BR122017017921A2 - métodos e sistema para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio - Google Patents

métodos e sistema para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio Download PDF

Info

Publication number
BR122017017921A2
BR122017017921A2 BR122017017921A BR122017017921A BR122017017921A2 BR 122017017921 A2 BR122017017921 A2 BR 122017017921A2 BR 122017017921 A BR122017017921 A BR 122017017921A BR 122017017921 A BR122017017921 A BR 122017017921A BR 122017017921 A2 BR122017017921 A2 BR 122017017921A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
individual
generation
nucleic acid
Prior art date
Application number
BR122017017921A
Other languages
English (en)
Inventor
David Joseph James
H Hager Jeffrey
Qian Jing
Lee Sensintaffar John
Lu Nhin
D Smith Nicholas
Original Assignee
Aragon Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aragon Pharmaceuticals Inc filed Critical Aragon Pharmaceuticals Inc
Publication of BR122017017921A2 publication Critical patent/BR122017017921A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4166—1,3-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. phenytoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Abstract

métodos e sistema para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio a presente invenção refere-se a polipeptídeos de receptor de androgênio modificados que são resistentes à inibição por um inibidor de receptor de androgênio. são aqui descritos composições, combinações e kits que contêm os polipeptídeos de receptor de androgênio modificados e métodos do uso dos polipeptídeos de receptor de androgênio modificados. são também aqui descritos métodos de uso dos polipeptídeos de receptor de androgênio modificados como agentes de triagem para a identificação e o design de moduladores de receptor de androgênio de terceira geração. são também aqui descritos moduladores de receptor de androgênio de terceira geração que inibem a atividade dos polipeptídeos de receptor de androgênio modificados. são também descritas composições farmacêuticas e medicamentos que incluem os compostos descritos no presente documento, bem como métodos de uso desses moduladores de receptor de androgênio, sozinhos e em combinação com outros compostos, para tratar doenças ou condições, incluindo cânceres, como cânceres de próstata resistentes à castração, que são mediados ou dependentes de receptores de androgênio.

Description

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA COMO UM ARQUIVO DE TEXTO POR MEIO DE EFS-WEB [002] O presente pedido contém uma listagem de sequência, que foi submetida como um arquivo de texto legível por computador no formato ASCII por meio de EFS-Web e é por meio desta incorporada em sua totalidade por referência no presente documento. O arquivo de texto, criado na data de 16 de julho de 2013, é nomeado 38937-725601_SEQ.txt e tem 132 KB de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] O receptor de androgênio (AR) é uma proteína regulatória transcricional ativada por ligante que faz a mediação da indução de uma variedade de efeitos biológicos através de sua interação com androgênios endógenos. Os androgênios endógenos incluem esteroides como testosterona e di-hidrotestosterona. A testosterona é convertida em di-hidrotestosterona pela enzima 5 alfa-redutase em muitos tecidos.
[004] As ações dos androgênios com receptores de androgênio foram implicadas em diversas doenças ou condições, como cânceres dependentes de androgênio, virilização em mulheres e acne, dentre outras. Os compostos que diminuem os efeitos da sinalização de androgênio por meio do receptor de androgênio e/ou reduzem as concentrações de receptores de androgênio têm uso no tratamento de doenças ou condições em que os receptores de androgênio têm um papel.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 11/302
2/167
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] É descrita no presente documento a identificação de modificações no receptor de androgênio (AR) que confere resistência dos pacientes a tratamento com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de fenilalanina na posição 876 de um polipeptídeo de AR. Em algumas modalidades, a modificação é F876L. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado é resistente a inibição por um antagonista de receptor de androgênio de segunda geração selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, O polipeptídeo de AR modificado é resistente a inibição por um antagonista de receptor de androgênio de primeira geração selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida. Em algumas modalidades, o paciente tem um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata, câncer de mama, câncer de fígado (isto é, hepatocelular), ou câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado exibe uma ou mais atividade de um receptor de AR do tipo selvagem, incluindo, mas não se limitando a, ligação de coativador, ligação de DNA, ligação de ligante, ou translocação nuclear. Em algumas modalidades, o antagonista de primeira ou de segunda geração exibe atividade antagonística reduzida contra um polipeptídeo de AR modificado em comparação a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem.
[006] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para determinar se um indivíduo é ou se tornará resistente a terapia com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração, que compreende, que consiste em, e/ou que consiste essencialmente em: (a) testar uma amostra que
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 12/302
3/167 contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de receptor de androgênio do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de receptor de androgênio codificado é modificado na posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou se tornará resistente a terapia com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se o indivíduo tiver a modificação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente uma etapa para obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, foi administrado a um indivíduo um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração para o tratamento de um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata, câncer de mama, câncer de fígado (isto é, hepatocelular), ou câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, consistem em, e/ou consistem essencialmente em descontinuar o tratamento com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na continuação do tratamento com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo não tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na administração de um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração que inibe o AR modificado se o amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de segunda geração é selecionado dentre ARN-509,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 13/302
4/167 enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira geração é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida.
[007] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para selecionar um indivíduo para a terapia com um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração, que compreende, que consiste em, e/ou que consiste essencialmente em: (a) testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de receptor de androgênio do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de receptor de androgênio codificado é modificado na posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para a terapia com um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração se o indivíduo tiver a modificação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente uma etapa para obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, consistem em, e/ou consistem essencialmente em descontinuar o tratamento com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na continuação do tratamento com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo não tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na administração de um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração que inibe o AR modificado se o amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 14/302
5/167 segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira geração é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida.
[008] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para caracterizar um receptor de androgênio do indivíduo para determinar se esse indivíduo pode ser resistente a inibição com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração, que compreende, que consiste em, e/ou que consiste essencialmente em: (a) testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de receptor de androgênio do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de receptor de androgênio codificado é modificado na posição de aminoácido 876 do SEQ ID NO: 1; e (b) se o indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1, caracterizar o receptor de androgênio do indivíduo como sendo resistente a inibição com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente uma etapa para obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, o antagonista de primeira ou de segunda geração exibe atividade antagonística reduzida contra um polipeptídeo de AR modificado em comparação a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, consistem em, e/ou consistem essencialmente em descontinuar o tratamento com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na continuação do tratamento com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo não tiver a modifi
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 15/302
6/167 cação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na administração de um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração que inibe o AR modificado se o amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira geração é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida.
[009] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para monitorar se um indivíduo receber um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração para o tratamento de um câncer desenvolveu ou desenvolverá resistência à terapia, que compreende: (a) testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de receptor de androgênio do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de receptor de androgênio codificado é modificado na posição de aminoácido 876 do SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou se tornará resistente a terapia com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se o indivíduo tiver a modificação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente uma etapa para obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, consistem em, e/ou consistem essencialmente em descontinuar o tratamento com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na continuação do tratamento com um antagonista de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 16/302
7/167 receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo não tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na administração de um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração que inibe o AR modificado se o amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira geração é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida.
[0010] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para otimizar a terapia de um indivíduo que recebe um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração para o tratamento de um câncer, que compreende, que consiste em, e/ou que consiste essencialmente em: (a) testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de receptor de androgênio do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de receptor de androgênio codificado é modificado na posição de aminoácido 876 do SEQ ID NO: 1; e (c)(i) se a amostra tiver a modificação, descontinuar o tratamento do indivíduo com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração ou (ii) se a amostra não tiver a modificação, continuar o tratamento do indivíduo com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se o indivíduo não tiver a modificação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente uma etapa para obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, consistem em, e/ou consistem essencialmente em descontinuar o tratamento com o antagonista de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 17/302
8/167 receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na continuação do tratamento com um antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração se a amostra do indivíduo não tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente na administração de um antagonista de receptor de androgênio de terceira geração que inibe o AR modificado se o amostra do indivíduo tiver a modificação na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira geração é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida ou nilutamida.
[0011] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende, consiste em, e ou consiste essencialmente em uma substituição ou uma deleção do aminoácido na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente na substituição de fenilalanina a um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente na substituição de fenilalanina a um aminoácido selecionado dentre glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modi
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 18/302
9/167 ficado compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente na substituição de fenilalanina a leucina na posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente na deleção de ácido nucleico que codifica a posição de aminoácido 876 do SEQ ID NO: 1.
[0012] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de AR modificado tem (i) uma mutação de timina (t) a citosina (c) em uma posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2626 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18; (ii) uma mutação de citosina (c) para adenina (a) na posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2628 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18; ou (ii) uma mutação de citosina (c) para guanina (g) na posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2628 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18.
[0013] Em algumas modalidades do método, a amostra de ácido nucleico é RNA ou DNA. Em algumas modalidades do método, a amostra de ácido nucleico é DNA genômico. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente, consiste em, e/ou consiste essencialmente em isolar mRNA da amostra de RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é isolado de uma amostra de célula de tumor obtido do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de biópsia de tumor, uma amostra sanguínea, uma amostra de soro, uma amostra de linfa, ou um aspirato de medula óssea obtidos do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra contém células tumorais circulantes. Em algumas modalidades, a amostra contém células tumorais disseminadas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é purificado a partir da amostra antes do teste. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é amplificado antes do teste.
[0014] Em algumas modalidades do método, o teste compreende,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 19/302
10/167 consiste em, e/ou consiste essencialmente na realização da amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de uma amostra de ácido nucleico que codifica a posição 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a amplificação por PCR compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente no uso de um par de iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiam a região que codifica a posição de aminoácido 876 do SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente o sequenciamento do ácido nucleico amplificado por PCR com o uso de técnicas conhecidas pelos versados na técnica.
[0015] Em algumas modalidades, o teste compreende, consiste em, e/ou consiste essencialmente em colocar o ácido nucleico em contato com uma sonda de ácido nucleico específica por sequência, em que a sonda de ácido nucleico específica por sequência: (a) se liga ao ácido nucleico que codifica um receptor modificado que é modificado na posição de aminoácido 876; e (b) não se liga a ácido nucleico que codifica o receptor de tipo selvagem que tem fenilalanina na posição 876 do SEQ ID NO: 1.
[0016] Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração inibe um polipeptídeo de receptor de tipo selvagem de androgênio por antagonismo competitivo. Em algumas modalidades, o antagonista de receptor de androgênio de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida ou (MDV3100), ou RD162.
[0017] Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença ou distúrbio selecionado dentre câncer, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio proliferativo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer mediado por AR. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de um câncer de próstata, um câncer de mama, câncer de fígado (isto é, he
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 20/302
11/167 patocelular), ou uma câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um tumor sólido.
[0018] Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração antes de obter a amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é responsivo ao tratamento com o antagonista de receptor de androgênio de primeira ou de segunda geração quando o mesmo é administrado. Em algumas modalidades, a amostra para uso nos métodos é uma amostra obtida em 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 14 meses, 16 meses, 18 meses, 20 meses, 22 meses, ou 24 meses após a primeira administração do antagonista de AR de primeira ou de segunda geração. Em algumas modalidades, a amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes ao longo do curso do tratamento com o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração. Em algumas modalidades, o indivíduo é responsivo ao tratamento com o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração quando o mesmo é administrado.
[0019] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos para testar os compostos que antagonizam um receptor modificado de androgênio, que compreende, que consiste em e/ou que consiste essencialmente em: (a) expressar um receptor modificado de androgênio em uma célula, em que o receptor modificado de androgênio é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição 876 do SEQ ID NO: 1; (b) colocar a célula em contato com um composto de teste; e (c) detectar o nível de atividade de receptor de androgênio na célula, em que uma redução na atividade expressa indica que o composto antagoniza o AR modificado. Em algu
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 21/302
12/167 mas modalidades, o composto de teste exibe atividade de antagonista completa para o AR modificado. Em algumas modalidades, o composto de teste não exibe atividade de agonista para o AR modificado. É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, é um inibidor de receptor de androgênio de terceira geração identificado pelos métodos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, a modificação do polipeptídeo de AR usada no método é uma substituição ou deleção do aminoácido na posição 876 do polipeptídeo de receptor de androgênio. Em algumas modalidades, a modificação do polipeptídeo de AR usada no método é uma substituição de fenilalanina a um aminoácido selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de receptor de androgênio. Em algumas modalidades, a modificação do polipeptídeo de AR usada no método é uma substituição de fenilalanina a um aminoácido selecionado dentre glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de receptor de androgênio. Em algumas modalidades, a modificação do polipeptídeo de AR usada no método é uma substituição de fenilalanina em leucina na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de receptor de androgênio.
[0020] Em algumas modalidades, a célula empregada no método é deficiente para a expressão de receptor de tipo selvagem de androgênio, expressa um nível baixo de receptor de tipo selvagem de androgênio, ou expressa um receptor de AR modificado. Em algumas modalidades, a célula é uma selecionada dentre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3, TSY-PR1, LNCaP, CWR, VCaP e LAPC4. Em algumas modalidades, a célula compreende um gene-repórter ligado de maneira funcional a um promotor responsivo a androgênio. Em al
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 22/302
13/167 gumas modalidades, a atividade do polipeptídeo de AR é determinada analisando-se a expressão do gene-repórter. Em algumas modalidades, o promotor compreende um elemento de resposta a androgênio. Em algumas modalidades, o elemento de resposta a androgênio é 4XARE ou um elemento de probasina. Em algumas modalidades, o promotor é uma probasina, um antígeno específico a próstata, MMTV LTR, FASN, STEAP4, TMPRSS2, ORM1, ou promotor de NKX3.1. Em algumas modalidades, o gene-repórter codifica uma proteína selecionada dentre uma luciferase, uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, ou uma enzima.
[0021] É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um polipeptídeo de receptor de androgênio isolado ou uma variante do mesmo que tem atividade de receptor de androgênio que compreende uma modificação em uma posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, em que a modificação confere resistência a um antagonista de receptor de androgênio no polipeptídeo de receptor modificado de androgênio ou variante. Em algumas modalidades, a modificação compreende substituição do aminoácido na posição 876 em comparação a um receptor de tipo selvagem de androgênio apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a substituição é F876L. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma deleção da posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado é um polipeptídeo recombinante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma substituição do aminoácido na posição 876 em comparação a um receptor de tipo selvagem de androgênio apresentado na SEQ ID NO: 1 e um ou mais substituições de aminoácido adicionais. Em algu
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 23/302
14/167 mas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma substituição no aminoácido na posição 876 que é F876L. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma ou mais substituições de aminoácido adicionais selecionadas dentre uma ou mais substituições de aminoácido associadas a câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácido adicionais é selecionada dentre uma ou mais substituições nas posições de aminoácido 701, 741, 874 e 877 em comparação a um receptor de tipo selvagem de androgênio apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácido adicionais é selecionada dentre T877A, W741C, W741L, W741R, L701H e H874Y. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado é um polipeptídeo recombinante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 ou uma variante que tem pelo menos ou ao menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com o polipeptídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5, em que o aminoácido na posição 876 não é fenilalanina.
[0022] É descrita no presente documento, em determinadas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo de receptor modificado de androgênio fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um DNA ou uma molécula de RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma amplificação por produto de PCR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula sintética. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 24/302
15/167 apresentada na SEQ ID NO: 19 ou uma variante que tem ao menos ou ao menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com o polipeptídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 19, em que o códon de ácido nucleico que codifica o aminoácido na posição 876 não codifica fenilalanina.
[0023] É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um vetor, que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de receptor modificado de androgênio fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral ou plasmídico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é ligado de maneira funcional a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo ou um promotor induzível. É descrita no presente documento, em determinadas modalidades, uma célula hospedeira, que compreende o vetor. Em algumas modalidades, a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um polipeptídeo de AR mutante expresso pela célula hospedeira.
[0024] É descrita no presente documento, em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um inibidor de receptor de androgênio de terceira geração identificado pelos métodos fornecidos no presente documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável. São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, usados de um inibidor de receptor de androgênio de terceira geração identificado pelos métodos fornecidos no presente documento para a fabricação de um medicamento. São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, métodos de tratamento que compreendem administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, em que a composição compreende um carreador farma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 25/302
16/167 ceuticamente eficaz. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer mediado por AR. Em algumas modalidades o câncer é um câncer de próstata, câncer de mama, câncer de fígado (isto é, hepatocelular), ou câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o indivíduo expressa um AR mutante. Em algumas modalidades, o AR mutante compreende uma substituição ou uma deleção do aminoácido na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo de receptor de androgênio. Em algumas modalidades, a substituição é F876L. Em algumas modalidades, o antagonista de AR de terceira geração é administrado com um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o antagonista de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional são administrados sequencialmente, de forma simultânea ou intermitente. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado dentre hormônios, agonistas de receptor de hormônio ou antagonistas, corticosteroides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticâncer, agentes anti-inflamatórios, inibidores da quinase, inibidores de HSP90, inibidores de histona desacetilase (HDAC). Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agonista ou antagonista de hormônio liberador de gonadotropina (GnRH). Em algumas modalidades, o agonista de GnRH é leuprolídeo, bruserelina ou goserelina.
[0025] É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um microcircuito que compreende o polipeptídeo de AR mutante fornecido no presente documento ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de AR modificado fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma modificação no aminoácido 876. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de aminoácido que é F876L. [0026] São descritos no presente documento, em determinadas
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 26/302
17/167 modalidades, kits que compreendem o polipeptídeo de AR mutante fornecido no presente documento. É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um kit que compreende o ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo de AR mutante fornecido no presente documento. São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, kits que compreendem um ou mais reagentes para a detecção de um polipeptídeo de AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876. É descrito no presente documento, em determinadas modalidades, um kit que compreende um ou mais reagentes para a detecção de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de aminoácido que é F876L. Em algumas modalidades, os kits compreendem um par de iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiam a região de ácido nucleico que codifica o aminoácido 876 de um polipeptídeo de AR. Em algumas modalidades, os kits compreendem um iniciador de oligonucleotídeo que (a) se liga ao ácido nucleico que codifica um AR modificado que é modificado na posição de aminoácido 876; e (b) não se liga ao ácido nucleico que codifica o AR de tipo selvagem que tem fenilalanina na posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, os kits compreendem um microcircuito que compreende (a) um polipeptídeo de AR modificado que tem uma modificação que é F876S, ou uma porção do mesmo que compreende uma modificação que é F876S; ou (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR mutante que tem uma modificação que é F876S, ou uma porção do mesmo que compreende uma modificação que é F876S.
[0027] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, os sistemas para detectar um AR modificado que é resistente a inibição com um antagonista de AR de primeira ou de se
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 27/302
18/167 gunda geração em um indivíduo, que compreende: (a) uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) uma micromatriz que compreende o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR mutante ou uma porção do mesmo que é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a micromatriz é contida em um microcircuito. São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, sistemas para detectar um AR modificado que é resistente a inibição com um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração em um indivíduo, que compreende: (a) uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) uma sonda de ácido nucleico específica por sequência, em que a sonda de ácido nucleico específica por sequência: (i) se liga ao ácido nucleico que codifica um AR modificado que é modificado na posição de aminoácido 876; e (ii) não se liga ao ácido nucleico que codifica o AR de tipo selvagem que tem fenilalanina na posição de aminoácido 876. São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, os sistemas para detectar um AR modificado que é resistente a inibição com um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração em um indivíduo, que compreende: (a) uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) um par de iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiam a região de ácido nucleico que codifica o aminoácido 876 de um polipeptídeo de AR.
[0028] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, anticorpos isolados que se ligam a um polipeptídeo de receptor modificado de androgênio fornecido no presente documento, em que o anticorpo não se liga ou se liga com afinidade inferior a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem que tem a sequência de aminoá
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 28/302
19/167 cidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de AR modificado compreende uma modificação no aminoácido 876. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de aminoácido que é F876L.
[0029] São descritos no presente documento, em determinadas modalidades, os métodos para a terapia de manutenção em um paciente que tem um câncer, que compreende: (a) administrar ao paciente um regime de terapia de manutenção que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz do antagonista de AR de primeira ou de segunda geração; e (b) monitorar o paciente em intervalos de tempo predeterminados ao longo do curso do regime de terapia de manutenção para determinar se o indivíduo tem mutação em um gene endógeno que codifica AR que resulta em uma modificação em uma posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o monitoramento compreende: testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de AR codificado é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente descontinuar o regime de terapia de manutenção se o indivíduo tiver a mutação ou continuar o regime de terapia de manutenção se o indivíduo não tiver a modificação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar antagonista de AR de terceira geração que inibe o AR modificado se o indivíduo tiver a modificação. Em algumas modalidades, a modificação no polipeptídeo de AR é F876L. Em algumas modalidades, o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração inibe um polipeptídeo de AR do tipo selvagem por antagonismo competitivo. Em
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 29/302
20/167 algumas modalidades, o antagonista de AR de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), e RD162. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata, um câncer de mama, um câncer de bexiga, ou um câncer hepatocelular. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o intervalo de tempo predeterminado é toda semana, todo mês, a cada 2 meses, a cada 3 meses, a cada 4 meses, a cada 5 meses, a cada 6 meses, a cada 7 meses, a cada 8 meses, a cada 9 meses, a cada 10 meses, a cada 11 meses, ou a cada ano.
[0030] Outros objetivos, recursos e vantagens dos polipeptídeos, ácidos nucleicos, compostos, métodos e composições descritas no presente documento se tornará aparente a partir da seguinte descrição detalhada. Deve-se compreender, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indica modalidades específicas, são dados somente a título de ilustração, visto que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da presente revelação se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0031] A Figura 1 ilustra ARN-509 e resistência a enzalutamida. (A) proliferação celular de LNCaP e LNCaP ARN-509r1. As células LNCaP e LNCaP ARN-509r1 foram cultivadas na presença de meio esgotado de hormônio por 2 dias seguido de adição de ligante. A proliferação é quantificada por ensaio de viabilidade baseada em luminescência de CellTiter-Glo® (Promega Corp.) após tratamento de composto com 7 dias. (B) Ensaio de proliferação de agonista de linhagens celulares de LNCaP/AR-Luc, LNCaP/AR-Luc ENZr2 e LNCaP ARN509r2. As células foram cultivadas na presença de meio esgotado de hormônio por 2 dias seguido de tratamento de ligante por 7 dias. A
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 30/302
21/167 proliferação é quantificada pelo ensaio de viabilidade baseado em luminescência de CellTiter-Glo®. (C) ensaio de proliferação de antagonista de parental e linhagens celulares resistentes a antiandrogênio de 2a geração. As células foram cultivadas na presença de meio esgotado de hormônio por 2 dias seguido de tratamento de ligante na presença de R1881 (concentração final = 100 pM). A proliferação é quantificada pelo ensaio de viabilidade baseado em luminescência de CellTiter-Glo. (D) Representação esquemática da estrutura de domínio de AR que mostra aminoácidos que quando mutados exibem atividade de ligante alterada em CRPC.
[0032] A Figura 2 ilustra níveis de AR em linhagens celulares resistentes a antiandrogênio de 2a geração e parental. Os extratos de proteína foram gerados a partir de células cultivadas em meio esgotado de hormônio por 3 dias. Os níveis de proteína de AR foram analisados e por western blot. Os níveis de AR foram quantificados e normalizados para α-tubulina e expressos em relação a células de LNCaP.
[0033] A Figura 3 ilustra ARN-509 e enzalutamida são agonistas parciais de AR F876L. (A) atividade de agonista transcricional e antagonista de ARN-509 e enzalutamida em AR de tipo selvagem ou F876L. ativação transcricional de um repórter de 4X ARE-luciferase foi medida na presença de concentração de composto crescente na ausência ou presença de 1 nM R1881 (para AR de tipo selvagem) ou 5 nM de R1881 (para AR de F876L). (B) atividade de agonista transcricional de prednisona e antiandrogênio de 1a e 2a geração em ativação dependente de AR de tipo selvagem, F876L, T877A, F876L/T877A, L701H, H874Y e W741C de repórter de 4X ARE-Luciferase foi medida em células de HepG2 transfectadas de forma transiente.
[0034] A Figura 4 ilustra VP16-AR (A) e F876L VP16-AR (B) atividade de agonista e antagonista de ARN-509 e enzalutamida. atividade de repórter de 4X ARE-luciferase foi monitorada na presença da conPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 31/302
22/167 centração de composto crescente na ausência ou presença de 90 pM de R1881 (para VP16-AR de tipo selvagem) ou 1 nM de R1881 (para
F876L VP16-AR).
[0035] A Figura 5 ilustra um teste de ligação competitiva de AR de tipo selvagem (A) em função de AR de F876L (B). ligação de 3HR1881 realizada em extratos celulares de PC3 que expressam AR de tipo selvagem ou F876L. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes. Barras de erro, SEM; n=2.
[0036] A Figura 6 ilustra níveis de AR em linhagens celulares que expressam excessivamente AR. Os extratos de proteína foram gerados a partir de células de LNCaP, LNCap/AR(cs), LNCaP/SRaF876L e LNCaP/pCDNAF876L cultivadas em meio esgotado de hormônio por 3 dias. Os níveis de proteína de AR foram analisados e por Western blot. Os níveis de AR foram quantificados e normalizados para actina e expressos em relação a células de LNCaP.
[0037] A Figura 7 ilustra a mutação de AR de F876L que confere atividade de antagonista parcial a ARN-509 e enzalutamida. (A) proliferação de célula de LNCaP/AR(cs) e LNCaP/SRaF876L. As células foram cultivadas na presença de meio esgotado de hormônio por 2 dias seguido de tratamento de ligante por 7 dias. A proliferação é quantificada pelo ensaio de viabilidade baseado em luminescência de CellTiter-Glo. (B) proliferação celular de LNCaP/AR(cs), LNCaP/SRaF876L e LNCaP/pCDNAF876L As células foram cultivadas em meio esgotado de hormônio por 2 dias seguido de tratamento de ligante por 7 dias. Para os ensaios de antagonista, os compostos foram adicionados na presença de 200 pM de R1881 (100 pM de concentração final). A proliferação foi quantificada com o uso do ensaio de CellTiter-Glo® baseado em luminescência.
[0038] A Figura 8 ilustra o ensaio de interação de AR N/C. A interação de N/C induzida por ligante foi monitorada por meio de dois en
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 32/302
23/167 saios híbridos de mamífero em células de HepG2. Os antagonistas foram testados em 8 μM, R1881 em 1 nM.
[0039] A Figura 9 ilustra análise de AR ChIP dos genes alvos de AR. Os ensaios de ChIP foram realizados em células de LNCaP/AR(cs) e LNCaP/SRaF876L incubadas por 3 dias em meio esgotado de hormônio seguido de tratamento de ligante de 4 horas. As células foram tratadas com 10 μΜ de antagonista na presença ou ausência de 1 nM de R1881. Os dados para AR e controle de IgG não específico são apresentados como porcentagem de entrada.
[0040] A Figura 10 ilustra a mutação de AR F876L confere resistência a ARN-509 e enzalutamida in vivo. Xenoenxertos de tumor de LNCaP/AR(cs) e LNCaP/SRaF876L. Camundongos machos castrados que portam tumores foram tratados diariamente com veículo ou 30 mg/kg/dia de composto. Crescimento de tumor para cada grupo é apresentado como o volume de tumor médio ± SEM.
[0041] A Figura 11 ilustra o cronograma de dosagem para segurança de fase 1/2 de etiqueta aberta, farmacocinético, estudo de prova de conceito de ARN-509 em pacientes com câncer de próstata resistente à castração metastático avançado progressivo.
[0042] A Figura 12 ilustra a identificação de AR-F876L em pacientes tratados com ARN-509. (A) resposta de PSA de 29 pacientes analisados quanto à mutação de F876L. A extremidade de terminal de linhagem de resposta de PSA é o tempo no qual o plasma de paciente foi testado quanto à mutação de F876L com o uso da análise de BEAMing. O plasma usado nesse usado foi inicialmente coletado para determinar farmacocinéticos de ARN-509 e com tal as amostras não foram preparadas com o uso de metodologia para maximizar a razão de ctDNA para DNA de linfócito. (B) resposta de PSA de paciente positivo para F876L. Resposta de PSA do paciente 7 no ciclo de tratamento indicado. Plasma circulante foi analisado para o F876L em tempos
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 33/302
24/167 indicados com setas. As amostras de plasma sem mutante detectável são notados como w.t., a presença da mutação de F876L é representada por m. Uma amostra de plasma foi chamada positiva para o mutante se a porcentagem de microesferas mutantes estava acima do valor de corte (0,02%) e as diversas cópias de mutante estimadas como > 0,5 (número de equivalentes de genoma na amostra de plasma x fração de microesfera mutante = > 0,5).
[0043] A Figura 13 ilustra a quantidade relativa de antígeno específico a próstata (PSA) detectado ao longo do curso do estudo clínico de fase 1/2 ARN-509 em cada um dos três pacientes (7, 10, e 13) que portam mutações de F876L somáticas detectáveis em AR. A seta indica a amostra em que a(s) mutação(ões) foram detectadas. DESCRIÇÃO DETALHADA
Terminologia determinada [0044] Exceto onde definido em contrário, todos os termos científicos e técnicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme é compreendido comumente por uma pessoa versada na técnica para a qual a matéria reivindicada pertence. Todos as patentes, pedidos de patente, pedidos publicados e publicações, sequências de GENBANK, sites da web e outros materiais publicados chamados de por toda a presente revelação no presente documento, exceto onde definido em contrário, são incorporados a título de referência em sua totalidade. No evento em que existe uma pluralidade de definições para os termos no presente documento, aquelas nessa seção prevalece. Quando referência é feita a uma URL ou outro identificador ou endereço similar, compreende-se que esses identificadores podem mudar e informações particulares sobre a internet podem surgir e desaparecer, mas informações equivalentes são conhecidas e podem ser acessadas prontamente, como buscando-se a internet e/ou bases de dados adequadas. Referência a isso evidencia a disponibilidade e dissemina
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 34/302
25/167 ção pública dessas informações. De modo geral, os procedimentos para a cultura de célula, infecção de célula, produção de anticorpos e métodos de biologia molecular são métodos comumente usados na técnica. Essas técnicas-padrão podem ser encontradas, por exemplo, em referência manual, como, por exemplo, Sambrook et al. (2000) e Ausubel et al. (1994).
[0045] Conforme usado no presente documento, as formas singulares um, uma, o e a incluem referências no plural a menos que o contexto determine claramente o contrário. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural a menos que declarado especificamente de outro modo. Conforme usado no presente documento, o uso de ou significa e/ou a menos que declarado de outro modo. Ademais, o uso do termo que inclui bem como outras formas (por exemplo, incluem, inclui, e incluído) não é limitador.
[0046] Conforme usado no presente documento, as faixas e quantidades podem ser expressas como cerca de uma faixa ou valor particular. Cerca de também inclui a quantidade exata. Por conseguinte cerca de 5 pg significa cerca de 5 pg e também 5 pg. De modo geral, o termo cerca de inclui uma quantidade que seria esperado estar dentro do erro experimental.
[0047] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo de receptor de androgênio (AR) se refere a qualquer polipeptídeo ou proteína de receptor de androgênio, incluindo, mas não se limitando a, uma proteína produzida de forma recombinante, uma proteína produzida sinteticamente, uma proteína de receptor de androgênio nativa, e uma proteína de receptor de androgênio extraída de células ou tecidos. Um polipeptídeo de AR inclui polipeptídeos relacionados de espécies diferentes que incluem, sem limitação, animais de origem humana ou não humana. Os polipeptídeos de AR de origem não humana incluem, sem limitação, primata não humano (por exemplo chimpanzé e
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 35/302
26/167 macaco), murina (por exemplo, camundongo e rato), canino (cachorro), felino (gato), leporina (coelho), aviário (pássaro), bovino (vaca), ovino (ovelha), porcino (porco), equino (cavalo), piscina (peixe), ranina (sapo) e outro polipeptídeos de AR de mamífero ou não mamífero. Os polipeptídeos de AR exemplificadores incluem, por exemplo, SEQ ID NOS: 1 a 17. Um polipeptídeo de receptor de androgênio inclui o receptor de tipo selvagem de androgênio, isoformas de variante alélica, mutações somáticas incluindo aquelas encontradas em tumores, moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, proteína isolada de células e tecido humano, e formas modificadas do mesmo. Os polipeptídeos de receptor de androgênio fornecidos no presente documento podem ser modificados adicionalmente pela modificação da sequência de aminoácidos primária, por deleção, adição, ou substituição de um ou mais aminoácidos. Um polipeptídeo de receptor de androgênio inclui qualquer polipeptídeo de AR ou uma porção do mesmo que tem atividade de AR, incluindo, por exemplo, polipeptídeos de fusão de um domínio de ligação de ligante de AR a um domínio de ligação de DNA heterólogo.
[0048] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo de receptor de androgênio (AR) mutante, uma proteína de AR mutante, um polipeptídeo de AR modificado, ou uma proteína de AR modificado ou são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um polipeptídeo de receptor de androgênio que é modificado em uma ou mais posições de aminoácido. As modificações exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, substituições, deleções ou adições de aminoácidos.
[0049] Conforme usado no presente documento, o termo antiandrogênio se refere a um grupo de compostos antagonistas do receptor de hormônio que têm capacidade de evitar ou inibir os efeitos biológicos dos androgênios sobre tecidos normalmente responsivos no corPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 36/302
27/167 po.
[0050] Conforme usado no presente documento, o termo inibidor de AR ou antagonista de AR são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um agente que inibe ou reduz ao menos uma atividade de um polipeptídeo de AR. As atividades de AR exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, ligação de coativador, ligação de DNA, ligação de ligante, ou translocação nuclear.
[0051] Conforme usado no presente documento, um antagonista completo se refere a um antagonista que, em uma concentração eficaz, inibe de forma essencialmente completa uma atividade de um polipeptídeo de AR. Conforme usado no presente documento, um antagonista parcial se refere a um antagonista que tem a capacidade de inibir parcialmente uma atividade de um polipeptídeo de AR, mas que, até mesmo em uma maior concentração não é um antagonista completo. A expressão 'de forma essencialmente completa' significa ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 96%, ao menos cerca de 97%, ao menos cerca de 98% ao menos cerca de 99%, ou maior inibição da atividade de um polipeptídeo de AR.
[0052] Conforme usado no presente documento, o termo inibidor de AR de terceira geração ou antagonista de AR de terceira geração são usados de forma intercambiável no presente documento e se refere a um agente que inibe ao menos uma atividade de um polipeptídeo de AR que contém uma ou mais modificações de aminoácido que confere resistência a inibição por um antagonista de AR de segunda geração, como, por exemplo, ARN-509 (CAS n°956104-40-8), enzalutamida (também conhecido como MDV3100; CAS No: 915087-33-1), ou RD162 (CAS n° 915087-27-3). Em algumas modalidades, um inibidor de AR de terceira geração inibe ao menos uma atividade de um polipeptídeo de AR do tipo selvagem, como, mas não limitado a, ligação
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 37/302
28/167 de coativador, ligação de DNA, ligação de ligante, ou translocação nuclear. Em algumas modalidades, um inibidor de AR de terceira geração inibe uma atividade de um polipeptídeo de AR mutante que também é inibido por um inibidor de AR de primeira ou de segunda geração.
[0053] Conforme usado no presente documento, a frase resistente a inibição se refere a uma diminuição na capacidade de um antagonista de AR de inibir (isto é, antagonizar) uma ou mais atividades de um polipeptídeo de AR modificado em comparação a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem. Por exemplo, o antagonista de AR é menos eficaz na inibição de um polipeptídeo de AR modificado em comparação a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a atividade antagonística reduzida em relação a um polipeptídeo de AR modificado é cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% em comparação à atividade antagonística em relação a um polipeptídeo de AR do tipo selvagem. As atividades de AR exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, ligação de coativador, ligação de DNA, ligação de ligante, ou translocação nuclear. Em algumas modalidades, o antagonista de AR não tem a capacidade de se ligar a ou ligar com afinidade reduzida a um polipeptídeo de AR modificado.
[0054] Conforme usado no presente documento, o termo inibidor de AR de segunda geração ou antagonista de AR de segunda geração são usados de forma intercambiável no presente documento e se refere a um agente que exibe atividade de antagonista completa de um polipeptídeo de AR do tipo selvagem, mas não exibe atividade de antagonista completa de um polipeptídeo de AR que contém uma ou mais modificações de aminoácido que confere resistência à inibição, como uma modificação na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo de AR. Em algumas modalidades, o inibidor de AR de segunda gera
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 38/302
29/167 ção não exibe atividade de antagonista completa em um polipeptídeo de AR que tem uma substituição de aminoácido que é F876L. Em algumas modalidades, o inibidor de AR de segunda geração induz atividade de AR (isto é, é um agonista de AR) nas concentrações que são equivalentes ou superiores à concentração requerida para inibir um AR de tipo selvagem. Os inibidores de AR de segunda geração diferem dos inibidores de AR de primeira geração, como bicalutamida e flutamida, em que os inibidores de AR de segunda geração agem como antagonistas completos em células que expressam níveis elevados de AR, como, por exemplo, em cânceres de próstata resistentes a castração (CRPC). Inibidores de AR de primeira geração, como bicalutamida e flutamida, agem como agonistas em CRPC. Os inibidores de AR de segunda geração exemplificadores incluem ARN-509, enzalutamida e RD162. Em algumas modalidades, um inibidor de AR de segunda geração é um agonista de um polipeptídeo de AR mutante fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, um inibidor de AR de segunda geração se liga a um polipeptídeo de AR no ou próximo ao local de ligação de ligante do polipeptídeo de AR.
[0055] O termo ácido nucleico se refere a deoxiribonucleotídeos, deoxiribonucleosídeos, ribonucleosídeos, ou ribonucleotídeos e polímeros do mesmo na forma de filamento duplo ou único. A menos que limitado especificamente, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes como o ácido nucleico de referência e são metabilizados de uma forma semelhante a nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que limitado especificamente de outro modo, o termo também se refere a análogos de oligonucleotídeo que incluem PNA (peptidoácido nucleico), análogos de DNA usados na tecnologia antissenso (por exemplo, fosforotioatos, fosforoamidatos). Exceto onde indicado em contrário, uma sequência de ácidos nucleicos particular
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 39/302
30/167 também abrange implicitamente variantes conservativamente modificados dos mesmos (incluindo, mas não se limitando a, substituições de códon degenerado) e sequências complementares bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado são alcançadas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por base mista e/ou resíduos de deoxiinosina (Batzer et al. (1991)ácido nucleico Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605 a 2608; e Cassol et al. (1992) Mol. célula. Probes 6, 327 a 331; e Rossolini et al. (1994) Mol. célula. Probes 8:91 a 98).
[0056] O termo aminoácido se refere a aminoácidos de ocorrência natural e de ocorrência não natural, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma forma semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos codificados naturalmente são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina) e pirolisina e selenocisteina. Os análogos de aminoácido se referem a agentes que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um α carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, como, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos têm grupos R modificados (como, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificadas, mas retém a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural.
[0057] Os aminoácidos são chamados no presente documento por seus símbolos de três letras conhecidos comumente ou pelos símbolos de uma letra pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, são chamados por
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 40/302
31/167 seus códigos de única letra aceitos comumente.
[0058] Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados de forma intercambiável no presente documento para referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido de ocorrência natural bem como polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido de ocorrência não natural, por exemplo, um análogo de aminoácido. Os termos abrangem cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento completo, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações peptídicas covalentes.
[0059] Conforme usado no presente documento, modificação se refere a uma modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico e inclui deleções, inserções, e substituições de aminoácidos e nucleotídeos, respectivamente.
[0060] Para determinar a porcentagem de homologia de duas sequências de aminoácidos de dois ácidos nucleicos, as sequências podem ser alinhadas para propósitos de comparação ideais (por exemplo, vãos são introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para o alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido correspondentes ou posições de nucleotídeo podem então ser comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo menos resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A porcentagem de homologia entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = # de posições idênticas/# total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em algumas
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 41/302
32/167 modalidades as duas sequências têm o mesmo comprimento.
[0061] Para determinar a porcentagem de homologia entre duas sequências, o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 a 2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 a 5877 é usado. Esse algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410. As buscas de nucleotídeo BLAST são realizadas com o programa NBLAST, pontuação=100, comprimento de palavra=12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácido nucleico descritas ou reveladas no presente documento. As buscas de proteína BLAST são realizadas com o programa XBLAST, pontuação=50, comprimento de palavra=3. Para obter alinhamentos com vãos para propósitos de comparação, Gapped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389 a 3402. Quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) são usados. Visite o site da web do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia para detalhes adicionais (sobre o World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov). As proteínas adequadas para uso nos métodos descritos no presente documento também incluem proteínas que têm entre 1 a 15 mudanças de aminoácido, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 substituições de aminoácido, deleções, ou adições, em comparação à sequência de aminoácidos de qualquer proteína descrita no presente documento. Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos alterada é ao menos 75% idêntica, por exemplo, 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer proteína descrita no presente documento. Essas proteínas de variantes de sequência são adequadas para os métodos descritos no presente
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 42/302
33/167 documento desde que a sequência de aminoácidos alterada retenha atividade biológica suficiente para ser funcional nas composições e métodos descritos no presente documento. Quando as substituições de aminoácido são feitas, as substituições deveriam ser substituições de aminoácido conservativas. Dentre os aminoácidos comuns, por exemplo, uma substituição de aminoácido conservativa é ilustrada por uma substituição dentre aminoácidos dentro de cada um dos seguintes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, e triptofano, (3) serina e treonina, (4) aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina, e (6) lisina, arginina e histidina. Aquelas pessoas versadas na técnica reconhecem que, em general, substituições de aminoácido únicas em regiões não essenciais de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (consulte, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., página 224). A tabela de BLOSUM62 é uma matriz de substituição de aminoácido derivada de cerca de 2.000 alinhamentos locais múltiplos de segmentos de sequência de proteínas, representando regiões altamente conservadas de mais do que 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 a 10919). Consequentemente, as frequências de substituição de BLOSUM62 são usadas para definir substituições de aminoácido conservativas que, em algumas modalidades, são introduzidas nas sequências de aminoácidos descritas ou reveladas no presente documento. Embora seja possível projeta as substituições de aminoácido com base somente nas propriedades químicas (conforme discutido acima), a linguagem substituição de aminoácido conservativa se refere de preferência a uma substituição representada por um valor de BLOSUM62 maior do que -1. Por exemplo, uma substituição de aminoácido é conservativa se a substituição for caracterizada por um valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2, ou 3. De
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 43/302
34/167 acordo com esse sistema, substituições de aminoácido conservativas preferenciais são caracterizadas por um valor de BLOSUM62 de ao menos 1 (por exemplo, 1, 2 ou 3), enquanto substituições de aminoácido conservativas mais preferenciais são caracterizadas por um valor de BLOSUM62 de ao menos 2 (por exemplo, 2 ou 3).
[0062] Conforme usado no presente documento, resíduos correspondentes se referem a resíduos que ocorrem em loci alinhados. Polipeptídeos relacionados ou variantes são alinhados por qualquer método conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses métodos tipicamente maximizam correspondências, e incluem métodos como o uso de alinhamentos manuais e com o uso dos numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos por aqueles versados na técnica. Alinhando-se as sequências de polipeptídeos, o versado na técnica pode identificar resíduos correspondentes, com o uso de resíduos de aminoácido conservados ou idênticos como guias. As posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, com o uso de alinhamentos simulados em computador da estrutura de proteína. Em outros casos, as regiões correspondentes podem ser identificadas.
[0063] Conforme usado no presente documento, uma variante alélica ou variação alélica se refere a um polipeptídeo codificado por um gene que difere de uma forma de referência de um gene (isto é, é codificado por um alelo). Tipicamente a forma de referência do gene codifica uma forma de tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo de uma população ou único membro de referência de uma espécie. Tipicamente, as variantes alélicas, que incluem variantes entre e dentre espécies, têm ao menos 80%, 90% ou mais de identidade de aminoácido com um tipo selvagem e/ou forma predominante da mesma espécie; O grau de identidade depende do gene e de se a comparação é interespécies ou intraespécies. De modo geral, as vari
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 44/302
35/167 antes alélicas intraespécies têm ao menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou mais com um tipo selvagem e/ou forma predominante, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com um tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo.
[0064] Conforme usado no presente documento, as variantes de espécie se referem a variantes do mesmo polipeptídeo entre e dentre espécies. De modo geral, as variantes interespécies têm ao menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade ou mais com um tipo selvagem e/ou forma predominante de outra espécie, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com um tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo.
[0065] Conforme usado no presente documento, os termos tratar, tratando ou tratamento, e outros equivalentes gramáticos, incluem aliviar, minorar ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença ou condição, atenuar, evitar ou reduzir o surgimento, gravidade ou frequência de um ou mais sintomas adicionais de uma doença ou condição, atenuar ou evitar as causas metabólicas subjacentes de um ou mais sintomas de uma doença ou condição, inibir a doença ou condição, como, por exemplo, interromper o desenvolvimento da doença ou condição, aliviar a doença ou condição, causar regressão da doença ou condição, aliviar uma condição causada pela doença ou condição, ou inibir os sintomas da doença ou condição profilaticamente e/ou terapeuticamente. Em um exemplo não limitador, para o benefício profilático, um composto de inibidor de AR de terceira geração revelado no presente documento é administrado a um indivíduo e risco de desenvolver um distúrbio particular, predisposto a desenvolver um distúrbio particular, ou a um indivíduo que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de um distúrbio. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração revelado no presente documento é administrado a um indivíduo após o tratamento com um ou mais agen
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 45/302
36/167 tes terapêuticos. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração revelado no presente documento é administrado a um indivíduo em combinação com o tratamento com um ou mais agentes terapêuticos.
[0066] Conforme usado no presente documento, a prevenção ou profilaxia se refere à redução no risco de desenvolver uma doença ou condição.
[0067] Os termos quantidade eficaz, quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade farmaceuticamente eficaz, conforme usados no presente documento, se referem a uma quantidade de um composto de inibidor de AR que é suficiente para tratar um distúrbio. Em algumas modalidades, o resultado é uma redução e/ou atenuação dos sinais, sintomas, ou causas de um distúrbio, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por exemplo, um quantidade eficaz para usos terapêuticos é a quantidade da composição que compreende um composto de inibidor de AR revelado no presente documento requerido para fornecer uma diminuição clinicamente significativa em um distúrbio. Uma quantidade eficaz adequada em qualquer caso individual é determinada com o uso de qualquer técnica adequada, (por exemplo, um estudo de intensificação de dose).
[0068] O termo farmaceuticamente aceitável conforme usado no presente documento, se refere a um material, (por exemplo, um carreador ou diluente), que não anula a atividade biológica ou propriedades de um composto de inibidor de AR descrito no presente documento, e é relativamente não tóxico (isto é, o material é administrada a um individual sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma forma prejudicial com qualquer um dos componentes da composição em que está contido).
[0069] Conforme usado no presente documento, um controle se refere a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 46/302
37/167 teste, exceto que não é tratada com um parâmetro de teste, ou, se for uma amostra de plasma, pode ser de um voluntário normal não afetado com a condição de interesse. Um controle também pode ser um controle interno.
[0070] Conforme usado no presente documento, os termos indivíduo, sujeito e paciente são usados de forma intercambiável. Nenhum dos termos devem ser interpretados como requerendo a supervisão de um profissional médico (por exemplo, um doutor, enfermeira, assistente do médico, trabalhador de hospício regulado). Conforme usado no presente documento, o indivíduo pode ser qualquer animal, incluindo mamíferos (por exemplo, um ser humano ou animal não humano) e não mamíferos. Em uma modalidade dos métodos e composições fornecidas no presente documento, o mamífero é um ser humano.
[0071] Conforme usado no presente documento, colocar em contato se refere ao ato de tocar, fazer contato, ou de colocar substâncias em proximidade imediata. Contato pode ser alcançado misturando-se os componentes em um fluido ou mistura de semifluido.
Perspectiva geral função de ar e resistência a fármacos em câncer [0072] O receptor de androgênio (AR) é um membro da superfamília de esteroide e receptor nuclear. Dentre essa grande família de proteínas, somente cinco receptores de esteroide vertebrado são conhecidos e incluem o receptor de androgênio, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de glicocorticoide, e receptor mineralocorticoide. AR é um proteína solúvel que funciona como um fator de transcrição intracelular. A função de AR é regulada pela ligação de androgênios, que inicia as mudanças conformacionais sequenciais do receptor que afetam as interações de receptor-proteína e interações de receptor-DNA.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 47/302
38/167 [0073] AR é principalmente expresso em tecidos alvo de androgênio, como a próstata, músculo esquelético, fígado, e sistema nervoso central (CNS), com o maior nível de expressão observado na próstata, glândula adrenal, e epidídimo. AR em determinado casos é ativado pela ligação de androgênios endógenos, incluindo testosterona e 5adi-hidrotestosterona (5a-DHT).
[0074] AR é um receptor nuclear de 110 kD que, mediante ativação por androgênios, media a transcrição de genes alvo que modulam o crescimento e diferenciação das células epiteliais de próstata. AR é codificado pelo gene de AR localizado no cromossomo X em Xq11-12. O gene de AR compreende 8 exões que codificam o receptor de androgênio de comprimento completo. Semelhante aos outros receptores de esteroide, o AR não ligado está localizado principalmente no citoplasma e associado a um complexo de proteínas de choque térmico (HSPs) através de interações com o domínio de ligação de ligante. Mediante a ligação de agonista, o AR passa por uma série de mudanças conformacionais: As proteínas de choque térmico se dissociam de AR, e o AR transformado passa por dimerização, fosforilação, e translocação para o núcleo, que é mediado pelo sinal de localização nuclear. O receptor translocado então se liga ao elemento de resposta a androgênio (ARE), que é caracterizado pelas duas sequências de consenso de meio local de seis nucleotídeos hexaméricas 5-TGTTCT-3' dispostas como repetições invertidas separadas por três nucleotídeos aleatórios e está localizada no promotor ou região acentuadora de alvos de gene de AR. O recrutamento de outros correguladores de transcrição (incluindo coativadores e correpressores) e maquinário transcricional assegura adicionalmente a modulação adequado de expressão de gene regulada por AR. Esses processos são iniciados pelas mudanças conformacionais no domínio de ligação de ligante.
[0075] A sinalização de AR é crucial para o desenvolvimento e
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 48/302
39/167 manutenção de órgãos reprodutores masculinos incluindo as glândula de próstata, já que machos genéticos abrigam a perda de função as mutações de AR e camundongos manipulados com defeitos de AR não desenvolvem próstatas. Essa dependência das células de próstata na sinalização de AR continua mesmo mediante a transformação neoplástica. A depleção de androgênio (por exemplo com o uso agonistas de hormônio de ligação de gonadotropina (GnRH)) continua a ser o pilar do câncer de próstata tratamento. Entretanto, a depleção de androgênio é geralmente eficaz por uma duração limitada e o câncer de próstata evolui para recuperar a capacidade de crescer independentemente dos níveis baixos de androgênios circulantes.
[0076] O câncer de próstata é o câncer mais prevalente em homens. O câncer de próstata representa aproximadamente 29 por cento de todos os novos casos de câncer diagnosticados e 10 por cento de mortes de câncer em homens. Além disso, os homens norteamericanos ao longo de sua via têm uma chance aproximada de 17 por cento de desenvolver câncer de próstata invasivo. No diagnóstico inicial, uma grande porcentagem de cânceres de próstata têm risco baixo a médio, significando que o risco de mortalidade de 10 anos é relativamente baixo (até 24%) com pouca intervenção. Entretanto, cânceres de próstata metastáticos e avançados têm sobrevivência média de 2,5 a 3 anos e são sujeitos a tratamento agressivo incluindo cirurgia e terapia de castração química.
[0077] Dado que a maioria das células de câncer de próstata dependem de AR para sua proliferação e sobrevivência, o tratamento geralmente consiste na administração de agentes que bloqueiam a produção de testosterona (por exemplo, agonistas de GnRH), sozinhos ou em combinação com antiandrogênios (por exemplo bicalutamida), que antagoniza o efeito de qualquer testosterona residual. Infelizmente, embora com frequência inicialmente bem-sucedida como evidenci
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 49/302
40/167 ado por uma queda no antígeno específico a próstata (PSA) e regressão do tumor visível se presente, os tumores metastáticos inevitavelmente se tornam resistentes a terapia hormonal, estágio no qual nenhum tratamento curativo existe.
[0078] Os cânceres de próstata resistentes a terapias hormonais são atualmente chamados de 'resistente à castração', implicando que eles progrediram além do ponto no qual fármacos alvejando qualquer ponto no eixo geométrico de androgênio teria qualquer utilidade clínica. A evidência pré-clínica e clínica indica que o AR é um alvo terapêutico viável mesmo nos cânceres resistentes a castração. Relatou-se que as mutações AR ocorrem em até 33 por cento dos casos de câncer de próstata e são mais comumente observados após o tratamento no estado resistente à castração dependente de AR. Observou-se que as mutações que alteram a especificidade e potência de ligante e que resulta na atividade de receptor independente de ligante. As mutações específicas variam amplamente mas parecem ser dependentes do regime de tratamento. Adicionalmente, a suprarregulação do próprio AR foi associada à progressão para o estado resistente à castração em ambos os pacientes e modelos de animal.
[0079] Dois agentes, acetato de abiraterona (Zytiga; CAS n° 154229-19-3) e MDV3100 (enzalutamida; CAS n° 915087-33-7) têm sido empregados recentemente em teste clínico de estágio final para o tratamento de homens com câncer de próstata resistente à castração (CRPC). O acetato de abiraterona tem como alvo a 7-αhidroxilase/17,20-liase (CYP17A), desse modo, inibindo a biossíntese de androgênio residual. O MDV3100 é um antiandrogênio descoberto em uma triagem por antiandrogênios potentes que não têm atividade agonista no contexto de superexpressão de AR. As eficácias clínicas de MDV3100 e acetato de abiraterona sustentam a hipótese de que AR continua a promover crescimento e sobrevivência de câncer de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 50/302
41/167 próstata resistente à castração. Infelizmente, similar às terapias por ablação de androgênio de primeira geração, um tratamento prolongado com acetato de abiraterona ou antagonistas de AR de segunda geração resulta, por fim, em resistência.
[0080] A resistência ao acetato de abiraterona e ao MDV3100 foi observada em ambos os modelos de câncer de próstata e em pacientes. Dados preliminares sugerem que, similar ao câncer de próstata resistente à castração, a resistência ao antiandrogênio de segunda geração se desenvolve através de múltiplos mecanismos e pensa-se que o AR permanece sendo um alvo terapêutico nesse ambiente. Tanto em modelos de xenoenxerto quanto em pacientes, a suprarregulação de CYP17A e a presença de níveis em picograma de androgênios foi observada em populações resistentes. A suprarregulação de CYP17A supostamente promove resistência através da ativação de AR por síntese de androgênio intratumoral. Em outros casos, a resistência se correlaciona a níveis de AR elevados, assim como localização nuclear. Adicionalmente, numerosas vias de sinalização celulares conhecidas por ativar AR na ausência de ligantes endógenos podem promover resistência à terapia de segunda geração. A observação de que tumores com altos teores de Src ativado respondem de forma ruim ao MDV3100 e ao tratamento por acetato de abiraterona sustenta essa hipótese. Até a presente data, nenhuma mutação de AR foi descrita que confere resistência a MDV3100, a ARN-509 ou a abiraterona.
[0081] O ARN-509 é um composto de tioidantoina sintético descoberto com o uso de química médica guiada por relacionamento de estrutura-atividade (SAR) para identificar antiandrogênios não esteroidais que retêm atividade antagonista completa no ambiente de expressão de AR elevada. O ARN-509 exibe atividade antitumoral em modelos de xenoenxerto sensíveis e resistentes à castração de câncer de próstata e efeitos antiandrogênicos em cães que castração fenocópia.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 51/302
42/167
Identificação de linhagens celulares resistentes ao inibidor de AR e um polipeptídeo de AR mutante [0082] São aqui descritos exemplos de trabalho que demonstram a produção de linhagens celulares resistentes a fármaco. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são empregados para a geração de uma linhagem celular que é resistente à inibição por um antagonista de AR de segunda geração como, mas não se limitando a, ARN509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são empregados para a geração de uma linhagem celular que é resistente à inibição por um antagonista de AR que inibe a produção de androgênio e exibe ligação a um receptor de AR. Em algumas modalidades, a antagonista de AR que inibe produção de androgênio é um inibidor de CYP17A e exibe ligação a AR. Em algumas modalidades, a antagonista de AR que inibe produção de androgênio e exibe ligação de AR é galeterona (TOK001) ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o antagonista de AR que inibe produção de androgênio e exibe ligação de AR é TAK-700.
[0083] Conforme descrito aqui, linhagens celulares resistentes foram geradas in vivo em um xenoenxerto de célula de câncer de próstata resistente à castração (CRPC) e linhagens celulares de câncer de próstata responsivo a androgênio in vitro mediante a exposição a concentrações crescentes dos fármacos de antiandrogênio ARN-509 ou MDV3100. Em ensaios de proliferação celular e transcricionais, sendo que as linhagens celulares são segregadas em duas classes distintas.
[0084] As linhagens celulares de classe 1 expressaram um nível maior de AR em comparação com as linhagens celulares parentais das mesmas e proliferadas na ausência de androgênios adicionados. O crescimento independente de ligante das células de classe 1 foi inalterado na presença de ARN-509, MDV3100 ou bicalutamida. O androgênio sintético R1881 inibiu a proliferação nas células de classe 1 e é
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 52/302
43/167 antagonizado ou por MDV3100 ou por ARN-509 indicando que AR nessas linhagens celulares ainda se liga a MDV3100 e a ARN-509. [0085] Linhagens celulares resistentes classe 2 permaneceram dependentes de androgênio para crescimento similar às linhagens celulares parentais das mesmas. Embora ARN-509 e MDV3100 inibam a proliferação da linhagem celular parental, ambos os compostos exibiram atividade agonista e estimularam uma proliferação das linhagens celulares classe 2. Análise do ácido nucleico que codifica AR nas linhagens celulares classe 2 revelou que as linhagens celulares expressaram um AR mutante com uma mutação na domínio de ligação de ligante. A mutação era uma mutação com troca de sentido de timidina (T) para citosina (C) que resultou em uma substituição de aminoácido de fenilalanina na posição 876 do AR do tipo selvagem para leucina (F876L).
[0086] Conforme descrito aqui, nos exemplos, mutações no gene de AR foram identificadas nas amostras de plasma de pacientes com câncer de próstata sendo submetidos a estudos clínicos de Fase 1/2 de ARN-509. As mutações identificadas incluem uma mutação com troca de sentido de timidina (T) para citosina (C) na posição 2988 (primeira posição do códon que codifica fenilanina que é codificada no exon 8 do gene de AR) e uma mutação com troca de sentido de citosina (C) para alanina (A) na posição 2990 (terceira posição do códon que codifica fenilalanina) em uma substituição de aminoácido de fenilalanina na posição 876 do AR do tipo selvagem por leucina (F876L). Os pacientes identificados como tendo essas mutações também exibiram níveis maiores de antígeno específico de próstata (PSA) ao longo do estudo que indicam resistência crescente ao tratamento.
[0087] São aqui descritos polipeptídeos AR mutantes que contêm uma substituição de aminoácido de fenilalanina na posição 876 do AR do tipo selvagem por leucina (F876L) e ácidos nucleicos que codificam
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 53/302
44/167 os polipeptídeos. Também são aqui descritos métodos de produção dos ácidos nucleicos de AR mutante e polipeptídeos aqui descritos. Também são aqui descritas composições, combinações e kits contendo os ácidos nucleicos de AR mutante e polipeptídeos aqui descritos. Também são fornecidos métodos de uso dos polipeptídeos AR mutantes para identificar moléculas que interagem com AR mutante incluindo inibidores de androgênio incluindo compostos de inibidor de AR de terceira geração. Também são fornecidas composições contendo as moléculas que interagem com AR mutante incluindo composições farmacêuticas das mesmas. Também são fornecidos métodos de tratamento com o uso das moléculas identificadas que interagem com AR mutante. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que são ácidos nucleicos sintéticos. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que são moléculas de cDNA. Também são aqui descritos polipeptídeos AR mutantes produzidos por ácidos nucleicos de AR mutante que são ácidos nucleicos sintéticos. Também são aqui descritos polipeptídeos AR mutantes produzidos por ácidos nucleicos de AR mutante que são moléculas de cDNA. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que não contêm DNA genômico de AR. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que são não metilados. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que não contêm sequências de intron de AR. Também são aqui descritos ácidos nucleicos de AR mutante que compreendem uma sequência de nucleotídeos de dois ou mais exons da sequência genômica de AR. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam fenilalanina em uma posição que corresponde à posição 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem.
[0088] Conforme descrito aqui, a identificação de uma mutação na posição 876 no AR como, por exemplo, F876L, permite o projeto e tri
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 54/302
45/167 agem de inibidores eficazes para inibição de um AR mutante que tem uma ou mais mutações de resistência. Tais inibidores são úteis em aplicações clínicas e terapêuticas. Em algumas modalidades, os inibidores são úteis para o tratamento de um câncer como, por exemplo, um câncer mediado por AR como, por exemplo, um câncer de próstata, câncer de mama, câncer de fígado (isto é, hepatocelular) ou câncer de bexiga como, por exemplo, um câncer de próstata, mama, fígado (isto é, hepatocelular) ou de bexiga resistente a fármaco.
[0089] Conforme descrito aqui, em algumas modalidades, os indivíduos são triados para a identificação de uma mutação na posição 876 no AR como, por exemplo, F876L. Em algumas modalidades, a identificação de tal mutação permite a prescrição de um tratamento de câncer ou modificação de um tratamento de câncer. Em algumas modalidades, a identificação de tal mutação é usada para estratificar indivíduos para uma terapia em particular como, por exemplo, terapia com um inibidor que inibe a atividade do AR mutante (isto é, um inibidor de AR de terceira geração). Em algumas modalidades, a identificação de tal mutação é usada para caracterizar um indivíduo como tendo um alto risco de recidiva de uma doença ou afecção como, por exemplo, um câncer de próstata, um câncer de mama, um câncer de fígado (isto é, hepatocelular) ou um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, a identificação de tal mutação é usada para caracterizar um indivíduo como sem capacidade de resposta para um inibidor de AR em particular como, por exemplo, ARN-509, MDV3100 ou RD162. Em algumas modalidades, a identificação de tal mutação é usada para caracterizar um indivíduo como sem capacidade de resposta para um inibidor de AR que é um inibidor de CYP17A como, por exemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona.
Polipeptídeos AR mutantes [0090] São aqui fornecidos polipeptídeos AR mutantes. Em algu
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 55/302
46/167 mas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes isolados são polipeptídeos AR mutantes isolados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes isolados são polipeptídeos AR mutantes não nativos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes isolados são polipeptídeos AR mutantes recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos exibem atividade de receptor de androgênio. Por exemplo, os polipeptídeos AR mutantes se ligam a elementos de resposta de androgênio e promovem a expressão de genes responsivos ao AR. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes contêm uma ou mais substituições de aminoácidos que conferem resistência a antagonismo total por um antiandrogênio. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes contêm uma ou mais substituições de aminoácidos que conferem resistência a um antagonismo total por um inibidor de AR de segunda geração como, mas não se limitando a, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes contêm uma ou mais substituições de aminoácidos que conferem resistência à inibição por ARN-509. Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes contêm uma ou mais substituições de aminoácidos que conferem resistência à inibição por enzalutamida (MDV3100). Em algumas modalidades, os polipeptídeos AR mutantes contêm uma ou mais substituições de aminoácidos que conferem resistência à inibição por RD162.
[0091] Em algumas modalidades, um tratamento de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido com um inibidor de AR de segunda geração induz atividade de AR. Por exemplo, o inibidor de AR de segunda geração atua como um agonista do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, um tratamento de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido com ARN-509 induz atividade de AR. Em algumas modalidades, um tratamento de um polipeptídeo AR mutante aqui fornePetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 56/302
47/167 cido com enzalutamida (MDV3100) induz atividade de AR. Em algumas modalidades, um tratamento de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido com RD162 induz atividade de AR.
[0092] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação em uma posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 (n° de acesso P10275) ou uma posição correspondente no polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 2 (n° de acesso NP_000035.2). Em algumas modal idades, a modificação é uma substituição do aminoácido fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo receptor de androgênio (AR) mutante não compreende fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1.
[0093] Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição do aminoácido fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 e o aminoácido substituído é selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo receptor de androgênio (AR) mutante compreende uma leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição do aminoácido fenilalaniPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 57/302
48/167 na na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 e o aminoácido substituído é selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina e triptofano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo receptor de androgênio (AR) mutante compreende uma leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina ou triptofano na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição do aminoácido fenilalanina por leucina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1.
[0094] Em algumas modalidades, a modificação compreende uma deleção do aminoácido fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1.
[0095] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende um polipeptídeo que tem uma leucina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 e que tem 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de uma identidade de sequência de aminoácido para o polipeptídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende um polipeptídeo que não tem uma fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 e que tem 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 58/302
49/167 identidade de sequência de aminoácido para o polipeptídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5.
[0096] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 e uma modificação em uma ou mais posições de aminoácido adicionais. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 e uma modificação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais posições de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação em uma posição de aminoácido adicional. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição de aminoácido 876 e uma modificação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais posições de aminoácido adicionais. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma modificação em uma posição de aminoácido adicional. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 876 é uma substituição que é F876L.
[0097] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação em uma posição de aminoácido adicional que confere resistência a um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração ou um antagonista de AR que inibe produção de androgênio. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido em adição à modificação no aminoácido 876 aumenta a resistência do polipeptídeo AR a um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração ou a um antagonista de AR que inibe produção de androgênio se comparado com um polipeptídeo AR que compreende a modificação na posição de aminoácido 876 sozinha. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 876 é uma substituição que é F876L.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 59/302
50/167 [0098] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação selecionada dentre modificações de AR descritas em, por exemplo, Grasso et al. (2012) Nature 487(7406):239 a 243; Ning et al. (2012) Urology 80(1):216 a 218; Cong et al. (2012) Gene 500(2):220 a 223; Hay et al. (2012) PLoS One 2012;7(3):e32514; Koochekpour (2010) Asian J Androl. 12(5):639 a 657; Waltering et al. (2012) Mol Cell Endocrinol. 360:38 a 43; Robbins (2012) Mol Cell Endocrinol. 352(1-2):26 a 33; ou Gottlieb et al. (2012) Hum Mutat. 33(5):887 a 894. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 876 é uma substituição que é F876L.
[0099] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação selecionada dentre modificações de AR associadas a câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, a modificação associada ao câncer de próstata resistente à castração é uma substituição de aminoácido como, por exemplo, T877A, W741C, W741L, W741R, L701H ou H874Y. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 876 é uma substituição que é F876L.
[00100] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 e uma modificação na posição de aminoácido 877. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 877. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 877 é uma substituição do aminoácido treonina. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 877 é selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modali
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 60/302
51/167 dades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 877 é alanina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma alanina na posição de aminoácido 877. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma alanina na posição de aminoácido 877.
[00101] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 741 é uma substituição do aminoácido triptofano. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 741 é selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 741 é leucina, cisteina ou arginina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma leucina na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma cisteina na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma arginina na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma leucina na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma cisteina na posição de aminoácido 741. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 61/302
52/167 arginina na posição de aminoácido 741.
[00102] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 701. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 701. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 701 é uma substituição do aminoácido leucina. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 701 é selecionado dentre isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, histidina, serina, treonina, cisteina, lisina, arginina, triptofano, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 701 é histidina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma histidina na posição de aminoácido 701. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma histidina na posição de aminoácido 701.
[00103] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 874. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma modificação na posição de aminoácido 874. Em algumas modalidades, a modificação na posição de aminoácido 874 é uma substituição do aminoácido histidina. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 874 é selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, lisina, arginina, triptofano, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modalidades, o aminoácido substituído na posição de aminoácido 874 é tirosina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modifica
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 62/302
53/167 ção na posição 876 e uma tirosina na posição de aminoácido 874. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma leucina na posição 876 e uma tirosina na posição de aminoácido 874. [00104] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante é uma variante de polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição 876 e uma ou mais posições de aminoácido adicionais em relação ao polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Variantes exemplificantes incluem, por exemplo, variantes de espécie, variantes alélicas, variantes de emenda de RNA e variantes que contêm mutações de aminoácido conservativas e não conservativas. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglutamina de cerca de 6 resíduos de glutamina consecutivos a cerca de 39 resíduos de glutamina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglutamina de cerca de 16 resíduos de glutamina consecutivos a cerca de 29 resíduos de glutamina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglutamina de cerca de 21 resíduos de glutamina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglutamina de cerca de 22 resíduos de glutamina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglutamina de cerca de 23 resíduos de glutamina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglicina de cerca de 10 resíduos de glicina consecutivos a cerca de 27 resíduos de glicina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglicina de cerca de 23 resíduos de glicina consecutivos. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo AR compreende um trato de poliglicina de cerca de 24 resíduos de glicina consecutivos. [00105] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante com
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 63/302
54/167 preende uma porção do polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a porção exibe uma atividade de um polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende o domínio de ligação de DNA de um polipeptídeo AR e o domínio de ligação de ligante do polipeptídeo AR que compreende a modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante consiste essencialmente no domínio de ligação de DNA de um polipeptídeo AR e no domínio de ligação de ligante do polipeptídeo AR que compreende a modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende a sequência de aminoácidos de cerca da posição de aminoácido 554 a cerca da posição de aminoácido 919 do polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende o domínio de ligação de ligante do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante consiste essencialmente do domínio de ligação de ligante do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende a sequência de aminoácidos de cerca da posição de aminoácido 554 a cerca de posição de aminoácido 919.
[00106] Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende a modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligada a um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de aminoácido que é F876L. Métodos para a geração de proteínas de fusão são conhecidos no ARt e incluem técnicas de DNA recombinante padrões. Por exemplo, em algumas modalidades, fragmentos de DNA que codificam as diferentes
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 64/302
55/167 sequências de polipeptídeo são ligadas in-frame de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, pelo emprego de terminações terminadas sem corte ou balanceadas para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminações apropriadas, preenchimento de extremidades coesivas conforme for adequado, tratamento por fosfatase alcalina para evitar união indesejável e ligação enzimática. Em algumas modalidades, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Em algumas modalidades, a amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser executada com o uso de iniciadores de âncora que realizam projeções complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subsequentemente anulados e reamplificados para gerar uma sequência de genes quimérica (consulte, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Em algumas modalidades, vetores de expressão estão comercialmente disponíveis que codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR modificado pode ser clonado em tal um vetor de expressão de modo que a porção de fusão é ligada in-frame ao polipeptídeo AR modificado.
[00107] Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligada a um domínio de ligação de DNA heterólogo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 ligada a um domínio de ligação de DNA heterólogo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de DNA heterólogo é domínio de ligação de DNA GAL4. Em
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 65/302
56/167 algumas modalidades, o domínio de ligação de DNA heterólogo é um domínio de ligação de DNA LexA. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligada a um domínio de ligação de DNA heterólogo através de um conector de peptídeo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 ligada a um domínio de ligação de DNA heterólogo através de um conector de peptídeo.
[00108] Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligada a um peptídeo heterólogo para uso em um ensaio de interação de proteína como, mas não se limitando a, um ensaio híbrido de duas leveduras, um sistema híbrido em dois com base em célula de mamífero (M2H), um ensaio de Transferência de Energia de Ressonância de Forster (Fluorescência) (FRET), uma Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência (BRET) ou um ensaio de Fluorescência Solucionada no Tempo Homogênea (HTRF®). Em algumas modalidades, um polipeptídeo AR é uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 ligada a um peptídeo heterólogo para uso em um ensaio de interação de proteína como, mas não se limitando a, um ensaio híbrido de duas leveduras, um sistema híbrido de dois com base em célula de mamífero (M2H), um ensaio de Transferência de Energia de Ressonância de Forster (Fluorescência) (FRET), uma Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência (BRET) ou um ensaio de Fluorescência Solucionada
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 66/302
57/167 no Tempo Homogênea (HTRF®).
[00109] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligado a um polipeptídeo detectável. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de a polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 é ligado a um polipeptídeo detectável. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligado a uma proteína fluorescente como, mas limitado a, uma proteína fluorescente verde (GFP), vermelha (RFP), ciano (CFP), amarela (YFP) ou azul (BFP). Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 é ligado a uma proteína fluorescente como, mas limitado a, uma proteína fluorescente verde (GFP), vermelha (RFP), ciano (CFP), amarela (YFP) ou azul (BFP). Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligado a uma proteína de bioluminescência. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de a polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 é ligado a uma proteína de bioluminescência. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1 ligado a uma etiqueta de peptídeo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante de um polipeptídeo AR mutante apresentado na SEQ ID NO: 5 é ligado a uma etiqueta de peptídeo. Em algumas modalidades, a etiqueta de peptídeo é uma etiqueta de epítopo reconhe
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 67/302
58/167 cida por um anticorpo específico de etiqueta. Em algumas modalidades, a etiqueta é uma etiqueta de epítopo como, mas não se limitando a, uma c-myc, V-5, hemaglutinina (HA), FLAG. Em algumas modalidades, a etiqueta é uma etiqueta de afinidade como, mas não se limitando a, biotina, etiqueta de estrep, proteína de ligação de quitina (CBP), proteína de ligação de maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST) ou uma etiqueta poli(His).
[00110] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma matriz que compreende um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante é ligado a um microcircuito. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante é ligado diretamente ao microcircuito. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante é ligado indiretamente ao microcircuito através de um conector. Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma matriz de microcircuito que compreende um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido.
Ácidos nucleicos [00111] São aqui fornecidos ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos AR mutantes. São aqui fornecidos ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui descritos. Métodos para deduzir ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos AR em particular são conhecidos na técnica e envolvem técnicas de biologia molecular padrão. Ácidos nucleicos exemplificadores que codificam polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos são fornecidos. É compreendido que, devido à degenerescência do código genético, múltiplos ácidos nucleicos variantes existem que codificam o mesmo polipeptídeo. Ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos abrangem tais variantes. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante são ácidos nucleicos sintéticos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante são moléculas de cDNA. Em algumas modalidades, os ácidos nuclei
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 68/302
59/167 cos de AR mutante não contêm DNA genômico. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante são não metilados. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante não contêm sequências de intron genômicas de AR. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante compreendem uma sequência de nucleotídeos de dois ou mais exons da sequência genômica de AR incluindo exon 8 ou uma porção do mesmo que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica a posição 876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de AR mutante compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam fenilalanina em uma posição que corresponde à posição 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem.
[00112] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica polipeptídeo AR mutantes compreende uma modificação em relação a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação onde o polipeptídeo codificado compreende uma substituição do aminoácido fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação onde um polipeptídeo codificado não compreende fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1.
[00113] Em algumas modalidades, a modificação de ácido nucleico é uma mutação com troca de sentido ou uma deleção de um ou mais códons que codificam o polipeptídeo. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina em uma posição de amino
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 69/302
60/167
876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR é TTC ou TTT. Em algumas modalidades, o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR é TTC. Em algumas modalidades, o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR é TTT. Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTC para um códon de ácido nucleico que codifica leucina. Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTT para um códon de ácido nucleico que codifica leucina. Em algumas modalidades, o códon de ácido nucleico que codifica leucina é selecionado dentre TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG.
[00114] Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) para citosina (C). Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTC para CTC. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de timina (T) por citosina (C) na posição de ácido nucleico 2626 da sequência de ácido nucleico de AR apresentada na SEQ ID NO:18.
[00115] Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Adenina (A). Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTT para TTA. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 70/302
61/167 uma substituição de Timina (T) por Adenina (A) na posição de ácido nucleico 2628 da sequência de ácido nucleico de AR apresentada na
SEQ ID NO:18.
[00116] Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Guanina (G). Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTT para TTG. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Guanina (G) na posição de ácido nucleico 2628 da sequência de ácido nucleico de AR apresentada na SEQ ID NO:18.
[00117] Em algumas modalidades, a modificação compreende uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Citosina (C) na primeira posição do códon que codifica F876 do polipeptídeo AR e uma segunda mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Adenosina (A) na terceira posição do códon que codifica F876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTT a CTA. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Citosina (C) na posição de ácido nucleico 2626 e uma segunda mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Adenosina (A) na posição de ácido nucleico 2628 da sequência de ácido nucleico de AR apresentado na SEQ ID NO:18.
[00118] Em algumas modalidades, a modificação compreende uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Citosina (C) na primeira posição do códon que codifica
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 71/302
62/167
F876 do polipeptídeo AR e uma segunda mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Guanina (G) na terceira posição do códon que codifica F876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, a modificação altera o códon de ácido nucleico que codifica fenilalanina na posição de amino 876 do polipeptídeo AR de TTT para CTG. Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Citosina (C) na posição de ácido nucleico 2626 e uma segunda mutação com troca de sentido que compreende uma substituição de Timina (T) por Guanina (G) na posição de ácido nucleico 2628 da sequência de ácido nucleico de AR apresentada na SEQ ID NO:18.
[00119] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AR mutante compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AR mutante compreende um ácido nucleico que tem 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de ácido de nucleotídeo para o ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19 onde o AR mutante codificado compreende uma modificação em relação ao polipeptídeo AR do tipo selvagem em uma posição que corresponde à posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AR mutante compreende um ácido nucleico que tem 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de ácido de nucleotídeo para o ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19 onde o AR mutante codificado não compreende uma fenilalanina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AR mutante compreende um ácido
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 72/302
63/167 nucleico que tem 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de ácido de nucleotídeo para o ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19 onde o AR mutante codificado compreende uma leucina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876.
[00120] Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante é um ácido nucleico isolado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante é uma molécula de DNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante é uma molécula de cDNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante é uma molécula de RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante é uma molécula de RNA inibitória (isto é, RNAi). Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido é uma molécula de ácido nucleico que é complementar ou se liga a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante.
[00121] Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante ou uma porção do mesmo contém ácido nucleico que codifica um aminoácido na posição 876 que não é fenilalanina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido que codifica um polipeptídeo AR mutante ou uma porção do mesmo contém ácido nucleico que codifica leucina na posição de aminoácido 876.
[00122] Em algumas modalidades, o ácido nucleico fornecido aqui é um oligonucleotídeo que codifica uma porção do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido é um oligonucleotídeo que codifica uma porção do polipeptídeo AR mutante que contém um códon de nucleotídeo que codifica o aminoácido que
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 73/302
64/167 corresponde à posição de aminoácido 876. Em algumas modalidades, o códon codifica um aminoácido que não é fenilalanina. Em algumas modalidades, o códon codifica um aminoácido que é leucina.
[00123] Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido é um vetor que compreende ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido é um vetor que compreende ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos é um vetor de expressão. Em algumas modalidades, o ácido nucleico aqui fornecido é um vetor que compreende ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos está ligado de maneira funcional a um promotor para a expressão dos polipeptídeos AR mutantes.
[00124] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor plasmidial. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral de DNA ou RNA. Vetores virais exemplificadores incluem, mas não se limitam a, uma varíola, adenovírus, vírus associado a adeno (AAV), retrovírus ou vetor de herpesvirus. [00125] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma matriz que compreende um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de AR mutante é ligado a um microcircuito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de AR mutante é ligado diretamente ao microcircuito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de AR mutante é ligado indiretamente ao microcircuito através de um conector. Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma matriz de microcircuito que compreende um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidos.
Produção de ácidos nucleicos e polipeptídeos [00126] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 74/302
65/167 isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é gerada por métodos recombinantes padrão. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é gerada por amplificação de uma sequência de AR mutante de DNA genômico. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecidos é gerada por reação em cadeia da polimerase com o uso de iniciadores específicos de sequência de AR. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é gerada por transcrição reversa de mRNA que codifica um polipeptídeo AR mutante.
[00127] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é inserida em um vetor de expressão e expressada em uma célula hospedeira ou um extrato sem célula. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é ligada operacionalmente a um promotor para expressão do polipeptídeo codificador em uma célula ou extrato sem célula. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível.
[00128] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é exógena a uma célula, o que significa que é estranha à célula na qual o vetor é introduzido ou que a sequência é homóloga a uma sequência na célula, mas em uma posição dentro do ácido nucleico de célula hospedeira no qual a sequência não é normalmente encontrada. Os vetores incluem plasmídios, cosmídios, vírus (bacteriófago, vírus animal e vírus vegetal) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs). Um versado no ARt seria bem equipado para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão, as quais são descritas em Sambrook et al.,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 75/302
66/167
1989 e Ausubel et al., 1996, ambos aqui incorporados, a título de referência.
[00129] Métodos para a expressão de uma proteína em uma célula são bem conhecidos no ARt e incluem, por exemplo, expressão em células como células animais e vegetais. Células animais exemplificadoras para a expressão de polipeptídeos AR mutantes aqui fornecidas incluem, mas não se limitam a, bactérias, levedura, células de inseto e células de mamífero como, por exemplo, células humanas, primatas, roedoras, bovinas e ovinas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o AR mutante é integrado no genoma da célula hospedeira.
[00130] Em algumas modalidades, um método para a expressão de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido compreende cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo AR mutante de modo que o polipeptídeo AR mutante é produzido pela célula. Em alguns métodos, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo mutante está conectado a um ácido nucleico que codifica uma sequência de sinal de modo que a sequência de sinal é expressa como um peptídeo de fusão com o polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, a sequência de sinal permite a secreção do polipeptídeo AR mutante pela célula hospedeira.
[00131] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante é isolado de uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo mutante. Em algumas modalidades, um extrato é preparado da célula hospedeira e o polipeptídeo AR mutante é isolado por métodos de purificação como, mas não se limitando a, cromatografia ou imunoafinidade com um anticorpo que é específico para polipeptídeos AR ou específico para o polipeptídeo AR mutante em particular.
Anticorpos [00132] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um polipep
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 76/302
67/167 tídeo AR mutante aqui fornecido e se liga com menos afinidade ou não se liga a um polipeptídeo AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um polipeptídeo AR mutante na presença de um inibidor de segunda geração como, mas não se limitando a, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162.
[00133] Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é detectado com o uso de anticorpos que reconhecem especificamente os polipeptídeos AR mutantes, mas não reconhecem polipeptídeos AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante aqui fornecido é detectado com o uso de anticorpos que reconhecem especificamente um polipeptídeo AR mutante que tem uma leucina na posição de aminoácido 876, mas não reconhecem polipeptídeos AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, anticorpos são destacados contra uma ou mais formas alélicas do polipeptídeo AR mutante aqui fornecido. Técnicas para usar uma proteína específica ou um oligopeptídeo como um antígeno para obter anticorpos que reconhecem especificamente epítopos no peptídeo ou proteína são bem conhecidas. Em uma modalidade, a sequência de DNA da forma alélica desejada do gene alvo é clonada pela inserção em um vetor de expressão apropriado e traduzida em proteína em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. A proteína pode ser recuperada e usada como um antígeno para obter a produção de anticorpos específicos. Em uma outra modalidade, o DNA da forma alélica desejada do gene alvo é amplificado pela tecnologia PCR e é subsequentemente traduzido in vitro em proteína a ser usada como o antígeno para a produção de anticorpos específicos. Em uma outra modalidade, a sequência de DNA dos alelos alternativos é usada como uma base para a geração de peptídeos sintéticos que representam a sequência de aminoácidos dos alelos para uso como o antígeno para obter a produção de anticorpos específicos.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 77/302
68/167 [00134] Em algumas modalidades, os anticorpos são gerados ou por técnicas de anticorpo monoclonal padrão ou gerados através de sistemas de expressão com base em recombinante. Consulte, de modo geral, Abbas, Lichtman e Pober, Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co. (1991). O termo anticorpos destina-se a incluir moléculas de anticorpo intactas, assim como fragmentos de anticorpo ou derivados como Fab e F(ab')2 que são capazes de se ligar especificamente a um antígeno. Os anticorpos produzidos assim, de preferência, se ligam somente à proteína mutante produzida na forma alélica que foi usada como um antígeno para criar o anticorpo. Os métodos de geração de anticorpos específicos de alelo também são descritos na patente US n°6.200.754 e patente US n° 6 .054.273, estando a totalidade de seus conteúdos aqui incorporada, a título de referência. [00135] Em algumas modalidades, o anticorpo aqui fornecido é um anticorpo humanizado. Um anticorpo humanizado refere-se a um tipo de anticorpo manipulado que tem as CDRs do mesmo derivadas de uma imunoglobulina doadora não humana, as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula sendo derivada de uma ou mais imunoglobulina(s) humana. Em algumas modalidades, resíduos de sustentação de estrutura são alterados para preservar afinidade de ligação (consulte, por exemplo, Queen et al. Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029 a 10032 (1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991)). Em algumas modalidades, um anticorpo aceitante humano adequado é um selecionado dentre uma base de dados convencional, por exemplo, a base de dados KABAT®, base de dados Los Alamos e base de dados Swiss Protein por homologia ao nucleotídeo e sequências de aminoácidos do anticorpo doador. Em algumas modalidades, um anticorpo humano caracterizado por uma homologia para as regiões de estrutura do anticorpo doador (em uma base por aminoácido) é adequado para fornecer uma região constante de cadeia pesada e/ou
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 78/302
69/167 uma região de estrutura variável de cadeia pesada para inserção das CDRs doadoras. Em algumas modalidades, um anticorpo aceitante adequado capaz de doar regiões de estrutura constante ou variável de cadeia leve é selecionado de maneira similar. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de anticorpo aceitante originam do mesmo anticorpo aceitante. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de anticorpo aceitante originam de anticorpos aceitantes diferentes. A técnica anterior descreve várias formas de produzir tais anticorpos humanizados, consulte, por exemplo, EP-A-0239400 e EPA-054951.
[00136] Em algumas modalidades, anticorpos específicos para um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido podem ser usados para detectar a presença de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido em uma amostra, por exemplo, uma amostra de ensaio, uma amostra de célula, um extrato de célula, uma amostra biológica ou uma amostra de paciente com o uso de técnicas conhecidas na ARt. Essas técnicas incluem, por exemplo, Western blot, imunoistoquímica, imunofluorescência indireta e micromatriz de anticorpo. Em algumas modalidades, anticorpos que reconhecem especificamente um polipeptídeo AR mutante são inibidores de AR de terceira geração. Em algumas modalidades, a habilidade de um anticorpo que reconhece especificamente um polipeptídeo AR mutante em inibir a atividade biológica do polipeptídeo AR mutante pode ser determinada com o uso dos métodos aqui descritos para identificar inibidores de AR de terceira geração.
Ensaios de diagnóstico para detectar polipeptídeos ar mutantes e polipeptídeos ar mutantes codificadores de ácidos nucleicos [00137] São aqui fornecidos métodos de diagnóstico que envolvem a detecção de um polipeptídeo AR mutante em um indivíduo ou em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença ou afec
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 79/302
70/167 ção mediada por AR. Em algumas modalidades, os métodos de diagnóstico são empregados para a triagem de indivíduos que têm uma câncer que é resistente à terapia com um antiandrogênio como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, identificação de indivíduos para o tratamento com antiandrogênio como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, monitoramento da terapia de indivíduos que recebem uma terapia por antiandrogênio como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, otimização da terapia de indivíduos que recebem uma terapia por antiandrogênio como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os métodos compreendem selecionar um indivíduo para terapia com um antagonista de AR de terceira geração. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar ao indivíduo um antagonista de AR de terceira geração conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante detectado compreende uma modificação em uma posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante detectado compreende uma substituição do aminoácido fenilalanina por leucina na posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um antagonista de uma primeira ou de uma segunda geração.
[00138] Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um antagonista de uma primeira ou de uma segunda geração. Em algumas modalidades, um
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 80/302
71/167 indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um antagonista de uma primeira e de uma segunda geração. Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma leucina na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um antagonista de uma primeira ou de uma segunda geração. Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma leucina na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um antagonista de uma primeira e de uma segunda geração. Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um inibidor de CYP17A que se liga a AR como, por exemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, um indivíduo que tem um polipeptídeo AR mutante que compreende uma modificação na posição de aminoácido 876 é resistente à inibição com um inibidor de CYP17A que se liga a AR como, por exemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona.
[00139] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para caracterizar um polipeptídeo AR que é resistente à inibição com um antagonista de AR de segunda geração em um indivíduo que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentado na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o AR como resistente à inibição com um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 81/302
72/167 mutante. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente não administrar um antagonista de AR de segunda geração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00140] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para caracterizar um AR que é resistente à inibição com um antagonista de AR de primeira geração em um indivíduo que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o AR como resistente à inibição com um antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente não administrar um antagonista de AR de segunda geração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 82/302
73/167 obter a amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00141] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para caracterizar um AR que é resistente à inibição com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A em um indivíduo que compreende: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o AR como resistente à inibição com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente não administrar um antagonista de AR de segunda geração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades o inibidor de CYP17A é galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente obter a amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00142] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para selecionar um indivíduo para terapia com um antagonista de AR de segunda geração que compreende (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 83/302
74/167 aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para terapia com um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente caracterizar o indivíduo como um não candidato para terapia com um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00143] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para selecionar um indivíduo para terapia com um antagonista de AR de primeira geração que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para terapia com um antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente caracterizar o indivíduo como um não candidato para terapia com um antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o in
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 84/302
75/167 divíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00144] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para selecionar um indivíduo para terapia com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para terapia com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente caracterizar o indivíduo como um não candidato para terapia com um inibidor de CYP17A se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades o inibidor de CYP17A é galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00145] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para selecionar um indivíduo para terapia com um antagonista de AR de terceira geração que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 85/302
76/167 indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para terapia com um antagonista de AR de terceira geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00146] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar se um indivíduo é ou é provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR de segunda geração que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração de um inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amosPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 86/302
77/167 tra de ácido nucleico do indivíduo.
[00147] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar se um indivíduo é ou é provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR de primeira geração que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração de um inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00148] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar se um indivíduo é ou é provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou provável de se tornar resistente à terapia com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 87/302
78/167 compreende adicionalmente a administração de um inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades o inibidor de CYP17A é galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00149] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para monitorar se um indivíduo que recebe um antagonista de AR de segunda geração para tratamento de um câncer desenvolveu ou irá desenvolver resistência à terapia que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou como se tornará resistente à terapia com um antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00150] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para monitorar se um indivíduo que recebe um antagonista de AR de pri
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 88/302
79/167 meira geração para tratamento de um câncer desenvolveu ou irá desenvolver resistência à terapia que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou como se tornará resistente à terapia com um antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui fornecido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00151] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para monitorar se um indivíduo que recebe um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A para tratamento de um câncer desenvolveu ou irá desenvolver resistência à terapia que compreendem (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como resistente ou como se tornará resistente à terapia com um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma administração de um antagonista de AR de terceira geração aqui for
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 89/302
80/167 necido para inibição do AR mutante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades o inibidor de CYP17A é galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00152] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para otimizar a terapia de um indivíduo que recebe um antagonista de AR de segunda geração para tratamento de um câncer que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) descontinuar tratamento com o antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo tem uma modificação ou continuar um tratamento com o antagonista de AR de segunda geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00153] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para otimizar a terapia de um indivíduo que recebe um antagonista de AR de primeira geração para tratamento de um câncer que compreendem: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) descontinuar um tratamento com o antagonista de AR de primeira geração se o indivíduo tem a modificação ou continuar um tratamento com o antagonista de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 90/302
81/167
AR de primeira geração se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00154] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para otimizar a terapia de um indivíduo que recebe um antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A para tratamento de um câncer que compreende: (a) ensaiar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo codificado AR é modificado em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) descontinuar um tratamento com o antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo tem a modificação ou continuar um tratamento com o antagonista de AR que é um inibidor de CYP17A se o indivíduo não tem a modificação. Em algumas modalidades o inibidor de CYP17A é galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de obtenção da amostra de ácido nucleico do indivíduo.
[00155] Em algumas modalidades, o AR modificado é resistente ao antagonismo total por um antagonista de AR de segunda geração como, por exemplo, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162. Em algumas modalidades, um antagonista de AR de segunda geração como, por exemplo, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162 exibe atividade agonista em direção ao AR modificado. Em algumas modalidades, o AR modificado é resistente a um antagonismo total por um antagonista de AR de primeira geração. Em algumas modalidades, o AR modificado é resistente a um antagonismo total por um antagonista de AR que é um CYP17A.
[00156] Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR. Em algumas modaliPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 91/302
82/167 dades, a doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR é hiperplasia de próstata benigna, hirsutismo, acne, adenomas e neoplasmas da próstata, células de tumor benignas ou malignas contendo o AR, hiperpilosidade, seborreia, endometriose, síndrome do ovário policístico, alopécia androgênica, hipogonadismo, osteoporose, supressão de espermatogênese, libido, caquexia, anorexia, suplementação de androgênio para níveis de testosterona menores relacionados a idade, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer endometrial, câncer uterino, afrontamentos, doença de Kennedy, atrofia muscular e fraqueza, atrofia cutânea, perda óssea, anemia, arteriosclerose, doença cardiovascular, perda de energia, perda de bem estar, diabetes tipo 2 ou acumulo de gordura abdominal. [00157] Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata, um câncer de mama, um câncer de fígado ou um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de próstata.
[00158] Em algumas modalidades, a amostra é de qualquer tecido ou fluido de um organismo. As amostras incluem, mas não se limitam a. sangue total, medula óssea dissociada, medula óssea aspirada, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido espinhal central, fluido abdominal, fluido pancreático, líquido cefalorraquidiano, fluido cerebral, ascite, fluido pericardial, urina, saliva, limpeza bronquial, suor, lágrimas, fluxo de orelha, escarro, fluido hidrocelo, sêmen, fluxo vaginal, leite, líquido amniótico e secreções de trato respiratório, intestinal ou geniturinário. Em modalidades em particular, a amostra é uma amostra de biopsia de tumor. Em modalidades em particular, a amostra é de um fluido ou tecido que é parte do ou associada ao sistema linfático ou sistema circulatório. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue que é uma amostra de sangue venoso, arterial, periférico, teci
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 92/302
83/167 do ou de cordão. Em modalidades em particular, a amostra é uma amostra de soro. Em algumas modalidades, a amostra contém uma ou mais células de tumor em circulação (CTCs). Em algumas modalidades, a amostra contém uma ou mais células de tumor disseminadas (DTC, por exemplo, em uma amostra de medula óssea aspirada). [00159] Métodos para o isolamento de ácidos nucleicos e proteínas de células contidas no tecido e amostras de fluido são bem conhecidas no ARt. Em modalidades em particular, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é isolada de células contidas em uma biopsia de tumor do indivíduo. Em modalidades em particular, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é isolada de células em uma medula óssea aspirada. Em modalidades em particular, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é isolada de células contidas em uma amostra de soro. Em modalidades em particular, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é isolada de células contidas em uma amostra de linfa.
[00160] Em algumas modalidades, as amostras são obtidas do indivíduo por quaisquer meios adequados de obtenção da amostra com o uso de métodos clínicos bem conhecidos e de rotina. Os procedimentos para obter amostras de fluido de um indivíduo são bem conhecidos. Por exemplo, os procedimentos para desenhar e processar sangue total e linfa são bem conhecidos e podem ser empregados para obter uma amostra para uso nos métodos fornecidos. Tipicamente, para coleta de uma amostra de sangue, um agente anticoagulação (por exemplo, EDTA ou citrato e heparina ou CPD (citrato, fosfato, dextrose) ou substâncias comparáveis) é adicionado à amostra para impedir a coagulação do sangue. Em alguns exemplos, a amostra de sangue é coletada em um tubo de coleta que contém uma quantidade de EDTA para evitar a coagulação da amostra de sangue.
[00161] Em algumas modalidades, a amostra é uma biopsia de te
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 93/302
84/167 cido e é obtida, por exemplo, por biopsia por agulha, biopsia por agulha guiada por CT, biopsia por aspiração, biopsia endoscópica, biopsia broncoscópica, lavagem bronquial, biopsia incisional, biópsia excisional, biopsia por punção, biopsia por raspagem, biópsia de pele, biopsia de medula óssea e o Procedimento de Excisão Eletrocirúrgico de Circuito (LEEP). Tipicamente, uma biopsia esterilizada ou espécime não necrótico é obtido que é maior que 100 mg, mas que pode ser menor como menor que 100 mg, 50 mg ou menos, 10 mg ou menos ou 5 mg ou menos; ou maior, como maior que 100 mg, 200 mg ou mais ou 500 mg ou mais, 1 g ou mais, 2 g ou mais, 3 g ou mais, 4 g ou mais ou 5 g ou mais. O tamanho de amostra a ser extraída para o ensaio depende de vários fatores incluindo, mas não se limitando a, o número de ensaios a serem realizados, a saúde da amostra de tecido, o tipo de câncer e a afecção do paciente. Em algumas modalidades, o tecido é colocado em um vaso estéril como um tubo estéril ou placa de cultura e é opcionalmente imerso em um meio adequado. Tipicamente, as células são dissociadas em suspensões de célula por meios mecânicos e/ou tratamento enzimático tal como é bem conhecido na ARt. Tipicamente, as células são coletadas e, então, individualizadas para procedimentos padrões para o isolamento de ácido nucleico para o ensaio.
[00162] Em algumas modalidades, as amostras são obtidas do indivíduo em intervalos regulares como, por exemplo, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, duas semanas, semanas, quatro semanas, um mês, duas meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, um ano, diariamente, semanalmente, bimestralmente, trimestralmente, semestralmente ou anualmente. Em algumas modalidades, a coleta de amostras é realizada em um tempo predeterminado ou em intervalos regulares em relação a um tratamento com um ou mais agentes anticâncer. Em algumas modalidades, a coleta de amostras é realizada em um tempo predeterminado
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 94/302
85/167 ou em intervalos regulares em relação a um tratamento com um antagonista de AR como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração. Por exemplo, uma amostra é coletada em um tempo predeterminado ou em intervalos regulares antes, durante ou após um tratamento ou entre tratamentos sucessivos. Em exemplos em particular, uma amostra é obtida do indivíduo antes de uma administração de uma terapia anticâncer e, então, novamente em intervalos regulares após o tratamento ser efetuado. Em exemplos em particular, uma amostra é obtida do indivíduo antes de uma administração de um antagonista de AR como um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, terapia e, então, novamente em intervalos regulares após tratamento ser efetuado. Em algumas modalidades, o antagonista de AR é selecionado dentre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) e RD162. Em algumas modalidades, o antagonista de AR é um inibidor de CYP17A. Em algumas modalidades, o inibidor de CYP17A é selecionado dentre galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona.
[00163] O volume de uma amostra de fluido pode ser qualquer volume que é adequado para a detecção de um AR mutante nos métodos fornecidos. Em alguns exemplos, o volume para a amostra de fluido depende do método de ensaio em particular usado. Por exemplo, métodos de ensaio em particular podem exigir volumes de amostra de fluido maiores ou menores dependendo de fatores como, mas não se limitando a, a capacidade do dispositivo ou método usado e nível de velocidade do método de ensaio. Em alguns exemplos, uma amostra de fluido é diluída em um meio adequado antes da aplicação do método de ensaio. Em alguns exemplos, uma amostra de fluido que é obtida a partir de um indivíduo e de uma porção ou de alíquota da amostra é usada no método de ensaio. A porção ou alíquota pode ser diluída em um meio adequado antes da aplicação do método de ensaio.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 95/302
86/167 [00164] Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir de um indivíduo que é mamífero. Pacientes mamíferos exemplificadores incluem, mas não se limitam a primatas como seres humanos, chimpanzés e macacos; roedores, como camundongos, ratos, coelhos e furões; ruminantes como cabras, vacas, cervos e ovelhas; cavalos, porcos, cães, gatos e outros animais. Em algumas modalidades, a amostra é obtida a partir de um paciente. Em alguns exemplos, o paciente é um paciente humano.
[00165] Em algumas modalidades, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é uma amostra de ácido nucleico genômico. Em algumas modalidades, a amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo é uma amostra de RNA. Em algumas modalidades, o mRNA é isolado do RNA total em uma amostra de RNA. Em algumas modalidades, a amostra de RNA é transcrita em reverso no cDNA. Em algumas modalidades, a amostra de ácido nucleico genômico é amplificada por um método de amplificação de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o método de amplificação de ácido nucleico é reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas modalidades, a amostra de ácido nucleico genômico é amplificada com o uso de um conjunto de iniciadores de nucleotídeo específicos para o gene de AR. Em algumas modalidades, o conjunto de iniciadores de nucleotídeo flanqueia a sequência de ácido nucleico que codifica uma posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, o produto de amplificação é um ácido nucleico que codifica uma posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, um iniciador específico de sequência é conjugado a uma molécula detectável como um marcador fluorescente, um marcador bioluminescente, um marcador quemiluminescente, um rádiomarcador, um marcador de enzima, um substrato detectável ou um peptídeo ou molécula que se liga a uma segunda molécula detectável.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 96/302
87/167 [00166] Em algumas modalidades, ensaiar compreende sequenciar a amostra de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica AR em uma amostra de ácido nucleico é amplificado primeiro por um método como reação em cadeia da polimerase (PCR) com o uso de iniciadores específicos de sequência e o fragmento de PCR amplificado é, então, sequenciado. Métodos de sequenciamento exemplificadores para uso nos métodos fornecidos da presente invenção são bem conhecidos no ARt e incluem, mas não se limitam a, didesóxi ou métodos de terminação de cadeia, sequenciamento de Maxam-Gilbert, sequenciamento de assinatura paralela massivo (ou MPSS), sequenciamento de colônia de polimerase, pirosequenciamento, sequenciamento por corante Illumina, sequenciamento SOLiD (ou sequenciamento por ligação), sequenciamento de semicondutor de íon, sequenciamento de nanoesfera de DNA, sequenciamento de heliscópio e sequenciamento em tempo real de molécula única (SMRT).
[00167] Em algumas modalidades, as amostras são uma amostra de plasma ou de soro contendo DNA de tumor circular (ctDNA), RNA (ctRNA) ou microRNA (consulte, por exemplo, Chan et al. (2007) Br J Cancer. 96(5):681 a 5). Em algumas modalidades, o DNA que codifica o AR mutante é avaliado por método de sequenciamento PCR BEAMing (microesferas, amplificação, emulsão, magnético) (consulte, por exemplo Li et al. (2006) Nat Methods. 3(2):95 a 7; Li et al. (2006) Nat Methods. 3(7):551 a 9; e Diehl et al. (2008) Nat Med. 14(9): 985 a 990). A BEAMing é uma técnica na qual moléculas de DNA individuais são fixadas a microesferas magnéticas em emulsões de água-em-óleo e, então, individualizadas para amplificação compartimentalizada por PCR. O estado mutacional de DNA ligado a microesferas é, então, determinado por hibridização para sondas específicas para alelo fluorescentes para AR mutante ou do tipo selvagem. A citometria de fluxo é, então, usada para quantificar o nível de DNA mutante presente no
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 97/302
88/167 plasma ou soro (consulte, por exemplo, Higgins et al. (2012) Clin Cancer Res 18: 3462 a 3469).
[00168] Em algumas modalidades, ensaiar uma amostra para detectar a presença de DNA que codifica o AR mutante compreende uma detecção da mutação com uma sonda de oligonucleotídeo específica de sequência que é específica para um ácido nucleico que codifica o AR mutante, mas não o AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, ensaiar compreende (a) colocar uma amostra em contato com uma sonda de oligonucleotídeo específica de sequência de ácido nucleico de AR mutante, de modo que se a sequência de ácido nucleico mutante está presente na amostra, um complexo sonda-DNA é formado e (b) detectar o complexo sonda-DNA. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é específica para ácido nucleico que codifica leucina em uma posição que corresponde ao aminoácido 876 de um polipeptídeo AR. Em algumas modalidades, a sonda específica de sequência é conjugada a uma molécula detectável, como um marcador fluorescente, um marcador bioluminescente, um marcador quemiluminescente, um rádiomarcador, um marcador de enzima, uma substrato detectável ou um peptídeo ou molécula que se liga a uma segunda molécula detectável.
[00169] Em algumas modalidades, alterações de nucleotídeo individuais são detectáveis por PCR com o uso de marcadores de sequências polimórficas amplificadas clivada com base em PCR (CAPS) que criam sítios de restrição nas sequências mutantes (Michaels et al (1998) Plant J. 14(3):381 a 5) ou sondas em forma de grampo específicas de sequência fixadas a porções detectáveis como, mas não se limitando a, um fluoróforo (Mhlanga e Malmberg (2001) Methods 25:463 a 471). Em algumas modalidades, a sonda específica de sequência é conjugada a uma molécula detectável, como um marcador fluorescente, um marcador bioluminescente, um marcador quemilumi
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 98/302
89/167 nescente, um rádiomarcador, um marcador de enzima, uma substrato detectável ou um peptídeo ou molécula que se liga a uma segunda molécula detectável. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é específica para ácido nucleico que codifica leucina em uma posição que corresponde ao aminoácido 876 de um polipeptídeo AR. [00170] Em algumas modalidades, ensaiar uma amostra para detectar a presença de DNA que codifica o AR mutante é realizado com o uso de uma matriz de oligonucleotídeo (consulte, por exemplo, Hastia et al. (1999) J Med Genet. 36(10):730 a 6). Em algumas modalidades, a amostra contendo ácido nucleico do indivíduo é hibridizada diretamente ao circuito integrado. Em algumas modalidades, a amostra contendo ácido nucleico do indivíduo é amplificada com o uso de um método de amplificação como, mas não se limitando a, reação em cadeia da polimerase (PCR) e o ácido nucleico amplificado é hibridizado no circuito integrado. Em algumas modalidades, a matriz de oligonucleotídeo é contida em um microcircuito. Em algumas modalidades, um alterações de nucleotídeo individuais são detectáveis com o uso de microcircuitos.
[00171] Em algumas modalidades, ensaiar uma amostra compreende detectar a mutação com um anticorpo específico para o polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o método de detecção de um polipeptídeo AR mutante compreende obter uma amostra de um indivíduo em que a amostra compreende um polipeptídeo AR e testar a amostra pela presença de um polipeptídeo AR mutante pelo contato da amostra com um anticorpo que é específico para ligação ao polipeptídeo AR mutante e não se liga ou se liga com afinidade menor ao polipeptídeo AR do tipo selvagem em que a presença do polipeptídeo AR mutante cria um complexo anticorpo-polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente detectar o complexo anticorpo-polipeptídeo AR mutante. Em algumas
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 99/302
90/167 modalidades, o método compreende adicionalmente detectar o complexo anticorpo-polipeptídeo AR mutante com um reagente de detecção. Em algumas modalidades, o anticorpo específico de AR mutante é conjugado a uma molécula detectável como um marcador fluorescente, um marcador bioluminescente, um marcador quemiluminescente, um rádiomarcador, um marcador de enzima, um substrato detectável ou um peptídeo ou molécula que se liga a uma segunda proteína detectável (por exemplo, um anticorpo secundário). Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo específico de AR mutante é detectada por ensaio da molécula detectável. Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo específico de AR mutante é detectada pelo uso de um anticorpo secundário (por exemplo, anti-IgG). Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de biopsia de tumor, uma medula óssea aspirada, uma amostra de sangue, uma amostra de soro ou uma amostra de linfa.
Identificação de moléculas que interagem com receptor de androgênio mutante [00172] São aqui fornecidos métodos de uso dos polipeptídeos AR mutantes para triagem de compostos que inibem o receptor mutante (isto é, compostos de inibidor de AR de terceira geração). Em algumas modalidades, os métodos são empregados para a identificação de compostos de inibidor de AR de terceira geração para o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, os métodos são empregados para a identificação de compostos de inibidor de AR de terceira geração para o tratamento de canceres resistentes como câncer de próstata resistente ao tratamento com antagonistas de AR de segunda geração como ARN-509, enzalutamida (MDV3100) ou RD162.
[00173] Em algumas modalidades, um método para identificar compostos de inibidor de AR de terceira geração compreende (a) expressar um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido em uma célula, (b) coPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 100/302
91/167 locar a célula em contato com um composto de teste e (c) detectar o nível de atividade de AR na célula. Em algumas modalidades, a célula é colocada em contato com um agonista AR antes ou ao mesmo tempo do contato da célula com o composto de teste. Em algumas modalidades, a célula é colocada em contato com um agonista AR por cerca de 1 hora, 2, horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas ou mais antes colocar a célula em contato com o composto de teste. Em algumas modalidades, a célula é colocada em contato com um agonista AR ao mesmo tempo em que a célula é colocada em contato com o composto de teste. Em algumas modalidades, o agonista AR é selecionado dentre metiltrienolona (R1881), DHT, mibolerona (Mb) e testosterona. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante não contém uma fenilalanina na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante contém uma leucina na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo.
[00174] Em algumas modalidades, uma linhagem celular que pode ser transfectada com ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AR mutante e na qual uma atividade de AR pode ser monitorada é usada. Em algumas modalidades, a célula não expressa o AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a célula expressa um baixo nível de AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma célula expressa um polipeptídeo AR mutante endógeno. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante endógeno compreende uma modificação em um aminoácido que corresponde a um aminoácido 877 de um polipeptídeo AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 101/302
92/167
AR mutante endógeno compreende uma modificação que é uma substituição de treonina para alanina na posição de aminoácido 877 (T877A). Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação em um aminoácido que corresponde ao aminoácido 874 de um polipeptídeo AR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma modificação que é uma substituição de histidina para tirosina na posição de aminoácido 874 (H874Y). Em algumas modalidades, a célula é uma selecionada dentre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3 e TSY-PR1. Em algumas modalidades, a linhagem celular é uma linhagem celular de câncer de próstata. Em algumas modalidades, a linhagem celular é selecionada dentre CWR, LNCaP, VCaP e LAPC4.
[00175] Em algumas modalidades, a célula expressa de maneira estável o polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o AR mutante é integrado no genoma da célula.
[00176] Em algumas modalidades, o nível de atividade de AR é detectado com o uso de um gene-repórter ligada de maneira funcional a um promotor responsivo a AR. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a AR compreende uma ou mais elementos de resposta de androgênio (AREs) aos quais o polipeptídeo AR mutante se liga. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado dentre uma probasina (Pb), um antígeno específico de próstata (PSA), uma repetição de terminal de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV LTR), ácido graxo sintase (FASN), seis antígenos epiteliais transmembrânicos da próstata 4 (STEAP4), transmembrânica protease, serina 2 (TMPRSS2), alfa-1-ácido glicoproteína 1 (ORM1) ou promotor de gene homeobox humano KX3.1. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor sintético contendo uma ou mais AREs.
[00177] Em algumas modalidades, o promotor responsivo a AR está ligado de maneira funcional a um gene-repórter adequado que codifica
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 102/302
93/167 uma proteína detectável. Proteínas detectáveis exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, luciferase, proteínas fluorescentes, proteínas de bioluminescência, β-galactosidase, fosfatase alcalina e cloranfenicol acetiltransferase. Em algumas modalidades, uma diminuição na expressão do gene-repórter após exposição ao composto de teste se comparado com um controle adequado indica que o composto de teste é eficaz para inibição do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o controle é uma expressão basal do gene-repórter antes da exposição da célula ao composto de teste. Em algumas modalidades, a expressão do gene-repórter é ensaiada com o uso de um extrato de célula preparado das células de teste.
[00178] Em algumas modalidades, o nível de atividade de AR é detectado pela medição da expressão de uma ou mais genes responsivos a androgênio endógenos em uma célula. Em algumas modalidades, o gene responsivo a androgênio é infrarregulado (isto é, induzido) em resposta ao tratamento por androgênio. Em algumas modalidades, o gene responsivo a androgênio é suprarregulado (isto é, reprimido) em resposta ao tratamento por androgênio. Genes responsivos a androgênio exemplificadores incluem, mas não se limitam a, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), prostasina, homólogo de caracol 2 (SLUG), protease transmembrânica, serina 2 (TMPRSS2), seis antígenos epiteliais transmembrânicos do membro 4 da família de próstata (STEAP4), proteína de ligação 5 FK506 (FKBP5), orosomucoide 1/alfa-1-ácido glicoproteína 1 (ORM1), família carreadora de soluto 35 (SLC35F2/NOV), fator de crescimento similar a insulina I (IGF-1) proteína de ligação IGF-3 e -5, proteína de ligação intensificadora de CCAAT-δ, fosfatase e homólogo de tensina deletado no cromossomo 10 (PTEN), FASN, NKX3.1, AMIGO2, BDNF, CAMK2N1, HPGD, NCAPD3, PLD1, IL-15, IL-18 e ERBB2/HER2.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 103/302
94/167 [00179] Em algumas modalidades, o nível de atividade de AR é detectado pela medição da expressão de um ou mais genes endógenos que são induzidos mediante a exposição a um androgênio ou a um agonista AR. Em algumas modalidades, uma diminuição na expressão de um ou mais genes induzíveis de androgênio após exposição ao composto de teste se comparada com um controle adequado indica que o composto de teste é eficaz para inibição do polipeptídeo AR mutante. Genes induzíveis de androgênio exemplificadores incluem, mas não se limitam a, antígeno específico de próstata (PSA), prostasina, homólogo de caracol 2 (SLUG), protease transmembrânica, serina 2 (TMPRSS2), seis antígenos epiteliais transmembrânicos do membro 4 da família de próstata (STEAP4), proteína de ligação 5 FK506 (FKBP5) e orosomucoide 1/alfa-1-ácido glicoproteína 1 (ORM1). Em algumas modalidades, a expressão do gene induzível é avaliada na presença de um agonista AR. Em algumas modalidades, as células são colocados em contato com um agonista de androgênio antes ou simultaneamente com o composto de teste.
[00180] Em algumas modalidades, o nível de atividade de AR é detectado pela medição da expressão de uma ou mais genes endógenos que são reprimidos mediante a exposição a um androgênio ou a um agonista AR. Em algumas modalidades, um aumento na ou falha na repressão da expressão de uma ou mais genes reprimidos de androgênio após exposição ao composto de teste se comparado com um controle adequado indica que o composto de teste é eficaz para inibição do polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, o controle é uma expressão basal do gene antes da exposição da célula ao composto de teste. Genes reprimidos de androgênio exemplificadores incluem, mas não se limitam a, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), família carreadora de soluto 35 (SLC35F2/NOV), proteína de ligação IGF-3 e -5, proteína de ligação intensificadora de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 104/302
95/167
CCAAT-δ, fosfatase e homólogo de tensina deletado no cromossomo 10 (PTEN), IL-15, IL-18 e ERBB2/HER2. Em algumas modalidades, a expressão do gene reprimível é avaliada na presença de um agonista AR. Em algumas modalidades, as células são colocados em contato com um agonista de androgênio antes ou simultaneamente com o composto de teste.
[00181] Métodos para medir a expressão de genes endógenos são bem conhecidos no ARt. Métodos exemplificadores para a medição de expressão gênica incluem, mas não se limitam a métodos analíticos de proteína como, por exemplo, imunoistoquímica, imunoblotting (por exemplo, análise Western), cromatografia e métodos analíticos de ácidos nucleicos, por exemplo reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativa (qPCR), PCR em tempo real (RT-PCR), análise Northern.
[00182] Em algumas modalidades, a atividade de um polipeptídeo AR mutante é medida com o uso de um ensaio como, mas não se limitando a, um ensaio de ligação de coativador de AR (por exemplo, ensaios de imunoprecipitação, ensaios híbridos em dois, ensaios de transferência de energia de ressonância de Forster (fluorescência), por exemplo, ensaio de coativador de receptor de androgênio TR-FRET LanthaScreen™), um ensaio de perfilação de AR conformacional (consulte, por exemplo, Joseph et al. (2009) PNAS 106(29):12178 a 12183), um ensaio de ligação de DNA de AR (consulte, por exemplo, Roche et al. (1992) Mol. Endocrinol. 6(12):2229 a 35), imunoprecipitação de cromatina, ensaio de interação de terminal N/C (consulte, por exemplo, Hsu et al. (2005) Mol. Endocrinology 19(2) 350 a 361 e Ghali et al. (2003) J Clin Endocrinol Metab. 88(5):2185 a 2193).
[00183] Em algumas modalidades, um método para identificar compostos de inibidor de AR de terceira geração compreende selecionar um composto de inibidor de AR de terceira geração em potencial com
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 105/302
96/167 o uso de uma modelagem auxiliada por computador com uma estrutura de cristal tridimensional ou de solução de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante compreende uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde à posição de aminoácido 876 do polipeptídeo AR do tipo selvagem apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante não contém uma fenilalanina na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo AR mutante contém uma leucina na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o método compreende colocar o polipeptídeo AR mutante em contato com o composto de teste e detectar a interação do composto de teste com o polipeptídeo AR mutante. Em algumas modalidades, um composto de teste que interage com o polipeptídeo AR mutante é identificado como um composto de inibidor de AR de terceira geração candidato.
[00184] Em algumas modalidades, um composto de teste para uso nos métodos fornecidos é um membro de uma biblioteca de compostos. Em algumas modalidades, a geração de uma biblioteca de compostos de teste é por qualquer método adequado para a produção de compostos químicos. Uma biblioteca de compostos de teste se refere a um painel que compreende uma multiplicidade de compostos de teste. Uma abordagem exemplificadora para a síntese de bibliotecas moleculares de pequenas moléculas orgânicas foi descrita (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061). Em algumas modalidades, os compostos de teste aqui fornecidos são obtidos com o uso de qualquer uma das numerosas abordagens de métodos de biblioteca combinatória conhecidas no ARt incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase de solução ou fase de sólido paralelas solucionáveis espacialmente, métodos de biblioteca sintética que exigem desconvolução, o
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 106/302
97/167 método de biblioteca de uma microesfera um composto e métodos de biblioteca sintética com o uso de seleção por cromatografia por afinidade. A abordagem de biblioteca biológica é limitada a bibliotecas de peptídeos, enquanto que as outras quatro abordagens são aplicáveis a um peptídeo, oligômero não peptídeo ou bibliotecas de moléculas pequenas de compostos (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Outros métodos exemplificadores para a síntese de bibliotecas moleculares são encontrados no ARt, por exemplo em: Erb et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68-; e em Gallop et al. (1994); J. Med. Chem. 37:1233-. Em algumas modalidades, as bibliotecas de compostos são apresentadas na solução (por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412 a 421) ou em microesferas (Lam (1991) Nature 354:82 a 84), circuitos integrados (Fodor (1993) Nature 364:555 a 556), bactérias (patente US de Ladner n°5.223.409), esporos (Ladner USP '409), plasmídios (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865 a 1869) ou em bacteriófago (Scott e Smith (1990) Science 249:386 a 390); (Devlin (1990) Science 249:404 a 406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378 a 6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301 a 310). Em algumas modalidades, os polipeptídeos combinatórios são produzidos a partir de uma biblioteca de cDNA. Os compostos exemplificadores que podem ser submetidos à triagem quanto à atividade incluem, mas não se limitam a, peptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, moléculas orgânicas pequenas e bibliotecas de extrato de produto natural.
Inibidores de AR identificados através de métodos de triagem [00185] Os inibidores de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos de triagem aqui fornecidos são os moduladores de AR. Em algumas modalidades, o inibidor de AR de terceira geração inibe ou reduz pelo menos uma atividade de um polipeptídeo AR. As
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 107/302
98/167 atividades de AR exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, ligação de coativador, ligação de DNA, ligação de ligante, ou translocação nuclear. Em algumas modalidades, o inibidor de AR de terceira geração inibe uma atividade de um polipeptídeo AR em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% em comparação com a atividade do polipeptídeo AR na ausência do inibidor. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são agonistas inversos de AR, antagonistas de AR, degradadores de AR, moduladores de tráfico de AR e/ou inibidores de ligação ao DNA de AR. Em algumas modalidades, compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são agonistas inversos de AR. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são antagonistas de AR. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são degradadores de AR. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são moduladores de tráfico de AR. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são inibidores de ligação ao DNA de AR. Em algumas modalidades, o inibidor de AR inibe pelo menos uma atividade de um polipeptídeo AR de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o inibidor de AR inibe pelo menos uma atividade de um polipeptídeo AR mutante.
[00186] Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos tem mínima atividade pró-convulsiva e/ou mínimo impacto sobre o limiar de convulsão. Em algumas modalidades, o composto de inibidor
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 108/302
99/167 de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos exibe mínima modulação do canal de cloreto regulado por GABA. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos exibe mínima ligação ao canal de cloreto regulado por GABA. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos tem mínimo antagonismo do canal de cloreto regulado por GABA. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é um modulador de AR com mínima interação com um canal de cloreto regulado por GABA. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é um modulador de AR com mínima interação com o canal de cloreto regulado por GABAA. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos é um modulador de AR com mínima interação com o canal de cloreto regulado por GABAA e ou mínima penetração de barreira de sangue e cérebro. Os ensaios de GABA são conhecidos e incluem, mas não se limitam àqueles descritos em Ashok K. Mehta e Maharaj K. Ticku Characterization of the Picrotoxin Site of GABAA Receptors Current Protocols in Pharmacology (2000) 1.18.1-1.18.17; Copyright © 2000 por John Wiley & Sons, Inc., que está aqui incorporado por referência. [00187] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe a translocação nuclear de AR. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe a ligação de DNA de AR aos elementos de resposta de androgênio. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 109/302
100/167 dos métodos aqui fornecidos inibe o recrutamento de coativador em um promotor responsivo de AR. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos não exibe nenhuma atividade agonista em células de câncer de próstata que expressam excessivamente AR. [00188] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam AR de tipo selvagem. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam um AR mutante que tem uma mutação de F876L. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam o AR de tipo selvagem e um AR mutante que tem uma mutação de F876L. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam um AR mutante que tem uma mutação de T877A (por exemplo, tumores de xenoenxerto formados a partir de células de LNCaP). Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 110/302
101/167 inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam o AR de tipo selvagem e um AR mutante que tem uma mutação de T877A (por exemplo, tumores de xenoenxerto formados a partir de células de AR/LNCaP). Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos inibe o crescimento de modelos de xenoenxerto de câncer de próstata resistente à castração e sensível à castração que expressam um AR mutante que tem uma mutação de T877A e um AR mutante que tem uma mutação de F876L.
Composições farmacêuticas [00189] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos de triagem aqui fornecidos. Em algumas modalidades, é fornecido o uso de um inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos de triagem aqui fornecidos para a preparação de um medicamento.
[00190] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende um inibidor de AR de terceira geração também contém pelo menos um ingrediente inativo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende um inibidor de AR de terceira geração é formulada para injeção intravenosa, injeção subcutânea, administração oral ou administração tópica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende um inibidor de AR de terceira geração é um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um líquido, uma suspensão, um gel, um coloide, uma dispersão, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, uma pomada ou uma loção.
[00191] As composições farmacêuticas são formuladas de uma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 111/302
102/167 maneira convencional com o uso de um ou mais ingredientes inativos farmaceuticamente aceitáveis que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada é depende da via de administração escolhida. Um sumário de composições farmacêuticas descritas na presente invenção pode ser encontrado, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania 1975; Liberman, H.A. e Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999), aqui incorporados por referência para tal revelação.
[00192] São fornecidos neste documento: composições farmacêuticas, um inibidor de AR de terceira geração, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e pelo menos um ingrediente inativo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o inibidor de AR de terceira geração descrito na presente invenção é administrado como composições farmacêuticas em que o inibidor de AR de terceira geração é misturado com outros ingredientes ativos, conforme em terapia de combinação. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas incluem outros agentes medicinais ou farmacêuticos, carreadores, adjuvantes, agentes de prevenção, estabilização, umedecimento ou emulsificação, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Ainda em outras modalidades, as composições farmacêuticas incluem outras substâncias de valor terapêutico. [00193] Uma composição farmacêutica, como usado aqui, se refere a uma mistura do inibidor de AR de terceira geração ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com outros componentes químicos
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 112/302
103/167 (isto é, ingredientes inativos farmaceuticamente aceitáveis), tais como carreadores, excipientes, ligadores, agentes de preenchimento, agentes de suspensão, agentes flavorizantes, agentes colorantes, agentes de desintegração, agentes dispersantes, tensoativos, lubrificantes, corantes, diluentes, solubilizantes, agentes de hidratação, plastificadores, estabilizantes, intensificadores de penetração, agentes umectantes, agentes antiespuma, antioxidantes, preservativos ou uma ou mais combinações dos mesmos. A composição farmacêutica facilita a administração do composto a um indivíduo, tal como um mamífero.
[00194] Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar amplamente dependendo da severidade da doença, da idade e saúde relativa do indivíduo, a potência do composto usado e outros fatores. Os compostos podem ser usados de modo unitário ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, tais como componentes de misturas.
[00195] As formulações farmacêuticas descritas na presente invenção são administradas a um indivíduo através de vias de administração adequadas, incluindo, mas não se limitando às vias de administração oral, parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), intranasal, bucal, tópica, retal ou transdérmica. As formulações farmacêuticas descritas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, dispersões de líquido aquoso, dispersões autoemulsificantes, soluções sólidas, dispersões lipossômicas, aerossóis, formas de dosagem sólida, pós, formulações de liberação imediata, formulações de liberação controlada, formulações de derretimento rápido, tabletes, cápsulas, pílulas, formulações de liberação tardia, formulações de liberação estendida, formulações de liberação pulsátil, formulações multiparticuladas e formulações de liberação imediata e controlada misturadas.
[00196] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 113/302
104/167 compreende adicionalmente um ou mais agentes terapeuticamente ativos adicionais, incluindo, mas não se limitando a, corticoesteróides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticâncer, agentes antiinflamatórios, inibidores da quinase, inibidores de HSP90 e inibidores de desacetilase de histona (HDAC).
[00197] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido.
Métodos terapêuticos [00198] Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados com o uso dos métodos aqui fornecidos são administrados para o tratamento de uma doença ou afecção. Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos para tratamento de uma doença ou afecção dependente de AR mediado por AR em mamíferos que compreendem a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00199] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos que compreendem a administração de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) que tem uma doença ou afecção que é mediada por AR ou dependente de AR. Em algumas modalidades, é fornecido um uso de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos para a preparação de medicamentos para o tratamento de uma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 114/302
105/167 doença ou afecção que é mediada por AR ou dependente de AR. Em algumas modalidades, é fornecido um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos para o tratamento de uma doença ou afecção que é mediada por AR ou dependente de AR. Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) recebe, atualmente, um ou mais agentes terapeuticamente ativos adicionais além do composto de inibidor de AR de terceira geração.
[00200] Em algumas modalidades, sendo que o método compreende adicionalmente a administração de um ou mais agentes terapeuticamente ativos adicionais além de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapeuticamente ativos adicionais além de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos são selecionados dentre: hormônios, agonistas ou antagonistas receptores de hormônio, corticoesteróides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticâncer, agentes anti-inflamatórios, inibidores da quinase, inibidores de HSP90, inibidores de deacetilase de histona (HDAC). Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada antes de, simultaneamente, após ou de modo intermitente com o um ou mais agentes terapeuticamente ativos adicionais além do composto de inibidor de AR de terceira geração.
[00201] Em algumas modalidades, é administrado um agonista ou antagonista de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH) ao indivíduo em combinação com o composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido. Em algumas modalidades, um agonista receptor de GnRH, tal como leuprolida, bruserelina e goserelina é administrado a um indivíduo em combinação com o composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido. Os agonistas de receptor de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 115/302
106/167
GnRH geram um surto inicial na produção de hormônio (isto é, impacto clínico) seguido da inibição de produção de hormônio de lutenização, que, por sua vez, gera uma supressão de testosterona e dihidrotestosterona, da qual depende o crescimento continuado de células de câncer de próstata. Em algumas modalidades, é administrado um agonista ou antagonista de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH) ao indivíduo em combinação com o composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido para o tratamento de uma doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR, tal como um câncer de próstata, mama, bexiga ou câncer hepatocelular. Em algumas modalidades, é administrado um agonista ou antagonista de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH) ao indivíduo em combinação com um composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido para o tratamento de um câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Em algumas modalidades, é administrado um composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido ao indivíduo para reduzir ou inibir o surto inicial na produção de hormônio gerado pelo tratamento com um agonista receptor de GnRH. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado ante de, simultaneamente, após ou de modo intermitente com um agonista ou antagonista receptor de GnRH.
[00202] Em algumas modalidades, a doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR são hiperplasia de próstata benigna, hirsutismo, acne, adenomas e neoplasmos da próstata, células de tumor benignas ou malignas que contêm o receptor de androgênio, hiperpilosidade, seborreia, endometriose, síndrome do ovário policístico, alopécia androgênica, hipogonadismo, osteoporose, supressão de espermatogênese, libido, caquexia, anorexia, suplementação de androgênio para níveis de testosterona diminuídos em relação à idade, câncer de próstata, câncer de mama, câncer endometrial, câncer uterino, câncer
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 116/302
107/167 de bexiga, câncer de hepatocelular, afrontamentos e doença de Kennedy, atrofia muscular e fraqueza, atrofia cutânea, perda óssea, anemia, arterioesclerose, doença cardiovascular, perda de energia, perda de bem-estar, diabetes de tipo 2 ou acúmulo de gordura abdominal. Em algumas modalidades, a doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR é um câncer dependente de AR ou mediado por AR, tal como, por exemplo, um câncer de próstata, mama, bexiga ou fígado (isto é, hepatocelular).
[00203] Em algumas modalidades, estão descritos neste documento os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreendem a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer dependente de hormônio. Em algumas modalidades, o câncer dependente de hormônio é um câncer dependente de AR. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o método para o tratamento de câncer compreende, ainda, a administração, ao mamífero, de pelo menos um agente anticâncer adicional.
[00204] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar o câncer de próstata em um mamífero, em que o mamífero não recebeu um tratamento com um agente anticâncer. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que o mamífero não recebeu um tratamento com um composto quimioterapêutico.
[00205] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 117/302
108/167 de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que um ou mais agentes anticâncer foram administrados ao mamífero. Os agentes anticâncer exemplificadores incluem, mas não se limitam a, agentes terapêuticos hormonais, incluindo, mas não se limitando aos antagonistas de AR de primeira e segunda geração (por exemplo, bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) e RD162) e compostos que inibem a produção de hormônio (por exemplo, androgênio), tal como, por exemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona, compostos quimioterapêuticos, antimetabólitos, anticorpos anticâncer, cirurgia, radiação e terapia hipertérmica. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que um ou mais compostos quimioterapêuticos foram administrados ao mamífero. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que o mamífero foi tratado através de cirurgia. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que o mamífero foi tratado com radioterapia. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que o mamífero foi tratado com uma terapia hipertérmica.
[00206] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é usado para tratar um câncer de próstata em um mamífero, em que foram administrados ao mamífero um ou mais ciclos de tratamento
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 118/302
109/167 com um agente anticâncer.
[00207] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção de tratamento de câncer em um mamífero que compreendem a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um agonista inverso de AR, antagonista de AR, um degradador de AR, um modulador de tráfico de AR, um inibidor de ligação ao DNA de AR ou combinações dos mesmos.
[00208] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreendem a administração, ao mamífero, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um agonista inverso de AR.
[00209] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreende a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um antagonista de AR.
[00210] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreendem a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um dePetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 119/302
110/167 gradador de AR.
[00211] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreende a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um modulador de tráfico de AR.
[00212] Em algumas modalidades, os descritos na presente invenção são métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreende a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um inibidor de ligação ao DNA de AR.
[00213] Em algumas modalidades, estão descritos na presente invenção os métodos de tratamento de câncer em um mamífero que compreende a administração, ao mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos ou a sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto é um inibidor de síntese de proteína AR.
[00214] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata resistente à castração. Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente ao ARN-509. Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente à enzalutamida (MDV3100). Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente ao RD162. Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente ao acetato de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 120/302
111/167 abiraterona. Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente à galeterona (TOK001). Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um câncer de próstata resistente ao TAK-700.
[00215] As formulações farmacêuticas descritas na presente invenção são administráveis a um indivíduo em uma variedade de formas através de múltiplas vias de administração, incluindo, mas não se limitando às vias de administração oral, parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), bucal, tópica ou transdérmica. As formulações farmacêuticas descritas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, dispersões de líquido aquoso, dispersões autoemulsificantes, soluções sólidas, dispersões lipossômicas, formas de dosagem sólida, pós, formulações de liberação imediata, formulações de liberação controlada, formulações de derretimento rápido, tabletes, cápsulas, pílulas, formulações de liberação tardia, formulações de liberação estendida, formulações de liberação pulsátil, formulações multiparticuladas formulações de liberação imediata e controlada misturadas. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é administrado por via oral. Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é administrado de maneira intravenosa.
[00216] Em algumas modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é administrado topicamente. Em tais modalidades, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é formulado em uma variedade de composições administradas topicamente, tais como soluções, suspensões, loções, géis, pastas, xampus, esfoliantes, atritos, esfregaços, bastões de medicamento, bandagens de medicamento, bálsamos, cremes ou poma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 121/302
112/167 das. Tais compostos farmacêuticos podem conter solubilizantes, estabilizadores, agentes de intensificação de tonicidade, tampões e preservativos. Em um aspecto, o composto antiandrogênio identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é administrado topicamente à pele.
[00217] Em um outro aspecto o uso de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, distúrbio ou afecções em que a atividade de AR contribui para a patologia e/ou sintomas da doença ou afecção. Em um aspecto, a doença ou afecção é qualquer uma das doenças ou afecções especificadas na presente invenção.
[00218] Em qualquer dos aspectos anteriormente mencionados existem modalidades adicionais em que: (a) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos é, sistematicamente, administrada ao mamífero; e/ou (b) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada por via oral ao mamífero; e/ou (c) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada de maneira intravenosa ao mamífero; e/ou (d) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada através da injeção ao mamífero; e/ou (e) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada topicamente ao mamífero; e/ou (f) a quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração é administrada de maneira não sistemática ou localmente ao mamífero.
[00219] Em qualquer dos aspectos anteriormente mencionados existem modalidades adicionais que compreendem únicas administrações da quantidade eficaz do composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos, incluindo
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 122/302
113/167 modalidades adicionais em que (i) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado uma vez; (ii) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado ao mamífero múltiplas vezes ao longo de um dia; (iii) continuamente; ou (iv) constantemente.
[00220] Em qualquer dos aspectos anteriormente mencionados existem modalidades adicionais que compreendem múltiplas administrações da quantidade eficaz de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos, incluindo modalidades adicionais em que (i) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado constantemente ou de modo intermitente: como em uma dose única; (ii) o tempo entre múltiplas administrações é a cada 6 horas; (iii) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado ao mamífero a cada 8 horas; (iv) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado ao mamífero a cada 12 horas; (v) o composto de inibidor de AR de terceira geração é administrado ao mamífero a cada 24 horas. Em modalidades adicionais ou alternativas, o método compreende um período de descanso de fármaco, em que a administração do composto de inibidor de AR de terceira geração é temporariamente suspensa ou a dose do composto que é administrado é temporariamente reduzida; no fim do período de descanso de fármaco, a dosagem do composto é retomada. Em algumas modalidades, a duração do período de descanso de fármaco varia de 2 dias a 1 ano.
[00221] Além disso, são fornecidos métodos de redução da ativação de AR em um mamífero que compreendem a administração ao mamífero de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o método compreende a redução da ativação de AR nas células de próstata no mamífero. Em algumas modalidades, o método compreende a redução da ativação de AR em células que não são de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 123/302
114/167 próstata. Em algumas modalidades, o método de redução da ativação de AR compreende a redução da ligação de androgênios ao receptor de androgênio. Em algumas modalidades, o método de redução da ativação de AR compreende a redução de concentração de AR em uma célula.
[00222] Em alguns casos é revelado na presente invenção o uso de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças ou afecções que são dependentes de AR ou mediadas por AR. Em algumas modalidades, a doença ou afecção é um câncer de próstata. Em algumas modalidades, a doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR é descrito da presente invenção.
[00223] Em alguns casos é revelado na presente invenção o uso de um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos no tratamento ou prevenção de doenças ou afecções que são dependentes de AR ou mediadas por AR. Em algumas modalidades, a doença ou afecção dependente de AR ou mediada por AR é descrito da presente invenção.
[00224] Em qualquer uma das modalidades reveladas na presente invenção, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido é administrado a um ser humano.
[00225] Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração aqui fornecido é usado para diminuir, reduzir ou eliminar a atividade de AR.
[00226] Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados pelos métodos revelados na presente invenção são moduladores de AR seletivos. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados pelos
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 124/302
115/167 métodos revelados na presente invenção têm uma alta especificidade para o AR e têm atividades farmacológicas de seleção de tecido desejáveis. As atividades farmacológicas de seleção de tecido desejáveis incluem, mas não se limitam a, atividade de antagonista de AR em células de próstata e nenhuma atividade de antagonista de AR em células que não são de próstata. Em algumas modalidades, os compostos de inibidor de AR de terceira geração revelados na presente invenção são antiandrogênios que exibem atividade desprezível ou nenhuma atividade de agonista de AR.
[00227] Em algumas modalidades, são apresentados na presente invenção os compostos de inibidor de AR de terceira geração identificados pelos métodos revelados na presente invenção selecionada dentre os matabólitos ativos, tautômeros, solvatos farmaceuticamente aceitáveis, sais farmaceuticamente aceitáveis ou pró-fármacos de um inibidor de AR composto identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos.
[00228] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende os compostos de inibidor de AR de terceira geração é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, mas não se limitando a, corticoesteróides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticâncer, agentes antiinflamatórios, inibidores da quinase, inibidores de HSP90 e inibidores de deacetilase de histona (HDAC). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende os compostos de inibidor de AR de terceira geração é administrada em combinação com um agente anticâncer incluindo, mas não se limitando a, um agente terapêutico hormonal, incluindo, mas não se limitando aos antagonistas de AR de primeira e segunda geração (por exemplo, bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) e RD162), um composto que inibe a produção hormonal (por exemplo,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 125/302
116/167 androgênio), tal como um inibidor de CYP17A, incluindo, por exemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 ou acetato de abiraterona, compostos quimioterapêuticos, antimetabólitos, anticorpos anticâncer, cirurgia, radiação e terapia hipertérmica. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional é administrado na mesma composição. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional são administrados como composições separadas. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional são administrados simultaneamente, sequencialmente ou de modo intermitente. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional são administrados através da mesma via de administração. Em algumas modalidades, o composto de inibidor de AR de terceira geração e o agente terapêutico adicional são administrados através de diferentes vias de administração.
Kits/Artigos de fabricação [00229] Para o uso nas aplicações de diagnóstico e aplicações terapêuticas descritas na presente invenção, os kits e artigos de fabricação também são descritos na presente invenção. Tais kits podem compreender um carreador, embalagem ou recipiente que é compartimentalizado para receber um ou mais recipientes, tais como frascos, tubos e similares, sendo que cada um dos recipientes compreende um dos elementos separados a serem usados em um método descrito na presente invenção. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes são formados a partir de qualquer material aceitável incluindo, por exemplo, vidro ou plástico.
[00230] Em algumas modalidades, os kits aqui fornecidos são para o uso na detecção de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 126/302
117/167 mutante em um indivíduo ou para a detecção de um polipeptídeo AR mutante em um indivíduo (isto é, um kit de diagnóstico). Em algumas modalidades, os kits são empregados para selecionar pacientes para o tratamento com um antagonista de AR da terceira geração, para identificar os indivíduos como resistentes ou com a probabilidade de se tornarem resistentes a um antagonista de AR da primeira ou segunda geração, para monitorar o desenvolvimento de resistência a uma terapia de antagonista de AR da primeira ou segunda geração ou combinações dos mesmos. Os kits aqui fornecidos contêm um ou mais reagentes para a detecção do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo AR mutante, para a detecção de polipeptídeos mutantes de AR, para a detecção de atividade de AR em células do indivíduo ou combinações dos mesmos. Os reagentes exemplificadores incluem, mas não se limitam a, tampões, reagentes de PCR, anticorpos, substratos para o manchamento enzimático, cromogênios ou outros materiais, tais como lâminas, recipientes, placas de microtitulação e, opcionalmente, instruções para realizar os métodos. Os elementos versados na técnica irão reconhecer outros recipientes e placas e reagentes possíveis que podem ser usados para colocar os vários materiais em contato. Os kits podem, também, conter amostras de controle, tais como, por exemplo, ácidos nucleicos ou proteínas, tais como, por exemplo, um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido ou ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo AR mutante aqui fornecido. Em algumas modalidades, os kits contêm um ou mais conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeo para a detecção de expressão de gene androgênio endógeno.
[00231] Em algumas modalidades, o(s) recipiente(s) pode compreender um ou mais antagonistas de AR da primeira ou segunda geração ou compostos de inibidor de AR de terceira geração identificada pelos métodos descritos na presente invenção, opcionalmente, em uma composição ou em combinação com outro agente conforme reve
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 127/302
118/167 lado na presente invenção. O(s) recipiente(s) têm, opcionalmente, uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que têm um batente perfurável através de uma agulha de injeção hipodérmica). Tais kits compreendem, opcionalmente, um composto com uma descrição de identificação ou marcador ou instruções relacionadas ao seu uso nos métodos descritos na presente invenção.
[00232] Um kit irá compreender, tipicamente, um ou mais recipientes adicionais, sendo que cada um tem um ou mais dentre vários materiais (tais como reagentes, opcionalmente, sob a forma concentrada e/ou dispositivos) desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário para o uso de um composto descrito na presente invenção. Alguns exemplos não limitadores desses materiais incluem, mas não se limitando a, tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; Os marcadores de carreador, embalagem, recipiente, frasco e/ou tubo que listam os conteúdos e/ou instruções para o uso e insertos de embalagem com as instruções para o uso. Um conjunto de instruções também será, tipicamente, incluído.
[00233] Um marcador pode estar no recipiente ou associada ao mesmo. Um marcador pode estar em um recipiente quando letras, números ou outros caracteres que formam um marcador estiverem fixados, moldados ou gravados no recipiente em si; um marcador pode estar associado a um recipiente quando o mesmo estiver presente no interior de um receptáculo ou transportador que também prende o recipiente, por exemplo, como um inserto de embalagem. Um marcador pode ser usado para indicar que os conteúdos devem ser usados para uma aplicação terapêutica específica. O marcador também pode indicar as direções para o uso dos conteúdos, tais como nos métodos descritos na presente invenção.
[00234] São fornecidos artigos de fabricação, que incluem o materi
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 128/302
119/167 al de embalagem, um composto de inibidor de AR de terceira geração identificado com o uso dos métodos aqui fornecidos no material de embalagem e um marcador que indica que o composto ou composição ou sal farmaceuticamente aceitável, tautômeros, N-óxido farmaceuticamente aceitável, metabólito farmaceuticamente ativo, pró-fármaco farmaceuticamente aceitável ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos, são usados para reduzir, diminuir ou eliminar os efeitos dos receptores de androgênio ou para o tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas de uma doença ou afecção que se beneficiariam com uma redução ou eliminação de atividade de receptor de androgênio.
Produção de linhagens de célula resistentes ao antiandrogênio [00235] São fornecidos na presente invenção os métodos para a produção de linhagens de célula de câncer de próstata resistentes ao tratamento com um antagonista de AR. Em algumas modalidades, as linhagens de célula de câncer de próstata são resistentes ao tratamento com ARN-509. Em algumas modalidades, as linhagens de célula de câncer de próstata são resistentes ao tratamento com enzalutamida (MDV3100). Em algumas modalidades, as linhagens de células resistentes geradas pelo método fornecido expressam um nível superior de AR em comparação com a linhagem de célula parental usada para gerar a linhagem de célula resistente. Em algumas modalidades, as linhagens de células resistentes geradas através do método expressam cerca de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 vezes ou mais a quantidade de AR em comparação com a linhagem de célula parental. Em algumas modalidades, as linhagens de células resistentes expressam uma proteína mutante AR.
[00236] Em algumas modalidades, o método compreende colocar uma linhagem de células de câncer de próstata (isto é, linhagem de célula parental) em contato com um antagonista de AR e cultivar as
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 129/302
120/167 células durante um período de tempo predeterminado. Em algumas modalidades, o método compreende cultivar as células em concentrações crescentes do antagonista de AR durante um período de tempo predeterminado. Em algumas modalidades, a concentração do antagonista de AR fica na faixa de cerca de 0,1 pm a cerca de 100 pm, tal como, por exemplo, 1 pm a cerca de 10 pm. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em 0,8 pm, 1,5 pm, 3 pm e 6 pm do antagonista de AR. Em algumas modalidades, a concentração do antagonista de AR é aumentada em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes. Em algumas modalidades, a concentração do antagonista de AR é aumentada 3 vezes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença do antagonista de AR 1 dia, 2 dias, 3, dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses ou mais. Em algumas modalidades, as células são divididas e redispostas em placas a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada semana ou mais. Em algumas modalidades, os meios de cultura que contêm o antagonista de AR são renovados a cada dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, a cada semana ou mais. Em algumas modalidades, o antagonista de AR é um antagonista de segunda geração. Em algumas modalidades, o antagonista de AR é ARN-509. Em algumas modalidades, o antagonista de AR é enzalutamida (MDV3100).
[00237] Em algumas modalidades, a linhagem de células de câncer de próstata é uma linhagem de células de adenocarcinoma de próstata de ser humano. Em algumas modalidades, a linhagem de células de câncer de próstata é uma linhagem de células de LNCaP. Em algumas modalidades, a linhagem de células de câncer de próstata superexpressa o receptor de androgênio. Em algumas modalidades, a linhagem de células de câncer de próstata é LNCaP/AR(cs) ou
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 130/302
121/167
LNCaP/AR(cs)-Luc.
EXEMPLOS [00238] Esses exemplos são fornecidos apenas para propósitos ilustrativos e não limitam o escopo das reivindicações aqui fornecidas.
Exemplo 1: Geração de linhagem de células resistentes ao fármaco in vivo [00239] As linhagens de células resistentes ao tratamento com o composto anti-AR, ARN-509, foram geradas in vivo em camundongos portadores de tumores de xenoenxerto de adenocarcinoma de próstata de ser humano resistentes à castração (LNCap/AR(cs)). A linhagem de células de LNCaP/AR(cs) superexpressa o receptor de androgênio (AR) de 3 a 5 vezes ao longo da linhagem de células de LNCaP parentais de modo a imitar o câncer de próstata resistente à castração (Chen et al. (2004) Nature Medicine 10:33 a 39).
[00240] Os tumores de xenoenxerto de LNCaP-AR(cs) foram cultivados em camundongos Exogâmicos Sem pelo com seis SCID machos com semanas de idade castrados (SHO, Charles Rivers Laboratories). 1x106 células de LNCaP-ARcs em 50% de RPMI isento de soro e 50% de Matrigel™ foram injetadas subcutaneamente (100 pl/animal) no flanco direito de 10 camundongos de 3 a 5 dias após a castração. O tamanho do tumor foi monitorado diariamente. Quando os tumores alcançaram um volume médio de aproximadamente 200 mm3(aproximadamente 60 dias após a injeção), os animais iniciaram o tratamento com o veículo sozinho (n = 1) ou 30 mg/kg de ARN509 (n = 9) por regime de dosagem de QD (isto é, oralmente em 15% de TPGS de Vitamina E e 65% de uma solução de 0,5%, p/v, de carboximetilcelulose (CMC) em tampão de citrato 20 mM (pH 4,0)). Inicialmente, o tratamento com ARN-509 induziu a regressão de tumor. Após, aproximadamente, 75 dias de dosagem, um único tumor retomou o crescimento e progrediu para um tamanho maior que no início
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 131/302
122/167 do tratamento. Uma vez que o tumor resistente alcançou aproximadamente 800 mm3, o camundongo foi submetido à eutanásia e o tumor foi colhido. As células de tumor foram manualmente dispersadas através de homogeneização com uma seringa de 3 ml. As células de tumor foram cultivadas em RPMI mais 10% de SFB e 10 pm de ARN509. Uma linhagem de célula resistente foi gerada através de tal método.
Exemplo 2: Geração de linhagens de células resistentes ao fármaco in vitro [00241] As linhagens de células resistentes ao tratamento com os compostos anti-AR, ARN-509 e MDV3100, foram geradas in vitro com o uso de linhagens de células de adenocarcinoma de próstata de ser humano de LNCaP.
[00242] LNCaP (ATCC), LNCaP/AR(cs) (Guo et al. (2006) Cancer Cell 0:309 a 319) e LNCaP/AR-Luc (Tran et al. Science (2009) 324(5928):787 a 790; Ellwood-Yen et al. (2006) Cancer Res. 66:10513 a 10516) foram mantidos em RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB (Hyclone). As células de LNCaP (ATCC), LNCaP/AR(cs) ou LNCaP/AR(cs)-Luc foram cultivadas em concentrações crescentes tanto de ARN-509 quanto de MDV3100 ao longo de um curso de 6 meses. Inicialmente, 50 ml de células foram semeados em um conceptáculo de cultura de células 225 cm2 em uma concentração de aproximadamente 80,000 células/ml e cultivados em RPMI mais 10% de SFB na presença de 800 nm de ARN-509 ou MDV3100. O meio e o fármaco foram alterados semissemanalmente e as células foram subcultivadas em conceptáculos de cultura de células de 75 cm2 conforme necessário. A concentração de cada composto foi aumentada várias vezes de cerca de 1,5 pm a cerca de 6 pm conforme a taxa de crescimento das células tratadas com o fármaco aumentou até aquele das células de controle não tratadas. Após, aproximadamente, 6 meses de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 132/302
123/167 seleção de fármaco, as células foram mantidas em RPMI mais 10% de SFB e 6 μm de ARN-509 ou MDV3100. Após a seleção, 10 linhagens de células resistentes a ARN-509 e MDV3100 independentes foram obtidas. Duas linhagens foram derivadas a partir de células de LNCaP (ATCC) selecionadas na presença de ARN-509. Quatro linhagens de células foram derivadas a partir de LNCaP/AR(cs), duas após o tratamento com ARN-509 e duas após o tratamento com MDV3100. As células de LNCaP/AR(cs)-Luc foram usadas para derivar 4 linhagens de células resistentes, duas a partir de tratamento de ARN-509 e duas a partir do tratamento de MDV3100.
Exemplo 3: Ensaios de proliferação de resistência de fármaco de teste [00243] Os ensaios de proliferação celular foram realizados para testar a resistência das linhagens de células ao tratamento de ARN509 e o tratamento de MDV3100.
[00244] Os ensaios de proliferação foram realizados em todas as linhagens de células resistentes a ARN-509 e MDV3100 semeando-se 16 μl/cavidade de células em uma densidade de 50.000 células por ml em RPMI 1640 isento de vermelho de fenol (com 5% de CSS) em uma placa de cultura de célula de 384 cavidades (placas de 384 Cavidades tratadas com Black Polystyrene TC de Fundo Plano Transparente (Corning)) e incubados durante 2 dias a 37 °C. Para os ensaios de agonista, diluições semilogarítmicas de 11 pontos de cada composto foram feitas em meio de cultura e 16 μl de cada diluição foram adicionados às células. ARN-509, MDV3100 e bicalutamida foram executados a uma concentração final na faixa de 3,16 χ 10-5 M a 3,18 χ 10-10 M, enquanto a metiltrienolona de androgênio sintético (R1881) foi executada em uma faixa de concentração final de 3,16 χ 10-8 M a 3,18 χ 10-13 M. Para o ensaio de modo de antagonista, sendo que os compostos foram diluídos em meio de cultura que também contém 200 pm de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 133/302
124/167
R1881 (PerkinElmer, Waltham, MA) ([R1881] final = 100 pm) e, então, adicionados às células (16 μ^. Após 7 dias, 16 μl de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) foram adicionados diretamente às culturas de célula e Unidades de Luminescência Relativa (RLUs) medidas de acordo com as instruções do fabricante.
[00245] No ensaio de modo de agonista, a porcentagem de viabilidade das amostras foi calculada como: % de viabilidade = 100 X ([amostra de RLU-meio de RLU sem as células]/[células tratadas com RLU 1881-meio de RLU sem células]) (Tabela 1A). No ensaio de modo de antagonista, a porcentagem de viabilidade das amostras foi calculada como: % de viabilidade = 100 X ([amostra de RLU-RLU Dia 0]/[células tratadas com RLU R1881 - RLU Dia 0]) (Tabela 1B).
Tabela 1A. Ensaio de proliferação de agonista (% de viabilidade)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP 100,0 + + +
LNCaP/AR(cs) 100,0 + + +
Classe 1 100,0 ++ ++ ++
Classe 2 100,0 + ++ ++
'+' = < 30, '++' = > 30 [R1881] = 0,1 nm, [Antagonistas] = 10 μm
Tabela 1B. Ensaio de proliferação de antagonista (% de viabilidade)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP 100,0 + + +
LNCaP/AR(cs) 100,0 + + +
Classe 1 100,0 ++ ++ ++
Classe 2 100,0 ++ ++ ++
'+' = < 30, '++' = > 30 [R1881] = 0,1 nm, [Antagonistas] = 10 μm [00246] Nos ensaios de proliferação, tanto o ARN-509 quanto a enzalutamida foram antagonistas completamente proliferativos em todas
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 134/302
125/167 as três linhagens de células parentais de LNCaP (Tabela 1A, Figura 1A). As linhagens de células resistentes segregadas em duas classes distintas. Ao contrário de suas linhagens de células parentais, a primeira classe de células resistentes a ARN-509 e MDV3100 (Classe 1) prolifera na ausência de androgênios adicionados. O crescimento independente de ligante das células é inalterado na presença de ARN-509, MDV3100 ou bicalutamida. O androgênio sintético, R1881, inibe a proliferação nas células de classe 1 a altas concentrações. Tal atividade inibidora de crescimento de R1881 é antagonizada tanto através de MDV3100 quanto de ARN-509, indicando que o AR ainda pode ligar MDV3100 e ARN-509 em tais linhagens de células.
[00247] As linhagens de células resistentes de classe 1 incluem a uma linhagem de célula derivada do tumor de xenoenxerto de LNCaPAR(cs), as 2 linhagens de células derivadas da célula de LNCaP/AR(cs) selecionada na presença de ARN-509, as 2 linhagens de células derivadas de células de LNCaP/AR(cs) selecionadas na presença de MDV3100, as 2 linhagens de células derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc selecionadas na presença de ARN-509 e uma das linhagens de células derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc selecionada na presença de MDV3100.
[00248] A segunda classe de linhagens de células resistentes a MDV3100 e ARN-509 (Classe 2) permanece dependente de androgênio para o crescimento, de modo similar às suas linhagens de células parentais. Entretanto, ao contrário de sua atividade nas linhagens de células parentais, ARN-509 e MDV3100 podem estimular a proliferação nas linhagens de células de classe 2. A bicalutamida, entretanto, não estimulou a proliferação nas linhagens de células de classe 2. As linhagens de células resistentes da classe 2 incluíam as duas linhagens de células derivadas das células de LNCaP selecionadas na presença de ARN-509 (LNCaP ARN-509r1 e ARN-509r2 de LNCaP) e
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 135/302
126/167 uma das linhagens de células derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc selecionada na presença de MDV3100 (LNCaP ENZr2).
[00249] A atividade agonista parcial foi independente do composto utilizado para a seleção; O ARN-509 e a enzalutamida exibiram atividade agonista parcial em todas as três linhagens de células, Independentemente do composto usado para derivar as variantes de resistência. De maneira consistente com a atividade proliferativa, o ARN-509 ou a enzalutamida antagonizaram apenas parcialmente o crescimento dependente de androgênio de tais linhagens resistentes (Tabela 1B, Figura 1B, C).
Exemplo 4: Ensaios de repórter transcricional para resistência ao fármaco de teste [00250] Os ensaios de repórter transcriscional com o uso de elemento de resposta de ARE ligados operacionalmente a um generepórter foram realizados à resistência de teste das células para tratamento de ARN-509, MDV3100 e bicalutamida.
[00251] Os ensaios de repórter transcricional foram realizados em todas as linhagens de células resistentes semeando-se 100 pl de células em uma densidade de 250.000 células/ml em placas de cultura de célula de 96 cavidades em RPMI 1640 suplementado com 5% de soro submetido a stripping de carvão vegetal e que pode se fixar de um dia para o outro a 37 °C.
[00252] Com a exceção das células de LNCaP/AR(cs)-Luc que contêm um repórter responsivo ao androgênio integrado, as células foram transitoriamente transfectadas com o uso de Lipofectin® (Life Technologies) de acordo com o protocolo de fabricante. Para as células de LNCaP e LNCaP/AR(cs), as transfecções triplicadas foram realizadas com o uso de 428 ng de vetor de repórter (luciferase de pGL4 Pb (o promotor de probasina de rato em pGL4 (Promega, Madison, WI))), 50 ng de pRL-CMV (vetor de normalização, Promega, Madison, WI) e 0,7
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 136/302
127/167 μΙ de Lipofectin®. Após a transfecção, as células foram incubadas durante 4 horas.
[00253] As células foram, então, tratadas com os compostos de teste ARN-509, MDV3100 e bicalutamida. Para os ensaios de agonista, os compostos foram serialmente diluídos e 50 μl de composto mais RPMI 1640 mais 5% de SFB submetido a stripping de carvão vegetal foram adicionados ás células. Para os ensaios de antagonista, os compostos foram serialmente diluídos e 50 μl de composto com RPMI mais 3 nm de R1881 suplementados com 5% de soro submetido a stripping de carvão vegetal foram adicionados às células. Após uma incubação de 48 horas, o meio foi removido e as células foram lisadas em 40 μl de tampão de lise (Tris fosfato 25 mM, CDTA 2 mM, 10% de Glicerol, 0,5% de Triton X-100, DTT 2 mM). A atividade de luciferase de vagalume foi medida imediatamente após a adição de 40 μl de tampão de luciferase (tricina 20 mM, EDTA 0,1 mM, (MgCo3)4 Mg(OH)2*5H2O 1,07 mM, MgSO4 2,67 mM, DTT 33,3 mM, 270 μm de coenzima A, 470 μm de luciferina, 530 μm de ATP). A luciferase de Renilla foi medida após a adição de 40 μl de tampão de coelenterazina (NaCl 1,1 M, Na2EDTA 2,2 mM, KXPO4 0,22 M (pH 5,1), 0,44 mg/ml de BSA, NaN3 1,3 mM, 1,43 μm de coelenterazina, pH final ajustado a 5,0).
[00254] As duas classes de linhagens de células resistentes ARN509 e MDV3100 identificadas nos ensaios de proliferação também exibiram propriedades distintas nos ensaios transcricionais. Nos ensaios de transfecção temporária com o uso de repórteres de luciferase de pGL4 Pb ou nos ensaios com o uso do repórter de luciferase de probasina integrados (isto é, células derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc), ARN-509 e MDV3100 foram antagonistas eficazes nas células resistentes de classe 1 independentes de androgênio conforme evidenciado por uma diminuição na atividade de luciferase em relação aos con
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 137/302
128/167 troles sem tratamento (Tabela 2). A bicalutamida, entretanto, exibiu uma atividade agonista aumentada nas células resistentes de classe 1 em comparação com as células parentais. Nas células resistentes de classe 2, o MDV3100 foi um agonista parcial fraco no ensaio de repórter de luciferase de probasina, enquanto a bicalutamida e o ARN-509 não exibiram atividade agonista.
Tabela 2A. Ensaio de Repórter Transcricional de Agonista (% de Atividade Máxima)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP >90 + + +
LNCaP/AR(cs) >90 + + +
Classe 1 >90 ++ + +
Classe 2 >90 + ++ +
'+' = < 5, '++' = > 5 [R1881] = 10 nM, [Antagonistas] = 50 pm
Tabela 2B. Ensaio de Repórter Transcricional de Antagonista (%
R1881 de Atividade ARN-509
Bicalutamida MDV3100
LNCaP >90 + + +
LNCaP/AR(cs) >90 + + +
Classe 1 >90 ++ + ++
Classe 2 >90 + ++ +
'+' = < 5, '++' = > 5 [R1881] = 10 nM, [Antagonistas] = 50 pm
Exemplo 5: Ensaios trancricionais de gene endógeno [00255] Os efeitos do tratamento de R1881, MDV3100 e bicalutamida em transcrição de gene endógeno foram examinados.
[00256] Os ensaios transcricionais de gene endógeno foram realizados em todas as linhagens resistentes dispondo-se em placas 0,5 ml de células a uma densidade de 500.000 células/ml em placas de 24 cavidades em RPMI que contêm 5% de SFB submetido a stripping de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 138/302
129/167 carvão vegetal (de hormônio esgotado) e cultivando as células durante dias a 37 °C. As células foram, então, tratadas d urante 24 horas com nm de R1881, 30 pm de MDV3100 ou 30 pm de bicalutamida.
[00257] O RNA total foi isolado com o uso do kit de isolamento de RNA total Aurum™ (BIO-RAD, Hercules, CA). O RNA (1 pg) foi inversamente transcrito com o uso de kit de síntese cDNA iScript (BIORAD, Hercules, CA) para produzir cDNA. A PCR em tempo real foi realizada com o uso do instrumento de Applied Biosystems 7900HT e Master Mix de PCR SYBR Verde (Applied Biosystems, Foster City, CA). As reações de PCR foram realizadas em 6 pl de acordo com o protocolo de fabricante e um protocolo de termociclo de 95 °C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e 58 °C durante 1 minuto. A expressão do gene responsivo de androgênio (PSA, SLUG, TMPRSS2, STEAP4, FKBP5, ORM1, NOV, FASN, NKX3.1, AMIGO2, BDNF, CAMK2N1, HPGD, NCAPD3, PLD1) foi normalizada para expressão de GAPDH e expressou em relação ao tratamento de veículo da linhagem de célula parental. Os resultados de expressão relativa são fornecidos na Tabela 3A. Os iniciadores empregados para a PCR estão listados na Tabela 3B.
[00258] As atividades de agonista seletivas de composto e classe foram observadas em genes responsivos ao androgênio endógenos, porém, no contexto dos genes endógenos, a atividade transcricional de MDV3100 é mais evidente (Tabela 3). Nas células resistentes de classe 1, a bicalutamida exibe uma atividade transcricional robusta e o MDV3100 é um agonista transcricional fraco. Em contraste, nas linhagens de células resistentes de classe 2, a bicalutamida é um agonista transcricional fraco enquanto o MDV3100 exibe atividade transcricional agonista robusta nos genes testados.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 139/302
130/167
Tabela 3A. Atividade Transcricional de Gene Endógeno (Veículo de Dobra)
PSA SLUG TMPR SS2 STE- AP4 FKBP 5 ORM1 NOV
DMSO 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
R1881 ++ +++ ++ ++++ ++ +++ --
LNCaP Bicalutamida + + + + + - +
MDV3100 + + + - + + +
DMSO 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
LNCaP/ AR(cs) R1881 +++ +++ ++ ++++ ++ ++++ --
Bicalutamida ++ + + ++ + +++ +
MDV3100 + + + + + + +
DMSO 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
R1881 ++ +++ + ++++ +++ ++++ --
Classe 1 Bicalutamida + +++ + +++ ++ ++ +
MDV3100 + + + + + + +
DMSO 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
R1881 +++ +++ ++ ++++ +++ ++++ --
Classe 2 Bicalutamida + + + + + + +
MDV3100 +++ +++ ++ +++ ++ +++ -
[R1881] = 10 nM, [Antagonistas] = 30 pm
-- < 0,1, - = 0,1 - 1, + = 1 - 10, ++ = 10 - 50, +++ 50 - 500, ++++ > 500
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 140/302
131/167
Tabela 3B: Sequência de Oligonucleotídeo de PCR em Tempo Real Transcricional
Gene Sequência Iniciadora na Direção (5'-3') Sequência Iniciadora na Direção (3'-5')
AMI- GO2 AGAGACTCAGAGGCGACCAT (SEQ ID NO: 20) ATCAGCAAACACAGCAGCTC (SEQ ID NO: 21)
BDNF AGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAA (SEQ ID NO: 22) AGGCTCCAAAGGCACTTGACTACT (SEQ ID NO: 23)
CAMK2 N1 GACCAAGCGGGTTGTTATTGA (SEQ ID NO: 24) TGCCTTGTCGGTCATATTTTTCA (SEQ ID NO: 25)
FKBP5 CGGAGAACCAAACGGAAAGG (SEQ ID NO: 26) CTTCGCCCACAGTGAATGC (SEQ ID NO: 27)
HPGD ACAGCAGCCGGTTTATTGTGCTTC (SEQ ID NO: 28) TGGCATTCAGTCTCACACCACTGT (SEQ ID NO: 29)
NCAPD 3 ACCACTCACCATCATCTCAAGGCA (SEQ ID NO: 30) TGCTCTTCTTTGCCAGATCCTCGT (SEQ ID NO: 31)
NOV GCCTTACCCTTGCAGCTTAC (SEQ ID NO: 32) GAGCATGCTGTCCACTCTGT (SEQ ID NO: 33)
ORM1 CTTGCGCATTCCCAAGTCAGATGT (SEQ ID NO: 34) TTTCCTCTCCTTCTCGTGCTGCTT (SEQ ID NO: 35)
PLD1 GAGCCTGCTACAGATGGTCA (SEQ ID NO: 36) TGTCTACCAGCAGGACGAAG (SEQ ID NO: 37)
PSA CCTCCTGAAGAATCGATTCC (SEQ ID NO: 38) GAGGTCCACACACTGAAGTT (SEQ ID NO: 39)
SLUG TTTCTGGGCTGGCCAAACATAAGC (SEQ ID NO: 40) ACACAAGGTAATGTGTGGGTCCGA (SEQ ID NO: 41)
STEAP4 CGGCAGGTGTTTGTGTGTGGAAAT (SEQ ID NO: 42) AGAAGACACACAGCACAGCAGACA (SEQ ID NO: 43)
TMPRS TAGTGAAACCAGTGTGTCTG- AGCGTTCAGCACTTCTGAGG-
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 141/302
132/167
Tabela 3B: Sequência de Oligonucleotídeo de PCR em Tempo Real Transcricional
Gene Sequência Iniciadora na Direção (5'-3') Sequência Iniciadora na Direção (3'-5')
S2 CCCA (SEQ ID NO: 44) TCTT (SEQ ID NO: 45)
FASN CGCTCTGGTTCATCTGCTCTG (SEQ ID NO: 46) TCATCAAAGGTGCTCTCGTCTG (SEQ ID NO: 47)
NKX3.1 TGGAGAGGAAGTTCAGCCATCAGA (SEQ ID NO: 48) AGGAGAGCTGCTTTCGCTTAGTCT (SEQ ID NO: 49)
[00259] Em um experimento separado, a expressão de genes dos seguintes genes foi analisada nas células LNCaP, LNCaP/AR(cs), LNCaP/AR-Luc, LNCaP ARN-509r1, ARN-509r2 de LNCaP e LNCaP/AR-Luc ENZr2: PLD, CAM2KN, NOV, BDNF, AMIGO2, FASN, TMPRSS2, NKX3.1, PSA, FKBP5, HPGD, NCAPD3, SLUG, STEAP4 e ORM. As células foram cultivadas durante 3 dias em meio esgotado de hormônio após o tratamento com veículo, R1881 1 nM ou 30 pm de composto. A expressão de genes foi normalizada para GAPDH conforme descrito acima. Os resultados são apresentados nas Tabelas 4A e 4B.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 142/302
Tabela 4A. LNCaP. LNCaP/AR(cs) e transcrição de linhagem resistente
LNCaP LNCaP/AR(cs) LNCaP ARN-509r1
Gene Veículo ARN-509 ENZ R1881 Veícu- lo ARN- 509 ENZ R1881 Veículo ARN- 509 ENZ R1881
AMIGO2 1,00 1,12 1,20 0,68 1,00 0,72 1,13 0,54 1,00 0,62 0,99 0,21
BDNF 1,00 1,09 0,85 0,40 1,00 0,85 1,13 0,48 1,00 0,90 1,58 0,31
CAM2KN1 1,00 1,17 1,39 0,13 1,00 0,80 1,11 0,05 1,00 0,37 0,59 0,01
FASN 1,00 1,34 1,24 5,58 1,00 0,75 1,19 7,11 1,00 1,04 1,53 3,12
FKBP5 1,00 0,99 1,04 54,95 1,00 0,99 1,71 97,01 1,00 2,58 9,45 53,45
HPGD 1,00 1,48 1,78 100,43 1,00 1,18 2,01 183,55 1,00 2,36 10,20 61,39
NCAPD3 1,00 1,16 1,20 104,69 1,00 0,91 1,22 93,05 1,00 1,29 3,12 90,51
NKX3.1 1,00 0,90 1,66 30,06 1,00 1,13 2,51 8,82 1,00 6,54 11,55 8,11
NOV 1,00 1,73 2,57 0,15 1,00 1,04 1,27 0,04 1,00 1,40 1,39 0,03
ORM1 1,00 0,71 1,13 873,10 1,00 0,84 3,58 3444,31 1,00 15,89 205,07 1296,13
PLD1 1,00 1,09 0,70 0,02 1,00 1,04 0,65 0,02 1,00 0,33 0,24 0,03
PSA 1,00 0,66 1,69 47,84 1,00 1,43 2,69 19,16 1,00 32,67 57,68 85,63
SLUG 1,00 1,27 2,35 129,79 1,00 1,03 2,06 89,88 1,00 4,66 42,52 164,28
STEAP4 1,00 0,78 1,54 639,15 1,00 0,90 1,95 1314,23 1,00 3,03 32,22 1184,45
TMPRSS2 1,00 0,77 1,68 22,16 1,00 1,06 2,36 17,51 1,00 10,20 23,75 37,27
133/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 143/302
LNCaP ARN-509r2 de LNCaP
Gene Veículo ARN-509 ENZ R1881 Veícu- lo ARN- 509 ENZ R1881
AMIGO2 1,00 1,12 1,20 0,68 1,00 0,67 0,63 0,55
BDNF 1,00 1,09 0,85 0,40 1,00 1,04 0,77 0,47
CAM2KN1 1,00 1,17 1,39 0,13 1,00 0,46 0,38 0,02
FASN 1,00 1,34 1,24 5,58 1,00 0,98 0,93 4,82
FKBP5 1,00 0,99 1,04 54,95 1,00 8,00 3,41 48,50
HPGD 1,00 1,48 1,78 100,43 1,00 1,49 4,56 59,30
NCAPD3 1,00 1,16 1,20 104,69 1,00 1,13 1,35 54,95
NKX3.1 1,00 0,90 1,66 30,06 1,00 3,73 6,28 10,20
NOV 1,00 1,73 2,57 0,15 1,00 1,39 0,71 0,07
ORM1 1,00 0,71 1,13 873,10 1,00 3,94 23,75 625,99
PLD1 1,00 1,09 0,70 0,02 1,00 0,81 0,29 0,02
PSA 1,00 0,66 1,69 47,84 1,00 1,91 2,48 7,89
SLUG 1,00 1,27 2,35 129,79 1,00 1,31 9,58 77,17
STEAP4 1,00 0,78 1,54 639,15 1,00 1,45 4,69 377,41
TMPRSS2 1,00 0,77 1,68 22,16 1,00 3,07 4,86 15,14
134/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 144/302
Tabela 4B. Transcrição de LNCaP/AR-Luc e LNCaP/AR-Luc ENZr2
LNCaP/AR-Luc ENZr2 de LNCaP/AR-Luc
Gene Veículo ARN-509 ENZ R1881 Veículo ARN-509 ENZ R1881
AMIGO2 1,00 1,13 1,44 0,54 1,00 0,99 0,78 0,49
BDNF 1,00 1,17 1,08 0,18 1,00 0,56 0,44 0,12
CAM2KN1 1,00 1,13 1,51 0,11 1,00 0,65 0,57 0,11
FASN 1,00 1,08 1,40 3,48 1,00 1,72 1,20 4,44
FKBP5 1,00 1,16 1,46 20,82 1,00 2,46 3,03 23,43
HPGD 1,00 1,88 2,51 2,41 1,00 1,22 1,61 1,39
NCAPD3 1,00 1,09 1,33 17,27 1,00 1,38 1,39 31,12
NKX3.1 1,00 1,14 1,68 11,24 1,00 4,82 5,21 10,13
NOV 1,00 2,55 1,95 0,47 1,00 1,21 1,20 0,27
ORM1 1,00 1,27 1,39 7,89 1,00 15,24 17,88 347,29
PLD1 1,00 1,45 1,33 0,15 1,00 0,46 0,74 0,21
PSA 1,00 0,60 0,44 2,10 1,00 4,59 3,48 16,91
SLUG 1,00 1,13 2,73 48,84 1,00 5,98 12,30 160,90
STEAP4 1,00 0,88 1,23 20,25 1,00 1,66 4,38 79,89
TMPRSS2 1,00 0,74 1,35 3,46 1,00 4,44 4,23 7,73
135/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 145/302
136/167
Exemplo 6: Ensaios para mecanismos de resistência [00260] A matriz CGH, o perfil de expressão de mRNA e análise de sequências de tumores de câncer de próstata derivados de paciente, assim como muitos modelos de animal e in vitro implicam múltiplas trajetórias na progressão para o estado resistente à castração. Três das trajetórias mais comumente ativadas identificadas no câncer de próstata resistente à castração são as trajetórias PI3K, Raf e AR. Nesse exemplo, a fosforilação de Akt e Erk foi avaliada através de Western blot para avaliar os estados de ativação das trajetórias PI3K e Raf, respectivamente.
[00261] Para avaliar o modo de resistência ao fármaco nas linhagens de células de classe 1 e de classe 2, a análise Western foi realizada para avaliar os níveis de proteína AR e o estado de ativação de várias trajetórias de sinalização celular conhecidas por modular atividade de AR e comumente ativadas em câncer de próstata resistente à castração. A expressão relativa de AR, Akt, Akt fosforilada (Ser473), p44/42 MAPK (Erk1/2), p44/42 MAPK fosforilado (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), tubulina e actina foram determinados.
[00262] Para a análise Western, as células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 5% de soro submetido a stripping de carvão vegetal durante 3 dias. As células foram lisadas em tampão de radioimunopreciptação modificado (mRIPA; Tris 10 mM, NaCl 150 mM, 1% (v/v) de NP-40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, pH 7,4) que contém Coquetel Inibidor de Protase e Fosfatase onHalt™ (Thermo Scientific). A proteína total dos lisados clarificados foi quantificada através de Ensaio de Lowry (ensaio de proteína Biorad DC). O Agente de Redução de Amostra e Tampão de Amostra NuPAGE® LDS foram adicionados aos lisados e aquecidos até 70°C durante 10 minutos. 20 pg de proteína de célula total foram separados em 4 a 12% de Bis Tris Gel Acrilamida NuPAGE e transferidos para uma
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 146/302
137/167 membrana de nitro celuloses com o uso de um módulo de blot Xcell II™ (Invitrogen). As membranas foram incubadas em Tampão Bloqueador (LI-COR, Lincoln, NE) durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de incubações de 60 minutos com os anticorpos principais em relação ao Receptor de Androgênio (Santa Cruz Biotechnology cat. n°SC-816), Akt e Phospho-Akt (Ser473) (Sinalização de Célula cat. N°s 9272 e 4058, respectivamente), p44/42 MAPK (Erk1/2) e Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Sinalização de Célula cat. n°s 4695 e 4376s, respectivamente) e tubulina ou actina (Sigma cat. N°T6199 e A4700, respectivamente). Após a incubação com um IgG Conjungado de Cabra Anticamundongo ou de Coelho IRDye® (LICOR), as faixas de proteína foram quantificadas com o uso de um Sistema de formação de imagens de infravermelho Odyssey®.
[00263] Através de Western blot, os níveis de AR nas linhagens de células resistentes de classe 1 foram, aproximadamente, de 2 a 4 vezes superiores do que os observados na linhagem de células de LNCaP/AR(cs) (Figura 2). Sendo que análogo a um aumento de, aproximadamente, 3 vezes nos níveis de AR é suficiente para sustentar o crescimento de células de LNCaP em uma configuração castrada in vivo, a elevação adicional de 2 a 4 vezes nos níveis de AR pode ser suficiente para promover a proliferação na ausência de androgênios in vitro. Por outro lado, os níveis de AR das linhagens resistentes de classe 2 foram similares aos observados nas linhagens de células parentais. Dessa forma, a conversão de enzalutamida e ARN-509 em agonistas parciais nas linhagens de células de classe 2 de se deve à superexpressão de AR. As diferenças menos importantes no Akt e Erk total e fosforilados foram observadas sem nenhuma alteração consistente em nenhuma das classes de linhagens de células resistentes.
Exemplo 7: Determinação de sequência de AR mutante [00264] O MDV3100 e ARN-509 são agonistas transcricionais e
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 147/302
138/167 proliferativos nas linhagens de células resistentes de classe 2, enquanto a bicalutamida permanece uma antagonista. A expressão de AR nas células resistentes de classe 2 foi similar à linhagem de célula parental (Exemplo 6). Dessa forma, a sequência de AR em células resistentes de classe 2 foi determinada para verificar se uma mutação do domínio de ligação de ligante de AR promove o ganho de atividade de função. [00265] O cDNA gerado através de transcrição reversa de RNA isolado das células de classe 1 e classe 2 células (consulte o Exemplo 5) foi usado como um modelo para sequenciar o AR. Com o uso de diversos oligonucleotídeos, os segmentos sobrepostos que englobam o domínio de ligação de ligante de AR (c.2013 a 2757) foram gerados através de PCR com o uso de polimerase de Phusion® (New England Biolabs) com o uso do protocolo de fabricante. Os produtos de PCR foram purificados por gel para remover as faixas não específicas, assim como os oligonucleotídeos não incorporados. Os produtos de PCR purificados foram sequenciados com o uso de oligonucleotídeos internos.
[00266] Uma única mutação de ácido nucleico foi identificada no domínio de ligação de ligante de AR na posição de nucleotídeo 2626 em três linhagens de células independentemente derivadas. A mutação com troca de sentido identificada em todas as linhagens foi timina (T) para citosina (C) que converte fenilalanina (F) na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo codificado em leucina (L) (SEQ ID NO: 19). Adicionalmente, o sequenciamento de produtos de PCR subclonados individuais da linhagem de célula LNCaP/AR-Luc ENZr2 indicou que em todas as linhagens de células, a mutação de F876L surgiu no alelo de AR endógeno.
[00267] F876 repousa na hélice 11 em uma região de bolso de ligação de ligante de AR que é um ponto ativo para mutações de AR de
CRPC (Figura 1D). Entretanto, ao contrário de T877 e L701, que coorPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 148/302
139/167 denam a ligação ao hidrogênio para o grupo 17a-OH de dihidrotestosterona, o F876 contribui para um pequeno núcleo hidrofóbico formado por resíduos na hélice 11 (F786, L880), o laço entre as hélices 11 e 12 (F891) e a hélice 3 (F697, L701). Embora interações de resíduos e ligante hidrofóbico similares sejam conservadas no receptor de estrogênio e progesterona, o F876 não foi implicado em ligação de alta afinidade ou seletividade de esteróide. De modo consistente com o papel relativamente menor, é previsto que o F876 desempenhe uma função na ligação de esteróide, a mutação de AR de F876L não foi relatada em populações de câncer de próstata ou insensíveis ao androgênio.
Exemplo 8: Expressão do AR mutante em células com deficiência de AR [00268] Para confirmar que a mutação de F876L confere atividades agonistas ao ARN-509 e MDV3100, a mutação de ponto foi gerada no contexto do AR de tipo selvagem de comprimento completo e o receptor mutante de T877A de LNCaP. Os mutantes de F876L e F876L/T877A foram gerados no AR de pcDNA3 de plasmídeo com o uso do Kit de Mutagênese Sítio-Dirigida QuickChange II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) de acordo com o protocolo de fabricante.
[00269] Os ensaios de repórter transcricional com o uso de um elemento de resposta de ARE operacionalmente ligado a um generepórter foram realizados para testar a atividade transcricional do AR mutante em resposta ao tratamento de ARN-509, MDV3100 e bicalutamida.
[00270] Os ensaios de repórter transcricional foram realizados semeando-se 100 pl de células de HEPG2 a uma densidade de 250.000 células/ml em placas de cultura de célula de 96 cavidades em MEM suplementado com 10% de soro submetido a stripping de carvão vegePetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 149/302
140/167 tal e que puderam se fixar de um dia para o outro a 37 °C.
[00271] As células foram transfectadas de modo temporário com o uso de Lipofectin® (Life Technologies) de acordo com o protocolo de fabricante. As transfecções triplicadas foram realizadas com o uso de 378 ng de vetor de repórter (4X luciferase de ARE ou luciferase de pGL4 Pb (o promotor de probasina de rato em pGL4 (Promega, Madison, WI)), 50 ng de pcDNA-AR (de tipo selvagem ou mutante) 50 ng de pRL-CMV (vetor de normalização) e 0,7 pl de Lipofectin®. Após a transfecção, as células foram incubadas durante 4 horas.
[00272] Após a incubação, as células foram tratadas com os compostos de teste ARN-509, MDV3100 e bicalutamida. Para os ensaios de agonista, os compostos foram diluídos de 1:6 e 50 pl do composto em MEM mais 5% de SFB submetido a stripping de carvão vegetal foram adicionados às células para uma faixa de concentração final de 30 pm para 0,64 nM. Para os ensaios de antagonista, os compostos foram serialmente diluídos com R1881 1 nM (para AR de tipo selvagem) ou R1881 5 nM (para AR F876L).
[00273] Após uma incubação de 48 horas, o meio foi removido e as células foram lisadas em 40 pl de tampão de lise (Tris fosfato 25 mM, CDTA 2 mM, 10% de Glicerol, 0,5% de Triton X-100, DTT 2 mM). A atividade de luciferase de vagalume foi medida imediatamente após a adição de 40 pl de tampão de luciferase (tricina 20 mM, EDTA 0,1 mM, (MgCo3)4 Mg(OH)2*5H2O 1,07 mM, MgSO4 2,67 mM, DTT 33,3 mM, 270 pm de coenzima A, 470 pm de luciferina, 530 pm de ATP). A luciferase de Renilla foi medida após a adição de 40 pl de tampão de coelenterazina (NaCl 1,1 M, EDTA de Na2 2,2 mM, 0,22 M de KXPO4 (pH 5,1), 0,44 mg/ml de BSA, NaN3 1,3 mM, 1,43 pm de coelenterazina, pH final ajustado para 5,0).
[00274] Nos ensaios de transfecção temporária, os antagonistas de
AR de segunda geração, ARN-509 e MDV3100 induziram a atividade
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 150/302
141/167 transcricional dependente de AR no contexto do AR mutante de F876L ou F876L/T877A, enquanto a indução a partir de bicalutamida foi mínima (Tabela 5). Por exemplo, nas células de HepG2 com o uso tanto de uma luciferase de 4XARE quanto de repórter de luciferase de Pb, o ARN-509 e MDV3100, mas não a bicalutamida, induziram a atividade transcricional dependente de AR no contexto do AR mutante de F876L ou F876L/T877A. Isso indica que o mecanismo de resistência nas linhagens de células de classe 2 é o AR mutação de F876L.
Tabela 5 Atividade Transcricional de AR (DMSO de Dobra)
R1881 Bicalutamida MDV3100 (enzalutamida) ARN509
WT de AR +++ + + +
F876L de AR +++ + ++ ++
+ = < 20, ++ = 10 - 200, +++ > 200 [R1881] = 100 nM, [Antagonistas] = 6,3 pm [00275] Um segundo experimento foi realizado em 4X-Repórter de Luciferase de ARE para confirmar os resultados acima. Em tal experimento, os antiandrogênios de primeira geração, nilutamida e hidroxiflutamida, também foram comparados juntamente com a bicalutamida, o ARN-509 e enzalutamida. Os ensaios de repórter transcricional de AR foram realizados, essencialmente, conforme descrito acima com modificações mínimas. As transfecções triplicadas foram realizadas com o uso de 50 ng de AR de pCDNA3 ou AR mutante de pCDNA3, 65 ng de 4X Luciferase de ARE, 20 ng de pRL (Promega) e 25 ng de pCMX. Para os ensaios de agonista, os compostos foram serialmente diluídos e 50 pl do composto mais RPMI 1640 suplementado com soro submetido a stripping de carvão vegetal foram adicionados às células. Para os ensaios de antagonista, os compostos foram serialmente diluídos e 50 pl do composto com RPMI suplementado com soro submetido a stripping de carvão vegetal mais metiltrienolona (R1881) foram adicionados às células. A concentração final de R1881 usada nos ensaios
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 151/302
142/167 de antagonista foi de 1 nM com a exceção de F876L para o qual
R1881 5 nM foi usada.
[00276] Conforme mostrado na Figura 4, no contexto de AR de tipo selvagem, o ARN-509 e a enzalutamida foram antagonistas completos e com atividade agonista mínima nos ensaios de repórter transcricional responsivos ao androgênio de 4X-ARE. Entretanto, nas células que expressam o F876L de AR ou F876L/T877A de AR, a enzalutamida e o ARN-509 foram agonistas transcricionais parciais (Figura 4A). Por outro lado, os antiandrogênios de primeira geração, bicalutamida, nilutamida e hidroxiflutamida, exibiram mínima atividade agonista no mutante de F876L (Tabela 6, Figura 4) (Emax = porcentagem de resposta de R1881 máxima). A enzalutamida e o ARN-509 foram antagonistas completos em T877A, L701H, H874Y e W741C mutantes de AR que tanto conferem resistência aos antagonistas de AR de primeira geração quanto ampliam as especificidades de ligantes esteroidais em pacientes de CRPC.
Tabela 6
Ensaio de Repórter de 4X ARE
Composto IC de WT50 (μΜ) Emax de WT F876L IC50 (μΜ) Emax de F876L
ARN-509 0,79 ± 0,15 1,3 ± 0,3 0,09 ± 0,06 49,7 ± 11,1
Enzalutamida 1,12 ± 0,17 0,4 ± 0,1 0,13 ± 0,04 20,2 ± 5,2
Bicalutamida 1,65 ± 0,93 10,0 ± 2,9 3,63 ± 0,04 0,7 ± 0,3
Hidroxiflutamida 0,36 ± 0,04 28,9 ± 5,0 2,60 ± 6,61 0,8 ± 0,2
Nilutamida 1,11 ± 0,17 5,1 ± 2,1 7,59 ± 1,18 0,6 ± 0,1
[00277] Para testar a competência de ligação do DNA dos mutantes
F876L, as construções de fusão VP16-AR foram geradas. pVP16-AR foi gerado por subclonagem do AR humano inteiro em pVP16 (Clontech). As mutações de ponto AR foram geradas em VP16-AR com uso do kit QuickChange II Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), de acordo com o protocolo do fabricante.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 152/302
143/167 [00278] Os ensaios de transcrição foram realizados essencialmente conforme descrito acima. Transfecções triplicadas foram realizadas com uso de 35 ng de pVP16-AR ou pVP16-F876L, 70 ng de 4X ARELuciferase, 20 ng de pRL (Promega) e 35 ng de pCMX. A atividade repórter de 4X ARE-luciferase foi monitorada na presença de concentrações crescentes de compostos na ausência ou presença de 90 pM R1881 (para o VP16-AR do tipo selvagem) ou 1 nM R1881 (para F876L VP16-AR). A atividade de luciferase foi medida conforme descrito acima.
[00279] O refletivo do ensaio repórter transcricional, no ensaio de VP16-AR do tipo selvagem, que monitora a competência de ligação do DNA do receptor, enzalutamida e ARN-509 foram antagonistas completos (Tabela 7, Figura 4) (Emáx = resposta de R 1881 máxima porcentagem). Entretanto, no contexto do VP16-AR-F876L, ARN-509 e enzalutamida simularam a ligação de AR DNA. Dessa forma, a mutação de AR F876 para L foi suficiente para converter os antiandrógenos de 2a geração, enzalutamida e ARN-509, a agonistas parciais.
Tabela 7
AR-VP16
Composto IC de WT50 (μΜ) Emax de WT F876L IC50 (μΜ) Emax de F876L
ARN-509 0,16 ± 0,06 3,98 ± 0,27 0,03 ± 0,02 53,98 ± 1,45
Enzalutamida 0,21 ± 0,07 2,65 ± 0,73 0,05 ± 0,01 34,32 ± 5,38
Bicalutamida 0,18 ± 0,10 32,77 ± 5,76 2,51 ± 1,11 2,20 ± 1,35
Hidroxiflutamida 0,03 ± 0,01 42,28 ± 4,44 0,97 ± 0,27 5,36 ± 5,35
Nilutamida 0,13 ± 0,08 33,53 ± 9,75 2,12 ± 0,68 2,90 ± 1,80
Exemplo 9: Geração de linhagem de célu a estável
[00280] Nesse exemplo, as linhagens celulares foram geradas com expressão estável de AR F876L mutante. Os retrovírus pSRaF876L, pQCXIN-AR e pQCXIN-F876L foram primeiramente gerados por cotransfecção de células GP2-293 com pVSV-G (Clontech), de acordo
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 153/302
144/167 com o protocolo do fabricante.
[00281] As células PC3 que expressam de modo estável o tipo selvagem ou AR-F876L foram geradas por transdução de células PC3 com retrovírus pQXIN-F876L ou pQXIN-AR e seleção em meio RPMI 1640 que contém 500 pg/ml de gentamicina.
[00282] As células LNCaP que expressam de modo estável ARF876L foram geradas por transfecção de células LNCaP com pCDNAF876L ou transdução de células LNCaP com retrovírus SRaF876L. Os clones individuais de LNCaP/pCDNA-F876L foram isolados após seleção em 400 pg/ml de gentamicina. Agrupamentos de célula LNCaP/SRaF876L foram selecionados 400 mg/ml de gentamicina.
[00283] A expressão de proteína de AR de todas as linhagens celulares foi validada por análise western que usa o anticorpo AR N-20 (Santa Cruz Biotechnology).
Exemplo 10: Ensaios de ligação de AR de equilíbrio [00284] Os ensaios de ligação competitivos do tipo selvagem AR vs. F876L AR foram realizados conforme descrito em Clegg et al. (2012) Cancer pesquisa 72:1494 a 503 que usa células PC3 que expressam de modo estável AR humano do tipo selvagem ou AR-F876L, conforme descrito acima. Ki foi calculado como Ki = IC50/(1 + ([3HR1881]/Kd)), [3H-R1881] = 0,6 nM.
[00285] Em ensaios de ligação de AR de equilíbrio, ARN-509 e enzalutamida se ligaram ao mutante com afinidade 30 e 48 vezes maior, respectivamente (Tabela 8, Figura 5) (Kd para R1881: AR = 0,5 nM; AR-F877L = 0,64 nM). Dessa forma, a atividade agonista elevada em AR está associada à afinidade da ligação elevada tanto ao tipo selvagem quanto ao receptor F876L, sugerindo que a confirmação de agonista permite maior afinidade através de constante dissociação diminuída.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 154/302
145/167
Tabela 8
Composto Ligação de AR, WT K,· (nM) Ligação de AR, F876L K,· (nM)
ARN-509 18,07 ± 7,46 0,68 ± 0,15
Enzalutamida 26,30 ± 12,77 0,60 ±0,17
Bicalutamida 26,56 ± 12,51 360,36 ± 283,85
Hidroxiflutamida 14,56 ± 8,25 150,57 ± 55,10
Nilutamida 17,74 ± 5,65 197,42 ± 9,26
Exemplo 11: Expressão de genes-alvo AR e a proliferação de linhagens celulares de câncer de próstata estáveis F876L [00286] Conforme mostrado acima, a expressão de AR-F876L foi suficiente para conferir à enzalutamida e ao ARN-509 resistência in ensaios com base em repórter transitório. Nesse exemplo, os efeitos de F876L em genes-alvo AR endógenos e proliferação em células de câncer de próstata que expressam de modo estável que o mutante foi examinado. Duas linhagens celulares de LNCaP (LNCaP/SRaF876L e LNCaP/pCDNAF876L) foram projetadas conforme descrito no Exemplo 9 para superexpressar AR-F876L em níveis comparáveis ao modelo de LNCaP/AR(cs).
[00287] Para medir os níveis de AR nas células, os extratos de proteína foram gerados a partir de células LNCaP, LNCap/AR(cs), LNCaP/SRaF876L e LNCaP/pCDNAF876L cultivadas em meio com depleção de hormônio por 3 dias. Os níveis de proteína de AR foram analisados por western blot. Os níveis de AR foram quantificados e normalizados para actina e expressos em relação à expressão de AR em células LNCaP (Figura 6).
[00288] Para a análise de gene-alvo endógeno, as células
LNCaP/AR(cs), LNCaP SRaF876L, e LNCaP/pCDNAF876L foram cultivadas por 3 dias em meio com depleção de hormônio seguido de tratamento com veículo, 1 nM R1881 ou 1, 3, 10 e 30 μΜ ARN-509 ou enzalutamida na presença ou ausência em 1 nM R1881,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 155/302
146/167 [00289] Para os ensaios de proliferação, células LNCaP/AR(cs), LNCaP SRaF876L, e LNCaP/pCDNAF876L foram cultivadas na presença de meio com depleção de hormônio por 2 dias seguido de tratamento com ligando por 7 dias, conforme descrito acima. Para ensaios antagonistas, ARN-509 ou enzalutamida foi adicionado na presença de 200 pM R1881 (100 pM concentração final). A proliferação foi quantificada por CellTiter-Glo ensaio de viabilidade com base em luminescência, conforme descrito acima.
[00290] Em células LNCaP/AR(cs), ARN-509 e enzalutamida tiveram um pequeno efeito na indução de genes-alvo AR ou atividade proliferativa (Figura 7A, Tabela 9A). Ambos os antagonistas bloquearam a transcrição induzida de R1881 e a proliferação para níveis em consonância com sua atividade agonista na concentração maior (Figura 7B, Tabela 9B). Em contraste, em células que expressam F876L-AR, tanto a enzalutamida quanto ARN-509 demonstraram atividade agonista proliferativa e transcricional robusta (Figuras 7A e 7B, Tabelas 9C a 9F).
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 156/302
Tabela 9A. Transcrição de agonista LNCaP/AR(cs)
- R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,98 0,68 0,61 0,62 0,66 1,22 1,14 0,69 0,89 0,65 2,41
BDNF 1,00 0,86 1,04 0,92 0,88 0,95 0,98 1,15 0,93 1,03 1,03 1,80
CAM2KN1 1,00 0,04 0,80 0,70 0,71 0,64 0,64 0,90 0,76 0,99 0,78 1,56
FASN 1,00 4,12 0,47 0,32 0,29 0,31 0,58 0,46 0,40 0,42 0,41 1,30
FKBP5 1,00 100,51 0,91 0,62 0,75 0,61 0,85 0,99 0,71 0,91 0,75 1,87
HPGD 1,00 324,60 0,74 0,57 0,61 0,63 1,29 0,81 0,56 0,78 0,61 1,86
NCAPD3 1,00 95,54 0,66 0,57 0,47 0,56 0,79 0,72 0,74 0,73 0,74 1,34
NKX3.1 1,00 12,72 0,71 0,52 0,51 0,86 1,63 1,11 0,68 0,73 0,85 2,24
NOV 1,00 0,05 1,12 0,91 0,80 1,02 1,01 1,12 1,00 1,11 0,98 2,07
ORM1 1,00 6987,01 0,92 0,90 1,06 0,71 2,02 1,37 1,79 1,20 0,97 1,35
PLD1 1,00 0,03 0,77 0,62 0,63 0,56 0,56 1,28 0,66 0,88 0,65 1,33
PSA 1,00 22,14 0,42 0,32 0,38 0,74 1,60 0,44 0,49 0,58 0,61 1,13
SLUG 1,00 91,84 0,53 0,55 0,31 0,51 0,91 0,38 0,42 0,52 0,56 1,36
STEAP4 1,00 1498,46 0,75 0,73 0,52 1,16 1,28 0,94 0,77 1,05 0,56 1,01
TMPRSS2 1,00 35,42 0,75 0,53 0,63 0,89 1,45 0,99 0,64 1,04 0,62 2,78
147/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 157/302
Tabela 9B. Transcrição de antagonista LNCaP/AR(cs)
+ 1 nM R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,98 0,49 0,19 0,48 0,78 0,92 0,30 0,31 0,52 0,60 0,76
BDNF 1,00 0,86 0,61 0,28 0,63 0,99 1,12 0,43 0,35 0,67 0,74 0,88
CAM2KN1 1,00 0,04 0,04 0,06 0,27 0,50 0,56 0,04 0,06 0,19 0,43 0,42
FASN 1,00 4,12 1,30 0,42 0,71 0,46 0,59 1,92 1,52 1,08 0,60 0,64
FKBP5 1,00 100,51 23,51 5,64 3,32 1,41 1,50 33,14 22,49 12,56 2,74 1,08
HPGD 1,00 324,60 99,16 16,30 13,19 3,85 4,25 105,97 76,25 32,19 8,36 2,78
NCAPD3 1,00 95,54 23,74 4,35 3,14 1,29 1,27 43,93 32,00 15,57 2,39 0,96
NKX3,1 1,00 12,72 7,70 3,77 6,72 4,70 5,03 8,32 9,92 12,01 7,22 5,49
NOV 1,00 0,05 0,11 0,14 0,61 1,00 0,92 0,03 0,09 0,31 0,86 0,82
ORM1 1,00 6987,01 3521,95 503,02 257,85 43,91 22,70 5100,90 2679,73 1031,40 156,90 16,42
PLD1 1,00 0,03 0,02 0,02 0,13 0,42 0,54 0,02 0,02 0,04 0,11 0,32
PSA 1,00 22,14 22,76 8,82 11,75 6,59 5,65 19,09 21,75 23,57 12,90 7,20
SLUG 1,00 91,84 50,08 10,20 10,56 5,26 5,22 71,33 62,00 50,70 11,15 5,49
STEAP4 1,00 1498,46 585,81 109,37 74,44 13,61 7,79 1019,98 742,61 256,89 32,98 6,86
TMPRSS2 1,00 35,42 19,88 7,72 10,51 3,58 4,62 19,07 24,11 23,38 11,45 5,94
148/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 158/302
Tabela 9C. Transcrição de agonista LNCaP/SRaF876L
- R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,29 0,58 0,32 0,47 0,40 0,31 0,27 0,47 0,23 0,34 0,27
BDNF 1,00 1,65 1,04 1,30 1,01 0,99 1,55 0,79 1,07 0,75 0,84 0,94
CAM2KN1 1,00 0,03 0,52 0,48 0,38 0,23 0,37 0,30 0,24 0,17 0,21 0,18
FASN 1,00 3,76 0,50 0,64 0,58 1,09 1,34 0,64 1,01 0,93 1,50 2,77
FKBP5 1,00 66,89 1,38 1,14 2,54 9,61 23,67 2,66 5,95 5,56 13,02 27,89
HPGD 1,00 182,19 0,68 0,96 2,79 18,98 55,76 4,18 7,90 10,12 25,79 69,22
NCAPD3 1,00 31,69 0,77 1,01 1,09 3,56 8,83 1,39 1,58 1,69 3,53 9,35
NKX3,1 1,00 10,80 4,26 5,54 7,05 11,94 14,20 7,12 9,47 7,96 9,85 12,67
NOV 1,00 0,06 0,55 0,28 0,55 0,42 0,21 0,27 0,51 0,31 0,29 0,17
ORM1 1,00 6535,38 2,17 4,85 18,77 242,08 2114,41 44,44 58,96 101,45 459,30 1357,12
PLD1 1,00 0,02 0,67 0,76 0,60 0,42 0,41 0,49 0,44 0,30 0,45 0,36
PSA 1,00 3,43 1,95 2,25 3,02 4,05 5,02 3,71 3,26 3,00 5,07 5,16
SLUG 1,00 99,20 1,21 1,55 3,28 16,87 107,64 5,56 5,91 8,15 26,35 56,48
STEAP4 1,00 1706,02 1,13 2,15 9,98 96,53 343,81 20,36 27,49 46,06 187,24 479,64
TMPRSS2 1,00 25,55 3,11 3,85 5,39 9,20 18,61 6,36 6,29 5,84 10,90 14,20
149/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 159/302
Tabela 9D. Transcrição de antagonista LNCaP/SRaF876L
+ 1 nM R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,29 0,23 0,29 0,33 0,39 0,40 0,17 0,22 0,14 0,18 0,18
BDNF 1,00 1,65 0,53 0,64 0,62 0,51 0,71 0,74 0,76 0,57 0,50 0,63
CAM2KN1 1,00 0,03 0,08 0,12 0,19 0,24 0,32 0,03 0,03 0,06 0,11 0,17
FASN 1,00 3,76 1,29 1,22 0,85 0,94 1,58 2,23 2,03 1,39 1,30 2,66
FKBP5 1,00 66,89 17,90 14,89 10,21 17,33 40,52 36,57 39,48 26,46 29,94 22,71
HPGD 1,00 182,19 49,66 30,03 21,62 34,77 93,52 149,34 134,70 79,93 70,80 131,79
NCAPD3 1,00 31,69 6,34 4,28 2,21 3,44 13,64 19,83 15,47 8,71 6,50 11,82
NKX3,1 1,00 10,80 21,66 20,78 16,19 11,84 15,26 12,63 14,12 11,34 10,15 13,64
NOV 1,00 0,06 0,12 0,28 0,25 0,33 0,26 0,05 0,06 0,09 0,11 0,09
ORM1 1,00 6535,38 386,40 216,67 137,73 661,51 3496,87 3335,14 2343,29 1469,18 1608,16 3440,86
PLD1 1,00 0,02 0,04 0,08 0,14 0,37 0,48 0,01 0,01 0,02 0,08 0,20
PSA 1,00 3,43 5,84 5,63 4,47 4,54 4,64 4,93 4,38 4,59 5,28 4,17
SLUG 1,00 99,20 85,97 64,63 35,50 48,80 161,58 85,97 64,63 35,50 48,80 161,58
STEAP4 1,00 1706,02 259,94 147,25 83,20 275,88 645,04 259,94 147,25 83,20 275,88 645,04
TMPRSS2 1,00 25,55 14,05 13,81 11,78 12,92 20,19 14,05 13,81 11,78 12,92 20,19
150/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 160/302
Tabela 9E. Transcrição de agonista LNCaP/pCDNAF876L
- R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,92 1,28 0,82 0,87 0,72 0,91 1,07 0,86 1,25 0,60 1,55
BDNF 1,00 1,01 1,54 1,04 1,11 0,82 0,64 1,01 0,76 0,87 0,85 1,16
CAM2KN1 1,00 0,02 0,55 0,96 0,51 0,37 0,23 0,47 0,55 0,34 0,41 0,27
FASN 1,00 22,20 0,91 0,72 0,48 1,27 3,66 1,16 1,42 1,59 1,79 7,86
FKBP5 1,00 145,63 2,18 2,91 4,28 10,54 42,25 7,24 7,82 9,52 17,39 55,55
HPGD 1,00 854,42 4,70 6,32 13,26 26,78 105,81 15,36 19,27 29,25 47,33 173,82
NCAPD3 1,00 169,67 1,95 1,94 3,68 9,41 35,36 5,83 6,52 8,28 20,42 51,13
NKX3,1 1,00 9,67 3,76 3,71 3,57 4,69 8,12 6,07 5,72 5,93 7,05 11,69
NOV 1,00 0,08 1,73 1,62 2,19 0,88 0,49 1,24 1,01 0,82 0,86 0,72
ORM1 1,00 12816,69 116,91 195,36 659,73 2530,13 4760,77 932,41 1371,33 2307,29 3322,63 5541,08
PLD1 1,00 0,75 1,37 0,80 0,69 0,29 0,45 0,78 0,69 1,01 0,68 0,48
PSA 1,00 12,17 3,56 4,04 5,29 9,53 11,70 6,74 7,19 8,25 10,06 12,99
SLUG 1,00 268,77 1,99 3,53 4,74 14,91 55,93 7,84 8,70 10,91 21,21 71,08
STEAP4 1,00 3084,81 10,38 15,58 46,50 240,68 520,15 113,39 113,29 173,77 317,80 597,09
TMPRSS2 1,00 26,85 4,98 6,46 6,09 8,51 21,78 9,49 8,51 9,70 11,09 23,01
151/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 161/302
Tabela 9F. Transcrição de antagonista LNCaP/pCDNAF876L
+ 1 nM R1881
Enzalutamida ARN-509
Gene Veículo 1 nM R1881 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ 0,3 μΜ 1 μΜ 3 μΜ 10 μΜ 30 μΜ
AMIGO2 1,00 0,92 0,51 0,43 0,39 0,49 0,52 0,24 0,31 0,43 0,41 0,40
BDNF 1,00 1,01 0,59 0,71 0,53 0,50 0,41 0,28 0,41 0,42 0,45 0,34
CAM2KN1 1,00 0,02 0,05 0,16 0,17 0,21 0,14 0,01 0,02 0,06 0,11 0,06
FASN 1,00 22,20 5,29 2,44 1,55 2,08 4,22 3,89 5,52 3,22 2,10 3,98
FKBP5 1,00 145,63 53,18 26,29 10,03 14,22 32,97 45,69 48,95 38,89 24,82 30,26
HPGD 1,00 854,42 149,44 59,67 21,66 35,90 96,55 192,05 170,69 107,79 73,28 87,03
NCAPD3 1,00 169,67 101,65 31,49 14,34 16,69 42,06 68,41 90,52 62,27 22,96 44,10
NKX3,1 1,00 9,67 8,53 7,05 5,69 5,54 7,61 3,08 5,95 5,42 4,81 5,24
NOV 1,00 0,08 0,08 0,17 0,32 0,49 0,39 0,02 0,10 0,12 0,26 0,18
ORM1 1,00 12816,69 4375,20 1581,76 587,00 1377,92 3765,54 4802,10 4943,10 3366,19 2576,38 2470,99
PLD1 1,00 0,75 0,08 0,12 0,09 0,11 0,12 0,04 0,12 0,05 0,06 0,04
PSA 1,00 12,17 16,08 12,73 7,92 8,12 14,27 10,36 14,01 12,21 10,27 13,14
SLUG 1,00 268,77 166,04 86,01 30,23 36,56 98,34 112,06 134,56 113,34 69,55 85,38
STEAP4 1,00 3084,81 524,97 156,24 47,11 92,80 214,69 633,57 587,91 376,66 195,78 232,63
TMPRSS2 1,00 26,85 19,03 16,05 8,14 8,92 15,32 12,13 15,75 14,19 12,99 12,67
152/167
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 162/302
153/167
Exemplo 12: A interação de expressão de N e C de genes-alvo AR e a proliferação de linhagens celulares de câncer de próstata estáveis F876L [00291] A interação do amino-terminal AR com o AR carbóxiterminal é importante para a capacidade de transativação de AR completa. Muitos agonistas parciais e completos de AR estimulam a interação N-C dependente de AF2. Um ensaio de interação de dois híbridos N-C foi realizado para avaliar a interação dos C- e N-terminais de AR no F87L mutante na presença de ARN-509 e enzalutamida.
[00292] pM-AR1-660, pVP16-AR507-919 e pVP16-F876L507-919 foram gerados por subclonagem de produtos PCR apropriados a partir de pCDNA3-AR e pCDNA3-F876L em pM e pVP16 (Clontech). Para ensaios de interação de N-C terminal, transfecções triplicadas foram realizadas com uso de 50 ng pM-AR1-660, 75 ng pVP16-AR507-919 ou pVP16-F876L507-919, 25 ng pMH100-Luc e 10 ng pRL (Promega). As células transfectadas foram incubadas 4 horas, então, tratadas com ligando. ARN-509 e enzalutamida foram ensaiados em 8 μΜ e R1881 em 1 nM.
[00293] Em consonância com suas atividades transcricionais, enzalutamida e ARN-509 promoveram a interação N-C de AR-F876L, mas não do tipo selvagem AR (Figura 8). Dessa forma, a atividade agonista de ARN-509 e enzalutamida em AF-F876L é associada a um conformação AF-2 semelhante a agonista.
Exemplo 13: Ensaio de imunoprecipitação de cromatina de AR [00294] A ativação transcricional de genes-alvo AR regulados por androgênio exige a ligação de DNA induzida por agonista e subsequente recrutamento de correguladores transcricionais. Para confirmar os resultados de repórter VP16-AR que indicam que ARN-509 e enzalutamida estimulam a ligação de DNA AR-F876L, realizou-se a análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) de 6 genes-alvo AR a partir
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 163/302
154/167 de células tratadas com R1881 e/ou cada antagonista foi realizado. [00295] Os ensaios de ChIP foram realizados conforme descrito em Joseph et al. (2009) PNAS E.U.A. 106:12178 a 12183]. Brevemente, as células LNCaP/AR(cs) e LNCaP SRaF876L foram colocadas em placas em placas de cultura de 150 mm (7 x 106 células em 20 ml) em RPMI 1640 suplementado com 10% de CSS por 3 dias. As células foram tratadas com 10 μΜ de antagonista na presença ou ausência de 1 nM R1881 por 4 horas. Após o tratamento com ligando, o formaldeído foi adicionado aos meios a uma concentração final de 1%, incubado por 10 min e resfriado rapidamente com glicina (concentração final de 125 mM) por 5 minutos. As células foram lavadas 3X com PBS que contêm 1X Halt™ Protease & Phosphatase Single-Use Inhibitor Cocktail (1X PI, Thermo Scientific), peletizadas, lisadas em tampão de 1 ml RIPA (50 mM Tris pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% de NP-40, 0,5% Nadeoxicolato, 0,05% de SDS, 1 mM EDTA, 1X PI) e sonicadas até que o fragmento de tamanho de DNA médio foi de =500 bp. A cromatina reticulada sonicada foi diluída em 3,3 ml de RIPA e pré-limpa com 100 ml de pasta fluida de agarose A/G de proteína a 50% (SC-2003, Santa Cruz Biotechnology) que contém 200 mg por ml de DNA de esperma de salmão sonicado e 500 mg por ml de BSA. Um ml de cromatina pré-limpa foi, então, imunoprecipitado com 15 μg de anti-AR (SC-816, Santa Cruz Biotechnology) ou de IgG normal de coelho (SC-2027, Santa Cruz Biotechnology), por 2 horas a 4°C, e 100 ml de uma pasta fluida a 50% de cápsulas de agarose A/G de proteína foram adicionados e incubados de um dia para o outro a 4°C. As cá psulas foram lavadas 2 vezes sequencialmente em tampão com baixo nível de sal (50 mM HEPES pH 7,8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-100, 0,1% de Na-deoxicolato, 0,1% de SDS), tampão com alto nível de sal (o mesmo que o de baixo nível de sal com 500 mM NaCl), tampão de LiCl (20 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% de NP-40,
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 164/302
155/167
0,5% de Na-deoxicolato) e tampão de TE (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA). Todas as etapas de lavagem foram realizadas na presença de 1X PI. Complexos de proteína-DNA foram eluídos em 225 ml de tampão de Eluição (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% de SDS) a 65°C duas vezes por 15 minutos. Os complexos de proteína-DNA eluídos foram reticulados de modo reverso na presença de NaCl de um dia para o outro a 65°C e tratados adicionalmente com E DTA e proteinase K a 42°C por 1 hora. Os fragmentos de DNA foram purificados em 10 mM Tris pH 8,5 com uso do kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen), diluído e analisado por PCR em tempo real com uso de iTaq SYBR Green Supermix com ROX (Bio-Rad). As amostras foram amplificadas no instrumento ABI 7900HT. As sequências de iniciador de oligonucleotídeo são listadas na Tabela 8.
Tabela 8 Sequência de Oligonucleotídeo de PCR em tempo real de ChIP
Gene Sequência Iniciadora na Direção (5'-3') Sequência Iniciadora na Direção (3'-5')
PSA E2 ACCTGCTCAGCCTTTGTCT CTGAT (SEQ ID NO: 50) AGATCCAGGCTTGCTTACT GTCCT (SEQ ID NO: 51)
PSA D1 ATTCTGGGTTGGGAGTGCA AGGAA (SEQ ID NO: 52) AGGAGACATGCCCAGGATG AAACA (SEQ ID NO: 53)
STEAP4 ACTAGGCAGGACATTGACA TCCCA (SEQ ID NO: 54) ACAGTAAACCTCTCCACAC ATGGC (SEQ ID NO: 55)
FASN TATGACACCCAGGGCTTTC GTTCA (SEQ ID NO: 56) TAACGTTCCCTGCGCGTTT ACAGA (SEQ ID NO: 57)
TMPRS S2 TCCCAAATCCTGACCCCA (SEQ ID NO: 58) ACCACACAGCCCCTAGGAG A (SEQ ID NO: 59)
NKX3.1 ACAGGGTGGCCCAAATAGA AC (SEQ ID NO: 60) CCTGTCTTGGACAAGCGGA GA (SEQ ID NO: 61)
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 165/302
156/167
Tabela 8 Sequência de Oligonucleotídeo de PCR em tempo real de ChIP
Gene Sequência Iniciadora na Direção (5'-3') Sequência Iniciadora na Direção (3'-5')
ORM1 GGGTCATTTCCACCACCTC AAACA (SEQ ID NO: 62) GGAGAAAGGCCTTACAGTA GTCTC (SEQ ID NO: 63)
[00296] Nas células LNCaP/AR(cs), R1881 promoveu AR DNA (Fi-
gura 9). Em consonância com os dados de repórter VP16-AR, tanto ARN-509 quanto enzalutamida promoveram a ligação de AR DNA de células LNCaP/SRaF876L. Na presença de R1881, todos os antagonistas inibiram ligação de AR DNA simulada por R1881 a níveis em consonância com seu agonista parcial ou atividade antagonista em ambas as linhagens celulares (Figura Suplementar S9).
Exemplo 14: Efeitos in vivo de AR F876L [00297] Para determinar se a alteração de F876L transporta a resistência a enzalutamida e ARN-509 in vivo, as linhagens celulares de LNCaP que expressam de modo estável F876L AR foram injetadas (s.c.) em camundongos imunodeficientes castrados e com tumores estabelecidos.
[00298] Todos os estudos em animais foram realizados mediante protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais para Uso e Cuidado de Animais (Institutional Animal Care and Use Committees) e diretivas institucionais para o uso compassivo, apropriado de animais em pesquisa foram seguidas. Os experimentos de xenoenxerto In vivo foram realizados em camundongos machos exogâmicos sem pelos (SHO) SCID (Charles River Laboratories). Os camundongos foram orquiectomizados sob anestesia de isoflurano e foram dadas 7a 10 dias para recuperar. As células de LNCaP/AR(cs) ou LNCaP/SRaF876L (conforme descrito acima) foram suspensas em 50% de RPMI, 50% de Matrigel (BD Biosciences), e 3 χ 106 células/xenoenxerto foram injetadas em um volume de 100 pl. Os animais foram observados semanalmen
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 166/302
157/167 te até que o crescimento de tumor foi evidente. Após 40 a 60 dias pósinjeção, os animais foram selecionados aleatoriamente em coortes de faixa e meio de carga de tumor equivalente (150 a 250 mm3). Todos os compostos foram administrados diariamente por gavagem oral em uma dose de 30 mg/kg/dia de composto. Por todos os estudos de xenoenxerto LNCaP/AR(cs), estoques de fármacos ARN-509 e enzalutamida foram preparados em 18% de PEG-400, 1% de Tween-80 e 1% de povidona, e foram formulados por dosagem em 15% de Vitamina ETPGS e 65% de uma solução de CMC a 0,5% p/v em 20 mM de tampão de citrato (pH 4,0). A farmacocinética de ARN-509 e enzalutamida foi verificada ao final do estudo, conforme descrito previamente (Clegg et al. (2012) Cancer Research 72:1494-503).
[00299] Em consonância com os dados in vitro, nem ARN-509 nem enzalutamida 30 mg/kg/dia impactaram o crescimento de tumores LNCaP/AR/SRaF876L (Figura 10). Essa falta de atividade não foi uma função da exposição de composto inesperadamente baixa, visto que os níveis de fármaco no plasma no 28o dia foram quantificados e estavam em consonância com estudos prévios de xenoenxerto LNCaP/AR (Tabela 9). Além disso, em um experimento paralelo, ARN-509 30 mg/kg/dia exibiu atividade antitumor robusta no modelo LNCaP/AR(cs), em consonância com resultados prévios (Figura 10).
Tabela 9 Farmacocinética de Xenoenxerto de LNCaP/SRaF876L
Composto Dose C24 (Mg/ml) T1/2 (h) AUC0 a 24 (pg-h/ml) Cmax (Pg/ml) T max (h)
Enzalutamida 30 mg/kg 9,14 9,9 527,3 33,5 1,0
ARN-509 30 mg/kg 1,02 7,1 98,9 9,11 1,0
Exemplo 15: Estudo de validação de conceito de ARN-509, aberto, segurança de 1/2 fase e farmacocinética em pacientes com câncer de próstata resistente à castração avançado progressivo (CRPC) [00300] Nesse estudo, o DNA foi isolado a partir de 29 amostras de plasma de paciente, pacientes que participam em um tratamento de
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 167/302
158/167
ARN-509 de estudo clínico de 1/2 fase para câncer de próstata. Esses foram analisados com uso do método da tecnologia BEAMing com base em emulsão de PCR (Dressman et al. (2003) PNAS E.U.A.100:8817 a 8822). BEAMing foi usada com sucesso para detectar uma variedade de tumor derivado de mutações em oncogenes acionadores, tais como PIKC3a e K-ras em ctDNA derivados de plasma humano (Diehl et al. (2008) Nature Medicine 14:985 a 990). A mutação de AR F876L foi identificada em 3 das 29 amostras de paciente testadas.
[00301] O estudo clínico realizado foi em multi-instituição, primeiramente em homem, 1/2 Fase, em escalação de doses e estudo de validação de conceito através de 9 níveis de dose, em que pacientes elegíveis com CRPC avançado progressivo receberam doses orais de ARN-509 em uma base de pacientes externos para determinar a segurança, a farmacocinética (PK) e a evidência preliminar dos efeitos antitumor de ARN-509.
[00302] Pacientes com mCRPC foram determinados sequencialmente para níveis de dose em coortes de 3 a 6 pacientes por nível de dose com uso de critérios-padrão de escalação de doses 3x3.
[00303] O objetivo foi determinar a dose máxima tolerada (MTD) e/ou a dose da Fase 2 recomendada (RP2D) de ARN-509 que leva a uma toxicidade limitante de dose (DLT) em um máximo de 30% de pacientes. Uma DLT é definida geralmente conforme qualquer convulsão de Grau 1 ou maior, qualquer toxicidade não hematológica de Grau 3 a 4 (toxicidades GI precisam persistir em Grau 3 a 4, apesar da terapia médica máxima) e/ou toxicidade hematológica de Grau 4 de mais do que 5 dias de duração, definida por CTCAE V4,0, e que é verificada como relacionada ao tratamento com ARN-509. Um esquema do projeto de estudo é fornecido na Figura 11.
[00304] Os pacientes elegíveis que assinaram documentos de con
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 168/302
159/167 sentimento informado foram inicialmente inscritos em um coorte de escalação de dose em que os mesmos receberão uma dose oral única de ARN-509 seguida por um período de observação de uma semana (Semana PK). A dosagem contínua iniciou no Ciclo 1 dia 1, presumindo que nenhuma toxicidade não aceitável foi observada.
[00305] Um mínimo de 3 indivíduos em cada nível de dose foram monitorados por uma DLT através do dia 28 de Ciclo 1. Se nenhuma DLT foi observada nos primeiros 3 pacientes em cada nível de dose, a inscrição subsequente procedeu no próximo nível de dose. Se 2 ou mais pacientes experimentaram uma DLT em um dado nível de dose ou um único episódio de convulsão de qualquer grau foi observado em um dado nível de dose, a escalação de dose foi parada e a MTD foi definida conforme o nível de dose prévio. Se nenhuma DLT foi observada, a RP2D foi baseada na farmacocinética total e no perfil seguro de ARN-509 e na dose biológica ótima determinada a partir de dados pré-clínicos, e não necessariamente na MTD.
[00306] A dose inicial era de 30 mg/dia, com intensificações para 60 mg, 90 mg, 120 mg, 180 mg, 240 mg, 300 mg, 390 mg e 480 mg diariamente. Foi antecipado que esses níveis de dose amplificam a faixa de dose ativa farmacologicamente antecipada e que estão dentro da margem segura indicada pelos resultados de toxicologia pré-clínicos.
[00307] Após a seleção de 240 mg conforme a RP2D, pacientes elegíveis adicionais foram inscritos na porção da Fase 2 do estudo, que consiste em 3 coortes de expansão concomitantes na MTD e/ou RP2D para acumular informações adicionais de segurança e fornecer uma atividade antitumor de sinal inicial. Os três coortes de expansão incluíram:
[00308] 1. Virgem de tratamento de CRPC não metastático (50 pacientes com CRPC não metastático que são virgens de tratamento com quimioterapia e abiraterona);
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 169/302
160/167 [00309] 2. Virgem de tratamento de CRPC metastático (20 pacientes com mCRPC que são virgens de quimioterapia e abiraterona); e [00310] 3. Tratado com abiraterona para CRPC metastático (10 a pacientes).
[00311] Esperou-se que cada paciente com mCRPC receberia pelo menos 3 ciclos (12 semanas) de tratamento contínuo e que cada paciente com CRPC não metastático receberá pelo menos 4 ciclos (16 semanas) de tratamento contínuo. O tratamento foi descontinuado a qualquer tempo para a progressão da doença definida por protocolo ou toxicidade não aceitável. As avaliações do tumor foram realizadas a cada 3 ciclos (12 semanas) por pacientes com mCRPC e a cada 4 ciclos (16 semanas) por pacientes com CRPC não metastático. A segurança foi verificada a partir da primeira dose, através de pelo menos quatro semanas após a última dose ou até a resolução da toxicidade relacionada ao fármaco, ou quando a toxicidade é considerada irreversível, conforme foi mais longa. O efeito do alimento na absorção de ARN-509 e o efeito de ARN-509 na repolarização ventricular foram avaliados na fase de expansão da Fase 2 em sítios clínicos selecionados.
[00312] A análise das amostras com uso de tecnologia BEAMing no atual estudo clínico de ARN-509 foi realizada por Inostics GMBH. O sangue foi coletado em tubos a vácuo K2-EDTA e misturado de modo cuidadoso invertendo-se lentamente várias vezes. Dentro de 30 minutos de coleta, os tubos foram rotacionados em 2000 x g por 15 minutos. O plasma foi decantado, transferido para tubos de crioarmazenamento. Dentro de 90 minutos de decantação, o plasma foi armazenado a -70°C ou inferior até a análise. O DNA foi purifi cado a partir de 300 a 500 pl de alíquotas de plasma e extraído conforme descrito em Diehl et al. (2008) Nature medicine 14:985 a 990. A detecção de mutação foi realizada de acordo com a tecnologia BEAMing, conforme descrito em
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 170/302
161/167
Diehl et al. Brevemente, na etapa de PCR inicial, a região-alvo (0100 bp) foi ampliada com uso de iniciadores de gene específico com sequências de etiqueta e submetida a um iniciador que contém emulsão de PCR revestido de cápsulas magnéticas. Após a emulsão de PCR, a discriminação de cápsulas mutantes e do tipo selvagem foi realizada por hibridização de alelo específico após citometria de fluxo. Os resultados de citometria de fluxo foram analisados com uso de FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA) que resulta na quantificação da razão do alelo mutante sobre os alelos do tipo selvagem.
[00313] As amostras foram analisadas para a presença de AR do tipo selvagem ou 3 alelos mutantes de ponto único que poderia resultar em F876L (t2988c, c2990a, e c2990 g (ou t2626c, c2628a, e c2928 g, respectivamente, em relação à sequência de codificação de ácido nucleico AR apresentada na SEQ ID NO: 18). As mutações analisadas e a sensibilidade técnica do Método BEAMing são mostradas na Tabela 10. Por detecção, a frequência tem que ser acima da quantidade total de equivalente de genoma usado por ensaio. Por exemplo, se em uma amostra, 1.000 equivalentes genômicos estiverem presentes, ainda, a fração calculada de moléculas de DNA mutantes for 0,02% (1 alelo mutante em 5.000 alelos do tipo selvagem), as amostras são marcadas como do tipo selvagem.
Tabela 10. mudanças do nucleotídeo AR monitoradas por ensaio BEAMing
Posição do Nucleotídeo Mudança do Nucleotídeo Posição do Aminoácido Mudança do Aminoácido
c.2626 t > c 876 F>L
c.2628 c > A 876 F>L
c.2628 c > G 876 F>L
RESULTADOS
[00314] Um subconjunto de pacientes através de todos os grupos de dose exibiu resposta de PSA com 14/30 de pacientes exibindo na
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 171/302
162/167 semana 12 > 50% de declínio no PSA comparado ao nível basal. A resposta do PSA para os 29 pacientes classificados é representada na Figura 12. Amostras de plasma pré-tratamento e durante o tratamento foram analisadas. O tempo de análise de BEAMing é indicado pela extremidade terminal da linhagem de resposta do PSA. Dezoito fora dos 29 pacientes tiveram PSA acima do nível basal no tempo de análise que indica a resistência adquirida ou intrínseca para ARN-509.
[00315] Três provas foram projetadas para monitorar as 3 mudanças de nucleotídeos que podem codificar para a substituição de aminoácido F876L. Os experimentos de mistura de diluição com a sequência mutante e o DNA do tipo selvagem indicou uma sensibilidade técnica de 0,02% (potencial para detectar 1 sequência mutante dentre 5000 do tipo selvagem). Em uma exibição inicial de amostras de plasma de 29 pacientes tratados com ARN-509, a evidência da mutação foi detectada em 3 pacientes (Tabelas 11 e 12). No momento da análise de BEAMing, o Paciente 7 e 10 teve níveis de PSA acima do nível basal, enquanto que o Paciente 13 tem a evidência de aumento do PSA acima do tratamento nadir (Figura 13). Em todos os 3 pacientes, a mudança de nucleotídeo c2628a foi detectada. Em um desses 3 pacientes (Paciente 10) o t2626c mutante também foi detectada, indicativo de doença policlonal. As mutações de codificação de F876L não foram detectadas em qualquer uma das amostras pré-tratamento (0/29), que sugerem que, se presente antes do tratamento com ARN509, as mesmas estiveram abaixo do limite de detecção ou que as mutações se elevaram de novo durante o tratamento de ARN-509. Em qualquer cenário, os dados sustentam a hipótese de que o resultado seletivo de lesões que suportam o alelo mutante em níveis suficientes para detectar em ctDNA é dependente de exposição crônica a ARN509 e está associado ao aumento de PSA. Para estabelecer adicionalmente a associação de F876L com a doença progressiva, analisou
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 172/302
163/167 se as amostras de plasma tomadas em pontos de tempo adicionais a partir dos 3 pacientes marcados como positivos durante a exibição inicial (Tabela 12). No Paciente 10, a mutação não foi detectada no outro único ponto de tempo analisado (Ciclo 4; PSA 102% de T0). No Paciente 13, a mutação não foi detectada no Ciclo 4 (PSA 16,2 % de nível basal) ou no Ciclo 12 (o paciente foi marcado como positivo no Ciclo 11). A sequência mutante no Ciclo 11 foi no limite de detecção e é estimada para se elevar através da amplificação de uma única molécula mutante. Embora o PSA da Paciente 13 foi se elevando lentamente a partir do tratamento nadir no Ciclo 11 e 12, em ambos os pontos de tempo o PSA ainda estava >60% abaixo do início do estudo, e dessa forma, a resistência frank ainda não emergiu. A identificação da sequência mutante no limite de detecção provavelmente reflete a presença de um clone mutante, relativamente raro que teve potencial para se expandir sob pressão seletiva continuada e eventualmente acionar a doença progressiva.
[00316] Dada a duração relativamente longa do tratamento do Paciente 7, o plasma a partir de pontos de tempo adicionais durante a redução evidente de PSA; (> 90% de declínio a partir do nível basal; Ciclo 4, 8 e 10) e no aumento inicial de PSA inicial, a partir de seu nadir (Ciclo 15 e 19) (Figura 13) foi analisado. De modo interessante, as mutações não foram detectadas nas 3 amostras a partir do tratamento Ciclo 4, 8 e 10, enquanto que a mutação c2628a foi detectada nas 2 amostras analisadas a partir do aumento inicial de PSA (Ciclo 15 e 19). Esses dados clínicos estão em consonância com os dados préclínicos que indicam que a mudança de aminoácido F876L é suficiente para transportar a resistência para ARN-509.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 173/302
164/167
Tabela 11. Resultados BEAMing a partir de pacientes positivos para F876L
Paciente Ciclo de Tratamento* PSA [Percentual do dia 0] Chamada Genotípica Frequência de Mutante [cápsulas de mutante/w.t. x 100]
c2990a c2990g t2988c
7 0 100 Tipo Selvagem - - -
7 4 1,4 Tipo Selvagem - - -
7 8 3,3 Tipo Selvagem - - -
7 10 5,6 Tipo Selvagem - - -
7 15 41,2 Mutante 0,162 - -
7 19 97,2 Mutante 5,005 - -
7 22 281,0 Mutante 1,002 - -
10 0 100 Tipo Selvagem - - -
10 4 102 Tipo Selvagem - - -
10 7 245 Mutante 0,051 - 0,12
13 0 100 Tipo Selvagem - - -
13 4 16,2 Tipo Selvagem - - -
13 11 31,7 Mutante 0,065 - -
13 12 39,5 Tipo Selvagem - - -
* O ciclo de tratamento foi de 4 semanas; O ciclo 0 é ponto de tempo pré-tratamento.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 174/302
165/167
Tabela 12 F876L BEAMing primário de pacientes ARN-509-001
Paciente Resposta do PSA na semana 12 Análise de BEAMing Ciclo de Tratamento* PSA no Tempo de Análise de BEAMing [Percentual do Nível Basal] Chamada Genotípica do Nível Basal# Chamada Genotípica Durante o Tratamento
1 30,49 19 195,4 w.t. w.t.
2 -61,8 10 337,08 w.t. w.t.
3 22,7 4 122 w.t. w.t.
4 12,4 5 134 w.t. w.t.
5 -70,65 8 16 w.t. w.t.
6 -90,02 10 84,6 w.t. w.t.
7 -98,6 22 281 w.t. Mutante
8 -62,2 16 10,2 w.t. w.t.
9 26,38 7 185 w.t. w.t.
10 2,33 7 245 w.t. Mutante
11 -49,76 8 143,88 w.t. w.t.
12 -56,65 7 99,47 w.t. w.t.
13 -83,79 11 31,7 w.t. Mutante
14 -43,21 11 150,5 w.t. w.t.
15 164,14 3 220 w.t. w.t.
16 89,09 4 189 w.t. w.t.
17 -45,86 4 54,14 w.t. w.t.
18 -95,65 6 7,34 w.t. w.t.
19 -71,19 11 196,86 w.t. w.t.
20 -30,88 21 89,3 w.t. w.t.
21 -74,43 10 46,91 w.t. w.t.
22 -82,7 25 0,19 w.t. w.t.
23 97,78 8 222,46 w.t. w.t.
24 -74,86 25 4,89 w.t. w.t.
25 -30,07 12 161 w.t. w.t.
26 96,51 5 214,85 w.t. w.t.
27 -0,89 13 20,69 w.t. w.t.
28 -33,59 10 126 w.t. w.t.
29 -58,44 13 105 w.t. w.t.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 175/302
166/167
Exemplo 16: Método para a geração de linhagens celulares para triagem de fármaco [00317] Para identificar compostos que retêm a atividade antagonista de AR no contexto da mutação F876L do receptor de androgênio, um número de ensaios in vitro e in vivo, conforme descrito acima, foi adaptado.
[00318] Em uma configuração in vitro, ensaios de transcrição de transfecção temporários similares àqueles descritos no Exemplo 8 são usados para identificar compostos que são desprovidos de atividade agonista e antagonizam totalmente tanto o tipo selvagem, assim como a atividade transcricional de AR mutante F876L. As células HEPG2 ou qualquer célula eucariótica em que a transcricional atividade de AR pode ser monitorada são empregadas para essa exibição.
[00319] Como uma alternativa para a transfecção temporária, o repórter transcricional e F876L AR são integrados de modo estável em um número de linhagens celulares e usados para selecionar compostos. A integração estável do mutante F876L AR em uma linhagem de células da próstata sensíveis ao androgênio, tais como LNCaP, LaPC4 ou VCaP através do uso de plasmídio (isto é pCDNA3.1) ou integração baseada em viral permite que a seleção e avaliação de compostos em configuração transcricional, de proliferação e de xenoenxerto. Brevemente, o F876L AR é clonado em um vetor de expressão retroviral, tal como pQCXIP (Clontech, Mountain View, CA). O plasmídio resultante é, então, usado para gerar estoques virais de alta titulação para uso na geração de linhagens celulares estavelmente transduzidas, de acordo com o protocolo do fabricante. As linhagens celulares resultantes são usadas nos ensaios transcricionais de transfecção temporária, conforme descrito no Exemplo 4, ensaios transcricionais de gene endógeno, conforme descrito no Exemplo 5, ensaios de proliferação, conforme descrito no Exemplo 3 ou estudos de xenoenxerto, conforme descrito
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 176/302
167/167 no Exemplo 1.
[00320] Alternativamente, as células são modificadas adicionalmente pela integração estável de um repórter responsivo de AR, tal como Cignal Lenti AR Repórter (Qiagen, Valencia, CA) que permite a seleção de composto baseada em repórter, sem a necessidade de transfecção temporária.
[00321] Os exemplos e modalidades descritos no presente documento são para propósitos ilustrativos apenas e várias modificações ou mudanças sugeridas para pessoas versadas na técnica devem ser incluídas dentro do espírito e do alcance desse pedido e escopo das reivindicações anexas.
Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 177/302

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para determinar se um indivíduo é ou se tornará menos responsivo à terapia com um antagonista de receptor de androgênio (AR) de primeira ou de segunda geração, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) testar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR de um indivíduo para determinar se o polipeptídeo de AR codificado é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição 876 do aminoácido da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b1) tipificando o indivíduo como resistente ou se tornar resistente ao tratamento com um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, se o indivíduo tiver a modificação.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que foi administrado ao indivíduo um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração para o tratamento de um câncer, preferivelmente em que o câncer é câncer de próstata.
  3. 3. Método para otimizar a terapia de um indivíduo que recebe um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração para o tratamento de um câncer, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) testar uma amostra contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR de um indivíduo para determinar se o polipeptídeo de AR codificado é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição 876 do aminoácido da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) tipificando o indivíduo como:
    (i) um candidato para tratamento com um antagonista de terceira geração para o tratamento de câncer, se o indivíduo tiver a modificação ou a continuar o tratamento com um antagonista de AR de primeira geração; ou
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 178/302
    2/8 (ii) um candidato para o uso continuado do antagonista de
    AR de segunda geração se o indivíduo não tiver a alteração.
  4. 4. Método para selecionar um indivíduo para a terapia com um antagonista de AR de terceira geração, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) testar uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo para determinar se o polipeptídeo de AR codificado é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 876 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; e (b) caracterizar o indivíduo como um candidato para a terapia com um antagonista de AR de terceira geração se o indivíduo tiver a modificação.
  5. 5. Método para o rastreio de compostos que antagonizam um AR modificado, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) expressar um AR modificado em uma célula, em que o AR modificado é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição 876 do aminoácido da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1;
    (b) contatar a célula com um composto de teste; e (c) detectar o nível de atividade de AR na célula, em que uma diminuição da atividade indica que o composto antagoniza o receptor de AR modificado.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma substituição ou uma deleção do aminoácido na posição de aminoácido 876 no polipeptídeo de AR.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a modificação é uma substituição de fenilalanina por um aminoácido selecionado dentre leucina, isoleucina, valina, alanina,
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 179/302
    3/8 glicina, metionina, serina, treonina, cisteina, triptofano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR;
    preferivelmente, em que a modificação é uma substituição de fenilalanina por um aminoácido selecionado dentre glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR, ainda mais preferivelmente, em que a modificação é uma substituição de fenilalanina por leucina na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma deleção de ácido nucleico que codifica a posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de AR modificado tem:
    (a) uma mutação de timina (t) para citosina (c) em uma posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2626 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18; ou (b) uma mutação de citosina (c) para adenina (a) na posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2628 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18; ou (c) uma mutação de citosina (c) para guanina (g) na posição de ácido nucleico correspondente à posição de ácido nucleico 2628 na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 18.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que:
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 180/302
    4/8 (a) o ácido nucleico codifica leucina na posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR; e/ou (b) a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA ou DNA; preferivelmente em que o DNA é DNA genômico; e/ou (c) o método compreende adicionalmente isolar o mRNA da amostra de RNA; e/ou (d) o teste compreende amplificar o ácido nucleico que codifica a posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR; preferivelmente em que a amplificação é feita por reação em cadeia da polimerase (PCR); mais preferivelmente a amplificação por PCR compreende o uso de um par de iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiam a região que codifica a posição de aminoácido 876 do polipeptídeo de AR; e/ou (e) o método compreende sequenciar o ácido nucleico amplificado; e/ou (f) o teste compreende colocar o ácido nucleico em contato com uma sonda de ácido nucleico específica da sequência, em que a sonda de ácido nucleico específica da sequência:
    (i) se liga ao ácido nucleico que codifica um receptor modificado que é modificado na posição de aminoácido 876; e (ii) não se liga ao ácido nucleico que codifica o receptor de tipo selvagem que tem fenilalanina na posição de aminoácido 876.
  11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que:
    (a) a amostra é de uma amostra de célula de tumor do indivíduo; e/ou (b) a amostra é de uma amostra de biópsia de tumor, uma amostra sanguínea, uma amostra de soro, uma amostra de linfa, ou um aspirato de medula óssea; e/ou (c) a amostra contém células tumorais circulantes (CTC) ou
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 181/302
    5/8 células tumorais disseminadas (DTC); e/ou (d) o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração inibe um polipeptídeo de AR do tipo selvagem por antagonismo competitivo; e/ou (e) o antagonista de AR de segunda geração é selecionado dentre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) e RD162; e/ou (f) o indivíduo tem uma doença ou distúrbio selecionado dentre câncer, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio proliferativo.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem câncer, preferivelmente em que o câncer é um câncer de próstata, um câncer de mama, um câncer de bexiga ou um câncer hepatocelular; mais preferivelmente em que o indivíduo tem câncer de próstata; ainda mais preferivelmente em que o indivíduo tem um câncer de próstata resistente à castração.
  13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um tumor sólido.
  14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração antes da obtenção da amostra, preferivelmente:
    (a) em que a amostra é uma amostra obtida em 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 14 meses, 16 meses, 18 meses, 20 meses, 22 meses ou 24 meses após a primeira administração do antagonista de AR de primeira ou de segunda geração, e/ou (b) em que a amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes ao longo do curso do tratamento com o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração; e/ou
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 182/302
    6/8 (c) o indivíduo é responsivo ao tratamento com o antagonista de AR de primeira ou de segunda geração na primeira vez em que ele é administrado.
  15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 e 14, caracterizado pelo fato de que:
    (a) o composto de teste exibe atividade de antagonista completa para o receptor de AR modificado; e/ou (b) o composto de teste não exibe atividade de antagonista para o receptor de AR modificado.
  16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 e 14, caracterizado pelo fato de que:
    (a) a célula é deficiente para a expressão de AR do tipo selvagem, expressa um nível baixo de AR do tipo selvagem, ou expressa um receptor de AR modificado; e/ou (b) a célula é selecionada dentre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3, TSY-PR1, LNCaP, CWR, VCaP e LAPC4; e/ou (c) a célula compreende um gene-repórter ligado de maneira funcional a um promotor responsivo a androgênio, preferivelmente em que a atividade é determinada pela análise da expressão do generepórter; e/ou (d) o promotor compreende elemento de resposta a androgênio, preferivelmente em que o elemento de resposta a androgênio é 4xARE ou um elemento de probasina; e/ou (e) o promotor é uma probasina, um antígeno específico da próstata, MMTV LTR, FASN, STEAP4, TMPRSS2, ORM1, ou promotor de NKX3.1; e/ou (f) o gene-repórter codifica uma proteína selecionada dentre uma luciferase, uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, ou uma enzima.
    Petição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 183/302
    7/8
  17. 17. Sistema para a detecção de um AR modificado que é resistente à inibição com um antagonista de primeira ou de segunda geração de AR em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) uma amostra contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) um microarranjo que compreende o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR mutante ou uma sua porção que é modificado em uma posição de aminoácido correspondente à posição 876 do aminoácido da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
  18. 18. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o microarranjo está contido em um microchip.
  19. 19. Sistema para detectar um AR modificado que é resistente à inibição com um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) uma sonda de ácido nucleico específica da sequência, em que a sonda de ácido nucleico específica da sequência:
    (i) se liga ao ácido nucleico que codifica um AR modificado que é modificado na posição de aminoácido 876; e (ii) não se liga ao ácido nucleico que codifica o AR de tipo selvagem que tem fenilalanina na posição de aminoácido 876.
  20. 20. Sistema para detectar um AR modificado que é resistente à inibição com um antagonista de AR de primeira ou de segunda geração em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) uma amostra que contém uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de AR do indivíduo; e (b) um par de iniciadores de oligonucleotídeo que flanqueiPetição 870170061032, de 22/08/2017, pág. 184/302
    8/8 am a região de ácido nucleico que codifica o aminoácido 876 de um polipeptídeo de AR.
BR122017017921A 2012-07-27 2013-07-26 métodos e sistema para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio BR122017017921A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261676842P 2012-07-27 2012-07-27
US201361783763P 2013-03-14 2013-03-14
US201361829123P 2013-05-30 2013-05-30
BR112015001801A BR112015001801A2 (pt) 2012-07-27 2013-07-26 métodos e composições para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio
PCT/US2013/052395 WO2014018926A1 (en) 2012-07-27 2013-07-26 Methods and compositions for determining resistance to androgen receptor therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR122017017921A2 true BR122017017921A2 (pt) 2019-09-10

Family

ID=48948536

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122017017921A BR122017017921A2 (pt) 2012-07-27 2013-07-26 métodos e sistema para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio
BR112015001801A BR112015001801A2 (pt) 2012-07-27 2013-07-26 métodos e composições para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112015001801A BR112015001801A2 (pt) 2012-07-27 2013-07-26 métodos e composições para determinar a resistência à terapia de receptor de androgênio

Country Status (34)

Country Link
US (2) US9617602B2 (pt)
EP (2) EP3653733A1 (pt)
JP (3) JP6297556B2 (pt)
KR (2) KR20210012064A (pt)
CN (3) CN110845626A (pt)
AU (3) AU2013295543B2 (pt)
BR (2) BR122017017921A2 (pt)
CA (1) CA2879926A1 (pt)
CL (1) CL2015000194A1 (pt)
CO (1) CO7280477A2 (pt)
CR (1) CR20150022A (pt)
CY (1) CY1122651T1 (pt)
DK (1) DK2877599T3 (pt)
EA (2) EA035535B1 (pt)
EC (1) ECSP15007420A (pt)
ES (1) ES2764381T3 (pt)
GT (1) GT201500019A (pt)
HK (1) HK1211060A1 (pt)
HR (1) HRP20192342T1 (pt)
HU (1) HUE047781T2 (pt)
IL (2) IL236844B (pt)
LT (1) LT2877599T (pt)
MX (2) MX370507B (pt)
NI (1) NI201500004A (pt)
NZ (4) NZ740700A (pt)
PE (3) PE20150644A1 (pt)
PH (2) PH12015500175B1 (pt)
PL (1) PL2877599T3 (pt)
PT (1) PT2877599T (pt)
RS (1) RS59812B1 (pt)
SG (2) SG10201703254VA (pt)
SI (1) SI2877599T1 (pt)
UA (1) UA118178C2 (pt)
WO (1) WO2014018926A1 (pt)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2566750T3 (es) 2008-04-16 2016-04-15 The Johns Hopkins University Método para determinar el riesgo de recidiva de cáncer de próstata
EP2791128A4 (en) 2011-12-16 2015-04-22 Olema Pharmaceuticals Inc NOVEL BENZOPYRAN COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP2839028B1 (en) 2012-04-20 2016-12-28 Cepheid Methods of detecting bladder cancer
US10206911B2 (en) 2012-10-26 2019-02-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
EP3696276A1 (en) * 2013-02-25 2020-08-19 Novartis AG Novel androgen receptor mutation
WO2014138396A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Cepheid Methods of detecting bladder cancer
AU2014236135A1 (en) 2013-03-14 2015-09-10 Thomas Jefferson University Androgen receptor down-regulating agents and uses thereof
US9808472B2 (en) 2013-08-12 2017-11-07 Tokai Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for treatment of neoplastic disorders using androgen-targeted therapies
SG11201602249RA (en) 2013-10-18 2016-05-30 Deutsches Krebsforsch Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
JP6666254B2 (ja) * 2014-02-05 2020-03-13 レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー アンドロゲン受容体アンタゴニストの固体医薬組成物
US10774387B2 (en) 2014-05-19 2020-09-15 The Johns Hopkins University Methods for identifying androgen receptor splice variants in subjects having castration resistant prostate cancer
EP3186393A4 (en) * 2014-08-25 2018-01-10 The Johns Hopkins University Methods and compositions related to prostate cancer therapeutics
JP7088840B2 (ja) 2016-03-29 2022-06-21 エフ ホフマン－ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト 分析物データを受信するための受信機を作動する方法、受信機、およびコンピュータプログラム製品
CN106405085B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性***癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106290919B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性***癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106198985B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性***癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106526185B (zh) * 2016-10-28 2018-03-30 拜尔康(天津)医药科技有限公司 用于检测去势抵抗性***癌的elisa试剂盒及检测方法
PT3527210T (pt) 2016-12-16 2021-08-11 Kangpu Biopharmaceuticals Ltd Composição combinada que compreende um composto benzo-heterocíclico e um modulador da via dos recetores de androgénio e usos da mesma
TWI826395B (zh) * 2017-10-19 2023-12-21 耶魯大學 以藥草萃取物及其組成物抑制雄性素受體
CN108018342A (zh) * 2017-12-04 2018-05-11 合肥艾迪康临床检验所有限公司 检测ar基因突变的引物和方法
JP6993683B2 (ja) 2017-12-15 2022-01-13 東都興業株式会社 ビニールハウスにおけるシート押え紐の止め具
CN109115742A (zh) * 2018-09-05 2019-01-01 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种抗雄激素效应的检测方法
CN109321569B (zh) * 2018-10-29 2022-04-12 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种引物探针组合物及其应用
KR102473989B1 (ko) 2018-11-28 2022-12-07 (주)바이오니아 안드로젠 수용체 특이적 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 및 이를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물
CN114761003B (zh) * 2019-09-23 2023-12-29 冰洲石生物科技公司 具有雄激素受体降解活性的新型脲类及其用途
GB201914296D0 (en) * 2019-10-03 2019-11-20 Univ Oxford Innovation Ltd Treatment
WO2021110731A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Bayer Aktiengesellschaft Method for determining the response of prostate cancer patients to treatment with androgen receptor antagonists based on gene expression changes or super-enhancer protein-binding profiles
CN113533730B (zh) * 2021-07-23 2022-09-06 南方医科大学深圳医院 一种血浆外泌体标志物组合及其应用
WO2024001989A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. Compositions and methods for modulating molecules

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0714410A4 (en) 1993-07-26 1997-08-20 K O Technology Inc GENE ALTERNATIVE ALLEH INHIBITORS USED AS A BASE FOR THERAPEUTIC AGENTS AGAINST CANCER
US6200754B1 (en) 1998-03-19 2001-03-13 Variagenics, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes
GB0005689D0 (en) * 2000-03-09 2000-05-03 Schering Ag Crystal
US6960474B2 (en) * 2000-06-28 2005-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Method for the treatment of a condition remediable by administration of a selective androgen receptor modulator
NZ550102A (en) * 2004-02-24 2010-10-29 Univ California Methods and materials for assessing prostate cancer therapies and compounds (thiohydantoine derivatives)
ES2456990T3 (es) * 2007-11-26 2014-04-24 Santaris Pharma A/S Antagonistas basados en LNA dirigidos al receptor de andrógenos
EP2065474A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-03 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH A method to assess prognosis and to predict therapeutic response to endocrine treatment
US8133724B2 (en) * 2008-09-17 2012-03-13 University Of Maryland, Baltimore Human androgen receptor alternative splice variants as biomarkers and therapeutic targets
JP5631382B2 (ja) * 2009-04-03 2014-11-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 複合材料の製造方法
EP2490531A4 (en) * 2009-10-23 2013-06-19 Panacela Labs Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF ANDROGEN RECEPTOR POSITIVE CANCER

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017203385A1 (en) 2017-06-08
PE20190574A1 (es) 2019-04-22
AU2019201726B2 (en) 2021-04-01
SI2877599T1 (sl) 2020-03-31
IL265610A (en) 2019-05-30
CN104685072A (zh) 2015-06-03
WO2014018926A1 (en) 2014-01-30
JP6592545B2 (ja) 2019-10-16
IL265610B (en) 2021-03-25
EA201792520A3 (ru) 2018-08-31
JP6297556B2 (ja) 2018-03-20
SG10201703254VA (en) 2017-06-29
US20150252426A1 (en) 2015-09-10
NZ704487A (en) 2018-05-25
CN110845626A (zh) 2020-02-28
US9617602B2 (en) 2017-04-11
JP2018113968A (ja) 2018-07-26
LT2877599T (lt) 2020-01-27
RS59812B1 (sr) 2020-02-28
JP2015531590A (ja) 2015-11-05
CY1122651T1 (el) 2021-03-12
AU2017203385B2 (en) 2018-12-20
EA201792520A2 (ru) 2018-04-30
NZ742581A (en) 2020-02-28
AU2013295543A1 (en) 2015-02-05
US20170196840A1 (en) 2017-07-13
KR20210012064A (ko) 2021-02-02
CA2879926A1 (en) 2014-01-30
IL236844B (en) 2019-09-26
IL236844A0 (en) 2015-03-31
CL2015000194A1 (es) 2015-04-24
CN108048567A (zh) 2018-05-18
KR20150072399A (ko) 2015-06-29
UA118178C2 (uk) 2018-12-10
NZ744288A (en) 2020-04-24
WO2014018926A8 (en) 2014-04-10
EA201590290A1 (ru) 2015-06-30
ES2764381T3 (es) 2020-06-03
ECSP15007420A (es) 2016-01-29
BR112015001801A2 (pt) 2017-11-07
PH12018502500A1 (en) 2020-09-14
MX2015001209A (es) 2015-09-23
HUE047781T2 (hu) 2020-05-28
CR20150022A (es) 2015-04-30
EP2877599A1 (en) 2015-06-03
PL2877599T3 (pl) 2020-05-18
PH12015500175A1 (en) 2015-03-16
PE20190845A1 (es) 2019-06-17
MX2019015148A (es) 2020-02-19
JP2020072655A (ja) 2020-05-14
PE20150644A1 (es) 2015-05-11
DK2877599T3 (da) 2020-01-20
KR102210183B1 (ko) 2021-01-29
NZ740700A (en) 2019-07-26
EA035535B1 (ru) 2020-07-01
HRP20192342T1 (hr) 2020-04-03
GT201500019A (es) 2017-07-24
EP2877599B1 (en) 2019-10-23
AU2019201726A1 (en) 2019-04-04
EP3653733A1 (en) 2020-05-20
PH12015500175B1 (en) 2015-03-16
EA029563B1 (ru) 2018-04-30
SG11201500184TA (en) 2015-04-29
AU2013295543B2 (en) 2019-03-14
HK1211060A1 (en) 2016-05-13
PT2877599T (pt) 2020-01-24
MX370507B (es) 2019-12-16
CO7280477A2 (es) 2015-05-29
NI201500004A (es) 2015-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017203385B2 (en) Methods and compositions for determining resistance to androgen receptor therapy
Andersen et al. Regression of castrate-recurrent prostate cancer by a small-molecule inhibitor of the amino-terminus domain of the androgen receptor
JP7061068B2 (ja) 癌治療のための併用薬
ES2874875T3 (es) Procedimiento de tratamiento de adenocarcinoma de pulmón
JP2017509631A (ja) エストロゲン受容体突然変異体を調節する方法及び組成物
CA3063614A1 (en) Compositions and methods for treating cancer with atypical braf mutations
Woo et al. Novel heterozygous mutations of NR5A1 and their functional characteristics in patients with 46, XY disorders of sex development without adrenal insufficiency
Dauki Targeting Androgen Receptor Signaling in Hepatocellular Carcinoma
Porter The dynamic role of the androgen receptor (AR) and ABL interactor-1 (ABI1) axis in prostate cancer
Robey et al. ABCG2, THE BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN (BCRP)
AU2022354149A1 (en) Cyp11a1 inhibitor for use in the treatment of prostate cancer
Shah Regulation of the glucocorticoid receptor in prostate cancer disease progression and resistance to anti-androgen therapy
Watkins A new pathway in the induction of breast cancer
Centenera Characterisation of a dominant negative androgen receptor in prostate cancer cells.
NZ725576B2 (en) Method of treating lung adenocarcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL.MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL.