BR112021004464A2

BR112021004464A2 - composição de ração animal e uso da mesma

Info

Publication number: BR112021004464A2
Application number: BR112021004464-7A
Authority: BR
Inventors: Leticia Cardoso Bittencourt; Rual Lopez-Ulibarri; Estefania Perez Calvo
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.; Novozymes A/S
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-05-25
Also published as: WO2020053275A2; BR112021004464A8; WO2020053275A3; EP3849338A2; AU2019339615A1

Abstract

“COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL E USO DA MESMA”. A presente invenção se refere a um método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas.

Description

“COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL E USO DA MESMA” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[0002] A presente invenção se refere a métodos de tratamento, prevenção ou aprimoramento de uma infecção de um animal usando uma ou mais muramidases microbianas. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] Muramidase, também chamada de lisozima, é uma O- glicosil hidrolase produzida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de paredes celulares bacterianas ao clivar as ligações glicosídicas de peptídeoglicano, uma molécula estrutural importante em bactérias. Após deixar suas paredes celulares enfraquecidas por meio da ação de muramidase, ocorre a lise das células bacterianas como resultado da pressão osmótica não balanceada.

[0004] Muramidase ocorre naturalmente em muitos organismos como vírus, plantas, insetos, aves, répteis e mamíferos. Muramidase foi classificada em cinco famílias de glicosídeo hidrolase (GH) diferentes (CAZy, www.cazy.org): muramidase de clara de ovo de galinha (GH22), muramidase de gema de ovo de galinha (GH23), muramidase de bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). Muramidases das famílias GH23 e GH24 são principalmente conhecidas a partir de bacteriófagos e foram apenas recentemente identificadas nos fungos. Constatou-se que a família de muramidase GH25 não está estruturalmente relacionada a outras famílias de muramidase.

[0005] Muramidase foi tradicionalmente extraída da clara de ovo de galinha devido a sua abundância natural e até muito recentemente a muramidase de clara de ovo de galinha foi a única muramidase investigada para uso na alimentação animal. Muramidase extraída da clara de ovo de galinha é o produto principal disponível no mercado comercial, mas não cliva o ácido N,6-O-diacetilmurâmico em, por exemplo, paredes celulares de Staphylococcus aureus e é, então, incapaz de lisar esse patógeno humano importante, entre outros (Masschalck B, Deckers D, Michiels CW (2002), “Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by muramidase under atmospheric and high hydrostatic pressure”, J Food Prot. 65(12):1916-23).

[0006] O documento WO2000/21381 revela uma composição que compreende pelo menos duas enzimas antimicrobianas e um ácido graxo poli-insaturado, em que uma das enzimas antimicrobianas era uma muramidase de GH22 de clara de ovo de galinha. O documento GB2379166 revela uma composição que compreende um composto que rompe a camada de peptídeoglicano de bactérias e um composto que rompe a camada de fosfolipídeos de bactérias, em que o composto de rompimento de peptídeoglicano era uma muramidase de GH22 da clara de ovo de galinha.

[0007] O documento WO2004/026334 revela uma composição antimicrobiana para suprimir o crescimento de patógenos entéricos no intestino do gado que compreende (a) uma substância de lise de parede celular ou seu sal, (b) uma substância antimicrobiana, (c) um agente de sequestro e (d) um lantibiótico, em que a substância de lise de parede celular ou seu sal é uma muramidase de GH22 da clara de ovo de galinha.

[0008] De modo surpreendente, os inventores da presente invenção revelaram que as muramidases podem ser usadas na ração para tratar, prevenir ou aprimorar uma infecção de um animal monogástrico. Visto que a demanda por proteína animal está crescendo, tal solução que aprimora a saúde do animal é sempre de interesse dos criadores.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para tratar, prevenir ou aprimorar uma infecção de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas. Visão Geral da Listagem de Sequência

[0010] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos maduros de uma muramidase de GH25 do tipo selvagem de Acremonium alcalophilum com SPIRR de N-terminal como descrito no documento WO 2013/076253.

[0011] SEQ ID NO: 2 é a sequência de genes da muramidase de GH24 como isolado de Trichophaea saccata.

[0012] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos como deduzido a partir de SEQ ID NO: 2.

[0013] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase de GH24 do tipo selvagem de Trichophaea saccata.

[0014] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase de GH22 do tipo selvagem de Gallus gallus (muramidase de clara de ovo de galinha).

[0015] SEQ ID NO: 6 é o iniciador F-80470.

[0016] SEQ ID NO: 7 é o iniciador R-80470.

[0017] SEQ ID NO: 8 é o iniciador 8643.

[0018] SEQ ID NO: 9 é o iniciador 8654.

[0019] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos maduros de uma muramidase de GH25 do tipo selvagem de Acremonium alcalophilum como descrito no documento WO 2013/076253.

DEFINIÇÕES

[0020] Muramidase microbiana: O termo “muramidase microbiana” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que é obtida ou obtenível a partir de uma fonte microbiana. Exemplos de fontes microbianas são fungos; isto é, a muramidase é obtida ou obtenível do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Em particular, a muramidase microbiana é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, como o subfilo Pezizomycotina, em que os termos filo e subfilo são as classificações taxonômicas.

[0021] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não é conhecido, a mesma pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica realizando-se uma busca BLASTP do polipeptídeo (com o uso, por exemplo, do site do National Center for Biotechnology Information (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando o mesmo aos homólogos mais próximos. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.

[0022] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das 1,4-beta- ligações entre resíduos de ácido N-acetilmurâmico e N- acetil-D-glucosamina em um peptidoglicano ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriolise devido à pressão osmótica. A muramidase pertence à classe enzimática EC 3.2.1.17. A atividade de muramidase é tipicamente medida por meio de determinação turbidimétrica. O método se baseia nas alterações na turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzida pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais adequadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (consulte INS 1105 do Combined Compendium of Food Additive Specifications da Food and Agriculture Organisation da UN (www.fao.org)). Para o propósito da presente invenção, a atividade de muramidase é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 5 (“Determinação de Atividade de Muramidase”). Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO:

10.

[0023] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de muramidase. Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e tem atividade de muramidase.

[0024] Em um outro aspecto, um fragmento compreende pelo menos 210 aminoácidos, como pelo menos 215 aminoácidos, pelo menos 220 aminoácidos, pelo menos 225 aminoácidos, pelo menos 230 aminoácidos, pelo menos 235 aminoácidos ou pelo menos 240 aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e tem atividade de muramidase.

[0025] Em um aspecto, um fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e tem atividade de muramidase.

[0026] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma que o ambiente não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação a, qualquer enzima, variação, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais a mesma está associada por natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor maior forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0027] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final que segue a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento de N-terminal, truncamento de C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[0028] Identidade de sequência: O parentesco entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0029] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição de EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A saída de Needle identificada como “identidade mais longa” (obtida usando a opção –nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma:

[0030] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Lacunas em Alinhamento)

[0031] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (diversos) resíduos de aminoácido em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa a troca do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de 1, 2 ou 3 aminoácidos adjacentes a e imediatamente um após o aminoácido que ocupa a posição.

[0032] Em um aspecto, uma variante de muramidase de acordo com a invenção pode compreender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; de 1 a 20; de 1 a 25; de 1 a 30; de 1 a 35; de 1 a 40; de 1 a 45; ou de 1-50, isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 alterações e têm pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da presente muramidase, como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO:

10.

[0033] Animal monogástrico: O termo “animal monogástrico” se refere a qualquer animal que tem um estômago de uma câmara simples, exceto humanos. Exemplos de animais monogástricos incluem porcos ou suínos (incluindo, porém sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves, como perus, patos, codornas, galinha-da-angola, gansos, pombos (incluindo pombos jovens) e galinha (incluindo, mas sem limitação, frangos que servem para corte (referido ao presente documento como frangos de corte), frangos, galinhas poedeiras (referidas no presente documento como poedeiras)); animais de estimação, como gato e cachorro; cavalos (incluindo, mas sem limitação, de sangue quente, de sangue frio e de sangue morno), crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus) e peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará- grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe- leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão,

sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco).

[0034] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura solúvel para, ou destinada para consumo por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados assim como vitaminas, minerais, enzimas, ingredientes microbianos de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura) enquanto a ração animal para ruminantes geralmente compreende forragem (incluindo fibras e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados assim como vitaminas, minerais, ingredientes microbianos de alimentação direta de enzimas, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura).

[0035] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com altas concentrações de proteína e energia, como farinha de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (sejam integrais ou preparados por meio de trituração, moagem, etc., de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), torta de prensagem de semente oleaginosa (por exemplo, de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (como farinha de soja), colza/canola, amendoim ou planta oleaginosa da família do amendoim), torta de semente de palma, material derivado de levedura e grãos destiladores (como grãos úmidos de destiladores (WDS) e grãos secos de destiladores com solúveis (DDGS)).

[0036] Forragem: O termo “forragem” como definido no presente documento também inclui fibra. Forragem é o material vegetal fresco como feno e silagem de plantas de forragem, gramíneas e outras plantas de forragem, alga do mar, grãos germinados e legumes, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas de forragem são Alfalfa (luzerna), cornichão perene, brassica (por exemplo, couve- frisada, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo alsike, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), gramínea (por exemplo, grama- bermudas, capim, aveia-perene, festucas, cambaleia-grama, prados, panasco, azevém, erva-dos-prados), milho (maís), painço, cevada, aveia, centeio, sorgo, sojas e trigo e vegetais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura de produção de grãos (como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de vegetais como colos de beterraba; resíduos da produção de semente como caules e folhas da soja, colza e outros legumes; e frações do refino de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.

[0037] Fibra: O termo “fibra” significa material vegetal seco com altos níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de culturas (como paleta, copra, palha, joio, resíduo de beterraba sacarina).

[0038] Tratamento: o termo “tratar” significa atenuação, como um todo ou em parte, de uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, ou um sintoma das mesmas, ou retardamento ou parada da progressão adicional ou agravamento de uma infecção.

[0039] Prevenção: o termo "prevenir" significa a prevenção do surgimento, recorrência ou velocidade, como um todo ou em parte, de uma infecção, como infeções por Eimeria e Clostridium perfringes ou um sintoma das mesmas.

[0040] Aprimoramento: o termo “aprimorar” significa que um ou mais parâmetros influenciados por uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, estão alterando em uma direção desejada. Por exemplo, nos frangos de corte com infeções por Eimeria e Clostridium perfringes, o ganho de peso corporal é aumentado, a lesão corporal é reduzida e a expressão das citocinas anti-inflamatórias, como IL10 e IL8, é aumentada, etc.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Métodos de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções

[0041] Constatou-se surpreendentemente que a suplementação de uma ração animal com uma muramidase microbiana resulta em um benefício significativo de tratamento, prevenção ou aprimoramento de uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, em um animal monogástrico, em comparação a uma ração animal sem a muramidase microbiana.

[0042] Particularmente, constatou-se de modo surpreendente que a suplementação de uma ração animal com uma muramidase microbiana pode aprimorar os seguintes parâmetros dos frangos de corte que são infectados por Eimeria e Clostridium perfringes: a) desempenho de crescimento, como ganho de peso, ingestão de ração e/ou razão de conservação de alimento (FCR);

b) lesões macroscópicas e histológicas; c) expressão de citocinas anti-inflamatórias, como IL10 e IL8; e/ou d) teor de carotenoides no sangue.

[0043] Desse modo, a invenção se refere a um método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas.

[0044] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser dosada em um nível de 100 a 1000 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg, 500 a 600 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0045] Na presente invenção, o animal monogástrico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo domesticado, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto, gato, cão, cavalo, crustáceos, camarões menores, camarões maiores, peixe, seriola, pirarucu, barbo, bass, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, char, ciclídeos, bijupirá, bacalhau, gênero crappie, dorada, freshwater drum, enguia, peixe goby, peixinho-dourado, gourami, garoupa, guapote, halibute, musgo de java, labeo, lai, loach, cavala japonesa, peixe-leite, mojarra, peixe pulmonado, tainha, paco, pearlspot, pejerrey, perca, pike,

pompano, peixe-barata roach, salmão, sampa, sauger, robalo japonês, seabream, shiner, sleeper, snakehead, snapper, snook, linguado, spinefoot, esturjão-branco, peixe-lua, sweetfish, tench, terror, tilápia, truta, atum, pregado, vendace, walleye e peixes brancos. Preferencialmente, o animal monogástrico é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo jovem, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto. Mais preferencialmente, o animal monogástrico é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial e pinto.

[0046] Na presente invenção, a microbiana pode ser fornecida ao animal desde o nascimento até ao abate. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida ao animal diariamente desde o nascimento até ao abate. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida ao animal diariamente por pelo menos 10 dias, como pelo menos 15 dias ou pelo menos 20 dias (em que os dias podem ser contínuos ou não contínuos) durante o período de vida do animal. Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida ao animal por 10-20 dias seguido de um período sem tratamento de 5-10 dias, e esse ciclo é repetido durante o período de vida do animal.

[0047] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos frangos de corte pelos primeiros 49 dias após a eclosão. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte pelos primeiros

36 dias após a eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte nos dias 22 a 36 após a eclosão. Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período de pré-iniciador (dias 1-7). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período iniciador (dias 8- 22). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período pré- iniciador (dias 1-7) e iniciador (dias 8-22).

[0048] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida às poedeiras para produção comercial durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos poedeiras para produção comercial por 76 semanas de eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos poedeiras para produção comercial durante o período de descanso, (de aproximadamente 18 semanas). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida às poedeiras para produção comercial durante o período de descanso, mas retida durante o período de muda forçada.

[0049] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos perus durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos perus por 24 semanas de eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos perus pelos primeiros 16 semanas de eclosão (para fêmeas) e pelos primeiros 20 semanas para eclosão (para machos).

[0050] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos suínos durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos suínos por 27 semanas a partir do nascimento. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões do nascimento ao desmame (em 4 semanas). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões pelos primeiros 6 semanas a partir do nascimento (4 semanas de lactação e 2 semanas pós-desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o pré-iniciador (dias 1-14 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o período iniciador (dias 15-42 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o período pré- iniciador (dias 1-14 após o desmame) e iniciador (dias 15- 42 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos suínos durante o período de colheita/engorda (semana 10 a aproximadamente semana 27 após o nascimento).

[0051] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser de origem fúngica. Preferencialmente, a muramidase microbiana é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, como o subfilo Pezizomycotina. Preferencialmente, a muramidase microbiana compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25.

[0052] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ter pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos

88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1, 4 ou 10.

[0053] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de muramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Preferencialmente, a muramidase microbiana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma variante alélica da mesma e uma etiqueta His e/ou etiqueta Hq de N-terminal e/ou C-terminal. Mais preferencialmente, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO:

1.

[0054] Alternativamente, a muramidase microbiana pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de muramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 210 aminoácidos, como pelo menos 215 aminoácidos, pelo menos 220 aminoácidos, pelo menos 225 aminoácidos, pelo menos 230 aminoácidos, pelo menos 235 aminoácidos ou pelo menos 240 aminoácidos. Preferencialmente, a muramidase microbiana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica da mesma e uma etiqueta His e/ou etiqueta Hq de N-terminal e/ou C-terminal. Mais preferencialmente, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 4.

[0055] Mais alternativamente, a muramidase microbiana pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de muramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 210 aminoácidos, como pelo menos 215 aminoácidos, pelo menos 220 aminoácidos, pelo menos 225 aminoácidos, pelo menos 230 aminoácidos, pelo menos 235 aminoácidos ou pelo menos 240 aminoácidos. Preferencialmente, a muramidase microbiana compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou uma variante alélica da mesma e uma etiqueta His e/ou etiqueta Hq de N-terminal e/ou C-terminal. Mais preferencialmente, o polipeptídeo compreende ou consiste em aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10.

[0056] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser uma variante da SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições, e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer combinação das mesmas nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50. Preferencialmente, o número de posições que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas na SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 é entre 1 e 45, como nas posições 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5. Mais preferencialmente, o número de posições que compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas na SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 é não superior a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Com preferência adicional, o número de substituições, deleções, e/ou inserções na SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 é não superior a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Com preferência adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, na SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 é não superior a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Com preferência adicional, o número de substituições conservativas na SEQ ID NO: 1, 4 ou 10 é não superior a 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0057] Qualquer pessoa versada na técnica pode entender que o polipeptídeo da muramidase microbiana pode ter alterações de aminoácidos. As alterações de aminoácido podem ser de natureza secundária, ou seja, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o enovelamento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões de terminal amino ou carboxila, como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo de ligante pequeno de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação alterando- se a carga líquida ou uma outra função, como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0058] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, geralmente, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0059] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de muramidase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consulte também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia,

difração de elétrons ou marcação de fotoafinidade, em conjunto com a mutação de aminoácidos do sítio de contato putativo. Consulte, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0060] A estrutura de cristal da CBS114.92 muramidase de Acremonium alcalophilum foi resolvida em uma resolução de 1,3 Å como revelado no documento WO 2013/076253. Essas coordenadas atômicas podem ser usadas para gerar um modelo tridimensional que descreve a estrutura da CBS114.92 muramidase de Acremonium alcalophilum ou estruturas homólogas (como as variantes da presente invenção). Usando a estrutura de raios X, os resíduos de aminoácido D95 e E97 (usando SEQ ID NO: 1 para numeração) foram identificados como resíduos catalíticos.

[0061] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas, em que: (a) a muramidase microbiana é uma muramidase microbiana que compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25, é dosada em um nível de 300 a 500 mg de proteína de enzima por kg de ração animal; e

(b) o animal é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto.

[0062] Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas, em que: (a) a muramidase microbiana é uma muramidase de GH24 ou GH25 obtida ou obtenível do filo Ascomycota, e é dosada em um nível de 300 a 500 mg de proteína de enzima por kg de ração animal; e (b) o animal é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto. Formulação

[0063] A muramidase microbiana da presente invenção pode ser formulada como uma composição para tratar, prevenir ou aprimorar uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico, o que a presente invenção também se destina a abranger. A muramidase microbiana da presente invenção pode ser formulada como um líquido ou um sólido.

[0064] Para uma formulação líquida, o agente de formulação pode compreender um poliol (como, por exemplo, glicerol, etileno glicol ou propileno glicol), um sal

(como, por exemplo, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio) ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol). Desse modo, a composição da presente invenção pode ser uma composição líquida que compreende a muramidase microbiana da presente invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados a partir da lista que consiste em glicerol, etileno glicol, 1,2-propileno glicol, 1,3- propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol. A formulação líquida pode ser aspergida na ração após ser peletizada ou pode ser adicionada à água potável fornecida aos animais.

[0065] Para uma formulação sólida, a composição da presente invenção pode ser, por exemplo, como um grânulo, pó seco por aspersão ou aglomerado. O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio como, por exemplo, como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol).

[0066] Por exemplo, a composição sólida está na forma granulada. O grânulo pode ter uma estrutura de matriz em que os componentes são misturados de modo homogêneo. No entanto, o grânulo compreende tipicamente uma partícula central e um ou mais revestimentos, que são tipicamente revestimentos de sal e/ou cera. Exemplos de ceras são polietileno glicóis; polipropilenos; cera de carnaúba; cera de candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal, como sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenado e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácido graxo; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e derivados dos mesmos. Uma cera preferencial é o óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado. A partícula central pode ser uma mistura homogênea de muramidase da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais e opcionalmente em conjunto com um ou mais sais ou uma partícula inerte com a muramidase da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais aplicadas na mesma.

[0067] No grânulo acima, o material das partículas centrais pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em sais inorgânicos (como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), moléculas orgânicas pequenas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidratado). Preferencialmente, o núcleo compreende um mineral de argila como caolinita ou caulim.

[0068] O revestimento de sal tem tipicamente pelo menos 1 µm de espessura e pode ser um sal particular ou uma mistura de sais, como Na2SO4, K2SO4, MgSO4 e/ou citrato de sódio. Outros exemplos são aqueles descritos, por exemplo, nos documentos WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 1997/05245, WO 1998/54980, WO 1998/55599, WO 2000/70034 ou revestimento de polímero como descrito no documento WO 2001/00042.

[0069] Preferencialmente, a composição da presente invenção é uma composição sólida que compreende a muramidase da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados a partir da lista que consiste em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. Mais preferencialmente, o agente de formulação é selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio e carbonato de cálcio. Com preferência adicional, a composição sólida está na forma granulada. Com mais preferência adicional, a composição sólida está na forma granulada e compreende uma partícula central, uma camada de enzima para propósito comercial que compreende a muramidase da invenção e um revestimento de sal.

[0070] Preferencialmente, o agente de formulação é selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: glicerol, etileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose. Mais preferencialmente, o agente de formulação é selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: 1, 2- propileno glicol, 1, 3-propileno glicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio. Ração Animal e Aditivos de Ração Animal

[0071] A muramidase microbiana da presente invenção também pode ser formulada como ração animal ou aditivo de ração animal para tratar, prevenir ou aprimorar uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal, o que a presente invenção também se destina a abranger.

[0072] Dietas ou composições de ração animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B do documento WO 2001/058275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 desta Tabela B. Ademais, tais dietas de peixe normalmente têm um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.

[0073] Uma composição de ração animal de acordo com a presente invenção pode ter um teor de proteína bruta entre 50 e 800 g/kg, e compreende adicionalmente uma ou mais muramidases microbianas como descrito no presente documento.

[0074] Adicional ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da presente invenção pode ter um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1- 200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0075] Particularmente, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina pode estar em qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B do documento WO 2001/058275 (R. 2- 5).

[0076] O teor de nitrogênio é determinado pelo método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14ª ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC, EUA) e proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicada por um fator 6,25 (isto é, Proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25).

[0077] A energia metabolizável pode ser calculada com base nas exigências de Nutriente da publicação de NRC em suínos, nona edição revisada 1988, subcomissão em nutrição de suínos, comitê sobre nutrição de animal, conselho de agricultura, Concelho Nacional de Pesquisa. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2- 6, e a Tabela Europeia de Valores Energéticos para Alimentos para Aves, Centro Spelderholt para pesquisa e extensão de aves, 7361 DA Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

[0078] O teor dietário de cálcio, fósforo e aminoácidos disponíveis em dietas animais completas é calculado com base nas tabelas alimentícias como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

[0079] A composição de ração animal da presente invenção pode conter pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.

[0080] A composição de ração animal da presente invenção também pode conter proteína animal, como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou farinha de peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25 %. A composição de ração animal da presente invenção também pode compreender Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.

[0081] Preferencialmente, a composição de ração animal da presente invenção contém 0-80 % de maís; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de Cevada; e/ou 0- 30 % de aveia; e/ou 0-40 % de farinha de soja; e/ou 0-25 % de farinha de peixe; e/ou 0-25 % de farinha de carne e ossos; e/ou 0-20 % de soro de leite.

[0082] Preferencialmente, a ração animal da presente invenção compreende proteínas vegetais. O teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % (p/p).

[0083] Na presente invenção, as proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoço, farinha de colza e combinações dos mesmos.

[0084] A fonte de proteína vegetal pode consistir em material a partir de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. A fonte de proteína vegetal também pode consistir em material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza e repolho. A soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.

[0085] As dietas animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração amassada (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações enzimáticas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração amassada uma formulação enzimática sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturação de ingrediente. Para a ração peletizada (líquida ou sólida) a preparação de muramidase/enzima também pode ser adicionada antes ou durante a etapa de ingrediente de ração. Tipicamente, uma preparação enzimática líquida compreende a muramidase microbiana da presente invenção opcionalmente com um poliol, como glicerol, etileno glicol ou propileno glicol, e é adicionada após a etapa de peletização, como pela aspersão da formulação líquida nos péletes. A muramidase também pode ser incorporada em uma pré-mistura ou aditivo de ração.

[0086] Alternativamente, a muramidase microbiana da presente invenção pode ser preparada congelando-se uma mistura de solução enzimática líquida com um agente avolumador, como farinha de soja moída e liofilizando-se, então, a mistura.

[0087] Na presente invenção, a composição de ração animal pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, micróbios, vitaminas, minerais, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração.

[0088] Preferencialmente, a composição compreende uma ou mais das muramidases microbianas da presente invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais componentes selecionados a partir da lista que consiste em: uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e um ou mais outros ingredientes de ração.

[0089] A concentração de muramidase final na composição de ração animal da presente invenção pode estar dentro da faixa de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, como 0,1 a 150 mg, 0,5 a 100 mg, 1 a 75 mg, 2 a 50 mg, 3 a 25 mg, 2 a 80 mg, 5 a 60 mg, 8 a 40 mg ou 10 a 30 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0090] Contempla-se atualmente que a muramidase microbiana é administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01-200; 0,01-100; 0,5- 100; 1-50; 5-100; 5-50; 10-100; 0,05-50; 5-25; ou 0,10-10 – em que todas essas faixas estão em mg muramidase por kg de ração (ppm).

[0091] Para determinar mg de proteína muramidase por kg de ração, a muramidase é purificada a partir da composição de ração, e a atividade específica da muramidase purificada é determinada usando um ensaio relevante (consulte sob a atividade de muramidase). A atividade de muramidase da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio, e com base nessas duas determinações, a dosagem em mg de proteína muramidase por kg de ração é calculada.

[0092] O aditivo de ração animal da presente invenção é destinado a estar incluído (ou prescrito como tendo que estar incluído) em dietas para animais ou rações em níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente, 0,05 a 5,0 %; ou 0,2 a 1,0 % (% que significa g de aditivo por 100 g de ração). Isso é, então, em particular para pré-misturas.

[0093] Os mesmos princípios se aplicam para determinar mg de proteína muramidase em aditivos de ração. Certamente, se uma amostra estiver disponível da muramidase usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partir dessa amostra (não há necessidade de purificar a muramidase da composição de ração ou do aditivo). Enzimas Adicionais

[0094] Na presente invenção, as composições ou ração animal ou aditivo de ração animal descrito no presente documento incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), vide também o site na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. É principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Essa nomenclatura de Enzima de IUB-MB tem como base sua especificidade de substrato e, ocasionalmente, seu mecanismo molecular; tal classificação não reflete os recursos estruturais dessas enzimas.

[0095] Uma outra classificação de certas enzimas de hidrolases de glicosídeos, como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase, muramidase e galactosidase é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490-D495; consulte também www.cazy.org.

[0096] Desse modo, a composição ou ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender pelo menos uma outra enzima selecionada a partir do grupo que consiste em fitase (EC 3.1.3.8 ou

3.1.3.26), xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC

3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC

3.4); fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC

3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55); beta-xilosidase (EC 3.2.1.37); acetil xilan esterase (EC 3.1.1.72); feruloil esterase (EC 3.1.1.73); celulase (EC 3.2.1.4); celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91); beta-glucosidase (EC 3.2.1.21); pululanase (EC 3.2.1.41), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), mananase (EC 3.2.1.25) e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6) ou qualquer combinação dos mesmos.

[0097] Os exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB enzimas), OptiPhos® (Huvepharma) Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.

[0098] Os exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX e Ronozyme® G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma) e Axtra® XB (Xylanase/beta-glucanase, DuPont).

[0099] Exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products). Micróbios

[0100] Na presente invenção, a composição ou ração animal ou aditivo de ração animal pode compreender adicionalmente um ou mais micróbios adicionais. Por exemplo, a composição ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.

[0101] Preferencialmente, a composição ou ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.

[0102] Mais preferencialmente, a composição ou ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA-6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B- 50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-

7547.

[0103] Mais preferencialmente, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-50886.

[0104] Mais preferencialmente, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.

[0105] Mais preferencialmente, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29872, NRRL B 50607, PTA-7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.

[0106] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção está entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, preferencialmente, entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca, mais preferencialmente, entre 1x107 e 1x1011 e, com máxima preferência, entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.

[0107] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção está entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, preferencialmente, entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, mais preferencialmente, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia e, com máxima preferência, entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia.

[0108] Na presente invenção, a uma ou mais cepas bacterianas podem estar presentes na forma de um esporo estável. Pré-mistura

[0109] Na presente invenção, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal pode incluir uma pré-mistura, que compreende, por exemplo, vitaminas, minerais, enzimas, aminoácidos, conservativos, antibióticos, outros ingredientes de ração ou qualquer combinação dos mesmos que são misturados na ração animal. Aminoácidos

[0110] A composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Os exemplos dos aminoácidos incluem, porém sem limitação, lisina, alanina, beta- alanina, treonina, metionina e triptofano. Vitaminas e Minerais

[0111] Na presente invenção, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Opcionalmente, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção pode incluir um ou mais minerais, como uma ou mais minerais-traço e/ou uma ou mais macro minerais.

[0112] Geralmente, vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traço formam parte de uma denominada pré-mistura pretendida para a adição à ração, ao passo que macrominerais geralmente são adicionados separadamente à ração.

[0113] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

[0114] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

[0115] Os exemplos não limitativos de minerais residuais incluem boro, cobalto, cloreto, cromo, cobre, fluoreto, iodo, ferro, manganês, molibdênio, selênio e zinco.

[0116] Os exemplos não limitativos de macrominerais incluem cálcio, magnésio, potássio e sódio.

[0117] As exigências nutricionais desses componentes (exemplificados com aves e leitões/porcos) são listadas na Tabela A do documento WO 2001/058275. Requisitos nutricionais significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

[0118] Como alternativa, a composição, ração animal ou aditivo de ração animal para ração da presente invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do documento WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dentre, um ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, esse pelo menos um componente individual está incluído na composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção em tal quantidade de modo a fornecer uma concentração em ração dentro da faixa indicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis de Tabela A.

[0119] Preferencialmente, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas abaixo, para fornecer uma concentração em ração dentro das faixas especificadas na Tabela 1 abaixo (para dietas para leitão e poedeira, respectivamente).

[0120] Tabela 1: Recomendações de vitamina típicas Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte

10.000-15.000 8-12.500 IU/kg de Vitamina A IU/kg de ração ração 1800-2000 IU/kg de 3000-5000 IU/kg Vitamina D3 ração de ração 60-100 mg/kg de 150-240 mg/kg de Vitamina E ração ração 2-4 mg/kg de Vitamina K3 2-4 mg/kg de ração ração 2-3 mg/kg de Vitamina B1 2-4 mg/kg de ração ração 6-10 mg/kg de 7-9 mg/kg de Vitamina B2 ração ração 3-6 mg/kg de Vitamina B6 4-8 mg/kg de ração ração

Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte 0,03-0,05 mg/kg de 0,015-0,04 mg/kg Vitamina B12 ração de ração Niacina 30-50 mg/kg de 50-80 mg/kg de (Vitamina B3) ração ração Ácido 20-40 mg/kg de 10-18 mg/kg de Pantotênico ração ração 1-2 mg/kg de Ácido fólico 1-2 mg/kg de ração ração 0,15-0,4 mg/kg de 0,15-0,3 mg/kg de Biotina ração ração Cloreto de 200-400 mg/kg de 300-600 mg/kg de colina ração ração Outros ingredientes de ração

[0121] A composição, ração animal ou aditivo de ração animal da presente invenção pode compreender adicionalmente agentes corantes, estabilizadores, aditivos para melhorar o crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs); espécies de geração de oxigênio reativo, peptídeos antimicrobianos e polipeptídeos antifúngicos.

[0122] Os exemplos dos agentes corantes são carotenoides, como beta-caroteno, astaxantina e luteína.

[0123] Os exemplos dos agentes de estabilização (por exemplo, acidificantes) são ácidos orgânicos. Os exemplos desses são ácido benzoico (VevoVitall®, DSM Nutritional

Products), ácido fórmico, ácido butírico, ácido fumárico e ácido propiônico.

[0124] Os exemplos dos compostos de aroma/aromatizantes são creosol, anetol, deca, undeca e/ou dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilidena fatalida, butilideno fatalida, capsaicina e tanina.

[0125] Exemplos dos ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso-hexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.

[0126] Os exemplos das espécies de geração de oxigênio reativo são produtos químicos, como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas, como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[0127] Os exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina, como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, que incluem os compostos e polipeptídeos revelados nos documentos WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos dos mencionados acima que retêm atividade antimicrobiana.

[0128] Os exemplos dos polipeptídeos antifúngicos (AFP’s) são os peptídeos Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como variantes e fragmentos dos mesmos que retêm atividade antifúngica, como revelado nos documentos WO 94/01459 e WO 02/090384. Uso de lizozima microbiano

[0129] Em um outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal para tratar, prevenir ou aprimorar uma infecção, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes infecções, de um animal monogástrico em que a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal compreende uma ou mais muramidases microbianas.

[0130] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser dosada em um nível de 100 a 1000 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg, 500 a 600 mg de proteína de enzima por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0131] Na presente invenção, o animal monogástrico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo domesticado, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto, gato, cão, cavalo, crustáceos, camarões menores, camarões maiores, peixe, seriola, pirarucu, barbo, bass, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, char, ciclídeos, bijupirá, bacalhau, gênero crappie, dorada, freshwater drum, enguia, peixe goby, peixinho-dourado, gourami, garoupa, guapote, halibute, musgo de java, labeo, lai, loach, cavala japonesa, peixe-leite, mojarra, peixe pulmonado, tainha, paco, pearlspot, pejerrey, perca, pike, pompano, peixe-barata roach, salmão, sampa, sauger, robalo japonês, seabream, shiner, sleeper, snakehead, snapper, snook, linguado, spinefoot, esturjão-branco, peixe-lua, sweetfish, tench, terror, tilápia, truta, atum, pregado, vendace, walleye e peixes brancos. Preferencialmente, o animal monogástrico é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo jovem, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto. Mais preferencialmente, o animal monogástrico é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial e pinto.

[0132] Na presente invenção, a microbiana pode ser fornecida ao animal desde o nascimento até ao abate. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida ao animal diariamente desde o nascimento até ao abate. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida ao animal diariamente por pelo menos 10 dias, como pelo menos 15 dias ou pelo menos 20 dias (em que os dias podem ser contínuos ou não contínuos) durante o período de vida do animal. Em uma modalidade, a muramidase microbiana é fornecida ao animal por 10-20 dias seguido de um período sem tratamento de 5-10 dias, e esse ciclo é repetido durante o período de vida do animal.

[0133] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos frangos de corte pelos primeiros 49 dias após a eclosão. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte pelos primeiros 36 dias após a eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte nos dias 22 a 36 após a eclosão. Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período de pré-iniciador (dias 1-7). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período iniciador (dias 8- 22). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos frangos de corte durante o período pré- iniciador (dias 1-7) e iniciador (dias 8-22).

[0134] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida às poedeiras para produção comercial durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos poedeiras para produção comercial por 76 semanas de eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos poedeiras para produção comercial durante o período de descanso, (de aproximadamente 18 semanas). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida às poedeiras para produção comercial durante o período de descanso, mas retida durante o período de muda forçada.

[0135] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos perus durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos perus por 24 semanas de eclosão. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos perus pelos primeiros 16 semanas de eclosão (para fêmeas) e pelos primeiros 20 semanas para eclosão (para machos).

[0136] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser fornecida aos suínos durante o período de vida do animal. Preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos suínos por 27 semanas a partir do nascimento. Mais preferencialmente, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões do nascimento ao desmame (em 4 semanas). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões pelos primeiros 6 semanas a partir do nascimento (4 semanas de lactação e 2 semanas pós-desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o pré-iniciador (dias 1-14 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o período iniciador (dias 15-42 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos leitões desmamados durante o período pré- iniciador (dias 1-14 após o desmame) e iniciador (dias 15- 42 após o desmame). Com preferência adicional, a muramidase microbiana é fornecida aos suínos durante o período de colheita/engorda (semana 10 a aproximadamente semana 27 após o nascimento).

[0137] Na presente invenção, a muramidase microbiana pode ser de origem fúngica. Preferencialmente, a muramidase microbiana é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, como o subfilo Pezizomycotina. Preferencialmente, a muramidase microbiana compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25.

EXEMPLOS Cepas

[0138] Trichophaea saccata CBS804.70 foi adquirida a partir de Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrecht, os Países Baixos). De acordo com Central Bureau vor Schnimmelkulture, Trichophaea saccata CBS804.70 foi isolado do solo de depósito de carvão de Staffordshire, Inglaterra em maio de 1968.

[0139] De acordo com Central Bureau vor

Schnimmelkulture, Acremonium alcalophilum CBS 114.92 foi isolado por A. Yoneda em 1984 do lodo do composto de excremento de porco próximo ao Lago Tsukui, Japão. Meios e Soluções

[0140] YP + 2 % de meio de glicose foram compostos de 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona e 2 % de glicose.

[0141] YP + 2 % de meio de maltodextrina foram compostos de 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona e 2 % de maltodextrina.

[0142] As placas de ágar PDA foram compostas de infusão de batata (infusão de batata foi feita fervendo-se 300 g de batatas fatiadas (lavadas, mas não descascadas) em água por 30 minutos e, então, decantando ou coando o caldo em gaze). A água destilada que foi, então, adicionada até o volume total da suspensão foi um litro, seguido de 20 g de dextrose e 20 g de pós de ágar. O meio foi esterilizado por autoclave em 0,10 Mpa (15 psi) por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8ª Edição, Revisão A, 1998).

[0143] As placas de LB foram compostas de 10 g de Bacto- Triptono, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de Bacto-ágar, e água deionizada para 1 litro.

[0144] O meio de LB foi composto de 10 g de Bacto- Triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, e água deionizada para 1 litro.

[0145] As placas de COVE sacarose foram compostas de 342 g de sacarose, 20 g de pós de ágar, 20 ml de soluções de sais COVE e água deionizada para 1 litro. O meio foi esterilizado por autoclave em 0,10 Mpa (15 psi) por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8ª Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado a 60 °C e acetamida a 10 mM, CsCl a 15 mM, TRITON® X-100 (50 µl/500 ml) foram adicionados.

[0146] A solução de sais COVE foi composta de 26 g de MgSO4•7H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solução de metais-traço COVE e água deionizada para 1 litro.

[0147] A solução de metais-traço COVE foi composta de 0,04 g de Na2B4O7•10H2O, 0,4 g de CuSO4•5H2O, 1,2 g de FeSO4•7H2O, 0,7 g de MnSO4•H2O, 0,8 g de Na2MoO4•2H2O, 10 g de ZnSO4•7H2O e água deionizada para 1 litro. Exemplo 1: Clonagem, Expressão e Purificação da muramidase de GH25 de Acremonium alcalophilum CBS 114.92

[0148] A muramidase de GH25 de Acremonium alcalophilum CBS 114.92 (SEQ ID NO: 1) foi clonada e expressa como descrito no exemplo 8 e purificada como descrito no exemplo 5 do documento WO 2013/076253. Alternativamente, SEQ ID NO: 10 pode ser clonada e expressa como descrito no exemplo 2 do documento WO 2013/076253. Exemplo 2: Expressão da muramidase de GH24 de Trichophaea saccata

[0149] A cepa fúngica foi cultivada em 100 ml de YP + 2 % de meio de glicose em 1000 ml de frascos de agitação Erlenmeyer por 5 dias a 20 °C. Os micélios foram colhidos dos frascos por filtração do meio através de um funil de vácuo Buchner revestido com MIRACLOTH® (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA). Os micélios foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ºC até o uso adicional. O DNA genômico foi isolado usando um kit DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

[0150] As informações da sequência genômica foram geradas por Illumina MySeq (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). 5 µg do DNA genômico de Trichophaea saccata isolado foram usados para a preparação e análise da biblioteca de acordo com as instruções do fabricante. Uma estratégia de extremidade emparelhada de 100 pb foi empregada com um tamanho de inserção de biblioteca de 200-500 pb. Metade de uma execução HiSeq foi usada para o total de 95.744.298 leituras brutas de 100 pb obtidas. As leituras foram subsequentemente fracionadas para 25 %, seguido por corte (extração de sub-sequências mais longas com pontuações de Phred de 10 ou mais). Essas leituras foram montadas usando Idba versão 0.19. Contigs menores que 400 pb foram descartados, resultando em 8.954.791.030 pb com um N-50 de

10.035. Os genes foram chamados usando GeneMark.hmm ES versão 2.3c e a identificação do domínio catalítico foi feita usando "Phage muramidase PF00959" Modelo de Markov Oculto fornecido por Pfam. A sequência de codificação do polipeptídeo para toda a região de codificação foi clonada a partir de DNA genômico de Trichophaea saccata CBS804.70 por PCR usando os iniciadores F-80470 e R-80470 (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 respectivamente) como descrito abaixo. 5’- ACACAACTGGGGATCCACCATGCACGCTCTCACCCTTCT -3’ (SEQ ID NO: 6) 5’- CTAGATCTCGAGAAGCTTTTAGCACTTGGGAGGGTGGG -3’ (SEQ ID NO: 7)

[0151] Letras em negrito representam sequência de codificação de enzima de Trichophaea saccata. Os sítios de restrição estão sublinhados. A sequência à esquerda dos sítios de restrição é homóloga aos sítios de inserção de pDau109 (documento WO 2005/042735).

[0152] A mistura de PCR de extensor HIFI, com concentração 2x (Thermo Scientific nº de cat AB-0795) foi usada para o experimento.

[0153] A reação de amplificação (25 µl) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Scientific nº de cat AB-0795) com as seguintes concentrações finais: mistura de PCR: 0,5 µM de Iniciador F-80470 0,5 µM de Iniciador R-80470 12,5 µl de Mistura de PCR de Extensor HIFI, 2x conc. 11,0 µl de H2O 10 ng de DNA genômico de Trichophaea saccata CBS804.70.

[0154] A reação de PCR foi incubada em um Ciclador Térmico de Bloco Duplo DYAD® (BioRad, EUA) programado para 1 ciclo a 94 °C por 30 segundos; 30 ciclos, cada um a 94 °C por 30 segundos, 52 °C por 30 segundos e 68 °C por 60 segundos seguido de 1 ciclo a 68 °C por 6 minutos. As amostras foram resfriadas a 10 °C antes da remoção e processamento adicional.

[0155] Três µl da reação de PCR foram analisados por 1 % de eletroforese em gel de agarose usando base Tris a 40 mM, acetato de sódio a 20 mM, tampão de EDTA dissódico (TAE) a 1 mM. Observou-se uma faixa principal de cerca de 946 pb. A reação de PCR restante foi purificada diretamente com um Kit de Purificação de Faixa e Gel de DNA de PCR ILLUSTRA™ GFX™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[0156] Dois µg do plasmídeo pDau109 foram digeridos com Bam HI e Hind III e o plasmídeo digerido foi passado em um gel de agarose a 1 % usando base Tris a 50 mM-ácido bórico a 50 mM-tampão de EDTA dissódico (TBE) a 1 mM, a fim de remover o fragmento empacotador do plasmídeo restrito. As faixas foram visualizadas pela adição de cepa de gel de DNA SYBR® Safe (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EUA) e uso de um transiluminador de comprimento de onda de 470 nm. A faixa correspondente ao plasmídeo restrito foi excisada e purificada usando um kit de Purificação de Faixa de Gel e DNA de PCR ILLUSTRA ™ GFX ™. O plasmídeo foi eluído em Tris a 10 mM pH 8,0 e a sua concentração ajustada para 20 ng por µl. Um Kit de Clonagem IN-FUSION® PCR (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA) foi usado para clonar o fragmento de PCR de 983 pb em pDau109 digerido com Bam HI e Hind III (20 ng). O volume de reação total de IN-FUSION® foi 10 µl. O volume de reação total de IN-FUSION® foi 10 µl. A reação de IN-FUSION® foi transformado em células E. coli de FUSION-BLUE™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e plaqueadas em placas de LB ágar suplementadas com 50 µg de ampicilina por ml. Após a incubação durante a noite a 37 °C, colônias transformantes foram observadas crescendo sob a seleção nas placas de LB suplementadas com 50 µg de ampicilina por ml.

[0157] Várias colônias foram selecionadas para análise por PCR de colônia usando os iniciadores de vetor pDau109 descritos abaixo. Quatro colônias foram transferidas das placas de LB suplementadas com 50 µg de ampicilina por ml com um pino de inoculação amarelo (Nunc A/S, Dinamarca)

para novas placas de LB suplementadas com 50 µg de ampicilina por ml e incubadas durante a noite a 37 °C. Iniciador 8653: 5’-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’ (SEQ ID NO: 8) Iniciador 8654: 5’-CATATAACCAATTGCCCTC-3’ (SEQ ID NO: 9)

[0158] Cada uma das três colônias foi transferida diretamente em 200 µl de tubos de PCR compostos de 5 µl de 2X mistura de PCR de Extensor HIFI, (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA, 0,5 µl de iniciador 8653 (10 pm/µl), 0,5 µl de iniciador 8654 (10 pm/µl) e 4 µl de água deionizada. Cada PCR de colônia foi incubado em um Ciclador Térmico de Bloco Duplo DYAD® programado para 1 ciclo a 94 °C por 60 segundos; 30 ciclos, cada um a 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 45 segundos, 72 °C por 60 segundos, 68 °C por 10 minutos e 10 °C por 10 minutos.

[0159] Três µl de cada reação de PCR concluída foram submetidos a 1 % de eletroforese em gel de agarose usando tampão de TAE. Todos os quatro transformantes de E. coli mostraram uma faixa de PCR de cerca de 980 pb. O DNA de plasmídeo foi isolado de cada uma das quatro colônias usando um Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemanha). O DNA de plasmídeo resultante foi sequenciado com iniciadores 8653 e 8654 (SEQ ID NO: 8 e 9) usando um Sequenciador de DNA Automatizado Applied Biosystems Modelo 3730 usando química de terminador de versão 3.1 BIG-DYE™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA). Um plasmídeo, designado pKKSC0312-2, foi escolhido para transformar Aspergillus oryzae MT3568. A. oryzae MT3568 é um derivado de gene interrompido por amdS (acetamidase) de

Aspergillus oryzae JaL355 (documento WO 2002/40694) em que a auxotrofia de pyrG foi restaurada pela inativação do gene amdS de A. oryzae. Os protoplastos de A. oryzae MT3568 foram preparados de acordo com o método descrito na Patente Europeia, EP0238023, páginas 14-15.

[0160] E. coli 3701 contendo pKKSC0312-2 foi cultivado durante a noite de acordo com as instruções do fabricante (Genomed) e o DNA de plasmídeo de pKKSC0312-2 foi isolado usando um Kit Plasmid Midi (kit Genomed JETquick, cat.nr. 400250, GENOMED GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo purificado foi transformado em Aspergillus oryzae MT3568. Protoplastos de A. oryzae MT3568 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. As placas de seleção consistiam em sacarose COVE com acetamida a 10 mM + CsCl a 15 mM + TRITON® X-100 (50 µl/500 ml). As placas foram incubadas a 37 °C. Resumidamente, 8 µl de DNA de plasmídeo representando 3 ug de DNA foram adicionados a 100 µl de protoplastos MT3568. 250 µl de solução de PEG a 60 % foram adicionados e os tubos foram suavemente misturados e incubados a 37 °C por 30 minutos. A mistura foi adicionada a 10 ml de agarose de topo Cove pré-fundida (a agarose de topo derreteu e, então, a temperatura foi equilibrada para 40 °C em um banho de água morna antes de ser adicionada à mistura de protoplastos). A mistura combinada foi, então, plaqueada em duas placas de petri de seleção Cove-sacarose com acetamida a 10 mM. As placas foram incubadas a 37 °C por 4 dias. Colônias únicas transformadas por Aspergillus foram identificadas pelo crescimento em placas usando a seleção de Acetimida como uma fonte de carbono. Cada um dos quatro transformantes de A. oryzae foram inoculados em 750 µl de meio YP suplementado com glicose a 2 % e também 750 µl de maltodextrina a 2 % e também DAP4C em placas de 96 poços de profundidade e incubados a 37 °C estacionário por 4 dias. Ao mesmo tempo, os quatro transformantes foram novamente riscados em meio de ágar de sacarose COVE-2.

[0161] O caldo de cultura dos transformantes de Aspergillus oryzae foi, então, analisado quanto à produção do polipeptídeo GH24 por SDS-PAGE usando géis NUPAGE® 10 % Bis-Tris SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Uma faixa de proteína em aproximadamente 27 kDa foi observada para cada um dos transformantes de Aspergillus oryzae. Um transformante de A. oryzae foi cultivado em frascos de agitação Erlenmeyer de 1000 ml contendo 100 ml de meio DAP4C a 26 °C por 4 dias com agitação a 85 rpm. Exemplo 3: Purificação da muramidase de GH24 de Trichophaea saccata

[0162] O sobrenadante de fermentação com muramidase GH24 do exemplo 2 foi filtrado através de um filtro de topo Fast PES Bottle com um corte de 0,22 µm. A solução resultante foi diafiltrada com acetato de Na a 5 mM, pH 4,5 e concentrada (volume reduzido por um fator de 10) em uma Unidade de Ultrafiltração (Sartorius) com uma membrana de corte de 10 kDa.

[0163] Após o pré-tratamento, cerca de 275 ml da solução contendo muramidase foram purificados por cromatografia em SP Sepharose (aproximadamente 60 ml) em uma coluna XK26 eluindo a muramidase ligada com gradiente de 0 a 100 % de tampão A (acetato de Na a 50 mM pH 4,5) e tampão B (acetato de Na a 50 mM + NaCl a 1 M pH 4,5) em 10 volumes de coluna. As frações da coluna foram agrupadas com base no cromatograma (absorção a 280 e 254 nm) e análise SDS-PAGE.

[0164] O peso molecular, como estimado a partir de SDS- PAGE, foi de aproximadamente 27 kDa e a pureza foi > 90 %. Exemplo 4: Outras Características para a muramidase de GH24 de Trichophaea saccata

[0165] Determinação da sequência de N-terminal foi: YPVKTDL.

[0166] O peso molecular calculado dessa sequência madura é 26205,5 Da (M+H)+.

[0167] O peso molecular determinado por análise de peso molecular intacta foi 26205,3 Da. (M+H)+.

[0168] A sequência madura (de dados de sequenciamento de N-terminal de EDMAN, análise de peso molecular intacta e análise proteômica):

YPVKTDLHCRSSPSTSASIVRTYSSGTEVQIQCQTTGTSVQGSNVWDKTQHGCY VADYYVKTGHSGIFTTKCGSSSGGGSCKPPPINAATVALIKEFEGFVPKPAPDPIGLPT VGYGHLCKTKGCKEVPYSFPLTQETATKLLQSDIKTFTSCVSNYVKDSVKLNDNQYGAL

ASWAFNVGCGNVQTSSLIKRLNAGENPNTVAAQELPKWKYAGGKVMPGLVRRRNAEVAL FKKPSSVQAHPPKC (SEQ ID NO: 4). Exemplo 5: Determinação de Atividade de Muramidase

[0169] A atividade da muramidase foi determinada medindo-se a diminuição (queda) na absorbância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lysodeikticus ATTC nº 4698 (Sigma-Aldrich M3770) ou Exiguobacterium undea (DSM14481) medido em um espectrofotômetro a 540 nm. Preparação de substrato de Micrococcus lysodeikticus

[0170] Antes do uso, as células foram ressuspensas em tampão de ácido cítrico - fosfato pH 6,5 a uma concentração de 0,5 mg de células/ml e mediu-se a densidade óptica (OD) a 540 nm. A suspensão de células foi, então, ajustada de modo que a concentração de células fosse igual a uma DO540 = 1,0. A suspensão de células ajustada foi, então, armazenada fria antes do uso. As células ressuspensas foram usadas em 4 horas. Preparação de células secas de substrato de Exiguobacterium undae

[0171] Uma cultura de E. undae (DSM14481) foi cultivada em 100 ml de meio LB (Fluka 51208, 25 g/l) em um frasco de agitação de 500 ml a 30 °C, 250 rpm durante a noite. A cultura durante a noite foi, então, centrifugada a 20 °C e 5000 g por 10 minutos e o sedimento foi, então, lavado duas vezes com água milliQ estéril e ressuspenso em água Milli- Q. As células lavadas foram centrifugadas por 1 minuto a 13000 rpm e tanto quanto possível do sobrenadante foi decantado. As células lavadas foram secas em uma centrífuga de vácuo por 1 hora. O pélete celular foi ressuspenso em tampão de ácido cítrico - fosfato pH 4, 5 ou 6 de modo que a densidade óptica (DO) a 540 nm = 1. Medição de atividade antimicrobiana de muramidase no ensaio de turbidez

[0172] A amostra de muramidase a ser medida foi diluída a uma concentração de 100-200 mg de proteína enzimática/l em tampão de ácido cítrico - fosfato pH 4, 5 ou 6 e mantida em gelo até o uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc), 200 µl do substrato foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada a 37 °C por 5 minutos em um leitor de microplacas VERSAmax (Molecular Devices). Após a incubação, a absorbância de cada poço foi medida a 540 nm (valor inicial). Para iniciar a medição da atividade, 20 µl da amostra de muramidase diluída foram adicionados a cada substrato (200 µl) e a medição cinética da absorbância a 540 nm foi iniciada por um mínimo de 30 minutos até 24 horas a 37 °C. A absorbância medida a 540 nm foi monitorada para cada poço e ao longo do tempo uma queda na absorbância é vista se a muramidase tiver atividade de muramidase. Os resultados são apresentados na tabela 2 abaixo.

[0173] Tabela 2: Atividade de Muramidase contra Micrococcus lysodeikticus e Exiguobacterium undea como medido por Queda de Densidade Óptica Micrococcus Exiguobacterium Muramidase lysodeikticus1 undae1 Muramidase de GH22 de Gallus gallus +++ (pH 6) + (pH 6) (SEQ ID NO: 5) Muramidase de GH24 de Trichophaea ++ (pH 6) ++ (pH 6) saccata (SEQ ID NO: 4) Muramidase de GH25 de A. alcalophilum + (pH 4) + (pH 5) (SEQ ID NO: 1) 1 - significa nenhum efeito; + significa efeito pequeno; ++ significa efeito médio; +++ significa grande efeito. O valor de pH nos parênteses lista o pH de ensaio com base na combinação de muramidase-substrato.

[0174] Os dados confirmam que a muramidase de GH22 de

Gallus, a muramidase de GH24 de Trichophaea saccata e a muramidase de GH25 de A. alcalophilum, todas, têm atividade de muramidase. Exemplo 6: Ensaio de frango de corte in vivo 1 Materiais e Métodos Local:

[0175] Centro de Estudos da Resposta Imunológica em Aves (CERIA) na Universidade Federal do Paraná. As aves foram alojadas na sala experimental com pressão negativa. Cada réplica estava em gaiolas com detrito esterilizado, bebedouros do tipo chupeta e controle automático de temperatura. As aves foram criadas com água e alimentadas ad libitum. Projeto experimental – Tratamentos e animais

[0176] A quantidade de 256 frangos de corte do sexo masculino (01 a 28 dias de idade) foi distribuída em um projeto completamente aleatorizado dividido em 4 tratamentos com 7 repetições cada um, começando com 8 aves em cada repetição e 1 controle de grupo sem desafio.

[0177] As aves foram alocadas em diferentes salas: com ou sem desafio.

[0178] 8 salas com 4 gaiolas cada uma: - 1 sala sem desafio (controle negativo experimental) – 4 gaiolas com 8 aves (1 gaiola por tratamento) – total: 32 aves; - 7 salas com um desafio (Eimeria e C. perfringens): Em cada sala, 4 tratamentos foram alocados e no final, há 7 replicações com 8 aves cada uma – total: 224 aves. Tratamentos:

[0179] Tabela 3. Descrição de tratamentos. Desafio de Desafio de Tratamento Produto Eimeria Clostridium CN Não Não Nenhuma T1 Sim Sim Nenhuma Muramidase (25 000 T2 Sim Sim LSU/kg, 476 mg/kg) Muramidase (35 000 T3 Sim Sim LSU/kg, 667 mg/kg) Enramicina a 10 ppm T4 Sim Sim (Enradin® a 8 %) Muramidase: atividade 52 500 FSU(F)/g Desafio

[0180] No primeiro dia do ensaio, os animais de T1, T2, T3 e T4 receberam a vacina anticoccidiana 15 vezes a dose recomendada de fabricação. Nos 10º, 11º e 12º dias do experimento, os mesmos foram inoculados por gavagem com Clostridium perfringens (108 UFC/ml - isolado do campo Caso de enterite necrótica). Dietas

[0181] Todos os grupos (tratamentos sem desafio e desafio 4) receberam a dieta basal de purê (milho, SBM e farinha de carne e ossos) que foi formulada para atender às especificações nutricionais de Rostagno (2011) para cada fase dos requisitos nutricionais: inicial (0-14d ) e produtor (15-28d). Todas as dietas incluíram 1.000 FYT de fitase (RONOZYME® HiPhos GT) e 4 ppm de Apo-éster (CAROPHYLL® amarelo) como um biomarcador. Outras enzimas alimentares e anticoccidianos (produtos químicos ou ionóforos) não foram incluídos nas dietas.

[0182] Tabela 4: Composição e teores de nutrientes das dietas experimentais basais Crescimento (d 15- Ingredientes (%) Partida (d 1-14) 28) MILHO 58,853 60,645 FARINHA DE SOJA 33,4 32,3

FARINHA DE CARNE 3,6 2,9

E OSSO SAL 0,46 0,44

CLORETO DE 0,06 0,06

COLINA ÓLEO DE SOJA 1,55 2

FOSFATO 0,12 0

DICÁLCICO CALCÁRIO 0,78 0,68 DL-METIONINA 0,385 0,32 L-LISINA 0,36 0,275 L-TREONINA 0,14 0,088 PX ROVIMIX AVES* 0,15 0,15

PX ROLIGOMIX 0,05 0,05 AVES** HiPhos GT 0,01 0,01 BHT 0,01 0,01 Carophyll Yellow 0,004 0,004 Veículo 0,068 0,068 100 100 Análise calculada, % AMEn, kcal/kg 3 002,45 3 052,93

Crescimento (d 15- Ingredientes (%) Partida (d 1-14) 28) Proteína Bruta 22,04 21,21 Cálcio 1 0,85 Av. P 0,47 0,41 Lys dig 1,32 1,22 Met dig 0,67 0,6 AAS dig 0,96 0,89 Thr dig 0,86 0,79 Trp dig 0,23 0,22 Arg dig 1,36 1,31 Val dig 0,9 0,88 *1Pré-mistura de vitamina : Vit. A 9.000.000 UI/kg; Vit. D3 2.500.000 UI/kg; Vit.

E 20.000 UI/kg; Vit. K3 2.500 mg/kg; Vit. B1 2.000 mg/kg; Vit. B2 6.000 mg/kg; Ácido pantotênico 12 g/kg; Vit. B6 3.000 mg/kg; Vit. B12 15.000 mcg/kg; Ácido nicotínico 35 g/kg; Ácido fólico 1.500 mg/kg; Biotina 100 mg/kg; Selênio 250 mg por kg de pré- mistura. *2 Pré-mistura de mineral: Ferro 100 g/kg; Cobre 20 g/kg; Manganês 130 g/kg; Cobalto 2.000 mg/kg; Zinco 130 mg/kg; Iodo 2.000 mg por kg de pré-mistura. *3 RONOZYME® HiPhos GT – 1.000 FYT/kg.

Medição

[0183] 1 – Desempenho: O desempenho avaliado da ração e das aves foi ponderado semanalmente para avaliar a ingestão de ração (FI), ganho de peso corporal (GPL), taxa de conversão de alimento (FCR).

[0184] 2 – Histopatologia e imunologia: Aos 07, 14, 21 e 28 dias de idade, 7 aves/tratamento (1 ave por repetição) das salas de desafio + 4 aves de gaiolas diferentes da sala de não desafio, foram necropsiados para avaliar alterações macroscópicas em órgãos e amostragem de íleo e fígado para análise histopatológica de acordo com Belote et al. (2018).

[0185] Para expressão de mRNA de citocinas, aos 07, 14, 21 e 28 dias de idade 7 aves/tratamento (1 ave por repetição) das salas de desafio + 4 aves de gaiolas diferentes da sala de não desafio, foram amostrados e colocados em eppendorfs com 1 ml de RNAlater. O RNA total de tecidos do fígado e íleo foi isolado usando o reagente Trizol (15596-018, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções de procedimentos do fabricante. O kit Turbo- DNAse (AM1907, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi usado para as amostras coletadas. As concentrações de RNA foram quantificadas por NanoDrop Spectrophotometer (ND1000, Thermo Scientific, Bonn, Alemanha) e a integridade de RNA determinada pelo Sistema de Eletroforese Automatizado Experion (700-7000, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As amostras de RNA foram submetidas à transcrição reversa seguida por análises qPCR realizadas com um Sistema MyiQ (170-9740, Bio-Rad). Um micrograma de RNA foi convertido em cDNA em um volume de reação de 20 µl usando o kit de Super Mistura de Transcrição Reversa iScript ™ (170- 8841, Bio-rad) a 25 °C por 1 h, 42 °C por 30 min e 85 °C por 5 min. Os genes analisados por qPCR foram mostrados na Tabela 5:

[0186] Tabela 5

CITOCINA F R IL-10 5′ CGGGAGCTGAGGGTGAA 3′ 5′ GTGAAGAAGCGGTGACAGC 3′ IL-12 5′ AGACTCCAATGGGCAAATGA 3′ 5′ CTCTTCGGCAAATGGACAGT 3′ IL-8 5’ CAGTTTCCTAGTCAGAGTCAGC 3’ 5’ ACCAAACCCACAGTCTTACAG 3’ GAPDH 5′ GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT3′ 5′ ACCTCTGTCATCTCTCCACA 3′

[0187] O PCR final de 20 µl continha 2 µl de produto de transcrição reversa, 2 µl do gene direto e reverso e 10 µl de iTAq® Universal SYBR Green Supermix (172-5122, Bio-Rad). As condições de ciclo para todos os iniciadores usados foram: etapa inicial de desnaturação de 60 segundos a 95 °C seguida de 40 ciclos de desnaturação (15 segundos a 95 °C), anelamento e extensão (30 s a 60 °C). O perfil de fusão de cada amostra foi analisado após cada execução de qPCR para confirmar a especificidade de produto qPCR; posteriormente determinado pelo aquecimento de amostras a 65 °C por 30 segundos e, então, pelo aumento da temperatura em uma taxa linear de 20 °C/segundos para 95 °C, enquanto monitora continuamente a fluorescência. As eficiências de amplificação de amostra qPCR foram determinadas na fase loglinear com o programa LinRegPCR. Além disso, a equação delta-delta subtrai os valores de amostra e Ct de referência de um controle endógeno.

[0188] 3- Macroscópico: As alterações macroscópicas foram avaliadas pela metodologia ISI (I See Inside) de acordo com Kraieski et al., 2017.

[0189] 4- Microbiota: As fezes totais do intestino delgado foram coletadas para análise da microbiota aos 21 dias, de acordo com Zhu e Joerget (2003). Essas amostras foram congeladas e o DSM deve decidir se será seguido a análise da microbiota.

[0190] 5- Teor de carotenoides no sangue: Aos 14, 21 e 28 dias de idade, os carotenoides foram medidos por iCheck CAROTENE para saber se o BOND teve um efeito positivo na má absorção.

[0191] Análise estatística: Os dados foram avaliados no software estatístico Statistix 9 e analisados pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk. Os dados paramétricos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para as médias com uma diferença significativa. Os dados não paramétricos foram submetidos ao teste de Kruskal- Wallis a 5 % de probabilidade. Para a análise de expressão de citocinas, usou-se o teste t não pareado com correção de Welch a 10 % de probabilidade. Resultados e Discussões

[0192] 1. Alojamento

[0193] As aves foram alojadas em instalações com 8 salas experimentais com pressão negativa, cada sala possuindo 4 gaiolas. As 256 aves foram distribuídas em gaiolas com 8 frangos em cada uma. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para as médias com uma diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos (Tabela 6).

[0194] Tabela 6. Peso vivo médio (g) e erro padrão de cada tratamento no alojamento do primeiro dia. Tratamento BW (g) % de CV CN 46,312±6,0469 5,309 T1 46,411±12,155 7,512 T2 46,464±10,983 7,132 T3 46,375±11,323 7,256 T4 46,554±10,385 6,922 valor P 1,000 Não houve diferenças significativas entre os pares entre as médias (P <0,05)

[0195] 2. Contagem de Inóculo do Desafio de Eimeria

[0196] Para confirmar o número de oocistos no inóculo, foi realizada a contagem dos oocistos com Câmara de Neubauer. A dose de desafio foi de 7,1 x 104 oocistos por ml, o que corresponde a 15X da dose recomendada fabricada para vacinação.

[0197] 3. Desempenho

[0198] Aos 7, 14, 21 e 28 dias de idade, a ração e as aves foram pesadas e foram avaliadas a ingestão de ração (FI), ganho de peso corporal (GPB) e a taxa de conversão de alimento (FCR). Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para as médias com diferença significativa (P <0,05). Os dados estão listados nas Tabelas 7, 8 e 9.

[0199] Tabela 7. Desvio médio ± padrão de BWG -Ganho de Peso Corporal (g) em todos os períodos.

ab Médias com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes em teste de Tukey P<0,05

[0200] Tabela 8. Desvio médio ± padrão de FI (Ingestão de Ração) em todos os períodos.

[0201] Tabela 9. Desvio médio ± padrão de FCR (Razão de Conversão de Ração) em todos os períodos.

[0202] A partir das tabelas acima, o desafio de Eimeria e Clostridium perfringens reduz significativamente o ganho de peso (16 %) e Ingestão de ração (3 %) em comparação ao controle (CN) sem desafio. Os grupos T2 e T3 suplementados com muramidase melhoraram o ganho de peso e FCR.

[0203] 4. Análise macroscópica (ISI)

[0204] Na avaliação macroscópica foi aplicada a metodologia ISI – I See Inside (patente INPI UFPR 10 2015 003601 9). Os dados estão listados na Tabela 10, 11, 12 e

13.

[0205] Tabela 10. Desvio médio ± padrão dos resultados macroscópicos ISI em 7 dias.

[0206] Tabela 11. Média ± desvio padrão dos resultados macroscópicos ISI em 14 dias.

[0207] Tabela 12. Desvio médio ± padrão dos resultados macroscópicos ISI em 21 dias.

[0208] Tabela 13. Média ± desvio padrão dos resultados macroscópicos ISI em 28 dias.

[0209] A partir das tabelas acima, o desafio de Eimeria e C.perfringens (T1) aumentou significativamente a pontuação de ISI em comparação com o controle (CN). No entanto, os grupos T2 e T3 (suplementados com Muramidase) diminuíram a pontuação de ISI em todo o período, e o efeito foi comparável e até melhor do que o grupo T4 suplementado com antibiótico Enramicina.

[0210] 5. HISTOLOGIA – I SEE INSIDE (ISI)

[0211] Na avaliação histológica de ISI no fígado, o grupo CN mostrou menor pontuação total de ISI (P <0,05) em todo o período em comparação com o grupo T1, e os grupos T2 e T3 reduziram a pontuação total em comparação ao grupo T1 e o efeito foi comparável e ainda melhor que o grupo T4. Os resultados de ISI no fígado são mostrados nas Tabelas 14, 15, 16 e 17.

[0212] Tabela 14. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 7 dias de idade no fígado.

a,b Médias com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes em teste de Tukey P<0,05

[0213] Tabela 15. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 14 dias de idade no fígado.

[0214] Tabela 16. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 21 dias de idade no fígado.

[0215] Tabela 17. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 28 dias de idade no fígado.

[0216] Na avaliação histológica de ISI no íleo, os grupos T2 e T3 reduziram a pontuação total em 21 dias e 28 dias em comparação com o grupo T1. Os resultados de ISI em

21 dias e 28 dias no íleo são mostrados nas Tabelas 18 e

19.

[0217] Tabela 18. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 21 dias de idade no Íleo.

[0218] Tabela 19. Erro médio e padrão da pontuação de ISI aos 28 dias de idade no Íleo.

[0219] 6. Expressão de citocinas

[0220] Os resultados sobre a expressão de mRNA de citocinas - IL10 e IL8 em 7d, 14d e 21d em Íleo estão listados na Tabela 20.

[0221] Tabela 20. Média de expressão de mRNA de citocinas - IL10 e IL8 em 7d, 14d e 21d em Íleo. Íleo- IL10 CN T1 T2 T3 T4 7d 1,28b 3,46 a 5,35 a 5,70 a 7,03a 14d 1,58b 4,48a 5,35a 3,49 a 4,06 a 21d 0,99c 2,74a 3,64 a 2,29ab 1,59 b

Íleo - IL8 CN T1 T2 T3 T4 7d 1,13b 2,37a 3,36a 3,82a 3,72a 14d 0,2 0,84 0,96 0,28 0,48 21d 0,53b’ 2,53a' 1,19ab’ 0,89ab' 1,61ab’ a,b Médias com letras diferentes na mesma linha são significativamente diferentes no teste t com correção de Welch P<0,05. ’P<0,10.

[0222] De acordo com os resultados acima, a expressão de RNA IL10 e IL8 aumentou em grupos desafiados no íleo em comparação com o grupo não desafiado em 7 dias. Os grupos T2 e T3 aumentam ainda mais a expressão de RNA IL10 e IL8 no íleo em comparação com o grupo T2.

[0223] 7. Análise de carotenoides

[0224] A análise do teor de carotenoides no sangue mostrou que os grupos T2 e T3 melhoraram a absorção de carotenoides em comparação com o grupo T1 em 14 dias e 28 dias. Os resultados são listados na Tabela 21.

[0225] Tabela 21. Médias de Análise de carotenoides (mg/l) em todos os períodos avaliados. Tratamento 14d 21d 28d CN 2,99a 3,56 3,16 T1 0,92b 2,48 2,88 T2 1,27b 2,37 3,14 T3 0,97b 2,32 2,96 T4 0,76b 2,83 2,98 CV 82,79 38,46 30,34 valor P <0,001 0,056 0,93 a,b,c Médias com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferente no teste de Tukey

Conclusão

[0226] Os resultados obtidos no estudo mostraram que a inclusão da muramidase microbiana em uma ração animal foi eficaz no aprimoramento do desempenho do crescimento (Ganho de peso e FCR), na redução das lesões macroscópicas e histológicas (pontuações de ISI) no fígado e íleo, no aprimoramento de expressão de citocinas anti-inflamatórias (IL10 e IL8) e absorção de carotenoides (teor de carotenoides no sangue) de frangos de corte que foram infectados por Eimeria e Clostridium perfringes

[0227] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ter o escopo limitado pelos aspectos específicos revelados no presente documento, visto que esses aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da presente invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da presente invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão claras para os indivíduos versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente revelação que inclui definições controlará.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções por Eimeria e Clostridium perfringes de um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o animal monogástrico é selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo jovem, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto, gato, cão, cavalo, crustáceos, camarões menores, camarões maiores, peixe, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe- gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é obtida ou obtenível do filo Ascomycota ou do subfilo Pezizomycotina.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1; (b) uma variante da SEQ ID NO: 1 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (c) um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de muramidase em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 4; (e) uma variante da SEQ ID NO: 4 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; e (f) um fragmento do polipeptídeo de (d) ou (e) que tem a atividade de muramidase em que o fragmento compreende pelo menos 210 aminoácidos, como pelo menos 215 aminoácidos, pelo menos 220 aminoácidos, pelo menos 225 aminoácidos, pelo menos 230 aminoácidos, pelo menos 235 aminoácidos ou pelo menos 240 aminoácidos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é selecionada a partir do grupo que consiste em aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 4 e aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10.

7. Método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas, em que: (a) a muramidase microbiana é uma muramidase microbiana que compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25, é dosada em um nível de 300 a 500 mg de proteína de enzima por kg de ração animal; e (b) o animal é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto.

8. Método de tratamento, prevenção ou aprimoramento de infecções, como infecções por Eimeria e Clostridium perfringes, de um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal que compreende uma ou mais muramidases microbianas, em que: (a) a muramidase microbiana é uma muramidase de GH24 ou GH25 obtida ou obtenível do filo Ascomycota, e é dosada em um nível de 300 a 500 mg de proteína de enzima por kg de ração animal; e (b) o animal é um selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto.

9. Uso caracterizado por ser uma composição, uma ração animal ou um aditivo de ração animal para tratar, prevenir ou aprimorar infecções por Eimeria e Clostridium perfringes de um animal monogástrico, em que a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal compreende uma ou mais muramidases microbianas.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o animal monogástrico é selecionado a partir do grupo que consiste em suínos, leitão, porco em crescimento, porca gestante, aves, peru, pato, codorniz, galinha d'angola, ganso, pombo, pombo jovem, frango, frango de corte, poedeira para propósito comercial, galinha e pinto, gato, cão, cavalo, crustáceos, camarões menores, camarões maiores, peixe, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe- gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum,

rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é obtida ou obtenível do filo Ascomycota ou do subfilo Pezizomycotina.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana compreende um ou mais domínios selecionados a partir da lista que consiste em GH24 e GH25.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1; (b) uma variante da SEQ ID NO: 1 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições;

(c) um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de muramidase em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 4; (e) uma variante da SEQ ID NO: 4 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; e (f) um fragmento do polipeptídeo de (d) ou (e) que tem a atividade de muramidase em que o fragmento compreende pelo menos 210 aminoácidos, como pelo menos 215 aminoácidos, pelo menos 220 aminoácidos, pelo menos 225 aminoácidos, pelo menos 230 aminoácidos, pelo menos 235 aminoácidos ou pelo menos 240 aminoácidos.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que a muramidase microbiana é selecionada a partir do grupo que consiste em aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 4 e aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10.