é adequadamente utilizado para o método de produção mencionado acima.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Um hormônio de crescimento secretagogo (GHS - growth hormone secretagogue) endógeno para um receptor de hormônio de crescimento secretagogo (GHS-R) que é um dos receptores órfãos, foi purificado e isolado de estômago de rato em 1999, e foi denominado de grelina (Kojima et al. ,

Nature, vol. 402, pg. 656-660, 1999). Este peptídeo é conhecido como apresentando uma estrutura característica na qual um grupo hidroxi de um resíduo de serina é acilado com um ácido graxo. Além disto, grelina na qual um resíduo de serina ou um resíduo de treonina na posição 3 contém um sítio modificado por ácido graxo foi isolada de vertebrados outros que não rato, tal como um humano, camundongo, porco, aves, enguia, vaca, cavalo, ovelha, rã, truta ou cão, ou foi obtido a partir de um cDNA (Tabela 1) . Por exemplo, a grelina humana consiste em 28 aminoácidos, e a serina na cadeia lateral na posição 3 é acilada com um ácido graxo (ácido N-octanóico). Foi observado que este novo peptídeo apresenta uma forte atividade de hormônio de crescimento secretagogo, e uma modificação na serina ou treonina da posição 3 com um ácido graxo é essencial para a

2/113 manifestação da atividade (Kojina et al., Nature, vol. 402, pg. 656-660, 1999). Adicionalmente, foi demonstrada a grelina secretada a partir de funções estomacais como um hormônio sanguíneo na regulação da secreção de hormônio de crescimento, e desta forma, uma maior atenção foi dada ao papel fisiológico da grelina e sua aplicação em medicamentos.

Tabela 1

Humano

Rato

Camundongo

Porcino

Bovino

Ovino

Canino

Enguia

Truta

Frango

Rã-Touro

Tilápia

Bagre

GSS(n-octanoil)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR GSS (n-octanoil)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR GSS (n-octanoil)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR GSS(n-octanoil)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR GSS(n-octanoil)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-MFÍ₂GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH₂GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQGKGKPPRV-Mfo?

GSS(n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR GSS(n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR GSS (n-octanoil)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH GLT(n-octanoil)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM GLT(n-octanoil)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM GLT(n-octanoil)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN GSS(n-octanoil)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH₂GSS (n-octanoil) FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-W? GSS(n-octanoil)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG

3/113

Eqüino

GSS(n-octanoil)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR

Adicionalmente a um peptídeo modificado com um grupo octanoil (C8), existem peptídeos modificados com grupo butanoil (C4), grupo hexanoil (C6), grupo decanoil (CIO) e grupo dodecanoil (C12). Além disto, existem peptídeos modificados com ácidos graxos insaturados.

Alguns peptídeos ou proteínas, como grelina e colecistoquinina, manifestam seus papéis fisiológicos quando um resíduo de aminoácido específico na· seqüência de aminoácidos sofreu modificações tais como acilação, sulfonação, glicosilação ou fosforilação. Acredita-se que estas modificações são causadas por um elaborado sistema de enzimas em um ser vivo, e um método geral para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de uma forma de alta qualidade e efetiva- em grandes quantidades ainda não foi reportado. Por exemplo, uma vez que a grelina exibe atividade de hormônio de crescimento secretagogo por modificação em um aminoácido. específico dé uma cadeia lateral com um ácido graxo de cadeia longa, modificação com ácido graxo é um elemento estrutural essencial. No entanto, qual sistema enzimático de um ser vivo está envolvido na ligação éster de um ácido graxo a um grupo hidroxi de um aminoácido específico de uma cadeia lateral ou na extensão de um ácido graxo ainda não é conhecido. Uma vez que, em particular, a grelina é o primeiro peptídeo fisiologicamente ativo a se conhecer como apresentando uma estrutura na qual um grupo hidroxi de um aminoácido de uma cadeia lateral é modificado com um ácido graxo, embora o presente peptídeo seja um hormônio /51

4/113 peptídico útil, o qual se espera seja um medicamento promissor como um medicamento curativo para distúrbios de nutrição, uma droga para promover a secreção de hormônio de crescimento, etc., a produção de um peptídeo apresentando modificação com ácido graxo em um aminoácido específico contendo hidroxi. de uma cadeia lateral ainda não foi generalizada. Isto é, um método de produção industrial que seja vantajosa para produção ..em massa de tal peptídeo ainda não foi estabelecido até o presente momento.

Atualmente, várias preparações de peptídeos ou proteínas tais como insulina, hormônio de crescimento, calcitonina, peptídeo natriurético atrial, derivado LH-RH e derivado do hormônio adrenocorticotrópico são utilizadas como medicamento. Como método para a produção destes peptídeos ou proteínas, são conhecidos produção por um método de síntese química, um método enzimático e um método por recombinação genética. Embora, o método a ser empregado seja apropriadamente selecionado, em geral um método de síntese química é selecionado quando o número de resíduos é pequeno, e um método enzimático ou um método por recombinação genética é selecionado quando o número de resíduos é alto.

Um método de síntese química, por exemplo, .é um método pelo qual um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa apresentando modificação tal como grelina, etc. pode ser produzido de forma estável. Muitos métodos de produção utilizando um método de síntese química foram já reportados como método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada. No caso da grelina, métodos são reportados por Bednarek et al. (J. Méd. Chem., vol. 43, pg.

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5/113

4370-4376, 2000) e Matsumoto et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 284, pg. 655-659, 2001). Também, a publicação internacional n° WO 01/07475 descreve um método de produção por um método de síntese química, como um to

para a	produção de	um	peptídeo que é a	grelina	ou	um
derivado	de grelina,	ou	um sal destes. No	entanto,	em	uma
produção	por método	de	síntese química, há	usualmente	uma

limitação quanto ao comprimento de cadeia do peptídeo que pode ser sintetizado, enquanto que mantendo constante a qualidade (pureza). Embora um método de síntese química em fase líquida possa sintetizar um peptídeo de alta pureza, o método não é comum para síntese de um peptídeo de cadeia longa tendo devido à solubilidade, etapa de produção longa e necessidade de técnicas especiais para a reação de tratamento. A saber, a produção efetiva em grandes quantidades é difícil em um método de produção utilizando um método de síntese química em fase líquida. Por outro lado, uma síntese química em fase sólida para estender uma cadeia peptídica em uma resina apresenta uma etapa simplificada, e é mais vantajosa para produção em.massa; no entanto este método também apresenta limitações quanto ao comprimento da cadeia a ser construída para se obter produtos apresentando qualidade constante. Adicionalmente, há também um problema no fato do método ser inferior em termos econômicos tendo em vista a quantidade excessiva de reagentes utilizada, em particular, na produção de um peptídeo de cadeia longa.

Entretanto, um método para acoplar enzimaticamente um fragmento de peptídeo tal como um método enzimático é excelente pelo fato de poder-se minimizar a proteção da

6/113 jéf cadeia lateral de um aminoácido. Neste método, no entanto, uma vez que é utilizada normalmente uma reação reversa de hidrólise, o ajuste das condições é em princípio difícil, e, desta forma, o método não é prático.

Por outro lado, a produção de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativos por um método de recombinação genética é um método de produção útil adequado para produção ..em massa. No entanto, em um método utilizando um procarioto tal como Escherichia coli apresentando alta produtividade, é difícil para produzir diretamente um peptídeo apresentando um sítio modificado, uma vez que um procarioto não apresenta qualquer sistema de modificação pós-traducional. Em um método de recombinação genética utilizando um eucarioto tal como levedura e várias células ovo, modificação tal como glicosilação, acilação, sulfonação e fosforilação é possível, no entanto, no que diz respeito a um ácido graxo, por exemplo, é difícil introduzir apenas ácido graxo apresentando um comprimento constante. Entre as grelinas isoladas, grelinas apresentando não apenas ácido octanóieo (C8):·, mas também ácido butanóico (C4), ácido decanóico (CIO), ou ácido graxo insaturado destes foram detectadas, e assim fica claro que pelo controle da introdução de um ácido graxo apresentando um comprimento de cadeia específico é difícil. Adicionalmente, uma vez que a produtividade por um eucarioto é em geral baixa, um sistema de produção de levedura e várias células ovo apresentando sistema de modificação tem muito mais espaço para aperfeiçoamentos do ponto de vista da produção em massa de um peptídeo modificado ou proteína modificada tal como grelina.

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Conforme descrito acima, embora um método de síntese química seja conhecido como um método para a síntese de um peptídeo modificado ou proteína modificada, e existam já vários relatórios, tal método tem espaço para aperfeiçoamento no que diz respeito ao rendimento e custo para o propósito de produção em massa. É difícil produzir diretamente um peptídeo modificado ou proteína modificada por um método de recombinação genética utilizando-se um procarioto tal como Escherichia coli. Também, a produção por um método de recombinação genética utilizando-se um eucarioto como levedura apresenta um problema no que diz respeito à uniformidade ou produtividade, e, desta forma, há espaço para aperfeiçoamento de maneira a superar este problema. Em um método enzimático utilizando uma reação reversa de hidrólise, é difícil ajustar-se as respectivas condições de condensação e, por esta razão, este método não pode ser tomado como um método vantajoso para a produção em massa.

Conforme descrito acima, tem havido espaço para aperfeiçoamento adicional em uma produção efetiva de um peptídeo ou proteína apresentando modificação tal como glicosilação, acilação, sulfonação, fosforilação, etc., o que satisfaz os elementos qualitativos e quantitativos, pela aplicação independente de um método de síntese química convencional conhecido, um método enzimático ou um método de recombinação genética apenas.

Assim, como um dos métodos utilizando as vantagens dos métodos mencionados acima e que compensa os defeitos dos métodos, pode ser exemplificado um método de semisíntese obtido da combinação de um método de síntese

8/113 química com um método de recombinação genética. Um ponto importante do método de produção é efetivamente produzir um fragmento de peptídeo em uma forma adequada para condensação. Um fragmento de peptídeo contendo um resíduo de aminoácido modificado (daqui em diante, também referido como componente modificado) e um fragmento de peptídeo não contendo qualquer resíduo de aminoácido modificado (daqui em diante, também referido como componente não modificado) pode estar em uma extremidade terminal-N ou uma extremidade terminal-C, ou pode haver uma pluralidade de componentes modificados. Um método de produção pode ser projetado apropriadamente dependendo do peptídeo ou proteína desejados. Como exemplo, o caso em que um componente modificado está presente em uma extremidade terminal-N, e um outro fragmento de peptídeo a ser condensado com o fragmento de peptídeo (componente modificado) é um componente não modificado será descrito em detalhe.

Um método de ligação química nativo (Dawsan et al., Science, vol. 266, pg. 7.76-779, 1994), para o qual se fez atenção recentemente, apresenta um defeito no fato de um.de Cys permanecer em um sítio de ligação. Recentemente, no entanto, foi proposto um método de tioéster obtido do aperfeiçoamento do método mencionado, acima. Por exemplo, Kawakami et al. relataram a síntese de um peptídeo fosforilado por um método utilizando tioéster (Tetrahedron Letter, vol. 41, pg. 2625-2628, 2000).

Um exemplo específico de método de tioéster será descrito abaixo. Em um exemplo de síntese de uma proteína p21Max fosforilada (Kawakami et al., Tetrahedron Lett., vol. 39, pg. 7901-7904, 1998), um fragmento de peptídeo

9/113 (componente modificado) (13mero) contendo um sítio modificado com ácido fosfórico é produzido como tioéster por um método de síntese química em fase sólida. Por outro lado, um fragmento de peptídeo contendo uma seqüência na qual um resíduo de aminoácido é adicionado ao terminal-N de um componente não modificado é produzido em Escherichia. coli, ácido glioxílico é feito agir sobre este na presença de um íon cobre ou níquel divalente .para converter um resíduo de aminoácido adicionado ao terminal-N em um grupo α-cetoacil, e um grupo amino de cadeia lateral é protegido com um grupo Boc. Assim, um grupo α-cetoacil é removido com fenilenodiamina, desta forma é produzido um fragmento de peptídeo (componente não modificado), no qual apenas um grupo aminoácido no resíduo de aminoácido do terminal-N é liberado. Finalmente, ambos estes fragmentos são condensados pela adição de um agente de esterificação ativo tal como um sal de prata, HOOBt em excesso, etc.

Também no método mencionado acima, ainda permanece o seguinte problema. Há um problema quanto a estabilidade do tioéster na produção de um fragmento de peptídeo (componente modificado) , e é reportado que o rendimento é de 11%. Adicionalmente, para a produção de um fragmento de peptídeo (componente não modificado), o dito método utilizando um grupo α-cetoacil é uma escolha potencial como um método químico de congelamento de um grupo amino do terminal-N. No entanto, o método apresenta um problema de segurança no fato do grupo α-cetoacil ser instável, e uma substância mutagênica tal como fenilenodiamina ser utilizada para eliminar o grupo, quando é produzido um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativos para um

10/113 medicamento. Adicionalmente, um agente de esterificação ativo tal como sal de prata, HOOBt em excesso, etc. é utilizado em uma reação de condensação dos fragmentos e, por esta razão, há também um problema de racemização, toxicidade e custo.

Um método de semi-síntese combinando um .método de síntese química e um método de recombinação genética é descrito na publicação internacional n° WO 07/07475 como um método para a produção de um peptídeo que é um derivado de grelina, ou um sal deste. Mais especificamente, é descrito um método para a produção de uma grelina de rato (1-18) pela condensação de grelina de rato (1-5) preparada por um método de síntese química com grelina de rato (6-28) preparada por um método de recombinação genética. No entanto, uma vez que tal método também apresenta o problema a seguir, há espaço para mais aperfeiçoamento de maneira a obter-se um método de produção eficiente e industrialmente vantajoso. Isto é, há espaço para aperfeiçoar a produtividade deste, quando grelina de rato (1-5) é obtida pela eliminação de uma cadeia peptídica com TFA a partir de uma resina, um grupo Boc e um grupo t-Bu são removidos ao mesmo tempo, e, desta forma, é necessário introduzir novamente o grupo Boc no terminal-N, e uma vez que uma Ser de cadeia lateral se torna desprotegida, não pode ser utilizado um agente de ativação forte para a condensação com grelina de rato (6-28), etc. Além disto, em um processo de condensação de uma grelina de rato (1-5) protegida e grelina de rato (6-28) protegida, um aminoácido do terminal-C de uma parte do fragmento de acilpeptídeo pode ser racemizada, e, por esta razão, há espaço para

11/113 aperfeiçoamento de maneira a evitar este problema. Aqui, grelina (m-n) significa um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos de n° a n° a partir do terminal-N da grelina. Daqui em diante, tem-se o mesmo.

Adicionalmente, existem alguns problemas na preparação de um fragmento de peptídeo protegido (componente não modificado). Um método para a produção de grelina de rato protegida (6-28) descrito na publicação internacional n° WO 01/07475 fundamentalmente adota um método de tratamento enzimático em duas etapas (publicação internacional n° WO 99/38984) e, como, um processamento enzimático, são utilizados dois tipos de enzimas, isto é, um derivado de protease V8 recombinante (rV8D5) (JP-A n° 947291) e uma protease Kex2 (JP-A n° 10-229884). No entanto, uma vez que é construído um plasmídeo (pG97s rGR) que expressa uma proteína de fusão contendo grelina de rato protegida (6-28) com base em um plasmídeo (JP-A n° 9296000) com alta expressão de uma proteína de fusão de Escherichia coli derivada de β-galactosidase com hormônio paratireóide humano (1-34), pode ser. necessária a seleção de uma seqüência ligante adequada para sua seqüência de aminoácidos na preparação de um fragmento de peptídeo protegido (componente não modificado).

Além disto, como ocorre um fenômeno no qual um grupo protetor para grelina de rato protegida (6-28) é eliminado em solução aquosa, uma taxa de recuperação na etapa de purificação é tão baixa quanto 10%, e, por esta razão, há ainda um problema para o suprimento estável de grelina em grandes quantidades.

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Conforme descrito acima, mesmo uma combinação de um método de síntese química e um método de recombinação genética apresenta um problema adicional de maneira a realizar-se um método para produzir eficientemente um peptídeo modificado ou proteína modificada fisiologicamente ativos, os quais sejam seguros o suficiente para serem utilizados como medicamento.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é prover um método industrial simples e efetivo para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada. Especificamente, um objetivo da presente invenção é prover um método para efetivamente produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada fisiologicamente ativos apresentando alta qualidade pela produção de um fragmento de peptídeo contendo um sítio modificado (componente modificado) utilizando-se um método de síntese química, produção de um fragmento de peptídeo não contendo partes modificadas (componente não modificado) utilizando-se um método de recombinação genética, e os., condensando. Conforme descrito acima, estes respectivos fragmentos de peptídeo (componente modificado e componente não modificado) podem ser tanto um fragmento lateral de terminal-N quanto um fragmento lateral de terminal-C, ou podem apresentar uma pluralidade de componentes modificados. Um método de produção pode ser projetado apropriadamente dependendo do peptídeo ou proteína desejados. Outros objetivos da presente invenção são prover um método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido (componente modificado) adequado para a reação de condensação sob condição branda, não

13/113 influenciando sobre a estrutura do sitio modificado, e prover um método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido (componente modificado) adequado para a condensação com um fragmento de peptídeo protegido (componente não modificado). Ainda um outro objetivo da pres:ente invenção é prover um método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada fisiologicamente ativos, que sejam seguros o suficiente para serem utilizados como medicamento. Em particular, um objetivo da presente invenção é prover um método industrial para a produção de uma grelina e um derivado de grelina de maneira simples e efetiva.

Os presentes inventores aperfeiçoaram um método para a síntese de um fragmento de peptídeo contendo um aminoácido que é modificado com um grupo acil em grelina ou um derivado deste (componente modificado), que utiliza grelina como material, e estabeleceram um método pelo qual um fragmento.: de peptídeo (componente modificado) pode ser produzido de uma forma mais simples e eficiente. Isto é, os presentes inventores desenvolveram um método no qual uma seqüência de uma cadeia peptídica principal de um fragmento de peptídeo (componente modificado) é construída em uma resina de clivagem em ácido fraco tal como uma resina de 2clorotritil, etc., e então o dito peptídeo é, após modificação seletiva do resíduo, tratado com um ácido fraco tal como ácido acético, pelo que um peptídeo protegido e modificado pode ser clivado a partir da resina em fase sólida. Como estado da técnica, é. conhecido um método no qual um grupo modificado é introduzido em uma resina tal como uma resina Wang, o qual pode ser excisado com ácido

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14/113 trifluoracético, etc. da resina, e então um grupo protetor é eliminado quando um peptídeo é clivado da resina. No entanto, no dito método, uma vez que um fragmento de peptídeo clivado (componente modificado) é subseqüentemente submetido a uma reação de condensação com um outro fragmento de peptídeo (componente não modificado), um grupo protetor deve ser introduzido novamente, e assim um método baseado no estado da técnica pelo qual um grupo protetor é também eliminado ao mesmo tempo da divagem a partir da resina não é preferível a partir do ponto de vista de uma produção simples e efetiva.

Tendo em vista estes fatores, os presentes inventores realizaram estudos intensivos e, como resultado, desenvolveram um método no qual um ácido fraco (incluindo ácido forte diluído), que dificilmente elimina um grupo protetor da cadeia lateral de um aminoácido, é utilizado para clivar um fragmento de peptídeo (componente modificado) de uma resina, enquanto que utilizando um fluoreto de amônia quaternária como um método efetivo para modificar seletivamente um resíduo· pela eliminação de um grupo protetor da cadeia lateral de um aminoácido em uma resina sem clivar o peptídeo na resina. Convencionalmente, entre os fluoretos de amônia quaternária, fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF) tem sido utilizado como reagente para a divagem de um peptídeo de uma resina de fase sólida (J. Chem. Soc., Chem. Commun., pg. 414-415, 1988, Tetrahedron Letters, vol. 34, pg. 7599-7602, 1993). No entanto, os presentes inventores descobriram que um peptídeo construído sobre uma resina de clivagem em ácido fraco não é clivado da resina por tratamento com TBAF.

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Como resultado, quando TBAF é utilizado, um peptídeo não é clivado da resina e, por esta razão, um grupo protetor para um aminoácido específico de cadeia lateral pode ser eliminado na resina e o resíduo pode ser seletivamente modificado, e pela clivagem de um fragmento de peptídeo (componente modificado) da resina utilizando-se um ácido fraco (incluindo ácido forte diluído) que dificilmente elimina um grupo protetor da cadeia lateral de um aminoácido, se torna desnecessária uma etapa anterior de proteção de um fragmento de peptídeo (componente modificado) para a próxima etapa de reação de condensação com um fragmento de peptídeo (componente não modificado). Conseqüentemente, pode ser obtido um processo de produção de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativos modificados.

Adicionalmente, os presentes inventores aperfeiçoaram um método para a preparação de um fragmento de peptídeo protegido de grelina (componente não modificado) e determinaram uma seqüência ligante ótima para produção em massa de um fragmento de grelina (8-28) protegido por um método de tratamento enzimático em duas etapas. Além disto, os presentes inventores estabeleceram um método que pode simplificar consideravelmente e tornar efetiva uma etapa de produção de um fragmento de peptídeo protegido (componente não modificado) pela purificação em condições de pH sob as quais um grupo protetor não é eliminado. Isto é, os presentes inventores determinaram que o fenômeno de eliminação de um grupo protetor durante a preparação de um peptídeo protegido depende do pH e da temperatura da solução aquosa, e a eliminação de um grupo protetor pode

16/113 ser suprimida pelo ajuste do pH da solução aquosa para de 4 a 8, pelo que um peptídeo protegido (componente não modificado) pode ser efetivamente preparado.

Adicionalmente, os presentes inventores aperfeiçoaram um método para condensar cada fragmento de peptídeo, e desenvolveram um método de produção pelo qual a racemização na ativação e condensação dos aminoácidos pode ser suprimida, e pode ser produzida uma grelina ou um derivado de grelina de qualidade mais alta em um rendimento maior. Em particular, um método para a produção de grelina utilizando uma resina de divagem em ácido fraco tem a vantagem de suprimir a formulação de dicetopiperazina formada a partir de uma reação secundária. Isto é, uma vez que um resíduo de aminoácido de terminal-C é prolina na posição 7, uma reação secundária de eliminação de dicetopiperazina da resina pode ser minimizada pela exposição da dicetopiperazina quando o terceiro aminoácido (Leu) é condensado com um dipeptídeo (-Ser-Pro-).

Com base nestas descobertas, os presentes inventores determinaram que o método mencionado acima pode ser facilmente aplicado também à produção de peptídeos e proteínas fisiologicamente ativos apresentando várias estruturas modificadas nas quais um grupo acil, um grupo fosfato ou um grupo sulfato, obviamente um grupo alquil, é ligado a uma cadeia lateral de um aminoácido ou de um não aminoácido por meio de uma ligação glicosídica, uma ligação dissulfeto, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação amida ou semelhantes, e finalmente completaram a presente invenção.

A saber, a presente invenção refere-se:

17/113 (1) a um método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados representados pela fórmula 1: A(R)~ (onde A representa um aminoácido ou um não aminoácido, e R representa um substituinte ligado à cadeia lateral de A), que compreende a utilização de uma resina de clivagem em ácido fraco, (2) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com (1), onde (a) é preparado um fragmento de peptídeo apresentando uma seqüência desejada de um aminoácido ou/e um não aminoácido com uma cadeia lateral protegida sobre uma resina de clivagem em ácido fraco, (b) um grupo protetor para a cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido A, a qual deve ser modificada com um substituinte R, é desprotegido sem clivagem do fragmento de peptídeo da resina de clivagem em ácido fraco, (c) a cadeia lateral desprotegida é modificada com um substituinte R, e (d) o fragmento de peptídeo é clivado.da resina de clivagem em ácido fraco, (3) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com (1) ou (2), onde o grupo protetor para a cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido A é um grupo protetor silil, e fluoreto de amônia quaternária é utilizado para a desproteção do grupo protetor, (4) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com (3), onde o grupo protetor silil é t-butildimetilsilil (TBDMS), t-butildifenilsilil (TBDPS), triisopropilsilil (TIPS), triisobutilsilil (TIBS), thexildimetilsilil (ThxDMS) ou trifenilsilil (TPS), e o /41

18/113 fluoreto de amônia quaternária é fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF), fluoreto de tetraetilamônio (TEF) ou fluoreto de amônio, (5) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com qualquer um dos itens acima (1) a (4), onde A é serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalônico, ácido aspártico, tirosina ou asparagina, e R é ligado à cadeia lateral por meio de uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amido, uma ligação O-glicosídica, uma ligação N-glicosídica ou semelhantes,

(6)	ao	método	para	a	produção	de	um	fragmento	de
peptídeo	de	acordo	com	(5)	acima,	onde	A	é serina	ou
treonina,	e	R é ligado à	cadeia lateral <	de	A por meio	de
uma ligação éster,
(7)	ao	método	para	a	produção	de	um	fragmento	de
peptídeo	de	acordo	com	(6)	acima,	onde	o	fragmento	de

peptídeo é grelina ou um,, derivado desta, ou uma parte contendo um aminoácido modificado na grelina ou um derivado desta, (8) um método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada, que compreende (a) produzir um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados representados pela fórmula 1: -A(R)- (onde A representa um aminoácido ou um não aminoácido, e R representa um substituinte ligado à cadeia lateral de A) utilizando-se uma resina de clivagem em ácido fraco, (b) produzir um

19/113 fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, juntamente com o fragmento de peptídeo de (a), e condensar o fragmento de peptídeo produzido em (a) com o fragmento de peptídeo produzido em (b) , (9) ao método para . a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (8) acima, onde o fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados é produzido pelo método descrito em qualquer um dos itens (2) a (4), (10) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com os itens (8) ou (9) acima, onde A é serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalônico, ácido aspártico, tirosina ou asparagina, e R é ligado à cadeia lateral por meio de uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amido, uma ligação O-glicosídica, uma ligação Nglicosídica, (11) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (10) acima, onde A é serina ou treonina, e R é ligado à cadeia lateral de A por meio de uma ligação éster, (12) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (11) acima, onde o peptídeo modificado ou proteína modificada é grelina ou um derivado desta, (13) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um

20/113 dos itens (8) a (12) acima, onde a condensação dos fragmentos de peptídeo é realizada utilizando-se um agente de condensação, (14) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (13) acima, onde o agente de condensação é hexafluorfosfato de 2—(l— hidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU), tetrafluorborato de 2-(1-hidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3tetrametilurônio (TBTU), difenilfosforilazida (DPPA), difenilfosforocianidato (DEPC), diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), (15) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (13) acima, onde o agente de condensação é diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), e a condensação dos fragmentos de peptídeo utilizando o agente de condensação mencionado acima é realizada na presença de 1hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxisuccinimida (HOSu) ou 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-benzotriazina (HOOBt).

Mais especificamente, a presente invenção refere-se, em um processo para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada por condensação de fragmentos, a (a) um método para a produção de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativos, que compreende sintetizar um fragmento de peptídeo contendo um grupo modificado utilizando-se uma resina de divagem em ácido fraco tal como resina de 2-clorotritil, (b) um método para a produção de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativos

21/113 apresentando modificação, particularmente grelina ou um derivado de grelina, gue compreende produzir um fragmento de peptídeo contendo um grupo acil, um grupo sulfato, etc., os guais são facilmente eliminados com um ácido, utilizando uma resina de divagem em ácido fraco tal como resina de 2clorotritil, (c) um método para a produção de grelina ou um derivado de grelina, gue compreende suprimir a racemização de um aminoácido constituinte com a mediação de prolina para uma resina com terminal-C de um fragmento lateral terminal-N a ser ativado, guando um fragmento de peptídeo contendo modificação (componente modificado) e um fragmento de peptídeo não contendo modificação (componente não modificado) são condensados, e (d) um agente de condensação gue é altamente apropriado para a produção de grelina ou um derivado de grelina.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se:

(1) a um método para a produção de fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados, gue compreende preparar, em uma resina de clivagem em ácido fraco, um fragmento de peptídeo gue contém um següência desejada compreendendo aminoácidos ou/e não aminoácidos, pelo menos um aminoácido ou não aminoácido destes sendo um aminoácido ou. não aminoácido modificado, representado pela fórmula 1: -A(R)- (onde A representa um aminoácido ou não aminoácido, e R representa um substituinte ligado à cadeia lateral de A gue é introduzido como modificação) , e no gual um ou mais grupos funcionais reativos gue podem provocar uma reação secundária indesejável na preparação de um fragmento de peptídeo, selecionados do grupo consistindo em um grupo

22/113 hidróxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido, são protegidos com um grupo protetor, e clivar o fragmento de peptídeo da resina de clivagem em ácido fraco sob condições ácidas fracas sem eliminação de um grupo protetor no fragmento de peptídeo,

(2)	ao	método para	a	produção	de	um fragmento	de
peptídeo	de	acordo com	(D	acima,	que	compreende	(a)
preparar,	em	uma resina	de	clivagem	em	ácido fraco,	um

fragmento de peptídeo contendo uma seqüência desejada compreendendo aminoácidos ou/e não aminoácidos, no qual um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável na preparação de um fragmento de peptídeo, selecionados do grupo consistindo em um grupo hidróxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido, são protegidos com um grupo protetor, (b) desproteger o grupo protetor sem clivar o fragmento de peptídeo da resina de clivagem em ácido fraco, quando um grupo protetor é introduzido em um grupo funcional reativo na. cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido A a ser modificado com um substituinte R, (c) modificar a cadeia lateral desprotegida com um substituinte R, e (d) clivar o fragmento de peptídeo da resina de clivagem em ácido fraco sob condições ácidas fracas sem eliminação de um grupo protetor no fragmento de peptídeo, (3) a um método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não

23/113 aminoácidos, representado pela fórmula 1: -A(R)- (onde A representa um aminoácido ou não aminoácido, e R representa um substituinte ligado a uma cadeia lateral de A) , que compreende (a) produzir, em uma resina de divagem em ácido fraco, um fragmento de peptídeo contendo uma seqüência desejada de um aminoácido ou/e um não aminoácido, e na qual um ou mais substituintes reativos selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido, são protegidos com um grupo protetor, (b) clivar o fragmento de peptídeo da resina de divagem em ácido fraco sem eliminação de um grupo protetor no fragmento de peptídeo sob condições ácidas fracas, (c) desproteger o grupo protetor para o substituinte reativo na cadeia lateral de pelo menos um aminoácido ou não aminoácido A do fragmento de peptídeo clivado, e (d) modificar a cadeia lateral desprotegida com um substituinte

R, ..

(4) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com os itens (2) ou (3) acima, onde um grupo protetor para um substituinte reativo em uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido A a ser modificado por um substituinte R, é um grupo protetor silil, e um fluoreto de amônia quaternária é utilizado para desproteger o grupo protetor, (5) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com (4) acima, onde o grupo protetor silil é t-butildimetilsilil (TBDMS), t-butildifenilsilil (TBDPS), triisopropilsilil (TIPS), triisobutilsilil (TIBS),

24/113 t-hexildimetilsilil (ThxDMS) ou trifenilsilil (TPS), e o fluoreto de amônia quaternária é fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF), fluoreto de tetraetilamônio (TEF) ou fluoreto de amônio, (6) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (5) acima, onde A é serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalônico, ácido aspártico, tirosina ou asparagina, e R é ligado ao grupo funcional reativo na cadeia lateral de A por meio de uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amino, uma ligação 0glicosídica ou uma ligação N-glicosídica,

(7)	ao	método	para a produção de	um	fragmento	de
peptídeo	de	acordo	com (6) acima, onde	A	é serina	ou
treonina,	e R	é ligado a um grupo hidroxi na cadeia lateral
de A por	meio	de uma	ligação éster,
(8)	ao	método	para a produção de	um	fragmento	de
peptídeo	de	acordo	com (7) acima, onde	o	fragmento	de
peptídeo	é grelina ou	um derivado desta, ou um	fragmento	de
peptídeo	contendo um	aminoácido modificado na grelina	ou
derivado	desta,
: (9)	a	um método para a produção	de	um peptídeo

modificado ou proteína modificada, que compreende (a) preparar um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados pelo método descrito em qualquer um dos itens (1) a (8), (b) preparar um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, e no qual um ou mais grupos

25/113 funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável, selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, na cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido, são protegidos, juntamente com o fragmento de peptídeo de (a) , e condensar os fragmentos de peptídeo preparados em (a) e (b) , (10) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (9) acima, onde a condensação dos fragmentos de peptídeo é realizada utilizando-se um agente de condensação, (11) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (10) acima, onde o agente de condensação é hexafluorfosfato de 2-(lhidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3, 3-tetrametilurônio (HBTU) , tetrafluorborato de 2-(1-hidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3tetrametilurônio (TBTU), difenilfosforilazida (DPPA), difenilfosforocianidato (DEPC), diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), (12) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (10) acima, onde o agente de condensação é diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), e a condensação dos fragmentos de peptídeo (a) e (b) utilizando o agente de condensação é realizada na presença de 1hidroxibenzotriazol (HOBt) , 1-hidroxisuccinimida (HOSu) ou 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-benzotriazina (HOOBt),

26/113 (13) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um dos itens (9) a (12) acima, que compreende produzir um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, por um método enzimático ou/e um método de recombinação genética, (14) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (13) acima, onde o fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados é produzido por um método compreendendo:

etapa (1): uma etapa de cultivo de uma célula transformada com um vetor de expressão contendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo contendo uma entre uma seqüência de aminoácidos do fragmento de peptídeo (daqui em diante referido como peptídeo desejado no presente item) e uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão opcionalmente com um peptídeo de proteção adicionado ao peptídeo desejado por meio de uma seqüência ligante, e coleta do peptídeodesejado ou da proteína de fusão da cultura;

etapa (2) : uma etapa de clivagem e separação do peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado a partir da proteína de fusão resultante, e opcionalmente adicionalmente purificação do peptídeo desejado quando a proteína de fusão é coletada na etapa (1); e etapa (3): uma etapa de proteção, com um grupo protetor, de um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável, uma

27/113 selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, na cadeia lateral do peptídeo desejado obtido na etapa (1) ou na etapa (2), (15) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com (14) acima, onde a clivagem e separação do peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado na etapa (2) são realizadas em duas etapas utilizando protease OmpT ou um derivado desta e uma protease Kex2 ou um derivado desta,

(16)	ao	método	para	a	produção	de um	peptídeo
modificado	ou	proteína	modificada de acordo com	os itens
15 (14) ou	(15)	acima,	onde	a	seqüência	ligante	! é uma
seqüência	representada	na SEQ	ID	NO.: 27,
(17)	ao	método	para	a	produção	de um	peptídeo

modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um dos itens (13) a (16) acima, onde o fragmento de peptídeo é um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou .não aminoácidos modificados na grelina ou um derivado desta, (18) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um dos itens (13) a (17) acima, onde o fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados é purificado e armazenado em uma solução com pH de 4 a 8, (19) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um

28/113 dos itens (13) a (18) acima, onde o grupo protetor é um grupo Boc, (20) a um método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, que compreende produzir o fragmento de peptídeo por um método compreendendo:

etapa (1): uma etapa de cultivo de uma célula transformada com um vetor de expressão, contendo uma entre uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo contendo a seqüência de aminoácidos desejada (daqui em diante referido como peptídeo desejado no presente item) e uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão opcionalmente com um peptídeo de proteção adicionado ao peptídeo desejado por meio de uma seqüência ligante, e coleta do peptídeo desejado ou da proteína de fusão da cultura;

etapa (2) : uma etapa de divagem e separação do peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado a partir da proteína de fusão resultante, e opcionalmente adicionalmente purificação deste, quando a proteína de fusão é coletada na etapa (1);

etapa (3): uma etapa de proteção, com um grupo protetor, de um ou mais substituintes reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável, selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral do peptídeo desejado obtido na etapa (1) ou (2);

29/113 etapa (4): uma etapa de purificação e armazenamento do peptídeo desejado protegido obtido na etapa (3) em uma solução com um pH de 4 a 8, (21) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados de acordo com (20) acima, onde o grupo protetor é um grupo Boc, (22) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados de acordo com os itens (20) ou (21) acima, onde a clivagem e separação do peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado na etapa (2) são realizadas em duas etapas utilizando protease OmpT ou um derivado desta e uma protease Kex2 ou um derivado desta, (23) ao método para a produção de um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados de acordo com qualquer um dos itens (20) a (22) acima, onde a seqüência ligante é representada na SEQ ID NO.: 27, (24) ao método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada de acordo com qualquer um dos itens (20).a (23) acima, onde o fragmento de peptídeo é um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não

aminoácidos modificados na	grelina ou derivado	desta.
BREVE EXPLICAÇÃO DOS	DESENHOS
A Fig. IA mostra um	oligo-DNA sintético	total e	uma
seqüência de aminoácidos	de hGhrelin(8-28 ) .	A Fig.	1B
mostra uma seqüência de	aminoácidos de uma	proteína	de

/63

30/113 fusão hGhrelin(8-28) que é expressada pelo plasmídeo pll7

8-28oRr.

A Fig. 2 mostra resultados da análise de HPLC de [Lys

16,19, 20,24

Boc)]hGhrelin(8-28).

O pico a) refere-se ao pico de [Lys

16, 19,20,24 (Boc)]hGhrelin(8-2Í . A Fig. 3 mostra uma reação de condensação de fragmentos. O pico A refere-se ao pico de [N^a-Boc, Ser^2,6 (tBu) ] hGhrelin (1-7) , o pico B refere-se ao pico de [Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28) , o pico C refere-se ao pico de [N^a-Boc, Ser^2,6 (tBu), Lys¹⁶' ^19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) , e o pico D refere-se ao pico de hGhrelin.

A Fig. 4 mostra resultados da determinação de HPLC de hGhrelin modificada.

A Fig. 5 mostra sequências de aminoácidos de proteínas de fusão apresentando diferentes sítios de reconhecimento de divagem da protease Kex2.

A Fig. 6 mostra resultados da análise de HPLC da eficiência de clivagem da Kex2 das respectivas proteínas de fusão preparadas na Fig. 5. A Fig. 6A mostra resultados da análise de HPLC após reação enzimática de Kex2. sobre PRhGhrelin (8-28) . A Fig. 6B mostra resultados da análise de HPLC após reação enzimática de Kex2 sobre RR-hGhrelin(825 refere-se ao uma ao pico de seqüência pico de

O pico c) refere-se ao

28). O pico a) refere-se [Lys^16,19'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) contendo ligante. O pico b) [Lys^16,19,20,24 (Boc) ]hGhrelin (8-28) pico de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (16-28 ) .

A Fig. 7 mostra uma seqüência de aminoácidos de cada proteína de fusão de hGhrelin(8-28) preparada para determinar um proteína de fusão ideal para a incubação.

31/113

A Fig. 8Α mostra a diferença nos resultados da incubação entre as diferentes proteínas de fusão, e a Fig. 8B mostra a razão relativa entre a turbidez após o esmagamento das células e a turbidez antes do esmagamento das células de uma solução de cultura utilizando cada proteína de fusão (diferença devida às proteínas de fusão).

A Fig. 9 mostra resultados da estabilidade obtida para [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) . .

A Fig. 10 mostra resultados da estabilidade obtida para [Lys¹⁶'^19,20'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) .

MELHOR FORMA DE REALIZAR A INVENÇÃO

Na exposição da presente invenção, os termos utilizados na presente invenção são definidos como se segue:

Um aminoácido refere-se a um composto contendo um grupo amino e um grupo carboxil na. mesma molécula, e inclui todos os aminoácidos tais como um L-aminoácido, um Daminoácido, um α-aminoácido, um β-aminoácido, um γaminoácido, um aminoácido natural, um aminoácido não natural, um aminoácido sintético e semelhantes.

Um aminoácido natural refere-se aos vinte aminoácidos codificados por genes.

Um aminoácido não natural refere-se a um composto no qual um carbono α em um α-aminoácido é modificado com um substituinte arbitrário que não está presente em um aminoácido natural ou um D-aminoácido correspondente. Isto é, quando um α-aminoácido é expresso pela seguinte fórmula:

32/113 /80 ί’

Η,Ν—C—COOH

I

R” r

um exemplo de aminoácido não natural inclui um composto contendo substituintes arbitrários que não estão presentes em um aminoácido natural ou um D-aminoácido correspondente, ou um átomo de hidrogênio, como substituintes representados por R' e R, desde que ambos R' e R não sejam átomos de hidrogênio.

Um não aminoácido refere-se a um análogo de um aminoácido compreendendo um ou mais átomos selecionados entre o grupo consistindo de C, Η, 0, N e S, que não estão incluídos em um aminoácido natural e um aminoácido não natural. Inter alia, é preferível m composto apresentando um comprimento de cadeia molecular do comprimento de um peptídeo ou comprimento de um dipeptídeo. Por exemplo, NH₂-CH (CH₂OH) -CH₃, CH₃-CH (Rn)-COOH, CH₃-CH (Rn)-CH₃, todos estes apresentando o comprimento de um peptídeo, ou NH₂(CH₂) ₃CH (CH₂OH) -COOH, NH₂ (CH₂) 4-cooh, NH₂-C (CH₃) ₂-(CH₂) 3-COOH, NH₂-CH (CH₃) - (CH₂) ₂-CH (CH₃)-COOH, nh₂- (ch₂) ₃ch (CH₂OH) -ch₃, nh₂(CH₂) ₃CH(Rn)-CH₃, todos estes apresentando o comprimento de um dipeptídeo, estão incluídos em não aminoácido na presente invenção. Aqui, Rn representa uma cadeia lateral de um aminoácido natural. Exemplos de um resíduo de não aminoácido em um peptídeo inclui -NH-CH (CH₂OH)-CH₂-, —CH₂—CH(Rn)-CO-, -CH₂-CH(Rn)-CH₂-, todos estes apresentando o comprimento de um peptídeo, e -NH-(CH₂) ₃CH (CH₂OH)-CO-, -NH- (CH₂) 4-C0-, -NH-C(CH₃)₂- (CH₂)₃-C0-, -NH-CH (CH₃) - (CH₂) ₂-

33/113

CH(CH₃)-CO-, -NH-(CH₂) ₃CH (CH₂OH)-CH₂-, -NH-(CH₂) ₃CH (Rn)-CH₂-, todos estes apresentando o comprimento de um dipeptídeo, e pode haver um caso em que uma ligação com um aminoácido adjacente não seja uma ligação peptídica.

Um peptídeo ou um fragmento de peptídeo refere-se a um composto no qual uma pluralidade de aminoácidos estão ligados por uma ligação peptídica. Aqui, quando está contido um não aminoácido, há o caso em que uma ligação entre o não aminoácido e um aminoácido adjacente não é uma io ligação peptídica. No entanto, um composto, neste caso, é também coletivamente referido como um peptídeo ou fragmento de peptídeo.

Um fragmento de peptídeo protegido refere-se a um fragmento de um peptídeo no qual um ou mais substituintes reativos selecionados entre o grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil da cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido de um fragmento de peptídeo, que podem provocar uma reação secundária indesejável na preparação de um fragmento de peptídeo ou reação de condensação de fragmentos de peptídeo, são protegidos com um grupo protetor. Daqui em diante, é abreviado como fragmento de peptídeo protegido no presente relatório.

Um aminoácido ou não aminoácido modificado pode ser representado pela fórmula 1: -A(R)-, onde A representa um aminoácido ou um não aminoácido, e R representa um substituinte ligado à cadeia lateral de A, que é introduzido como modificação.

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Há o caso em que o substituinte R está ligado a um grupo formado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto ou um grupo carboxil na cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido, ou um caso ·. em que o substituinte R está diretamente ligado a um carbono a de um aminoácido ou um não ácido. 0 substituinte R pode ser uma cadeia lateral modificada de um aminoácido ou um não aminoácido.

Não há qualquer limitação quanto ao substituinte R. Exemplos de R incluem um grupo representado pela fórmula 2: - (CH₂)_n ^-P-Q (onde n representa um integrador de 1 a 10, P representa -CO-, -S0₂-, -C0-0-, -0-C0-, -0-, -CO-S-, -S-CO-, -CS-S-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-NH-CO-, -CS-NH-CS-, -S-S-, -CS-NH- ou -NH-CS-, e Q representa um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquil contendo de 1 a 35 átomos de carbono ou preferivelmente de 1 a 20 átomos de carbono, um grupo aril contendo de; 6 a 20 átomos de carbono ou um grupo aralquil contendo de 7 a 16 átomos de carbono), um grupo representado pela fórmula 3:.-P-Q fonde P e Q têm os mesmos significados conforme definidos acima), e um grupo representado pela fórmula 4: -Q (onde Q tem o mesmo significado conforme definido acima). Inter alia, quando o substituinte R está diretamente ligado a um carbono α de um aminoácido ou um não aminoácido, um exemplo preferível de R inclui um grupo no qual um grupo alquil contendo de 1 a 35 átomos de carbono ou preferivelmente de 1 a 20 átomos de carbono, um grupo aril contendo de 6 a 20 átomos de carbono ou um grupo aralquil contendo de 7 a 16 átomos de carbono, está ligado por meio de uma ligação selecionada entre o

35/113 grupo consistindo em ligação éster, éter, tioéster, tioéter, amido e carbamido, opcionalmente por meio de um grupo alquil contendo um ou mais átomos de carbono. Quando o substituinte R está diretamente ligado a um carbono α de um aminoácido ou um não aminoácido, o substituinte R não inclui um substituinte ligado a um carbono α em um aminoácido natural. Quando o substituinte R está ligado a um substituinte reativo em uma cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido, o substituinte R é preferivelmente um grupo representado pela fórmula 4: -Q, onde Q tem o mesmo significado conforme definido acima.

Aqui, o termo grupo alquil refere-se a um grupo alquil cíclico, de cadeia reta ou ramificada, e exemplos deste incluem um grupo metil, um grupo etil, um grupo propil, um grupo isopropil, um grupo ciclopropil, um grupo butil, um grupo sec-butil, um grupo isobutil, um grupo tert-butil, um grupo ciclobutil, um grupo pentil, um grupo isopentil, um grupo tert-pentil, um grupo neopentil·, um grupo ciclopentil, um grupo hexil, um grupo isohexil, um grupo ciclohexil, um grupo 3,3-dimetilbutil, um grupo heptil, um grupo 1-propilbutil, um grupo octil, um grupo nonil, um grupo decil, um grupo undecil, um grupo dodecil, um grupo tridecil, um grupo tetradecil, um grupo pentadecil e semelhantes. Estes podem parcialmente conter uma ligação carbono insaturada, e o número de carbonos é de 1 a 35, preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10.

Exemplos do grupo aril incluem um grupo fenil, um grupo 1- ou 2-naftil, um bifenil, um grupo 1-, 2- ou 9 antril, um grupo 1-, 2-, 3-, 4- ou 9-fenantril, um grupo acenaftil, um grupo antracenil, um grupo azulenil e

36/113 semelhantes. O número de carbonos é de 6 a 20, preferivelmente de 6 a 15.

Exemplos do grupo aralguil incluem grupo benzil, pmetoxibenzil, 3,4-dimetoxibenzil, o-nitrobenzil, pnitrobenzil, benzidril, tritil e semelhantes. 0 número de carbonos é preferivelmente de 7 a 16.

Adicionalmente, estes grupos alguil, aril e aralguil podem ter um substituinte gue normalmente é utilizado na técnica em uma posição e número guimicamente aceitáveis.

Como aminoácido ou não aminoácido modificado, o caso preferido é aguele em gue o aminoácido ou não aminoácido A é serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, um ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalônico, ácido aspártico, tirosina ou asparagina, e o substituinte R é um grupo representado pela fórmula 5: -(CH₂) _n ^_P^1_Q¹ (onde n tem o mesmo significado conforme definido acima; P¹ representa uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amido, uma ligação 0glicosídica ou uma ligação N-glicosídica; e Q¹ tem o mesmo significado gue aguele de Q mencionado anteriormente).

Especificamente, por exemplo, guando um aminoácido A é serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, uma vez gue o aminoácido apresenta um grupo hidroxi na cadeia lateral, exemplos do aminoácido modificado incluem serina, treonina, tirosina e oxiprolina em gue um grupo hidroxi na cadeia lateral está eterificado ou esterifiçado. Quando um aminoácido A é cisteína, uma vez gue o aminoácido apresenta um grupo mercapto na cadeia lateral, exemplos do aminoácido modificado incluem cisteína na gual um grupo /90

37/113 mercapto na cadeia lateral está tioesterifiçado ou dissulfetado. Quando um aminoácido A é lisina, arginina ou ácido 2,3-diaminopropiônico, uma vez que o aminoácido apresenta um grupo amino na cadeia lateral, exemplos do aminoácido modificado incluem lisina, arginina ou ácido 2,3-diaminopropiônico em que um grupo amino na cadeia lateral está amidado, tioamidado, carbamidado, tiocarbamidado ou alquilado. Quando um aminoácido A é histidina, triptofano, prolina ou oxiprolina, uma vez que o aminoácido apresenta um grupo amino na cadeia lateral, exemplos do aminoácido modificado incluem histidina, triptofano, prolina ou oxiprolina em que um grupo amino na cadeia lateral está amidado, tioamidado, iminoeterifiçado, iminotioeterifiçado ou alquilado.

Inter alia, é preferível como aminoácido ou não aminoácido modificado serina ou treonina em que um grupo hidroxi na cadeia lateral está esterifiçado.

Além disto, quando uma cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido A contém -OH, -SH, -NH- ou -NH2, exemplos mais preferidos do subs.tituinte R incluem um grupo formado pela acilação destes. Exemplos do grupo acil, desta forma, incluem um grupo formado pela remoção de um grupo hidroxi do composto ácido carboxílico orgânico, ácido sulfônico orgânico ou fosfato orgânico. Um exemplo mais específico de um ácido carboxílico orgânico inclui um ácido graxo, e o número de carbonos é preferivelmente de 2 a 35, mais preferivelmente de 6 a 18, o mais preferido de 8 a 16. Exemplos de ácido graxo incluem ácidos graxos saturados tais como ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido butírico, ácido capróico, ácido undecílico,

38/113 ácido palmítico, ácido decanóico, ácido nonadecanóico, ácido behenico, ácido montanóico, ácido laccérico, etc., e ácidos graxos insaturados tais como ácido acrílico, ácido oléico, ácido linolêico, ácido linolênico, ácido esteárico, etc. 0 ácido graxo insaturado pode ser monoeno ou polieno. Inter alia, os exemplos preferidos incluem ácido octanóico (preferivelmente ácido caprílico), ácido decanóico (preferivelmente ácido cáprico), ácido dodecanóico (preferivelmente ácido láurico), etc. Com relação ao composto ácido sulfônico orgânico ou ácido fosfórico orgânico, o número de carbonos é preferivelmente de 2 a 35.

A expressão peptídeo modificado ou proteína modificada refere-se a um peptídeo ou uma proteína contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos que foram submetidos às modificações mencionadas acima em um peptídeo ou uma proteína.

Grelina é um hormônio de crescimento secretagogo (GHS) endógeno, e apresenta atividade no aumento da concentração de íon cálcio em uma célula e atividade na indução da secreção de hormônio de crescimento. Inter alia, grelina derivada de humanos, rato, camundongo, porco, aves, enguia, vaca, cavalo, ovelha, rã, truta ou cão é preferida. Exemplos mais específicos de grelina incluem uma proteína que apresenta uma seqüência de aminoácidos descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs. : 1 a 21, e na qual um átomo de hidrogênio do grupo hidróxi da cadeia lateral da serina ou treonina na posição 3 é substituído com qualquer um entre um grupo n-octanoil, um grupo butanoil, um grupo hexanoil, um grupo decanoil ou um grupo

39/113 dodecanoil; ou uma proteína apresentando atividade no aumento da concentração de íon cálcio em uma célula, que apresenta uma seqüência de aminoácidos na qual de 1 a 10, preferivelmente 1 a poucos, aminoácidos são substituídos, adicionados ou eliminados em uma parte outra que não a seqüência do primeiro ao quarto aminoácido do terminal-N, em uma seqüência de aminoácidos descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs.:. 1 a 21, e na qual um átomo de hidrogênio do grupo hidroxi da cadeia lateral da serina ou treonina na posição 3 é substituída com qualquer um entre um grupo noctanoil, um grupo butanoil, um grupo hexanoil, um grupo decanoil ou um grupo dodecanoil.

Exemplos de derivado de grelina incluem um peptídeo apresentando atividade no aumento da concentração de íon cálcio em uma célula e contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Inter alia, um peptídeo apresentado pelo menos uma seqüência de entre o terminal amino e o 4° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 5° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 6° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 7° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 8° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 9° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 10° aminoácido, em uma seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO.: 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste sendo preferido. Adicionalmente, um peptídeo contendo uma seqüência de aminoácidos na qual pelo menos um aminoácido,

40/113 preferivelmente de 1 a 10 aminoácidos, mais preferivelmente de 1 a vários aminoácidos foram eliminados e/ou adicionados, em uma parte outra que não uma seqüência de entre o terminal amino e o 4° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 5° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 6° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 7° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 8° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 9° aminoácido, preferivelmente uma seqüência de entre o terminal amino e o 10° aminoácido, em uma seqüência de aminoácidos descrita nas SEQ ID NOs. : 1 a 21, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste sendo preferido. Inter alia, entre todos os peptideos ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes nas realizações mencionadas acima, o mais preferido é um aminoácido ou não aminoácido no qual os aminoácidos entre o terminal amino e o 2° ou 3° aminoácido, mais preferivelmente entre o terminal amino e o 3° aminoácido, são modificados.

Além disto, uma realização preferida inclui um peptídeo no qual uma seqüência de entre o terminal amino e o 4° aminoácido é substituída com um fragmento de peptídeo representado pela fórmula: A-B-C-D- (onde A representa um aminoácido, um não aminoácido ou não existe, B representa um aminoácido, um não aminoácido ou não existe, desde que uma cadeia molecular com o comprimento de A+B apresente o comprimento de um dipeptídeo, e C e D podem ser independentemente (a) um aminoácido modificado, (b) um aminoácido apresentando uma cadeia lateral hidrofóbica ou

41/113 (c) um aminoácido apresentando uma cadeia lateral básica), em uma seqüência de aminoácidos descrita nas SEQ ID NOs.: 1 a 21 ou em uma seqüência de aminoácidos na qual pelo menos um aminoácido, preferivelmente de 1 a 10 aminoácidos, mais preferivelmente de 1 a vários aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados na dita seqüência de aminoácidos, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Exemplos do aminoácido apresentando uma cadeia lateral hidrofóbica incluem leucina, valina, norleucina, homoleucina, homoisoleucina, naftilalaninas, triptofano, fenilalanina, cilcohexilalanina, etc. ou ácido N-metilamino ou ácido D-amino destes. Exemplos do aminoácido apresentando uma cadeia lateral básica incluem lisina, arginina ou histidina, ou ácido D-amino destes. Inter alia, o preferido é um aminoácido no qual C é um aminoácido que foi submetido à modificação mencionada acima, e D é um aminoácido apresentando uma cadeia lateral hidrofóbica na fórmula 6 mencionada acima.

No lugar do fragmento de peptídeo mencionado acima .20 representando pela fórmula 6: A-B-C-D-, pode ser utilizado um fragmento de peptídeo representado pela fórmula 7: A¹-B¹C¹-D¹- (onde A¹ representa um aminoácido ou um não aminoácido, preferivelmente um aminoácido . natural ou um ácido D-amino deste; pelo menos um de. B¹ ou C¹ é um aminoácido ou não aminoácido modificados e, no caso de apenas um de B¹ ou C¹ ser um aminoácido ou não aminoácido modificados, o outro é um aminoácido ou não aminoácido não modificados, preferivelmente um aminoácido natural ou um ácido D-amino deste; um comprimento de cadeia molecular de

A¹+B¹ é o comprimento de um dipeptídeo; e D¹ representa um

42/113 aminoácido contendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou um aminoácido contendo uma cadeia lateral básica).

Além disto, no lugar do fragmento de peptídeo mencionado acima representado pela fórmula 6: A-B-C-D-, pode ser utilizado um fragmento de peptídeo representado pela, fórmula 8: B²-C²-D²- (onde B.² é um não aminoácido apresentando o comprimento de um dipeptídeo, C² é um aminoácido ou não aminoácido modificados, e D² representa um aminoácido contendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou um aminoácido contendo cadeia lateral básica).

Adicionalmente, no que diz respeito ao derivado de grelina, o terminal amino ou o terminal carboxil de um peptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável na realização mencionada acima pode ser modificado. Especificamente, é preferível que um aminoácido básico seja ainda ligado a um terminal carboxil de um peptídeo ou sal farmaceuticamente aceitável deste na realização mencionada acima. Adicionalmente, é preferível que um terminal amino de um peptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável deste na realização mencionada acima seja modificado um grupo alquil saturado ou insaturado ou um grupo acil contendo um ou mais átomos de carbono e/ou OH de um grupo carboxil do terminal carboxil seja convertido para OZ ou NR2R3 (onde Z é um cátion farmaceuticamente aceitável ou um grupo alquil de baixo peso molecular ramificado ou não ramificado, e R2 e R3 cada independentemente representam um grupo selecionado do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio e um grupo alquil de baixo peso molecular de cadeia ramificada ou reta contendo de 1 a 6 átomos de carbono) . Além disto, estas modificações podem ser combinadas.

43/113

Um método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada compreende três etapas de (a) produzir um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados utilizandose uma resina de divagem em ácido fraco, (b) produzir separadamente um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, juntamente com o fragmento de peptídeo de (a), e (c) condensar os fragmentos de peptídeo protegidos produzidos em (a) e (b) .

Cada etapa na produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada será mais especificamente descrita abaixo.

Uma vez que um peptídeo modificado ou proteína modificada obtido pelo método de produção da presente invenção, ou um fragmento destes é peptídico, pode ser sintetizado por métodos de síntese conhecidos per se. Aqui, um peptídeo modificado ou proteína modificada, ou um fragmento destes inclui compostos nos quais estes grupos funcionais reativos estão protegidos com um grupo protetor. Um método de síntese de peptídeo pode ser, por exemplo, de acordo com tanto com um método de síntese em fase sólida quanto um método de síntese em fase líquida. Isto é, um peptídeo desejado pode ser produzido pela condensação de um peptídeo parcial ou aminoácidos que podem constituir um peptídeo modificado ou proteína modificada brutos, ou um fragmento destes, com uma parte remanescente, seguida da eliminação de um grupo protetor quando um produto contém um grupo protetor. Exemplos do método de condensação

44/113 conhecido e um método de eliminação de um grupo protetor incluem métodos descritos nas publicações 1 a 3 a seguir.

1. Nobuo Izumiya et al. Basic and Experiment of Peptide Synthesis publicada por Maruzen Co., Ltda. (1985);

2. Haruaki Yajima e Shunpei Sakakibara Biochemistry Experimental Course 1, Protein Chemistry IV, editada pela The Japanese Biochemical Society, publicada por Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltda. (1997);

3. Development of Medicament, Sequel, vol. 14, Peptide Synthesis supervisionada por Haruaki Yajima publicada por Hirokawashoten.

Uma etapa de produção de um fragmento de peptídeo contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados compreende a utilização de síntese química em fase sólida ou a extensão de uma cadeia peptídica em uma resina de divagem em ácido fraco. Mais especificamente, um fragmento de peptídeo protegido desejado pode ser obtido pela condensação de aminoácidos ou não aminoácidos, nos quais um grupo α-amino e grupos funcionais reativos na cadeia lateral que podem ..provocar uma reação secundária indesejável na preparação de um fragmento de peptídeo estão apropriadamente protegidos, em uma resina de divagem em ácido fraco de acordo com uma seqüência de um fragmento de peptídeo desejado de acordo com vários métodos de condensação conhecidos per se, e divagem do fragmento de peptídeo protegido produzido da resina de divagem em ácido fraco sem a eliminação de um grupo protetor.

A resina de divagem em ácido fraco refere-se a uma resina utilizada em síntese de peptídeo, que pode clivar um fragmento de peptídeo preparado em uma a partir da resina

45/113 sob condições ácidas fracas. Por exemplo, como resina de clivagem em ácido fraco, a preferida é uma resina que pode clivar, a partir da resina, um fragmento de peptídeo preparado na resina, em uma solução contendo um ou mais compostos compreendendo o grupo consistindo em ácidos carboxílicos tais como ácido acético, ácido trifluoracático e ácido fórmico, e álcoois fluorados tais como trifluoretanol e hexafluorisopropanol. Exemplos mais específicos da resina de clivagem em ácido fraco incluem resinas baseadas em tritil tais como resina de 2clorotritil, resina de tritil, resina de 4-metiltritil, resina de 4-metoxitritil, resina Rink Amide de Barlos, etc., e resina Sieber Amide e semelhantes.

Um grupo protetor para um grupo α-amino e um grupo funcional reativo em uma cadeia lateral (daqui em diante, chamado simplesmente de grupo funcional de cadeia lateral) não é particularmente limitado. Exemplos de grupo protetor para um grupo α-amino incluem um grupo alcoxicarbonil um substituinte tal como ttricloroetiloxicarbonil, tamiloxicarbonil, 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), metilsulfoniletoxicarbonil, tricloroetoxicarbonil, 2(trimetilsilil)etoxicarbonil e piridina-4-metoxicarbonil; um grupo cilcoalquiloxicarbonil· opcionalmente contendo um opcionalmente contendo butoxicarbonil (Boc), substituinte tal como um cicloheptiloxicarbonil ciclohexiloxicarbonil; um grupo aralquiloxicarbonil tal como benziloxicarbonil (Z) , p-metoxibenziloxicarbonil (pMZ), p-clorobenziloxicarbonil (Cl-Z), pbromobenziloxicarbonil (Br-Z), p-nitrobenziloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, 2-fenilisopropiloxicarbonil, p-

46/113 metilfenilisopropiloxicarbonil, pbifenilisopropiloxicarbonil, e 3,5-dimetoxi-a, adimetilbenziloxicarbonil; um grupo aralquil opcionalmente contendo um substituinte tal como benzil (Bzl), benzidril, e tritil; um grupo acil opcionalmente contendo um substituinte tal como trifluoracetil, ftaloil, formil, benzenosulfonil, p-toluenosulfonil (Ts), onitrofenilsulfenil, 2,4-dinitrofenilsulfenil, e 3-nitro-2piridilsulfenil; ditiasuccinoil, 2-nitrofeniltio, difenilfosfinil, difenilfosfinotioil, e dimetilfosfinotioil.

Um grupo hidroxi de serina e semelhantes pode ser protegido com um grupo alcanoil de baixo peso molecular apresentando de 1 a 6 átomos de carbono tal como um grupo acetil, um grupo aroil tal como um grupo benzoil, e um grupo derivado de ácido carbônico tal como um grupo benziloxicarbamoil, um grupo etoxicarbamoil, etc.

Um grupo guanidino de arginina pode ser protegido, por exemplo, com um grupo nitro, um grupo Z, um grupo Ts, um grupo p-metoxibenzenosulfonil (Mbs), um. grupo 4-metoxi2,6-dimetilbenzenosulfonil (Mds), um grupo 4-metoxi-2,3, 625 trimetilbenzenosulfonil sulfonil (Mts), pentametilbenzenosulfonil trimetoxibenzenosulfonil um grupo mesitileno-2grupo 2,3,4,5,6um grupo 2,4,6um grupo 2,2,5,7,830 (Mtr), um (Pme), (Mtb), pentametilcromano-6-sulfonil (Pmc), ou um grupo 2,2,4,6,7pentametil-dihidrobenzofurano-5 sulfonil (Pbf).

Em adição, um grupo mercapto de cisteína pode ser protegido, por exemplo, com um grupo tritil, um grupo acetamidometil (Acm), um grupo tert-butil, um grupo benzil,

900

47/113 um grupo p-metilbenzil, um grupo p-metoxibenzil, um grupo 3-nitro-2-piridinosulfenil, ou um grupo butiltio.

Como grupo protetor para um grupo imidazolil de histidina, são utilizados, por exemplo, um grupo Boc, um grupo tritil (Trt), um grupo Ts, um grupo 4-metoxi-2,3,6trimetilbenzenosulfonil, um grupo 2,4-dinitrofenol (DNP), um grupo benziloximetil (Bom), um grupo t-butoximetil (Bum), e um grupo Fmoc. Em adição, um grupo indolil de triptofano pode ser protegido, por exemplo, com um grupo formil, um grupo Z, um grupo 2,4-diclorobenziloxicarbonil, um grupo tricloroetiloxicarbonil, um grupo 4-metoxi-2,3,6trimetilbenzenosulfonil, ou um grupo 2,4,6trimetoxibenzenosulfonil.

Uma reação de condensação por síntese em fase sólida pode ser realizada por qualquer método de alongamento passo-a-passo de condensação de aminoácidos um a um em uma resina de clivagem em ácido fraco, uma condensação de fragmento que consiste na condensação de um fragmento de peptídeo composto de dois ou mais aminoácidos, e uma combinação destes. 0 fragmento^- de peptídeo composto de dois ou mais aminoácidos pode ser produzido a partir dos respectivos aminoácidos por meio da síntese em fase líquida ou sólida convencional.

Em primeiro, um aminoácido ou um não aminoácido apresentando o grupo α-amino mencionado acima e um grupo funcional apropriadamente protegido na cadeia lateral (daqui em diante abreviado como aminoácido protegido, a não ser que de outra forma indicado) são ativados, e uma resina de clivagem em ácido fraco é condensada com o aminoácido protegido ativado. Na condensação, um solvente utilizado

48/113 para a ativação de um aminoácido protegido ou condensação com a resina de clivagem em ácido fraco é apropriadamente selecionado entre os solventes conhecidos em um método de condensação de peptídeo. Por exemplo, amidas ácidas tais como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, e Nmetilpirrolidona; hidrocarbonetos .halogenados tais como cloreto de metila, e clorofórmio; álcoois tais como trifluoretanol e fenol; sulfóxidos tais como dimetilsulfóxido; ésteres tais como piridina, dioxano, e tetrahidrofurano; nitrilas tais como acetonitrila, e propionitrila; ésteres tais como acetato de metila, e acetato de etila, e uma mistura apropriada destes são utilizados. A temperatura reacional pode ser a mesma que a temperatura reacional de uma reação de formação de ligação peptídica, e é usualmente apropriadamente selecionada na faixa que varia entre cerca de -20°C a 50°C. Um aminoácido protegido ativado é usualmente utilizado em uma quantidade em excesso de 1 a 4 vezes. Quando a condensação é considerada insuficiente como resultado de um /. teste utilizando uma reação de ninidrina, uma condensação suficiente pode ser realizada pela repetição de reação de condensação sem eliminação de um grupo protetor. Quando uma. condensação suficiente não é obtida mesmo quando a reação é repetida, é possível que não haja qualquer influência em uma reação subsequente pela acetilação de um aminoácido protegido não reagido utilizando-se anidrido acético ou acetilimidazol.

Então, um aminoácido protegido é condensado com um aminoácido protegido condensado com uma resina de clivagem em ácido fraco de acordo com uma seqüência desejada. Uma

49/113 c5oâ reação de condensação de cada aminoácido protegido pode ser realizada por um método convencional tal como um método de ativação de terminal-C e um método de acoplamento utilizando um reagente de acoplamento. 0 método de ativação de terminal-C inclui um método de éster ativo, e um método de anidrido ácido simétrico. Exemplos de um tal éster ativo utilizado no método de éster ativo incluem éster alquilicos tais como éster cianometílico; ésteres fenílicos tais como éster tiofenílico, éster pnitrotiofenílico, éster p-metanosulfonilfenílico, éster pnitrofenílico, éster 2,4-dinitrofenílico, éster 2,4,6triclorofenílico, e éster pentaclorofenílico; imidoésteres de ácido dicarboxílico tais como 1-hidroxisuccinimida (HOSu), imidoéster de ácido N-hidroxiftálico, e imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB);

derivados de hidroxilamina . tais como éster 8hidroquinolínico, éster N-hidroxipiperidínico, e éster 2hidroxipiridínico.

Exemplos do método de acoplamento utilizando um agente de acoplamento incluem um método .de carbodiimida utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC), e uma carbodiimida solúvel em água (WSC); um método DCC-aditivo; .um método de carbonildimidazol (CDI); um método utilizando um sal isoxazol tal como um reagente de Woodward (N-etil-5fenilisoxazol-3'-sulfonato) e trifluorborato de N-etil-2'hidroxibenzoisoxazol, l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2dihidroxiquinolina (EEDQ), l-etoxicarbonil-2-isobutoxi-l,2dihidroquinolina (IIDQ), hexafluorfosfato de benzotriazol1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorfosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU),

303

50/113 tetrafluorborato de O-benzotriazol-N,Ν,Ν',N'-tetrametil-

uronio	(TBTU),	ou difenilfosforilazida	(DPPA).
A	carbodiimida solúvel	em água	(WSC)	utilizada no
método	de	carbodiimida	inclui	EDC	(l-etil-3-(3-

dimetilaminopropil)carbodiimida, N-ciclohexil-N'-morfolinoetilcarbodiimida, e N-ciclohexil-N(N,N-dietilamino) ciclohexilcarbodiimida. A carbodiimida solúvel em água pode ser um sal tal como hidrocloreto.

Em adição, o método DCC-aditivo inclui um método de DCC-HOSu, um método de DCC-HOBt (1-hidroxibenzotriazol), um método de DCC-HONB, um método, de DCC-etil-2-hidroxiimino-2cianoacetato, um método de WSC-HOSu, e um método de WSCHOBt.

Uma reação de condensação preferida inclui um método de carbodiimida, um método de éster ativo, um método DCCaditivo. Um método de condensação adicionalmente preferido inclui um método de prevenção de racemização tal como um método de éster ativo, e um método DCC-aditivo; (por exemplo, método de DCC-HOBt, método de DCC-HOSu, método de WSC-HOSu, método de WSC-HOBt, etc:.).

Um fragmento de peptídeo protegido desejado contém um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados. Como método de inserção de um aminoácido ou ..não aminoácido modificado em uma cadeia peptídica existem os dois métodos a seguir.

Como primeiro método, há um método de modificação especifica de uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido desejado antes, e introdução de tal aminoácido ou não aminoácido (daqui em diante referida como um aminoácido ou não aminoácido com modificação resíduo

51/113 específica) no estágio de extensão de uma cadeia peptídica. Mais especificamente, um aminoácido ou não aminoácido com modificação resíduo específica (incluindo compostos dos quais um grupo ct-amino está protegido) pode ser sintetizado pelo método de síntese conhecido per se. Exemplos de um tal método incluem esterificação, amidação, eterificação, acilação, e alquilação, e estes são realizados pelos métodos bem conhecidos de um especialista na técnica. Além disto, esse pode ser introduzido em uma cadeia peptídica por qualquer um dos materiais de condensação mencionados acima. Neste caso, a eliminação de um fragmento de peptídeo protegido da resina de divagem em ácido fraco é apropriadamente selecionada a partir de condições descritas posteriormente e, preferivelmente, a eliminação é apropriadamente selecionada a partir de condições sob as quais um substituinte R de uma cadeia . lateral de um aminoácido ou não aminoácido com modificação resíduo específica desejado não é eliminado.

Como segundo método, há um método de preparação de um fragmento de peptídeo contendo uma seqüência desejada compreendendo um aminoácido ou/e um não aminoácido pelo método mencionado acima e, posteriormente, modificando especificamente uma cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido desejado (daqui em diante referida como uma modificação resíduo específica). 0 método de modificação resíduo específica não limitado em particular, no entanto o método conhecido pode ser utilizado. Exemplos do método incluem esterificação, amidação, eterificação, acilação, e alquilação, e estas são realizadas pelos métodos bem conhecidos por um especialista na técnica. Além disto, um

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3Qd método de modificação por fosforilação inclui métodos descritos em Tetrahedron Letters, vol. 41, pg. 4457-4461, 2000 ou Biopolymers, vol. 60, pg. 3-31, 2001. Um método de modificação com açúcar inclui métodos descritos em J. Peptide Protein Res., vol. 42, pg. 165-170, 1993, Science, vol. 291, pg. 2344-2350,. 2001, ou Science, vol. 291, pg. 2357-2364, 2001.

Um tal método pode ser classificado nos dois métodos a seguir. Isto é, quando um grupo funcional de uma cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido a ser modificado resíduo especificamente é protegido com um grupo protetor, o método pode ser grosseiramente classificado no caso em que, pela desproteção de tal grupo protetor, um fragmento de peptídeo protegido é clivado da resina de clivagem em ácido fraco, e o caso em que pela desproteção de tal grupo protetor, um fragmento de peptídeo protegido não é clivado da resina. No caso anterior, um fragmento de peptídeo desejado pode ser obtido protegendo-se um grupo carboxil terminal-C com um grupo protetor, realizando a modificação . resíduo específica pelo método sintético conhecido per se, após o que, desprotegendo-se o grupo carboxil terminal-C selecionando-se apropriadamente um método entre os métodos descritos anteriormente. Neste último caso, a modificação resíduo específica pode ser realizada em uma resina pelo método sintético conhecido per se e, após isto, um fragmento de peptídeo desejado pode ser retirado da resina selecionando-se apropriadamente um método entre os métodos descritos anteriormente.

Na presente invenção, um método mais preferido é aquele no qual um fragmento de peptídeo contendo uma

53/113 seqüência desejada compreendendo um aminoácido ou/e um não aminoácido é preparado pelo método mencionado acima, após o que, quando um grupo funcional reativo de uma cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido a ser modificado resíduo especificamente é protegido com um grupo protetor, o grupo protetor é desprotegido, ..a modificação resíduo específica é realizada em uma resina pelo método sintético conhecido per se e, é realizada a retirada do fragmento de peptídeo protegido da resina de clivagem em ácido fraco descrita anteriormente e, opcionalmente, a desproteção de cada grupo protetor.

No método mencionado acima, um grupo protetor para um aminoácido ou um não aminoácido a ser modificado resíduo especificamente não é particularmente limitado desde que o fragmento de peptídeo protegido não seja clivado da resina pela desproteção de tal grupo protetor, mas exemplos preferidos incluem grupos silil tais como um grupo tbutildimetilsilil, e um grupo t-butildifenilsilil. Pela desproteção de tal grupo protetor, é utilizado um reagente que pode desproteger especificamente um grupo protetor para um grupo funcional da cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido a ser modificado resíduo especificamente sem clivagem de um fragmento de peptídeo protegido da resina. Tal reagente é apropriadamente selecionado dependendo do tipo da resina de clivagem em ácido fraco e do grupo protetor, e quando o grupo protetor é um grupo silil, fluoreto de amônia quaternária é preferivelmente utilizado, e fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF) é mais preferivelmente utilizado.

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Se um grupo protetor é selecionado como descrito acima, quando um grupo amino terminal-N é desprotegido de maneira a efetuar a condensação para a extensão de um peptídeo, um grupo protetor para um grupo funcional de cadeia lateral de cada aminoácido protegido não é eliminado e um fragmento de peptídeo protegido não é clivado da resina de clivagem em ácido fraco e, quando uma resina de clivagem em ácido fraco é eliminada da ligação peptídeoresina, um grupo protetor para um grupo funcional de cadeia lateral de cada resíduo de aminoácido não é eliminado. Adicionalmente, devido a isto, pode ser suprimida a produção de um subproduto. Por esta razão, um fragmento de peptídeo no qual um grupo funcional de cadeia lateral está protegido com um grupo protetor pode ser obtido de forma simples com alta pureza e alto rendimento. Uma vez que este fragmento de peptídeo apresenta um grupo funcional de cadeia lateral protegido, não é necessário introduzir mais um grupo protetor, e o fragmento pode ser. preferivelmente utilizado como um material de partida para a preparação de um peptídeo modificado ou proteína modificada desejado por um método em fase líquida na etapa seguinte.

Finalmente, um fragmento de peptídeo protegido assim obtido é clivado da resina de clivagem em ácido fraco. Logo após, a clivagem é realizada em condições de ácido fraco sob as quais um grupo protetor em um fragmento de peptídeo protegido, isto é, um grupo protetor para um grupo funcional de cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido não é desprotegido. Condições de ácido fraco incluem condições sob as quais uma resina de clivagem em ácido fraco é suspensa em uma solução contendo ácidos

306

55/113 carboxílicos tais como ácido acético, ácido trifluoracético e ácido fórmico, e/ou álcoois fluorados tais como trifluoretanol e hexafluorisopropanol. Especificamente, o fragmento de peptídeo assim obtido pode ser clivado da resina de clivagem em ácido fraco agitando-se a solução mencionada acima por um tempo desejado, preferivelmente de cerca de 5 minutos a 4 horas, mais preferivelmente de cerca de 10 minutos a 2 horas. Mais especificamente, a clivagem pode ser de acordo com o método conhecido descrito em Barlos et al. (Tetrahedron Lett., vol. 30, pg. 3947, 1989), por exemplo, um método em gue se suspende em um solvente tal como ácido trif luoracético/diclo.rometano a 0,5%, ou ácido acético/trifluoretanol/diclorometano = 1/2/7, ou ácido acético/trifluoretanol/diclorometano = 2/2/6.

Na presente invenção, um fragmento de peptídeo contendo um aminoácido ou não aminoácido modificados pode também ser preparado pela clivagem de um fragmento de peptídeo protegido de uma resina ;de clivagem em ácido fraco sem a introdução de um aminoácido ou não aminoácido modificados,, em uma cadeia peptídica, seguida por uma modificação resíduo específica de um resíduo de aminoácido específico. 0 método de modificação resíduo específica é como descrito acima.

O método de produção mencionado acima pode ser aplicado a um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados, sem limitação. Inter alia, é preferível gue o método mencionado acima seja utilizado na preparação de um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais <509

56/113 aminoácidos ou não aminoácidos modificados representados pela fórmula 9 a seguir, ou um seu sal.

Isto é, é um peptideo representado pela fórmula 9: (RI) _n-Gly-Ser(XI)-A(R)-Phe-Leu-Ser(X2)-Pro-OR2 (onde -A(R)é o aminoácido ou não aminoácido mencionado acima que foi submetido à modificação. Inter alia, A é preferivelmente serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2-aminomalônico, ácido aspártico,

tirosina ou	asparagina,	R é	preferivelmente	um	grupo
modificador	tal como um	grupo	acil, um açúcar,	um	grupo
fosfato, um	grupo sulfato, um grupo alquil,	um	grupo

aralguil, e um grupo aroil, e é preferível que R seja ligado a um substituinte reativo de uma cadeia lateral de A por meio de uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amido, uma ligação O-glicosídica ou uma ligação N-glicosídica.

Rl representa um grupo alcoxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte tal como t-butoxicarbonil (Boc), tricloroetiloxicarbonil, t-amiloxicarbonil, 9fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), metilsulfoniletoxicarbonil, tricloroetoxicarbonil, 2-(trimetilsilil)etoxicarbonil e piridina-4-metoxicarbonil; um grupo cicloalquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte tal como cicloheptiloxicarbonil, e ciclohexiloxicarbonil; um grupo aralquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte tal como benziloxicarbonil (Z) , p-metoxibenziloxicarbonil (pMZ), p-clorobenziloxicarbonil (Cl-Z), pbromobenziloxicarbonil (Br-Z), p-nitrobenziloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, 2-fenilisopropiloxicarbonil, p57/113 áio metilfenilisopropiloxicarbonil, p-bifenilisopropiloxicarbonil e 3,5-dimetoxi-a,α-dimetilbenziloxicarbonil; um grupo aralquil opcionalmente contendo um substituinte tal como benzil (Bzl), benzidril, e tritil; um grupo acil tal como trifluoracetil, ftaloil, formil, benzenosulfonil, ptoluenosulfonil (Ts) , o-nitrofenilsulfenil, 2,4dinitrofenilsulfenil, e 3-nitro-2-piridilsulfenil; ditiasuccinoil, 2-nitrofeniltio, difenilfosfinil, difenilfosfinotioil, ou dimetilfosfinotioil, n é 1 ou 2,

XI e X2 representam um grupo protetor para um grupo hidroxi de uma cadeia lateral de serina, e representam um grupo alcanoil de baixo peso molecular contendo de 1 a 6 átomos de carbono tal como um grupo acetil; um grupo aroil tal como um grupo benzoil; um grupo derivado de ácido carboxílico.tal como um grupo benziloxicarbonil e um grupo etoxicarbonil, ou tal como um grupo adequado para eterificação. que ligue o substituinte R mencionado acima à cadeia lateral por meio de uma ligação éter, representa um grupo t-butil, um grupo benzil, um grupo tetrahidropiranil, um grupo tritil, ou um grupo silil tal como um grupo tbutildimetilsilil,

R2 representa um grupo protetor ou a ausência de um grupo protetor e, quando há um grupo protetor, representa um grupo éster alquílico (por exemplo, um grupo éster alquílico de cadeia reta, ramificada ou cíclico tal como éster metílico, éster etílico, éster propílico, éster butílico, éster t-butílico, éster ciclopentílico, éster ciclohexílico, éster cicloheptílico, éster ciclooctílico, e éster 2-adamantílico), um grupo éster aralquílico (por

58/113 exemplo, um grupo éster benzílico, éster 4-nitrobenzílico, éster 4-metoxibenzílico, éster 4-clorobenzílico, éster benzidrílico), um grupo éster fenacílico, um grupo benziloxicarbonilhidrazida, um grupo tbutoxicarbonilhidrazida, ou um grupo tritilhidrazida, ou um sal deste.

Na fórmula 9, RI é preferivelmente um grupo Boc, um grupo. Z, um grupo pMZ ou um grupo Fmoc, e exemplos de grupo protetor representado por XI e X2 incluem preferivelmente um grupo t-butil e um grupo 34-benzil, mais preferivelmente um grupo t-butil. R2 é preferivelmente hidrogênio ou um grupo tioéster.

Adicionalmente, o método de produção mencionado acima pode ser adequadamente utilizado pela preparação de grelina, preferivelmente grelina humana, de rato, camundongo, suína, de frango, de enguia, bovina, equina, ovina, de rã, de truta ou canina, ou um derivado de grelina. Em adição, o método de produção mencionado acima é adequadamente utilizado na preparação de uma parte contendo um aminoácido ou não aminoácido modificados na grelina ou derivado de grelina. As estruturas das grelinas dos respectivos organismos são descritas na Tabela 1.

Mais especificamente, o método de produção mencionado acima é útil na preparação de um fragmento de peptídeo (a) que compreende uma seqüência de pelo menos dos primeiro ao quarto aminoácidos do terminal-N em uma seqüência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs.: 1 a 21, preferivelmente compreende uma seqüência dos primeiro ao quinto aminoácidos do terminal-N na dita seqüência de aminoácidos, ou compreende uma seqüência dos primeiro ao

59/113 sétimo aminoácidos do terminal-N na dita seqüência de aminoácidos, (b) no qual um grupo hidroxi da cadeia lateral de serina ou treonina que é o terceiro aminoácido do terminal-N está acilado, preferivelmente acilado com um grupo acil saturado ou insaturado contendo um número de carbonos de 2 a 35, preferivelmente de 6 a 18, e (c) no qual um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável pela preparação de um fragmento de peptídeo, selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um aminoácido, preferivelmente um grupo hidroxi e um grupo amino são protegidos com um grupo protetor.

Na presente invenção, um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados é preparado separado do fragmento de peptídeo protegido mencionado acima contendo um aminoácido ou não aminoácido modificados.

Um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos que tenham sido submetidos a modificações tais como acilação, glicosilação, e fosforilação, de um peptídeo ou proteína na presente invenção pode ser produzido pela técnica de recombinação genética ou método enzimático conhecidos per se. Por exemplo, pode ser preparado por um método compreendendo uma etapa de cultivo de uma célula transformada com um vetor de expressão contendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos do fragmento de peptídeo mencionado acima (daqui em diante

60/113 referido como peptídeo desejado), coleta do peptídeo desejado da cultura, e uma etapa de proteção, com um grupo protetor, de um grupo funcional que pode provocar uma reação secundária indesejada, entre os grupos funcionais de cadeia lateral do peptídeo desejado obtido na etapa mencionada acima. Um método para/ a construção de um vetor de expressão pode ser realizado pelo método convencional na técnica. Para a construção de um vetor de expressão, como outros elementos necessários para uma alta expressão do peptídeo desejado, por exemplo, podem também ser apropriadamente utilizados um promotor, um terminador, e um sítio de abertura, aqueles já conhecidos no método convencional. Uma célula hospedeira que é transformada com o vetor de expressão não é particularmente limitada, no entanto uma célula hospedeira pode ser utilizada selecionando-se apropriadamente uma célula que possa adequadamente expressar uma seqüência de nucleotídeos que codifica o peptídeo desejado, entre uma célula procariótica e uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula microbiana tal como Escherichia coli, levedura e uma célula animal que já tenha sido utilizada no método convencional. A proteção do grupo funcional da cadeia lateral do peptídeo desejado pode ser realizada pelo método mencionado acima.

Um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados pode ser produzido por um método compreendendo:

etapa (1) : (a) uma etapa de cultivo de uma célula transformada com um vetor de expressão contendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão opcionalmente com um peptídeo de proteção adicionado

61/113 ao peptídeo desejado por meio de uma seqüência ligante, e coleta da proteína de fusão da cultura;

etapa (2) : uma etapa de divagem e separação de um peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado da proteína de fusão obtida na etapa (1) , seguidas de purificação opcional; e etapa (3): uma etapa de proteção, com um grupo prote.tor, de um grupo funcional, que pode provocar uma reação secundária indesejável, entre os grupos funcionais da cadeia lateral do peptídeo desejado obtido na etapa (2).

É utilizado um peptídeo de proteção com o propósito de suprimir a degradação do peptídeo desejado por uma enzima em uma célula hospedeira, e tal peptídeo não é particularmente limitado desde que o propósito seja atingido, no entanto pode ser utilizado um fragmento contendo uma seqüência de aminoácidos relativa à βgalactosidase derivada de Escherichia coli. A seqüência de aminoácidos relativa à dita enzima é conhecida de um especialista na técnica, e um fragmento de peptídeo derivado de β-galactosidase é amplamente utilizado como peptídeo de proteção em um método de proteína de fusão por um especialista na técnica.

Uma seqüência ligante é uma seqüência que é inserida entre um peptídeo de proteção e o peptídeo desejado quando a divagem e separação de um peptídeo de proteção do peptídeo desejado não são realizadas apropriadamente, por exemplo, quando não há qualquer enzima adequada para a divagem e separação de um peptídeo de proteção do peptídeo desejado na etapa (2). Por esta razão, a seqüência do dito peptídeo de proteção pode ser apropriadamente selecionada

62/113 terminal-C de clorosuccinimida.

de tal forma que a clivagem e separação de uma seqüência ligante do peptídeo desejado sejam realizadas apropriadamente na etapa (2).

A clivagem e separação de um peptídeo de proteção e, opcionalmente, da seqüência ligante e do peptídeo desejado podem ser realizadas por um método enzimático e/ou químico.

Como métodos de clivagem enzimático e químico, o método descrito em Methods in ENZYMOLOGY, vol. 185, Gene Expression Technology editado por David V. Goeddel, publicado pela ACADEMIC PRESS, INC. pode também ser utilizado.

Exemplos de método de clivagem químico incluem um método para clivar uma extremidade terminal-C de metionina com brometo de cianogênio (D.V. Goeddel et al., Proc. Natl. Sei. USA, vol. 76, pg. 106-110, 1979), um método para clivar entre uma seqüência -Asp-Pro- com ácido fórmico (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 40, pg. 1173, 1970), um método para clivar entre uma seqüência -Asn-Gly- com hidroxilamina, e um método para clivar uma extremidade tripsina com BNPS-skatole ou > NPor exemplo, quando metionina não está contida em uma seqüência de aminoácidos relacionada ao peptídeo desejado, a clivagem em uma região com sítio de clivagem pode ser realizada quimicamente por tratamento com brometo de cianogênio pela introdução de metionina em uma extremidade de uma região com sítio de clivagem adjacente ao peptídeo desejado.

Adicionalmente, como método de clivagem enzimático, uma região com sítio de clivagem que pode ser especificamente reconhecida como um substrato por uma

63/113 enzima utilizada para tratamento de clivagem pode ser estabelecida. Exemplos destes incluem um método para a clivagem de uma ligação peptídica em um centro de um par de aminoácidos básicos de arginina-arginina, lisina-lisina, arginina-lisina e lisina-arginina, ou uma ligação peptídica em. um centro de um par de aminoácidos de argininametionina, arginina-alanina ou arginina-valina com uma protease OmpT de Escherichia coli (Sugimura, K. e Nishihara, T.J., Bacteriol. 170:5625-5632, 1988), um método para a clivagem entre uma seqüência -X-Gly- em uma seqüência X-Gly ou Pro-X-Gly-Pro com colagenase (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 81, pg. 4692-4696, 1984), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Lys em uma seqüência -Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NO.: 22) com enteroquinase, um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Arg em uma seqüência -Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NO. : 23) com fator de coagulação sangüínea Xa (JP-A n° 61-135591), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Arg em uma seqüência -Gly-Pro-Arg- com trombina (JP-A n° 62-135500), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de -Arg- com tripsina ou clostripaína, um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Arg ou Lys com endoprotease Arg-C (Nature, vol. 285, pg. 456-461, 1980), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de uma seqüência Lys-Arg, ArgArg ou Pro-Arg com uma protease Kex2 de Saccharomyces cerevisae e um derivado desta (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 144, pg. 807-814, 1987, JP-A n° 1-199578, JPA n° 10-229884), um método a clivagem de uma extremidade terminal-C de Lis com lisilendopeptidase ou endopeptidase

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Lys-C (JP-A n° 61-275222), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Asp ou Glu com protease V8 de Staphylococcus aureus (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 69, pg. 3506-3509, 1972), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de uma seqüência -Phe-Arg- com calicreína (JP-A n° 62-248489), um método para a clivagem entre Leu-Leu de uma seqüência -Pro-Phe-His-Leu-Val-Tyr(SEQ.ID NO.: 24) com renina (JP-A n° 60-262595), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de uma seqüência -Glu-Gly-Arg- com uroquinase (JP-A n° 2-100685), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de uma seqüência Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO.: 25) com enteropeptidase (Biotechnology, vol. 6, pg. 1204-1210, 1988), um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de poli-Gly com lisostafina (JP-A n° 1-160496), e um método para a clivagem de uma extremidade terminal-C de Lys-Arg, Arg-Arg ou Pro-Arg com Kluveromyces lactis (JPA n° 1-124390).

O vetor de expressão, a célula, hospedeira e a proteção de um grupo funcional de cadeia lateral de um peptídeo desejado no presente método são como descritos para o método mencionado acima.

Adicionalmente, como método para a produção de um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos que foram submetidos a modificações utilizando pode ser utilizado um método de recombinação genética ou um método enzimático, o método descrito na publicação internacional n° WO 99/38984.

Quando um fragmento de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados é um fragmento

65/113 de peptídeo não contendo aminoácidos ou não aminoácidos que foram submetidos a modificações de grelina ou derivado de grelina (daqui em diante referido como fragmento de grelina (componente não modificado)), um método para a produção do fragmento por um método de recombinação genética e um método enzimático é descrito na publicação internacional n° WO 01/07475.

Adicionalmente, um fragmento de grelina (componente não modificado) pode também ser produzido pela utilização de um método enzimático em duas etapas com uma protease OmpT ou um derivado desta, bem como uma protease Kex2 ou um derivado desta, adotando-se uma proteína protegida e uma seqüência ligante utilizada para a produção de glucagons como peptídeo-1 descrito na publicação internacional n° WO 00/52193. Neste método, uma vez que uma protease OmpT endógena de Escherichia coli que é um hospedeiro pode ser utilizada, não é necessário preparar uma enzima separadamente. 0 derivado de uma protease OmpT ou uma •protease Kex2 não é particularmente limitado desde que apresente a mesma atividade de uma protease OmpT ou de uma protease Kex2. Exemplos dos derivados de protease OmpT incluem enzimas pertencendo à família omptin, representantes da qual são as protease OmpT de Escherichia coli, e protease pgtE de Salmonella, e·. peptídeos parciais contendo uma parte ativa de uma protease OmpT. Exemplos de derivados de protease Kex2 incluem aqueles descritos no documento JP-A n° 10-229884, e enzimas pertencendo à família Kex2, representantes da qual são furina e PC1/3.

No presente método, um fragmento de grelina (componente não modificado), inter alia, um fragmento de

66/113 grelina (8-28), em particular, um fragmento de grelina humana (8-28) pode ser efetivamente obtido pelo método de tratamento enzimático em duas etapas utilizando uma protease OmpT e uma protease Kex2, utilizando-se, no lugar de uma seqüência ligante

EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (SEQ ID NO.: 26) descrita na publicação internacional n° WO 00/52193, uma seqüência EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (SEQ ID NO.: 27) na qual o 35° resíduo de prolina é substituído com um resíduo de arginina na seqüência mencionada acima, como uma seqüência ligante, conforme mostrado no Exemplo 13. Embora um sítio de reconhecimento de clivagem seja produzido separadamente em adição ao sítio de reconhecimento de clivagem de uma protease OmpT na seqüência ligante recentemente descoberta descrita na SEQ ID NO.: 27, a clivagem ocorre precisamente apenas no sítio desejado (ver Exemplo 3).

Além disto, pela purificação e armazenamento de um fragmento de peptídeo protegido (componente não modificado), pelo ajuste do pH de uma solução utilizada para a purificação ou armazenamento para de 4 a 8, pode-se evitar a eliminação de um grupo protetor. Por esta razão, pela supressão da eliminação de um grupo protetor, um peptídeo modificado ou proteína modificada com alta pureza pode ser produzido com alto rendimento de recuperação. Como solução utilizada para purificação ou armazenamento, é preferível uma solução aquosa. Exemplos de tal solução incluem água, preferivelmente, água de ultrafiltração e uma solução de acetato de sódio. Como óbvio a partir do Exemplo 15, no qual foi examinada a estabilidade de um

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SOO fragmento de grelina humana protegido (8-28) em uma solução aquosa, a estabilidade de um fragmento de peptídeo protegido com um grupo Boc é diferente dependendo do status de uma solução aquosa e, em particular, do status de uma solução aquosa a um pH de 2 ou menos, foi reconhecida claramente a eliminação do presente grupo protetor e, desta forma, quando o grupo Boc é utilizado como grupo protetor, é preferível ajustar o pH da solução entre 4 e 8 pela purificação oi armazenamento.

Então, na presente invenção, são condensados (a) o fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados e (b) o fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados obtidos acima, opcionalmente seguido pela desproteção de um grupo protetor para um grupo funcional de cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido.

É preferível que a reação, de condensação acima seja realizada por um método em fase líquida. Adicionalmente, na reação para condensar os fragmentos de peptídeo (a) e (b) por um método em fase líquida, um grupo funcional de cadeia lateral de cada aminoácido ou não aminoácido dos fragmentos de peptídeo é usualmente protegido com um grupo protetor. Exemplos do grupo protetor incluem aqueles exemplificados acima como grupo protetor para cada grupo funcional. Exemplos de um grupo protetor preferido incluem grupos protetores tais que um grupo protetor para os fragmentos de peptídeo protegidos (a) e (b) pode ser eliminado sob a mesma condição de eliminação. Neste caso, uma vez que uma resina de clivagem em ácido fraco tenha

68/113 sido já clivada, não é necessário considerar-se as condições de clivagem para a resina de clivagem em ácido fraco. Como um grupo protetor para um grupo funcional de cadeia lateral neste caso, é preferido um grupo protetor que seja eliminado sob condições de eliminação para um grupo amino terminal-N.

Na reação para condensar os fragmentos de peptídeo protegidos (a) e (b) por. um método de fase líquida, os reagentes e condições utilizados para a condensação são apropriadamente selecionados daqueles descritos em uma reação de condensação de aminoácido conforme descrita acima. Preferivelmente, são selecionados entre métodos que dificilmente produzem impurezas tais como isômeros racêmicos de um peptídeo ou uma proteína como subproduto. Em particular, exemplos preferíveis de um reagente utilizado na condensação (agente de condensação) incluem hexafluorfosfato de 2-(1-hidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3tetrametiluronio (HBTU), tetrafluorborato de 2—(l— hidrobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), difenilfosforilazida (DPPA),.. difenilf osf orocianidato (DEPC), diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) e l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Inter .alia, é preferível que o agente de condensação seja diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), e a condensação de um fragmento de peptídeo utilizando o agente de condensação seja realizada na presença de 1hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxisuccinimida (HOSu) ou 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-benzotriazina (HOOBt).

âM

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No produto de reação condensado, um grupo protetor para uma cadeia lateral de um aminoácido ou um não aminoácido pode ser apropriadamente desprotegido. Os reagentes e condições para a desproteção neste caso são 5 preferivelmente selecionados entre métodos que dificilmente produzem impurezas tais como isômeros racêmicos de um peptídeo ou proteína como subproduto.

As condições para a eliminação de cada grupo protetor podem ser, por exemplo, de acordo com o método conhecido 10 descrito em Fundamental and Experiment of Peptide Como método para a eliminação há métodos que utilizam, respectivamente, um ácido forte, um ácido fraco, uma base, um agente redutor (redução catalítica, metal, tiol, etc.), 15 um reagente oxidante, um agente nucleofílico, um agente eletrof ílico, um íon, elétron, luz, um solvente e uma enzima. A seleção do grupo protetor pode ser realizada levando-se em consideração as condições de eliminação destes métodos de eliminação.

Como método para a remoção de um grupo protetor (reação de desproteção), por exemplo, tratamento ácido com ácido acético, fluoreto de ácido ou (preferivelmente, ácido trifluoracético, ácido acético, etc.); tratamento alcalino com diisopropiletilamina, trietilamina, piperidina ou piperazina; redução catalítica sob uma corrente de hidrogênio na presença de um catalisador tal como Pd-carbono; tratamento com pó de zinco em ácido acético (Zn/ácido acético); e tratamento com

Synthesis mencionada acima, de um grupo protetor, ácido trifluoracético, hidrogênio anidro, trifluormetanosulfônico, ácido destes metanosulfônico, uma mistura

333

70/113 fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF) são utilizados. A reação de desproteção é geralmente realizada a uma temperatura de cerca de 40°C ou menor, preferivelmente cerca de 25°C, pelo que, a produção de isômeros racêmicos de um fragmento de peptídeo protegido como subproduto pode ser efetivamente suprimida. Um tempo reacional para a reação de desproteção é usualmente de cerca de 0,5 a cerca de 5 horas.

No tratamento ácido acima, é preferível adicionar-se um cátion absorvedor tam como água, triisopropilsilano (TIPS), fenol, anisol, tioanisol, metacresol, paracresol, dimetilsulfeto, 1,4-butanoditiol, e 1,2-etanoditiol (preferivelmente fenol). Adicionalmente, um grupo 2,4dinitrofenil utilizado como grupo protetor para o imidazol de histidina é removido pelo tratamento com tiofenol, e um grupo formil utilizado como grupo protetor do indol de triptofano é removido por tratamento alcalino com uma solução diluída de hidróxido de sódio ou amônia diluída em adição à desproteção mencionada acima por tratamento ácido na presença de 1,2-etanoditiol ou 1,,4-butanodiol.

O produto reacional obtido pela presente invenção pode ser isolado e purificado pelos meios convencionais de separação e purificação tais como um método de filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de partição, cromatografia líquida de alta performance, cromatografia líquida de alta performance em fase reversa e eletroforese. 0 produto a ser purificado não fica limitado ao peptídeo modificado ou proteína modificada como produto final, mas não é necessário mencionar que um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não

71/113 aminoácidos modificados, ou um fragmento de peptídeo protegido não contendo aminoácidos ou não aminoácidos modificados, ou o produto como um intermediário em uma etapa de purificado produção destes pode ser apropriadamente purificação separaçao pelos meios de mencionados acima.

Conforme descrito acima, um peptídeo modificado ou proteína modificada pode ser produzido. O método de produção mencionado acima da presente invenção pode ser aplicado a quaisquer peptídeos modificados ou proteínas modificadas sem qualquer limitação. Inter alia, o método de produção é adequadamente utilizado para a produção de grelina, preferivelmente grelina humana, de rato, de camundongo, suína, de frango, de enguia, bovina, equina, ovina, de rã, de truta ou canina, ou derivado de grelina. As estruturas das grelinas mencionadas acima dos respectivos organismos são descritas na Tabela 1. Uma vez que grelina ou derivado de grelina obtidos pela presente invenção é uma grelina ou derivado de grelina de altíssima qualidade contêm uma quantidade consideravelmente pequena de impurezas (em particular, isômeros racêmicos de grelina ou derivado de grelina) quando em comparação com grelina ou derivado de grelina obtidos pela técnica anterior. Como resultado, uma purificação suficiente pode ser efetivamente realizada por um método de purificação mais simples, e a grelina ou derivado de grelina podem ser produzidos com um alto rendimento. Também a este respeito, o método de produção da presente invenção é um método extremamente vantajoso para a produção de grelina ou derivado de grelina.

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Exemplos de grelina ou derivado de grelina de alta qualidade mencionado acima incluem grelina ou derivado de grelina purificados ou um sal destes que apresentem um conteúdo de substâncias análogas totais de cerca de não mais que 1% (preferivelmente cerca de não mais que 0,9%, mais preferivelmente não mais que 0,8%, mais preferivelmente ainda cerca de não mais que 0,7%. Aqui, substâncias análogas totais significa um total de todas as impurezas que são detectadas por cromatografia líquida de alta performance. Exemplos de tais impurezas incluem isômeros racêmicos de grelina ou derivado de grelina, substâncias análogas de alta polaridade, e outra impurezas.

Uma realização particularmente preferível de um método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada da presente invenção é como se segue: isto é, a realização é um método para a produção de um peptídeo modificado ou proteína modificada compreendendo:

etapa 1: uma etapa de produção, em uma resina de eliminação fracamente ácida, de um fragmento de peptídeo (a) que compreende uma seqüência de pelo menos os 1° a 4° aminoácidos do terminal-N, na seqüência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs. : 1 a 21, preferivelmente compreende uma. seqüência dos 1° a 5° aminoácidos do terminal-N, na dita seqüência de aminoácidos, ou compreende uma seqüência dos 1° ao 7° aminoácidos do terminal-N na dita seqüência de aminoácidos, (b) no qual um grupo hidroxi de uma cadeia lateral de serina ou treonina que é o 3° aminoácido do terminal-N é acilado, preferivelmente acilado com um grupo alquil saturado ou insaturado com um número de carbonos de 2 a 35,

73/113 preferivelmente de 6 a 18, e (c) no qual um ou mais grupo funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável pela preparação de um fragmento de peptídeo e uma reação de condensação de fragmentos de peptídeo na etapa seguinte (4), selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um go indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um aminoácido, preferivelmente um grupo hidroxi e um grupo amino, são protegidos com um grupo protetor.

etapa (2) : uma etapa de divagem do fragmento de peptídeo da resina de divagem em ácido fraco sob condições ácidas fracas sem a eliminação de um grupo protetor no fragmento de peptídeo, etapa (3) : uma etapa de produção de um fragmento de peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos outra que não uma seqüência de aminoácidos contida em um fragmento de peptídeo produzido nas etapas (1) e (2) na seqüência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs..: 1 a 21, preferivelmente uma . seqüência dos 6° ao 28° aminoácidos do terminal-N na dita seqüência de aminoácidos, ou uma seqüência dos 8° ao 28° aminoácidos do terminal-N na dita seqüência . de aminoácidos, e no qual um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável pela produção de um fragmento de peptídeo e uma reação de condensação de fragmento de peptídeo nas etapas seguintes (4), selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um go indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, em uma cadeia lateral de um

74/113 aminoácido ou um não aminoácido, preferivelmente um grupo hidróxi e um grupo amino, são protegidos com um grupo protetor, e etapa (4): uma etapa de condensação do fragmento de peptídeo produzido na etapa (2) com o fragmento de peptídeo produzido na etapa (3), opcionalmente. seguida da desproteção de um grupo protetor para um grupo funcional reativo.

Um peptídeo modificado ou proteína modificada obtido pelo método da presente invenção é produzido na forma de um peptídeo livre ou um seu sal dependendo das condições reacionais. Um peptídeo livre e seu sal são intercambiáveis pelo método convencional. Quando um peptídeo livre é convertido a um sal farmacologicamente aceitável, por exemplo, o peptídeo pode ser reagido com o ácido inorgânico ou ácido orgânico exemplificado a seguir. Como sal de um peptídeo ou proteína, é preferível um sal farmacologicamente aceitável. Exemplos de um tal sal, quando o peptídeo ou a proteína contêm um grupo básico tal como um grupo amino, incluem sais com ácidos inorgânicos (também chamados de ácidos inorgânicos livres) (por exemplo, ácido carbônico, ácido bicarbônico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bórico, etc.), ou ácidos orgânicos (também chamados de ácidos orgânicos livres) (por exemplo, ácido succínico, ácido acético, ácido propiônico, ácido trifluoracético, etc.). Quando o peptídeo ou a proteína contêm um grupo ácido tal como um grupo carboxil, são exemplificados sais de bases inorgânicas (também chamadas de bases inorgânicas livres) (por exemplo, metais alcalinos tais como sódio, potássio,

75/113 mamífero (por exemplo, etc., metais alcalino terrosos tais como cálcio, magnésio, etc.), ou bases orgânicas (também chamadas de bases orgânicas livres) (por exemplo, aminas orgânicas tais como trietilamina, etc., aminoácidos básicos tais como arginina, etc.). Alternativamente, o peptídeo ou a proteína podem formar um composto complexo metálico (por exemplo, complexo de cobre, complexo de zinco, etc.).

Um peptídeo modificado ou proteína modificada produzido pelo método da presente invenção pode ser utilizado para várias aplicações. Por exemplo, a grelina ou derivado de grelina purificados mencionados acima apresenta baixa toxidez, e pode ser administrada a um humano, macaco, cão, rato, camundongo) como um medicamente para tratar distúrbios alimentares, um agente para promover a secreção de hormônio de crescimento, um medicamento para doenças cardíacas, um medicamento, um medicamento para doenças funcionais estomacais, um agente para a proteção da mucosa do trato intestinal ou um agente para prevenir distúrbios da mucosa intestinal menores por administração via venosa, um medicamento para osteoporose, um agente para redução da caquexia devida a doenças crônicas, e um medicamento para disfunções pulmonares. A grelina ou derivado de grelina mencionados acima podem ser administrados de forma oral como um tablete, uma cápsula, um elixir ou uma preparação de liberação controlada que é revestida com um açúcar de revestimento se necessário, ou pode ser administrados parenteralmente na forma de injeção tal como um solução estéril, uma suspensão e uma preparação de liberação controlada com água ou outra solução farmaceuticamente

76/113 flavorizante, estabilizante, aceitável; preparação nasal tal como uma solução, e uma suspensão; preparação pulmonar tal como um spray e um preparado para inalação; um supositório. A preparação mencionada acima pode ser produzida misturando-se a grelina ou derivado de grelina purificados com o suporte, excipiente, veiculo, anti-séptico, ligante e semelhantes conhecidos fisiologicamente aprovados, em uma dosagem unitária exigida na técnica geral farmacêutica aprovada.

Exemplos

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a presente invenção em detalhe, embora a presente invenção não esteja limitada a eles. Como método de teste e instrumental utilizado nos presentes exemplos, aqueles descritos abaixo foram utilizados a não ser de outra forma indicado.

(Principais abreviações)

HBTU: hexafluorfosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)1,1,3,3-tetrametiluronio;

DCC: diciclohexilcarbodiimida;

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol;

HOOBt: 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-l,2,3benzotriazina;

TFA: ácido trifluoracético;

TIPS: triisopropilsilano;

DIPEA: diisopropiletilamina;

TBAF: fluoreto de tetrabutilamônio

TFE: trifluoretanol;

Fmoc: fluorenilmetoxicarbonil;

Boc: t-butiloxicarbonil;

77/113 c93O tBu: t-butil;

TBDMS: t-butil dimetilsilil;

Trt: tritil;

Pac: fenacil;

DMF: N,N-dimetilformamida;

DCM: diclorometano;

NMP: N-metilpirrolidona;

Et₂O: éter dietílico;

DMAP: 4-dimetilaminopiridina;

EDC: l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.

(Aminoácidos protegidos e resinas utilizados para síntese)

Boc-Gly, Fmoc-Ser(TBDMS), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Ser, Fmoc-Pro (todos manufaturados por Watanabe Kagaku Kogyo ou Applied Biosystem), resina de prolil-2-clorotritil (Novabiochem).

(Instrumentos utilizados) (a) Sintetizador automático de peptídeo

Sintetizador 433A manufaturado por Applied Biosystem (b) Sistema analítico HPLC

Instrumento: Shimadzu LC-10A System

Coluna: YMC-Pack PROTEIN-RP ou YMC-Pack ODS AP-302 ou YMCPack PROTEIN-C8 (todas de 4,6 ιηιηφ x 150 mm).

Temperatura da coluna: 40°C

Eluente: em ácido trifluoracético a 0,1%, a concentração de acetonitrila foi alterada linearmente até um máximo de

100%.

Taxa de fluxo: 1 ml/minuto

Detecção: UV (210 nm ou 214 nm)

Quantidade injetada: 10 a 50 μΐ

78/113 (c) Sistema cromatográfico preparativo

Instrumento 1: explorador AKTA 10S(sistema cromatográfico manufaturado por Amersham Pharmacia Biotech)

Coluna SP-sefarose de pérolas grandes (XK26/30) (resina manufaturada por Amersham Pharmacia Biotech)

Diâmetro interno 26 mm x 300; mm de comprimento YMC-ODS 120 s50 (HR26/15) (resina manufaturada por YMC)

Diâmetro interno 26 mm x 15 mm de comprimento Vydac C4 (HR10/30) (Vydac)

Diâmetro interno 10 mm x 300 mm de comprimento Fonte 30RPC (HR10/30) 23 ml (resina manufaturada por

Amersham Pharmacia Biotech)

Diâmetro interno 10 mm x 30 mm de comprimento

As condições de taxa de fluxo, eluente e semelhantes são separadamente descritas nos Exemplos.

Instrumento 2: Applied Biosystem BioCAD de perfusão Equipamento de cromatografia

Coluna SP-Toypearl 550-c (diâmetro interno 16 mm x 280 mm manufaturada por TOSOH)

YMC-ODS AM (diâmetro de partícula 20 pm, diâmetro interno 21,5 mm x 300 mm manufaturada por YMC)

Coluna de cromatografia em fase reversa ODS-80Ts (coluna de diâmetro interno 21,5 mm x 300 mm (108 ml) diâmetro de partícula 20 pm, manufaturada por TOSOH)

As condições de taxa de fluxo, eluente e semelhantes são mostradas nos Exemplos separadamente.

(d) Sistema de HPLC preparativa

Instrumento: Waters 600 Multisolvent Delivery System Coluna: YMC-Pack ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) ou YMC-Pack PROTEIN-RP (5 pm, C4, 20 mm x 250 mm)

79/113

Eluente: em ácido trifluoracético a 0,1%, a concentração de acetonitrila foi apropriadamente alterada linearmente até um máximo de 100%.

Taxa de fluxo: 10 ml/minuto

Detecção: 210 nm e 260 nm

Injeção: de 10 a 2000 μΐ, 2000 μΐ ou mais foram injetados com uma bomba.

(e) Espectrômetro de massa

Instrumento 1: Finnigan MAT Corporation TSQ700

Fonte iônica: ESI

Modo de detecção iônica: positiva Voltagem de atomização: 4,5 kV Temperatura de capilaridade: 250°C

Fase móvel: solução mista (1:1) de ácido acético-metanol a

0,2%

Taxa de fluxo: 0,2 ml/minuto Faixa de varredura: m/z 300 a 1500

Instrumento 2: API3000 (TAKARA SHUZO Co., Ltda.)

Modo de detecção iônica: modo positivo

Tipo.de varredura: Qlscan

Taxa de fluxo: 0,3 ml/minuto

Faixa molecular: 500 a 2000 de massa (f) Análise de seqüência de aminoácidos

Instrumento: sequenciador do tipo Applied Biosystem 477A manufaturado por Perkin Elmer (g) Análise da composição em aminoácidos

Instrumento: instrumento de análise de aminoácidos do tipo L-8500 manufaturado por Hitachi, Ltda.

933

80/113

Amostra: em tubo selado, a amostra foi hidrolisada com ácido clorídrico 6M contendo fenol a 0,1% a 110°C por 24 horas.

[Escala para a produção de grelina humana(828 ) [Lys^16,16,20,24 (Boc) ] e delineamento]

Daqui em diante, os Exemplos de 2 a 8 são resultados do cultivo e purificação com o propósito de obter-se cerca de 0,6 g de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) (representa grelina humana. Daqui em diante, o mesmo) como produto final purificado. O vetor de expressão mostrado no exemplo 1 foi transformado em Escherichia coli, para expressar uma proteína de fusão apresentando a seqüência de aminoácidos mostrada no mesmo Exemplo. A fermentação foi realizada por cultura de alta densidade utilizando-se um fermentador de 2

1, e foram recuperados os corpos de inclusão. Uma quantidade correspondendo à metade dos corpos de inclusão recuperados foi utilizada para iniciar a purificação. Foram realizadas uma vez: reação com OmpT (escala de 0,9 1), troca catiônica com SP-sefarose de pérolas grandes (escala de 160 ml) , uma reação de carbonilação com butoxicarbonil (escala de 0,5 1), uma passagem em coluna de fase reversa YMC ODS-120 s50 (escala de 80 ml) e uma reação com Kex2 (escala de 0,3 1), respectivamente. Foi realizada duas vezes, como purificação final, passagem em uma coluna de fase reversa Vydac C4 (escala de 25 ml) . Na etapa de purificação final, foi realizada análise de fracionamento por eluição com um gradiente de concentração linear. Adicionalmente, foi utilizado um evaporador para dessolvatação e um filtro de fibra de vidro (Whatman plc) foi utilizado para filtração sob pressão reduzida.

81/113

Exemplo 1: Construção do vetor de expressão pll7 828oRR para derivado de hGhrelin(8-28)

Com base em uma seqüência genética de cDNA de hGhrelin (Kojima et al., Nature, vol. 402, pg. 656-660, 1999), foi obtido um fragmento de DNA de hGhrelin(8-28) utilizando-se um oligo-DNA sintético total (Pharmacia Biotech) por um método de anelamento. Um oligo-DNA sintético total e uma seqüência de aminoácidos utilizados para o anelamento são mostrados na Fig. IA.

De maneira a inserir este fragmento de DNA em um plasmídeo pGP117ompPR no qual foram introduzidos um gene de uma proteína de fusão de derivado de β-galactosidase de Escherichia coli e um peptídeo-1 semelhante a glucagon humano (publicação internacional n° WO 00/52193), o pGP117ompPR foi tratado com as enzimas de restrição Sall e SacII, e submetido a eletroforese em gel de Agar para preparar um fragmento de DNA deficiente no gene do peptídeo-1 semelhante a glucagon humano. Após posterior tratamento com fosfatase alcalina, este foi ligado . com um fragmento de gene de derivado de hGhrelin(8-28) o qual foi submetido a tratamento com SacII e tratamento com DNA quinase T4, com DNA ligase T4. 0 plasmídeo ligado foi transformado em uma cepa DH5a de Escherichia coli para obter-se um plasmídeo pll7 8-28oPR. O plasmídeo expressa uma proteína de fusão na qual uma seqüência de aminoácidos de hGhrelin(8-28) e um fragmento parcial (117 resíduos de aminoácidos) de β-galactosidase estão ligados a uma seqüência ligante apresentando uma seqüência de aminoácidos de EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO.: 26).

82/113

Além disto, foi realizado PCR plasmídeo pll7 8-28oPR como molde, (Toyobo Co., Ltda.) como enzima, e iniciadores a seguir:

utilizando-se este polimerase KODplus os dois tipos de

ORI-RR: GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC (SEQ ID NO.:

28)

SAL*R: ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG (SEQ ID NO.: 29) como iniciador, e o fragmento amplificado foi excisado do gel de eletroforese. Adicionalmente, este foi tratado com enzimas de restrição Sall e BamHI. O pll7 8-28oPR que foi previamente tratado similarmente com enzimas de restrição Sall e. BamHI foi purificado, e estes fragmentos foram ligados com uma DNA ligase T4, e o plasmídeo ligado foi transformado em uma cepa DH5a de Escherichia coli para obter-se um plasmídeo pll7 8-28oRR. O plasmídeo expressa uma proteína de fusão na qual uma seqüência de aminoácidos de hGhrelin(8-28) e um fragmento parcial de β-galactosidase (117 resíduos de aminoácidos) estão ligadas com uma seqüência ligante apresentando uma seqüência de aminoácidos de EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (SEQ ID NO.: 27). A proteína de fusão expressa é mostrada na Fig. 1B abaixo.

Exemplo 2: Expressão da proteína de fusão hGhrelin(828) recombinante em Escherichia coli e recuperação de corpos de inclusão

O plasmídeo pll7 8-28oRR preparado no Exemplo 1 foi transformado em uma cepa W3110 de Escherichia coli, e a Escherichia coli transformada foi cultivada em 2 1 de meio em um fermentador de 3 1. Este plasmídeo de expressão é um plasmídeo derivado do plasmídeo pBR322, e sua expressão é induzida com um promotor lac. Adicionalmente, o plasmídeo «736

83/113 contém um gene de resistência a tetraciclina como gene de resistência a droga. A pré-cultura foi realizada em caldo LB por agitação a 32°C por 14 horas. Na presente cultura foi utilizado um meio apresentando composição a seguir. A composição do meio é 4 g/1 de extrato de levedura, 4 g/1 de K₂HPO₄, 4 g/1 de KH₂PO₄, 2,7 g/1 de Na₂HPO₄, 0,2 g/1 de

NH₄C1, 1,2 g/1 de (NH₄)₂SO₄, 2 g/1 de MgSO₄.7H₂O, 40 mg/1 de

CaCl₂, 40 mg/1 de FeSO₄.7H₂O, 10 mg/1 de MnSO₄.nH₂O, 10 mg/1

de AICI3.	. 6H₂O, 4 mg/1 de	CoCl₂.	, 6H₂O	, 2 mg/1	de ZnSO₄.7H₂O, 2
mg/1 de	Na₂Mo0₄.2H₂O, 1	mg/1	de	CuC1₂.2H₂	0, 0,5 mg/1 de
H₃BO₄.	Glicose como	fonte	de	carbono	foi adicionada

inicialmente ao meio a 1% para iniciar o cultivo a 37°C. Após a glicose ter sido consumida, foi adicionado glicerol como fonte de carbono para continuar o cultivo. Após o que, a solução de cultura foi submetida à uma máquina de ruptura celular sob pressão (Mantongorin) para romper as células, e cerca de 80 g de corpos de inclusão foram recuperados por centrifugação. Posteriormente, estes corpos de inclusão foram ressuspendidos em 2 1 de água deionizada, e recuperados com uma centrífuga para lavar os corpos de inclusão. Finalmente, foram obtidos 200 ml de uma suspensão dos corpos de inclusão apresentando um valor OD§6o de 530.

Os Exemplos a seguir foram realizados utilizando-se 100 ml (metade da quantidade) desta suspensão de corpos de inclusão.

Exemplo 3: Processamento da proteína de fusão hGhrelin(8-28) com protease OmpT endógena.

A suspensão de corpos de inclusão obtida no Exemplo 2 foi diluída com aditivos e água deionizada nas condições

84/113 reacionais mostradas a seguir de tal forma que o valor de OD₆₆o se tornou 100,0, e uma reação com OmpT foi realizada sob as condições reacionais a seguir.

Condições reacionais:

Uréia 4M, Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 50 mM, volume reacional: 800 ml, temperatura reacional 32°C, tempo de reação 40 minutos.

Os corpos de inclusão foram dissolvidos e diluídos com 400 ml de uréia 8M para 100OD₆₆₀/ml, foram adicionados Tris-HCl e NaCl à solução, e completado com água deionizada para 800 ml. Posteriormente o pH foi ajustado para 7,4 par a iniciar a reação. Foram realizadas amostragens a 0 minuto, 20 minutos e 40 minutos a partir do início da reação, a análise foi realizada por HPLC, e a reação foi interrompida aos 40 minutos, quando o grau de clivagem excedeu a 80%. A reação foi interrompida elevando-se o pH para 11 com NaOH 5N. Após o término da reação, o resíduo foi removido por centrifugação a baixa velocidade para obter-se o sobrenadante.

Concentração de (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin (8-28) : 2,23 mg/1

Quantidade da solução: 800 ml

Conteúdo em peptídeo: 1,7 g

Como resultado da determinação por HPLC e espectrometria de massa, foi demonstrado que o processamento ocorre de forma precisa, e é liberada (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28)

Um valor de ESI-MS medido com um espectrômetro de massa (TSQ-700) da Finnigan MAT

Corporation foi de

4078 (valor teórico:

4077)

85/113 t38

Exemplo 4: Purificação de (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(828) (purificação por troca catiônica)

O sobrenadante da solução reacional de protease OmpT obtido no Exemplo 3 foi purificado por cromatografia catiônica.

Método:

Coluna utilizada: SP-sefarose de pérolas grandes (XK26/30) (160 ml) (resina manufaturada por Amersham Pharmacia Bioteck) diâmetro interno 260mm x 300 mm de comprimento Solução de equilíbrio e lavagem: uréia 1,5 M, NaHCO₃ 50 mM pH 11

Eluente: uréia 1,5 M, NaCl 0,5 M, NaHCO₃ 50 mM pH 11

Solução de iniciação, regeneração: NaOH 0,4 M

Taxa de fluxo: 10 ml/minuto (2,5 cm/minuto)

Manipulação: _; .

Iniciação, equilíbrio: 2 volumes de coluna de NaOH 0,4 M —> 2 volumes de coluna de água deionizada —> solução de equilíbrio: 3 volumes de coluna 100%

Alimentação da amostra: a amostra é alimentada, e lavada com uma solução de equilíbrio e lavagem até a redução do UV (cerca de 4 volumes de coluna).

Eluição: realizada com um passo de 100% de uma solução de eluição.

Resultados: a pureza do peptídeo obtido a partir da solução de eluição foi de 90%, e uma etapa de recuperação produziu um rendimento de 91,6%.

Concentração de (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28): 4,75 mg/ml

Quantidade de solução: 300 ml

86/113

Conteúdo de peptídeo: 1,43 g

Exemplo 5: Carbonilação com tert-butoxicarbonil de (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28) (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28) purificado é submetido a uma reação de adição de um grupo Boc, para proteger um grupo α-amino no terminal-N e um grupo amino de uma cadeia lateral de um resíduo de Lys contido na seqüência.

Método: Uma quantidade total de 300 ml do eluído da cromatografia catiônica foram transferidos para um vaso de vidro, e foi adicionado um equivalente (300 ml) de acetonitrila a acetonitrila a 50%. Posteriormente, foi adicionado 1 M de (Boc)₂0 a 8,8 ml (concentração final 20 mM, 25 equivalentes) correspondendo a 5 vezes a quantidade do número (total de 5) de grupos α-amino presentes em (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28) e grupos ε-amino de uma cadeia lateral de resíduo lisina, enquanto que sob agitação. Posteriormente, o pH foi ajustado com NaOH 5N de forma tal que o pH não se reduziu para 9 ou menos, e a reação foi realizada a temperatura ambiente por 60 minutos sob agitação com um agitador. Determinação da eficácia da reação foi monitorada por análise de HPLC e determinação do peso molecular.

Imediatamente após o término da reação, foi realizada a dessolvatação por um evaporador. Após a dessolvatação, o pH foi ajustado para 5,5 com ácido acético, e o precipitado foi filtrado com um filtro de fibra de vidro (Whatman plc) sob pressão reduzida. Esta etapa produziu 580 ml de uma solução contendo 1740 mg de [N“-Boc, Lys^16,19,20,24 (Boc) ] (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28)

87/113 c&MO

Taxa da etapa de recuperação: 116% (a razão pela qual uma taxa da etapa de recuperação é maior que 100% é considerada como se segue: a absorção em HPLC é aumentada pela adição de um grupo Boc, e a taxa de recuperação aparente é aumentada).

A espectrometria de massa foi realizada utilizando-se um espectrômetro de massa (TSQ-700) da Finnigan MAT Corporation. Um valor medido de ESI-MS foi .4578 (valor teórico: 4577).

Após a reação, o peso molecular foi aumentado (peso molecular medido = 4578, peso molecular teórico = 4577) em muitos casos quando em comparação com antes da carbonilação com t-butoxicarbonil (peso molecular medido = 4077, peso molecular teórico = 4077). Isto era presumivelmente [N^aBoc, Lys^16,19,20,24 (Boc) ]-(RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin (8-28) no qual quatro grupos ε-amino presentes em uma cadeia lateral de resíduo de lisina na seqüência de hGhrelin(8-28) e um grupo α-amino da extremidade terminal-N foram carb.onilados.

Exemplo 6: Purificação de (N^a-Boc, Lys (Boc)^16,1?9'²⁰'²⁴) (RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28) por cromatografia em coluna de fase reversa.

O [N^a-Boc, Lys^16,19,20,24 (Boc) ] - (RHHGSGSPSRHRR) -hGhrelin (8-28) obtido no Exemplo 5 foi purificado em uma coluna de fase reversa.

Método:

Coluna utilizada: YMC-ODS 120 s50 (HR26/15) de 80 ml (resina manufaturada por YMC) . Diâmetro interno de 26 mm x 15 mm de comprimento. Solução de equilíbrio e lavagem: acetonitrila a 10%, acetato de sódio 30 mM, pH 5,5.

88/113

Eluente: acetonitrila a 50%, acetato de sódio 30 mM, pH 5,5.

Solução de regeneração: acetonitrila a 80%.

Taxa de fluxo: 7 ml/minuto (2 cm/minuto).

Após o equilíbrio com 3 volumes da coluna de uma solução de equilíbrio, foi alimentada uma amostra, e a coluna foi lavada com 3 volumes da coluna de uma solução de equilíbrio (até que o UV foi reduzido) . A eluição foi realizada por uma eluição passo-a-passo com 100% de um eluente. Após a eluição, a coluna foi lavada com uma solução de regeneração.

Um eluído foi obtido como 150 ml de uma solução contendo 1770 mg de [N^a-Boc,Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴(Boc)](RHHGSGSPSRHRR)-hGhrelin(8-28). A esta foram adicionados 75 ml de água de ultrafiltração para diluir 1,5 vezes, e a acetonitrila contida na solução foi retirada por destilação com um evaporador.

Taxa da etapa de recuperação: 98%.

Exemplo 7: Produção de [Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ]-hGhrelin (828) com protease Kex2.

A solução de peptídeo obtida no Exemplo 6 foi ajustada para as condições a seguir para realizar-se uma reação com Kex2. Isto é, um eluído de ODS foi diluído com água de ultrafiltração para 8 mg/ml, e foi adicionado TrisHC1 1 M com pH 8,3 para 50 mM. Posteriormente foi adicionado CaCl₂ 0,25 M para 5 mM, isto foi pré-incubado a 30°C por 10 minutos, e foi adicionada a solução de protease Kex2 (JP-A n° 10-229884) (1 χ 10⁷ unidades/ml) para 2,5 x

10⁴ unidades, seguida da reação em um tanque a temperatura constante de 30°C por 120 minutos sob agitação com um

89/113 agitador. Após a reação, o pH foi ajustado para 5,5 utilizando-se ácido acético para interromper a reação. A partir de HPLC, espectrometria de massa e análise de aminoácidos, foi determinado gue o [N^aBoc, Lys^16,19,20,24 (Boc) ]- (RHHGSGSPSRHRR) -hGhrelin (8-28) gue era o material de partida, desapareceu após a clivagem com Kex2, e [Lys^16,19,20,24 (Boc) ]-hGhrelin (8-28) apareceu e, desta forma, ocorre um processamento preciso.

Exemplo 8: Purificação de [Lys^{16,19, 20,24} (Boc) ] hGhrelin(8-28) .

A solução contendo [Lys^16,19,20,24 (Boc) ]-hGhrelin ( 8-28 ) obtido no Exemplo 7 após a reação, foi purificado com uma coluna de fase reversa sob as seguintes condições:

Método:

Coluna de fase reversa utilizada: Vydac C4 (HR10/30) coluna de 23 ml (Vydac) . Diâmetro interno 10 mm x 300 mm de comprimento.

Condições:

Solução de eguilíbrio e lavagem: acetonitrila a 10%, TFA a 0,1%, pH 3.

Eluente: acetonitrila a 50%, TFA a 0,1%, pH 3.

Taxa de fluxo: 2 ml/minuto (taxa de fluxo linear: 3 cm/minuto).

A eluição foi realizada em um programa no gual 3 volumes de coluna de uma solução de eguilíbrio foram passados, a solução após a reação com Kex2 foi alimentada em duas partes (20 mg/ml de resina), a coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de um eluente a 10%, e um gradiente linear de 10% a 80% de um eluente foi completado para 8 volumes de coluna. Subseqüentemente, a coluna foi lavada

90/113 com 2 volumes de coluna de um eluente a 100%, durante o que cada fração de 6 ml de eluído foi coletada. As frações foram analisadas por HPLC, e as frações que não continham um ligante [N^a-Boc]-(RHHGSGSPSRHRR) e [N^aBoc, Lys^16,19,20,24 (Boc) ] - (RHHGSGSPSRHRR) -hGhrelin (8-28 ) não clivado foram combinadas.

Resultados:

Rendimento: 84,4%, pureza - 97,5%.

Concentração de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) : 5,62 mg/ml.

Quantidade da solução: 120 ml.

Conteúdo de peptídeo: 600 mg

A solução eluída foi dessolvatada com um evaporador, seguida de liofilização para obter-se 600 mg de [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-2 8) a partir de 1700 mg de um precursor (Exemplo 3) obtido pelo processamento de um derivado de protease OmpT (Fig. 2) .

Exemplo 9: Tabela da taxa de recuperação da purificação e pureza de [Lys^{16,19, 20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) .

A seguir tem-se uma lista do rendimento. de produção do [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) mostrado nos Exemplo 3 ao Exemplo 7 (Tabela 2).

91/113

92/113

Exemplo 10 (10-1) Síntese de fragmento de extremidade terminal-N ( [N^a-Boc,Ser²'⁶(tBu)]hGhrelin(1-7)) (Método 1)

Uma resina de propil-2-clorotritil (1,39 g, 1,0 mmol, manufaturado por Novabiochem) foi colocada em um reator equipado com um filtro de vidro, e introdução de Fmocaminoácido com HBTU e remoção de Fmoc com piperidina foram sucessivamente repetidas para inserir Boc-Gly em um resíduo terminal-N, para construir uma resina Boc-Gly-Ser(tBu)Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-clorotritil. A resinapeptídeo protegido resultante foi tratada com uma solução de TBAF/DMF 0,1 M (50 ml) por 30 minutos. A resinapeptídeo foi filtrada, lavada com DMF (30 ml) algumas poucas vezes, e lavada com álcool isopropílico, e DCM (30 ml). Então, a resina-peptídeo livre de TBDMS foi intumescida com NMP (5 ml) , e foram adicionados ácido octanóico (588 mg, 4,1 mmol) e EDC.HC1 (848 mg, 4,4 mmol) na presença de DMAP (374 mg, 3,1 mmol) de maneira a reagilos por 16 horas. A resina foi filtrada, lavada sucessivamente com NMP, álcool isopropílico e DCM, e secada sob pressão reduzida para obter-se uma resina-peptídeo protegido na qual uma cadeia lateral de serina na posição 3 foi acilada com ácido octanóico. A esta foram adicionados 30 ml de . uma solução a 0,5% de TFA/DCM, e posta sob agitação a temperatura ambiente por 30 minutos para clivar o peptídeo protegido da resina. A resina foi filtrada, o filtrado foi concentrado, e foi adicionada água ao resíduo para obter-se precipitados. Os precipitados foram filtrados, lavados por agitação com hexano, e filtrados novamente. Estes foram secados por uma noite sob pressão

93/113 reduzida para obter-se 742 mg do produto desejado (rendimento 72%). A pureza deste produto foi investigada por HPLC e encontrada como sendo de 94%.

(10-2) Síntese de fragmento de extremidade terminal-N 5 ( [N“-Boc, Ser²'⁵ (tBu) ] hGhrelin (1-7) ) (Método 2)

Uma resina de propil-2-clorotritil (1,95 g, 1,0 mmol, manufaturado por Novabiochem) foi colocada em um reator equipado com um filtro de vidro, e introdução de Fmocaminoácído com HBTU e remoção de Fmoc com piperidina foram 10 sucessivamente repetidas para construir uma resina Phe-LeuSer (tBu) -Pro-2-clorotritil . Então, Fmoc-Ser-OH foi introduzido juntamente com HOOBt/DCC, e remoção de Fmoc e condensação com HOOBt/DCC foram repetidas para introduzir Boc-Gly em um resíduo terminal-N, para construir uma resina 15 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-clorotritil. A resina-peptídeo foi intumescida com NMP (5 ml), e foram adicionados ácido octanóico (579 mg, 4,0 mmol) e EDC.HCl (847 mg, 4,4 mmol) na presença de DMAP (374 mg, 3,1 mmol) de maneira a reagi-los por 16 horas. A resina foi filtrada, lavada sucessivamente com NMP, álcool isopropílico e DCM, e secada sob pressão reduzida para obter-se uma resina-peptídeo protegido na qual uma cadeia lateral de serina na posição 3, foi acilada com ácido octanóico. A esta foram adicionados 30 ml de uma solução a 25 0,5% de TFA/DCM, e a mistura foi posta sob agitação a temperatura ambiente por 30 minutos para clivar o peptídeo protegido da resina. A resina foi filtrada, o filtrado foi concentrado, e foi adicionada água ao resíduo para obter-se precipitados. Os precipitados foram filtrados, lavados por 30 agitação em hexano, e filtrados novamente.

Estes foram

94/113 secados por uma noite sob pressão reduzida para obter-se 715 mg do produto desejado (rendimento 69%). A pureza deste produto foi investigada por HPLC e encontrada como sendo de 74%.

Exemplo 11: Condensação e desproteção de fragmento.

[N^a-Boc, Ser (tBu) ²'⁶] hGhrelin (1-7) [Lys

16, 19,20,24

Boc)]hGhrelin(8-28) obtidos nos Exemplo 10-1 e

Exemplo 8 foram quantificados previamente utilizando-se um analisador de aminoácidos, e submetidos a uma reação de condensação. Cada

Boc, Ser (tBu) ²'⁶] hGhrelin (1-7 ) ,

0,19

HBTU mmol e

de

DIPEA [N foram dissolvidos em 1 ml de DMF, e a solução foi posta sob agitação a temperatura ambiente por 30 minutos. Após o que, 0,16 mmol de [Lys

16,19,20,24 (Boc)]hGhrelin(8-28) e 0,4!

mmol de DIPEA foram dissolvidos em 1,5 ml de DMF, e a solução de fragmento de extremidade terminal-N ativado mencionada acima foi adicionada gota-a-gota sob agitação. Após 1 hora, o solvente da reação foi retirado por destilação sob pressão reduzida, e foi adicionado Et2O ao resíduo para obter-se precipitados, os quais foram lavados e secados. Aos pós resultantes foram adicionados 6 ml de TFA, e a mistura foi posta sob agitação lentamente' a temperatura ambiente por 30 minutos. O TFA foi retirado por destilação sob pressão reduzida, e foi adicionado Et₂O ao resíduo para obter-se precipitados, os quais foram lavados e secados para obter-se 0,70 g do peptídeo bruto em forma de um pó branco. Este foi analisado por HPLC analítica e, como resultado, a pureza do produto desejado em um gráfico foi de 80%, e o tempo de retenção foi consistente com o de um produto químico inteiramente

95/113

SM 8 sintético. Posteriormente, o produto semi-sintético e o produto químico inteiramente sintético foram injetados conjuntamente, e picos em um cromatograma foram consistentes. Gráficos de HPLC antes e depois da condensação são mostrados na Fig. 3.

Exemplo 12: Purificação de hGhrelin

0,7 0 g do peptídeo bruto em pó branco obtido no Exemplo 11 foi dissolvido em 7 mg/ml de ácido acético a 5%, seguida pela purificação sob as seguintes condições:

Método, condições:

Coluna utilizada: Fonte 30RPC (HR10/30) coluna de 23 ml (resina manufaturada por Amersham Pharmacia Biotech). Diâmetro interno 10 mm x 30 mm de comprimento.

Solução de equilíbrio e lavagem: acetonitrila a 10%, ácido acético 50 mM.

Eluente: acetonitrila a 60%, ácido acético 50 mM.

Solução de regeneração: acetonitrila a 80%.

Taxa de fluxo: 2,5 ml/minuto (2 cm/minuto).

Após equilíbrio com 3 volumes de coluna de uma solução de equilíbrio, a solução de hGhrelin dissolvida foi dividida em duas metades, cada metade foi alimentada, e a coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de uma solução de equilíbrio (até a redução do UV) . A eluição foi realizada em um programa pelo qual um gradiente linear de 0% a 100% de um eluente foi completado para 6 volumes de coluna. Cada fração de 5 ml de eluídos foi fracionada, analisada por HPLC a um tempo apropriado, e as frações contendo hGhrelin foram combinadas. A combinação foi dessolvatada com um evaporador, seguida de liofilização. Como resultado, 512 mg de hGhrelin apresentando uma pureza de

96/113

98% (taxa de recuperação 73%) foram obtidos. Resultados de análise HPLC de hGhrelin purificada são mostrados na Fig.

.

Os Exemplos 13 a 15 a seguir referem-se à otimização das condições mostradas nos Exemplos 1 a 12 mencionados acima. Desta forma, não é necessário mencionar que a presente invenção não está limitada às condições a seguir.

Exemplo 13:. Diferença na eficácia de clivagem com Kex2 devida à diferença nas sequências das proteínas de fusão.

Uma eficácia de clivagem com Kex2 é altamente diferente dependendo de uma seqüência de reconhecimento para ela. Foi reportado que a eficácia de clivagem se torna mais baixa in vivo na ordem de seqüência de clivagem Kex2 KR (10) »RR (5) »TR (1,2) >PR (1,0) (O valor entre parêntesis é a eficácia de clivagem quando, a de PR é 1) (Proc. Natl. Acad. Sei. 95, pg. 10384-10389, 1998).

A Fig. 5 mostra proteínas expressadas pelos pll7s 828oPR e pll7 8-28oRR preparados no Exemplo 1, e um plasmídeo pll7 8-28oKR preparado por PCR utilizando-se o pll7 8-28oPR como molde.

Escherichia coli W3110 contendo um plasmídeo expressando cada um destes três .: tipos de proteína, foi cultivada, e a purificações foi realizada em uma escala de 1/10 daquela dos métodos mostrados nos Exemplos de 2 a 6, de maneira a preparar três tipos de peptídeos de [N^aBoc,Lys

16, 19,20,24

Boc)]-(RHHGSGSPSRHPR)hGhrelin(8-28) (daqui em diante, PR-hGhrelin (8-28 ) ) , [N^a-Boc, Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] (RHHGSGSPSRHRR)hGhrelin(8-28 ) (daqui em diante, RRhGhrelin (8-28 )) , e [N^a-Boc, Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] 97/113 áSO (RHHGSGSPSRHRR)hGhrelin(8-28) (daqui em diante, KRhGhrelin(8-28)), respectivamente.

Os peptídeos preparados foram submetidos a tratamento com protease Rex2 utilizando-se o método mostrado no Exemplo 7. Um perfil analítico de HPLC a 60 minutos após o início da reação é mostrado na Fig. 6. ;

Conforme mostrado na Fig. 6, a ordem de taxa de divagem é RR-hGhrelin(8-28)>PR-hGhrelin(8-28)>RRhGhrelin(8-28), e RR-hGhrelin(8-28) mostrou a taxa de divagem mais alta. No caso da KR-hGhreün (8-28) , uma vez que um grupo Boc protege o resíduo de lisina de RR, e uma carga de lisina é perdida, nenhuma divagem não ocorreu. Em adição, PR-hGhrelin (8-28) apresentou uma eficácia de divagem baixa, e uma outra divagem ocorreu na hGhrelin (828). Na degradação nesta hGhrelin(8-28), a divagem ocorreu entre arginina aminoácido número 15 da hGhrelin e lisina aminoácido número 16.

Exemplo 14: Construção de uma proteína de fusão adequada para cultivo em Escherichia coli.

De maneira a obter-se uma proteína de fusão adequada para cultivo, um plasmídeo expressando proteínas de fusão mostradas na Fig. 7 juntamente com a proteína de fusão mostrada no Exemplo 13 e Fig. 5 foi preparado. Todas as proteínas de fusão mostradas na Fig. 7 foram preparadas por PCR a partir de diferentes iniciadores utilizando-se pll7 8-28oPR como molde. Para pll7 8-28oRR, estas variantes foram construídas com o propósito de reduzir o ponto isoelétrico da proteína.

Cada um dos plasmídeos que se esperava expressassem cada proteína de fusão foi transformado em Escherichia coli

98/113 cepa W3110, que foi cultivada em um fermentador de 3 1 a uma escala de 2 1. A pré-cultura foi realizada em caldo LB por agitação a 32°C por 14 horas. A composição do meio da presente cultura é a mesma que aquela mostrada no Exemplo 2. Foi inicialmente adicionada glicose como fonte de carbono ao meio de cultura a 1%, e o cultivo foi iniciado a 32°C. Após o consumo da glicose, foi adicionado glicerol, seguindo-se o cultivo. E, após o consumo da glicose, ... a temperatura do cultivo foi aumentada para 37°C e, após o cultivo, as células foram rompidas com uma máquina de ruptura celular sob pressão (Mantongorin). O resultado do cultivo foi determinado por turbidez final e turbidez ao rompimento celular. Uma turbidez celular mais alta, e uma razão entre turbidez antes e turbidez após o rompimento celular foram determinadas como sendo devidas a uma bactéria apresentando uma maior produtividade de corpos de inclusão. Os resultados são mostrados nos gráficos A e B da Fig. 8.

Conforme visto pelos gráficos A e B, de uma turbidez final, e uma razão entre- a turbidez antes e depois do rompimento celular, a proteína de fusão 117 8-28oRR exibiu a produtividade mais alta entre as proteínas de fusão construídas.. A partir dos resultados dos'Exemplos 13 e 14, considerou-se que o plasmídeo pll7 8-28oRR expressando a proteína é também adequada para o cultivo do Exemplo 2.

Exemplo 15: Estabilidade de [Lys¹⁶' ^19,20,24 (Boc) ] hGhrelin(8-28).

Nos Exemplos 6, 7 e 8, observou-se um fenômeno no qual cerca de 1 a 10% de grupos Boc são eliminados em [N^aBoc, Lys¹⁶'^19,20'²⁴ (Boc) ]- (RHHGSGSPSRHRR) hGhrelin (8-28 ) e

99/113 [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) . Uma vez que mesmo quando um dos grupos Boc adicionados de [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) é eliminado, isto resulta em uma alta redução do grau de condensação em uma etapa de condensação, por esta razão, a estabilidade de [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) foi investigada de maneira a prevenir a eliminação de um grupo Boc.

Como um parâmetro influenciando na degradação, o pH durante o armazenamento e a temperatura de armazenamento foram examinados. Então, foi analisada e determinada a estabilidade sob as condições a seguir por HPLC.

Método: [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28) recentemente purificada foi dissolvida em uma solução de acetato de sódio 30 mM, o pH foi ajustado para 2, 3 ou 4 utilizando-se TFA, e o pH foi ajustado para 6, 7 ou 8 utilizando-se NaOH 5N, e isto foi deixado em repouso em um banho a temperatura constante de 4°C, 20°C, 37°C ou 42°C por uma semana. Após o início do repouso, foram realizadas amostragens a 0 hora, 2 horas, 6 horas, 9 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas e 168 horas, e as amostras foram analisadas por HPLC. A análise foi realizada obtendo-se no tempo uma razão (%) da área do pico de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) em relação à área do pico total dos resultados da análise com HPLC.

Resultados: Quatro tipos, de gráficos sumarizam todas as temperaturas de armazenamento e são mostrados nas Fig. 9 e Fig. 10. Observou-se que, a um pH mais baixo (pH 3 ou mais baixo) e a uma temperatura mais alta, o produto de degradação foi aumentado. Adicionalmente, observou-se que, a um pH de 4 ou mais alto, [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28) é também estável mesmo a 42°C. Desta forma, observou-se

100/113 que o controle do pH é importante para suprimir-se a produção deste produto de degradação.

Exemplo 16: Produção de hGhrelin(8-28) (Método 2) (1) Construção do vetor pll7-8-28ok de expressão de derivado de hGhrelin(8-28).

De acordo com o mesmo procedimento do Exemplo 1, .foi obtido o plasmídeo pll7-8-28ok. A única diferença entre o plasmídeo pll7-8-28PR preparado no Exemplo 1 e o plasmídeo pll7-8-28ok é o fato da seqüência ligante do primeiro ser EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO.: 26) e, a seqüência ligante do último é RRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO.: 35) .

(2) Expressão de proteína de fusão hGhrelin(8-28) recombinante em Escherichia coli.

plasmídeo pll7-8-28ok o qual é esperado que expresse proteína de fusão hGhrelin(8-28) foi transformado em Escherichia coli cepa W3110 para obter-se um transformante. Este transformante foi cultivado em 20 1 de um meio utilizando glicose e glicerol como fonte de carbono, para obter-se uma solução de cultura apresentando um valor OD₆₆o final de 54.

(3) Processamento de proteína de fusão hGhrelin(8-28) com protease OmpT endógena.

Células (cerca de 680 g) provenientes da solução de cultura obtida em (2) acima foram suspensas em 20 1 de um tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), e foram realizados tratamentos de rompimento das células duas vezes utilizando-se um homogeneizador de alta pressão. Após o que, foram recuperados corpos de inclusão por centrifugação, e os corpos de inclusão foram lavados por

101/113 nova suspensão em água deionizada e centrifugação da suspensão. Então, o pelete de corpo de inclusão (peso úmido de cerca de 170 g) obtido na centrifugação foi suspenso em uma pequena quantidade de água deionizada, para obter-se 550 ml do concentrado de corpos de inclusão apresentando um valor OD₆₆₀ 82 6. Foram tomados 50 ml dos 550 ml do concentrado de corpos de inclusão, diluídos com água deionizada de tal forma que o valor OÜ660 se tornou 50,0, foram adicionados Tris-HCl (pH 8,2) e EDTA (pH 8,0) para concentrações finais de 50 mM e 1 mM, respectivamente, e os corpos de inclusão foram dissolvidos em uréia (concentração final 4,0 M) . Os corpos de inclusão foram dissolvidos em uréia para clivar entre Arg-Arg de uma seqüência ligante RRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO.: 35) com uma protease OmpT endógena. Isto é, a solução reacional foi mantida a 30°C por 5 minutos, e submetida ao tratamento com protease OmpT a 30°C por 15 minutos. Após o que, foi adicionado AcOH a 3% para interromper a reação. O presente tratamento produziu 1,3 g de RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28).

Como resultado da análise, por. cromatografia líquida de alta performance, da etapa de processamento da proteína de fusão com uma protease OmpT endógena, um ESI-MS de 4019 (valor teórico 4018) demonstrou que RRHHGSGSPSRHPRhGhrelin ( 8-28 ) foi mantida na forma solúvel.

(4) Purificação de RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) (Purificação por troca catiônica).

A solução reacional de protease OmpT (900 ml) obtida em (3) acima foi alimentada a uma coluna de troca catiônica SP-Toyopearl 550-c (volume do leito 55 ml, Dl 16 mm x 280 mm, manufaturada por TOSOH) equilibrada com uma solução de &55

102/113 equilíbrio (uréia 1,5 M, NaCl 20 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3) em três partes. A eluição foi realizada por uma programação na qual, após suficiente lavagem da coluna com uma solução de equilíbrio, um gradiente de concentração de

75% de	uma solução de	equilíbrio	e 25%	de	um eluente	(uréia
1,5 ,M,	NaCl 1,5 M,	Tris-HCl 10	mM,	pH	8,3) até	que se
atingiu	100% do eluente em 1,5	volumes	de coluna	Uma
amostra	foi tomada a	cada 5 ml,	cada	fração fo.i analisada

por cromatografia líquida de alta performance, e frações que não continham um derivado de β-galactosidase de Escherichia coli foram tomadas. Um rendimento total de quatro vezes foi de cerca de 950 mg.

eluído purificado mencionado acima ' (660 ml) foi dividido em duas metades, e alimentado duas vezes a uma coluna YMC-ODS AM (diâmetro de partícula 20 pm, manufaturada, por YMC) DI 21,5 mm x 300 mm, equilibrado com acetonitrila a 2% e TFA a 0,1%. Após suficiente lavagem com uma solução de equilíbrio, a coluna foi eluída com um eluente (acetonitrila 50%, TFA 0,095%). Foi tomado um pico de eluição, e a acetonitrila no eluente foi removida com um evaporador rotativo para obter-se 220 ml de uma solução contendo 720 mg de RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28). As condições da cromatografia líquida de alta performance utilizada em (3) e (4) são mostradas abaixo:

Coluna: YMC ODS AP-302, detector: sistema de cromatografia líquida de alta performance da Hitachi (D7000), taxa de fluxo: 1 ml/minuto, eluição: gradiente de concentração linear de um tampão A (acetonitrila a 1,0%, TFA a 0,1%) 100% para tampão B (acetonitrila a 50,0%, TFA a 0,1%) 100%, por 20 minutos.

103/113 (5) Carbonilação com t-butoxicarbonil de RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28).

220 ml da amostra (contendo 720 mg de RRHHGSGSPSRHPRhGhrelin ( 8-28 ) ) obtida em (4) foram transferidos para um frasco Erlenmeyer de vidro, e foi adicionado uma quantidade equivalente de acetonitrila 220 ml. A isto foram adicionados 4,4 ml de dicarbonato de di-t-butila 1 M (concentração final de 10 mM, 25 equivalentes) correspondendo a 5 vezes a quantidade molar do número (total de 5) de grupos α-amino e grupos ε-amino de Lys presentes em RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28). Posteriormente, o pH foi ajustado para 9 com trietilamina, e os materiais foram reagidos a temperatura ambiente por 60 minutos sob agitação com um agitador. Foi adicionado ácido acético à concentração final de 0,5% para interromper a reação tornando o pH aproximadamente neutro, e a acetonitrila foi rapidamente removida com um evaporador rotativo para obter-se 300 ml de? uma solução contendo 530 mg de Boc-RRHHGSGSPSRHPR-[Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) . ESI-MS: 4519 (valor teórico: 4518).

A julgar-se pelos perfis de eluição de RRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28) antes e após a carbonilação e resultados das determinações de espectrometria de massa, foi confirmada a produção de Boc-RRHHGSGSPSRHPR[Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) . Para monitoração da presente reação, foi utilizado o sistema de cromatografia a seguir. Coluna: YMC-C8, detector: sistema de cromatografia liquida de alta performance da Hitachi (D7000), taxa de fluxo: 1 ml/minuto, eluição: gradiente de concentração linear de 100% de um tampão A (acetonitrila a 1,0%, TFA a £51

104/113

0,1%) para 100% de um tampão B (acetonitrila a 60%, TFA a 0,095%) por 20 minutos.

(6) Produção de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) com protease Kex2.

Boc-RRHHGSGSPSRHPR- [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28) obtido em (5) foi purificado por cromatografia de coluna em fase reversa. A coluna foi equilibrada com acetonitrila a 2%, TFA a 0,1%, e solução de acetato de sódio 10 mM a pH 4,5. o derivado Boc (cerca de 500 mg) foi alimentado a uma coluna YMC-ODS AM (diâmetro de partícula de 20 pm, manufaturada por TOSOH) DI 21,5 mm x 300 mm. Após lavagem suficiente com uma solução. de equilíbrio, a coluna foi eluída com um eluente (acetonitrila a 70%, TFA a 0,095%, acetato de sódio 10 mM, pH 4,5) . Um pico de eluição contendo Boc-RRHHGSGSPSRHPR-[Lys

16,19,20,24 (Boc)]hGhrelin(8-28) (420 mg) foi coletado, e a acetonitrila foi removida com um evaporador. À presente solução foi adicionada uma solução 250 mM de cloreto de cálcio e Tris-HCl 1 M de pH 8,2 para as concentrações finais de 5 mM e 50 mM, respectívamente. Após permanência a 30°C por 5 minutos, foi adicionada solução (1 x 10⁷ unidades/ml) de protease Kex2 (JP-A n° 10229884) para 3 x 10⁴ unidades/ml, para reação a 30°C por 45 minutos.

Como resultado da análise por cromatografia líquida 25 de alta performance na presente etapa, foi demonstrado que uma seqüência ligante RHHGSGSPSRHPR e [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28) foram clivados.

(7) Purificação de [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28 )

A solução após a reação (300 ml) contendo 30 [Lys^16,19,20,24 (Boc) ] hGhrelin (8-28) (320 mg) obtido em (6) foi

105/113 ajustada para pH 3,5 com ácido acético, e alimentada a uma coluna de cromatografia em fase reversa ODS-80Ts (coluna de Dl 21,5 mm x 300 mm (108 ml), diâmetro de partícula 20 pm, manufaturada por TOSOH) previamente equilibrada com acetonitrila a 10% e TFA a 0,095%. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de uma solução de equilíbrio, e uma programação na qual um gradiente de concentração de 7 0% de um tampão A (acetonitrila a 10%, TFA a 0,095%) .e 30% de um tampão B (acetonitrila a 65%, TFA a 0,1%) até atingir-se 100% de um tampão B em 5 volumes de coluna, de maneira a eluir [Lys^16,19'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28) . Foram coletadas

frações de	eluído	(5 ml	cada),	e analisadas	por
cromatografia líquida	de alta performance (as condições	são
as mesmas	daquelas	de (6)).	As	frações eluídas	de
[Lys¹⁶'¹⁹'^20,24(	’Boc)]hGhrelin(8-28)		foram coletadas,
concentradas	, e liofilizadas	para	obter-se 136 mg	de

[Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) . A partir de 1300 mg de um precursor (o. de (3)) obtido pelo processamento com um derivado de protease OmpT, foram obtidos 136 mg de uma amostra final de [Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (8-28) .

(8-1) Síntese de fragmento de extremidade terminal-N [N^a-Boc, Ser^2,6 (tBu) ] grelina (1-7) ) (Método 1).

Uma resina Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu. Ser(tBu)-Pro-2-clorotritil foi - construída em uma resina prolil-2-clorotritil (548 mg, 0,25 mmol, manufaturada por Navabiochem) repetindo-se sucessivamente introdução de Fmoc-aminoácido com HBTU e remoção de Fmoc com piperidina para inserir Boc-Gly em um resíduo terminal-N utilizando-se um sintetizador automático de peptídeo. A resina-peptídeo protegido resultante (757 mg) foi tratada com uma solução

106/113 de TBAF/DMF 0,1 M (5 ml) por 1 hora. A resina-peptídeo foi filtrada, lavada com DMF (10 ml) algumas vezes, e lavada com álcool isopropílico e cloreto de metileno (10 ml) . Então, a resina-peptídeo isenta de TBDMS foi intumescida com DMF (10 ml), e foram adicionados ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol) e EDC.HC1 (211 mg, 1,1 mmol) na presença de DMAP (31 mg, 0,25 mmol), para realizar a reação por 16 horas... A resina foi filtrada, lavada sucessivamente com DMF, álcool isopropílico e cloreto de metileno, e secada sob pressão reduzida para obter-se uma resina-peptídeo protegido no gual a cadeia lateral na terceira serina foi acilada.com ácido octanóico. A esta foram adicionados 6 ml de uma solução mista de 2 ml de ácido acético/2 ml de TFE/6 ml de cloreto de metileno, e a mistura foi posta sob agitação a temperatura ambiente por 1 hora para clivar o peptídeo protegido da resina. -;A resina foi filtrada, o filtrado foi concentrado, e foi adicionado éter ao resíduo para obter-se precipitados. Os precipitados foram filtrados, e secados para obter-se 248 mg do peptídeo bruto (rendimento 96%). O presente produto foi dissolvido em cerca de 2 ml de uma solução mista de ácido acético e acetonitrila, e a solução foi adicionada a YMC-Pack ODS-A (20 mm x 250 mm) , seguida por eluição com um gradiente linear (taxa de fluxo: 10 ml/minuto) de acetonitrila 40% para 80% em ácido trifluoracético 0,1% por 60 minutos. As frações desejadas foram tomadas, e liofilizadas para obterse 210 mg do produto desejado.

(8-2) Síntese de fragmento de extremidade terminal-N [N^a-Boc, Ser^2,5 (tBu) ] grelina (1-7 ) (Método 2).

360

107/113

Uma resina Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Trt)-Phe-LeuSer(tBu)-Pro-2-clorotritil foi construída em uma resina prolil-2-clorotritil (466 mg, 0,25 mmol, manufaturada por Navabiochem) repetindo-se sucessivamente introdução de Fmoc-aminoácido com HBTU e remoção de Fmoc com piperidina para inserir Boc-Gly em um resíduo terminal-N.. utilizando-se um sintetizador automático de peptídeo. Esta resina foi tratada com TFA a 1%, TIPS/diclorometano 5% por 30 minutos, para conseguir-se a remoção do grupo Trt e clivar da resina ao mesmo tempo. Após a resina ter sido filtrada, o diclorometano foi separado por destilação sob pressão reduzida para concentrar o material, e foi adicionado Et₂O para obter-se precipitados, os quais foram secados para obter-se 165 mg de Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)Pro-OH como precipitados brancos. Então, foram adicionados brometo de fenacila (40 mg, 1,1 equivalentes) e trietilamina (20 mg, 1,1 equivalentes) para reagi-los por 2 horas em cerca de 3 ml de DMF. Após a reação, a solução reacional foi colocada em uma quantidade de cerca de 5 vezes de acetato de etila, e a mistura foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada. Os precipitados formados pela adição de Et₂O. foram secados para obter-se Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-ProOPac como precipitados brancos. Então, foram adicionados ácido octanóieo (18,2 mg, 1,1 equivalentes), EDC.HC1 (26,4 mg, 1,2 equivalentes) e DMAP (1,4 mg, 0,1 equivalentes) para reagi-los por uma noite em cerca de 2 ml de DMF. A solução reacional foi colocada em uma quantidade de cerca de 5 vezes de acetato de etila, lavada com água e uma

108/113 solução aquosa saturada de cloreto de sódio, foi adicionado sulfato de sódio para secá-la, e esta foi filtrada, concentrada, foi adicionado Et₂O para obter-se 144 mg de Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(octanoil)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OPac como precipitados brancos. Então foram adicionados 1,5 ml de ácido acético e pó de· zinco (163 mg, 20 equivalentes) para reagir por uma hora, isto foi filtrado, e foi adicionada água fria para obter-se precipitados., que foram lavados com Et₂O e secados. 65 mg de Boc-Gly-Ser(tBu)Ser(octanoil)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH foram obtidos como precipitados brancos. 0 produto foi dissolvido em cerca de 2 ml de uma solução mista de ácido acético aquoso e acetonitrila, a solução foi adicionada a YMC-Pack ODS-A (20 mm x 250 mm), e foi eluída com um gradiente linear (taxa de fluxo: 10 ml/minuto) de acetonitrila 40% para 80% em ácido trifluoracético a 0,1% por 60 minutos; As frações desejadas foram tomadas, e liofilizadas para obter-se 50 mg do produto desejado.

(9) Condensação e desproteção do fragmento.

[N^a-Boc, Ser (tBu)²'⁶] grelina (1-7 ) e [Lys¹⁶'¹⁹'²⁰'²⁴ (Boc) ] hGhrelin(8-28) obtidas em (8-1) e (7) foram quantificadas previamente utilizando-se um analisador de aminoácidos, e submetidas a uma reação de condensação. 19,3 pmol de [N^aBoc, Ser (tBu) ²'⁶] grelina (1-7 ) , 20,3 pmol de HBTU e 20,3 pmol de DIPEA foram dissolvidos em 500 μΐ de DMF, e a solução foi posta sob agitação a temperatura ambiente por 1 hora. Após o que, 18,4 pmol de [Lys^{16, 19,20,24} (Boc) ] hGhrelin (8-28 ) e 55,2 pmol de DIPEA foram dissolvidos em 1 ml de DMF, e a solução de fragmento de extremidade terminal-N ativada mencionada acima foi adicionada gota-a-gota sob agitação.

109/113

Após três horas, o solvente da reação foi retirado por destilação sob pressão reduzida, e Et₂O foi adicionado ao resíduo para obter-se precipitados, os quais foram lavados e secados. Ao pó resultante foram adicionados 3 ml de TFA, e a mistura foi posta sob agitação lentamente a temperatura ambiente por 30 minutos. TFA foi retirado por destilação sob pressão reduzida, e foi adicionado Et₂O ao resíduo para obter-se precipitados, os quais foram lavados e secados para obter-se 77 mg do peptídeo bruto em forma de um pó branco. Este foi analisado por HPLC analítica e, como resultado, a pureza do produto desejado no gráfico foi de 83%, e o tempo de retenção foi consistente com o de um produto sintético químico. Posteriormente, um produto semi-sintético e um produto totalmente sintético foram coinjetados, e os picos no cromatograma foram consistentes.

(10) Purificação de hGhrelin(1-28).

mg do pó branco de hGhrelin bruta obtido em (9) foram dissolvidos em ácido acético 1% a 1 mg/ml, e a solução foi alimentada a uma coluna de cromatografia em 'fase reversa TSK-ODS-80Ts de 108 ml (DI 21,5 mm x 300 mm) equilibrada com ácido acético 0,1 M. Após lavagem com 2 volumes de coluna de uma solução de equilíbrio, uma programação foi realizada na qual um gradiente de concentração a partir de 100% de tampão A (ácido acético 0,1 M) para 100% de um tampão B (acetonitrila a 40%, ácido acético 0,1 M) completados em 5 volumes de coluna, para desta forma eluir hGhrelin(1-28) . Frações apresentando alta pureza foram coletadas, e liofilizadas para obter-se

34,4 mg de hGhrelin(1-28).

110/113 â£3

ESI-MS 3371 (valor teórico 3370,86), razão da composição de aminoácidos após hidrólise com ácido clorídrico 6N: Ala: 1,01 (1), Arg: 2,97 (3), Glx: 5,95 (6), Gly: 1,02 (1), His: 1,00 (1), Leu: 2 (2), Lys: 4,01 (4), Phe: 1,00 (1), Pro: 4,01 (4), Ser: 3,60 (4), Vai: 1,00 (1) (valores teóricos entre parêntesis), atividade de mobilização de Ca: 1,3 nM (ref.: 1,5 nM).

Exemplo 17: Otimização da condição de remoção de TBDMS e condição de acilação com ácido octanóico de BocGly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu) -Pro-OH.

De acordo com o mesmo procedimento do método do Exemplo 16 (8-1), a otimização da condição de uma reação para remoção de um grupo TBDMS da terceira serina e uma reação de acilação com ácido octanóico foi estudada. Uma resina Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2clorotritil foi construída sobre uma resina de prolil-2clorotritil repetindo-se sucessivamente introdução de Fmocaminoácido com HBTU e remoção de Fmoc com piperidina,: para inserir Boc-Gly em um resíduo terminal-N utilizando-se um sintetizador automático de peptídeo (433A manufaturado por Applied Biosystem Japan). Então a resina foi subdividida em 0,05 mmol (cerca de 150 mg), e submetida a acilação com ácido octanóico sob condições mostradas na Tabela 3 e Tabela 4. Condições de lavagem da resina, e divagem do peptídeo da resina são as mesmas que aquelas do Exemplo 16 (8-1) .

Como resultado, ficou claro que uma reação de remoção de um grupo TBDMS é preferivelmente realizada por de 30 minutos a 1 hora utilizando-se uma solução de TBAF 0,1 M, e uma reação de acilação com ácido octanóico é

111/113 preferivelmente realizada por de 8 a 16 horas utilizando-se 4 equivalentes de ácido octanóico, 4,4 equivalentes de EDC, e 1 equivalente de DMAP.

Tabela 3 ' Reação de remoção de grupo TBDMS ^a TBAF Tempo de Rendimento ^b Pureza do Razão ^c (M) reação (%) produto Octanoil:

		(horas)		desejado Desoctanoil (%)
I	0,01	0,25	89	94	98,3	:1,7
II	0,01	3	100	97	100	:N.D.^d
III	0,1	0,25	94	97	100	:N. D.
IV	0,1	0,5	100	96	100	:N. D.
V	0,1	1	98	96	100	:N.D.
VI	0,1	3	100	96	100	:N. D.

a: A taxa de remoção de um grupo TBDMS foi obtida como a razão entre um composto octanoil e um composto desoctanoil não exibindo remoção de TBDMS, onde estes compostos foram obtidos por acilação com ácido octanóico de resina-peptídeo tratada com TBAF, seguida pela desproteção. A acilação foi realizada por uma reação durante 24 horas utilizando 4 equivalentes de ácido octanóico, 4,4 equivalentes de EDC, e 1 equivalente de DMAP.

b: Calculado com base no grau de substituição de uma resina prolil-2-clorotritil.

c: A pureza do produto e a razão foram calculadas por

HPLC analítica.

d: N.D. = não detectada.

112/113

113/113

â.66

Exemplo 18: estudo da condição de condensação de fragmento.

As eficácias reacionais de vários reagentes de condensação foram estudadas utilizando-se [N“5 Boc, Ser (tBu) ²'⁶] hGhrelin (1-7 ) e [Lys¹⁶'^19,20'²⁴ (Boc) ] hGhrelin (828), ficou evidente que HBTU produziu o melhor resultado, mas a reação ocorre também em EDC/HOBt, EDC/HOSu e DPPA.

Tabela 5 [N^a-Boc, Ser (tBu) ²'⁶] grelina (1-7 ) +hGhrelin (8-28 )_

Reagente	Tempo de	Pureza do produto desejado
de condensação	reação	(calculada de HPLC)
HBTU	5 horas	83%
EDC/HOBt	16 horas	74%
EDC/HOSu	16 horas	40%
DPPA	24 horas	19%

Aplicabilidade industrial

De acordo com o método da presente invenção, um peptideo modificado ou proteina modificada apresentando alta qualidade podem ser obtidos com alto rendimento.

1/10

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um fragmento de peptídeo protegido contendo um ou mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados em que pelo menos um aminoácido ou não aminoácido é modificado como representado pela fórmula 1: -A(R)-, em que A representa um aminoácido ou um não aminoácido, e R representa um substituinte ligado a uma cadeia lateral de A, que é introduzido como modificação, em que o não aminoácido é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em NH2-CH(CH2OH)-CH3, CH3-CH(Rn)-COOH,

CH3-CH(Rh)-CH3, NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-COOH, NH2(CH2)4-COOH, NH2C(CH3)2-(CH2)3-COOH, NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH, NH2(CH2)3CH(CH2OH)-CH3 e NH2-(CH2)3CH(R11)-CH3, em que R11 representa uma cadeia lateral de um aminoácido natural, o método caracterizado pelo fato de compreender:

preparar, sobre uma resina à base de tritil, um fragmento de peptídeo que contém uma seqüência desejada compreendendo aminoácidos ou/e não aminoácidos, em que um ou mais grupos funcionais reativos na cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido que podem provocar uma reação secundária indesejável na preparação do fragmento de peptídeo são protegidos por um grupo protetor, o um ou mais grupo funcional reativo sendo selecionado do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, e um grupo funcional reativo na cadeia lateral de uma aminoácido ou um não aminoácido A, que é para ser modificado com um substituinte R, é protegido com um grupo protetor de silil;

de 11/08/2017, pág. 11/22
2/10 eliminar o grupo protetor de silil sem clivar o fragmento de peptídeo da resina à base de trilil, usando um fluoreto de amônio quaternário, quando o grupo protetor de silil é introduzido em um grupo funcional reativo na cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido A, que é para ser modificado com um substituinte R, em que o grupo protetor silil é t-butildimetilsilil (TBDMS), t-butildifenilsilil (TBDPS), triisopropilsilil (TIPS), triisobutilsilil (TIBS), t-hexildimetilsilil (ThxDMS) ou trifenilsilil (TPS), e o fluoreto de amônio quaternário é fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF), fluoreto de tetraetilamônio (TEF) ou fluoreto de amônio;

(c) modificar a cadeia lateral desprotegida com um substituinte R; e (d) clivar o fragmento de peptídeo da resina à base de trilil sob condições fracamente ácidas, usando uma solução contendo ácidos carboxílicos e/ou álcoois fluoretados, sem eliminação do grupo protetor, conforme definido na etapa (a), no fragmento de peptídeo.

2. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor de um grupo a-amino no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo alcoxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte, um grupo cilcoalquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte, um grupo aralquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte, um grupo aralquil opcionalmente contendo um substituinte, um grupo acil opcionalmente contendo um substituinte, ditiasuccinoil, 2de 11/08/2017, pág. 12/22
3/10 nitrofeniltio, difenilfosfinil, difenilfosfinotioil e dimetilfosfinotioil;

o grupo protetor do grupo hidroxi no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um grupo alcanoil inferior apresentando de 1 a 6 átomos de carbono, um grupo aroil, um grupo benziloxicarbonil e um grupo etoxicarbonil;

o grupo protetor do grupo guanidino de arginina no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo nitro, um grupo benziloxicarbonil, um grupo p-toluenosulfonil, um grupo p-metoxibenzenosulfonil, um grupo 4-metoxi-2,6-dimetilbenzenosulfonil, um grupo 4metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonil, um grupo mesitileno2-sulfonil, um grupo 2,3,4,5,6-pentametilbenzenosulfonil, um grupo 2,4,6-trimetoxibenzenosulfonil, um grupo 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonil, ou um grupo 2,2,4,6,7-pentametil-diidrobenzofurano-5 sulfonil;

o grupo protetor do grupo mercapto de cisteína no fragmento de peptídeo é selecionado do grupo que consiste em grupo tritil, um grupo acetamidometil, um grupo tercbutil, um grupo benzil, um grupo p-metilbenzil, um grupo pmetoxibenzil, um grupo 3-nitro-2-piridinosulfenil e um grupo butiltio;

o grupo protetor do grupo imidazolil de histidina no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em um gropo t-butoxicarbonil, um grupo tritil, um grupo p-toluenosulfonil, um grupo 4-metoxi-2,3,6trimetilbenzenosulfonil, um grupo 2,4-dinitrofenol, um grupo benziloximetil, um grupo t-butoximetil e um grupo 9fluorenilmetoxicarbonil;

de 11/08/2017, pág. 13/22
4/10 o grupo protetor do grupo indolil de triptofano no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo formil, um grupo benziloxicarbonil, um grupo 2,4-diclorobenziloxicarbonil, um grupo tricloroetiloxicarbonil, trimetilbenzenosulfonil

um grupo e um

4-metoxi-2,3,6grupo 2,4,6trimetoxibenzenosulfonil; e o grupo protetor do grupo carbonil no fragmento de peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo alquil éster, um grupo aralquil éster, um grupo fenacil éster, um grupo benziloxicarbonilidrazida, um grupo t-butoxicarbonilidrazida e um grupo tritilidrazida.

3. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o grupo alcoxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte é t-butoxicarbonil, tricloroetiloxicarbonil, t-amiloxicarbonil, 9-fluorenilmetoxicarbonil, metilsulfoniletoxicarbonil, tricloroetoxicarbonil, 2(trimetilsilil)etoxicarbonil ou piridina-4-metoxicarbonil;

o grupo cicloalquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte é cicloheptiloxicarbonil ou ciclohexiloxicarbonil;

o grupo aralquiloxicarbonil opcionalmente contendo um substituinte é benziloxicarbonil, pmetoxibenziloxicarbonil, p-clorobenziloxicarbonil, pbromobenziloxicarbonil, p-nitrobenziloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, 2-fenilisopropiloxicarbonil, pmetilfenilisopropiloxicarbonil, pde 11/08/2017, pág. 14/22
5/10 bifenilisopropiloxicarbonil, ou 3,5-dimetoxi-a, αdimetilbenziloxicarbonil;

o grupo aralquil opcionalmente contendo um substituinte é benzil, benzidril, ou tritil;

o grupo acil opcionalmente contendo um substituinte é trifluoroacetil, ftaloil, formil, benzenosulfonil, p-toluenosulfonil, o-nitrofenilsulfenil,

2,4-dinitrofenilsulfenil, ou 3-nitro-2-piridilsulfenil;

o grupo alcanoil inferior contendo de 1 a 6 átomos de carbono é um grupo acetil;

o grupo aroil é um grupo benzoil; o grupo alquil éster é metil éster, etil éster, propil éster, butil éster, t-butil éster, ciclopentil éster, ciclohexil éster, cicloheptil éster, ciclooctil éster, ou 2-adamantilester; e o grupo aralquil éster é grupo benzil éster, 4nitrobenzil éster, 4-metoxibenzil éster, 4-clorobenzil éster, ou benzidril éster.

4. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a resina à base de tritil é resina de 2-clorotritil, resina de tritil, resina de 4metiltritil ou resina de 4-metoxitrtil ou resina Rink Amida

Barlos.

5. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor de silil é t-butildimetilsilil (TBDMS).
6. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, de 11/08/2017, pág. 15/22

6/10 caracterizado pelo fato de que o fluoreto de amônio quaternário é fluoreto de tetrabutilamônio (TBAF).
7. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os ácidos carboxílicos são ácido acético, ácido trifluoroacético ou ácido fórmico e o os álcoois fluoretados são trifluoroetanol ou hexafluoroisopropanol.
8. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de A ser serina, treonina, cisteína, homocisteína, lisina, ornitina, ácido glutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido diaminoacético, ácido 2aminomalônico, ácido aspártico, tirosina ou asparagina, e R ser ligado a um substituinte reativo na cadeia lateral de A por meio de uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação tioéter, uma ligação dissulfeto, uma ligação amida, uma ligação O-glicosídica ou uma ligação N-glicosídica.
9. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de A ser serina ou treonina, e R ser ligado a um grupo hidroxi na cadeia lateral de A por meio de uma ligação éster.
10. Método para produzir um fragmento de peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do fragmento de peptídeo ser grelina ou um derivado desta, ou um fragmento de peptídeo contendo um aminoácido modificado na grelina ou derivado desta.
11. Método para produzir um peptídeo ou proteína modificados, caracterizado pelo fato de compreender (a) preparar um fragmento peptídeo protegido contendo um ou de 11/08/2017, pág. 16/22

7/10 mais aminoácidos ou não aminoácidos modificados pelo método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, (b) preparar um fragmento de peptídeo contendo nenhum aminoácido modificado ou não aminoácido modificado, e no qual um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável, selecionados do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, na cadeia lateral de um aminoácido ou não aminoácido, estão protegidos, além do fragmento de peptídeo de (a), e (c) condensar os fragmentos de peptídeo preparados em (a) e (b).
12. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato da condensação dos fragmentos de peptídeo ser realizada utilizando-se um agente de condensação.
13. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do agente de condensação ser hexafluorfosfato de 2-(1-hidrobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3tetrametilurônio (HBTU), tetrafluorborato de 2-(1hidrobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU), difenilfosforilazida (DPPA), difenilfosforocianidato (DEPC), diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).
14. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do agente de condensação ser de 11/08/2017, pág. 17/22

8/10 diisopropilcarbodiimida (DIPC), diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), e a condensação dos fragmentos de peptídeo (a) e (b) utilizando o agente de condensação ser realizada na presença de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1hidroxisuccinimida (HOSu) ou 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxobenzotriazina (HOOBt).
15. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de compreender produzir um fragmento de peptídeo protegido contendo nenhum aminoácido ou não aminoácido modificado, por um método enzimático ou/e um método de recombinação genética.
16. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato do fragmento de peptídeo protegido contendo nenhum aminoácido ou não aminoácido modificado ser produzido por um método compreendendo:

etapa (1): uma etapa de cultivo de uma célula transformada com um vetor de expressão contendo uma dentre uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo contendo uma sequência de aminoácidos de um fragmento de peptídeo daqui em diante referido como peptídeo desejado, na presente reivindicação 16 - e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão opcionalmente com um peptídeo de proteção adicionado ao peptídeo desejado por meio de uma sequência ligante, e coleta do peptídeo desejado ou proteína de fusão da cultura;

de 11/08/2017, pág. 18/22

9/10 etapa (2): uma etapa de clivagem e separação do peptídeo protegido e, opcionalmente, da sequência ligante e do peptídeo desejado da proteína de fusão resultante, e opcionalmente adicionalmente purificar o peptídeo desejado quando a proteína de fusão é coletada na etapa (1); e etapa (3): uma etapa de proteção, com um grupo protetor, de um ou mais grupos funcionais reativos que podem provocar uma reação secundária indesejável, selecionado do grupo consistindo em um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo imidazolil, um grupo indolil, um grupo mercapto e um grupo carboxil, na cadeia lateral do peptídeo desejado obtido na etapa (1) ou na etapa (2) .
17. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da clivagem e separação do peptídeo de proteção e, opcionalmente, da sequência ligante e do peptídeo desejado na etapa (2) ser realizada em duas etapas utilizando uma protease OmpT ou um derivado desta e uma protease Kex2 ou um derivado desta.
18. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato da sequência ligante ser uma sequência representada na SEQ ID NO.: 27.
19. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato do fragmento de peptídeo ser um fragmento de peptídeo contendo nenhum aminoácido ou não aminoácido modificado na grelina ou derivado desta.

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20. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato do fragmento de peptídeo protegido contendo nenhum aminoácido

5 ou não aminoácido modificado ser purificado e armazenado em uma solução apresentando pH de 4 a 8.
21. Método para produzir um peptídeo modificado ou proteína modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato do grupo

10 protetor ser um grupo Boc.

Petição 870170057972, de 11/08/2017, pág. 20/22

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DESENHOS