BR112021008800A2 - Método de produção de uma cultura de suspensão de célula de planta para isolamento de protoplastos, cultura de suspensão de célula de planta, protoplasto, método de obtenção de um protoplasto de uma planta e cultura de suspensão de célula de soja derivada de folha - Google Patents

Abstract

método de produção de uma cultura de suspensão de célula de planta para isolamento de protoplastos, cultura de suspensão de célula de planta, protoplasto, método de obtenção de um protoplasto de uma planta e cultura de suspensão de célula de soja derivada de folha. a presente descrição revela novos métodos para a preparação de culturas de suspensão de células de planta derivadas de folhas. as culturas de suspensão de células produzidas pelos métodos proporcionam uma fonte renovável e eficiente de protoplastos para transformação de alto rendimento e outros usos. os requerentes descobriram surpreendentemente que os protoplastos podem ser obtidos a partir das culturas de suspensão de células com enzimas de degradação de parede celular baratas e que os protoplastos proporcionam eficiências de transformação aumentadas em relação aos protoplastos de outras fontes.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CULTURA DE SUSPENSÃO DE CÉLULA DE PLANTA PARA ISOLAMENTO DE PROTOPLASTOS, CULTURA DE SUSPENSÃO DE CÉLULA DE PLANTA, PROTOPLASTO, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UM PROTOPLASTO DE UMA PLANTA E CULTURA DE SUSPENSÃO DE CÉLULA DE SOJA DERIVADA DE FOLHA REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade de pedidos provi- sórios dos EUA Nº de série 62/755.642 depositado em 5 de novembro de 2018 Nº de série 62/807.907 depositado em 20 de fevereiro de 2019, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é incorporada aqui por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 4 de novembro de 2019, chama-se SULTANA_P13090WO00_SEQ_LIS- TING_ST25.txt e tem 5.529 bytes.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Esta invenção refere-se ao campo de biotecnologia ve- getal. Em particular, esta invenção refere-se a métodos para a preparação de culturas de suspensão de células de planta bem como o uso de tais culturas de suspensão de células como um fonte renovável e eficiente fonte de protoplastos para transformação e ensaios transientes de alto rendimento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A soja é uma importante cultura oleaginosa que é cul- tivada para alimentação, alimentação animal, biocombustíveis, e outros usos industriais. Em termos de cultivo mundial de varie- dades geneticamente modificadas, a soja ocupa a maior área de terra de todas as espécies agrícolas. Enquanto a transformação de soja é genótipo dependente com respeito a eficiência e a facilidade, muito esforço tem sido feito para permitir o estudo de genética reversa nas espécies, mas isso fica para trás de muitas outras culturas. Várias metodologias de transformação tem sido desenvolvidas, incluindo aquelas usando embriões imaturos e sementes maduras como explantes para introdução de transgenes por Agrobacterium tumefaciens e biolística.

[0005] Dado o nível de esforço e tempo necessário para a transformação estável da soja, outras espécies dicotiledôneas fáceis de transformar, como Nicotiana benthamiana, Arabidopsis e Nicotiana tabacum, têm sido empregadas como substitutas para estimar a expressão e a utilidade do transgene nas folhas da soja. Enquanto estes representantes são considerados para ser sub-ótimos-a-minimamente relevantes a soja como uma cultura, a produção de raízes capilares através de Agrobacterium rhizogenes é rotineiramente realizada nos estudos funcionais de genômica da soja; que é, no entanto, de trabalho intensivo e apenas relevante para traços de raiz.

[0006] Genômica da soja, biotecnologia e biologia sintética se beneficiaria do desenvolvimento de um sistema fácil para aná- lise de alto rendimento de elementos genéticos; de ambas as origens endógena e sintética. Protoplastos de planta têm longo sido considerado como representantes de espécies relevantes para o rastreamento de sequência de DNA de função em relação à síntese de parede celular, expressão genética, e a transdução do sinal. Em alguns casos, os dados de protoplastos podem ser relevantes para seus doadores de órgãos e tecidos sob várias restrições ambientais, exigindo testes empíricos para validar a função te- cido específica de elementos reguladores, como promotores, po- tencializadores e fatores de transcrição.

[0007] Como pode ser visto uma necessidade existe na arte de sistema de cultura de células adequados para isolamento de pro- toplastos e transformação de alto rendimento em soja e outras espécies de plantas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Os métodos da invenção proporcionam culturas de sus- pensão de células de planta como uma fonte de protoplastos para transformação de alto rendimento e outros usos. Uma concretiza- ção preferida inclui métodos de produção de culturas de suspensão de células de plantas. Os métodos compreendem a geração de calos a partir de tecido foliar, transferência do calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células, subcultivo da sus- pensão de células sob condições suficientes para manter as cé- lulas em um estado viável, e filtragem da suspensão de células para remover grande aglomerado de células.

[0009] Em algumas concretizações, a geração de calos a partir de tecido foliar compreende a colocação do tecido foliar adaxial-

lado para baixo em meio de indução do calo e mantendo o tecido foliar sob a luz para um tempo suficiente para gerar calo, pre- ferivelmente menos do que cerca de três semanas. Em algumas concretizações, o meio de indução de calo é suplementado com uma auxina. Preferencialmente, a auxina é o ácido 2,4-diclorofeno- xiacético. Preferencialmente, o meio de indução do calo compre- ende de cerca de 5 µM a cerca de 40 µM de ácido 2,4-diclorofe- noxiacético. Em algumas concretizações, o calo é dividido em pedaços antes de transferir o calo para o meio líquido. Prefe- rencialmente, a suspensão de células é mantida no escuro. Em algumas concretizações, os métodos incluem a coleta do sobrena- dante da suspensão de células após permitir que a suspensão de células se estabeleça por um período de tempo, de preferência após se estabelecer por cerca de 30 minutos. Preferencialmente, a filtragem remove os aglomerados de células maiores do que cerca de 100 µm. Em algumas concretizações, os métodos compreendem a criopreservação das culturas de suspensão de células. Em algumas concretizações, a planta é selecionada de soja, batata, tomate, feijão, ervilha, girassol, milho, arroz, cevada e trigo. Prefe- rencialmente, a planta é soja.

[0010] Em algumas concretizações, os métodos compreendem a obtenção de protoplastos a partir de culturas de suspensão de células. Em algumas concretizações, os métodos compreendem a introdução de um ácido nucleico no protoplasto. Preferencial- mente, o ácido nucleico compreende um promotor. Preferencial- mente, o ácido nucleico compreende um gene repórter. Em algumas concretizações, a introdução é por microinjeção, eletroporação, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por polietilenoglicol (PEG) ou bombardeio de microprojéteis.

Preferencialmente, a introdução é por transformação mediada por PEG. Em algumas concretizações, a introdução do ácido nucleico é automatizada.

[0011] Uma concretização preferida inclui métodos de obtenção de protoplastos a partir de uma planta. Os métodos compreendem o fornecimento do tecido foliar da planta, colocação do tecido foliar com lado adaxial para baixo no meio de indução dos calos, incubação sob luz durante um tempo suficiente para gerar calos, divisão do calo em pedaços, transferência dos pedaços de calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células, sub- cultivo da suspensão de células sob condições suficientes para manter as células em um estado viável, filtragem da suspensão de células para remover aglomerados de células grandes, recuperação das células a partir do meio líquido, e a remoção da parede celular das células com enzimas adequadas para formar protoplas- tos.

[0012] Uma concretização preferida inclui culturas de suspen- são de células de planta e protoplastos de plantas preparados pelos métodos anteriores.

[0013] Embora múltiplas concretizações sejam divulgadas, ainda outras concretizações da presente invenção se tornarão aparentes para aqueles habilitados na arte a partir da seguinte descrição detalhada, que mostra e descreve concretizações ilus- trativas da invenção. Consequentemente, as figuras e a descrição detalhada devem ser consideradas de natureza ilustrativa e não restritiva.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Os desenhos a seguir fazem parte da especificação e são incluídos para mais demonstrar certas concretizações ou de vários aspectos da invenção. Em alguns casos, as concretizações da invenção podem ser compreendidas melhor pela referência aos desenhos acompanhantes, em combinação com a descrição detalhada apresentada aqui. A descrição e os desenhos acompanhantes podem destacar um determinado específico exemplo, ou um certo aspecto da invenção. No entanto, um habilitado na arte entenderá que porções do exemplo ou aspecto podem ser usadas em combinação com outros exemplos ou aspectos da invenção.

[0015] Figura 1 mostra o desenvolvimento de cultura de células de folhas de soja. A fotografia mostra as plantas crescidas in vitro, folhas de 3 semanas de idade utilizadas para indução de calo, 3 semanas de incubação a 24 °C sob luz branca induzida por produção de calo, 4 semanas de incubação a 25 °C nos calos proliferados no escuro, e culturas de células finas obtidas a partir de calos em 5 semanas.

[0016] Figuras 2A-C mostram alterações na cor do calo após a exposição à luz. A Figura 2A mostra os calos mantidos no escuro a 25 °C, Figura 2 B mostra os calos de cores alteradas de pálida/ branca para luz verde dentro de três semanas sob luz branca, e a Figura 2 C mostra os calos de cores alteradas da luz para o verde escuro dentro de mais 3 semanas.

[0017] Figuras 3A-B mostram que a idade da cultura afeta a proliferação da célula. Figura 3A mostra os aglomerados de cé- lulas a partir de 6 meses de idade de cultura, que tiveram a proliferação celular ativa reduzida. A Figura 3B mostra proli- feração de células saudável e vigorosa 7 dias após subcultivo.

[0018] Figura 4 mostra a manutenção da cultura de suspensão de células de soja. A fotografia mostra a cultura de 7 dias de idade, 5 mL de cultura de células de 7 dias de idade misturadas com 45 mL meios frescos para reposição de culturas, e células incubando a 24 °C no escuro sobre uma agitador rotativo a 80 rpm.

[0019] Figuras 5A-B mostram o rearranjo de formas de células 4 dias após subcultivo. A Figura 5A mostra um aglomerado de células de forma redonda/oval e a Figura 5B mostra uma células alongada.

[0020] Figuras 6A-B mostram que a forma das células influencia a distribuição de padrões. A Figura 6A mostra células arredon- dadas-ovais tendem a aglutinar-se em conjunto e a Figura 6B mostra que as células alongadas permaneceram mais amplamente distribuídas.

[0021] Figuras 7A-F mostram que a proporção de células alon- gadas aumenta com o tempo após o subcultivo. A Figura 7A mostra dia 0, A Figura 7B mostra dia 2, Figura 7C mostra dia 4, Figura 7D mostra dia 6, Figura 7E mostra dia 8, e Figura 7F mostra dia

10.

[0022] Figuras 8A-B mostra os efeitos do subcultivo no cres- cimento de cultura de células. A Figura 8A mostra peso fresco ao longo do tempo após o subcultivo, uma placa de leitor foi uti- lizado para medir óptico densidade ao longo do tempo após o subcultivo, as barras de erros representam o erro padrão (n = 6). As mesmas letras acima da barra de erro indicam diferença não significativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p < 0,05). A Figura 8B mostra a fotografia de células colhidas no filtro de papel.

[0023] Figura 9 mostra os estágios de tecido de colheita para isolamento de protoplastos. As fotografias mostram 5 mL de PCV coletados a partir de 4 dias após subcultivo, cotilédones ima- turos de 30 dias de idade colhidos de plantas crescidas em estufa, caules de 15 dias de idade crescidos em solo e coletados, e folhas de 17 dias de idade cultivadas em solo (10 dias no claro + 7 dias no escuro).

[0024] Figuras 10A-C mostram os efeitos da idade e tipo de tecido na produção e viabilidade de protoplastos. A Figura 10A mostra a idade da célula de cultura, após subcultivo em rendi- mento de protoplastos. A Figura 10B mostra o efeito do tempo após subcultivo na viabilidade de protoplastos. A Figura 10C mostra que a recuperação de milhões de protoplastos/g e viabi- lidade foram afetadas pela fonte de tecido. As barras de erro representam o erro padrão (n = 6). Mesmas letras acima das barras indicam diferença não significativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p <0,05).

[0025] Figuras 11A-C mostram os vetores utilizados em expe- rimentos de transformação de protoplastos. A Figura 11A mostra a estrutura do vetor teste utilizando um padrão interno de uma proteína repórter de cor laranja fluorescente do promotor CaMV 35S:: cassete Tag RFP -T e a proteína repórter verde fluorescente do promotor teste:: cassete mEmerald. A linha representa os pro- motores teste com o comprimento do promotor (pares de bases; bp) sendo indicado acima de cada linha. NosT; Nos terminator. A Figura 11B mostra o controle positivo usado em promotores CaMV 35S idênticos que dirigem ambos os genes repórter. A Figura 11C mostra o vetor de controle negativo que contém um cassete mEme- rald sem promotor. Todos os plasmídeos são vetores binários e abrigam um gene resistente à canamicina para a seleção bacteriana.

[0026] Figura 12 mostra a otimização da eficiência da trans- formação de protoplastos de soja protoplastos por tecido fonte, a duração da incubação com base em polietilenoglicol (PEG). Os protoplastos foram transfectados com 10 µg do DNA do plasmídeo (pB2GW7: 9983 pb). As barras de erro representam o erro padrão (n = 6). Mesmas letras acima das barras indicam a diferença não significativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p < 0,05).

[0027] Figuras 13A-D mostram a expressão transiente em pro- toplastos. Imagens de campo brillhante, fluorescência OFP, flu- orescência`GFP e mistura de fluorescência de duas cores foram mostradas para cada tecido fonte. A fluorescência foi avaliada às 48 horas. após transformação usando microscopia confocal. A expressão foi observada em cultura de células, folha, caule, e protoplastos derivados de cotilédones imaturos. A Figura 13A mostra cultura de células, A Figura 13B mostra folha, Figura 13C mostra caule, e a Figura 13D mostra cotilédone imaturo. A barra de escala representa 100 µM e imagem de baixa ampliação (10x) de protoplastos.

[0028] Figuras 14A-D mostram medições quantitativas de força do promotor em diferentes protoplastos derivados de tecidos e análise de associação. A fluorescência foi quantificada 48 horas após a transfecção. Note que o vetor de controle positivo inclui 35S: OFP e 35S: GFP como uma expressão de referência e a força do promotor foi determinada pela fluorescência GFP proporcional contra a fluorescência OFP. Vetor de controle positivo dos pro- motores 35S: 35S foram normalizados para 1,0, o qual foi usado para normalizar a força de promotores de interesse. A força do promotor relativa foi mostrada em culturas de células, folhas, caules, e protoplastos derivados de cotilédones imaturos de soja. A Figura 14A mostra cultura de células, A Figura 14B mostra folhas, Figura 14C mostra caules, e a Figura 14D mostra cotilé- dones imaturos. As barras de erro representam o erro padrão (n = 6). Mesmas letras acima das barras indicam diferença não sig- nificativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p < 0,05). A Figura 14E mostra análise de regressão linear da força de promotor relativa em folhas e protoplastos derivados de cultura de células, caules e protoplastos derivados de cultura de células, e cotilédones imaturos e protoplastos derivados de cultura de células.

[0029] Figuras 15A-D mostra abundância de transcritos por qRT-PCR do gene promotor alvo da esquerda em tecidos de soja. As transcrições de vários genes foram estimadas em cultura de cé- lulas, folhas, caules e cotilédones imaturos. A Figura 15A mostra culturas de células, a Figura 15B mostra folhas, a Figura 15C mostra caules e a Figura 15D mostra cotilédones imaturos. Os níveis relativos de transcritos foram normalizados para ubiqui- tina de soja (GmUBI3) e gene actin11. As barras de erro repre- sentam o erro padrão (n = 3). Mesmas letras acima das barras indicam diferença não significativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p < 0,05).

[0030] Figura 16 mostra a expressão relativa do gene do pro- motor alvo endógeno através de tipos de tecido. Ubiquitina, tu- bulina, Hsp90, proteína ribossomal, GAL e actina transcrição s abundância em folha, de células de suspensão de cultura, caule e imaturo cotilédone. Os níveis relativos de transcritos foram normalizados para o gene actin11 da soja. As barras de erro representam o erro padrão (n = 6). Mesmas letras acima barras indicam não significativa diferença de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD (p < 0,05).

[0031] Figura 17 mostra a expressão de protoplastos usando um sistema de transformação automatizado. Os protoplastos foram transfectados com uma construção pB2GW7 fundida com o promotor 35S intensificado- mEmerald e a construção pMTV fundida com o promotor-GFP da ubiquitina e o promotor 35S -OFP. Após incubação durante a noite, a expressão do gene repórter foi visualizada usando um microscópio confocal. A escala de barras representa 100 µM e imagem de baixa ampliação (10x) de protoplastos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiro. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual as concretizações da invenção se referem. A menos que de outro modo definido, todos os técnicos e científicos termos utilizados aqui têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um perito comum na arte. De um modo geral, as definições de vários termos utilizados aqui são bem conhecidos e convencionalmente utilizados na arte.

[0033] Os termos singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra “ou” é destinado a incluir “e” a menos que o contexto claramente indicar o contrário. A palavra “ou” significa qualquer um membro de uma determinada lista e também inclui qualquer combinação de membros desta lista.

[0034] Intervalos numéricos recitados dentro da especificação incluem os números que definem o intervalo e incluem cada número inteiro dentro do intervalo definido. Ao longo desta divulgação, vários aspectos desta invenção são apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da in- venção. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todos os su- bintervalos, frações e valores numéricos individuais possíveis dentro desse intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo, como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo especificamente 5 subintervalos divulgados, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e decimais e frações, por exemplo, 1,2, 3,8, 1½ e 4¾. Isso se aplica inde- pendentemente da amplitude do intervalo.

[0035] O termo “cerca de”, conforme usado neste documento, refere-se à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, por meio de técnicas e equipamentos de medição típicos, com respeito a qualquer variável quantificável, inclu- indo, mas não se limitando a, massa, volume, tempo, e concen- tração. Além disso, dados os procedimentos de manuseio de sólidos e líquidos usados no mundo real, há certo erro inadvertido e variação que é provável por meio de diferenças na fabricação, fonte ou pureza dos ingredientes usados para fazer as composições ou realizar os métodos e semelhantes. O termo “cerca de” também abrange quantidades que diferem devido a diferentes condições de equilíbrio para uma composição resultante de uma mistura inicial particular. O termo “cerca de” também abrange essas variações. Modificadas ou não pelo termo “cerca de”, as reivindicações in- cluem equivalentes às quantidades.

[0036] Tal como utilizado aqui, os termos “célula em suspensão” ou “cultura de suspensão” (por exemplo; “linhagem de células em suspensão de plantas”, “cultura de suspensão de plantas”, “cé- lulas em suspensão de plantas” ou “cultura de suspensão de cé- lulas em plantas”) são uma população especializada de células de plantas homogêneas indiferenciadas cultivadas em nutrientes lí- quidos ou meios de cultura. As células são normalmente suspensas no meio em vez de aderir a uma superfície.

[0037] Conforme usado neste documento, o termo “suspensão”, conforme usado neste documento, pretende incluir qualquer colo- cação de um sólido (por exemplo, células de plantas) em um lí- quido, seja ou não criada uma suspensão real. Como tal, o termo “suspensão” pretende incluir qualquer mistura de um sólido em um líquido ou qualquer outra colocação de um sólido em um líquido. Como resultado, o termo “suspensão” também não se destina a ser limitado a suspensões, mas, em vez disso, pretende significar qualquer massa com um sólido presente em um líquido.

[0038] Tal como utilizado aqui, o termo “calo” ou “calos” refere-se a um grupo de células estruturalmente indiferenciadas provenientes de quaisquer plantas de partes de plantas. Uma vez que uma planta foi induzida a formar um calo, o tecido do calo pode ser usado como um sistema experimental para investigar e resolver uma ampla gama de problemas básicos de pesquisa e para introduzir genes estranhos em uma variedade de plantas hortíco- las e agronômicas para fins de melhoria de cultivo.

[0039] Tal como utilizado aqui, o termo “tecido vegetal” re- fere-se a um agrupamento organizado de células de plantas dife- renciadas e indiferenciadas. Por exemplo, um tecido vegetal in- cluiria embriões de plantas, folhas, pólen, raízes, pontas de raízes, anteras, sedas, flores, grãos, bulbos, tubérculos, ri- zomas e sementes. Além disso, o tecido vegetal inclui “órgãos da planta” que constituem o tecido da planta ou um grupo de tecidos que constituem uma parte morfológica e funcionalmente distinta de uma planta. Os tecidos vegetais podem ser localizados e iso- lados de uma planta ou em um órgão, tecido ou cultura de células de planta.

[0040] “Cultura de tecidos” é um termo usado para descrever o processo em que as células de planta são cultivadas fora de uma planta intacta em um meio nutriente adequado (por exemplo, meio de suspensão celular). A cultura de tecidos é definida como um método em que as partes de uma planta são transferidas para um ambiente artificial, em que eles podem continuar a sobreviver. O termo cultura de tecidos, conforme entendido na arte, refere- se a tecido cultivado que pode consistir em um indivíduo ou grupos de células de planta, protoplastos ou a totalidade ou partes de um órgão vegetal.

[0041] Em cultura de tecidos, células de plantas podem ser crescidas em uma superfície sólida como caroços coloridos páli- dos conhecidos como cultura de calos ou como aglomerados indi- viduais ou pequenos de células conhecidas como cultura de sus- pensão. As células crescidas em cultura estão se dividindo ati- vamente e podem ser mantidas indefinidamente em um estado indi- ferenciado, por transferência das células para meio de suspensão de células frescas (subcultivo ou passagem). As células culti- vadas também podem ser induzidas a se rediferenciar em plantas inteiras. As culturas de tecidos vegetais podem ser iniciadas a partir de quase qualquer parte da planta fonte (denominado ex- plante), embora as partes mais jovens da planta sejam geralmente mais úteis, pois contêm células que se dividem mais ativamente.

[0042] A presente invenção proporciona métodos para a produ- ção de culturas de suspensão de células de plantas para o iso- lamento de protoplastos e transformação de alto rendimento. Os métodos compreendem a geração de calos de tecido vegetal, trans- ferência do calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células, subcultivo da suspensão de células sob condições suficientes para manter as células em um estado viável, e fil- tragem da suspensão de células para remover grandes aglomerados de células. As culturas de suspensão celular produzidas pelos métodos fornecem uma fonte renovável de protoplastos para trans- formação. A invenção atual ainda fornece métodos de obtenção de protoplastos a partir de uma planta ou a partir da cultura de suspensão de células de plantas.

[0043] Os métodos compreendem a geração de calos a partir de um tecido vegetal, de preferência tecido foliar. Em algumas con- cretizações, os pedaços de folha são colocados com lado adaxial para baixo em meio de indução de calos. Em algumas concretizações, o meio de indução de calo compreende sais basais de MS. Os “sais basais de MS” são conhecidos na arte e foram originalmente des- critos por Murashige e Skoog, Physiology Plantarum, 15: 473-497 (1962). Nos métodos e meios da presente invenção, “meio basal MS” ou “meio MS” ou “sais basais MS” como utilizado aqui inclui meios basais MS, como descrito por Murashige e Skoog, bem como equivalentes de meio basal MS. Um perito na arte iria entender que os equivalentes de meio basal MS inclui meio que é substan- cialmente semelhante em conteúdos e concentrações de sais, de produtos químicos, etc., de tal modo que uma planta, um tecido de planta, ou uma cultura de células de planta desenvolve- ria/cresceria do mesmo modo quando expostos ao meio basal MS.

[0044] Em algumas concretizações, o meio de indução de calo é suplementado com uma auxina. “Auxinas” incluem, mas não estão limitadas a, auxinas de ocorrência natural e sintéticas. A auxina de ocorrência natural é o ácido indol acético (“IAA”), que é sintetizada a partir do triptofano. Auxina sintética exemplar em ácido diclorofenoxiacético (“2,4-D”). Outras auxinas incluem, mas não estão limitadas a, ácido 4-clorofenoxiacético (“4-CPA”), ácido 4-(2,4-diclorofenoxi)butírico (“2,4-DB”), tris[2-(2,4-di- clorofenoxi)etil]fosfito (“2,4-DEP”), ácido 2-(2,4-diclorofe- noxi)propiônico (“dicloroprop”), ácido (RS)-2-(2,4,5-tricloro- fenoxi)propiônico (“fenoprop”), naftalenoacetamida, ácido α- naftalenoacético (“NAA”), 1-naftol, ácido naftoxiacético, naf- tenato de potássio, ácido (2,4,5-triclorofenoxi)acético (“2,4,5- T”), ácido indol-3-acético, ácido indol-3-butírico (“IBA”), ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiridina-2-carboxílico (“picloram”), ácido 3,6-dicloro-o-anísico (“dicamba”), ácido indol-3-proiô- nico (“IPA”), ácido fenil acético (“PAA”), ácido benzofurano-3- acético (“BFA”) e ácido fenilbutírico (“PBA”).

[0045] Em algumas concretizações, o meio de indução de calo compreende de cerca de 5 µM a cerca de 40 µM de ácido 2,4- diclorofenoxiacético. Em algumas concretizações, o meio de in- dução de calo é suplementado com cerca de 10 µM a cerca de 14 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, de preferência de cerca de 11μM a cerca de 13μM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético. Mais preferencialmente, o meio de indução de calo é suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético cerca de 12 µM. Menos do que cerca de 12 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético pode produzir menores quantidades de calos, enquanto acima de cerca de 12 µM pode resultar em bordas de folhas acastanhadas. Um exemplo de meio de indução de calo compreende sais basais MS, 3% de sacarose, 150 mg/L de caseína hidrolisada, 0,8% de ágar suplementado com 12 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, pH 5,7.

[0046] No estágio inicial de indução do calo, a cultura é mantida sob luz por tempo suficiente para gerar calo. A incubação de luz é necessária para induzir o calo do tecido foliar, porque os pedaços de folhas podem gradualmente virar uma cor preta sob incubação no escuro. Em algumas concretizações, as condições de crescimento adequadas para iniciar o calo incluem 24 °C sob luz branca com um fotoperíodo de 16 h dia/8 h à noite. Preferenci- almente, o tempo suficiente para gerar o calo é inferior a cerca de três semanas porque o calo induzido pode se transformar em uma cor preta quando incubado sob luz por mais de 3 semanas. Após cerca de 3 semanas de cultura, o calo é retirado dos pedaços de folha e semeado em meio de indução de calo fresco para pro- liferação. Uma vez estabelecida, a proliferação de calos ocorre em condições escuras para obter calos friáveis e moles. Proli- feração de calos sob luz por sua vez é uma cor acastanhada com morfologia dura e não é adequada para a produção de suspensão de cultura de células.

[0047] Os métodos compreendem iniciar uma suspensão de célu- las a partir do calo. Em algumas concretizações, os métodos compreendem a transferência do calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células. Em algumas concretizações, o meio líquido compreende sais basais MS. Em algumas concretiza- ções, o meio líquido é suplementado com uma auxina. Preferenci- almente, a auxina é ácido 2,4-diclorofenoxiacético. Em algumas concretizações, o meio líquido é suplementado com ácido 2,4-

diclorofenoxiacético a cerca de 0,92 µM. Um exemplo de meio líquido compreende sais basais MS, sacarose a 3%, ácido 2,4- diclorofenoxiacético a 0,92 µM, pH 5,6.

[0048] Em algumas concretizações, o calo é delicadamente di- vidido em pedaços imediatamente antes de transferir o calo para o meio líquido. Conforme usado neste documento, o termo “dividir” e quaisquer outras formas de palavras ou cognatos dos mesmos, tais como, sem limitação, “dividir”, inclui o processo de redução de uma composição de um primeiro tamanho para um tamanho menor por qualquer método ou processo adequado, incluindo, sem limi- tação, picar, cortar, picar em cubos, picar em pequenos pedaços ou fatiar.

[0049] Os métodos compreendem a subcultivo da suspensão de células em condições suficientes para manter as células em um estado viável. O termo “subcultivo” refere-se a condições que tipicamente envolvem o cultivo (retirada) de células, diluição ou divisão de células com meio de suspensão de células fresco e cultivo da cultura de células diluído ou dividido. Preferenci- almente, a suspensão de células é mantida no escuro com agitação. Em algumas concretizações, os métodos compreendem a coleta do sobrenadante da suspensão de células após permitir que a sus- pensão de células se estabeleça por um período de tempo e a transferência do sobrenadante para meio fresco. Preferencial- mente, o período de tempo é de pelo menos cerca de 10 minutos, mais de preferência de cerca de 20 minutos a cerca de 40 minutos, ou mais preferivelmente cerca de 30 minutos.

[0050] Em algumas concretizações, os métodos compreendem fil- tragem da suspensão de células para remover grandes aglomerados de células. O termo “filtração” conforme utilizado aqui, é si- nônimo de peneiração, drenagem e semelhantes. Em concretizações particulares, uma tela ou malha de exclusão por tamanho é uti- lizada para isolar as células dos aglomerados de células que têm um maior diâmetro. Em algumas concretizações, os aglomerados de células são aqueles maiores que cerca de 50 µm, cerca de 75 µm, cerca de 100 µm, cerca de 125 µm ou cerca de 175 µm de diâmetro. Preferencialmente, os aglomerados de células são aqueles maiores do que cerca de 100 µm. Em algumas concretizações, a filtragem remove os aglomerados de células com um diâmetro maior que cerca de 50 µm, cerca de 75 µm, cerca de 100 µm, cerca de 125 µm ou cerca de 175 µm. Preferivelmente, a filtragem remove os aglome- rados de células que têm um diâmetro maior do que cerca de 100 µm.

[0051] Em algumas concretizações, os métodos compreendem a recuperação de uma célula de planta do meio líquido. Tal como utilizado aqui, o termo “recuperação” refere-se ao isolamento das células de plantas ou outros materiais biológicos de modo que seja significativamente livre de qualquer componente do meio.

[0052] Os métodos compreendem a obtenção de protoplastos a partir da cultura de suspensão de células. O termo “protoplasto”, tal como utilizado aqui, refere-se a uma célula de planta que teve sua parede celular completamente ou parcialmente removida, com a membrana de bicamada lipídica nua. Os protoplastos são produzidos, preferencialmente, submetendo as células de planta à degradação enzimática das paredes celulares. As enzimas de- gradantes de parede celular incluem celulases, hemicelulases, ligninases, e pectinases. Em uma concretização preferida, as enzimas degradantes de paredes celulares são enzimas de grau alimentício. É uma vantagem dos presentes métodos que enzimas de baixo custo, de grau alimentício são eficazes na obtenção de protoplastos vegetais a partir de cultura de suspensão de células de planta derivadas de folha. Em contraste, essas enzimas de grau alimentício são ineficazes na digestão e não produzem pro- toplastos viáveis quando o tecido foliar é usado diretamente.

[0053] Os métodos descritos neste documento incluem a intro- dução de um ácido nucleico em um protoplasto de planta. Tal como utilizado aqui, “introdução” pretende significar apresentar à planta a construção de nucleotídeos de tal maneira que a cons- trução ganha acesso ao interior da célula. Os métodos neste documento não dependem de um método particular para a introdução de uma construção de nucleotídeo em um protoplasto de planta, apenas que o ácido nucleico ganhe acesso ao interior de pelo menos um protoplasto. Os métodos para a introdução de ácidos nucleicos em plantas são conhecidos na arte, incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transiente, microinjeção e métodos mediados por vírus. Uma “transformação estável” é aquela em que a construção de nucleotídeos introduzida em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada por sua descendência. “Trans- formação transiente” significa que uma construção de nucleotídeo introduzida em uma planta não se integra ao genoma da planta. As construções de nucleotídeos das concretizações podem ser intro- duzidas em plantas pelo contato das plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de uma construção de nucleotídeo dentro de uma mo- lécula de DNA ou RNA viral.

[0054] Métodos para introduzir construções de nucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nas mesmas, envol- vendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes dos EUA Nos. 5.889.191, 5.889.190,

5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931).

[0055] Os protocolos de transformação, bem como os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tamanho da molécula de ácido nucleico e do número de protoplastos disponíveis. Métodos adequados de intro- dução de sequências de nucleotídeos em células de planta e sub- sequente inserção no genoma vegetal incluem microinjeção (Cros- sway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes US Nos.

5.981.840 e 5.563.055), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722) e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, as Patentes dos EUA Nos.

4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) In Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin) e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926). Em algumas concretizações, a introdução é por transformação mediada por polietilenoglicol (PEG).

[0056] Em algumas concretizações, os métodos da presente in- venção proporcionam uma eficiência de transformação de proto- plastos aumentada em relação a outras fontes de protoplastos. Por exemplo, em certas concretizações, os métodos fornecem cerca de 13% de eficiência de transformação usando protoplastos de folhas em comparação com cerca de 30 % de eficiência de trans- formação usando protoplastos de cultura de células derivadas de folhas.

[0057] As etapas nos métodos da presente invenção podem ser realizadas manualmente ou por automação. Para expressão transi- ente de alto rendimento, é preferível que os métodos sejam au- tomatizados. Em uma concretização preferida, uma ou mais etapas são automatizadas. Uma concretização da presente invenção for- nece manuseio automatizado de alto rendimento para isolamento e/ou transformação de protoplastos. O uso de robôs e outros dispositivos automatizados em laboratório é comum na arte (ver, por exemplo, Dlugosz et al, 2016, J Vis Exp (115) : 54300). Em um método automatizado de alto rendimento da presente invenção, uma pluralidade de protoplastos de plantas são transformados com uma pluralidade de ácidos nucleicos para produzir uma plurali- dade de protoplastos de plantas transformados. Em algumas con- cretizações, os protoplastos produzidos pelos métodos da pre- sente invenção fornecem uma taxa de transformação de protoplas- tos aumentada quando usados com um sistema de transformação au- tomatizado de alto rendimento.

[0058] Conforme utilizado aqui, os termos “polinucleotídeos”, “ácido nucleico”, e “molécula de ácido nucleico” são utilizados indiferentemente, e podem englobar uma único ácido nucleico;

ácidos nucleicos plurais; um fragmento de ácido nucleico, vari- ante ou derivado do mesmo, e construção de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (RNAm) e DNA de plasmídeo (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de comprimento total, ou um fragmento da mesma, incluindo sequências 5' e/ou 3' não tra- duzidas e sequência(s) de codificação. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de qualquer polirribonucleotí- deo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode incluir ribonucleo- tídeos ou desoxirribonucleotídeos não modificados ou ribonucle- otídeos ou desoxirribonucleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser constituído por DNA de cadeia simples e dupla; DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla; RNA de cadeia simples e dupla; e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla. As moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA podem ser de fita simples, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Os termos anteriores também incluem formas modificadas quimicamente, enzimaticamente e metabolicamente de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.

[0059] Entende-se que um DNA específico refere-se também para o complemento do mesmo, a sequência do qual é determinado de acordo com as regras de pareamento de bases de desoxirribonu- cleotídeo.

[0060] “Ácido nucleico exógeno” é um ácido nucleico que não é nativo de um sistema especificado (por exemplo, um germoplasma, planta, variedade, etc.), com relação à sequência, posição ge- nômica ou ambos. Tal como utilizado aqui, os termos “exógeno” ou

“heterólogo”, conforme aplicados a polinucleotídeos ou polipep- tídeos, normalmente se referem a moléculas que foram fornecidas artificialmente a um sistema biológico (por exemplo, uma célula de planta, um gene de planta, uma espécie ou variedade de planta particular ou um cromossomo da planta em estudo) e não são na- tivos desse sistema biológico específico. Os termos podem indi- car que o material relevante se originou de uma fonte diferente de uma fonte de ocorrência natural ou podem se referir a molé- culas com uma configuração não natural, localização genética ou arranjo de partes. Em contraste, por exemplo, um gene “nativo” ou “endógeno” é um gene que não contém elementos de ácido nu- cleico codificados por fontes diferentes do cromossomo ou outro elemento genético no qual é normalmente encontrado na natureza. Um gene endógeno, transcrito ou polipeptídeo é codificado por seu locus cromossômico natural e não é fornecido artificialmente à célula.

[0061] Tal como utilizado aqui, o termo “gene” refere-se a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou poli- peptídeo/proteína). Um gene pode incluir sequências regulatórias precedentes (sequências não codificantes 5') e/ou seguintes (se- quências não codificantes 3') a sequência que codifica o produto funcional.

[0062] Conforme usado aqui, o termo “polipeptídeo” inclui um polipeptídeo singular, polipeptídeos plurais e fragmentos dos mesmos. Este termo se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações amida (também co- nhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” re- fere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos,

e que não se referem a um determinado comprimento ou tamanho do produto. Deste modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oli- gopeptídeos, proteínas, cadeia de aminoácidos, e qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição de “po- lipeptídeo”, e os termos anteriores são usados indistintamente com “polipeptídeo” aqui. Um polipeptídeo pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas um polipeptídeo específico não é necessariamente traduzido de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer maneira apropriada, incluindo, por exemplo e sem limitação, por síntese química. Do mesmo modo, um polipeptídeo pode ser gerado por expressar uma sequência codificante nativa, ou porção da mesma, que é introduzida em um organismo em uma forma que é diferente a partir da sequência codificante nativa correspondente.

[0063] O termo “promotor” refere - se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante de ácido nucleico ou RNA funcional. Nos exemplos, a sequência co- dificante controlada está localizada a 3' de uma sequência pro- motora. Um promotor pode ser derivado na sua totalidade de um gene nativo, um promotor pode ser compreendido por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na na- tureza ou um promotor pode mesmo compreender segmentos de DNA concebidos de forma racional. Entende-se por aqueles especia- listas na arte que diferentes promotores podem direcionar a ex- pressão de um gene em diferentes tipos de células, ou em dife- rentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Exemplos de todos promo- tores precedentes são conhecidos e utilizados na arte para con- trolar a expressão heterólogas de ácidos nucleicos. Os promoto- res que direcionam a expressão de um gene na maioria das células de tipos na maioria das vezes são comumente referidos para como “promotores constitutivos”. Além disso, enquanto aqueles na arte têm (em muitos casos sem sucesso) tentado delinear os limites exatos das sequências reguladoras, que tem sido entendido que os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade de promotor idêntica. A atividade de promotor de um determinado ácido nucleico pode ser avaliada usando técnicas conhecidas para aqueles especialistas na arte.

[0064] O termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma as- sociação de sequências de ácido nucleico em um único ácido nu- cleico, em que a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacio- nalmente ligado com uma codificação sequência quando o promotor é capaz de efectuar a expressão de que a sequência codificante (por exemplo, a sequência codificante está sob controle trans- cricional do promotor). Uma sequência codificante pode ser ope- racionalmente ligada a uma sequência reguladora em uma orienta- ção senso ou antissenso.

[0065] O termo “expressão”, como utilizado aqui, pode refe- rir-se para a transcrição e acumulação estável de RNA senso (mRNA) ou antissenso derivado a partir de um DNA. A expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Como utilizado aqui, o termo “superexpressão” refere-se à expressão que é maior do que expressão endógena do mesmo gene ou um gene relacionado. Assim, um gene heterólogo é “superexpresso” se sua expressão for maior do que a de um gene endógeno comparável.

[0066] Tal como utilizado aqui, os termos “repórter”, “sis- tema repórter”, “gene repórter” ou “produto do gene repórter” devem significar um sistema genético operativo no qual um ácido nucleico compreende um gene que codifica um produto que, quando expresso, produz um sinal repórter que é facilmente mensurável, por exemplo, por ensaio biológico, imunoensaio, radioimunoensaio ou por métodos calorimétricos, fluorogênicos, quimioluminescen- tes ou outros. Tais genes incluem, sem limitação, β-glucuroni- dase (GUS), luciferase (LUC), cloranfenicol fransacetilase (CAT), proteína fluorescente verde (GFP) e β-galactosidase. O ácido nucleico pode ser RNA ou DNA, linear ou circular, de fita simples ou dupla, polaridade antissenso ou senso e está operacionalmente ligado aos elementos de controle necessários para a expressão do produto do gene repórter. Os elementos de controle necessários irão variar de acordo com a natureza do sistema repórter e se o gene repórter está na forma de DNA ou RNA, mas pode incluir, mas não estar limitado a, elementos como promotores, intensificado- res, sequências de controle de tradução, sinais de adição poli A, sinais de terminação da transcrição e semelhantes.

[0067] As culturas de suspensão de células de planta ou os protoplastos de planta obtidos a partir das mesmas podem ser opcionalmente criopreservados. Exemplos dos métodos de criopre- servação são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na arte e tais concretizações estão dentro do escopo da presente invenção. Tal como utilizado aqui, o termo “criopreservar” ou “criopre- servação” refere-se ao armazenamento de material biológico, por exemplo, células, tecidos ou órgãos, a temperaturas abaixo de 4 °C. Geralmente, a intenção da criopreservação é manter as células de planta em um estado preservado ou dormente, após o qual as células de planta são devolvidas a uma temperatura acima de 4 °C para uso subsequente. Preferencialmente, a temperatura de criopreservação está abaixo de 0 °C. Por exemplo, a tempera- tura de criopreservação pode estar abaixo de 0 °C, −5 °C, −10 °C, −20 °C, −60 °C, - 80 °C ou superior. Tais temperaturas podem ser atingido por exposição das células de plantas a nitrogênio lí- quido, hélio líquido, dióxido decarbono ('gelo seco'), ou de suspensões de dióxido de carbono com outros solventes. Em algumas concretizações, a temperatura de criopreservação é de cerca de −20 °C, cerca de −80 °C ou cerca de −180 °C.

[0068] Conforme usado neste documento, o termo “agente de criopreservação” ou “crioprotetor” é uma substância que é usada para proteger células de planta de danos por congelamento. Além disso, o agente de criopreservação ou crioprotetor pode proteger as células de planta do frio e choque térmico, desidratação e criotoxicidade durante a criopreservação. O agente de criopre- servação ou crioprotetor pode ser de penetração celular ou não. Exemplos não limitativos de crioprotetores incluem glicerol, DMSO (dimetil sulfóxido), propilenoglicol, etilenoglicol, ace- tamida, e metanol.

[0069] Os métodos da presente invenção podem ser praticados em uma ampla variedade de plantas. Exemplos não limitativos de plantas nas quais os métodos atuais podem ser praticados incluem, mas não estão limitados a, monocotiledôneas e dicotiledôneas, como milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B.

rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago saliva), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor; Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, milheto (Pen- nisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto painço (Setaria italica), capim pé-de-galinha (Eleusine cora- cana)), girassol (Helianthus annum), cártamo (Carthamus tincto- rius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Ara- chis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsu- tum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot escu- lenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ana- nas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camelia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Pervea americano a), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium gua- java), manga (Mangifer a indica), azeitona (Oleo europaea), ma- mão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena), cevada (Hordeum), palma, leguminosas, incluindo feijão e ervilha, como guar, alfarroba, feno-grego, feijão verde, feijão-nhemba, feijão-mungo, feijão-fava, fava, lentilha, grão-de-bico e mamona, Arabidopsis, vegetais, plantas ornamentais, gramíneas, coníferas, plantas de cultivo e grãos que fornecem sementes de interesse, plantas com sementes oleaginosas e outras plantas leguminosas.

Os vegetais incluem tomate (Solanum lycopersicum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijão verde (Phaseolus vulgaris), feijão-fava (Phaseolus limensis), ervilha (Lathyrus spp.) E mem- bros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), melão (C.

cantalupensis) e melão almiscarado (C. melo). Os ornamentais incluem azálea (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Pe- tunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pukherrima) e crisântemo. As coníferas incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiro-amarelo (Pinus taeda), pinheiro bravo (Pinus elliotil), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro contorta (Pinus contorta), pinheiro Monterey (Pinus ra- diata), abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii), cicuta oci- dental (Tsuga canadensis), abeto sitka (Picea glauca), sequóia (Sequoia sempervirens), abetos verdadeiros como o abeto prateado (Abies amabilis) e o abeto balsâmico (Abies balsamea) e cedros como o cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro-amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). Em algumas concretiza- ções, a planta é soja. Em uma concretização exemplar, a planta de soja é 'Williams 82'.

EXEMPLOS Exemplo 1: Iniciação de calo de tecido foliar e estabelecimento de culturas de suspensão de células

[0070] Sementes de soja 'Williams 82' maduras e colhidas a partir de plantas crescidas em estufa foram lavadas com etanol 70% em 2 min e secas com filtro de papel. Em seguida, as sementes foram esterilizadas em superfície em um dessecador por 12 h com gás cloro (100 mL de hipoclorito de sódio (100% Clorox, alvejante comercial) + 3,5 mL de ácido clorídrico 12 N). Sementes estéreis foram colocadas em vasos Magenta GA-7 contendo meios de germi- nação: sais basais Murashige e Skoog (MS), 2% de sacarose, 0,3% de fitagel, pH 5,8 e colocadas em uma câmara de crescimento sob ciclo de 16 h dia/8 h noite a temperatura de 24 °C por 3 semanas (Fig. 1). Plantas com 20 dias de idade foram usadas para extirpar folhas expandidas que foram posteriormente cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento. Os pedaços de folhas foram colocados com o lado adaxial para baixo em meio de indução de calo: sais basais MS, sacarose a 3%, caseína hidrolisada 150 mg/L, ágar 0,8% suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético 12 µM, pH 5,7. Na fase inicial, as culturas foram mantidas a 24 °C sob luz branca e fotoperíodo de16 h dia/8 h noite para iniciação do calo. Após 3 semanas de cultura, o calo foi excisado a partir das partes de folhas e plaqueado em meio de indução dos calos fresco para proliferação. Durante todo o estudo, calo foi mantido em uma incubadora a 25 °C no escuro. Calos foram subcultivados a cada 3 semanas em meio fresco.

[0071] Culturas de suspensão de células foram iniciadas a partir de calos de 1 g. O calo foi transferido para 50 mL de meio líquido contendo sais basais MS, sacarose a 3%, ácido 2,4- diclorofenoxiacético 0,92 µM, pH 5,6. Os 50 mL de cultura foram mantidos em frasco erlemeyer PYREX® de 250 mL defletido e incu- bados a 24 °C no escuro em um agitador rotativo a 80 rpm. Para obter culturas de suspensão de células de estrutura fina, 40 mL de sobrenadante foram removidos cada semana a partir dos frascos após eles terem repousado por 30 min e foram adicionados a 40 ml de meio fresco. Este procedimento foi continuado por até 5 se- manas. Finalmente, as culturas de suspensão de células foram filtradas através de um filtro de malha de nylon (100 µm) para remover grandes aglomerados de células. A partir da solução fil- trada, 5 mL de culturas de suspensão de células finas foram subcultivados semanalmente em 45 mL de meio MS fresco para per- petuação subsequente.

Exemplo 2: Manutenção de cultura de suspensão de células e de- terminação do crescimento

[0072] Os calos derivados de folhas mantidos no escuro ficaram descorados (branco), friáveis e não embriogênicos (Fig. 2A). O calo ficou verde quando exposto à luz branca em 6 semanas (Fig. 2C). Os esforços para regenerar o calo verde em plantas foram mal sucedidos. As culturas de suspensão de células derivadas do calo descorado-branco foram viáveis com nenhuma redução de cres- cimento adequado por 6 meses. Depois disso, aglomerados de cé- lulas alongadas se tornaram aparentes (Fig. 3), o que coincidiu com a diminuição da proliferação da célula. A cultura de sus- pensão de célula foi mantida pela mudança dos meios a cada semana (Fig. 4).

[0073] Fenotipicamente, a cultura de suspensão de células tornou-se mais homogênea e vigorosa após 1 mês de estabelecimento. Inicialmente, a introdução de calo para o meio líquido conduziu a calos agregados pequenos, que repousaram sobre o fundo do frasco. Em seguida, devido à agitação contínua, os calos libe- raram células (cultura de suspensão fina) para o meio, que per- maneceram suspensas. Microscopicamente, essas culturas consis- tiam de dois tipos de células dominantes: redonda/oval e alongada (Fig. 5). As células redondas/ovais tenderam a permanecer em pequenos grupos, enquanto as células alongadas não se aglomera- ram (Fig. 6). Ao longo do tempo, em cultura, as células redon- das/ovais iria transitar para cadeias de múltiplos aglomerados de células (Fig. 7).

[0074] O crescimento das culturas de células foi avaliado usando dois parâmetros: densidade das células (OD600) e medição de peso fresco (g). A fim de determinar a densidade de células, a turbidez foi gravada utilizando um leitor de microplaca a uma densidade óptica de 600 nm. Após a agitação vigorosa, 200 µl de culturas foram transferidos em uma placa de 96 poços para medição. Finalmente, para medir o peso fresco, as células foram coletadas usando filtros de topo de garrafa sob pressão a vácuo constante. O peso das células foi determinado por subtração do peso do filtro de papel molhado a partir do peso do filtro de papel com células. Os dados foram registrados durante um tempo de curso de 10 dias para estimar as características de crescimento.

[0075] Com base no peso fresco da cultura de células e medi- ções de turbidez ao longo do tempo, as taxas de crescimento podem ser caracterizadas (Fig. 8A). Havia variação pouco aparente em crescimento durante os primeiros 2 dias de cultura. Com o tempo, o peso fresco e a turbidez da cultura de células aumentaram gradualmente. Em 8 dias, peso fresco e turbidez atingiram o pico e, eventualmente, depois de 8 dias de cultura, o havia um aumento insignificante de células em crescimento. Visualmente, as mu- danças na concentração de células durante a cultura podem ser observadas em papel de filtro (Fig. 8B). Durante a proliferação ativa, as culturas foram subcultivadas semanalmente para preve- nir o crescimento excessivo.

Exemplo 3: Isolamento de protoplasto de culturas de células, caules, folhas e cotilédones imaturos

[0076] Três diferentes idades de culturas: 3, 4 e 5 dias, após subcultivo foram usadas para isolar protoplastos. Inicial- mente, 50 mL de culturas foram transferidos em um tubo Falcon de 50 mL, permitido a repousar por 1 hora e o sobrenadante removido. Em seguida, 20 mL de solução tampão fresca (0,6 M de manitol, 10 mM de ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico MES); pH 5,7, 1 mM de CaCl2, 20 mM de KCl, 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 5 mM de 2-mercaptoetanol) contendo de enzimas de grau alimentício (Rohament CL 7920 ECU, Rohapect 10L 5040 Aju, e Rohapect UF 0,039 Aju) foram esterilizados por filtro para os tubos Falcon de 50 ml contendo aproximadamente 5 mL de PCV. O tubo foi então ime- diatamente colocado horizontalmente em uma incubadora com agi- tação a 24 °C e 90 rpm no escuro durante 1,5 h.

[0077] Após a incubação, a solução foi filtrada através de uma malha de nylon de 40 µm para remover grandes fragmentos de tecido e centrifugada a 100 × G por 3 minutos para sedimentar os protoplastos. O sobrenadante foi removido e o sedimento de pro- toplasto foi ressuspenso em 5 ml de solução de lavagem (manitol 0,6 M, 4 mM de MES ; pH 5,7, 20 mM de KCl). A produção total de protoplastos foi quantificada utilizando um hemocitômetro para 5 ml PCV. A fim de separar os detritos, os protoplastos quebrados e intactos, 5 mL de 23% de solução de sacarose foi cuidadosamente adicionada para a parte inferior do tubo e centrifugaram a 100 × G durante 3 minutos. Após centrifugação, os protoplastos in- tactos foram encontrados na interface de duas soluções e uma ponta de pipeta cortada foi utilizada para cuidadosamente trans- ferir a camada de protoplasto em novos tubos Falcon. Os proto- plastos foram então centrifugados sob as mesmas condições para se obter um sedimento, que foi novamente suspenso em solução W5 (154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl2, 5 mM de KCl, 2 mM de MES; pH 5,7). Os protoplastos foram observados sob um microscópio e quantificados novamente utilizando um hemocitômetro para deter- minar a concentração de protoplastos intactos. A solução res- suspensa foi armazenada imediatamente após a contagem em gelo antes para a transfecção.

[0078] Experimentos de cotilédones imaturos e caules seguiram o mesmo procedimento de digestão assim como célula de culturas de suspensão. A enzima e solução tampão foram as mesmas das culturas de suspensão de células. Para caules, as plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento ambiental com um foto- período de 16/8 h a 25 °C. Tecidos de caule foram colhidos a partir de plantas de 10-13 dias de idade. Após a coleta de caules, a folha verdadeira e cotilédones foram removidos a partir de caules, e o tecido foi cortado em 0,1 cm de peça de espessura. Aproximadamente 1 grama de corte de tecido foi imediatamente imerso na solução de enzima para prevenir a secagem. Um vácuo foi aplicado por 30 minutos para aumento do contato da solução com superfícies de tecidos.

[0079] Para cotilédones imaturos, as plantas foram cultivadas em uma estufa sob fotoperíodo de 16/8 h a 26 °C. As vagens foram colhidas 30 dias após a floração (Fig. 9). Cotilédones imaturos foram recolhidos após corte transversal de vagens e cortadas em peças de 0,1 cm. Aproximadamente 1 g de tecido fatiado foi então transferido para a solução de enzima sem infiltragem a vácuo. Caules e tecidos de cotilédones imaturos foram incubados com agitação a 30 rpm durante 2 h à temperatura ambiente, seguido por um procedimento de lavagem semelhante ao da cultura de sus- pensão de células.

[0080] Para isolamento de protoplastos de folhas, o tampão de isolamento usado foi o mesmo da cultura de suspensão de células com diferentes enzimas (0,5% de celulase, 0,5% macerozima e 0,15% pectoliase Y23). Para colheita do tecido de folha, as plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16/8 h a 25 °C durante 7-10 dias, em seguida, as plantas foram removidas da câmara de crescimento incubadas sob condições de escuro a temperatura ambiente por outros 7 dias. As folhas tra- tadas no escuro foram colhidas (Fig. 9), cortadas em tiras de 5 mm e imediatamente transferidas para uma placa de petri contendo solução de enzima. As tiras de folhas foram infiltradas a vácuo durante 30 minutos e depois incubadas à temperatura ambiente com agitação suave a 30 rpm durante 4-5 h. Ambas a infiltração a vácuo e a incubação foram realizadas no escuro. Após a incubação, a placa de petri foi suavemente agitada manualmente por 5-10 minutos. Durante a rotação, a solução tampão tornou-se verde, indicando a liberação de protoplastos. A solução contendo o pro- toplasto foi então filtrada através de uma malha de nylon de 40 µm e lavada.

Exemplo 4: Eficiência do isolamento de protoplastos de culturas de células, folhas, caules e cotilédones imaturos

[0081] O isolamento de protoplastos a partir de cultura de suspensão de células de soja derivadas de folha (LDSC), caules e cotilédones imaturos foram obtidos utilizando enzima de grau alimentício (Fig. 9). Nós encontramos que o LDSC produziu o maior número de protoplastos de 2,82 ± 0,94 x 108 por grama de massa de cultura fresca (Fig. 10 A), enquanto caules e cotilédones imaturos produziram 9,8 ± 0,30 x 105 e 7,46 ± 0,65 x 106 de protoplastos por grama de tecido, respectivamente (Fig. 10C). O rendimento de protoplastos a partir de LDSC variou ao longo do tempo com culturas de 4 dias de idade resultando no rendimento mais alto rendimento (Fig. 10A). No tecido foliar, as enzimas de grau alimentício revelaram digestão ineficaz e não produziu pro- toplastos viáveis. No entanto, usando um método previamente de- senvolvido e enzimas de grau reagente, foram obtidos 5,4 ± 0,47 × 107 de protoplastos por grama de tecido foliar (Fig. 10 C).

[0082] A viabilidade dos protoplastos para todas as fontes de tecidos foi também determinada por método de coloração de azul Evans. O corante de azul Evans foi misturado com a solução MMG (0,4 M de manitol, 15 mM de MgCl2 e 4 mM de MES pH 5,7) e adicionado para os protoplastos para obter uma última concen- tração de 0,04%. Após incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos, o número de protoplastos viáveis foi determinado usando um hemocitômetro. Os protoplastos viáveis permaneceram descoloridos enquanto os protoplastos mortos foram coloridos de azul. A porcentagem de viabilidade foi calculada por divisão do número de células vivas pelo número total de células contados.

O número máximo de protoplastos viáveis foi derivado a partir de culturas de 4 dias de idade com 77 ± 7,10% (Fig. 10 B). Após 8 dias de cultura, a viabilidade diminuiu drasticamente, portanto, culturas de 4 dias de idade foram usadas para experimentação adicional. A viabilidade dos protoplastos também foi medida em caules, cotilédones imaturos e folhas e variou de 75-80%. (Fig. 10 C).

Exemplo 5: Transfecção de protoplastos mediada por PEG

[0083] Os protoplastos foram permitidos para repouso em tubo Falcon durante 1 hora de incubação em gelo. Em seguida, o so- brenadante foi removido, e o sedimento foi ressuspenso em uma concentração de 1 x 105 mL-1 usando solução MMG. Durante a trans- fecção, o DNA plasmidial (10 µg) foi colocado em cada um dos os tubos Falcon de poliestireno transparentes de 14 mL de fundo redondo seguido por 200 µL de solução de protoplastos. Proto- plastos e o DNA foram suavemente misturados com um igual volume de de solução de PEG 40% recém-preparada (4 g de PEG 4000, 3 ml de H2O, 2,5 mL de 0,8 M de D-manitol e 1 mL de 1 M de CaCl2). Depois de agitar suavemente a mistura de transformação à mão até misturar homogeneamente, a mesma foi incubada à temperatura am- biente por 10, 15 e 20 minutos. Durante a incubação, a mistura foi misturada suavemente a cada 5 minutos para evitar a sedi- mentação dos protoplastos. Após a incubação, 1 mL de solução W5 foi adicionada para encerrar a reação, seguida por centrifugação a 100 x G por 3 minutos. O sobrenadante foi então descartado e 200 µL de solução WI foram adicionados (0,6 M de manitol, 4 mM de KCl, 4 mM de MES, pH 5,7). Após a mistura suave, a solução foi transferida para uma placa de 96 poços e incubada durante a noite a temperatura ambiente. Seis repetições biológicas foram realizadas para a transformação de protoplastos de cada fonte (folha, cultura de células, caule e cotilédone imaturo).

Exemplo 6: Otimização do tempo de incubação em PEG na eficiência de transformação de protoplastos

[0084] Para utilizar ainda os protoplastos isolados para aná- lise funcional de promotores, nós otimizamos o tempo de incubação em PEG para protoplastos a partir de todas as fontes. O vetor binário (pB2GW7: 9983 pb) carregando o gene repórter GFP variante mEmerald (Fig. 11) foi usada para estudar o efeito do tempo de incubação em PEG na eficiência de transformação de protoplastos de soja. Para otimizar a duração da incubação em PEG para as quatro fontes diferentes de protoplastos, que examinaram o efeito do tempo de transfecção de 10, 15, 20 e 25 minutos (Fig. 12). O aumento do tempo de transfecção de 10 minutos para 15 minutos resultou em um aumento na eficiência média de transfor- mação na folha (12,94 ± 1,45%), caule (27,01 ± 3,2%) e cotilé- dones imaturos (14,06 ± 1,75%). Quando aumentou-se ainda mais de 15 minutos para 20 minutos, uma diminuição na eficiência de transformação foi observada (Fig. 12). Isso sugere que 15 minutos foi um tempo de transfecção ideal para protoplastos da folha, caule e cotilédone imaturo que resultou em eficiência máxima de transformação. A eficiência de transformação de protoplastos de- rivados de LDSC atingiu o máximo de eficiência em 20 minutos de tempo de transfecção com PEG: 31,06 ± 7,69%. O aumento do tempo de transfecção de 20 para 25 minutos resultou em uma diminuição na eficiência de transformação (Fig. 12).

Exemplo 7: Avaliação da expressão transiente de protoplastos direcionada ao promotor

[0085] Seis promotores de soja foram selecionados para testar o sistema protoplasto baseado em caracterização prévia: ubiqui- tina, actina, proteína de choque térmico 90, proteína ribossomal, tubulina, e GAL (α-galactosidase). A Tabela 1 mostra os IDs de gene para os genes e os respectivos tamanhos de seus promotores isolados. O DNA genômico 'Williams 82' foi extraído usando um método de rotina de folhas com 2 semanas de idade. Os iniciadores para amplificar o DNA do promotor foram projetados no Snapgene do genoma da soja (banco de dados Phytozome v12.1). Sítios de restrição foram incorporados nos iniciadores para frente (Eco RI ou Abs I ou Pac I) e reverso (Nco I) para a direção de clonagem. A Tabela 2 mostra a lista de sequências de iniciadores utilizadas para amplicon de PCR; sítios de restrição estão sublinhados, e a enzima de restrição apropriada está indicada em parênteses.

Tabela 1 Promotor Tamanho (bp) ID do Gene Actina 1042 Glyma.19G147900 Proteína 616 Glyma.09G094200 ribossomal Hsp90 831 Glyma.08G332900 Ubiquitina 1416 Glyma.20G141600 Tubulina 1513 Glyma.05G207500 GAL 2000 Glyma.03G137900

Tabela 2 Promotor Sequência de iniciador (5' a 3')

F: ATACTTGAATTCTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGG (Eco RI)

CaMV 35S (SEQ ID NO: 1) R: ATACTTCCATGGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAAT (Nco I) (SEQ ID NO: 2)

F: CACCAAAGAATTCACTTTAACAGCAACACAATTTACAAT (Eco RI) (SEQ ID NO: 3) Actina R: GGACGTCCATGGGGTTGTTTAAGGTAAAAGATGTTTGT (Nco I) (SEQ ID NO: 4)

F: ATTACG GAATTC ATCTACAAGTATAGGTTATTTGTCATGC (Eco RI) Proteína ribosso- (SEQ ID NO: 5) mal R: AATCGCCCATGGGGTTGAGGCACTGTTTCAA (Nco I) (SEQ ID NO: 6)

F: CGGAGGAATTCAAATAAATGGAAATCCACTCTAAAAAAA (Eco RI) (SEQ ID NO: 7) Hsp90 R: AATCGCCCATGGTGTCGATCTACGCGAG (Nco I) (SEQ ID NO: 8)

F: CACCTGGAATTCTCCTTAAGTTGCAGCATTTAACACATCTCCTC (Eco RI)

Ubiqui- (SEQ ID NO: 9) tina R: TGCCATCCATGGTACCTGTCGAGTCAACAATCACAGATAAATCAGAA (Nco I) (SEQ ID NO: 10)

F: CACCTC CCTCGAGG CTGTATGAAATGATATAATATATTCACA (Abs I)

Tubulina (SEQ ID NO: 1 1) R: CACCTCCCATGGTTTGAAGATAATTCAATTCAACT (Nco I) (SEQ ID NO: 12)

F: CACCTCTTAATTAATAGTTATTTGACTGGATTC (Pac I) (SEQ ID NO: 13)

GAL R: CACCTCCCATGGTTTCGAACACTTCACCACTG (Nco I) (SEQ ID NO: 14)

[0086] Um vetor de varredura de promotor de gene de proteína fluorescente dupla (TagRFP e mEmerald), pMTV (Fig. 11), foi pro- jetado especificamente para este estudo. Este vetor contém se- leção de planta dupla, Nos: Bar para dicotiledôneas e PvUbi1+3: Higromicina para monocotiledôneas, e isoladores UASrpg entre cada cassete para evitar leituras cruzadas entre os promotores. Em adição, pMTV contém bordas direita e esquerda para permitir a inserção mediada por Agrobacterium no genoma. Para este estudo, o cassete de rastreamento de promotor de referência foi a pro- teína fluorescente laranja CaMV 35S::TagRFP (OFP), enquanto que o cassete de rastreamento de promotor teste foi o gene repórter da proteína fluorescente verde __ :: mEmerald (GFP) (Fig. 11). Esta concepção ativou as proporções de fluorescência verde-para- vermelho para serem calculadas para cada um dos promotores teste para medir a força relativa de promotor do promotor 35S. Para o clone nos promotores teste, uma amplificação de PCR para cada promotor foi purificada, em seguida, os produtos purificados foram digeridos usando as enzimas de restrição apropriadas (EcoRI e NcoI ou AbsI e NcoI ou PacI e NcoI). O produto digerido foi ligado imediatamente a montante da GFP de acordo com o pro- tocolo (Fig. 11A). Um 35S::GFP foi usado como um controle posi- tivo (Fig. 11B) e uma construção sem promotor foi usada como o controle negativo (Fig. 11C) para cada experimento de transfor- mação. Após clonagem, os amplificons de PCR dos cassetes de teste completos foram verificados por sequência.

[0087] Em 48 horas após a transfecção, a expressão direcionada ao promotor de ubiquitina em protoplastos derivados de LDSC era muito alta, enquanto a expressão era muito baixa de promotores de tubulina, proteína ribossomal e actina conforme avaliado por microscopia (Fig. 13A). Um nível moderado de expressão de GFP foi observado em protoplastos sob o controle dos promotores 35S, Hsp90 e GAL (Fig. 13A). Em protoplastos derivados de todas as fontes, o promotor de referência 35S conduziu a expressão de OFP (Fig. 13 A-D). Os dados quantitativos foram obtidos a partir da razão de fluorescência GFP:OFP em que os dados representam pro- motor relativo: força GFP para o 35S interno:OFP. A razão de promotor ubiquitina:35S para expressão de GFP foi 2,54 para cul- tura de células, 2,11 para folha, 2,31 para caule e 2,36 para cotilédones imaturos (Fig. 14 A-D). Estes resultados sugeriram que a promotor de ubiquitina teve quase duas vezes a força do promotor 35S. Foi também aparente que 35S, Hsp90 e GAL tinham força semelhante à força de promotor da direcionar a expressão GFP; para LDSC (1,05 ± 0,08, 0,95 ± 0,33 e 1,36 ± 1,13), para a folha (1,04 ± 0,03, 1,07 ± 0,19 e 1,13 ± 0,10), para caule (0,99 ± 0,009, 0,74 ± 0,22 e 0,78 ± 0,08) e para cotilédones imaturos (1,03 ± 0,09, 1,06 ± 0,15 e 1,07 ± 0,29) (Fig. 14 A-D). Enquanto os promotores de tubulina, proteína ribossomal e actina tiveram uma expressão de GFP muito baixa na LDSC (0,61 ± 0,18, 0,52 ± 0,16 e 0,68 ± 0,19), na folha (0,75 ± 0,06, 0,71 ± 0,07 e 0,75 ± 0,02), no caule (0,52 ± 0,11, 0,54 ± 0,11 e 0,60 ± 0,12) e em cotilédones imaturos (0,73 ± 0,20, 0,71 ± 0,16 e 0,78 ± 0,29)

(Fig. 14 A-D). Para prever a associação da força de promotor entre LDSCs e outras fontes de protoplastos, foram realizadas análises de correlação e regressão linear simples. Descobrimos que a função de promotor em LDSC foi fortemente relacionada com a folha (y = 1,3982x - 0,397, R2 = 0,9802), caule (y = 1,055x + 0,1297, R2 = 0,927) e cotilédone imaturo (y = 1,1507x - 0,2031, R² = 0,9182) (Fig. 14E). Nós também encontramos o coeficiente de correlação para folha e LDSC de 0,99, de caule e LDSC é de 0,96 e para cotilédones imaturos e LDSC é 0,95.

Exemplo 8: Análise de expressão gênica de tecidos de soja

[0088] Para testar se o promotor de interesse que direciona a expressão do gene endógeno fornece um padrão semelhante, qRT- PCR foi conduzido em tecidos nativos. Iniciadores específicos de gene correspondentes para cada promotor foram concebidos; a Ta- bela 3 mostra a lista de sequências de iniciadores usadas para amplificação qRT-PCR. Nós encontramos os transcritos relativos de ubiquitina foi significativamente mais elevados do que todos os outros promotore/genes testados em cada fonte de tecido (Fig. 15A-D). Não foram há significativas diferenças em relação trans- crição abundância excepto para ubiquitina em todos os tecidos testados (Fig. 15 A-D). Nós também testamos a significância es- tatística quando excluiu-se a expressão do gene da ubiquitina para testar se quaisquer diferenças existem entre os baixos genes expressos. O resultado mostrou diferenças significativas na ex- pressão do gene; para cultura de células (Hsp90 era diferente em relação a outros genes), para folha (Hsp90 e tubulina eram di- ferentes em relação a outros genes), para caule (tubulina era diferente em relação a outros genes) e para cotilédones imaturos

(Hsp90 era diferente em relação a outros genes)). A Tabela 4 mostra a expressão relativa do gene endógeno em tecidos de soja. As comparações foram feitas entre os genes usando a média ± DP da expressão do gene que foi normalizado para o gene da ubiqui- tina de soja. As mesmas letras sobrescritas anteriores signifi- cam o valor indicado de diferença não significativa de acordo com o teste ANOVA de Fisher LSD de teste (p < 0,05).

Tabela 3 Gene Sequência de iniciador (5' a 3') GmUBI3 F: GTGTAATGTTGGATGTGTTCCC (SEQ ID NO: 15) (Ref) R: ACACAATTGAGTTCAACACAAACCG (SEQ ID NO: 16) Actin11 F: ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC (SEQ ID NO: 17) (Ref) R: GCTGGTCCTGGCTGTCTCC (SEQ ID NO: 18) F: GGCACCTCTTAATCCTAA (SEQ ID NO: 19) Actina R: ATAGCGACATACATAGCA (SEQ ID NO: 20) Proteína F: AAGGACCATTATTGTAAGGA (SEQ ID NO: 2 1) ribossomal R: ATTGAACCTCACTGTCTTCG (SEQ ID NO: 22) F: GAAGCCCATTTGGATGAGAA (SEQ ID NO: 23) Hsp90 R: GATAAAGACACGGCGGACAT (SEQ ID NO: 24) F: ACTTGGTGTTGCGTCTTCGT (SEQ ID NO: 25) Ubiquitina R: GCTTGCCAGCAAAAATCAG (SEQ ID NO: 26) F: CAACCAAATTGGAGGCAAGT (SEQ ID NO: 27) Tubulina R: AAGGACCAGAACGCAAGCTA (SEQ ID NO: 28) F: AAGGGGTCTTGTGACTGGTG (SEQ ID NO: 29)

GAL R: TCCCACAAGTTCCCATTCTC (SEQ ID NO: 30)

Tabela 4 Cultura de Cotilédones Gene Folhas Caule células imaturos 2,3 × 10-05 ± 0,063 ± 0,298 ± 0,026 ± Tubulina 8,96 × 10-06ab 0,029a 0,129a 0,015b 0,733 ± 0,066 ± 0,043 ± 0,318 ± Hsp90 0,063a 0,007a 0,018b 0,024a Proteína 0,005 ± 0,001 ± 0,0007± 0,003 ± ribossomal 0,004b 0,0003b 0,0002b 0,0003b 0,029 ± 0,001 ± 0,002 ± 0,001 ±

GAL 0,003b 0,0005b 0,0005b 0,0005b 0,034 ± 0,004 ± 0,005 ± 0,011 ± Actina 0,026b 0,004b 0,004b 0,008b

[0089] Nós também analisamos dados usando actin11 como o pa- drão interno para determinar a abundância de transcritos rela- tiva de genes endógenos em diferentes tipos de tecidos. A con- clusão geral não foi alterada desde as análises anteriores, no entanto estes dados forneceram uma visão adicional de trabalho de comparação de gene (Fig. 16). Os transcritos de ubiquitina foram mais abundantes em folhas, caule e cotilédones imaturos em comparação com culturas de células, enquanto os níveis de trans- crição de tubulina foram mínimos em todas as fontes. Hsp90 mos- trou abundância intermediária de transcritos em cultura de cé- lulas em relação a de folha e cotilédones imaturos, enquanto que os caules tinham transcritos muito baixos. Haviam níveis de abundância de transcrição muito baixos de proteína ribossomal, GAL e actina de todas as fontes.

Exemplo 9: Análise de expressão de protoplasto após transfecção automatizada

[0090] Uma transformação de protoplasto robótica foi utili- zada na viabilidade-teste da soja sistema. O protocolo Lenaghan e Stewart (2019) para varredura baseada em células de tabaco BY- 2 baseado foi utilizado como base para as células de soja para comparar eficiências de etapa com os manuais de manuseio de protoplastos e procedimentos de transformação descritos acima. O robô foi programado para fazer o seguinte procedimento. DNA de plasmídeo pré-carregado (10 µL) e protoplastos (50 µl) em placas de 96 poços fundos foram colocados dentro do ninho. PEG 40% pré- carregado, W5 e WI nas colunas 1, 2 e 3, respectivamente, em placa de 96 poços foi colocado no outro ninho. A solução PEG (60 µL) foi transferida para cada poço da placa de 96 poços contendo os protoplastos e o DNA de plasmídeo utilizando um manipulador líquido. Então, a placa de 96 poços foi transferida para a placa de agitação para misturar PEG e protoplastos. Depois disso, os protoplastos foram permitidos a incubar por 20 minutos a tempe- ratura ambiente e movidos para manipulador líquido de volume grande para adicionar 240 µL de W5 para cada poço. A placa de 96 poços fundos foi removida a partir da plataforma robótica e centrifugada a 100 × G durante 3 minutos. Após centrifugação, a placa de 96 poços fundo foi colocada novamente no ninho e o manipulador líquido foi usado para remover a solução W5 e adi- cionar 200 µL de solução WI. A solução WI contendo o protoplasto foi transferida para uma placa de varredura de 96 poços.

[0091] O protocolo de transformação de protoplastos derivados de LDSC foi conduzido com sucesso usando o sistema robótico. Os protoplastos transfectados automatizados foram capazes de ex- pressar o gene repórter usando duas construções de DNA de plas- mídeo diferentes (pB2GW7 e pMTV) (Fig. 17). Infelizmente, a efi- ciência de transformação foi baixa (4,32 ± 0,64%) em relação aos experimentos manuais (31,06 ± 7,69%). A possível razão para a baixa transformação pode ser a ponta de pipeta estreita (50 mm); ao passo que para o lado de transformação nós usamos pipeta de ponta ampla (70 mm). Outra possível razão pode ser o problema de mistura de PEG e protoplasto. Em nossas mãos, nós observamos diminuição da eficiência de transformação de protoplastos usando tubos Falcon de 15 mL em vez de tubos de poliestireno. Portanto, talvez o procedimento de mistura em placa de 96 poços fundos pode causar baixas taxas de transformação. A otimização dos pro- tocolos e componentes do sistema robótico é necessária para au- mentar a eficiência.

[0092] A automação da transfecção de protoplastos derivados de LDSC pode ser o sistema mais promissor até o momento para a varredura de promotores de alto rendimento relevantes para os atributos de folha. Nós identificamos pelo menos dois fatores críticos no atual protocolo que precisam ser endereçados para aumentar as frequências de transformação. Um dispositivo que pode manusear placas ainda mais profundas > 0,06 mL e pipeta de ponta de furo largo devem melhorar manuseio de protoplastos e alcançar um aumento da eficiência de transformação. Em estudos anteriores, a automação da eficiência de transfecção de proto- plastos BY-2 foi mostrada em ~ 2%; no entanto, este estudo atual alcançou uma transfecção melhor (~ 4%) usando protoplastos de- rivados de LDSC. Outras modificações de protocolos podem ser necessárias para aumentar o a eficiência global do sistema de varredura de alto rendimento. No entanto, nós concluímos que protoplastos de LDSC são viáveis para automatizar usando a trans- formação robótica de protoplastos.

Depósitos

[0093] Um depósito da cultura de suspensão de células de soja derivadas de folha tem sido mantida na Universidade de Tennessee desde antes para a data de arquivamento desta aplicação. Acesso a estes depósitos será disponível durante a pendência da apli- cação para o Comissário de Patentes e Marcas e pessoas determi- nadas pelo Comissário para ter direito aos mesmos mediante pedido. Após a provisão de quaisquer reivindicações na aplicação, os requerentes irão tornar disponível para o público, sem restrição de um depósito de cada uma destas culturas com a Coleção de Cultura de Tipo Americana (ATCC), Manassas, Virginia, 20110. As células depositadas com a ATCC serão tomadas a partir do mesmo depósito mantido na Universidade de Tennessee, como descrito acima. Adicionalmente, o Requerente irá satisfazer todos os re- quisitos de 37 C.F.R §1.801–1.809, incluindo fornecer uma indi- cação da viabilidade da amostra quando o depósito está feito. Este depósito das linhagens de célula mencionadas acima será mantido no Depósito ATCC, que é um depósito público, por um período de 30 anos, ou 5 anos após o pedido mais recente, ou para a vida executável da patente, o que é mais durável, e será substituído se ele nunca se torna inviável durante esse período. O Requerente não vai impor restrições sobre a disponibilidade do material depositado a partir da ATCC; entretanto, o Requerente não tem autoridade para renunciar a quaisquer restrições impos- tas por lei sobre a transferência de material biológico ou seu transporte no comércio.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de uma cultura de suspensão de célula de planta para isolamento de protoplastos, o método caracterizado por compreender: a) gerar calo a partir do tecido foliar; b) transferir o calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células; c) subcultivar a suspensão de células sob condições suficientes para manter as células em um estado viável; e d) filtrar a suspensão de células para remover grandes agrupamentos de células.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a geração de calo do tecido foliar compreende colocar o tecido foliar com o lado adaxial para baixo em um meio de indução de calo.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a geração de calo do tecido foliar compreende manter o tecido foliar sob luz por um tempo suficiente para gerar calo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o tempo suficiente para gerar calo é menor do que cerca de três semanas.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio de indução de calo é suplementado com uma auxina.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a auxina é ácido 2,4-diclorofenoxiacético.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de indução de calo compreende de cerca de 5 μΜ a cerca de 40 μΜ de ácido 2,4- diclorofenoxiacético.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o calo é dividido em pedaços antes de transferir o calo para o meio líquido.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a suspensão de células na etapa c) é mantida no escuro.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o subcultivo compreende coletar o sobrenadante da suspensão de células após permitir que a suspensão de células se deposite por um período de tempo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a filtragem remove os agrupamentos de célula maiores do que cerca de 100 μm.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda criopreservação da cultura de suspensão de célula.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada de soja, batata, tomate, feijão, ervilha, girassol, milho, arroz, cevada e trigo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a planta é soja.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a planta de soja é “Williams 82”.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a obtenção de um protoplasto da cultura de suspensão de célula.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda introduzir um ácido nucleico no protoplasto.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um gene, um promotor, um terminador e/ou um intensificador.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um promotor.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado de um promotor de ubiquitina, um promotor de actina, um promotor de proteína de choque térmico 90, um promotor de proteína ribossômica, um promotor de tubulina e um promotor de α-galactosidase.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um gene repórter.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a introdução é por microinjeção, eletroporação, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por polietileno glicol (PEG), ou bombardeio de microprojéteis.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a introdução é por transformação mediada por PEG.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que a introdução do ácido nucleico é automatizada.

25. Cultura de suspensão de célula de planta caracterizado pelo fato de é produzida de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

26. Protoplasto caracterizado pelo fato de que é obtido de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 24.

27. Protoplasto, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o protoplasto compreende um ácido nucleico exógeno.

28. Protoplasto, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o protoplasto é criopreservado.

29. Método de obtenção de um protoplasto de uma planta, o método caracterizado por compreender: a) fornecer tecido foliar a partir da planta; b) colocar o tecido foliar com o lado adaxial para baixo no meio de indução do calo; c) incubar sob luz por um tempo suficiente para gerar calo; d) dividir o calo em pedaços;

e) transferir os pedaços de calo para um meio líquido para formar uma suspensão de células; f) subcultivar a suspensão de células sob condições suficientes para manter as células em um estado viável; g) filtrar a suspensão de células para remover grandes agrupamentos de célula; h) recuperar uma célula do meio líquido; e i) remover a parede celular da célula com enzimas adequadas para formar um protoplasto.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a introdução de um ácido nucleico no protoplasto.

31. Cultura de suspensão de célula de soja derivada de folha caracterizada pelo fato de que a cultura de suspensão de célula foi depositada sob o Acesso ATCC Nº PTA-XXXX.

32. Cultura de suspensão de célula, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a cultura de suspensão de célula é criopreservada.

33. Protoplasto caracterizado pelo fato de que é produzido a partir da cultura de suspensão de célula conforme definida na reivindicação 31.

34. Protoplasto, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ácido nucleico exógeno.