BR122021017560B1 - Anticorpo, polinucleotídeo, composição farmacêutica, usos de um anticorpo, método in vitro, método de detecção post-mortem de multimêros do fosfo-tau, método de detecção in vitro da formação de um complexo imunológico, kits de teste, linhagem celular isolada e método de detecção in vitro de multimêros de fosfo-tau - Google Patents

Anticorpo, polinucleotídeo, composição farmacêutica, usos de um anticorpo, método in vitro, método de detecção post-mortem de multimêros do fosfo-tau, método de detecção in vitro da formação de um complexo imunológico, kits de teste, linhagem celular isolada e método de detecção in vitro de multimêros de fosfo-tau Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se aos métodos e composições para uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou estão associados a emaranhados neurofibrilares. Em particular, a invenção refere-se aos anticorpos, que reconhecem e se ligam especificamente aos confôrmeros tau da proteína fosforilada patológica e aos métodos e composições que envolvem os referidos anticorpos para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias, incluindo a doença de Alzheimer (AD).

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Europeu N° EP12163319.2 arquivado em 5 de abril de 2012 e do Pedido de Patente Internacional N° PCT/EP2011/067604 arquivado em 7 de outubro de 2011, o conteúdo de cada um por este meio é incorporado por referência a este em sua totalidade.
[002] A presente invenção refere-se aos métodos e composições para uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou estão associados a emaranhados neurofibrilares. Em particular, a invenção refere-se aos anticorpos, que reconhecem e se ligam especificamente aos confôrmeros tau da proteína fosforilada patológica e aos métodos e composições que envolvem os referidos anticorpos para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias, incluindo a doença de Alzheimer (DA).
[003] Emaranhados neurofibrilarese filamentos do neurópilo (NTs) são as características principais neuropatológicas da doença de Alzheimer (DA). Eles são compostos da tau da proteína associado ao microtúbulo que tem sofrido modificações pós-traducionais, incluindo a fosforilação, desaminação e isomerização em resíduos de asparaginil ou aspartil. Eles se originam pela agregação de hiper-fosforilada da tau da proteína e seus confômeros. A DA compartilha esta patologia com muitas tauopatias neurodegenerativas, em particular com os tipos especificados de demência frontotemporal (FTD).
[004] A proteína Tau é uma proteína solúvel, "naturalmente desdobrada" que liga avidamente ao microtúbulos (MTs) para promover a sua montagem e estabilidade. MTs são de grande importância para a integridade do citoesqueleto dos neurônios - e, assim, para a formação adequada e o funcionamento dos circuitos neuronais, daí para a aprendizagem e memória. A vinculação da tau ao MT é controlada por fosforilação dinâmica e defosforilação, como demonstrado principalmente in vitro e em células não- neuronais. Devido ao grande número de sítios de fosforilação possíveis (> 80), a contribuição exata de cada e a identidade de quinases responsáveis permanecem largamente indefinida in vivo.
[005] No cérebro de DA, patologia da tau se desenvolve mais tarde que e, portanto, provavelmente em resposta a patologia do amiloide, que constitui a essência da hipótese de cascata de amiloide. Isto é baseado em e indicado por estudos em pacientes com DA e síndrome de Down e é corroborado por estudos em camundongos transgênicos com amiloide combinado e patologia do tau (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al., 2008).
[006] O momento exato de ambas as patologias em pacientes com DA humanos, bem como mecanismos que vinculam amiloide à patologia do tau permanecem em grande parte desconhecidos, mas são propostos para envolver ativação das vias de sinalização neuronais que atuam em ou por GSK3 e cdk5 como os principais "tau-quinases" (revisto por Muyllaert et al., 2006, 2008).
[007] A hipótese de que a taupatia não é um efeito colateral inocente, mas um grande executor patológico em DA é baseada em observações genéticas, patológicas e experimentais que corroboram uma a outra totalmente: • Em casos de DA precoce familiares que são devido a mutações no precursor da proteína amiloide (APP) ou presenilina, a causa de patogenicidade obrigatória é acúmulo de amiloide, mas invariavelmente a patologia compreende taupatia colateral, idêntica nos casos esporádicos de DA tardia; • A gravidade da disfunção cognitiva e demência correlaciona-se com taupatia, não com patologia do amiloide, exemplificada mais recentemente por vários estudos clínicos na fase 1 & 2 que incluem imagens de PIB-PET para amiloide e identificam muitos "falsos positivos": indivíduos cognitivamente normais com alta carga de amiloide cerebral; • Na FTD familiar, a taupatia é provocada por tau mutante e causa neurodegeneração diretamente, sem patologia do amiloide; • Em modelos experimentais de camundongo, os defeitos cognitivos causados pela patologia do amiloide são quase completamente aliviados pela ausência de tau de proteína (Roberson et al., 2007).
[008] Os argumentos combinados sustentam a hipótese que o tau de proteína tem um papel importante no desaparecimento cognitivo na DA e relacionados a tauopatias neurodegenerativas.
[009] Um tratamento emergente proeminente da DA é por imunoterapia passiva com mAbs específicos, para limpar peptídeos amiloides e seus agregados que se presumem ser neuro-tóxicos ou sinapto-tóxicos.
[010] A imunoterapia direcionada à patologia de tau, como proposto aqui, é antecipada para neutralizar a proteína patológica confôrmeros tau que são conhecidos ou postulados para causar disfunção sináptica e neurodegeneração.
[011] Outras abordagens terapêuticas que se destinam ao tau de proteína são escassas e compreendem principalmente: • inibidores de quinases que são pensados por aumentar a fosforilação do tau para níveis patológicos • compostos que bloqueiam a agregação citoplasmática de tau de proteínas hiperfosforiladas.
[012] Essas abordagens sofrem várias retrações de especificidade e eficácia, um problema que compartilham com as tentativas de modificar o metabolismo do APP e amiloide, todas enfatizando a importância de uma busca contínua de opções de tratamento adicional, incluindo imunoterapia contra tau. Com efeito, imunoterapia direcionada à amiloide em um modelo de camundongos pré-clínicos com patologia similar à DA combinada também demonstrou um efeito sobre a patologia de tau embora agregados de tau tenham persistido (Oddo et al., 2004).
[013] Algumas dúvidas foram lançadas sobre a viabilidade de se abordar tau de proteína intracelular por imunoterapia. Estas têm sido combatidas pelo mais recente estudo experimental em um modelo do camundongo de taupatia (Asuni et al., 2007). Eles mostraram redução na patologia de emaranhado e melhorias funcionais por vacinação com um fosfo- peptídeo derivado de tau de proteína. Estes dados corroboram os relatórios anteriores da imunoterapia direcionando a-sinucleína em modelos de doença de Corpos de Lewy e a doença de Parkinson (DP) (Masliah et al., 2005, 2011) e da superóxido dismutase em um modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) (Urushitiani et al., 2007). Estas doenças são exemplos onde proteínas intracelulares levam a defeitos sinápticos e neurodegeneração por como mecanismos ainda não totalmente compreendidos.
[014] Há uma necessidade não atendida de imunoterapias passivas E/ou ativas que trabalham para neutralizar os confôrmeros de proteínas patológica de que são conhecidos - ou presumidos - por causar doenças neurodegenerativas, tais como patologia de amiloide em DA causada, por exemplo, por agregados intra neuronais de tau de proteína hiper-fosforilada da proteína que são tão típicos para DA como amiloide.
[015] Esta necessidade insatisfeita é atendida pela presente invenção que prevê proteínas reconhecendo e vinculando aos principais fosfo- epítopos patológicos da proteína tau. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos específicos contra fosfo-epítopos lineares e conformacionais, simples e complexos em tau de proteína, particularmente na tau de proteína agregado que se acredita serem responsáveis por sinapto e neuro-toxicidade em tauopatias, incluindo DA.
[016] Nesse sentido, a presente invenção refere-se em uma modalidade de uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional destes, tal proteína ou peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente em a proteína tau humana ou em um fragmento disso, particularmente a um fosfo-epítopo na proteína tau agregada, particularmente a um confôrmero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo, particularmente no cérebro, particularmente com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, particularmente de pelo menos 8 nM, particularmente de pelo menos 5 nM, particularmente de pelo menos 2 nM, particularmente de pelo menos 1 nM, particularmente de pelo menos 500 pM, particularmente de pelo menos 400 pM, particularmente de pelo menos 300 pM, particularmente de pelo menos 200 pM, particularmente de pelo menos 100 pM, particularmente de pelo menos 50 pM.
[017] Em particular, a constante de dissociação é em uma faixa entre 2 nM e 80 nM, particularmente entre 2 nM e 40 nM, particularmente entre 2 nM e 10 nM.
[018] Em certo aspecto, aqui é fornecido um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, em que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a um fosfo-epítopo tendo, ou dentro da, sequência de aminoácidos VYKSPVVSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau aa 393-408 da SEQ ID NO: 67, por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 1) compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396) e na posição 404 (pS404).
[019] Em uma segunda modalidade, a presente invenção refere- se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e tem uma taxa de constante de associação de 104 M-1s-1 ou maior, particularmente de entre 3 - 5 x 104 M-1s- 1 ou maior, particularmente de 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 2 - 9 x 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 1 - 4 x 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 107 M-1s-1 ou maior.
[020] Em particular, a taxa de constante de associação está em uma faixa entre 1,6 x 103 e 5 x 105, particularmente entre 2,4 x 104 e 5 x 105, entre 3 x 103 e 5 x 105.
[021] Em uma terceira modalidade, a presente invenção refere- se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e tem uma ligação de alta afinidade com uma constante de dissociação de pelo menos 4 nM e uma taxa de constante de associação de 105 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 3 nM e uma taxa de constante de associação de 106 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação pelo menos 2 nM e uma taxa de constante de associação de 104 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação pelo menos 1 nM e uma taxa de constante de associação de 105 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação pelo menos 200 pM e uma taxa de constante de associação de 105 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 100 pM e uma taxa de constante de associação de 106 M-1s-1 ou maior.
[022] Em particular, a constante de dissociação está em uma faixa entre 2 nM e 80 nM e a taxa de constante de associação está em uma faixa entre 1,6 x 103 e 5 x 105, particularmente a constante de dissociação está em uma faixa entre 2 nM e 40 nM e a taxa de constante de associação está em uma faixa entre 2,4 x 104 e 5 x 105, particularmente a constante de dissociação está em uma faixa entre 2 nM e 10 nM e a taxa de constante de associação está em uma faixa entre 3 x 103 e 5 x 105.
[023] Uma modalidade (4) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína Tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, selecionada do grupo constituído por Tau aa 393-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 396-401,compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 394-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 402-406, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404) e aa Tau 393-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[024] Uma modalidade (5) refere-se ao peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, em que tal peptídeo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente diante da proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, compreendendo Tau aa 393-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[025] Uma modalidade (6) refere-se ao peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, em que tal peptídeo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente diante da proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, compreendendo Tau aa 396-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[026] Uma modalidade (7) refere-se ao peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, em que tal peptídeo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente diante da proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, compreendendo Tau aa 394-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[027] Uma modalidade (8) refere-se ao peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, em que tal peptídeo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente diante da proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, compreendendo Tau aa 402-406, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404).
[028] Uma modalidade (9) refere-se ao peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, em que tal peptídeo liga-se a um epítopo em um mamífero, particularmente diante da proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana como mostrado na SEQ ID NO: 67, compreendendo Tau aa 393-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[029] Uma modalidade (10) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 73, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 74, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 70, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 72, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
[030] Em um aspecto, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo numa proteína Tau de mamífero ou em um fragmento da mesma, em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) um primeiro domínio de ligação, compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 73, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 74, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75; e/ou (b) um segundo domínio de ligação, compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 70, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 72.
[031] Uma modalidade (11) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 81, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 82, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 83, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma e/ou um segundo domínio de ligação, compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 78, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 79, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 80, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
[032] Em um aspecto, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo numa proteína Tau de mamífero ou em um fragmento da mesma, em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) um primeiro domínio de ligação, compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 81, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 82, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 83; e/ou (b) um segundo domínio de ligação, compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 78, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 79, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 80.
[033] Uma modalidade (12) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 93, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 94, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo, na sequência, uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 90, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 91, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos de 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[034] Em um determinado aspecto, é fornecido aqui um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo numa proteína Tau de mamífero ou em um fragmento da mesma, em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) um primeiro domínio de ligação, compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 93, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 94, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95; e/ou (b) um segundo domínio de ligação, compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 90, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 91.
[035] Uma modalidade (13) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 101, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 102, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 103, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo, na sequência, uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 98, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 99, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 100, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos de 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[036] Em um aspecto, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo numa proteína Tau de mamífero ou em um fragmento da mesma, em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) um primeiro domínio de ligação, compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 101, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 102, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 103; e/ou (b) um segundo domínio de ligação, compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 98, um CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 99, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 100.
[037] Uma modalidade (14) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 106, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 107, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 108, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo, na sequência, uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 89, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 115, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 91, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos de 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[038] Em um aspecto específico, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo numa proteína Tau de mamífero ou em um fragmento da mesma, em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (a) um primeiro domínio de ligação, compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 106, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 107, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 108; e/ou (b) um segundo domínio de ligação, compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 89, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 115, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 91.
[039] Em certa modalidade, o primeiro domínio de ligação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo respectivo aqui descrito é uma região variável da cadeia leve, e o segundo domínio de ligação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo respectivo aqui descrito é uma região variável da cadeia pesada.
[040] Outra modalidade (15) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 118, 97, 105, ou uma sequência de aminoácidos de particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 86%, particularmente pelo menos 87%, particularmente pelo menos 88%, particularmente pelo menos 89%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
[041] Uma modalidade (16) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 69, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% ou 99% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 68, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 91%, 92% ou 93% idêntica à mesma.
[042] Uma modalidade (17) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 77, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, 94% ou 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 76, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 88%, 89% ou 90% idêntica à mesma.
[043] Uma modalidade (18) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 116, 92 ou 118, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, 94% ou 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 88, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 91%, 92% ou 93% idêntica à mesma.
[044] Uma modalidade (19) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 97, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 96, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 86%, 87%, 88% ou 90% idêntica à mesma.
[045] Uma modalidade (20) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 105, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% ou 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 104, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 88%, 89% ou 90% idêntica à mesma.
[046] Uma modalidade (21) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 69, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 68, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 93% idêntica à mesma.
[047] Uma modalidade (22) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 77, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 76, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma.
[048] Uma modalidade (23) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 116, 92 ou 118 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 93 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 88, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 93% idêntica à mesma.
[049] Uma modalidade (24) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 97 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 96, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma.
[050] Uma modalidade (25) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% ou 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 104, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma.
[051] Uma modalidade (26) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, de acordo com a modalidade (16), em que tal primeiro domínio de ligação contém as CDRs como mostrado na SEQ ID NO: 73-75 e tal segundo domínio de ligação contém as CDRs como mostrado nas SEQ ID NOs: 70-72.
[052] Uma modalidade (27) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, de acordo com a modalidade (17), em que tal primeiro domínio de ligação contém as CDRs como mostrado na SEQ ID NO: 81-83 e tal segundo domínio de ligação contém as CDRs como mostrado nas SEQ ID NOs: 78-80.
[053] Uma modalidade (28) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, de acordo com a modalidade (18), em que tal primeiro domínio de ligação contém as CDRs como mostrado na SEQ ID NO: 93-95 e tal segundo domínio de ligação contém as CDRs como mostrado nas SEQ ID NOs: 12, 90 e 91.
[054] Uma modalidade (29) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, de acordo com a modalidade (19), em que tal primeiro domínio de ligação contém as CDRs como mostrado na SEQ ID NO: 101-103 e tal segundo domínio de ligação contém as CDRs como mostrado nas SEQ ID NOs: 98-100.
[055] Uma modalidade (30) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação ou uma parte funcional destes, particularmente a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, de acordo com a modalidade (18), em que tal primeiro domínio de ligação contém as CDRs como mostrado na SEQ ID NO: 89, 115, e 91 e tal segundo domínio de ligação contém as CDRs como mostrado nas SEQ ID NOs: 106-108.
[056] Em ainda outra modalidade (31) da presente invenção refere-se a uma proteína ou peptídeo de ligação de ou de uma parte funcional destes, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou parte funcional destes, particularmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer das modalidades anteriores, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento deste, particularmente para um confômero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta para Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel e é capaz de detectar e/ou modular níveis de Tau de proteína fosforilado solúvel, oligomérico e insolúvel in vivo e em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo compreende: a. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 69, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 68; ou b. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 77, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 76; ou c. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 116, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 88; ou d. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 92, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 88; ou e. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 97, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 96; ou f. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 105, e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 104. g. um primeiro domínio de ligação, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 118 e/ou um segundo domínio de ligação compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 88
[057] Em uma modalidade (32) da invenção, o peptídeo de ligação de qualquer uma das modalidades da anteriores é um anticorpo, particularmente um anticorpo do isótipo IgG2a, IgG2b ou o IgG3, particularmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano.
[058] Uma modalidade (33) da invenção relaciona-se com um polinucleotídio codificando o peptídeo de ligação de qualquer uma das modalidades anteriores.
[059] Um uma modalidade (34), tal polinucleotídio compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em: a. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácidos como retratado na SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; b. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 85% de identidade de sequência para a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; c. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; d. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 95% de identidade de sequência para a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; e. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 98% de identidade de sequência para a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; f. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 e 119; g. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica da fita complementar da qual hibridiza na molécula de ácido nucleico de qualquer um de a) - f); h. uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que se desvia da sequência nucleotídica definida em qualquer um de a) - g) pela degeneração do código genético: em que tal molécula do ácido nucleico como definido em qualquer um de a) - h) reconhece e liga-se especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento dos mesmos, particularmente na proteína Tau humana conforme SEQ ID NO: 67, selecionada do grupo constituído por Tau aa 393-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 396-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 394-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 402-406, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404) e aa Tau 393-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), em que, em uma modalidade, tal peptídeo de ligação tem uma afinidade de ligação alta com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, particularmente pelo menos 8 nM, particularmente pelo menos 5 nM, particularmente pelo menos 2 nM, particularmente pelo menos 1 nM, particularmente de pelo menos 500 pM, particularmente pelo menos 400 pM, particularmente pelo menos 300 pM, particularmente pelo menos 200 pM, particularmente de pelo menos 100 pM, particularmente pelo menos 50 pM e/ou tem uma taxa de constante de associação de 104 M-1s-1 ou maior, particularmente de entre 3 - 5 x 104 M-1s-1 ou maior, particularmente de 105 M-1s-1 maior; particularmente de 6 - 9 x 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 106 M-1s-1 maior, particularmente de 1 - 4 x 106 M- 1s-1 ou maior, particularmente de 107 M-1s-1 ou maior, mas, em uma modalidade, não se liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado.
[060] Em várias modalidades (35) da invenção, um peptídeo de ligação é fornecido ou um parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional destes, ou um polinucleotídio, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, ou uma combinação destas, que é capaz de especificamente reconhecer e ligar a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, particularmente um tau da proteína associado ao microtúbulo, particularmente um tau da proteína hiperfosforilado e associado ao microtúbulo agregado como aquele presente em filamentos helicoidais pareados (PHF), que são as estruturas predominantes em emaranhados neurofibrilares, filamentos de neurópilo e neuritos distróficos, mas, em uma modalidade, não se liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou não relacionado.
[061] Em uma modalidade específica (36) da invenção, a proteína tau humana é a proteína Tau humana conforme mostrado na SEQ ID NO: 67.
[062] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, portanto, podem ser usados (37) para redução dos níveis de proteína tau solúvel total, particularmente da proteína tau fosforilada solúvel, no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou um humano contendo níveis aumentados de proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada solúvel.
[063] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores também podem ser usados (38) para redução de filamentos helicoidais pareados contendo proteína tau hiperfosforilada (pTau PHF), no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou um humano contendo níveis aumentados de tal pTau ou filamentos helicoidais pareados.
[064] A redução do nível de tau solúvel total da proteína e/ou proteína tau fosforilada solúvel e/ou filamentos helicoidais pareados pTau no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou um humano contendo níveis aumentados de variantes de tal proteína tau, que contribuem para doenças associadas à proteína tau, distúrbios ou condições no referido mamífero ou humano, pode levar a uma melhoria e/ou alívio dos sintomas associados com tais doenças, distúrbios ou condições (39) associados à proteína tau.
[065] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores podem ser usados (40) na terapia, particularmente na terapia humana, para abrandar ou parar a progressão de uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína tau.
[066] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores também podem ser usados (41) na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com doenças, distúrbios ou condições associados à proteína tau, tais como, por exemplo, deficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial etc.
[067] Em uma modalidade (42), a invenção relaciona-se com os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores para usam em terapia, particularmente para uso no tratamento de tauopatias, um grupo de distúrbios e doenças associados à proteína tau, ou para aliviar os sintomas associados com tauopatias.
[068] Em uma modalidade (43), a invenção refere-se aos peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores para manter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero sofrendo de uma taupatia.
[069] Em outra modalidade específica (44) da invenção, peptídeos de ligação e anticorpos compreendendo pelo menos um ou todos das CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35- 2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; como fornecidos nas SEQ ID NOs: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108 e/ou pelo menos um ou todos das CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35- 2G5-Ab3; como fornecidos nas SEQ ID NOs: 70-72, 78-80, (12, 90, 91), 98100, (89, 115, 91) são usados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com doenças, distúrbios ou condições associados à proteína tau, tais como, por exemplo, deficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial etc.
[070] Em outra modalidade específica (45) da invenção, peptídeos de ligação e anticorpos compreendendo pelo menos um ou todos das CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-35-2 G 5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3 confirme fornecidos nas SEQ ID NOs: 106-108 e/ou pelo menos um ou todos das CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; como fornecidos nas SEQ ID NOs: 89, 115 e 91 são usados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com doenças, distúrbios ou condições associados à proteína tau, tais como, por exemplo, deficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial etc.
[071] A ligação dos peptídeos ou anticorpos, de acordo com as modalidades anteriores, a emaranhados de tau e pTau no cérebro pode ser determinada através da aplicação de teste de imunorreatividade de proteína em seções selecionadas do cérebro e por Western blot de homogenatos do cérebro, respectivamente, conforme descrito nos Exemplos.
[072] Em outra modalidade (46), a presente invenção fornece uma composição farmacêutica, compreendendo um peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional destes, ou um polinucleotídio, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas, em uma quantidade terapeuticamente eficaz juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável.
[073] Em uma modalidade (47), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional destes, ou um polinucleotídio, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas, é usado em terapia, particularmente em terapia humana para o tratamento ou alívio dos sintomas de doenças ou distúrbios associados à proteína tau incluindo distúrbios neurodegenerativos como tauopatias.
[074] Os peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, portanto, podem ser usados (48) para abrandar ou parar a progressão de condições, distúrbios ou doenças associadas à proteína tau, mediante administração de tais peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas a um animal, particularmente um mamífero, particularmente um humano, sofrendo de tal doença ou condição.
[075] Os peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, portanto, também podem ser usados (49) para melhorar ou aliviar os sintomas de condições, distúrbios ou doenças associados à proteína tau, tais como, por exemplo, deficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial etc. mediante administração de tais peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas a um animal, particularmente um mamífero, particularmente um humano, sofrendo de tal doença ou condição.
[076] Em uma modalidade (50), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleótidio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, ou uma combinação das mesmas, é usado no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia predominante do cérebro em taupatia compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que manifestam tanto patologias do tau do amiloide, incluindo, mas não limitado a, a doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilistica, síndrome de Down, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite por corpos de inclusão e angiopatia amiloide cerebral da proteína príon, traumatismo crânio- encefálico e outras doenças ou distúrbios que não mostram uma patologia do amiloide distinta incluindo, mas entre outros, complexo esclerose amiotrófica lateral-Parkinson-demência de Guam, doença do neurônio motor não chamorro com emaranhados neurofibrilares, demência de grão argirofílico, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, síndrome de Hallevorden-Spatz, atrofia de sistema múltiplo, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração pálido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas do emaranhado, parkinsonismo pós-encefalite, distrofia miotônica.
[077] Em uma modalidade (51), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleótido ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, ou uma combinação dos mesmos, é usado no tratamento da doença de Alzheimer.
[078] Em uma modalidade (52) da invenção, um método é fornecido para detectar e/ou modular níveis da proteína Tau fosforilada solúvel e/ou oligomérica e/ou insolúvel, particularmente in vivo, particularmente no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um animal, especialmente um mamífero ou um ser humano, compreendendo a administração a tal animal, particularmente de mamíferos ou humanos, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[079] Em um aspecto, a modulação relaciona-se com a redução dos níveis de proteína tau solúvel total, particularmente da proteína tau fosforilada solúvel, no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou um humano contendo níveis aumentados de proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada solúvel.
[080] Em uma modalidade (53) da invenção, um método é fornecido para reduzir os níveis da proteína tau insolúvel, particularmente de filamentos helicoidais pareados contendo proteína tau hiperfosforilada (pTau PHF) no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um animal, especialmente um mamífero ou um ser humano, contendo níveis elevados de proteína tau insolúvel, particularmente de filamentos helicoidais pareados pTau (pTau PHF) compreendendo a administração a tal animal, particularmente de mamíferos ou humanos, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[081] Em uma modalidade (54) a presente invenção refere-se a um método para abrandar ou parar a progressão de uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína tau em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, compreendendo a administração a tal animal, particularmente a tal mamífero ou ser humano, sofrendo de tal doença ou condição, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[082] Em uma modalidade (55) a presente invenção refere-se a um método para melhorar ou aliviar os sintomas associados a uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína tau, como, por exemplo, deficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial etc., em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, compreendendo a administração a tal animal, particularmente a tal mamífero ou ser humano, sofrendo de tal doença ou condição, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[083] Em uma modalidade (56), a presente invenção refere-se a um método para manter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero sofrendo de uma taupatia.
[084] Em ainda outra modalidade (57) a presente invenção refere-se a um método fornecido para o tratamento de doença ou distúrbio associado à proteína tau, incluindo um distúrbio ou doença degenerativos, tal como tauopatia, compreendendo a administração a tal animal, particularmente tal mamífero ou ser humano, sofrendo de tal doença ou distúrbio, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[085] Em uma modalidade (58) da invenção, o método é fornecido para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou estão associados à formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante na tauopatia compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que manifestam patologias de tau e amiloides, incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jacob, demência pugilística, síndrome de Down, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miosite com corpo de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral da proteína de príon, lesão cerebral traumática e outras doenças ou distúrbios que não mostram uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitadas a, esclerose amiotrófica lateral/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, demência frontotemporal, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração pálido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhados, parkinsonismo pós-encefalítico e distrofia miotônica, método este que compreende a administração a tal animal, particularmente tal mamífero ou ser humano, sofrendo de tal doença ou distúrbio, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas
[086] Em uma modalidade (59) da invenção, um método é fornecido para induzir para resposta imune passiva em um animal, especialmente um mamífero ou um humano, sofrendo de um distúrbio neurodegenerativo, tais como uma tauopatia, administrando a tal animal ou ser humano o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores ou uma combinação destas.
[087] Em ainda outra modalidade (60) da invenção, refere-se a um método fornecido para diagnosticar uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína tau em um paciente, compreendendo a detecção da ligação imunoespecífica o peptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, a um epítopo da proteína tau e uma amostra ou in situ que inclui as etapas de: a. colocar a amostra ou uma parte específica do corpo ou a área do corpo com suspeita de conter a proteína tau em contato com um peptídeo de ligação ou um fragmento do mesmo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; b. permitir tal peptídeo de ligação, particularmente tal anticorpo, particularmente tal anticorpo monoclonal ou parte funcional deste, a ligar à proteína tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico; e d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência da proteína tau na amostra ou parte ou área do corpo específica,
[088] Em ainda outra modalidade (61) da invenção, um método é fornecido para diagnosticar uma predisposição a uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína tau em um paciente, compreendendo a detecção da ligação imunoespecífica o peptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, a um epítopo da proteína tau e uma amostra ou in situ, que inclui as etapas de: a. colocar a amostra ou uma parte específica do corpo ou a área do corpo com suspeita de conter o antígeno tau em contato com um peptídeo de ligação ou um fragmento ativo do mesmo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que tal peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; b. permitir tal peptídeo de ligação, particularmente tal anticorpo, particularmente tal anticorpo monoclonal ou parte funcional deste, a ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico; e d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do antígeno tau na amostra ou parte ou área do corpo específica, e. comparar a quantidade de tais complexos imunológicos a um valor de controle normal; em que um aumento na quantidade do referido agregado, em comparação a um valor controle normal, indica que o referido paciente está sofrendo ou tem o risco de desenvolver uma doença ou condição associada à proteína tau.
[089] Em uma modalidade (62) da invenção, um método é fornecido para monitorar a doença residual mínima em um paciente seguindo o tratamento com o peptídeo de ligação ou parte funcional deste, nomeadamente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que tal método compreende: a. colocar a amostra ou uma parte específica do corpo ou a área do corpo com suspeita de conter o antígeno tau em contato com o peptídeo de ligação ou um fragmento do mesmo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que tal peptídeo de ligação ou anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; b. permitir tal peptídeo de ligação, particularmente tal anticorpo, particularmente tal anticorpo monoclonal ou parte funcional deste, a ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico; e d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do antígeno tau na amostra ou parte ou área específica do corpo, e. comparar a quantidade de tais complexos imunológicos a um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do referido agregado, em comparação a um valor controle normal, indica que o referido paciente sofre de uma doença residual mínima.
[090] Em uma modalidade (63), um método é fornecido para a previsão da responsividade de um paciente sendo tratado com o peptídeo de ligação ou parte funcional deste, nomeadamente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, ou um polinucleotídio ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo: a. colocar a amostra ou uma parte específica do corpo ou a área do corpo com suspeita de conter o antígeno tau em contato com um peptídeo de ligação ou um fragmento ativo do mesmo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que tal peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; b. permitir tal peptídeo de ligação, particularmente tal anticorpo, particularmente tal anticorpo monoclonal ou parte funcional deste, a ligar ao antígeno tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico; e d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do antígeno tau na amostra ou parte ou área específica do corpo, e. comparar a quantidade do referido complexo imunológico antes e após o início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade do referido agregado indica que o referido paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.
[091] Anticorpos anti-Tau e respectivos fragmentos podem ser utilizados nos métodos da invenção acima. Nos métodos acima, a amostra contendo o anticorpo ou fragmento deste pode ser enriquecida imunologicamente para aumentar a concentração de proteína Tau na amostra contactando a amostra com um anticorpo anti-Tau ou um fragmento deste anexado a um sólido suporte.
[092] Antes da etapa (a), a amostra é enriquecida imunologicamente para aumentar a concentração da proteína Tau na amostra, colocando em contato a amostra com um anticorpo anti-Tau ou um fragmento do mesmo anexado a um suporte sólido.
[093] Em outra modalidade (64), a invenção relaciona-se a um kit de teste para a detecção e diagnóstico de doenças, distúrbios ou condições associados à proteína tau compreendendo um peptídeo de ligação ou um fragmento ativo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
[094] Em uma modalidade (65), o referido kit de teste compreende um recipiente contendo um ou mais peptídeos de ligação ou fragmentos ativos dos mesmos, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes e instruções para o uso dos peptídeos de ligação para a finalidade de ligação ao antígeno tau para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico, de forma que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com a presença ou ausência do antígeno tau.
[095] Em ainda outra modalidade (66), a presente invenção refere-se a um epítopo de um mamífero, particularmente na proteína Tau humana conforme na SEQ ID NO: 67, selecionada do grupo constituído por Tau aa 393-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 396-401,compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 394-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), Tau aa 402-406, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404) e aa Tau 393-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[096] Em uma modalidade (67), tal epítopo consiste de Tau aa 393-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[097] Em uma modalidade (68), tal epítopo consiste de Tau aa 396-401, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[098] Em uma modalidade (69), tal epítopo consiste de Tau aa 394-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[099] Em uma modalidade (70), tal epítopo consiste de Tau aa 402-406, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404).
[0100] Em uma modalidade (71), tal epítopo consiste de Tau aa 393-400, compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
[0101] Em outra modalidade (72), a invenção relaciona-se a uma linhagem de células produzindo um peptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
[0102] Em uma modalidade (73), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A4-4A6-48 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136.
[0103] Em uma modalidade (74), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A6-2G5-30 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137.
[0104] Em uma modalidade (75), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A6-2G5-41, depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
[0105] Em uma modalidade (76), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A4-2A1-18 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139.
[0106] Em uma modalidade (77), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A4-2A1-40 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140.
[0107] Em uma modalidade (78), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12 depositado em 6 de setembro de 2011 como DSM ACC3141.
[0108] Em uma modalidade (79), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídio localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A4-2A1-18 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139 usando: a. um par de iniciador, compreendendo um 5'-iniciador da SEQ ID NO: 149 e um 3'-iniciador da SEQ ID NO: 51 para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139 e 140 e um 3'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 131, 134 e 141-148, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0109] Em uma modalidade (80), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídio localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A6-2G5-30 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137 usando: a. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 51 e 169-174 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 51 para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 124, 127, e 150-158 e um 3'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 130 e 159-168, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0110] Em uma modalidade (81), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídio localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A4-2A1-40 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140 usando: a. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 178, 179 e 180 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 51 para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NO s: 121, 127, 139, 154, 155, e 175 e um 3'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 128, 129, 147, 176, e 177, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0111] Em uma modalidade (82), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídio localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A6-2G5-41 depositado em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138 usando: a. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 51 e 188-192 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 51 para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NO s: 120, 124, 126, 181, 182 e 183 e um 3'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 144, 145 e 184-187, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0112] Em uma modalidade (83), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional respectivas, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por uma polinucleotídicas localizada em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A4-4A6-48 depositado na 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136 usando: a. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 50 e 201-204 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 51 para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NO s: 121, 137, 151 e 193-197 e um 3'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 131, 141, 144, 166, 198, 199 e 200, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0113] Em uma modalidade (84), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, composta por uma cadeia leve (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídio localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por amplificação por PCR do DNA da linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12 depositado em 6 de setembro de 2011 como DSM ACC3141 usando: a. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NOs: 209-214 e 219-221 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 215, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou b. uma mistura de iniciadores, compreendendo um 5'-iniciador selecionado do grupo constituído por SEQ ID NO s: 216, 217 e 218 e um 3'- iniciador da SEQ ID NO: 208, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0114] Em uma modalidade (85), o anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo camelídeos, um fragmento de anticorpo dimérico ou um anticorpo projetado ou modificado.
[0115] Em uma modalidade (86), a invenção fornece um método para produzir os peptídeos de ligação ou anticorpos de qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo a etapa de cultivo a linhagem de célula de qualquer uma das modalidades anteriores em um meio de cultivo adequado e, opcionalmente, purificando os peptídeos de ligação ou anticorpo do meio de cultivo ou linhagem de célula.
[0116] Em outra modalidade (87), a presente invenção fornece um método de detecção de multímeros de fosfo-Tau (pTau) em uma amostra de cérebro compreendendo: a. colocar uma amostra em contato com um anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, cujo peptídeo ou fragmento se liga a um epítopo da proteína fosfo-Tau; b. permitir que o anticorpo se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico, particularmente através da aplicação de um ensaio ELISA.
[0117] Em particular, a invenção relaciona-se em uma modalidade específica (88) a um método de detecção post-mortem de multímeros do fosfo- Tau (pTau) em homogenatos de cérebro de um sujeito em suspeita de sofrer de uma doença ou distúrbio associados ao tau e de um sujeito de controle de saúde compreendendo: a. colocar uma amostra homogenatos de cérebro de ambos os sujeitos em contato com um anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, cujo peptídeo ou fragmento se liga a um epítopo da proteína fosfo-Tau; b. permitir que o anticorpo se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico; c. detectar a formação do complexo imunológico, particularmente através da aplicação de um ensaio ELISA e d. , comparar a quantidade ou intensidade do complexo imunológico na amostra obtida a partir do sujeito suspeito de sofrer de uma doença associada ao tau ou da amostra controle, em que um aumento na quantidade ou intensidade do referido complexo imunológico, em comparação ao valor controle, indica que o referido paciente sofreu de uma doença residual mínima.
[0118] Em uma modalidade (89), o aumento observado na amostra em comparação com as amostras de controle é entre 30% e 50%, particularmente entre 35% e 45%.
[0119] Em uma modalidade (90), a invenção fornece um peptídeo de ligação ou proteína ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, cujo anticorpo ou fragmento mostra um perfil pK favorável. Em particular, tal anticorpo ou fragmento tem uma concentração de soro alta de até 10 dias pós administração, que indica um perfil farmacocinético (PK) favoravelmente suporta o uso de tais anticorpos como um anticorpo terapêutico. (Deng et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2012, 8(2) 141-60; Putman et al., Trends Biotech, 2010 (28) 509-516; Bai, S. Clin Pharmacokinet 2012; 51 (2): 119-135.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E SEQUÊNCIAS FIGURAS
[0120] A Figura 1 mostra resultados de detecção de multímeros de Tau fosforilados por ACI-35-2A1-Ab1 (painel esquerdo), ACI-35-2G5-Ab3 (painel central) e um anticorpo de controle (HT7; painel direito) no homogeneizado de cérebro de controle e sujeitos com DA.
[0121] A Figura 2 (2A e 2 B) mostra os resultados de detecção de total e p-Tau por anticorpos comerciais homogeneizado de cérebro humano.
[0122] A Figura 3 (3A, 3B, 3C) mostra a detecção de fosfo-Tau por ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B) e ACI-35-2G5-Ab3 (C) em homogeneizado de cérebro humano.
[0123] A Figura 4 (4A, 4B, 4C) mostra os resultados de detecção de Tau-pS396 em DA humana e cérebro de controle (Ctrl) por ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B) e ACI-35-2G5-Ab3 (C) anticorpos usando AlphaLISA. ****p<0,0001, **p<0,01 por teste Mann-Whitney.
[0124] A Figura 5 (5A e 5B) mostra resultados de coloração de IHC (AT180) de Tau-pT231 na amígdala (A) e hipocampo (B), no tratamento de camundongos transgênicos de Tau com ACI-35-2G5-Ab3.
[0125] A Figura 6 (6A e 6B) mostra resultados de coloração de IHC (HT7) de Tau total na amígdala (A) e hipocampo (B), no tratamento de camundongos transgênicos de Tau com ACI-35-2G5-Ab3.
[0126] A Figura 7 mostra um SDS-PAGE para Tau-pS396 gerado usando diferentes condições de GSK3β e a membrana manchada usando o anticorpo ACI-35-2G5-Ab3.
[0127] A Figura 8 mostra configuração de ensaio AlphaLISA específico usando anticorpos ACI-35-2G5-Ab3-BT e Tau-13.
[0128] A Figura 9 mostra a detecção de Tau-pS396 em fração de cérebro humano S1 de um doador de DA; em comparação com o sinal obtido a partir de amostras enriquecidas com amostras IP e não-IP.
[0129] A Figura 10 mostra resultados de detecção de Tau-pS396 em DA humana e CSF de controle (Ctrl) pelo anticorpo de ACI-35-2G5-Ab3 usando IP seguido por AlphaLISA. *** p=0,0003 por teste Mann-Whitney.
SEQUÊNCIAS
[0130] SEQ ID NO: 46 - 57 retratam as sequências de nucleotídeos de iniciadores diretos e reversos VH/VK.
[0131] SEQ ID NO: 62 retrata a sequência de aminoácidos de antígeno de Tau, peptídeo T3 (ver Tabela 1).
[0132] SEQ ID NO: 67 retrata a sequência de aminoácidos da isoforma mais longa de tau humano (441 aa) também chamado de Tau40.
[0133] SEQ ID NO: 68 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6- Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-18.
[0134] SEQ ID NO: 69 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-18.
[0135] SEQ ID NO: 70 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1.
[0136] SEQ ID NO: 71 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1.
[0137] SEQ ID NO: 72 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1.
[0138] SEQ ID NO: 73 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1.
[0139] SEQ ID NO: 74 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1.
[0140] SEQ ID NO: 75 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1.
[0141] SEQ ID NO: 76 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2- Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12.
[0142] SEQ ID NO: 77 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12.
[0143] SEQ ID NO: 78 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1.
[0144] SEQ ID NO: 79 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1.
[0145] SEQ ID NO: 80 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1.
[0146] SEQ ID NO: 81 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1.
[0147] SEQ ID NO: 82 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1.
[0148] SEQ ID NO: 83 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1.
[0149] SEQ ID NO: 84 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6- Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-18.
[0150] SEQ ID NO: 85 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-18.
[0151] SEQ ID NO: 86 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2- Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12.
[0152] SEQ ID NO: 87 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-1D2-12.
[0153] SEQ ID NO: 88 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1- Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 e ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, produzidos por linhagem de célula de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 e A4-4A6-48, respectivamente.
[0154] SEQ ID NO: 89 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0155] SEQ ID NO: 90 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, e ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente.
[0156] SEQ ID NO: 91 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 e ACI-35- 2G5-AB3, respectivamente.
[0157] SEQ ID NO: 92 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-2A1-40.
[0158] SEQ ID NO: 93 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0159] SEQ ID NO: 94 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia leve (VK) de anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0160] SEQ ID NO: 95 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0161] SEQ ID NO: 96 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-08.
[0162] SEQ ID NO: 97 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-08.
[0163] SEQ ID NO: 98 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0164] SEQ ID NO: 99 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0165] SEQ ID NO: 100 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0166] SEQ ID NO: 101 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0167] SEQ ID NO: 102 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia leve (VK) de anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0168] SEQ ID NO: 103 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0169] SEQ ID NO: 104 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- AB2 e ACI-35-2G5-AB3 respectivamente, produzidos por linhagem de célula de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0170] SEQ ID NO: 105 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0171] SEQ ID NO: 106 retrata a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0172] SEQ ID NO: 107 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0173] SEQ ID NO: 108 retrata a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0174] SEQ ID NO: 109 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1- Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, e ACI-35-4A6-Ab2 respectivamente, produzidos por linhagem de célula de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 e A4-4A6-48, respectivamente.
[0175] SEQ ID NO: 110 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-2A1-40.
[0176] SEQ ID NO: 111 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- AB1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-08.
[0177] SEQ ID NO: 112 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-AB1 produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-08.
[0178] SEQ ID NO: 113 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- AB2 e ACI-35-2G5-AB3 respectivamente, produzidos por linhagem de célula de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0179] SEQ ID NO: 114 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzido por linhagem de células de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0180] SEQ ID NO: 115 retrata a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-AB2 e ACI-35-2G5-AB3.
[0181] SEQ ID NO: 116 retrata a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-2A1-18.
[0182] SEQ ID NO: 117 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-2A1-18.
[0183] SEQ ID NO: 118 retrata a sequência de aminoácidos da variável região da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-48.
[0184] SEQ ID NO: 119 retrata a sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 produzido por linhagem de células de hibridoma A4-4A6-48.
[0185] SEQ ID NO: 120 - 221 retratam as sequências de nucleotídeos de iniciadores diretos e reversos VH/VK.
DEFINIÇÕES DOS TERMOS
[0186] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína", como usados neste documento, são usados de forma permutável e são definidos para significar uma biomolécula composta por aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.
[0187] O termo "polipeptídeo" ou "peptídeo de ligação” é usados forma permutável neste documento e se refere a cadeias de aminoácidos (tipicamente de L-aminoácidos) cujos carbonos alfa estão ligados através de ligações peptídicas formadas por uma reação de condensação entre o grupo carboxila do carbono alfa de um aminoácido e o grupo amino do carbono alfa de outro aminoácido. O aminoácido terminal em uma extremidade da cadeia (ou seja, o amino terminal) tem um grupo amino livre, enquanto o aminoácido terminal na outra extremidade da cadeia (ou seja, o carbóxi terminal) tem um grupo carboxila livre. Como tal, o termo "amino terminal" (abreviado N-terminal) se refere ao grupo alfa-amino livre no aminoácido no amino terminal do peptídeo, ou ao grupo alfa-amino (grupo imina quando participando de uma ligação peptídica) de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo. Da mesma forma, o termo "carbóxi terminal" (abreviado C-terminal) se refere ao grupo carboxila livre no aminoácido no carbóxi terminal de um peptídeo, ou ao grupo carboxila de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo. Um peptídeo de ligação pode constituir anticorpos, tais como anticorpos policlonais ou monoclonais, anticorpos humanos ou humanizados, diacorpos, anticorpos camelídeos, etc., ou partes funcionais do mesmo, conforme definido neste documento.
[0188] O termo "fragmento do(a)(s) mesmo(a)(s)" ou "fragmento", como usado no presente documento no contexto de um peptídeo, refere-se a um fragmento de peptídeo funcional que tem essencialmente a mesma atividade (biológica) que um peptídeo intacto definido neste documento. Os termos, quando usado aqui no contexto de um anticorpo, referem-se a um fragmento de anticorpo que compreende uma porção de um anticorpo intacto que contém uma ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; moléculas de anticorpos de cadeia única, incluindo moléculas de cadeia única Fv (scFv); e anticorpos e/ou fragmentos de anticorpos biespecíficos e multiespecíficos.
[0189] Normalmente, os aminoácidos que compõem um peptídeo são numerados em ordem, começando no amino terminal e aumentando na direção na direção do carbóxi terminal do peptídeo. Assim, quando se diz que um aminoácido "segue" o outro, esse aminoácido é posicionado ao mais próximo ao carbóxi terminal do peptídeo do que o aminoácido anterior.
[0190] O termo "resíduo" é usado neste documento para se referir a um aminoácido que é incorporado em um peptídeo por uma ligação amida. Como tal, o aminoácido pode ser um aminoácido natural ou, a menos que caso contrário limitado, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que funcionam de forma semelhante aos aminoácidos naturais (ou seja, aminoácido mimético). Além disso, um mimético de ligação amida inclui modificações da estrutura principal do peptídeo conhecidas para aqueles versados na técnica.
[0191] A frase "consistindo essencialmente de" é usada neste documento para excluir todos os elementos que alterariam substancialmente as propriedades essenciais dos peptídeos a que a frase se refere. Assim, a descrição de um peptídeo "consistindo essencialmente de..." exclui quaisquer substituições, adições ou deleções de aminoácidos que alterariam substancialmente a atividade biológica de tal peptídeo.
[0192] Além disso, um indivíduo versado na técnica irá reconhecer que, como mencionado acima, substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos (tipicamente menos de 5%, mais tipicamente menos de 1%) em uma sequência codificada são variações conservadoramente modificadas onde as alterações resultam na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituição conservadoras fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas na técnica. Os seguintes seis grupos contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservadoras um para o outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
[0193] As frases "isolado(a)" ou "biologicamente puro(a)(s)" referem-se ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. Assim, os peptídeos aqui descritos não contêm materiais normalmente associados com o seu ambiente in situ. Normalmente, os peptídeos isolados, imunogênicos aqui descritos são pelo menos cerca de 80% puros, geralmente pelo menos cerca de 90%, e de preferência pelo menos cerca de 95%, como medido pela intensidade da banda em um gel colorido prata.
[0194] A pureza ou homogeneidade da proteína pode ser indicada por um número de métodos conhecidos na técnica, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguida de visualização após coloração. Para certos fins, será necessária alta resolução e HPLC ou meios semelhantes para purificação utilizada.
[0195] Quando os peptídeos imunogênicos são relativamente curtos em comprimento (ou seja, menos de cerca de 50 aminoácidos), eles muitas vezes são sintetizados usando técnicas de síntese química padrão do peptídeo.
[0196] A síntese de fase sólida na qual o aminoácido C-terminal da sequência é anexado a um suporte insolúvel, seguido por adição sequencial dos aminoácidos restantes na sequência, é um método preferido para a síntese química dos peptídeos imunogênicos aqui descritos. Técnicas de síntese de fase sólida são conhecidas por aqueles versado na técnica.
[0197] Como alternativa, os peptídeos imunogênicos aqui descritos são sintetizados usando metodologia de ácido nucleico recombinante. Geralmente, isto envolve criar uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo, colocando o ácido nucleico em um cassete de expressão sob o controle de um promotor específico, expressando o peptídeo em um hospedeiro, isolando o peptídeo ou polipeptídeo expressado e, se necessário, renaturando o peptídeo. Técnicas suficientes para guiar um indivíduo versado na técnica através de tais procedimentos são encontradas na literatura.
[0198] Uma vez expressados, os peptídeos recombinantes podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão, incluindo a precipitação do sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese do gel e afins. Composições substancialmente puras de cerca de 50% a 95% de homogeneidade são preferidas, e homogeneidade de 80% a 95% ou maior é mais preferida para utilização como agentes terapêuticos.
[0199] Um indivíduo versado na técnica vai reconhecer que, após a síntese química, expressão biológica ou purificação, os peptídeos imunogênicos podem possuir uma conformação substancialmente diferente do que as conformações nativas dos peptídeos constituintes. Neste caso, muitas vezes é necessário desnaturar e reduzir o peptídeo antiproliferativo e, em seguida, fazer com que o peptídeo se redobre na conformação preferida. Métodos de redução e desnaturação de proteínas e indução de redobramento são bem conhecidos para aqueles versados na técnica.
[0200] A antigenicidade da proteína purificada pode ser confirmada, por exemplo, demonstrando reação com o soro imune ou com antissoros produzidos contra a própria proteína.
[0201] Os termos "um(a)", "uns(umas)" e "o(a)(s)" neste documento são definidos para significar "um(a) ou mais" e incluir o plural, a menos que o contexto seja inadequado.
[0202] Os termos "detectar" ou "detectou", como usados aqui, significam o uso de técnicas conhecidas para a detecção de moléculas biológicas, tais como métodos imunoquímicos ou histológicos e se referem qualitativamente ou quantitativamente à determinação da presença ou da concentração da biomolécula sob investigação.
[0203] "Isolada" significa uma molécula biológica livre de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela ocorre naturalmente.
[0204] Os termos "anticorpo" ou "anticorpos" ou "suas partes funcionais", como usados aqui, são termos reconhecido na técnica e são entendidos como se referindo a moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que se ligam aos antígenos conhecidos, especialmente moléculas de imunoglobulina e porções de moléculas de moléculas imunoglobulina imunologicamente ativas, ou seja, que contêm um sítio de ligação que liga imunoespecificamente um antígeno. A imunoglobulina de acordo com a invenção pode ser de qualquer tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasses da molécula de imunoglobulina.
[0205] "Anticorpos" destinam-se, no âmbito da presente invenção, a incluir anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia única, biespecíficos, de símios, anticorpos humanos e humanizados, anticorpos camelídeos, diacorpos, bem como partes funcionais ou ativos fragmentos dos mesmos. Exemplos de fragmentos ativos de moléculas que se ligam aos antígenos conhecidos incluem fragmentos Fab e F(ab')2, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de Fab da imunoglobulina e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.
[0206] Aqueles fragmentos ativos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção por um número de técnicas. Por exemplo, anticorpos monoclonais purificados podem ser clivados com uma enzima, como a pepsina, e submetidos a filtração em gel por HPLC. A fração apropriada contendo fragmentos Fab pode ser coletada e concentrada por filtração em membrana e afins. Para descrição mais detalhada das técnicas gerais para o isolamento de fragmentos ativos de anticorpos, ver, por exemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med.23: 1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121: 663-69, Academic Press, (1986).
[0207] Um "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo de anticorpo projetado tendo seus CDRs derivados de uma imunoglobulina de doador não humano, as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula sendo derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana(s).
[0208] Um anticorpo humanizado pode se referir ainda a um anticorpo tendo uma região variável onde uma ou mais das suas regiões de framework têm aminoácidos humanos ou de primata. Além disso, resíduos de apoio de framework poderão ser alterados para preservar a afinidade de ligação. Métodos para obter "anticorpos humanizados" são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. (veja, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
[0209] Um "anticorpo humanizado" também pode ser obtido por uma abordagem nova de engenharia genética que permite a produção de anticorpos policlonais semelhantes aos de humanos amadurecidos por afinidade em animais de grande porte como, por exemplo, coelhos (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
[0210] O termo "anticorpo plenamente humano" ou anticorpo "humano" pretende se referir a um anticorpo derivado de camundongos transgênicos carregando genes de anticorpo humano ou de células humanas. Para o sistema imunológico humano, no entanto, a diferença entre anticorpos "plenamente humanos", "humanos" e "humanizados" pode ser insignificante ou inexistente e, como tal, todos os três podem ser de igual eficácia e segurança.
[0211] O termo "anticorpos monoclonais" é também bem reconhecido na técnica e se refere a um anticorpo que é produzido em massa em laboratório a partir de um único clone e que reconhece apenas um antígeno. Os anticorpos monoclonais são tipicamente feitos pela fusão de uma célula B produtoras de anticorpos, normalmente de curta duração, em uma célula de crescimento rápido, como uma célula de câncer (por vezes referida como uma célula "imortal"). A célula híbrida resultante, ou hibridoma, multiplica- se rapidamente, criando um clone que produz grandes quantidades de um anticorpo.
[0212] O termo "antígeno" refere-se a uma entidade ou um fragmento da mesma que pode induzir uma resposta imune em um organismo, particularmente um animal, mais particularmente um mamífero, incluindo um ser humano. O termo inclui imunógenos e regiões responsáveis pela antigenicidade ou determinantes antigênicos.
[0213] Como usado aqui, o termo "solúvel" significa parcialmente ou completamente dissolvido em solução aquosa.
[0214] Também como usado neste documento, o termo "imunogênicas" refere-se a substâncias que provocam ou aumentam a produção de anticorpos, células T e outras células imunes reativas direcionadas contra um agente imunogênico e contribuem para uma resposta imune em humanos ou animais.
[0215] Uma resposta imune ocorre quando um indivíduo produz anticorpos, células T e outras células imunes reativas suficientes contra composições imunogênicas administradas da presente invenção para moderar ou atenuar a doença a ser tratada.
[0216] O termo "hibridoma" é reconhecido na técnica e é compreendido por aqueles versados na técnica como se referindo a uma célula produzida pela fusão de uma célula produtora de anticorpos e uma célula imortal, por exemplo, uma célula de mieloma múltiplo. Esta célula híbrida é capaz de produzir um fornecimento contínuo de anticorpo. Veja a definição de "anticorpo monoclonal" acima e os Exemplos abaixo para uma descrição mais detalhada do método de fusão.
[0217] O termo "carreador", como usado aqui, significa uma estrutura na qual o peptídeo antigênico ou construto supramolecular pode ser incorporado ou com a qual pode ser associado, apresentando ou expondo, assim, peptídeos antigênicos ou parte do peptídeo ao sistema imunológico de um ser humano ou animal. Qualquer partícula que pode ser convenientemente usada em terapia humana ou animal, tais como, por exemplo, uma vesícula, uma partícula ou um corpo de material particulado pode ser usado como um carreador dentro do contexto da presente invenção.
[0218] O termo "carreador" compreende ainda métodos de entrega em que composições de construto antigênico supramolecular compreendendo o peptídeo antigênico podem ser transportadas para sítios desejados por mecanismos de entrega. Um exemplo de tal sistema de entrega utiliza metais coloidais, como ouro coloidal.
[0219] As proteínas do carreador que podem ser usadas nas composições de construto antigênico supramolecular da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a peptídeo de ligação de maltose "MBP"; albumina de soro bovino "BSA"; hemocianina do caramujo Megathura crenulata "KLH"; ovalbumina; flagelina; tiroglobulina; albumina de soro de qualquer espécie; gama globulina de qualquer espécie; células singênicas; células singênicas com antígenos Ia; e polímeros de D- ou L-aminoácidos.
[0220] Ademais, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" refere-se à quantidade de peptídeo de ligação que, quando administrada a um ser humano ou animal, é suficiente para resultar em um efeito terapêutico no dito humano ou animal. A quantidade eficaz é prontamente determinada por um indivíduo versado na técnica seguindo procedimentos de rotina.
[0221] “pTau PHF”, “PHF”, e “filamentos helicoidais pareados" são utilizados aqui como sinônimos e referem-se aos pares de aproximadamente filamentos de 10 nm enrolados em hélices com uma http://www.anvita.info/wiki/Periodicity periodicidade de 160 nm visível na microscopia de elétron http://www.anvita.info/wiki/Microscopy. A largura varia entre 10 e 22 nm. PHF são as estruturas predominantes em emaranhados neurofibrilares de http://www.anvita.info/wiki/Alzheimer%27s_Disease Doença de Alzheimer (DA) e filamentos do neurópilo. PHF também podem ser vistos em alguns, mas nem todos os neuritos distróficos associados com placas neuríticas. O principal componente de PHF é uma forma hiperfosforilada do tau da proteína associado ao microtúbulo http://www.anvita.info/wiki/Microtubule_Associated_Protein_Tau. PHF são compostos de proteínas tau hiperfosforiladas antiparalelas ligadas por bissulfeto http://www.anvita.info/wiki/Microtubule_Associated_Protein_Tau. PHF tau podem ser truncados do seus 20 resíduos de aminoácido de C- terminal http://www.anvita.info/wiki/Amino_Acid_Residue. Os mecanismos subjacentes à formação de PHF são incertos, mas a hiperfosforilação de http://www.anvita.info/wiki/Phosphorylation tau pode desencaixá-lo de http://www.anvita.info/wiki/Microtubule microtúbulos, aumentando o agrupamento solúvel de tau.
[0222] No âmbito da presente invenção, foi demonstrado que a resposta induzida por anticorpos à composição antigênica de acordo com a invenção é largamente independente de célula T. Um modelo do camundongo nude foi usado neste respeito, e camundongos nude foram vacinados e respostas de anticorpos medidas para avaliar a resposta de anticorpo Aβ- específica induzida pela composição antigênica de acordo com a invenção nos camundongos nude imunizados. Os camundongos nude carregam a mutação Foxn1nu e, consequentemente, reduziram a função de células T devido à falta de um timo adequado.
[0223] Uma "quantidade farmaceuticamente eficaz", como usada neste documento, refere-se a uma dose do ingrediente ativo em uma composição farmacêutica adequada para curar, ou pelo menos parcialmente conter, os sintomas da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou quaisquer complicações associadas.
[0224] A presente invenção que provê peptídeos de ligação reconhecendo e se ligando aos principais fosfo-epítopos patológicos da proteína tau. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos específicos contra fosfo-epítopos lineares e conformacionais, simples e complexos em tau de proteína, que se acredita serem responsáveis por sinapto e neuro-toxicidade em tauopatias, incluindo DA.
[0225] Nesse sentido, a presente invenção refere-se em uma modalidade de um peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional deste, tal peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente em a proteína Tau humana ou em um fragmento da mesma, particularmente a um confôrmero da proteína tau patológico, mas, em uma modalidade, não se liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou epítopos não relacionados, em que referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma afinidade de ligação alta com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, particularmente de pelo menos 8 nM, particularmente de pelo menos 5 nM, particularmente de pelo menos 2 nM, particularmente de pelo menos 1 nM, particularmente de pelo menos 500 pM, particularmente de pelo menos 400 pM, particularmente de pelo menos 300 pM, particularmente de pelo menos 200 pM, particularmente de pelo menos 100 pM, particularmente de pelo menos 50 pM.
[0226] Proteína de "Tau solúvel", como usada neste documento, refere-se a proteínas consistindo de dois monômeros de proteína/peptídeo da Tau completamente solubilizados ou de peptídeos/proteínas semelhantes a Tau, ou de peptídeos/proteínas Tau modificados ou truncados ou de outros derivados de monômeros de peptídeos/proteínas Tau e de oligômeros de proteína Tau. "Tau solúvel" exclui particularmente emaranhados neurofibrilares (NFT).
[0227] "Tau Insolúvel", como usado neste documento, refere-se a vários monômeros agregados dos peptídeos ou proteínas Tau, ou de peptídeos/proteínas semelhante a Tau, ou de peptídeos/proteínas Tau modificadas ou truncadas ou de outros derivados de peptídeos/proteínas Tau formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são insolúveis in vitro em meio aquoso e in vivo em mamíferos ou no corpo humano, mais particularmente no cérebro, mas particularmente a vários monômeros agregados de Tau ou de peptídeos/proteínas Tau modificadas ou truncadas ou seus derivados, que são insolúveis em mamíferos ou no corpo humano, mais particularmente no cérebro, respectivamente. "Tau Insolúvel" inclui particularmente emaranhados neurofibrilares (NFT).
[0228] "Tau monomérico" ou "Monômero Tau", como utilizado neste documento, refere-se às proteínas Tau completamente solubilizadas sem complexos agregados em meio aquoso.
[0229] "Tau agregado", "Tau oligomérico" e "oligômero Tau", como usado neste documento, refere-se a vários monômeros agregados dos peptídeos ou proteínas Tau, ou de peptídeos/proteínas semelhante a Tau, ou de peptídeos/proteínas Tau modificadas ou truncadas ou de outros derivados de peptídeos/proteínas Tau formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são insolúveis ou solúveis in vitro em meio aquoso e in vivo em mamíferos ou no corpo humano, mais particularmente no cérebro, mas particularmente a vários monômeros agregados de Tau ou de peptídeos/proteínas Tau modificadas ou truncadas ou seus derivados, que são insolúveis ou solúveis em mamíferos ou no corpo humano, mais particularmente no cérebro, respectivamente.
[0230] Um "anticorpo de modulação" refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, como descrito nas várias modalidades, que podem também regular positivamente (por exemplo, ativar ou estimular), para regular negativamente (por exemplo, inibir ou suprimir) ou de outra forma alterar uma propriedade funcional, atividade biológica ou nível de proteína Tau solúvel e/ou insolúvel e/ou oligomérica, particularmente da proteína tau fosforilada solúvel, in vivo, particularmente no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um animal, especialmente um mamífero ou um humano contendo níveis crescentes de proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada solúvel. Um anticorpo de modulação ou fragmento funcional do mesmo pode agir para modular uma proteína tau ou um polipeptídeo codificando tal proteína tau direta ou indiretamente. Em determinadas modalidades, um anticorpo de modulação ou fragmento funcional do mesmo reduz os níveis de proteína tau solúvel e/ou insolúvel e/ou oligomérica, proteína tau particularmente solúvel e insolúvel, proteína tau oligomérica particularmente solúvel e insolúvel. Em um aspecto, a proteína tau solúvel e/ou insolúvel e/ou oligomérica é proteína tau fosforilada, particularmente proteína tau fosforilada solúvel, no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou um humano contendo níveis aumentados de proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada, especialmente proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada solúvel.
[0231] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um peptídeo de ligação ou parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo compreendendo uma sequência do ácido nucleico codificando o referido peptídeo de ligação ou anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas e reivindicadas neste documento, ou uma combinação dos mesmos, em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0232] Exemplos de carreadores, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente adequados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas de tampão fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc.
[0233] Os peptídeos de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, podem ser preparados em uma formulação fisiologicamente aceitável e podem incluir um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável usando técnicas conhecidas. Por exemplo, os peptídeos de ligação, de acordo com a invenção e como descrito neste documento, incluindo quaisquer peptídeos de ligação funcionalmente equivalente ou partes funcionais dos mesmos, em particular, os anticorpos monoclonais da invenção incluindo quaisquer anticorpos funcionalmente equivalentes ou partes funcionais dos mesmos, são combinados com um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição terapêutica. Exemplos de carreadores, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente adequados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas de tampão fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc.
[0234] A formulação da composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser realizada de acordo com a metodologia padrão conhecida por aqueles versados na técnica.
[0235] As composições da presente invenção podem ser administradas a um sujeito sob a forma de um sólido, líquido ou aerossol na dose apropriada e farmaceuticamente eficaz. Comprimidos, cremes e unidades de dosagem implantáveis são exemplos de composições sólidas. Comprimidos podem ser administrados por via oral. Cremes terapêuticos podem ser administrados topicamente. Unidades de dosagem implantáveis podem ser administradas localmente, por exemplo, em um sítio do tumor, ou podem ser implantadas para liberação sistemática da composição terapêutica, por exemplo, por via subcutânea. Formulações adaptadas para injeção por via intramuscular, via subcutânea, intravenosa, intra-arterial e formulações para administração tópica e intraocular são exemplos de composições líquidas. Exemplos de formulações de aerossol incluem formulações para inalador para administração nos pulmões.
[0236] As composições podem ser administradas por vias de administração padrão. Em geral, a composição pode ser administrada por rota tópica, oral, retal, nasal, intradérmica, intraperitoneal ou parenteral (por exemplo, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular).
[0237] Além disso, a composição pode ser incorporada em matrizes de liberação sustentada, tais como polímeros biodegradáveis, os polímeros sendo implantados nas imediações onde a entrega é desejada, por exemplo, no sítio de um tumor. O método inclui a administração de uma dose única, administração de doses repetidas em intervalos de tempo predeterminados e administração sustentada por um período de tempo predeterminado.
[0238] A matriz de liberação sustentada, como usada aqui, é uma matriz de materiais, normalmente polímeros degradáveis por hidrólise enzimática ou ácido/base ou por dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz é realizada por enzimas e fluidos corporais. A matriz de liberação sustentada é desejavelmente escolhida por materiais biocompatíveis como lipossomas, polilactidas (ácido polilático), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídios, polissacarídeos, ácidos nucleicos, ácidos poliamina, aminoácidos tal como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, propileno de polivinil, polivinilpirrolidona e silicone. Uma matriz biodegradável preferencial é uma matriz de um de polilactida, poliglicolida ou polilactida co-glicólida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico).
[0239] É sabido por aqueles versados na técnica que a dosagem da composição dependerá de vários fatores, tais como, por exemplo, a condição em tratamento, a composição específica utilizada e outros fatores clínicos como peso, tamanho, sexo e estado geral de saúde do paciente, área de superfície corporal, o composto ou composição específica a ser administrada, outras drogas sendo administradas simultaneamente e a via de administração.
[0240] A composição de acordo com a invenção pode ser administrada em combinação com outras composições compreendendo uma substância ou composto biologicamente ativo, tais como, por exemplo, um composto conhecido usado na medicação de tauopatias e/ou de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com amiloide ou proteína semelhante à amiloide, tal como a proteína β amiloide envolvida na doença de Alzheimer.
[0241] A outra substância ou composto biologicamente ativo pode exercer seu efeito biológico pelo mesmo mecanismo ou um mecanismo similar, como a vacina terapêutica de acordo com a invenção, ou por um mecanismo independente de ação ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou independentes.
[0242] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir potenciadores de nêutron-transmissão, drogas psicoterapêuticas, inibidores de acetilcolina esterase, bloqueadores de canais de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizantes benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, armazenamento ou liberação de potenciador, agonistas de receptores pós- sinápticos de acetilcolina, inibidores de monoamina oxidase-A ou -B, antagonistas dos receptores de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas não esteroides anti-inflamatórias, antioxidantes e antagonistas dos receptores serotonérgicos.
[0243] Em particular, o agente ou composto biologicamente ativo pode incluir pelo menos um composto selecionado do grupo constituído por compostos contra o estresse oxidativo, compostos antiapoptóticos, quelantes de metais, inibidores de reparação de DNA, tais como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1-propanossulfônico (3APS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores de secretase, inibidores de [beta]- e 7-secretase, proteínas tau, neurotransmissor, breakers de /3-folha, moléculas anti-inflamatórias, "antipsicóticos atípicos", tais como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina ou inibidores da colinesterase (ChEIs) como a tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina e outras drogas e suplementos nutritivos, tais como, por exemplo, a vitamina B 12, cisteína, um precursor da acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acietil- L-carnitina, idebenona, propentofilina ou um derivado da xantina, juntamente com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e instruções para o tratamento de doenças.
[0244] Em uma outra modalidade, a composição de acordo com a invenção pode incluir niacina ou memantina juntamente com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0245] Em ainda outra modalidade da invenção, são fornecidas composições que compreendem "antipsicóticos atípicos", tais como, por exemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos, incluindo alucinações, delírios, distúrbios do pensamento (manifestados por incoerência marcada, descarrilamento, pensamento tangencial), e comportamento bizarro ou desorganizado, bem como anedonia, efeito achatado, apatia e retraimento social, juntamente com o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos e, opcionalmente, um carreador e/ou diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0246] Outros compostos que podem ser usados adequadamente em composições além do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, são aqueles divulgados, por exemplo, em WO 2004/058258 (consulte especialmente as páginas 16 e 17) incluindo alvos de drogas terapêuticas (página 36-39), ácidos alcanossulfônicos e ácido alcanolssulfúrico (páginas 3951), inibidores da colinesterase (páginas 51-56), antagonistas dos receptores NMDA (páginas 56-58), estrogênios (páginas 58-59), drogas não esteroides anti-inflamatórias (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas (PPAR) dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (páginas 63-67), agentes redutores de colesterol (páginas 68-75); inibidores de amiloide (páginas 75-77), inibidores de formação de amiloide (páginas 77-78), quelantes de metal (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos, aumentando a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (ver páginas 89-93) e pró-drogas (páginas 93 e 94), qual documento está incorporado neste documento por referência, mas especialmente os compostos mencionados nas páginas indicadas acima.
[0247] Matéria farmaceuticamente ativa proteica pode estar presente em quantidades entre 1 ng e 10 mg por dose. Geralmente, o regime de administração deve ser na faixa de entre 0,1 μg e 10 mg do anticorpo de acordo com a invenção, particularmente em uma faixa de 1,0 μg a 1,0 mg, e mais particularmente em uma faixa entre 1,0 μg e 100 μg, com todos os números individuais dentro destas faixas, sendo também parte da invenção. Se a administração ocorre através de infusão contínua, uma dosagem mais adequada pode estar no intervalo de entre 0,01 μg e unidades de 10 mg por quilograma de peso corporal por hora com todos os números individuais dentro destas faixas, sendo também parte da invenção.
[0248] Administração será geralmente por via parentérica, por exemplo, por via intravenosa ou por via subcutânea. Preparativos para a administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, emulsões e suspensões. Solventes não aquosos incluem, entre outros, propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como azeite, e ésteres injetáveis orgânicos, tais como oleato de etila. Solventes aquosos podem ser escolhidos do grupo composto por água, soluções aquosas/de álcool, emulsões ou suspensões incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Transportadores intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer) e outros. Conservantes também podem estar presentes, como por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.
[0249] A composição farmacêutica pode compreender ainda carreadores proteicos, tais como, por exemplo, albumina ou imunoglobulina do soro, particularmente de origem humana. Agentes biologicamente ativos adicionais podem estar presentes na composição farmacêutica da invenção dependendo de seu uso pretendido.
[0250] Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, determinadas modalidades da invenção proveem o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, para atravessar a barreira hemato-encefálica. Certas doenças neurodegenerativas estão associadas com aumento da permeabilidade da barreira hemato-encefálica, tal que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais ou fragmento ativo do mesmo, pode ser facilmente introduzido ao cérebro. Quando a barreira hemato-encefálica permanece intacta, várias abordagens conhecidas na técnica existem para o transporte de moléculas através dela, incluindo, mas não limitado a métodos físicos, métodos baseados em lipídios e métodos baseados no canal e no receptor.
[0251] Métodos físicos de transporte do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou fragmento ativo do mesmo, através da barreira hemato- encefálica incluem, mas não estão limitados a, contornar a barreira hemato- encefálica inteiramente, ou criar aberturas na barreira hemato-encefálica. Métodos de contorno incluem, mas não estão limitados a, injeção direta no cérebro (Veja, por exemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implante de um dispositivo de entrega no cérebro (veja, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); e Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical). Métodos de criação de aberturas na barreira incluem, mas não estão limitados a, ultrassom (ver, por exemplo, Publicação de Patente US n° 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, pela administração de manitol hipertônico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, VoIs 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), permeabilização por, por exemplo, bradicinina ou permeabilizante A-7 (ver, por exemplo, Patente US n° 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 e 5.686.416) e transfecção de neurônios que escarrancham a barreira hemato-encefálica com vetores que contém genes que codificam o peptídeo de ligação ou fragmento de ligação do antígeno (ver, por exemplo, Publicação de Patente US n° 2003/0083299).
[0252] Métodos baseados em lipídios para transporte do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo do mesmo, através da barreira hemato-encefálica incluem, entre outros, encapsular o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou fragmento ativo em do mesmo, em lipossomas que são acopladas a seus fragmentos ativos que se ligam a receptores no endotélio vascular da barreira hemato-encefálica (ver, por exemplo, Publicação de Patente US n° 20020025313), e revestimento do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou seu fragmento ativo, em partículas de lipoproteína de baixa densidade (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 20040204354) ou apolipoproteína E (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 20040131692).
[0253] Métodos com base no receptor e no canal para transporte do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou fragmento ativo do mesmo, através da barreira hemato-encefálica incluem, entre outros, o uso de bloqueadores de glicocorticoide para aumentar a permeabilidade da barreira hemato-encefálica (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 2002/0065259, 2003/0162695 e 2005/0124533); ativação de canais de potássio (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 2005/0089473), inibição dos transportadores de drogas ABC (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 2003/0073713); revestimento de anticorpos com um transferrina e modulação da atividade dos um ou mais receptores de transferrina (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US n° 2003/0129186) e cationização dos anticorpos (ver, por exemplo, Patente US n° 5.004.697).
[0254] Administrações únicas ou repetidas do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo do mesmo, ou de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser fornecidas a um sujeito durante um período prolongado de tempo. A duração da administração pode ser entre 1 semana e até 12 meses ou mais. Durante este tempo, o peptídeo de ligação, anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrada uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, três semanas, quatro semanas, etc., ou em uma frequência maior ou menor, dependendo das necessidades do sujeito a ser tratado.
[0255] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece métodos e kits para a detecção e diagnóstico de doenças, distúrbios ou condições associadas à proteína tau, incluindo doenças ou distúrbios neurodegenerativos, tais como tauopatia compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que mostram a presença de patologias de tau e amiloides, incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt- Jacob, demência pugilística, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker, miosite com corpo de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral da proteína de príon, lesão cerebral traumática e outras doenças ou distúrbios que não mostram uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitadas a, esclerose amiotrófica lateral/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhados, parkinsonismo pós-encefalítico e distrofia miotônica. As anormalidades patológicas podem ser causadas por ou associadas com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia predominante do cérebro em taupatia.
[0256] Ademais, a presente invenção fornece métodos e kits para o diagnóstico de uma predisposição para doenças, distúrbios ou condições associadas à proteína tau, incluindo doenças neurodegenerativas ou distúrbios como tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças neurodegenerativas ou distúrbios incluindo doenças ou distúrbios que mostram a comanifestação de patologias de tau e amiloides, ou para monitoramento de doença residual mínima em um paciente ou para a estimativa da capacidade de resposta de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrita neste documento. Estes métodos incluem métodos imunológicos conhecidos comumente usados para detectar ou quantificar substâncias em amostras biológicas ou em condições in situ.
[0257] O diagnóstico de uma doença ou condição associada à proteína tau, ou de uma predisposição a uma doença ou condição associada à proteína tau em um sujeito em que necessite do mesmo, particularmente um mamífero, mais particularmente, um humano, incluindo doenças neurodegenerativas ou distúrbios como tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que manifestam as patologias tau e amiloide, pode ser alcançado através da detecção da ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação da invenção, particularmente de um anticorpo, particularmente de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo do mesmo, a um epítopo da proteína tau em uma amostra ou in situ, o que inclui estabelecer o contato da amostra ou uma determinada parte do corpo ou área suspeita de que conter a proteína tau com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína tau, permitindo que o anticorpo se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico, detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína tau na amostra ou parte ou área do corpo específica, opcionalmente, comparando a quantidade do complexo imunológico com um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do complexo imunológico comparado com um valor de controle normal indica que o sujeito sofre ou está em risco de desenvolver uma doença ou condição associada à proteína tau.
[0258] O monitoramento de doença residual mínima em um sujeito, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano, após o tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção, pode ser alcançado através da detecção de ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação da invenção, particularmente de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo do mesmo, a um epítopo da proteína tau em uma amostra ou in situ, o que inclui estabelecer o contato da amostra ou de uma parte específica do corpo ou área do corpo suspeita de conter a proteína tau com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, que liga um epítopo da proteína tau, permitindo que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico, detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína tau na amostra ou parte ou área do corpo específica, opcionalmente, comparando a quantidade do referido complexo imunológico a um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do referido complexo imunológico comparado com um valor de controle normal indica que o sujeito pode ainda sofrer de uma doença residual mínima.
[0259] A predição da reposta de um sujeito, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano, ao tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção, pode ser alcançada através da detecção de ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação da invenção, particularmente de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo do mesmo, a um epítopo da proteína tau em uma amostra ou in situ, o que inclui estabelecer o contato da amostra ou de uma parte específica do corpo ou área do corpo suspeita de conter a proteína tau com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, que liga um epítopo da proteína tau, permitindo que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico, detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína tau na amostra ou parte ou área do corpo específica, opcionalmente, comparando a quantidade do referido complexo imunológico antes e depois do início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade do referido complexo imunológico indica que o referido paciente tem um alto potencial de resposta ao tratamento.
[0260] Amostras biológicas que podem ser utilizadas no diagnóstico de uma doença ou condição associada à proteína tau, para o diagnóstico de uma predisposição para uma doença ou condição associada à proteína tau, incluindo doenças neurodegenerativas ou distúrbios como tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que manifestam patologias tau e amiloides, ou para monitoramento de doença residual mínima em um paciente ou para a estimativa da capacidade de resposta de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo a invenção incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrito neste documento, são, por exemplo, fluidos como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, muco, líquido cefalorraquidiano, líquido linfático e afins ou amostras de tecido ou célula obtidas de um organismo como tecido neural, cerebral, cardíaco ou vascular. Para determinar a presença ou ausência da proteína tau em uma amostra, qualquer imunoensaio conhecido por aqueles versados na técnica pode ser utilizado, como, por exemplo, os ensaios que utilizam métodos de detecção indireta usando reagentes secundários de detecção, ensaios ELISA e de imunoprecipitação e aglutinação. Uma descrição detalhada destes ensaios é, por exemplo, dada em Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612, WO96/13590 to Maertens and Stuyver, Zrein et al. (1998) e WO96/29605.
[0261] Para diagnóstico em situ, o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, da invenção ou qualquer parte ativa e funcional deste pode ser administrada ao organismo para ser diagnosticada por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intra arterial, tal que uma ligação específica entre um anticorpo de acordo com a invenção e uma região eptitópica na proteína amiloide pode ocorrer. O complexo do peptídeo/antígeno de ligação pode convenientemente ser detectado através de uma marca anexada ao peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente os anticorpos monoclonais, ou um fragmento funcional do mesmo, ou qualquer outro método de detecção conhecido na técnica.
[0262] Os imunoensaios usados nas aplicações diagnósticas ou para o diagnóstico de uma predisposição para doenças ou condições associadas à proteína tau, incluindo doenças neurodegenerativas ou distúrbios como tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças neurodegenerativas ou distúrbios incluindo doenças ou distúrbios que manifestam patologias de tau e amiloides, ou para monitoramento de doença residual mínima em um paciente ou para a estimativa da capacidade de resposta de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrita neste documento, tipicamente depende de antígenos marcados, peptídeos de ligação ou reagentes secundários para detecção. Estas proteínas ou reagentes podem ser marcados com compostos geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo enzimas, radioisótopos e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas, incluindo, entre outras, partículas coloridas, como ouro coloidal e grânulos de látex. Destes, a marcação radioativa pode ser usada para quase todos os tipos de ensaios e com a maioria das variações. Marcas conjugadas com enzima são particularmente úteis quando a radioatividade deve ser evitada ou quando resultados rápidos são necessários. Fluorocromos, embora exijam um equipamento caro para seu uso, fornecem um método muito sensível de detecção. Peptídeos de ligação úteis para estes ensaios são aqueles divulgados reivindicados neste documento, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e anticorpos policlonais purificados por afinidade.
[0263] Alternativamente, o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, pode ser marcado indiretamente por reação com substâncias marcadas que têm uma afinidade com imunoglobulina, como a proteína A ou G ou segundos anticorpos. O peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada tendo uma afinidade com a segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, pode ser conjugado com a biotina e o conjugado biotina/peptídeo de ligação detectado usando avidina ou estreptavidina marcada. Da mesma forma, o peptídeo de ligação pode ser conjugado com um hapteno e o conjugado hapteno/peptídeo de ligação detectado usando peptídeo de ligação anti- hapteno marcado.
[0264] Aqueles versados na técnica sabem destes e de outras marcas apropriadas que podem ser empregadas em conformidade com a presente invenção. A ligação dessas marcas a peptídeos de ligação ou fragmentos do mesmo pode ser realizada usando técnicas padrão comumente conhecidas por aqueles versados na técnica. Técnicas típicas são descritas por Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), e Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40). Técnicas de acoplamento mencionadas acima são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida e outros, todos os quais são incorporados por referência a este documento.
[0265] Imunoensaios atuais utilizam um método de anticorpo duplo para detectar a presença de um analito, em que o anticorpo é marcado indiretamente pela reatividade com um segundo anticorpo que foi marcado com uma marca detectável. O segundo anticorpo é, de preferência, um que se liga a anticorpos do animal do qual o anticorpo monoclonal é derivado. Em outras palavras, se o anticorpo monoclonal é um anticorpo de camundongo, então o segundo anticorpo marcado é um anticorpo anti-camundongo. Para que o anticorpo seja usado no ensaio descrito neste documento, esta marca é, de preferência, um grânulo revestido por anticorpo, particularmente um grânulo magnético. Para que o anticorpo seja empregado no imunoensaio aqui descrito, a marca é, de preferência, uma molécula detectável, tal como uma substância radioativa, fluorescente ou eletroquimiluminescente.
[0266] Um sistema alternativo de anticorpo duplo, muitas vezes referido como sistemas de formato rápido porque são adaptados para determinações rápidas da presença de um analito, pode também ser empregado no âmbito da presente invenção. O sistema requer alta afinidade entre o anticorpo e o analito. De acordo com uma modalidade da presente invenção, a presença da proteína amiloide é determinada usando um par de anticorpos, cada um específico para a proteína amiloide. Um dos tais pares de anticorpos é referido neste documento como um "anticorpo detector" e o outro do tal par de anticorpos é referido como um "anticorpo de captura". O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser usado como um anticorpo de captura ou um anticorpo detector. O anticorpo monoclonal da presente invenção pode também ser usado como anticorpo detector e de captura, juntos em um único ensaio. Uma modalidade da presente invenção usa, assim, o método sanduíche de anticorpo duplo para a detecção de proteína amiloide em uma amostra de líquido biológico. Neste método, o analito (proteína amiloide) é imprensado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura, o anticorpo de captura sendo irreversivelmente imobilizado em um suporte sólido. O anticorpo detector conteria uma marca detectável, a fim de identificar a presença do sanduíche anticorpo-analito e, portanto, a presença do analito.
[0267] Substâncias exemplares de fase sólida incluem, mas não estão limitadas a placas de microtitulação, tubos de ensaio de poliestireno, grânulos magnéticos, de plástico ou de vidro e deslizam, o que é sabido por aqueles versados na técnica de radioimunoensaio e imunoensaio de enzima. Métodos para acoplamento de anticorpos a fases sólidas também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Mais recentemente, um número de material poroso, tais como nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos, tem sido empregado como suportes sólidos.
[0268] A presente invenção refere-se também a um kit de diagnóstico para a detecção da proteína tau em uma amostra biológica que compreende uma composição conforme definido acima. Além disso, a presente invenção refere-se ao último kit diagnóstico que, além de uma composição conforme definida acima, compreende também um reagente de detecção como definido acima. O termo "kit de diagnóstico" refere-se em geral a qualquer kit de diagnóstico conhecido na técnica. Mais especificamente, este último termo se refere a um kit de diagnóstico conforme descrito em Zrein et al. (1998).
[0269] É ainda outro objeto da presente invenção fornecer novas imuno-sondas e kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas à proteína tau, compreendendo peptídeos de ligação de acordo com a presente invenção. Para imuno-sondas, os peptídeos de ligação são direta ou indiretamente anexados a uma molécula repórter apropriada, por exemplo, uma enzima ou um radionuclídeo. O kit de teste inclui um recipiente contendo um ou mais peptídeos de ligação de acordo com a presente invenção e instruções para o uso dos peptídeos de ligação para a finalidade de ligação ao antígeno tau para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico, tal que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com a presença ou ausência do antígeno tau.
EXEMPLOS
[0270] Exemplo 1: Geração e triagem de hibridomas e anticorpos
[0271] O objetivo deste estudo foi gerar e fazer a triagem de mAbs (anticorpos monoclonais) anti-Tau. Hibridomas foram geradas pela fusão de células de baço de camundongo com uma linhagem de células de mieloma imunizadas por vacina tau. As hibridomas foram avaliadas para reatividade contra proteína Tau de comprimento total fosforilada e não fosforilada, bem como os peptídeos antigênicos Tau fosforilados e não fosforilados utilizados para a preparação de vacinas. A triagem de hibridoma também foi realizada para reatividade de sobrenadante de hibridomas para emaranhados de tau usando imunoquímica em cortes cerebrais de camundongo transgênico Tau.
1.1 MÉTODOS 1.1.1 FUSÃO
[0272] Um tipo de camundongo selvagem C57BL/6 vacinado com ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404])) foi utilizado para produção de hibridoma. O rato foi estimulado com vacina ACI-35 no dia 0, então outra vez no dia 4, e a fusão foi realizada no dia 7.
[0273] 6x107 (ACI-35), esplenócitos do camundongo imunizado foram fundidos com células de mieloma 2x107 SP2-O-Ag14 a uma proporção de 3 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0274] As fusões resultaram em placas de 8 x 96 poços e os clones foram nomeados de acordo com a placa (1-8) e depois a linha (A-G) e, finalmente, a coluna (1-12).
1.1.2 MÉTODO DE VARREDURA PARA SELECIONAR CLONES
[0275] As placas de 8 x 96 poços foram primeiramente submetidas a duas varreduras para a expressão de IgG. Clones com expressão positiva foram transferidos em 24 placas de poço e célula sobrenadantes (= clones) de células em crescimento foram testados em uma varredura ELISA de Tau e uma varredura TAUPIR de imuno-histoquímica. Sobrenadantes positivos no ELISA e/ou TAUPIR foram transferidos para frascos T25, e os clones foram novamente submetidos à varredura para expressão de IgG em uma varredura de ELISA e TAUPIR de Tau.
1.1.3 VARREDURA DE IGG
[0276] Placas de ELISA (Costar; Sigma) foram revestidas com 50 μl/poço de anticorpo de IgG anti-camundongo (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemanha) em tampão de revestimento por 16 h a 4°C.Depois de lavar as placas com PBS/Tween, poços foram bloqueados com 100 μl/poço de solução de bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente. Sobrenadantes de hibridoma não diluídos (50 μlpor poço) foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de uma lavagem, uma mistura de IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgM (AbD Serotec) anti-camundongo conjugada com peroxidase de raiz forte (HRP) foi aplicada por 1 hora à temperatura ambiente. Após uma lavagem final, a detecção foi realizada com substrato de HRP (TMB; 3-3',5,5'- tetrametilbenzidina), e as placas foram lidas em 405 nm, utilizando um leitor de microplacas. Resultados são expressos em densidade óptica (D.O.).
1.1.4 VARREDURA ELISA DE TAU HIBRIDOMAS
[0277] A varredura ELISA de hibridomas foi realizada no peptídeo pTau (ACI-35, T3.5: Tau393-408[pS396/pS404; PolyPeptide Laboratories, Hiller0d, Dinamarca), o peptídeo da Tau correspondente não fosforilado (T3.6: Tau393-408, PolyPeptide Laboratories), proteína Tau de comprimento total fosforilada (441aa) (proteína pTau, Vandebroek et al, 2005) e proteína Tau de comprimento total (441aa) (proteína Tau, SignalChem, Richmond, Canadá). Finalmente a Albumina de Soro Bovino (BSA) foi usada como controle negativo.
[0278] Placas foram revestidas com 10 μg/ml de peptídeo da Tau correspondente e 1 μg/ml da proteína Tau correspondente durante a noite a 4°C. Depois de lavar cada poço com PBS-0,05% Tween 20 e bloqueando com BSA 1% em PBS-0,05% Tween 20, sobrenadante de hibridoma não diluído ou controle negativo do meio foi adicionado às placas e incubado a 37°C durante 2 horas. Depois da lavagem, as placas foram incubadas com um anticorpo total de IgG anti-camundongo conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, Estados Unidos da América) por 2 horas a 37°C.Após a lavagem, as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil- fosfato), o substrato de fosfatase para AP e lidas a 405 nm, utilizando um leitor de placa ELISA. Resultados são expressos em D.O. (Densidade Óptica).
1.1.5 VARREDURA IHC DE HIBRIDOMAS: LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TAU A EMARANHADOS NAS SEÇÕES DO CÉREBRO DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS (TAUPIR)
[0279] Experimentos TAUPIR foram feitos de acordo com o protocolo do EXEMPLO 3.1.2.
1.1.6 VARREDURA DE IGG EM FRASCOS T25
[0280] Pacas ELISA foram revestidas com 5ug/ml de anticorpo específico de fragmento F(ab’)2 IgG anti-camundongo (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, Estados Unidos da América) em tampão de revestimento carbonato-bicarbonato com pH 9,6 (Sigma, Buchs, Suíça) durante a noite a 4°C. Depois de lavar os pratos, sobrenadante de hibridoma não diluído, anticorpo IgG1 de controle positivo (6E10 a 1ug/ml: Covance, Emeryville, CA, EUA) ou controle negativo (meio de cultura sozinho) foi incubado durante 1 h à temperatura ambiente. Após uma etapa de lavagem, o anticorpo específico de fragmento FcY IgG (subclasses 1+2a+2b+3) anti-camundongo de cabra conjugado com AP secundário (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, Estados Unidos da América) foi incubado nas placas por 2 horas a 37°C. Após uma lavagem final, a detecção foi realizada com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato de fosfatase para AP, e placas foram lidas em 405 nm, utilizando um leitor de placa ELISA. Resultados são expressos em D.O. (Densidade Óptica).
1.2 RESULTADOS
[0281] Os sobrenadantes de células das placas de 8 x 96 poços resultando da fusão foram selecionados para produção de IgG. De 768 poços (8x96 poços) testados, 48 poços positivos para produção de IgG foram selecionados com base na melhor ligação com o fosfo-peptídeo da vacina e com o fosfo-Tau de comprimento total. A seleção foi baseada na ligação ao peptídeo e proteína fosfo-Tau de comprimento total por ELISA e também a seletividade quando comparando com peptídeo não fosfo e proteína Tau de comprimento total não fosfo. 24 hibridomas selecionadas foram subclonadas por semeadura de 2 placas por hibridoma em 1 célula/poço e 1 placa a 0,5 célula/poço. Sobrenadantes foram testados novamente para ligação a fosfo- peptídeo e fosfo-proteína para verificar o perfil de ligação, após o que a estabilidade foi avaliada em uma cultura de 6 semanas. Oito clones estáveis foram, então, selecionados e testados para isotipificação e ligação usando ELISA e TAUPIR, conforme descrito nos Métodos.
1.3 CONCLUSÃO
[0282]Os anticorpos gerados mostraram alta especificidade com peptídeos pTau com ligação apenas marginal de peptídeos não- fosforilados.
[0283] Um total de 8 clones foram selecionados para mais subclonagem adicional e foram sequenciados (ver Tabela 6 e Tabela 7) e 6 clones foram depositados no DSMZ (ver Tabela 10).
[0284] Os clones mãe positivos acima mencionados foram cultivados adicionalmente em placas de 96 poços, em seguida, placas de 24 poços e, finalmente, frascos T25. Em cada etapa, os sobrenadantes de clones de hibridoma foram selecionados por ELISA, Taupir e Western Blot.
EXEMPLO 2 CLONAGEM DE REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE E CADEIA PESADA DE ANTICORPO
[0285] Genes de região variável pesada e leve de anticorpo das células da hibridoma são clonados e sequências de DNA e localização das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) determinadas, bem como as características de ligação de anticorpos.
[0286] RNA total foi preparado a partir de 3 x 106 de células da hibridoma (1 frasco) usando o mini kit de Qiagen RNeasy (N° CAT: 74104). RNA foi eluído em 50uL de água e verificado em um gel de agarose de 1,2%.
[0287] cDNAs VH e VK foram preparados usando a transcriptase reversa com IgG e iniciadores de região constante kappa. Os cDNAs da primeira fita foram amplificados por PCR usando um grande conjunto de iniciadores da sequência sinal. Os DNAs amplificados foram purificados com gel e clonados para o vetor pGem® T Easy (Promega). Os clones VH e VK obtidos foram varridos para inserções do tamanho esperado. A sequência de DNA de clones selecionados foi determinada em ambas as direções por sequenciamento automatizado de DNA. Os locais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) nas sequências foram determinados com referência a outras sequências de anticorpo (Kabat EA et al., 1991).
EXEMPLO 3 ESTUDOS DE LIGAÇÃO I
[0288] O objetivo foi medir a ligação fosfo-Tau (pTau) dos anticorpos gerados a partir de hibridomas subclonadas derivadas de camundongos imunizados com as vacinas lipossomais tau. Para testar isso, um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) foi usado para medir a ligação dos anticorpos purificados à proteína Tau de comprimento total fosforilada e não fosforilada, bem como os peptídeos antigênicos Tau fosforilados e não fosforilados utilizados para a preparação de vacina lipossomal.
[0289] A varredura foi completada por dois outros métodos. Foi feita Imuno-histoquímica (IHC) em seções do cérebro de um animal transgênico Tau (TAUPIR) usando um anticorpo anti-tau como o anticorpo primário. Além disso, um western blot (WB) em homogeneizados de proteína do cérebro de camundongos transgênicos de Tau foi realizado, usando um anticorpo anti-tau como o blotting do anticorpo.
3.1 MÉTODOS 3.1.1. ELISAS: ENSAIO DE LIGAÇÃO FOSFO-TAU
[0290] Utilizou-se um ensaio de ELISA para testar a ligação dos anticorpos purificados a Tau e pTau. Brevemente, placas de 96 poços Nunc MaxiSorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 1 μg/mL de proteína Tau de comprimento total (441 aa) (SignalChem, Richmond, Canadá) ou proteína Tau de comprimento total fosforilada (441 aa) (Vandebroek et al., 2005). Além disso, as placas foram revestidas com 10 μg/mL de peptídeo da vacina derivada de Tau, Tau393-408 (fosforilada ou não em S396 e S404). Para testar por reatividade cruzada a sequências Tau e pTau de diferentes epítopos pTau que não foram utilizados para a preparação de vacinas, placas foram revestidas com 10 μg/mL dos seguintes peptídeos: Tau393-408 (fosforilada ou não em S396 e S404), O revestimento foi feito durante a noite em salina tamponada com fosfato (PBS) a 4°C. As placas foram lavadas com 0,05% de Tween20/PBS e depois bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,05% de Tween20/PBS por 1 hora a 37°C. O anticorpo que está sendo testado foi então adicionado em uma série de diluição dupla de 8 ou 16 entre 0 e 20 μg/mL, e a incubação permitida por 2 horas a 37°C. As placas foram, então, lavadas conforme descrito anteriormente, e anticorpo secundário de IgG anti-camundongo conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) foi adicionado na diluição de 1/6000 em 0,05% de Tween20/PBS por 2 horas a 37°C. Após a lavagem, as placas foram incubadas com p-nitrofenil fosfato dissódico hexahidratado (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) solução de substrato de fosfatase e lidas em 405 nm após tempos de incubação de 30 min, 1, 2 ou 16 h usando um leitor de placa de ELISA.
3.1.2. TAUPIR E WESTERN-BLOTS: LIGAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-TAU A EMARANHADOS TAU NAS SEÇÕES DO CÉREBRO DE UM ANIMAL TRANSGÊNICO TAU (TAUPIR)
[0291] Para coloração de TAUPIR, as seções do cérebro eram de camundongos TPLH (camundongos transgênicos expressando a isoforma mais longa (441aa) de hTauP301L), camundongos velhos (> 18 meses de idade) biGT duplos transgênicos (camundongos transgênicos GSK-3β cruzados com TPLH) e camundongos de biAT duplos transgênicos (camundongos transgênicos hAPPV717I cruzados com TPLH). Como um controle negativo, seções de camundongos nocaute Tau (TKO; 6 meses de idade) foram utilizadas. Seções do cérebro foram lavadas por 5 min em PBS, em seguida incubadas durante 15 min à temperatura ambiente em 1,5% H2O2 em PBS:MeOH (1:1) para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Depois de lavar as seções 3 vezes em PBST (PBS/0,1% de TritonX100), elas foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente em solução de bloqueio PBST+10% de FCS (soro fetal de bezerro). A incubação com o anticorpo anti-Tau sendo testado foi feita durante a noite a 4°C, utilizando as seguintes concentrações de anticorpos: ACI-35-2A1-Ab1 a 0,0053 μg/mL, ACI-35-2A1-Ab2 a 0,0048 μg/mL, ACI-35-4A6-Ab1 a 0,015 μg/mL, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,0047 μg/mL, ACI-35-2G5-Ab1 a 0,0055 μg/mL, e ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-Ab3 a 0,01 μg/mL em PBST/10% de FCS. Seções foram em seguida lavadas 3 vezes em PBST antes da incubação com anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado por HRP (comprado de Dako, Glostrup, Dinamarca) em PBST/10% de FCS por 1 hora à temperatura ambiente Antes da detecção, seções foram lavadas 3 vezes com PBST e incubadas em 50 mM Tris/HCl pH 7,6 por 5 min. A detecção foi feita por incubação das seções por 3 min em diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido em 10 ml de 50mM Tris.HCl + 3 μl H2O2 30%; MP Biomedicals, Solon, OH, EUA). A reação foi interrompida pela lavagem das seções 3 vezes em PBST. Seções foram então transferidas para placas de vidro silanizadas e secadas por ar em chapa aquecida a 50°C por 2 horas. A coloração de contraste foi feita usando incubação com hematoxilina de Mayer (Fluka Chemie, Buchs, Suíça) por 1 min, seguida por uma etapa de lavagem por 4 min. em água corrente. Seções foram desidratadas passando em 50%, 70%, 90% e duas vezes em 100% de banho de etanol, então em 2 vezes em xilol durante 1 min. Finalmente as seções foram montadas com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra) em lamínulas de vidro para imageamento.
[0292] Coloração adicional (Western-blotting) foi feito em proteínas homogeneizadas de cérebro de cérebro separadas de SDS-PAGE (10%) de camundongos do tipo selvagem (FVB), camundongos transgênicos de Tau (TPLH e biGT), ou camundongos nocaute Tau (TKO). Para Westernblotting, anticorpos foram usados nas seguintes concentrações: ACI-35-2A1- Ab1 a 0,53 μg/mL, ACI-35-2A1-Ab2 a 0,48 μg/mL, ACI-35-4A6-Ab1 a 0,5 μg/mL, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,47 μg/mL, ACI-35-2G5-Ab1 a 0,55 μg/mL, ACI- 35-2G5-Ab2 a 0,33 μg/mL, e ACI-35-2G5-Ab3 a 0,5 μg/mL.
3.2 RESULTADOS
[0293]Anticorpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35- 1D2-Ab1, ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-Ab3 demonstraram alta atividade de ligação e especificidade à proteína Tau humana fosforilada (Tabela 2), mais especificamente ao peptídeo antigênico fosfo-Tau usado na vacina correspondente. Não foi observada reatividade cruzada alguma à Tau não fosforilada, ou a outros peptídeos derivados de Tau fosforilada e não fosforilada testados. Anticorpo ACI-35-4A6-Ab1, de acordo com sua seleção, exibiu alta atividade de ligação apenas ao peptídeo antigênico fosfo-Tau utilizado para a preparação da vacina. Baixa reatividade cruzada foi encontrada com a contraparte não fosfo do peptídeo antigênico utilizado para a preparação da vacina, o que era esperado com base na seleção do clone. Anticorpo ACI-35-2G5-Ab1 exibiu alta atividade de ligação apenas ao peptídeo antigênico fosfo-Tau utilizado para a preparação da vacina. Pequena reatividade cruzada foi observada para o fosfo-peptídeo T4,5, que compreende a parte da sequência de peptídeo antigênico usada na vacina.
[0294] TAUPIR e WBs foram usados para olhar para visualizar emaranhados de Tau nos cérebros dos ratos com taupatia avançada (biGT > 18 meses) e ao Tau de comprimento total em homogeneizados desnaturados derivados destes camundongos. Analisaram-se as regiões diferentes do cérebro: o córtex e CA1 e CA3 e parte do giro dentado (DG) do hipocampo. Anticorpos ACI-35-2A1-Ab1 e ACI-35-2A1-Ab2 exibiram os melhores resultados de TAUPIR com uma coloração citoplasmática densa e filamentos de neurópilo claros, especialmente nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo. Anticorpo ACI-35-4A6-Ab1 foi negativo em TAUPIR com apenas estruturas tipo um fraco emaranhado esporádico levemente manchadas. Anticorpo ACI-35-1D2-Ab1 mostrou uma boa coloração de TAUPIR citoplasmática com filamentos de neurópilo na região CA1. Anticorpo ACI- 35-2G5-Ab1 foi negativo em TAUPIR com coloração nuclear e apenas alguma coloração de emaranhado. Finalmente, anticorpos ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-Ab3 exibiram uma boa coloração de TAUPIR citoplasmática semelhante com filamentos de neurópilo observados em CA1 e CA3 do hipocampo. A classificação da qualidade da coloração usando sinais + ou - é mostrada na Tabela 2. Homogeneizados de cérebro de camundongos transgênicos de Tau foram manchadas, mostrando que todos os anticorpos se ligaram bem às fitas de Tau esperadas (Tabela 2, classificados como +), com ACI-35-1D2-Ab1 e ACI-35-2G5-Ab1 também mostrando ligações adicionais inespecíficas (-/ +).
EXEMPLO 4 ESTUDOS DE LIGAÇÃO II 4.1 MÉTODOS 4.1.1 ENSAIO DE LIGAÇÃO SPR
[0295] Todos os experimentos SPR foram realizados em um instrumento Biacore X (GE Healthcare). Chip sensor SA (dextrano carboximetil derivatizado de estreptavidina) foi comprado da GE Healthcare. Tampão de corrida foi PBS (Dulbecco’s PBS, Sigma D8537). Estreptavidina ligada não covalentemente foi em primeiramente removida da superfície do sensor injetando 8 pulsos (~ 1 μL cada) de 16 mM NaOH (aq). Peptídeo fosfo-tau foi então solubilizado em PBS para dar uma concentração final de peptídeo de 1 μM e, então, injetou (35 μL) sobre célula de fluxo (fc) 2 do chip sensor a 5 μl/min. Após o acoplamento, obteve-se um nível de imobilização final de 130 RUs. Para estudar a ligação dos anticorpos à superfície do chip, várias concentrações de anticorpos foram preparadas por diluições dobradas em série com o tampão de corrida. As injeções foram realizadas ao longo de ambos os fc 1 e 2 com um fluxo de 50 μL/min. por 120 s. Célula de fluxo 1 não foi derivatizada e respostas de fc 1 foram subtraídas de fc 2 para corrigir alterações de refração em massa e ruído do instrumento. Após cada injeção, as superfícies foram lavadas imediatamente com o tampão de corrida por 100 s. Para remover qualquer anticorpo acoplado restante do chip, a regeneração de superfície foi realizada injetando 1 μL de 10 mM de Glicina-HCl com pH 1,7. Análises cinéticas foram realizadas usando algoritmos de integração numérica e análise global usando BIAevaluation 3.0. Os sensogramas obtidos para injeções de anticorpos em diferentes concentrações foram sobrepostos e as referências ajustadas a zero. Para encaixe de curva, todos os dados foram encaixados simultaneamente a um modelo homogêneo 1:1 (Langmuir).
[0296] Peptídeos utilizados:
Figure img0001
4.2 RESULTADOS
[0297] A ligação dos anticorpos anti-tau ao peptídeo Tau fosforilado foi monitorada em tempo real usando SPR. Análises das fases de associação e dissociação de ligação do anticorpo poderiam ser usadas para determinar a constante de taxa de associação (ka), a constante de taxa de dissociação (kd) bem como a constante de dissociação KD.
[0298] Concluiu-se que todos os anticorpos se ligam especificamente ao peptídeo T3.30 sobre a superfície de dextrano carboximetil não derivatizado na faixa de 46 ^ 734 nM de anticorpo analisado (ou 11,5 ^ 184 nM para ACI-35-4A6-Ab1). Análises cinéticas do sensogramas revelaram que a constante de dissociação KD para a interação de ligação entre os anticorpos diferentes e T3.30 está entre 2 e 82 nM. Isto demonstra, portanto, que os anticorpos reconhecem o fosfopeptídeo T3.30 com afinidade muito elevada (Tabela 3).
EXEMPLO 5 ESTUDOS DE LIGAÇÃO III AMOSTRAS DE ELISA NO CÉREBRO HUMANO (ELISA PARA A DETECÇÃO DE MULTÍMEROS DE TAU FOSFORILADA) 5.1 MÉTODOS 5.1.1 AMOSTRAS HUMANAS: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE CÉREBRO HUMANO UTILIZADAS PARA OS ENSAIOS DESCRITOS AQUI
[0299] Córtex temporal post-mortem para dez controles de doença de Alzheimer (DA) e dez controles combinados por idade foram obtidos do Brain Endowment Bank da Universidade de Miami. A idade média de morte para os pacientes com DA (sete fêmeas e três machos) foi de 81,1 ± 7,3 anos e para os controles (livres de sintomas neurológicos; nove fêmeas, um macho) foi de 87,0 ± 5,8 (não significativamente diferente dos pacientes com DA pelo teste t de student). Todas as amostras eram de origem caucasiana. As amostras de DA foram caracterizadas por estágio de doença Braak (Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259) como mostrado na Tabela 4.
[0300]Córtex post-mortem temporal para dez controles de DA e dez controles combinados por idade foram homogeneizados de acordo com o seguinte protocolo. Fragmentos do cérebro foram pesados e homogeneizados em 9 volumes de 25 mM de Tris-HCl com pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1mM de EDTA, 1 mM de EGTA contendo inibidores da fosfatase (30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido ocadaico, 1mM de PMSF, 5mM de Na4P2O7) e inibidores de protease (Complete Mini; Roche, Suíça). Homogeneização foi feita no gelo usando um oleiro de vidro. Isto constitui a fração Homogeneizada Total (TH). As concentrações de proteína foram medidas usando o reagente de Bradford (Sigma).
5.1.2 CONFIGURAÇÃO 1 ELISA: CONFIGURAÇÃO 1 ENSAIO DE ELISA PARA DETECTAR A PRESENÇA DE MULTÍMEROS DE TAU FOSFORILADA EM HOMOGENEIZADOS DE CÉREBRO CORTICAL HUMANOS POST-MORTEM DE INDIVÍDUOS AFETADOS POR DA E CONTROLES COMBINADOS POR IDADE
[0301] Placas multititulação de 96 poços foram revestidas com anticorpos durante a noite a 4°C a 5 μg/ml de tampão de carbonato/bicarbonato. Após 4 lavagens em PBS-Tween, as placas estavam saturadas com PBS-Tween 10% de BSA por 1 hora a 37°C. Homogeneizados do cérebro foram, então, adicionados aos poços na concentração de 100 ng/μL em 50 μl de PBS e incubados por 2 horas a 37°C. Depois da lavagem das placas, o mesmo anticorpo como usado para o revestimento, mas biotinilado, foi incubado por 1 hora a 37°C, a uma concentração final de 5 μg/mL. As placas foram lavadas e, após adição de avidina-peroxidase (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories) e seu substrato (ABTS, Roche 10881420), as placas foram lidas em pontos diferentes do tempo. Os valores são expressos como média de OD ±SD para 10 DA e 10 sujeitos controle.
5.2 RESULTADOS
[0302] Anticorpos ACI-35-2A1-Ab1 e ACI-35-2G5-Ab3 foram testados para sua capacidade de detectar multímeros de fosfoTau (pTau) em homogeneizados do cérebro de sujeitos controle de DA, usando uma Configuração 1 de ELISA específica a mútimero de fosfo. Observamos uma diferença altamente significativa (p < 0,001) entre DA e controles combinados por idade (n = 10) neste ensaio para ambos os anticorpos (Figura 1). Usando homogeneizados corticais post-mortem humanos de cérebro com DA e de controle combinado por idade, temos demonstrado a capacidade de anticorpos anti-pTau ACI-35-2A1-Ab1 e ACI-35-2G5-Ab3 para detectar multímeros de Tau-pS396 em amostras de cérebro humano post-mortem.
EXEMPLO 6 ESTUDOS DE LIGAÇÃO IV - WESTERN BLOTS EM AMOSTRAS DE CÉREBRO HUMANO. 6.1 MÉTODOS 6.1.1 AMOSTRAS HUMANAS: O MESMO MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS HUMANAS, COMO DESCRITO NO MÉTODO 5.1.1. 6.1.2 WESTERN-BLOTS: ENSAIO DE WESTERN-BLOT PARA DETECTAR A PRESENÇA DE MULTÍMEROS DE TAU FOSFORILADA EM HOMOGENEIZADOS DE CÉREBRO CORTICAL POST- MORTEM HUMANOS DE INDIVÍDUOS AFETADOS POR DA E CONTROLES COMBINADOS POR IDADE
[0303] Anticorpos anti-humanos Tau utilizados neste estudo foram o camundongo ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35-2G5-Ab3, todos dirigidos contra Tau-pS396. O anticorpo monoclonal de camundongo TAU-13 (Abcam ab24636) direcionado contra Tau humana total e o anticorpo monoclonal de coelho E178 direcionado contra Tau-pS396 (Abcam ab32057) foram usados como controles. 20 μg de cada homogeneizado total foi carregado por faixa em 10% de poliacrilamida gel prefabricados de Bis-TRIS (Nupage Novex 10% de Bis-TRIS Midi Gel, Invitrogen). As proteínas foram resolvidas conforme recomendado pelo fabricante em tampão de corrida NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen NP0001). Blotting de proteína foi feito por 3 h em 25 mM TRIS com pH 8,6, 190 mM de tampão glicina, 20% de metanol, no gelo nas membranas de PVDF (Immobilon-FL, Millipore IPFL00010). Membranas foram bloqueadas por 1 h no tampão de bloqueio de Licor (Odyssey) diluído a 1/3 em PBS. Membranas foram incubadas durante a noite com os anticorpos primários nas seguintes concentrações: TAU-13 em 0,6 μ g/mL, E178 diluído 1/5000, ACI-35-2A1-Ab1 a 0,53 μg/ml, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,47 μg/ml e ACI-35-2G5-Ab3 a 0,5 μg/mL, diluído em 1/3 no tampão de Licor e 2/3 PBS com 0,1% de Tween-20 (PBS-T). Após 4 lavagens em PBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-camundongo de cabra juntamente com o corante LICOR 800 (IRDye 800 CW anti-camundongo de cabra, Odyssay) por 1 hora à temperatura ambiente, lavado novamente 4 vezes com PBS-T e digitalizado para a reprodução de imagem usando o sistema LICOR.
6.2 RESULTADOS
[0304] Anticorpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35-2G5- Ab3 foram testados para sua capacidade de detectar fosfoTau (pTau) em homogeneizados do cérebro de sujeitos controle de DA, usando Western-blots fosfo-específicos. Todas as amostras de córtex humano post mortem foram primeiro caracterizadas usando anticorpos comerciais contra Tau humana: anticorpos anti Tau total (TAU-13) e anti Tau pS396 (E178). Como mostrado na Figura 2A, utilizando o anticorpo TAU-13, detectamos em todas as amostras a escala Tau característica correspondente a diferentes isoformas de Tau na faixa de 50-70 kDa. Curiosamente, em homogeneizados do cérebro com DA observou-se também uma relativa mudança no padrão de migração de Tau conforme o esperado para a presença de Tau hiper-fosforilada nos cérebros com DA. Confirmando esta hipótese, anticorpo Tau anti-pS396 comercial discriminado bem controles e DA (Figura 2B). Com efeito, o anticorpo Tau anti-pS396 revelou três principais fitas imunorreativas correspondentes a isoformas (hiper)-fosforiladas de Tau em todos os homogeneizados do cérebro com DA e com uma intensidade muito fraca ou ausente nos controles saudáveis. Além disso, as amostras de DA exibiram uma mancha imunorreativa TAU-13 de alto peso molecular, provavelmente refletindo a presença de agregados Tau (Figura 2A).
[0305] Western-blotting com ACI-35-2A1-Ab1 revelou a presença de duas fitas de proteínas imunorreativas do tamanho esperado para fosfo-Tau nos homogeneizados do cérebro com DA, mas não em controles (Figura 3A). Imunorreações fracas por western blot utilizando ACI-35-2A1-Ab1 podem ser explicadas pela presença de duas grandes fitas inespecíficas em ~35 e ~40 kDa. Western-blotting com ACI-35-1D2-Ab1 revelou a presença de duas fitas de proteínas imunorreativas do tamanho esperado para fosfo-Tau nos homogeneizados do cérebro com DA, mas não em controles (Figura 3B). Imunorreações fracas por western blot utilizando ACI-35-1-D2-Ab1 podem ser explicadas pela presença de fitas inespecíficas em ~40 e ~50 kDa, bem como 4 fotas inespecíficas entre 80 kDa e 150 kDa. Western-blotting com ACI-2G5-Ab3 revelou a presença de três fitas imunorreativas principais correspondentes a isoformas (hiper)-fosforiladas de Tau em todos os homogeneizados do cérebro com DA e ausência nos controles saudáveis, exceto por um sujeito controle (C22), que tem uma história familiar de DA (Figura 3C). Este relatório demonstrou que ACI-35- 2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35-2G5-Ab3, pode discriminar entre controles de DA e combinados por idade para a presença de Tau pS396 no córtex humano post mortem e, portanto, estes anticorpos monoclonais reconhecem isoformas de Tau patológicas associadas com DA.
EXEMPLO 7 ESTUDOS DE LIGAÇÃO V - CONFIGURAÇÃO 1 (ELISA EM AMOSTRAS DE CÉREBRO HUMANO) 7.1 MÉTODOS 7.1.1 AMOSTRAS HUMANAS. O MESMO MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS HUMANAS COMO DESCRITO NO MÉTODO 5.1.1., EXCETO PELA A ÚLTIMA PARTE, PREPARAÇÃO DE FRAÇÃO DE S1. 7.1.2 FRAÇÃO DE PROTEÍNA TAU DE S1: SUBFRACIONAMENTO DE FRAÇÕES DE HOMOGENATO TOTAL PARA OBTER PROTEÍNAS SOLÚVEIS DE FOSFO-TAU E TAU.
[0306] Para preparar a fracção solúvel de Tau (S1) utilizada para o ensaio de AlphaLISA, metade do volume da fração de TH foi dividida e armazenada a -80°C. O restante da fração de TH foi subsequentemente processado pela adição de Triton X-100 a uma concentração final de 0,4%. As amostras foram bem misturadas e agitadas em vórtex várias vezes antes de serem centrifugadas a 5'000 rpm por 5 min a 4°C. O sobrenadante constitui a fração de S1. As amostras foram divididas e armazenadas a - 80°C. As concentrações de proteína foram medidas usando o reagente de Bradford.
7.1.3 ALPHALISA: ENSAIO ALPHALISA PARA DETECTAR A PRESENÇA DE TAU FOSFORILADA EM HOMOGENATOS DE CÉREBRO CORTICAL POST-MORTEM HUMANOS DE INDIVÍDUOS AFETADOS POR DA E CONTROLES COMBINADOS POR IDADE
[0307]Anticorpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35- 2G5-Ab3, todos direcionados contra Tau-pS396, foram biotinilados usando o Kit EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Thermo Scientific), de acordo com as instruções do fabricante. Foi usado na reação de marcação o excesso molar vinte e cinco vezes a Biotina sobre anticorpo. Após biotinilação, o excesso de biotina livre foi removido pela diálise contra PBS usando os Dispositivos de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO (Thermo Scientific). Os anticorpos biotinilados são designados como ACI-35-2A1- Ab1-BT, ACI-35-1D2-Ab1-BT, e ACI-35-2G5-Ab3-BT. Anticorpo Tau-13 foi conjugado com os grânulos de Receptor Alfa ativados (Perkin Elmer) usando o seguinte protocolo: 0,1 mg de solução de anticorpo Tau-13 (purificada em coluna de proteína A) foi misturado com 1 mg de péletes de Grânulo de Receptor AlphaLISA e complementado com 0,13 M de tampão fosfato (pH 8,0) para um volume final de reação de 200 μL. Em seguida, 1,25 μL de 10% de Tween-20 e 10 μL de uma solução de 25 mg/mL de NaBH3CN foi adicionado e o tubo foi incubado por 48 h a 37°C, com uma rotação leve (7 rpm). Após a reação de conjugação, os sítios ativos em grânulos foram bloqueados pela adição de 10 μL de uma solução de Carboxi-metoxilamina e adicionalmente incubados a 37°C durante 1 h. Finalmente, os grânulos foram lavados duas vezes com 200 μL de 0,1 M Tris-HCl com pH 8,0 e armazenados a 4°C em 200 μL de tampão de armazenamento (PBS com 0,05% de Proclin-300) que resultou em uma concentração de grânulos de Receptor AlphaLISA final de 5 mg/ml.
[0308] AlphaLISA é um ensaio homogêneo com base em quimioluminescência de proximidade do grânulo. Se os grânulos de Doador e Receptor Alfa estão nas proximidades, após excitação de laser, uma cascata de reações químicas produz um sinal amplificado. Após excitação em 680 nm, o fotossensibilizador contido nos grânulos de Doador converte oxigênio ambiente em uma espécie de oxigênio singleto mais reativa. Estes singletos difundem (até 200 nm, em 4 μsegundos de uma meia vida) e produz em uma reação quimiluminescente em grânulos de Receptor, levando à emissão de luz. A configuração do ensaio foi a seguinte:
[0309] Amostras de S1 foram previamente diluídas no tampão de Ensaio Alpha (PerkinElmer AL000C) para obter uma concentração de estoque de 20 μg/mL. Os seguintes reagentes foram adicionados a uma OptiPlate de 384 poços branca (PerkinElmer) até um volume final de 50 μL: Homogenato de cérebro da S1 (5 μL), 10 μL de ACI-35-2A1-Ab1-BT, ACI- 35-1D2-Ab1-BT, ou ACI-35-2G5-Ab3-BT para uma concentração final de anticorpo de 0,2 nM, 0,5 nM, ou 0,5 nM, respectivamente, e 10 μL de conjugado de grânulos de Receptor Tau13 para uma concentração final de grânulo de 2,5 μg/mL. A mistura de reação foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente, e 25 μL de grânulos de Doador de Estreptavidina foram adicionados e adicionalmente incubados durante 2 h à temperatura ambiente no escuro. Leitura foi feita usando o instrumento EnSpire Alfa e a análise usando EnSpire Workstation versão 3.00. Análise estatística dos dados foi realizada utilizando o software GraphPad Prism. Os resultados são apresentados como unidades Alpha ±SD.
7.2 RESULTADOS
[0310] Um ensaio AlphaLISA foi usado para testar anticorpos ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35-2G5-Ab3 para a capacidade de detectar Tau-pS396 em homogenatos do cérebro humano post-mortem e discriminar DA de controles combinados por idade. Todos os anticorpos detectaram Tau-pS396 (Figura 4A, 4B, 4C). A diferença na detecção do sinal entre DA e controles (n = 10) também foi altamente significativa para todos os anticorpos, mostrando aumento de sinal nos cérebros dos indivíduos com DA; ACI-35-2A1-Ab1 (p<0,0001), ACI-35-1D2-Ab1 (p<0,0001), e ACI-35-2G5-Ab3 (p=0,002). Em conclusão, a tecnologia AlphaLISA foi usada para demonstrar a capacidade de ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1, e ACI-35-2G5-Ab3 para detectar pS396-Tau no cérebro do sujeito com DA e para diferenciar entre DA e doadores controle.
EXEMPLO 8 EFICÁCIA IN VIVO DO ANTICORPO ACI-35-2G5-AB3 8.1 MÉTODOS 8.1.1 CONFIGURAÇÃO DO ESTUDO: EFEITOS DO TRATAMENTO IN VIVO DE 2 ADMINISTRAÇÕES DO ANTICORPO ANTI-PTAU ACI-35-2G5-AB3 EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS TAU
[0311]Camundongos fêmea e macho transgênicos de Tau (TMHT) com um fundo C57BL/6xDBA, a uma idade de 6-7 meses, receberam administração por injeção i.p3 ou 10 mg/kg de ACI-35-2G5-Ab3, ou duas vezes o controle do veículo (PBS), com uma semana de intervalo. No dia 14, os animais foram sacrificados, cérebros foram colhidos e processados por imuno-histoquímica (IHC). Para a determinação da patologia de Tau no hipocampo e na amígdala, cortes 5 (1 de cada nível) por cérebro foram marcados usando AT180 (para Tau-pT231) e anticorpos HT7 (para Tau humana total) e, posteriormente, áreas imunorreativas foram avaliadas utilizando software Image Pro Plus (v. 6.2). Objetos imunorreativos foram medidos acima de uma restrição de tamanho (30 μm2 na amígdala, 7 μm2 no hipocampo) e a cima de um limiar de intensidade dinâmica. Área total e a intensidade dos objetos e o limiar individual foram arquivados automaticamente. Se usado, um limiar dinâmico foi definido como média de intensidade dentro da área de intensidade (AOI) mais um fator vezes o desvio-padrão das intensidades de pixel dentro da AOI. O tamanho da região foi medido por definição manual do hipocampo e da amígdala. Os dados das áreas AT180 e HT7 IR foram normalizados para a região (no hipocampo) ou tamanho AOI (em amígdala).
8.2 RESULTADOS
[0312] O anticorpo pTau AT180 detecta o pTau endógeno e humano (duplamente fosforilado em Thr231 e Ser235). Para os camundongos transgênicos de Tau utilizados neste estudo, medições histológicas AT180 concentraram nos neurônios amigdaloides e hipocampais. Camundongos tratados com ACI-35-2G5-Ab3 tem uma redução significativa de intensidade da soma normalizado e média de AT180 de marcação somal, na amígdala e no hipocampo (Figura 5A e 5B), apresentando redução do total somal de pTau positivos pra AT180 em camundongos tratados.
[0313] Para Tau humano (transgênico) total, o anticorpo HT7 foi usado. HT7 reconhece Tau humano normal entre resíduo 159 e 163. Medições histológicas concentraram-se na somata imunorreativa de neurônios amigdaloides e hipocampais. Camundongos tratados com ACI-35-2G5-Ab3 tinham reduzido a área imunorreativa de HT7, bem como ser a soma e média da intensidade de HT7 da imunorreatividade na amígdala (figura 6A). No hipocampo, o mesmo foi observado para a média de intensidade (figura 6B). No entanto, observou-se aumento da marcação HT7 à área imunorreativa e intensidade de soma no hipocampo de camundongos tratados com 10 mg/kg. Este aumento observado no hipocampo se deu principalmente devido aos três camundongos dentre o total de oito camundongos investigados.
[0314]Tratamento de ACI-35-2G5-Ab3 diminuiu significativamente os níveis de pTau imunorreativa AT180 em ambas as regiões investigadas, assim em somata de neurônios amigdaloides e hipocampais. Na amígdala, a intensidade da soma da marcação foi diminuída para pTau imunorreativa AT180 e Tau humana imunorreativa total HT7. Tratamento com uma dose de 3 mg/kg diminuiu também significativamente a intensidade HT7 média em ambas as regiões. No entanto, em 10 mg/kg a área imunorreativa de HT7 média e área e intensidade da quantidade no hipocampo foram aumentadas acima das do camundongo tratado controle, sugerindo que um tratamento de ACI-35-2G5- Ab3 leva a uma transformação de pTau patológica.
EXEMPLO 9 MAPEAMENTO DO EPÍTOPO DE ANTICORPOS ANTI PTAU 9.1 MÉTODOS
[0315] Mapeamento do epítopo dos anticorpos monoclonais de camundongo de Tau anti-fosfo foi realizado por ELISA usando diferentes bibliotecas de peptídeo fosfo e não fosfo. As sequências de aminoácidos da biblioteca de peptídeo T3 usadas são mostradas na Tabela 11A. Cada biblioteca consistia de peptídeos curtos biotinilados abrangendo sequências fosfo e não fosfo presentes na vacina de peptídeo. Além disso, uma biblioteca de peptídeo foi gerada substituindo cada resíduo de uma sequência de peptídeo que se liga ao anticorpo com Alanina (Ala), como mostrado nas Tabelas 11B e 11C. Cada biblioteca consistia de peptídeos curtos biotinilados abrangendo sequências fosfo e não fosfo presentes na vacina de peptídeo. Bibliotecas de peptídeo foram compradas da ANAWA Trading SA. Bibliotecas de peptídeo foram compradas da ANAWA Trading SA. O mapeamento do epítopo foi feito de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Brevemente, placas cobertas com estreptavidina (NUNC) foram bloqueadas com 0,1% de BSA em salina tamponada com fosfato (PBS) durante a noite a 4°C.Após a lavagem com PBS-0,05% de Tween 20, placas foram revestidas por 1 h à temperatura ambiente com os peptídeos diferentes de cada biblioteca, diluídas em 0,1% de BSA, 0,1% de azida de sódio em PBS para uma concentração final de 10 μM. Após a lavagem, as placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo a ser testado diluído a 40 ng/ml em 2% de BSA e 0,1% de azida de sódio em PBS. Placas foram lavadas novamente e incubadas com anticorpo secundário de IgG anti-camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra), na diluição de 1/6000 por 1 h à temperatura ambiente. Após uma lavagem final, as placas foram incubadas com p-nitrofenil fosfato dissódico hexahidratado (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) solução de substrato de fosfatase e lidas em 405 nm, após incubação de 2 h usando um leitor de placa de ELISA. A ligação foi considerada positiva se a densidade óptica (D.O.) foi pelo menos 2 vezes a D.O. de fundo.
9.2 RESULTADOS
[0316] Como resultado dos experimentos de mapeamento do epítopo, epítopos puderam ser identificados incluindo o resíduo de aminoácido fosforilado necessário (ver tabela 5) aos quais os anticorpos divulgados neste documento especificamente se ligam. • Tau aa 393-401, com exigência para pS396 (ACI-35-2A1- Ab1; ACI-35-2A1-Ab2) • Tau aa 396-401, com exigência para pS396 (ACI-35-4A6- Ab1) • Tau aa 394-400, com exigência para pS396 (ACI-35-1D2- Ab1) • Tau aa 402-406, com exigência para pS404 (ACI-35-2G5- Ab1) • Tau aa 393-400, com exigência para p396 (ACI-35-2G5- Ab2; ACI-35-2G5-Ab3)
EXEMPLO 10 FOSFORILAÇÃO DA TAU EM SERINA 396 (PS396) USANDO QUINASE GSK3 B E ANÁLISE SDS-PAGE / WESTERN-BLOT 10.1 MÉTODOS
[0317]A isoforma mais longa de Tau humana de comprimento total (TAU441; SignalChem) em uma concentração final de 16 μM (20 μg de Tau/25 μL de reação) foi incubado com 0,018 U de GSK3β/pmol de Tau no tampão de fosforilação contendo HEPES com pH 7,64 (40mM), EGTA (5 mM), MgCl2 (3 mM) e ATP (2 mM) para 1, 6 ou 20 h a 4, 30 ou 37°C. Uma unidade de GSK3β é definida pelo fabricante (New England BioLabs) como a quantidade de enzima que transferirá 1 pmol de fosfato de ATP para fosfopeptídeo CREB (KRREILSRRPpSYR) em 1 minuto a 30°C.Tau fosforilada com GSK3β (pTau-GSK3β) foi sondada com anticorpos dirigidos contra Tau fosforilada em serina 202, 396, 404, 409, treonina 181, 205 e 231 e Tau total, executada em ELISA e Western-blots (WBs) diretos, para otimizar e verificar a atividade da quinase e especificidade (não mostrado). Além disso, os blots foram analisados para a presença de GSK3β usando um anticorpo anti-GSK3α/β (BioSource Invitrogen). Para todos os WBs, pTau-GSK3β foi diluída pela adição de um volume igual de tampão de amostra A (125 mM de Tris-HCl com pH 6,8, 4% [p/v] de dodecil sulfato de sódio [SDS], 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, 5% de β-mercaptoetanol), e as amostras foram aquecidas a 95°C por 10 min. 30 μg de amostra foram carregados em 4-12% de um gel de Bis-Tris (Invitrogen) e executados em tampão MOPS SDS (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para 0,45 μm de uma membrana de PVDF no tampão de transferência (25 mM de Tris com pH 8,6, 190 mM de glicina, 20% de metanol). Para verificar a transferência de proteína, as membranas foram coradas com Ponceau S por 5 min. As membranas foram, então, lavadas e bloqueadas por 1 hora em tampão de bloqueio (5% de BSA em TBS [50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl]). Membranas foram manchadas durante a noite a 4°C, com os anticorpos primários no tampão de bloqueio e 0,1% de Tween. Blotting com o ACI-35-2G5-Ab3 foi feito com a diluição de 0,5 μg/mL de anticorpo.
10.2 RESULTADOS
[0318] Tau tratada com GSK3β resultou em alta presença de fosforilação em serina 396 de Tau (Tau-pS396), como verificado usando anticorpos específicos para diferentes resíduos de Tau fosfo-serina e -treonina (não mostrados). A Figura 7 mostra um SDS-PAGE para Tau-pS396 gerado usando diferentes condições de GSK3β e a membrana manchada usando o anticorpo ACI-35-2G5-Ab3. O anticorpo ACI-35-2G5-Ab3, específico para Tau- pS396, demonstrou um bom sinal para Tau-pS396, com fitas também observadas sugerindo que este se liga a dímeros de Tau-pS396 (Figura 7, faixas 11 e 13). Nenhuma fita foi observada na ausência de tratamento de GSK3β (faixas 6-8 e 14-15).
EXEMPLO 11 DETECÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE TAU (PSER396) EM AMOSTRAS DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDIANO (CSF) HUMANO 11.1 MÉTODOS 11.1.1 AMOSTRAS HUMANAS - AMOSTRAS DE CÉREBRO POST-MORTEM
[0319] Córtex temporal post-mortem de um doador com doença de Alzheimer (DA) e AD19 foi obtido do Brain Endowment Bank5 da Universidade de Miami. Nosso gentil reconhecimento ao Brain Endowment Bank da Universidade de Miami pelo fornecimento das amostras para este estudo. As informações demográficas sobre o doador são mostradas na Tabela 12 abaixo, onde o estágio da doença Braak (Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82: 239-259) também é indicado.
Figure img0002
[0320] Tabela 12: Descrição da amostra do cérebro AD19 usada neste estudo.
11.1.2 PREPARAÇÃO DA FRAÇÃO DE HOMOGENATO DE S1 DO CÉREBRO POST- MORTEM
[0321] Córtex temporal post-mortem do dador AD19 foi homogeneizado de acordo com o seguinte protocolo. O fragmento do cérebro foi pesado e homogeneizado em 9 volumes de 25 mM de Tris-HCl com pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1mM de EDTA, 1 mM de EGTA contendo inibidores da fosfatase (30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido ocadaico, 1mM de PMSF, 5mM de Na4P2O7) e inibidores de protease (Complete Mini, Roche 04 693124 001). Homogeneização foi feita no gelo usando um oleiro de vidro. Isto constitui a fração de Homogenatototal (TH). Metade do volume da fração de TH foi dividida e armazenada a -80°C. O restante da fração de TH foi subsequentemente processado pela adição de Triton X-100 a uma concentração final de 0,4%. A amostra foi bem misturada e agitada em vórtex várias vezes antes de serem centrifugadas a 5'000 rpm por 5 min a 4°C. O sobrenadante constitui a fração de S1. A amostra foi dividida e armazenada a - 80°C. A concentração de proteína foi medidas usando o reagente de Bradford (Sigma B6916-500).
11.1.3 AMOSTRAS DE CSF HUMANO
[0322] Amostras de líquido cefalorraquidiano (CSF) de pacientes com doença de Alzheimer (DA) leve a moderada clinicamente confirmada e doadores saudáveis voluntários controle (Ctrls) foram fornecidas pela Charité School of Medicine Berlin. Nosso gentil reconhecimento à Charité School of Medicine Berlin pelo fornecimento das amostras para este estudo. As amostras foram divididas, armazenadas a - 80°C e usadas sem processamento adicional. Informações demográficas e clínicas dos doadores de amostra de CSF são mostradas na Tabela 13 abaixo.
Figure img0003
[0323] Tabela 13. Informações demográficas e clínicas dos doadores de amostra de CSF
11.1.3 IMUNO-ENRIQUECIMENTO DA TAU DO CSF 11.1.3.1 ACOPLAMENTO DO ANTICORPO
[0324] Para imuno-enriquecimento da Tau do CSF, um anticorpo Tau humano comercial (clone HT7, Thermo Scientific MN 1000) foi usado. A fim de acoplar HT7 a Dynabeads de Proteína G (Life Technologies 10004D), para cada amostra de 1,5 mg (50 μL) de Dynabeads de Proteína G foram ressuspensos por mistura por vórtex e transferidos para um tubo Maximum Recovery de 1,7 mL (Axygen MCT-175-L-C). Os tubos foram colocados num suporte magnético (DynaMag, Life Technologies 123.21D) a fim de concentrarem os grânulos no lado do tubo e remover o tampão. A ligação de 1 μg de HT7 em 200 μL de PBS com Dynabeads de Proteína G foi realiz ada utilizando um Hula Mixer (Life Technologies) em 10/20 rpm, inclinação de 25°/10, vibro de 5°/2 por 10 min, após o que os tubos foram colocados sobre o ímã, o tampão foi removido e os tubos foram lavados uma vez pipetando suavemente com 200 μL de PBS/0,02% de Tween 20 e duas vezes com tampão de conjugação 200 μL (20 mM de Fosfato Na, 150 mM de NaCl, preparada na hora). Os tampões de lavagem sempre foram removidos usando o ímã. Para reticulação de HT7 com Dynabeads de Proteína G, os grânulos de HT7 foram ressuspensos em 250 μL de solução de 5mM de BS3 (Sigma-Aldrich S5799) dissolvidos em tampão de conjugação e incubados com rotação (mesmas configurações acima) durante 30 min à temperatura ambiente (RT), a reação foi encerrada pela adição de 12,5 μL de tampão de extinção (1M de Tris-HCl com pH 7,5) por 15 min, seguido de três lavagens com 200 μL de PBS/0,02% de Tween 20.
11.1.3.1 IMUNO-ENRIQUECIMENTO DA TAU DO CSF
[0325] O CSF foi usado diluído e 1 mL de CSF para cada doador foi transferido para o tubo contendo os grânulos reticulados de HT7 e incubado durante 1 hora, 4°C, sob rotação contínua (10 rpm). Após a remoção do material não ligado sobre o ímã, os grânulos foram lavados com 200 μL de PBS/0,02% de Tween 20 e Tau foi eluída em 20 μL 1% de sulfato dodecil de sódio (SDS) em PBS a 70°C por 10 min. A fim de evitar a sedimentação dos grânulos, os tubos foram logo misturados (300 rpm no misturador horizontal aquecido, durante 5 segundos, a cada minuto). Após esta incubação, as amostras eluídas foram coletadas pela colocação dos tubos sobre o ímã.
[0326] Como um controle positivo, Tau foi também enriquecida de homogenatos do cérebro humano. Para estas diluições em série de fração do cérebro humano do doador S1 AD19 foram preparadas em PBS (0,5 μg/mL, 0,17 μg/mL, 0,056 μg/mL, 0,019 μg/mL, 0,006 μg/mL, 0,002 μg/mL, 0,0007 μg/mL). Cada amostra (1 mL) foi então tratada como descrito acima e eluída em 25 μL 1% de SDS.
11.1.3ALPHALISA. 11.1.3.1 DESCRIÇÃO DO ENSAIO ALPHALISA
[0327] AlphaLISA é um ensaio homogêneo que utiliza a tecnologia baseada em grânulo de Alfa. AlphaLISA foi selecionado como uma plataforma de tecnologia com base na sensibilidade e número mínimo de passos. Brevemente, o ensaio baseia-se na proximidade do grânulo. Após excitação em 680 nm, o fotossensibilizador contendo grânulos do Doador converte o oxigênio ambiente em espécies de oxigênio singleto, esta função de difusão (até 200 nm, dentro de 4 μseg de uma meia vida) e produz uma reação quimiluminescente nos grânulos de Receptor, levando a emissão de luz.
[0328] A configuração de ensaio usada em nossos experimentos foi a seguinte (ver também Figura 8): • Anticorpo Pan-Tau Tau-13 (Abcam ab24636), acoplado a grânulos de Receptor Alfa liga Tau humana presente na amostra e forma o complexo "grânulos do Receptor de proteína Tau-anticorpo Tau13" • O anticorpo ACI-35-2G5-Ab3-BT de detecção se liga a pS396 de Tau humana e permite a ligação de os grânulos de Doador Alfa revestidos pr Estreptavidina (SAv) para o complexo.
[0329] Depois de trazer todos os reagentes para a reação, o sinal quimioluminescente é lido usando leitor EnSpire Alpha 2390. 11.1.5.2 BIOTINILAÇÃO DO ANTICORPO ACI-35-2G5-AB3 Para ser usado no ensaio AlphaLISA, o anticorpo ACI-35-2G5-Ab3 foi biotinilado usando o Kit EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Thermo Scientific 21935), de acordo com as instruções do fabricante. Foi usado na reação de marcação o excesso molar de vinte e cinco vezes de Biotina sobre anticorpo. Após a biotinilação, o excesso de biotina livre foi removido por lavagem do anticorpo quatro vezes em PBS usando 50’000 MWCO Spin- X UF 500 Concentrator(Corning 431480). O anticorpo ACI-35-2G5-Ab3 biotinilado é indicado como ACI-35-2G5-Ab3-BT.
11.1.5.3 ACOPLAMENTO DO ANTICORPO TAU-13 A GRÂNULOS DE RECEPTOR ALPHALISA.
[0330] A fim de ser usado no ensaio AlphaLISA, o anticorpo Tau-13 foi conjugado com os grânulos de Receptor Alfa ativados (Perkin Elmer 6772001). Utilizou-se o seguinte protocolo de conjugação: 0,1 mg de solução de anticorpo Tau-13 (purificada em coluna de proteína A) foi misturado com 1 mg de pélete de Grânulo de Receptor AlphaLISA e complementado com 0,13 M de tampão fosfato (pH 8,0) para um volume final de reação de 200 μL. Em seguida, 1,25 μL de 10% de Tween-20 e 10 μL de uma solução de 25 mg/mL de NaBH3CN foram adicionados e o tubo foi incubado por 48 h a 37°C, com uma rotação leve (7 rpm). Após a reação de conjugação, os sítios ativos em grânulos foram bloqueados pela adição de 10 μL de uma solução de Carboxi-metoxilamina e adicionalmente incubados a 37°C durante 1 h. Finalmente, os grânulos foram lavados duas vezes com 200 μL de 0,1 M Tris-HCl com pH 8,0 e armazenados a 4°C em 200 μL de tampão de armazenamento (PBS com 0,05% de Proclin-300) que resultou em uma concentração de grânulos de Receptor AlphaLISA final de 5 mg/ml.
11.1.5.3 LIMITE DE DETERMINAÇÃO DE DETECÇÃO USANDO O CÉREBRO PS396-TAU
[0331] Amostras de cérebro imuno-enriquecido Tau, amostras de fração de cérebro de S1 e vazios do tampão foram usados para esta experiência. Cada amostra foi analisada em volume de final de 50 μL usando uma OptiPlate de 384 poços branca (PerkinElmer 6007291). Diluições de todos os reagentes foram feitas com tampão de Ensaio Alpha (PerkinElmer AL000C). • 5 μL da amostra (1/10 do volume final, portanto, a concentração de proteína final no ensaio corresponde a 1/10 da concentração de amostra). • 10 μL de 0,5% de SDS para amostras de fração de cérebro da S1 ou 10 μL de tampão simples para as amostras de cérebro de Tau imuno-enriquecidas foram adicionados • 15 μL de anticorpo ACI-35-2G5-Ab3-BT (concentração final: 5 nM) misturado com conjugado de grânulos de Receptor Tau13 (concentração final do grânulo: 2,5 μg/mL) • Incubação à temperatura ambiente por 1 hora • 20 μL de grânulos de Doador de Estreptavidina (concentração final do grânulo: 25 μg/mL) • Incubação à temperatura ambiente por 30 min (protegido da luz) • Leitura usando o instrumento EnSpire Alfa e a análise usando EnSpire Workstation versão 3.00.
11.1.5.3 DETERMINAÇÃO DE PS396-TAU IMUNO-ENRIQUECIDO EM CSF
[0332] Cada amostra foi analisada em volume de final de 50 μL usando uma OptiPlate de 384 poços branca (PerkinElmer 6007291). Diluições de todos os reagentes foram feitas com tampão de Ensaio Alpha (PerkinElmer AL000C). • 5 μL de eluato imunoprecipitado de cada doador • 20 μL de anticorpo ACI-35-2G5-Ab3-BT (concentração final: 5 nM) misturado com conjugado de grânulos de Receptor Tau13 (concentração final do grânulo: 2,5 μg/mL) • Incubação à temperatura ambiente por 1 hora • 25 μL de grânulos de Doador de Estreptavidina (concentração final do grânulo: 25 μg/mL) • Incubação à temperatura ambiente por 30 min (protegido da luz) • Leitura usando o instrumento EnSpire Alfa e a análise usando EnSpire Workstation versão 3.00.
1 1.1.6ANÁLISE ESTATÍSTICA
[0333] Análise estatística dos dados foi realizada utilizando o software GraphPad Prism.
11.1 RESULTADOS
[0334] Experimentos preliminares indicaram que a quantidade de pS396 presentes no CSF humano era demasiado baixa para a detecção. Por este motivo, foi desenvolvido um protocolo de imuno- enriquecimento acoplado à imuno-detecção de alta sensibilidade. O protocolo de imuno-enriquecimento foi primeiramente validado utilizando material de cérebro humano com DA post-mortem. Comparação lado a lado de amostras de cérebro não tratado homogeneizado com amostras de Tau imuno-enriquecids revelou que, em concentrações correspondentes, o limite de detecção do ensaio AlphaLISA de Tau13/ACI-35-2G5-Ab3 foi alcançado em 0,5 μg/mL para as amostras não tratadas e entre 0,0020,006 μg/mL para as amostras imuno-enriquecidas, indicando um enriquecimento de 100 vezes (Figura 9).
[0335] Em seguida, o protocolo de imuno-enriquecimento foi aplicado nas amostras de CSF do doador vivo (n = 17 para pacientes com DA de leve a moderada e n = 16 para voluntários saudáveis com idade correspondente). Os dados obtidos (Figura 10) demonstram que: a) seguindo o protocolo de imuno-enriquecimento de Tau13/ACI-35-2G5-Ab3, o AlphaLISA detectou pS396-Tau em todas as amostras de CSF humano; e b) mais importante, um significativo aumento na quantidade de pS396-Tau em CSF com DA foi observado quando comparado ao controle (p = 0,0003, teste de Mann-Whitney).
[0336] Em conclusão, um protocolo de imuno-enriquecimento / imuno-detecção foi desenvolvido, permitindo a detecção de pS396-Tau no CSF humano. Aumento de pS396-Tau no CSF de DA de leve a moderada sugere que este método pode ser utilizado com sucesso em estudos clínicos de biomarcador para avaliar a progressão da doença, a estratificação do paciente e a eficácia da terapia. O anticorpo ACI-35-2G5- Ab3 detectou pS396-Tau em todas as amostras do CSF humano, e mais importante, o anticorpo foi capaz de discriminar CSF com DA quando comparado ao controle.
TABELA 1
[0337] Descrição de sequência Tau, vacina e anticorpos
Figure img0004
Figure img0005
Baseado na isoforma mais longa de Tau humana (Tau441). p indica resíduo fosforilado.
TABELA 2
[0338] Varredura de hibridomas para ligação ao alvo
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
[0339] A intensidade da ligação pode ser comparada apenas dentro da mesma coluna, dentro do mesmo ensaio (ELISA, ou TAUPIR ou WB).
[0340] - A ligação não é boa ou não há ligação; + Boa ligação; ++ Ligação muito boa; +++ Ligação excelente (melhor que ligação muito boa)
TABELA 3
[0341] Afinidade de ligação de anticorpos anti-tau.
Figure img0009
Figure img0010
[0342] a Análises realizadas com uma pureza de Fosfo-peptídeo de 64% por HPLC.
[0343] b Análises realizadas com uma pureza de Fosfo-peptídeo de 87% por HPLC.
TABELA 4
[0344] Descrição dos sujeitos com DA utilizados para este estudo.
Figure img0011
TABELA 5
[0345] Aminoácidos de Tau e fosfo-resíduos necessários para a ligação de anticorpos.
Figure img0012
[0346] *Com base na isoforma mais longa da Tau humana (Tau441)
TABELA 6
[0347] Sequência de Aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VK) e CDRs.
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
Figure img0016
Figure img0017
TABELA 7
[0348] Sequência de Nucleotídeo das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VK).
Figure img0018
Figure img0019
Figure img0020
Figure img0021
Figure img0022
TABELA 8
[0349] Iniciadores utilizados para sequenciamento do CDR das regiões variáveis do anticorpo.
Figure img0023
Figure img0024
Figure img0025
Figure img0026
Figure img0027
Figure img0028
Figure img0029
Figure img0030
Figure img0031
[0350] Códons Degenerados: R = A ou G S = C ou G D = A ou G ou T B = C
[0351] ou G ou T
[0352] Y = C ou T M = A ou C H = A ou C ou T
[0353] K = G ou T W = A ou T V = A ou G ou C
TABELA 9
[0354] Isoforma mais longa de Tau humana (441aa), também chamada de Tau40.
Figure img0032
Figure img0033
DEPÓSITOS TABELA 10
[0355] As seguintes linhagens celulares de hibridoma foram depositadas em nome da AC Immune SA, PSE-EPFL Building B, 1015 Lausanne/Suíça e KatholiekeUniversiteit Leuven, Waaistraat 6 - Box 5105, 3000 Leuven/Bélgica, com o “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste:
Figure img0034
TABELA 11A
[0356] Biblioteca de peptídeos usada para mapeamento do epítopo.
Figure img0035
TABELA 11B
[0357] Biblioteca de peptídeos de substituição de alanina (Ala) usada para mapeamento do epítopo de anticorpos específicos a pS396.
Figure img0036
TABELA 11C
[0358] Biblioteca de peptídeos de substituição de alanina (Ala) usada para mapeamento do epítopo de anticorpos específicos a pS404.
Figure img0037
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[0405] Publicação de Patente U.S. N° 2005/0124533
[0406] Publicação de Patente U.S. N° 2005/0089473
[0407] Publicação de Patente U.S. N° 2003/0073713
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[0413] Patente U.S. N° 5.004.697

Claims (17)

1. ANTICORPO, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo na proteína Tau de mamíferos ou em um fragmento da mesma, caracterizado pelo referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ter uma afinidade de ligação à proteína Tau fosforilada, solúvel, oligomérica e insolúvel com uma constante de dissociação que varia de 2 nM a 80 nM e em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 93, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 94, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 90, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 91.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo referido anticorpo ou fragmento de anticorpo: (a) modular os níveis de Tau solúvel e insolúvel no córtex cerebral e/ou no hipocampo; e/ou (b) reduzir os níveis totais da proteína tau solúvel e/ou proteína tau fosforilada solúvel; e/ou (c) reduzir os níveis filamentos helicoidais pareados contendo proteína tau hiperfosforilada.
3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo referido anticorpo ou fragmento de anticorpo ter uma constante de dissociação de menos de 10 nM.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano ou um fragmento funcional do mesmo.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado por ser do isótipo IgG2b, IgG2a ou IgG3.
6. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento funcional do mesmo, em que o polinucleotídeo compreende a molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 109, 110 ou 117.
7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma combinação dos mesmos, em uma quantidade terapeuticamente eficaz junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. USO DE UM ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo ou uma composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma combinação dos mesmos, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo, tais como um tauopatia em um mamífero, particularmente um humano em necessidade de tal tratamento.
9. USO DE UM ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo ou composição farmacêutica, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para uso no tratamento ou alívio de déficits cognitivos em um mamífero, particularmente um humano sofrendo de tal déficit, e opcionalmente: (i) em que o tratamento ou alívio dos déficits cognitivos em um mamífero, especialmente um humano, leva a uma contenção na progressão dos déficits cognitivos, ou (ii) em que o tratamento ou o alívio dos déficits cognitivos em um mamífero, particularmente um humano, leva a um aumento na retenção, particularmente uma restauração completa da capacidade cognitiva da memória no sujeito tratado.
10. USO DE UM ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo ou a composição farmacêutica, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para uso no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou estão associados à formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante na tauopatia compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que mostram a presença de patologias de tau e amiloides, incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt- Jacob, demência pugilística, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker, miosite com corpo de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral da proteína de príon, lesão cerebral traumática e outras doenças ou distúrbios que não mostram uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitadas a, esclerose amiotrófica lateral/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, demência frontotemporal, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhados, parkinsonismo pós-encefalítico e distrofia miotônica.
11. MÉTODO IN VITRO, para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou condição associada à proteína tau ou uma predisposição a uma doença, distúrbio ou condição associada à proteína tau em um paciente, caracterizado por compreender a detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo ou de um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um epítopo da proteína tau em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) colocar a amostra com suspeita de conter o antígeno tau em contato com um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, cujo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do antígeno tau na amostra, em que um aumento na quantidade do referido agregado, em comparação a um valor controle normal, indica que o referido paciente está sofrendo ou tem o risco de desenvolver uma doença ou condição associada à proteína tau.
12. MÉTODO DE DETECÇÃO post-mortem de multimêros do fosfo-Tau (pTau) em uma amostra de um sujeito com suspeita de sofrer de uma doença ou distúrbio associado à tau, caracterizado por compreender: (a) colocar uma amostra do sujeito em contato com um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, cujo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo da proteína fosfo-Tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) comparar a quantidade ou intensidade do complexo imunológico na amostra obtida do sujeito à quantidade ou intensidade do complexo imunológico obtido de um sujeito controle saudável, usando as mesmas condições, em que um aumento na quantidade ou intensidade do referido complexo imunológico, em comparação ao valor controle, indica que o referido paciente sofreu de uma doença ou distúrbio associado à tau.
13. MÉTODO DE DETECÇÃO IN VITRO da formação de um complexo imunológico associado a uma doença, distúrbio ou condição associada a proteína tau, ou predisposição a doença, distúrbio ou condição associada a proteína tau em um paciente, caracterizado por compreender a detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo ou de um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um epítopo da proteína tau em uma amostra, compreendendo as etapas de (a) colocar a amostra com suspeita de conter o antígeno tau em contato com um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, cujo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo da proteína tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e, opcionalmente (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência do antígeno tau na amostra.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pela amostra ser amostra de líquido cefalorraquidiano ou amostra de cérebro.
15. KITS DE TESTE, para detecção e diagnóstico de doenças, distúrbios ou condições associadas à proteína tau, caracterizados por compreenderem um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e instruções para usar os anticorpos para a finalidade de ligação ao antígeno tau para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico, de forma que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com a presença ou ausência do antígeno tau.
16. LINHAGEM CELULAR ISOLADA, caracterizada por produzir um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo a linhagem de células de hibridoma A4-2A1-18, depositada em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139 ou a linhagem de células de hibridoma A4-2A1-40, depositada em 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140.
17. MÉTODO DE DETECÇÃO IN VITRO de multimêros de fosfo-Tau (pTau) em uma amostra de cérebro de um sujeito suspeito de sofrer de uma doença ou distúrbio associado a proteína tau, caracterizado por compreender (a) colocar a amostra em contato com um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, cujo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo da proteína fosfo-Tau; (b) permitir que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligue à proteína tau para formar um complexo imunológico; e (c) detectar a formação do complexo imunológico.
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