BR112020024839A2 - manipulação de genes envolvidos em transdução de sinal para controlar a morfologia fúngica durante a fermentação e produção - Google Patents

Abstract

MANIPULAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS EM TRANSDUÇÃO DE SINAL PARA CONTROLAR A MORFOLOGIA FÚNGICA DURANTE A FERMENTAÇÃO E PRODUÇÃO. A presente revelação fornece um método de modificação genômica microbiana por engenharia genética e um sistema para transformação, avaliação e seleção de células fúngicas filamentosas que possuem morfologia alterada e/ou crescimento sob condições de crescimento específicas. O método e sistema utilizam métodos de alto rendimento (HTP) para produzir cepas fúngicas filamentosas de produção com um fenótipo morfológico desejado.

Description

MANIPULAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS EM TRANSDUÇÃO DE SINAL PARA CONTROLAR A MORFOLOGIA FÚNGICA DURANTE A FERMENTAÇÃO E PRODUÇÃO REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Esse pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido U.S. Provisório Nº de Série 62/681.604, depositado em 6 de junho de 2018, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

CAMPO

[002]A presente revelação é dirigida à regulação do crescimento hifal de células fúngicas em várias condições de crescimento. A regulação de crescimento hifal revelada envolve a manipulação genética de fungos filamentosos para gerar a cepas fúngicas de produção com crescimento hifal restrito sob condições de produção. As cepas fúngicas de produção resultantes são bem adequadas para o crescimento em culturas submersas, por exemplo, para a produção em larga escala de produtos de interesse (por exemplo, antibióticos, metabólitos, proteínas etc.) para aplicações comerciais.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003]A Listagem de Sequências associada a esse pedido é fornecida em formato de texto no lugar de uma cópia em papel, e é aqui incorporada por referência nesse relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequências é ZYMR_015_01WO_SeqList_ST25.txt. O arquivo de texto tem aproximadamente 307 KB, foi criado em 6 de junho de 2019, e está sendo submetido eletronicamente através da EFS-Web.

FUNDAMENTOS

[004]Células eucarióticas são organismos preferidos para a produção de polipeptídeos e metabólitos secundários. Na verdade, fungos filamentosos são capazes de expressar proteínas nativas e heterólogas até níveis elevados, tornando-as bem adequadas para a produção em larga escala de enzimas e outras proteínas para aplicações industriais, farmacêuticas, de saúde animal e alimentos e bebidas. No entanto, o uso de fungos filamentosos para produção em larga escala de produtos de interesse frequentemente exige manipulação genética dos referidos fungos, bem como o uso de maquinário e equipamento automatizados e certos aspectos do ciclo de vida de fungos filamentosos pode tornar a manipulação genética e manuseio difíceis.

[005]Por exemplo, DNA introduzido em um fungo se integra aleatoriamente dentro de um genoma, resultando em fragmentos de DNA integrados principalmente de forma aleatória, que bem frequentemente podem ser integrados como múltiplas repetições em tandem (veja, por exemplo, Casqueiro e cols., 1999, J. Bacteriol. 181: 1.181-1.188). Essa “integração múltipla aleatória” não controlada de um cassete de expressão pode ser um processo potencialmente prejudicial, que pode levar à modificação indesejada do genoma do hospedeiro.

[006]Adicionalmente, os sistemas de transfecção atuais para fungos filamentosos podem ser muito trabalhosos (para uma revisão, veja Fincham, 1989, Microbiol. Rev. 53: 148- 170) e em escala relativamente pequena. Isso pode envolver a formação de protoplasto, manuseio de líquido viscoso (ou seja, soluções de polietileno glicol), turbilhonamento um- por-um de tubos de vidro e plaqueamento seletivo subsequente. Além disso, as condições para a protoplastização podem ser de difícil determinação e os rendimentos podem frequentemente ser bem baixos. Além disso, os protoplastos podem conter vários núcleos, de modo que a introdução de uma manipulação genética desejada pode levar à formação de protoplastos heterocarióticos que podem ser difíceis de separar de protoplastos homocarióticos.

[007]Além disso, células fúngicas filamentosas típicas, incluindo aquelas derivadas de protoplastos, crescem como fibras longas denominadas hifas que podem formar redes densas de hifas denominadas micélio. Essas hifas podem conter vários núcleos que podem diferir uns dos outros em genótipo. As hifas podem se diferenciar e formar esporos assexuais que podem ser facilmente dispersos no ar. Caso as hifas contenham núcleos de genótipos diferentes, os esporos também conterão uma mistura de núcleos. Em função desse aspecto do crescimento fúngico, a manipulação genética inerentemente resulta em uma população mista que tem que ser purificada até a homogeneidade a fim de avaliar qualquer efeito das alterações genéticas feitas. Além disso, em um ambiente automatizado, os esporos podem causar contaminação de equipamento que poderia impactar negativamente a habilidade para purificar cepas e podem contaminar qualquer outro trabalho realizado no equipamento.

[008]Para atenuar a dispersão aérea de esporos, os fungos filamentosos podem ser desenvolvidos em culturas submersas. No entanto, o micélio formado por crescimento de fungos filamentosos hifais em culturas submersas pode afetar as propriedades reológicas do caldo. Geralmente, quanto maior a viscosidade do caldo, menos uniforme a distribuição de oxigênio e nutrientes, e maior a energia necessária para agitar a cultura. Em alguns casos, a viscosidade do caldo em função do crescimento fúngico filamentoso hifal se torna suficientemente alta para interferir significantemente com a dissolução de oxigênio e nutrientes, afetando adversamente, dessa forma, o crescimento dos fungos e, em última análise, o rendimento e produtividade de qualquer produto de interesse desejado.

[009]Dessa forma, há uma grande necessidade na técnica por novos métodos de modificação por engenharia genética de fungos filamentosos, que não sofram das desvantagens mencionadas anteriormente inerentes aos programas tradicionais de construção de cepas em fungos e acelerem acentuadamente o processo de descoberta e consolidação de mutações benéficas.

[0010]A presente invenção supera muitos dos desafios inerentes na manipulação genética de fungos filamentosos em uma plataforma de alto rendimento, automatizada. Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo são projetados para gerar cepas fúngicas de produção com uma morfologia desejada por incorporação de alterações genéticas com o uso de co- transformação automatizada combinada com avaliação automatizada de transformantes permitindo, dessa forma, a troca de traços genéticos entre duas cepas sem passar por um cruzamento sexual.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[0011]Em um aspecto, é fornecida nesse relatório descritivo uma cepa variante de fungo filamentoso derivada de uma cepa parental, em que células da cepa variante possuem um fenótipo de formação de pellets, não-micélio, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas em uma cultura submersa, causado pelo fato de que a cepa variante possui uma alteração genética em um ou mais genes de uma via de resposta osmótica que faz com que as células da cepa variante produzam uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

Em alguns casos, a cepa variante esporula normalmente, quando comparada com a cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas.

Em alguns casos, o fungo filamentoso é selecionado de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

Em alguns casos, o fungo filamentoso é Aspergillus niger (A. niger) ou teleomorfos ou anamorfos deste.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de

A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ou um gene nik1 Neurospora crassa (N. crassa). Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 1 ou ID.

DE SEQ.

Nº: 2. Em alguns casos, o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

Em alguns casos, o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

Em alguns casos, o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3. Em alguns casos, o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD). Em alguns casos, o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, a cepa variante ainda compreende uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2. Em alguns casos, o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional. Em alguns casos, o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA. Em alguns casos, o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3. Em alguns casos, o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD). Em alguns casos, o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina. Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único. Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

[0012]Em outro aspecto, é fornecida nesse relatório descritivo uma célula hospedeira fúngica filamentosa que compreende um promotor ligado operacionalmente a um gene que regula uma morfologia da célula hospedeira, em que o promotor é heterólogo para o gene, em que o promotor possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-4. Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação, quando comparada com uma célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira. Em alguns casos, o meio de fermentação compreende pelo menos 14 ppb de manganês.

Em alguns casos, o meio de fermentação é livre ou substancialmente livre de agentes quelantes (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em meios de fermentação conhecidos na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico). Em alguns casos, o meio de fermentação é livre de agentes quelantes.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa produz uma quantidade de um produto de interesse que é pelo menos igual à quantidade produzida pela célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira.

Em alguns casos, o produto de interesse é ácido cítrico ou uma enzima de interesse.

Em alguns casos, o gene que regula uma morfologia é selecionado de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, o gene que regula uma morfologia é uma forma do tipo selvagem ou uma forma mutada do gene.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum,

Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas. Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa. Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7. Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7. Em alguns casos, o promotor é selecionado da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

[0013]Ainda em outro aspecto, é fornecida nesse relatório descritivo uma célula hospedeira de fungo filamentoso que compreende uma modificação heteróloga de um ou mais genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira, em que os (um ou mais) genes modificados possuem atividade reduzida e/ou expressão reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 9, 10,

11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP de uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, a modificação heteróloga é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 1 ou ID.

DE SEQ.

Nº: 2. Em alguns casos, o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

Em alguns casos, o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

Em alguns casos, o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3. Em alguns casos, o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD). Em alguns casos, o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via do estresse osmótico consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae do gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa ainda compreende uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

Em alguns casos, o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 1 ou ID.

DE SEQ.

Nº: 2. Em alguns casos, o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional. Em alguns casos, o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA. Em alguns casos, o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3. Em alguns casos, o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD). Em alguns casos, o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina. Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único. Em alguns casos, a forma mutada dos (um ou mais) genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou

8.

[0014]Ainda em outro aspecto, é fornecido nesse relatório descritivo um caldo de fermentação que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e uma célula fúngica filamentosa que compreende um fenótipo de pellet não- micélio, em que o caldo é livre ou substancialmente livre de um agente quelante (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em caldo de fermentação conhecido na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico), e em que a célula fúngica filamentosa compreende um ou mais genes geneticamente alterados de uma via de resposta osmótica da célula fúngica filamentosa. Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica estão ligados operacionalmente a um promotor heterólogo. Em alguns casos, o promotor heterólogo é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2. Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica compreende uma mutação.

Em alguns casos, a mutação é um SNP.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos geneticamente alterados de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos geneticamente alterados de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são formas geneticamente alteradas de genes com sequências de ácidos nucleicos selecionadas do ID.

DE SEQ.

Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa. Em alguns casos, o ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é um gene com uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[0015]Em um aspecto, é fornecido nesse relatório descritivo um método para a geração de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa, que compreende as etapas de: a. fornecimento de um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; e b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos (um ou mais genes)-alvo que desempenham um papel na resposta ao estresse osmótico para a cepa fúngica filamentosa de base. Em alguns casos, o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2. Em alguns casos, os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura. Em alguns casos, a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou uma inserção. Em alguns casos, os (um ou mais) genes-

alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene

SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa. Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7. Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[0016]Em outro aspecto, é fornecido nesse relatório descritivo um método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, que compreende as etapas de: a. fornecimento de diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para a cepa fúngica filamentosa de base; c. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação a uma cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, variações genéticas únicas que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos; d. fornecimento de diversos micróbios fúngicos filamentosos subsequentes nos quais, cada um deles, compreende uma combinação de variações genéticas únicas das variações genéticas presente em pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais selecionadas na etapa precedente para, dessa forma, criar uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente; e. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação à cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, combinações únicas de variação genética que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos adicionais; e f. repetição das etapas d)-e) uma ou mais vezes, de uma forma linear ou não linear, até que uma cepa fúngica filamentosa exiba um nível desejado de fenótipo morfológico aprimorado, comparado com o fenótipo morfológico da cepa fúngica filamentosa de produção, em que cada repetição subsequente cria uma nova biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa de cepas microbianas, em que cada cepa na nova biblioteca compreende variações genéticas que são uma combinação de variações genéticas selecionadas entre pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais de uma biblioteca precedente.

Em alguns casos, a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

Em alguns casos, a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

Em alguns casos, a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

Em alguns casos, a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

Em alguns casos, o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2. Em alguns casos, os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

Em alguns casos, a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou inserção.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus,

Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7. Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em alguns casos, os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em alguns casos, o aprimoramento fenotípico morfológico compreende a conferência da habilidade para formar uma morfologia de pellet não-micélio quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

Em alguns casos, as condições de cultura submersa compreendem um meio de cultura que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e é livre ou substancialmente livre de agentes quelantes (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em meios de fermentação conhecidos na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico). Em alguns casos, o meio de fermentação é livre de agentes quelantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017]A FIG. 1 ilustra uma abordagem para troca de promotor em uma célula fúngica filamentosa. Em particular, um design de troca de promotor para um gene com um promotor anotado é mostrado.

[0018]A FIG. 2 ilustra perfis de expressão de promotores ilustrativos que exibem uma gama de expressão regulatória, de acordo com os promotores ladders da presente revelação. A expressão do Promotor A atinge o pico imediatamente mediante adição de um substrato selecionado, mas rapidamente retorna a níveis indetectáveis à medida que a concentração do substrato é reduzida. A expressão do Promotor B atinge o pico imediatamente mediante adição do substrato selecionado e reduz lentamente de volta a níveis indetectáveis junto com a redução correspondente no substrato. A expressão do Promotor C atinge o pico mediante adição do substrato selecionado, e permanece altamente expresso por toda a cultura, até mesmo após o substrato ter dissipado.

[0019]A FIG. 3 ilustra quatro promotores diferentes sendo colocados em frente de um gene-alvo para gerar 4 cepas diferentes. Essas cepas podem então ser comparadas em um teste para um traço desejado e um nível de expressão ideal pode ser determinado.

[0020]A FIG. 4 ilustra o uso de PCR de fusão para gerar construções de marcador dividido para uso na presente invenção.

[0021]A FIG. 5 ilustra análise de controle de qualidade de construções de marcador dividido geradas como retratado na FIG. 4.

[0022]A FIG. 6 é uma representação de como SNPs são direcionados a um lócus específico em fungos filamentosos usando um sistema de marcador dividido. O gene marcador (pyrG nesse exemplo) é amplificado em dois componentes que são incapazes de complementar a mutação na cepa-alvo sem recombinação homóloga, que restaura a função do gene. O flanqueamento desses fragmentos é uma repetição direta de DNA em que cada um dos quais contém os SNPs a serem direcionados ao lócus. Uma sequência de DNA não-repetição em cada construção facilita a integração adequada por meio de vias de recombinação homóloga nativas.

[0023]A FIG. 7 ilustra que as repetições diretas que flanqueiam o gene marcador são instáveis e resultarão na remoção do marcador por meio de recombinação homóloga entre as repetições diretas. Basicamente, a retirada da alça é facilitada por repetições diretas que foram incorporadas no DNA transformante. Basicamente, a retirada da alça é facilitada por repetições diretas que foram incorporadas no DNA transformante. Células contra-selecionadas para o marcador de seleção contêm deleções do DNA da alça flanqueadas pelas regiões de repetição direta.

[0024]A FIG. 8 ilustra o uso de construções de deleção para a avaliação de fenótipos de deleção para cada SNP da Tabela 3 como descrito no Exemplo 2. O fenótipo de deleção pode ser usado para informar análise da via.

[0025]A FIG. 9 ilustra a troca de promotor de um gene de morfologia (ou seja, FungiSNP_18; ID. DE SEQ. Nº: 7). Diferentes promotores que controlam a expressão desse gene impactam a morfologia. As cepas que contêm a fusão de manB e a fusão de amyB retêm as múltiplas pontas vs. a cepa parental 11414, enquanto aquelas com expressão maior de srpB e mbfA não possuem o fenótipo de pontas múltipla. As cepas foram desenvolvidas em meios de produção de ácido cítrico (14% p/v de Glicose, pH 2, depletados de Mn++) a 30°C por 48 horas. Quando permitidas que fiquem em incubação por 168 horas, as cepas com promotores de expressão maior, bem como o controle parental, todos continham hifas filamentosas longas. As cepas com o nível de expressão menor pela fusão de promotor, amyB e manB, permaneceram peletizadas.

[0026]A FIG. 10 é uma representação de uma modalidade de um sistema de computador, de acordo com modalidades da presente revelação.

[0027]A FIG. 11 ilustra a troca de promotor de alvo de gene de morfologia 18 (FungiSNP_18) na cepa de base 1015 e cepa de produção 11414. O produto gênico associado com FungiSNP_18 é uma quinase de sinalização que responde ao estresse osmótico (ou seja, ortólogo de A. niger de S. cerevisiae SLN1). Essa figura mostra que, quando a expressão gênica do referido gene é reduzida por substituição do promotor nativo com um promotor mais fraco, as células mantêm um fenótipo menos alongado, mais apertado, que é denominado nesse relatório descritivo um fenótipo de ‘pellet’ (veja os painéis à direita para as células que expressam o gene manB(p)snp18 na cepa de base 1015 e cepa de produção 11414). As cepas foram desenvolvidas em meios de produção de ácido cítrico (14% p/v de Glicose, pH 2, depletados de Mn++) a 30°C por 24 horas. Esse tipo de crescimento pode ser favorável à fermentação em tanque agitado.

[0028]A FIG. 12 ilustra que, níveis reduzidos do produto do gene FungiSNP_18 na cepa de base (ou seja, A. niger 1015) por introdução do gene FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) sob o controle do promotor manB(p) (ID. DE SEQ. Nº: 1) resulta na incapacidade de esporular na base genética da cepa de base. Esse fenótipo não era observado quando a mesma construção era introduzida na cepa de produção (ou seja, A. niger 11414).

[0029]A FIG. 13 ilustra que cepas que contêm a SNP18 de Base crescem mais rápido em meios com pH baixo.

[0030]A FIG. 14 ilustra que cepas que contêm a SNP18 de Base crescem mais rápido em meios que fornecem estresse osmótico.

[0031]FIG. 15 ilustra que a troca de FungiSNP_18 entre as cepas de base e de produção possui um impacto sobre a esporulação e a taxa de crescimento radial.

[0032]A FIG. 16 ilustra a deleção na cepa de base de todas as sequências codificadoras que contêm SNPs (ou seja, os FungiSNPs da Tabela 4) na cepa de produção.

[0033]A FIG. 17 ilustra que o gene que contém FungiSNP_18 é dispensável para esporulação na cepa de produção, mas não na cepa de base.

[0034]A FIG. 18 ilustra o design das construções bipartites e esquema geral empregado para realização dos experimentos PROSWP descritos no Exemplo 3.

[0035]A FIG. 19 ilustra que promotores mais fracos usados no Exemplo 3 impactam a morfologia. A cepa que contém

FungiSNP_18 (SNP18) sob o promotor fraco de manB possui morfologia de colônia mais apertada do que cepas que contêm outras combinações de promotores. O impacto do controle de SNP18 é mais pronunciado sob estresse osmótico do que sob pH baixo.

[0036]A FIG. 20 ilustra o PROSWP de FungiSNP_12 (snp_12). Promotores de força menor ligados operacionalmente a snp_12 resultam em pigmento amarelo nas hifas e alguma morfologia alterada (observada na borda de colônias). Esse pigmento amarelo é comum em diversos mutantes e acredita-se que seja um sinal de estresse metabólico.

[0037]A FIG. 21 ilustra que quando, dirigido por promotores mais fracos, FungiSNP_18 (snp_18) possui fenótipo morfológico mais severo na cepa de base do que na cepa de produção.

[0038]A FIG. 22 ilustra que a introdução de um gene nikA de Aspergillus (também conhecido como proteína C do Sistema de dois componentes (TcsC)) que contém uma mutação pontual (ou seja, SNP da Tabela 3 para FungiSNP_18; alteração de nucleotídeo C > T no domínio codificador, como mostrado no ID. DE SEQ. Nº: 76 vs. ID. DE SEQ. Nº: 7) na cepa de base leva à produção de ácido cítrico maior e retenção de resposta osmótica adequada. A FIG. 22 também mostra que a deleção de nikA leva ao crescimento mais lento e produção de ácido cítrico menor na cepa de base.

[0039]A FIG. 23A-B ilustra que a inserção do gene nikA de Aspergillus que compreende a mutação pontual descrita na FIG. 22 na cepa de base aumenta a titulação de ácido cítrico por 33% em frascos agitados. A FIG. 23A mostra titulações de ácido cítrico que foram quantificadas usando um ensaio enzimático (Megazyme; K-CITR) de culturas desenvolvidas em Meios de Produção de Ácido Cítrico por 96 horas em frascos agitados. As cepas foram desenvolvidas em triplicata. As barras de erro indicam um desvio-padrão da média. A FIG. 23B mostra um gráfico de ANOVA Oneway com pontos de linhas indicando intervalos de 95% de confiança. No geral, a FIG. 23A-B mostra que a introdução do gene nikA de Aspergillus que compreende a mutação pontual na cepa de base levou a um aumento de 33% na titulação de ácido cítrico.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0040]A presente revelação supera muitos dos desafios inerentes na manipulação genética de fungos filamentosos em uma plataforma de alto rendimento, automatizada. Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo são projetados para gerar cepas fúngicas de produção com crescimento hifal alterado para crescimento mais eficiente em culturas submersas. Os métodos compreendem a incorporação de alterações genéticas com o uso de co-transformação automatizada combinada com avaliação automatizada de transformantes permitindo, dessa forma, troca de traços genéticos entre duas cepas que afetam o crescimento e a morfologia das células fúngicas, sem passar por um cruzamento sexual. Definições

[0041]Embora os termos seguintes supostamente sejam bem compreendidos por aqueles habilitados na técnica, as definições seguintes são apresentadas para facilitar a explicação do tema atualmente revelado.

[0042]Os termos “um”, “uma”, “o” ou “a” se referem a um ou mais daquela entidade, ou seja, podem se referir aos referentes no plural. Dessa forma, os termos “um”, “uma”, “o” ou “a”, “um ou mais” e “pelo menos um” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Além disso, referência a “um elemento” pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de that mais do que u dos elementos está presente, a menos que o contexto exija claramente que há um e somente um dos elementos.

[0043]Como usados nesse relatório descritivo, os termos “organismo celular” “micro-organismo” ou “micróbio” devem ser considerados de forma ampla. Esses termos são usados de forma intercambiável e incluem, sem limitação, os dois domínios procarióticos, Bactérias e Arquéias, bem como certos fungos eucarióticos e protistas. Em algumas modalidades, a revelação se refere aos “micro-organismos” ou “organismos celulares” ou “micróbios” de listas/tabelas e figuras presentes na revelação. Essa caracterização pode se referir não apenas aos gêneros taxonômicos identificados das tabelas e figuras, mas também às espécies taxonômicas identificadas, bem como às várias cepas inéditas e recém identificadas ou projetadas de qualquer organismo nas referidas tabelas ou figuras. A mesma caracterização é verdadeira para a citação desses termos em outras partes do Relatório descritivo, por exemplo, nos Exemplos.

[0044]O termo “cenócito” ou “organismo cenocítico”, como usado nesse relatório descritivo, pode se referir a uma célula multinucleada ou um organismo que compreende uma célula multinucleada. A célula multinucleada pode resultar de múltiplas divisões nucleares sem sua citocinese acompanhante, em contraste com um sincício, que resulta de celular agregação, seguida por dissolução das membranas celulares dentro da massa. Exemplos de organismos cenocíticos no que se refere aos métodos, composições e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir protistas (por exemplo, algas, protozoários, mixogastrídeos (fungos viscosos), alveolados, plantas, fungos (por exemplo, fungos filamentosos), e/ou metazoários (por exemplo, Drosphila spp).

[0045]O termo “procariotas” é reconhecido na técnica e se refere às células que não contêm nenhum núcleo ou outras organelas celulares. Os procariotas são geralmente classificados em um de dois domínios, as Bactérias e as Arquéias. A diferença definitiva entre organismos dos domínios das Arquéias e Bactérias se baseia nas diferenças fundamentais na sequência de bases de nucleotídeos no RNA ribossomal 16S.

[0046]O termo “Arquéias” se refere a uma categorização de organismos da divisão Mendosicutes, encontrados tipicamente em ambientes incomuns e distinguidos do resto dos procariotas por vários critérios, incluindo o número de proteínas ribossomais e a ausência de ácido murâmico nas paredes celulares. Com base na análise de ssrRNA, as Arquéias consistem em dois grupos filogeneticamente distintos: Crenarchaeota e Euryarchaeota. Com base em sua fisiologia, as Arquéias podem ser organizadas em três tipos: metanógenas (procariotas que produzem metano); halófilas extremas (procariotas que vivem em concentrações muito elevadas de sal (NaCl); e termófilas extremas (hiper) (procariotas que vivem em temperaturas muito elevadas). Além da unificação das características das Arquéias que as distinguem das Bactérias (ou seja, sem mureína na parede celular, lipídeos da membrana ligados a éster etc.), esses procariotas exibem atributos estruturais ou bioquímicos únicos que os adaptam aos seus habitats particulares. As Crenarchaeota consistem principalmente em procariotas hipertermofílicos enxofre- dependentes e os Euryarchaeota contêm as metanógenas e halófilas extremas.

[0047]O termo “bactérias” ou “eubactérias” se refere a um domínio de organismos procarióticos. Bactérias incluem pelo menos 11 grupos distintos, ou seja: (1) bactérias gram- positivas (gram+), das quais há duas subdivisões principais: (1) grupo com G+C elevado (actinomicetos, micobactérias, micrococos, outras), (2) grupo com G+C baixo (bacilos, clostrídios, lactobacilos, estafilococos, estreptococos, micoplasmas); (2) Proteobactérias, por exemplo, bactérias Gram-negativas roxas fotossintéticas + não fotossintéticas (inclui as bactérias Gram-negativas mais “comuns”); (3) Cianobactérias, por exemplo, fototróficas oxigênicas; (4) espiroquetas e espécies relacionadas; (5) Planctomicetos; (6) Bacteroides, Flavobactérias; (7) Clamídias; (8) bactérias Verdes-enxofre; (9) bactérias Verdes não enxofre (também fototróficas anaeróbicas); (10) micrococos radiorresistentes e parentes; (11) Termófilas Termotoga e Thermosipho.

[0048]Um “eucariota” é qualquer organismo cujas células contêm um núcleo e outras organelas confinadas dentro de membranas. Eucariotas pertencem ao táxon Eukarya ou Eukaryota. A característica determinante que diferencia as células eucarióticas das células procarióticas (as bactérias e Arquéias mencionadas anteriormente) é que elas possuem organelas ligadas à membrana, especialmente ao núcleo, que contém o material genético, e está envolvido pelo envelope nuclear.

[0049]Os termos “célula hospedeira modificada geneticamente”, “célula hospedeira recombinante” e “cepa recombinante” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo e se referem às células hospedeiras que foram modificadas geneticamente pelos métodos de clonagem e de transformação da presente revelação. Dessa forma, os termos incluem uma célula hospedeira (por exemplo, bactérias, célula de levedura, célula fúngica, CHO, célula humana etc.) que foi alterada, modificada ou projetada geneticamente, de tal modo que exiba um genótipo e/ou fenótipo alterado, modificado ou diferente (por exemplo, quando a modificação genética afeta sequências de ácidos nucleicos codificadoras dos micro-organismo), comparado com o organismo de ocorrência natural do qual foi derivada. Subentende-se que, em algumas modalidades, os termos se referem não apenas à célula hospedeira recombinante particular em questão, mas também à prole ou prole potencial de uma célula hospedeira desse tipo.

[0050]O termo “micro-organismo do tipo selvagem” ou “célula hospedeira do tipo selvagem” descreve uma célula que ocorre na natureza, ou seja, uma célula que não foi modificada geneticamente.

[0051]O termo “cepa parental” ou “cepa parente” ou “parente” pode ser referir a uma célula hospedeira da qual cepas mutantes são derivadas. Consequentemente, a “cepa parental” ou “cepa parente” é uma célula hospedeira ou célula cujo genoma é perturbado por alguma forma conhecida na técnica e/ou fornecida nesse relatório descritivo para gerar uma ou mais cepas mutantes. A “cepa parental” ou “cepa parente” pode ou não ter um genoma idêntico àquele de uma cepa do tipo selvagem.

[0052]O termo “modificada por engenharia genética” pode se referir a qualquer manipulação do genoma de uma célula hospedeira (por exemplo, por inserção, deleção, mutação ou substituição de ácidos nucleicos).

[0053]O termo “controle” ou “célula hospedeira de controle” se refere a uma célula hospedeira de comparação apropriada para determinação do efeito de uma modificação genética ou tratamento experimental. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de controle é uma célula do tipo selvagem. Em outras modalidades, uma célula hospedeira de controle é geneticamente idêntica à célula hospedeira modificada geneticamente, exceto quanto à modificação (ou modificações) genética que diferencia a célula hospedeira do tratamento. Em algumas modalidades, a presente revelação ensina o uso de cepas parentais como células hospedeiras de controle. Em outras modalidades, uma célula hospedeira pode ser uma geneticamente célula idêntica que não possui um promotor ou SNP específico que está sendo testado na célula hospedeira de tratamento.

[0054]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alelo(s)” significa qualquer uma ou mais formas alternativas de um gene, no qual todos alelos estão relacionados a pelo menos um traço ou característica. Em uma célula diploide, os dois alelos de certo gene ocupam loci correspondentes em um par de cromossomos homólogos. Na medida em que a presente revelação, em modalidades, se relaciona às QTLs, ou seja, regiões genômicas que podem compreender um ou mais genes ou sequências regulatórias, é, em alguns casos, mais preciso se referir ao “haplótipo” (ou seja, um alelo de um segmento cromossômico) ao invés de “alelo”, no entanto, naqueles casos, o termo “alelo” deve ser subentendido como compreendendo o termo “haplótipo”.

[0055]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “lócus” (plural loci) significa um local ou locais específicos em um sítio em um cromossomo onde, por exemplo, um gene ou marcador genético é encontrado.

[0056]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligados geneticamente” se refere a dois ou mais traços que são co-herdados em uma taxa elevada durante reprodução de modo que sejam de difícil separação por meio de cruzamento.

[0057]O termo “recombinação” ou “evento de recombinação”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um cruzamento cromossômico ou classificação independente. O termo “recombinante” se refere a um organismo que possui uma nova constituição genética que surge como resultado de um evento de recombinação.

[0058]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fenótipo” se refere às características observáveis de uma célula individual, cultura de células, organismo ou grupo de organismos que resultam da interação entre a constituição genética do indivíduo (ou seja, genótipo) e o ambiente.

[0059]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “quimérica” ou “recombinante”, quando se descreve uma sequência de ácidos nucleicos ou a uma sequência de proteína, se refere a um ácido nucleico, ou a uma sequência de proteína, que liga pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos, ou dois polipeptídeos heterólogos, em uma única macromolécula, ou que rearranja um ou mais elementos de pelo menos um ácido nucleico ou sequência de proteína natural. Por exemplo, o termo “recombinante” pode se referir a uma combinação artificial de dois segmentos de sequência de outro modo separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética.

[0060]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência de nucleotídeos sintética” ou “sequência de polinucleotídeos sintética” é uma sequência de nucleotídeos que sabidamente não ocorre na natureza ou que não é de ocorrência natural. Geralmente, essa sequência de nucleotídeos sintética compreenderá pelo menos uma diferença de nucleotídeo, quando comparada com qualquer outra sequência de nucleotídeos de ocorrência natural.

[0061]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ácido nucleico” se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos, ou análogos destes. Esse termo se refere à estrutura primária da molécula e, dessa forma, inclui DNA de fita dupla e de fita simples, bem como RNA de fita dupla e de fita simples. Ele também inclui ácidos nucleicos modificados como, por exemplo, ácidos nucleicos metilados e/ou capeados, ácidos nucleicos que contêm bases modificadas, modificações do arcabouço e semelhantes. Os termos “ácido nucleico” e “sequência de nucleotídeos” são usados de forma intercambiável.

[0062]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “arcabouço de DNA” ou “arcabouço de ácido nucleico” se refere a um arcabouço de ácido nucleico que é produzido artificialmente ou uma sequência de ocorrência natural que é adaptada como um arcabouço. Em uma modalidade da presente revelação, o arcabouço de ácido nucleico é um arcabouço de ácido desoxirribonucleico sintético. Os desoxirribonucleotídeos do arcabouço sintético podem compreender bases de purina e pirimidina ou outras bases de desoxirribonucleotídeo naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas, não-naturais ou derivatizadas. Como descrito em mais detalhe nesse relatório descritivo, o arcabouço de ácido nucleico da presente revelação é utilizado para montar e imobilizar espacialmente e temporalmente duas ou mais proteínas envolvidas em uma via biológica, ou seja, enzimas biossintéticas, para criar uma complexo funcional. A montagem e imobilização de cada proteína da via biológica no arcabouço ocorre por meio da interação de ligação entre uma das sequências de ligação de proteína, ou seja, proteína sítios de ancoragem, do arcabouço e uma porção de ligação ao DNA correspondente de uma enzima biossintética quimérica. Consequentemente, o arcabouço de ácido nucleico compreende uma ou mais subunidades, cada subunidade compreendendo duas ou mais sequências de ligação de proteína para acomodar a ligação de duas ou mais diferente proteínas quiméricas da via biológica.

[0063]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência de ligação ao DNA” ou “sítio de ligação ao DNA” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos específica que é reconhecida e ligada por uma porção do domínio de ligação ao DNA de genes biossintéticos quiméricos da presente revelação. Muitos domínios de proteína de ligação ao DNA e seus sítios de reconhecimento de parceiro de ligação cognatos

(ou seja, sítios de ligação de proteína) são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, numerosos domínios de ligação de dedo de zinco e seus sítios-alvo de ligação de proteína de DNA correspondentes são conhecidos na técnica e adequados para uso na presente revelação. Outros domínios de ligação ao DNA incluem, sem limitação, domínios de ligação de zíper de leucina e seus sítios de ligação de proteína de DNA correspondentes, domínios de ligação à hélice com asa e seus sítios de ligação de proteína de DNA correspondentes, domínios de ligação de hélice-giro-hélice com asa e seus sítios de ligação de proteína de DNA correspondentes, domínios de ligação de HMG-box e suas sequências de ligação de proteína de DNA correspondentes, domínios de ligação de hélice-alça-hélice e suas sequências de ligação de proteína de DNA correspondentes e domínios de ligação de hélice-giro- hélice e suas sequências de ligação de proteína de DNA correspondentes. Outros domínios de ligação ao DNA conhecidos com sequências de ligação de proteína de DNA conhecidas incluem o domínio de DNA de imunoglobulina, domínio de ligação ao DNA B3, e domínio de ligação ao DNA de efetor TAL. As subunidades de arcabouço de ácido nucleico da presente revelação podem compreender quaisquer dois ou mais dos sítios de ligação de proteína mencionados anteriormente.

[0064]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “gene” se refere a qualquer segmento de DNA associado a uma função biológica. Dessa forma, genes incluem, sem limitação, sequências codificadoras e/ou as sequências reguladoras necessárias à sua expressão. Genes também podem incluir segmentos de DNA não expressos que, por exemplo, formam sequências de reconhecimento para outras proteínas. Genes podem ser obtidos de diversas fontes, incluindo clonagem a partir de uma fonte de interesse ou a síntese a partir de informação de sequência conhecida ou prevista, e podem incluir sequências projetadas para ter parâmetros desejados.

[0065]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “homólogo” ou “ortólogo” é conhecido na técnica e se refere às sequências relacionadas que compartilham um membro ancestral ou da família comum e pode ser inferido com base no grau de identidade de sequência. Os termos “homologia”, “homólogo”, “substancialmente similar” e “substancialmente correspondente” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Eles se referem aos fragmentos de ácido nucleico nos quais alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam habilidade do fragmento de ácido nucleico para mediar a expressão gênica ou produzir certo fenótipo. Esses termos também se referem às modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente revelação como, por exemplo, deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante em relação ao fragmento inicial, não modificado. Subentende-se, portanto, como aqueles habilitados na técnica irão observar, que a revelação engloba mais do que as sequências exemplares específicas. Esses termos descrevem o relacionamento entre um gene encontrado em uma espécie, subespécies, variedade, cultivar ou cepa e o gene correspondente ou equivalente em outra espécie, subespécies, variedade, cultivar ou cepa. Para os objetivos dessa revelação são comparadas sequências homólogas. “Sequências homólogas” ou “homólogas” ou “ortólogas” estão supostamente ou comprovadamente funcionalmente relacionadas. Um relacionamento funcional pode ser indicado em qualquer uma de diversas formas incluindo, sem limitação: (a) grau de identidade de sequência e/ou (b) a mesma função biológica ou uma função biológica similar. De preferência, tanto (a) quanto (b) estão indicados. A homologia pode ser determinada com o uso de softwares prontamente disponíveis na técnica, tais como aqueles discutidos em “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel e cols., eds., 1987) Suplemento 30, Seção 7.718, Tabela 7.71. Alguns programas de alinhamento são MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania) e AlignX (Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA). Outro programa de alinhamento é Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), com o uso de parâmetros-padrão.

[0066]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “endógeno” ou “gene endógeno”, se refere ao gene de ocorrência natural, na localização na qual ele é encontrado naturalmente dentro do genoma da célula hospedeira. No contexto da presente revelação, a ligação operacional de um promotor heterólogo a um gene endógeno significa inserir geneticamente uma sequência promotora heteróloga na frente de um gene existente, na localização onde aquele gene está naturalmente presente. Um gene endógeno como descrito nesse relatório descritivo pode incluir alelos de genes de ocorrência natural que foram mutados de acordo com qualquer um dos métodos da presente revelação.

[0067]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “exógeno” é usado de forma intercambiável com o termo “heterólogo”, e se refere a uma substância que vem de alguma fonte diferente de sua fonte nativa. Por exemplo, os termos “proteína exógena”, ou “gene exógeno” se referem a uma proteína ou gene de uma nativa ou localização não fonte, e que foi fornecida artificialmente a um sistema biológico.

[0068]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “modificação heteróloga” pode se referir a uma modificação que vem de uma fonte diferente de uma fonte nativa para um sistema biológico particular (por exemplo, uma célula hospedeira como fornecida nesse relatório descritivo), ou uma modificação de uma fonte que é nativa para o sistema biológico particular, mas que é encontrada em um contexto/posição/localização não-nativa. Dessa forma, a modificação é não-nativa ou de ocorrência não natural em referência a um sistema biológico (por exemplo, uma célula hospedeira como fornecida nesse relatório descritivo, ou contexto/posição/localização não-nativa dentro de uma célula hospedeira), na qual a referida modificação foi ou será introduzida. A modificação heteróloga pode ser considerada, portanto, introduzida artificialmente no sistema biológico (por exemplo, uma célula hospedeira como fornecida nesse relatório descritivo, ou contexto/posição/localização heteróloga dentro de um hospedeiro). A modificação pode ser uma variação, ruptura ou perturbação genética ou epigenética. Uma variação, ruptura ou perturbação genética pode ser, por exemplo, substituição de um promotor nativo e/ou terminador de um gene com um promotor e/ou terminador que não é nativo para o referido hospedeiro, ou ela pode ser um promotor e/ou terminador de dentro do organismo hospedeiro que foi movido para um contexto/posição/localização heteróloga não-nativa. Uma variação, ruptura ou perturbação genética pode ser a substituição de um gene nativo ou de ocorrência natural com um gene não-nativo ou de ocorrência não natural como, por exemplo, um gene marcador selecionável. Ou, uma variação, ruptura ou perturbação genética pode ser a substituição, ou troca, de um gene nativo ou de ocorrência natural, com outro gene nativo (por exemplo, promotor) de dentro do genoma do hospedeiro, que é colocado em um contexto/posição/localização não-natural. Uma variação, ruptura ou perturbação genética pode ser a substituição de um gene nativo ou de ocorrência natural com uma forma não- nativa ou de ocorrência não natural do gene. A forma não- nativa ou de ocorrência não natural do gene pode ser uma forma mutante do gene não encontrada naturalmente em uma célula hospedeira particular e/ou uma forma mutante do gene não encontrada naturalmente em uma célula hospedeira particular operacionalmente ligada a um promotor e/ou terminador heterólogo.

[0069]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alteração de nucleotídeo” se refere, por exemplo, a uma substituição, deleção e/ou inserção de nucleotídeo, como é bem conhecido na técnica. Por exemplo, mutações contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades da proteína codificada ou como as proteínas são feitas.

[0070]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “modificação de proteína” se refere, por exemplo, à substituição de aminoácido, modificação de aminoácido, deleção e/ou inserção de aminoácido, como é bem conhecido na técnica.

[0071]Como usado nesse relatório descritivo, o termo

“pelo menos uma porção” ou “fragmento” de um ácido nucleico ou polipeptídeo significa uma porção que possui as características mínimas de tamanho dessas sequências, ou qualquer fragmento maior da molécula de comprimento total, até e incluindo a molécula de comprimento total. Um fragmento de um polinucleotídeo da revelação pode codificar uma porção biologicamente ativa de um elemento genético regulatório. Uma porção biologicamente ativa de um elemento genético regulatório pode ser preparada por isolamento de uma porção de um dos polinucleotídeos da revelação que compreende o elemento genético regulatório, e avaliação da atividade como descrito nesse relatório descritivo. Similarmente, uma porção de um polipeptídeo pode ser 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, e assim por diante, indo até o polipeptídeo de comprimento total. O comprimento da porção a ser usada dependerá da aplicação particular. Uma porção de um ácido nucleico útil como uma sonda de hibridização pode ser de apenas 12 nucleotídeos; em algumas modalidades, ela tem 20 nucleotídeos. Uma porção de um polipeptídeo útil como um epitopo pode ser de apenas 4 aminoácidos. Uma porção de um polipeptídeo que realiza a função do polipeptídeo de comprimento total geralmente seria mais longo do que 4 aminoácidos.

[0072]Polinucleotídeos variantes também englobam sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico como, por exemplo, embaralhamento de DNA. Estratégias para esse embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) PNAS 91:

10.747-10.751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri e cols. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore e cols.

(1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang e cols. (1997) PNAS 94: 4.504-4.509; Crameri e cols. (1998) Nature 391: 288-291; e Patentes U.S. Nos 5.605.793 e 5.837.458.

[0073]Para amplificações por PCR dos polinucleotídeos revelados nesse relatório descritivo, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para o design de iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e cols. (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova York). Veja também Innis e cols., eds. (1990) “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” (Academic Press, Nova York); Innis e Gelfand, eds. (1995) “PCR Strategies” (Academic Press, Nova York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) “PCR Methods Manual” (Academic Press, Nova York). Métodos conhecidos de PCR incluem, sem limitação, métodos de utilização de iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente incompatíveis e semelhantes.

[0074]O termo “iniciador”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de anelamento ao alvo da amplificação permitindo a adesão de uma DNA polimerase servindo, dessa forma, como um ponto de iniciação da síntese de DNA quando colocado sob condições nas quais a síntese de produto de extensão do iniciador é induzida, ou seja, na presença de nucleotídeos e de um agente para polimerização como, por exemplo, DNA polimerase, e em uma temperatura e pH adequados. O iniciador (de amplificação) é preferivelmente de fita simples para eficiência máxima na amplificação. De preferência, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo. O iniciador deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente para polimerização. Os comprimentos exatos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, incluindo a temperatura e composição (teor de A/T vs. G/C) do iniciador. Um par de iniciadores bidirecionais consiste em um iniciador direto e um reverso, como comumente usados na técnica de amplificação de DNA como, por exemplo, em amplificação por PCR.

[0075]Os termos “rigor” ou “condições de hibridização rigorosas” se referem às condições de hibridização que afetam a estabilidade de híbridos, por exemplo, temperatura, concentração de sal, pH, concentração de formamida e semelhantes. Essas condições são otimizadas empiricamente para maximizar a ligação específica e minimizar a ligação não específica do iniciador ou sonda à sua sequência de ácidos nucleicos-alvo. Os termos como usados incluem referência às condições sob as quais uma sonda ou iniciador hibridizará para sua sequência-alvo, até um grau detectavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao nível de fundo). Condições rigorosas são sequência-dependentes e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas maiores. Geralmente, condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C menores do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibridiza para uma sonda ou iniciador perfeitamente compatível. Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menos do que cerca de 1,0 M de íon Na+, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na+ (ou outros sais) em pH 7,0 até 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas ou iniciadores curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas ou iniciadores longos (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). Condições rigorosas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes como, por exemplo, formamida. Condições de baixo rigor exemplares ou “condições de rigor reduzido” incluem hibridização com uma solução- tampão de formamida 30%, 1 M de NaCl, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 2 x SSC a 40°C. Condições de rigor elevado exemplares incluem hibridização em formamida 50%, 1 M de NaCl, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,1 x SSC a 60°C. Os procedimentos de hibridização são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por Ausubel e cols., 1998 e Sambrook e cols., 2001. Em algumas modalidades, condições rigorosas são hibridização em 0,25 M de tampão de Na2HPO4 (pH 7,2) que contém 1 mM de Na2EDTA, dodecil sulfato de sódio 0,5-20% a 45°C, por exemplo, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%, seguido por uma lavagem em 5 x SSC, contendo dodecil sulfato de sódio 0,1% (p/v), a 55°C até 65°C.

[0076]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “promotor” se refere a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou RNA funcional.

Em algumas modalidades, a sequência promotora consiste em elementos a montante proximais e mais distais, os últimos elementos frequentemente referidos como intensificadores.

Consequentemente, um “intensificador” é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor, pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para intensificar o nível ou especificidade de tecido de um promotor.

Promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou podem ser compostos por elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza, ou até mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos.

Subentende-se por aqueles habilitados na técnica que promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em tecidos ou tipos de células diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta a condições ambientais diferentes.

Um promotor para uso nos métodos e sistemas descritos nesse relatório descritivo pode ser induzível, de modo que a expressão de um gene ou genes sob o controle do referido promotor é regulada pela presença e/ou ausência de um agente específico.

Os promotores induzíveis podem ser qualquer promotor cuja atividade transcricional seja regulada pela presença ou ausência de uma condição química ou física como, por exemplo, álcool, tetraciclina, esteroides, metal ou outros compostos conhecidos na técnica ou pela presença ou ausência de luz ou temperaturas baixas ou altas.

Reconhece-se ainda que, na medida em que na maioria dos casos os limites exatos de sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de alguma variação podem ter atividade promotora idêntica.

[0077]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “terminador” geralmente se refere a uma seção de sequência de DNA que marca o final de um gene no DNA genômico e é capaz de interromper a transcrição. Terminadores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou serem compostos por elementos diferentes derivados de terminadores diferentes encontrados na natureza, ou até mesmo compreenderem segmentos de DNA sintéticos. Subentende-se por aqueles habilitados na técnica que terminadores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em tecidos ou tipos de células diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta a condições ambientais diferentes.

[0078]Como usadas nesse relatório descritivo, as frases “construção recombinante”, “construção de expressão”, “construção quimérica”, “construção” e “construção de DNA recombinante” são usadas de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências regulatórias e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção quimérica pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente daquela encontrada na natureza. Essa construção pode ser usada como tal ou pode ser usada em conjunto com um vetor. Se um vetor é usado, então a escolha do vetor depende do método que será usado para transformar as células hospedeiras, como é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica.

Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado.

Aqueles habilitados na técnica estão cientes dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que compreendem qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolados da revelação.

Aqueles habilitados na técnica também reconhecerão que eventos de transformação independentes diferentes resultarão em níveis e padrões de expressão diferentes (Jones e cols., (1985) EMBO J. 4: 2.411-2.418; De Almeida e cols., (1989) Mol.

Gen.

Genetics 218: 78-86) e, dessa forma, que múltiplos eventos devem ser avaliados a fim de obter linhagens que exibem o nível e padrão de expressão desejados.

Essa avaliação pode ser feita por análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de mRNA, análise por immunoblotting de expressão de proteína, ou expressão fenotípica, entre outras.

Vetores podem ser plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fagomídeos, transposons, cromossomos artificiais e semelhantes, que replicam autonomamente ou podem integrar em um cromossomo de uma célula hospedeira.

Um vetor também pode ser um polinucleotídeo de RNA naked, um polinucleotídeo de DNA naked, um polinucleotídeo formado tanto por DNA quanto por RNA dentro da mesma fita, um DNA ou RNA conjugado a polilisina, um DNA ou RNA conjugado a peptídeo, um DNA conjugado a lipossomo ou semelhantes, que não replica autonomamente.

Como usado nesse relatório descritivo, o termo “expressão” se refere à produção de um produto final funcional, por exemplo, um mRNA ou uma proteína (precursora ou madura).

[0079]O termo “ligado operacionalmente” significa nesse contexto o arranjo sequencial do polinucleotídeo promotor de acordo com a revelação com um oligo- ou polinucleotídeo adicional, resultando na transcrição do referido polinucleotídeo adicional.

[0080]O termo “produto de interesse” ou “biomolécula”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a qualquer produto produzido por micróbios a partir de matéria-prima. Em alguns casos, o produto de interesse pode ser uma pequena molécula, enzima, peptídeo, aminoácido, ácido orgânico, composto sintético, combustível, álcool etc. Por exemplo, o produto ou biomolécula de interesse pode ser qualquer metabólito extracelular primário ou secundário. O metabólito primário pode ser, entre outros, etanol, ácido cítrico, ácido lático, ácido glutâmico, glutamato, lisina, treonina, triptofano e outros aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos etc. O metabólito secundário pode ser, entre outros, um composto antibiótico como penicilina, ou um imunossupressor como ciclosporina A, um hormônio de planta como giberelina, um fármaco de estatina como lovastatina, um fungicida como griseofulvina etc. O produto ou biomolécula de interesse também pode ser qualquer componente intracelular produzido por um micróbio, por exemplo: uma enzima microbiana, incluindo: catalase, amilase, protease, pectinase, glicose isomerase, celulase, hemicelulase, lipase, lactase, estreptoquinase, e muitas outras. O componente intracelular também pode incluir proteínas recombinantes, por exemplo: insulina, vacina para hepatite B, interferon, fator estimulante de colônia de granulócitos, estreptoquinase e outros. O produto de interesse também pode se referir a uma

“proteína de interesse”.

[0081]O termo “proteína de interesse” geralmente se refere a qualquer polipeptídeo que se deseja expressar em um fungo filamentoso. Uma proteína desse tipo pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural ou semelhantes, e pode ser expressa em níveis elevados, e pode ser para fins de comercialização. A proteína de interesse pode ser codificada por um gene endógeno ou um gene heterólogo em relação à cepa variante e/ou à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada. Caso a proteína de interesse não seja secretada naturalmente, o polinucleotídeo que codifica a proteína pode ser modificado para ter uma sequência sinalizadora de acordo com metodologias conhecidas na técnica. As proteínas, que são secretadas, podem ser proteínas endógenas que são expressas naturalmente, mas também podem ser heterólogas. O termo “heteróloga” significa que o gene codificado pela proteína não é produzido sob condição nativa na célula hospedeira fúngica filamentosa. Exemplos de enzimas que podem ser produzidas pelos fungos filamentosos da revelação são carboidrases, por exemplo, celulases como, por exemplo, endoglucanases, beta-glucanases, celobiohidrolases ou beta- glucosidases, hemicelulases ou enzimas pectinolíticas como, por exemplo, xilanases, xilosidases, mananases, galactanases, galactosidases, ramnogalacturonases, arabanases, galacturonases, liases, ou enzimas amilolíticas; fosfatases como, por exemplo, fitases, esterases como, por exemplo, lipases, enzimas proteolíticas, oxidorredutases como, por exemplo, oxidases, transferases ou isomerases.

[0082]O termo “fonte de carbono” geralmente se refere a uma substância adequada para ser usada como uma fonte de carbono para o crescimento celular. Fontes de carbono incluem, sem limitação, hidrolisados de biomassa, amido, sacarose, celulose, hemicelulose, xilose e lignina, bem como componentes monoméricos desses substratos. Fontes de carbono podem compreender vários compostos orgânicos em várias formas incluindo, sem limitação, polímeros, carboidratos, ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos etc. Esses incluem, por exemplo, vários monossacarídeos como, por exemplo, glicose, dextrose (D-glicose), maltose, oligossacarídeos, polissacarídeos, ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol etc., ou misturas destes. Organismos fotossintéticos podem adicionalmente produzir uma fonte de carbono como um produto da fotossíntese. Em algumas modalidades, fontes de carbono podem ser selecionadas de hidrolisados de biomassa e glicose.

[0083]O termo “matéria-prima” é definido como um material bruto ou mistura de materiais brutos fornecida a um micro-organismo ou processo de fermentação do qual outros produtos podem ser feitos. Por exemplo, uma fonte de carbono, por exemplo, biomassa ou os compostos de carbono derivados de biomassa, são uma matéria-prima para um micro-organismo que produz um produto de interesse (por exemplo, pequena molécula, peptídeo, composto sintético, combustível, álcool etc.) em um processo de fermentação. No entanto, uma matéria- prima pode conter outros nutrientes além de uma fonte de carbono.

[0084]O termo “produtividade volumétrica” ou “taxa de produção” é definido como a quantidade de produto formada por volume de meio por unidade de tempo. A produtividade volumétrica pode ser registrada em gramas por litro por hora (g/l/h).

[0085]O termo “produtividade específica” é definido como a taxa de formação do produto. A produtividade específica é ainda definida nesse relatório descritivo como a produtividade específica em grama de produto por grama de peso seco de célula (CDW) por hora (g/g CDW/h). Com o uso da relação de CDW para OD600 para certo micro-organismo, a produtividade específica também pode ser expressa como grama de produto por litro de meio de cultura por densidade óptica do caldo de cultura a 600 nm (OD) por hora (g/l/h/OD).

[0086]O termo “rendimento” é definido como a quantidade de produto obtida por unidade de peso de matéria-prima, e pode ser expresso como g de produto por g de substrato (g/g). O rendimento pode ser expresso como uma percentagem do rendimento teórico. O termo “rendimento teórico” é definido como a quantidade máxima de produto que pode ser gerada por certa quantidade de substrato, como ditado pela estequiometria da via metabólica usada para fazer o produto.

[0087]O termo “titulação” é definido como a força de uma solução ou a concentração de uma substância em solução. Por exemplo, a titulação de um produto de interesse (por exemplo, pequena molécula, peptídeo, composto sintético, combustível, álcool etc.) em um caldo de fermentação é descrita como g de produto de interesse em solução por litro de caldo de fermentação (g/l).

[0088]O termo “titulação total” é definido como a soma de todo o produto de interesse produzido em um processo incluindo, sem limitação, o produto de interesse em solução,

o produto de interesse em fase gasosa, se aplicável, e qualquer produto de interesse removido do processo e recuperado em relação ao volume inicial no processo ou ao volume operacional no processo.

[0089]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “biblioteca de design genético HTP” ou “biblioteca” se refere às coleções de perturbações genéticas de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, as bibliotecas da presente revelação podem se manifestar como i) uma coleção de informação de sequência em um banco de dados ou outro arquivo de computador, ii) uma coleção de construções genéticas que codificam a série de elementos genéticos mencionada anteriormente, ou iii) cepas de células hospedeiras que compreendem os referidos elementos genéticos. Em algumas modalidades, as bibliotecas da presente revelação podem ser referir às coleções de elementos individuais (por exemplo, coleções de promotores para bibliotecas de troca PRO, ou coleções de terminadores para bibliotecas de troca STOP). Em outras modalidades, as bibliotecas da presente revelação também podem ser referir às combinações de elementos genéticos, por exemplo, combinações de promotor::genes, gene:terminador, ou até mesmo promotor:gene:terminadores. Em algumas modalidades, as bibliotecas da presente revelação ainda compreendem metadados associados aos efeitos da aplicação de cada membro da biblioteca em organismos hospedeiros. Por exemplo, uma biblioteca como usada nesse relatório descritivo pode incluir uma coleção de combinações de sequências de promotor::gene, junto com o efeito resultante daquelas combinações em um ou mais fenótipos como, por exemplo,

alterações na morfologia, quando desenvolvidas em culturas submersas em uma espécie particular aumentando, dessa forma, o valor preditivo futuro da utilização da referida combinação em trocas de promotor futuras.

[0090]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “SNP” pode se referir ao Polimorfismo (ou Polimorfismos) Nuclear Pequeno. Em algumas modalidades, os SNPs da presente revelação devem ser construídos amplamente, e incluem polimorfismos de nucleotídeo único, inserções, deleções, inversões de sequência, e outras substituições de sequências. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “não sinônimos” ou “SNPs não sinônimos” se refere às mutações que levam a alterações de codificação em proteínas da célula hospedeira.

[0091]Um método de “alto rendimento (HTP)” de modificação genômica por engenharia genética pode envolver a utilização de pelo menos uma peça de equipamento automatizado (por exemplo, um manipulador de líquidos ou uma máquina manipuladora de placas) para a realização de pelo menos uma etapa do referido método.

[0092]Os termos “substancialmente reduzido” e “substancialmente menos” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo e, quando se referem a um nível de expressão ou quantidade ou ao nível de uma atividade de uma proteína ou enzima, podem ser referir a uma redução da referida quantidade ou atividade por uma percentagem ou faixa de percentagens, comparado com ou versus um nível ou atividade de controle ou de referência da referida proteína ou enzima. Os termos “substancialmente reduzido” e “substancialmente menos” podem ser referir a uma redução de uma quantidade ou nível de uma proteína ou enzima ou uma atividade de uma enzima por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparado com ou versus um controle ou referência (por exemplo, um nível ou atividade de controle ou de referência da referida proteína ou enzima). Os termos “substancialmente reduzido” e “substancialmente menos” podem ser referir a uma redução de uma quantidade ou nível de uma proteína ou enzima ou atividade de uma enzima (por exemplo, atividade enzimática) por 1%-5%, 10%-15%, 15%- 20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%- 85%, 85%-90%, 90%-95% ou 95%-100%, incluindo os pontos finais, comparado com ou versus um controle ou referência (por exemplo, um nível ou atividade de controle ou de referência da referida proteína ou enzima). Os termos “substancialmente reduzido” e “substancialmente menos” também podem significar que a quantidade de uma proteína ou enzima ou a atividade de uma enzima pode ser pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,

43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da quantidade da versão de controle ou de referência da referida proteína ou enzima ou a atividade da referida enzima. Os termos “substancialmente reduzido” e “substancialmente menos” também podem significar que a quantidade de uma proteína ou enzima ou a atividade de uma enzima é de 1%-5%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%- 45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95% ou 95%-100%, incluindo os pontos finais, da quantidade de um controle ou referência versão da referida proteína ou enzima ou a atividade de uma enzima. Com relação a um nível ou quantidade de uma proteína ou enzima, o controle ou referência pode ser um nível ou quantidade da referida proteína ou enzima em uma célula de controle ou de referência. Em uma modalidade, a proteína ou enzima testada em uma célula de controle de referência não possui uma modificação heteróloga. Com relação à atividade de uma enzima, o controle ou referência pode ser a atividade da referida proteína ou enzima em uma célula de controle ou de referência. Em uma modalidade, a proteína ou enzima testada em uma célula de controle de referência não possui uma modificação heteróloga.

[0093]O nível ou atividade de uma proteína ou enzima fornecida nesse relatório descritivo pode ser medido dentro de uma célula ou após extração e/ou isolamento de uma célula (por exemplo, in vitro). Em alguns casos, o nível ou quantidade de um gene que codifica uma proteína de interesse é medido ou determinado. O nível ou quantidade de um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser medido dentro de uma célula ou após extração de uma célula (por exemplo, in vitro). Em alguns casos, a atividade de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo é medida ou determinada. A atividade (por exemplo, atividade específica) de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser medida dentro de uma célula ou após extração de uma célula (por exemplo, in vitro). O ensaio utilizado para medir o nível ou a quantidade de expressão de um gene ou proteína fornecida nesse relatório descritivo pode ser do tipo alto rendimento. O ensaio utilizado para medir a atividade de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser do tipo alto rendimento.

[0094]O nível ou quantidade de um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser medido com o uso de qualquer ensaio conhecido na técnica para a medição de um nível ou quantidade de gene no nível de ácido nucleico. Exemplos de ensaios adequados para determinação ou medição dos níveis de ácido nucleico (por exemplo, um gene fornecido nesse relatório descritivo) podem ser selecionados de análise de microarranjo, RT-PCR como, por exemplo, RT-PCR quantitativa (qRT-PCR), análise serial da expressão gênica (SAGE), RNA- seq., Northern Blot, tecnologia de codificação de barras molecular digital, por exemplo, “Nanostring Counter Analysis”, e ensaios de PCR quantitativa TaqMan. Outros métodos de detecção e quantificação de mRNA podem ser aplicados, por exemplo, hibridização de mRNA in situ. A hibridização de mRNA in situ pode ser medida usando QuantiGene ViewRNA (Affymetrix), que usa conjuntos de sondas para cada mRNA que se ligam especificamente a um sistema de amplificação para amplificar os sinais de hibridização; esses sinais amplificados podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência-padrão ou sistema de imageamento. Esse sistema por exemplo, pode detectar e medir níveis de transcrito em amostras heterogêneas;

[0095]O nível ou quantidade de uma proteína codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser medido com o uso de qualquer ensaio conhecido na técnica para a medição de um nível ou quantidade no nível de proteína. Exemplos de ensaios adequados para determinação ou medição dos níveis de proteína (por exemplo, codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo) podem ser selecionados de espectrometria de massa quantitativa ou imunoensaios incluindo, por exemplo, imunoistoquímica, ELISA, Western blot, imunoprecipitação, ensaio Luminex® e semelhantes, nos quais um agente de detecção de biomarcador como, por exemplo, um anticorpo, por exemplo, um anticorpo marcado, se liga especificamente a uma proteína codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo e permite, por exemplo, a constatação relativa ou absoluta da quantidade de uma proteína em uma amostra ou uma célula. O nível ou quantidade de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo ou do próprio gene que foi modificado heterologamente como fornecido nesse relatório descritivo pode ser comparado com o nível ou quantidade da mesma enzima ou gene que não foi modificado heterologamente como descrito nesse relatório descritivo e a percentagem do nível ou quantidade da enzima ou gene modificado vs. a enzima ou gene não modificado pode ser determinada.

[0096]A atividade de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo pode ser medida com o uso de qualquer ensaio conhecido na técnica para a medição da atividade enzimática. Exemplos de ensaios adequados para a determinação da atividade enzimática podem ser qualquer ensaio de quinase conhecido na técnica como, por exemplo, ensaios bioquímicos de quinase comercialmente disponíveis por EMD Millipore (por exemplo, ensaios HTRF baseados em FRET), eBioscience (por exemplo, ensaios de sinalização celular Instant One), Life Technologies (ensaios de quinase LanthaScreen ou Omnia), Symansis (por exemplo, arranjo de ensaio Multikinase), Abcam ou Promega (por exemplo, o Ensaio de Quinase ADP-Glo). O ensaio de atividade de quinase pode ser de base radiométrica e empregam o uso de radioisótopos (por exemplo, ATP marcado com λ-32P ou 32P ortofosfato) ou serem ensaios baseados em luminescência ou fluorescência (por exemplo, ATP marcado com fluoróforos). Em uma modalidade, um ensaio de atividade de histidina-quinase é empregado para medir a atividade de uma histidina-quinase como, por exemplo, a histidina-quinase de dois componentes codificada pelo gene nikA de A. niger (por exemplo, proteína codificada pela sequência de ácidos nucleicos que contém SNP do ID. DE SEQ. Nº: 7 ou uma sequência de ácidos nucleicos que não contêm SNP dos IDS. DE SEQ. Nos: 14 ou 76). O ensaio de atividade de histidina-quinase pode ser qualquer ensaio de atividade de histidina-quinase conhecido na técnica. Em um exemplo, a atividade de uma quinase (por exemplo, uma histidina-quinase) codificada por um gene ou sequência de ácidos nucleicos fornecido nesse relatório descritivo (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos dos IDS. DE SEQ. Nos: 7, 4 ou 76) pode ser determinada com o uso de um ensaio radiométrico de atividade e análise de quinase (ou seja, eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em combinação com contagem de cintilação líquida), como descrito em Sankhe G.D., Dixit N.M., Saini D.K. 2018. “Activation of Bacterial Histidine Kinases: Insights Into the Kinetics of the cis Autophosphorylation Mechanism”. mSphere 3:e00111-18, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência. Em outro exemplo, a atividade de uma quinase (por exemplo, uma histidina-quinase) codificada por um gene ou sequência de ácidos nucleicos fornecido nesse relatório descritivo (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos dos IDS. DE SEQ. Nos: 7, 4 ou 76) pode ser determinada como uso de ensaios de fosfo-transferência que empregam marcação radioisotópica em combinação com SDS-PAGE e auto-radiografia, como descrito em Brown, J L e cols. “Yeast Skn7p Functions in a Eukaryotic Two-Component Regulatory Pathway”. The EMBO Journal vol. 13,21 (1994): 5.186-94, Aoyama, K e cols. “Spy1, a Histidine- Containing Phosphotransfer Signaling Protein, Regulates the Fission Yeast Cell Cycle Through the Mcs4 Response Regulator”. Journal of Bacteriology vol. 182,17 (2000):

4.868-74, e Li, S e cols. “The Yeast Histidine Protein Kinase, Sln1p, Mediates Phosphotransfer to two Response Regulators, Ssk1p and Skn7p”. The EMBO Journal vol. 17,23 (1998): 6.952-62, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência. A atividade de uma enzima codificada por um gene fornecido nesse relatório descritivo que foi modificado heterologamente como fornecido nesse relatório descritivo pode ser comparada com a atividade da mesma enzima que é codificada por um gene que não foi modificado heterologamente como descrito nesse relatório descritivo e o nível ou percentagem de atividade da enzima modificada vs. a enzima não modificada pode ser determinado. Visão geral

[0097]É um objetivo da presente invenção fornecer cepas de organismos eucarióticos filamentosos que possuem um fenótipo morfológico desejado quando desenvolvidos em meios de produção para um produto de interesse, bem como métodos para a geração das referidas cepas de organismos eucarióticos filamentosos. Uma cepa variante gerada usando os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que possui o fenótipo morfológico desejado pode produzir um rendimento, titulação ou titulação total maior do referido produto de interesse, comparada com uma cepa parental ou de controle. Uma cepa variante gerada usando os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que possui o fenótipo morfológico desejado pode produzir o referido produto de interesse em uma taxa de produção maior do que uma cepa parental ou de controle. Uma cepa variante gerada usando os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que possui o fenótipo morfológico desejado pode produzir o referido produto de interesse com uma produtividade volumétrica ou produtividade específica maior, comparada com uma cepa parental ou de controle. O organismo eucariótico filamentoso pode ser qualquer organismo eucariótico filamentoso conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, Aspergillus niger (A. niger). O fenótipo morfológico desejado pode ser um fenótipo de pellet não-micélio quando desenvolvido sob condições de cultura submersa em um meio de produção desejado para um produto de interesse desejado.

O produto desejado ou produto de interesse pode ser qualquer produto listado na Tabela 1. Em uma modalidade, o produto de interesse desejado é uma enzima.

A enzima pode ser qualquer enzima conhecida na técnica para ser produzida por organismos modificados geneticamente.

A enzima pode ser qualquer enzima encontrada na Tabela 1. Em uma modalidade, o produto de interesse desejado é ácido cítrico e o meio de produção desejado é meio de produção de ácido cítrico (CAP). Em alguns casos, as cepas eucarióticas filamentosas (por exemplo, A. niger) que compreendem o fenótipo morfológico desejado (por exemplo, morfologia de pellet, não-micélio) podem ser desenvolvidas em meio CAP que compreende manganês que é livre ou substancialmente livre (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em caldo de fermentação conhecido na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico) de agentes quelantes como, por exemplo, quelantes de manganês.

O manganês pode estar em uma quantidade de cerca de 13 ppb ou maior.

O manganês pode estar em uma quantidade de cerca de 14 ppb ou maior.

Em outra modalidade, as cepas de cepas eucarióticas filamentosas fornecidas (por exemplo, A. niger) que compreendem o fenótipo morfológico desejado (por exemplo, morfologia de pellet, não-micélio) compreendem um ou mais genes que participam do controle da morfologia que foram alterados ou rompidos.

A ruptura ou alteração pode ser uma mutação dentro do domínio codificador do gene.

A ruptura ou alteração pode ser uma alteração em um elemento de controle genético (por exemplo,

promotor e/ou terminador). A ruptura ou alteração pode ser uma mutação dentro do domínio codificador do gene em combinação com uma alteração em um elemento de controle genético (por exemplo, promotor e/ou terminador). A alteração no elemento de controle genético pode ser a substituição de um elemento de controle genético endógeno com a elemento de controle genético não nativo ou heterólogo.

Em alguns casos, o elemento de controle genético é um promotor.

O promotor pode ser selecionado de um promotor listado na Tabela 2. Os (um ou mais) genes que participam do controle da morfologia podem ser qualquer gene conhecido na técnica como participante no controle da morfologia do organismo eucariótico filamentoso (por exemplo, A. niger). Genes que participam do controle da morfologia podem ser genes que codificam proteínas que funcionam na estrutura física da célula, bem como genes que são parte das vias bioquímicas que regulam ou governam, direta ou indiretamente, a expressão de proteínas que funcionam na estrutura física da célula.

Os (um ou mais) genes que participam do controle da morfologia can podem ser qualquer gene fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, as sequências de genes que contêm SNP representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 5, 6, 7 ou 8 ou ortólogos destes da Tabela 4 isoladamente ou em combinação com um ou mais genes encontrados dentro das mesmas vias que as referidas sequências de genes que contêm SNP.

Em uma modalidade, os (um ou mais) genes que participam do controle da morfologia são um ou mais genes de uma via da resposta osmótica ou da resposta ao estresse osmótico.

Por exemplo, os (um ou mais) genes ou ortólogos destes podem ser selecionados dos genes da via de resposta osmótica mostrados na Tabela 7. Em uma modalidade, os (um ou mais) genes que participam do controle da morfologia de uma célula hospedeira de Aspergillus (por exemplo, A. niger) são os ortólogos de um ou mais dos genes da via osmótica de leveduras mostrados na Tabela 7. Por exemplo, o ortólogo de A. niger de um ou mais genes da via de resposta osmótica de leveduras pode ser selecionado das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9-32, 76 ou qualquer combinação destes.

Os métodos para a geração das cepas de organismos eucarióticos filamentosos que possuem um fenótipo morfológico desejado quando desenvolvidos em meios de produção para um produto de interesse podem compreender a realização de um método de troca PRO, um método de troca de SNP ou uma combinação de um método de troca PRO e um método de troca de SNP, como fornecidos nesse relatório descritivo.

Os métodos de troca de SNP e/ou de troca PRO podem ser realizados como descritos em PCT/US2018/036360, depositado em 6 de junho de 2018, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência.

Tabela 1. – Uma lista não limitante das células hospedeiras e produtos de interesse da presente revelação.

Categoria de Categoria de Produtos Hospedeiros produto hospedeiro Saccharomyces Sabor e fragrância Agarwood Levedura cerevisiae Saccharomyces Sabor e fragrância Ambrox Levedura cerevisiae Saccharomyces Sabor e fragrância Nootkatone Levedura cerevisiae Óleo de Saccharomyces Sabor e fragrância Levedura patchouli cerevisiae Saccharomyces Sabor e fragrância Açafrão Levedura cerevisiae Óleo de Saccharomyces Sabor e fragrância Levedura sândalo cerevisiae Saccharomyces Sabor e fragrância Valenceno Levedura cerevisiae Saccharomyces Sabor e fragrância Vanilina Levedura cerevisiae

Categoria de Categoria de Produtos Hospedeiros produto hospedeiro CoQ10/Ubiquino Schizosaccharomy Alimento Levedura l ces pombe Ácidos graxos Alimento Microalgas Schizochytrium Ômega 3 Ácidos graxos Alimento Microalgas Schizochytrium Ômega 6 Fungos Alimento Vitamina B2 Ashbya gossypii filamentosos Fungos do tipo Alimento Eritritol Torula coralline levedura Fungos do tipo Pseudozyma Alimento Eritritol levedura tsukubaensis Fungos do tipo Moniliella Alimento Eritritol levedura pollinis Glicosídeos do Saccharomyces Alimento Levedura esteviol cerevisiae Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido cítrico filamentosos niger Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido cítrico filamentosos carbonarius Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido cítrico filamentosos aculeatus Pichia Ácidos orgânicos Ácido cítrico Levedura guilliermondii Ácido Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos glucônico filamentosos niger Ácido Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos itacônico filamentosos terreus Ácido Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos itacônico filamentosos niger Ácidos orgânicos LCDAs - DDDA Levedura Candida Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido kójico filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido kójico filamentosos flavus Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido kójico filamentosos tamarii Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido málico filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido oxálico filamentosos niger Ácido Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos succínico filamentosos saccarolyticus Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido lático filamentosos niger Fungos Aspergillus Ácidos orgânicos Ácido lático filamentosos brasiliensis Agente Fungos Aspergillus Lovastatina hipolipidêmico filamentosos terreus Inibidor da Fungos Aspergillus Terreína melanogênese filamentosos terreus Fármaco Fungos Aspergillus Ciclosporina A imunossupressor filamentosos terreus Agente Fungos Aspergillus Asperfuranona antiproliferativo filamentosos terreus Agente Fungos Aspergillus Asperfuranona antiproliferativo filamentosos nidulans

Categoria de Categoria de Produtos Hospedeiros produto hospedeiro Agente de redução Fungos Aspergillus Piripiropeno do colesterol filamentosos fumigatus Fungos Aspergillus Antibióticos Penicilina filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Antibióticos Penicilina filamentosos nidulans Agente Fungos Aspergillus Fumagilina antimicrobiano filamentosos fumigatus Fumitremorgina Fungos Aspergillus Agente anticâncer C filamentosos fumigatus Espirotriprost Fungos Aspergillus Agente anticâncer atinas filamentosos fumigatus Agente anticâncer; Fungos Aspergillus Agente Plinabulina filamentosos ustus antimicrobiano Fungos Aspergillus Agente anticâncer Fenilahistina filamentosos ustus Estefacidina A Fungos Aspergillus Agente anticâncer e B filamentosos ochraceus Fungos Aspergillus Agente anticâncer Asperfenamato filamentosos flavus Antagonista de Fungos Aspergillus Asperlicina colecistoquinina filamentosos alliaceus Fungos Aspergillus Enzima industrial Alfa-amilase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Alfa-amilase filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Enzima industrial Aminopeptidase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Aminopeptidase filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Enzima industrial Aminopeptidase filamentosos sojae Fungos Aspergillus Enzima industrial AMP desaminase filamentosos melleus Fungos Aspergillus Enzima industrial Catalase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Celulase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Quimosina filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Esterase filamentosos niger Alfa- Fungos Aspergillus Enzima industrial galactosidase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Beta-glucanase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Beta-glucanase filamentosos aculeatus Glicose Fungos Aspergillus Enzima industrial oxidase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Glutaminase filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Enzima industrial Glutaminase filamentosos sojae Beta-D- Fungos Aspergillus Enzima industrial Glucosidase filamentosos niger Enzima industrial Inulinase Fungos Aspergillus

Categoria de Categoria de Produtos Hospedeiros produto hospedeiro filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Lactase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Lipase filamentosos niger Fungos Aspergillus Enzima industrial Lipase filamentosos oryzae Fungos Aspergillus Enzima industrial Xilanase filamentosos niger

[0098]É um objetivo adicional da presente invenção fornecer uma célula hospedeira de fungo filamentoso que compreende uma modificação heteróloga de um gene da via de resposta osmótica da célula hospedeira. O gene pode ser qualquer um dos genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira de fungo filamentoso ou uma combinação destes. Um gene modificado da via osmótica pode ter expressão reduzida e/ou codificar uma proteína com atividade reduzida, comparado com uma versão não modificada do gene. Em uma modalidade, o gene é um ortólogo fúngico filamentoso de um dos genes da via de resposta osmótica de levedura listados na Tabela 7. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula hospedeira de Aspergillus (por exemplo, A. niger) e o gene é um ortólogo de A. niger de um ou mais dos genes da via osmótica de leveduras mostrados na Tabela 7. Por exemplo, o ortólogo de A. niger de um ou mais genes da via de resposta osmótica de leveduras pode ser selecionado das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 9-32 ou 76. Em outra modalidade, vários ortólogos fúngicos filamentosos dos genes da via de resposta osmótica de levedura listados na Tabela 7 são modificados heterologamente em uma célula hospedeira fúngica filamentosa. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa compreende uma modificação heteróloga de um ortólogo da célula hospedeira de fungo filamentoso de um gene SLN1 de S. cerevisiae.

O ortólogo modificado de um gene SLN1 de S. cerevisiae pode ter expressão reduzida e/ou codificar um ortólogo de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae com atividade reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga.

O hospedeiro fúngico filamentoso pode possuir um fenótipo de formação de pellets, não-micélio.

Esse fenótipo de pellet pode ser decorrente do fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui a modificação heteróloga em um gene ou vários genes da via de resposta osmótica (por exemplo, um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae) o que faz com que as células da célula hospedeira filamentosa produzam uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa do ortólogo funcional do gene modificado (por exemplo, um ortólogo de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae) ou os vários genes modificados, comparadas com as células que não possuem a referida modificação ou modificações heterólogas.

A quantidade de proteína funcional na célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,

99% ou 100%, comparada com uma quantidade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle.

A quantidade de proteína funcional (por exemplo, quantidade molar) pode ser medida com o uso de qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, ELISA, ensaios Luminex®, espectrometria de massa e/ou análise quantitativa por Western blot.

A atividade (por exemplo, atividade específica) de proteína funcional na célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparada com a atividade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle.

A atividade de proteína funcional pode ser medida com o uso de qualquer método de determinação da atividade enzimática conhecido na técnica como, por exemplo, ensaios de quinase.

A medição da atividade enzimática pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, ensaios bioquímicos disponíveis comercialmente de atividade de quinase disponíveis por Life Technologies, EMD Millipore, eBioscience, Abcam ou Promega.

A célula hospedeira fúngica filamentosa e qualquer cepa parental da qual a referida célula hospedeira fúngica filamentosa é derivada pode ser qualquer fungo filamentoso conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, A. niger. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o gene da via de resposta osmótica com uma modificação heteróloga é um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae. O ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae pode ser qualquer um dos ortólogos de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae listados na Tabela

6. Em uma modalidade, os ortólogos de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae é o ortólogo de A. niger com o id ASPNIDRAFT_39736, que é o gene nikA de Aspergillus (ID. DE SEQ. Nº: 14). Em outra modalidade, os ortólogos de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae é o ortólogo de A. niger com a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 76. O gene nikA de Aspergillus é um ortólogo ou homólogo do gene nik1 de Neurospora crassa (N. crassa).

[0099]Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos. Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa esporula normalmente, quando comparada com a cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos, apenas quando um, todos ou uma combinação dos genes que contêm SNP da Tabela 3 ou ortólogos destes também são expressos na célula hospedeira fúngica filamentosa. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e a referida célula hospedeira de A. niger esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos, apenas quando um, todos ou uma combinação dos genes que contêm SNP da Tabela 3 também são expressos na referida célula hospedeira de A. niger.

Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos, apenas quando um, todos ou uma combinação de ortólogos dos genes que contêm SNP da Tabela 4 também são expressos na célula hospedeira fúngica filamentosa.

Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e a referida célula hospedeira de A. niger esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos, apenas quando um, todos ou uma combinação dos genes que contêm SNP da Tabela 4 também são expressos na referida célula hospedeira de A. niger.

As condições de cultura submersa podem compreender o crescimento da cepa variante em meio CAP.

Os meios CAP podem compreender manganês e podem ser livres ou substancialmente livres (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em caldo de fermentação conhecido na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico) de agentes quelantes.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 13 ppb ou maior.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 14 ppb ou maior.

[00100]A alteração genética ou modificação heteróloga de um gene ou de cada um dos genes de vários genes da via de resposta osmótica de um fungo filamentoso pode ser substituição da forma do tipo selvagem do gene com uma forma mutada, substituição do promotor nativo do gene com um promotor heterólogo que expressa mais fracamente o gene, comparado com o promotor nativo, ou uma combinação destes.

Alternativamente, a alteração genética ou modificação heteróloga de um gene ou de cada um dos genes de vários genes da via de resposta osmótica de um fungo filamentoso pode ser a remoção do gene (por exemplo, o gene do ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae) e substituição com um gene marcador selecionável.

A forma mutada de um gene ou de cada um dos genes de vários genes da via de resposta osmótica de um fungo filamentoso pode compreender um SNP, uma mutação não-senso, uma mutação missense, uma deleção, uma inserção ou qualquer combinação destas.

O gene ou cada um dos genes dos vários genes da via de resposta osmótica pode ser qualquer um dos genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira de fungo filamentoso.

Em uma modalidade, o gene ou cada um dos genes dos vários genes da via de resposta osmótica é um ortólogo fúngico filamentoso de um dos genes da via de resposta osmótica de levedura listados na Tabela 7. Em uma modalidade, o gene da via de resposta osmótica é um ortólogo do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 ou qualquer combinação destes.

A sequência de ácidos nucleicos do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3,

Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 pode ser selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 50-75. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e os ortólogos de SLN1 de um gene de levedura, Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 são ortólogos de A. niger ou mutantes destes.

Por exemplo, os ortólogos de A. niger podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9-32 ou 76. Em uma modalidade, os ortólogos de A. niger que são parte da via de resposta osmótica podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o gene da via de resposta osmótica é um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae.

Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o gene da via de resposta osmótica possui a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7 que compreende uma mutação missense que converte uma histidina na posição de aminoácido 272 na proteína codificada em uma tirosina.

Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o gene da via de resposta osmótica possui a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7 que compreende uma mutação missense que converte uma histidina na posição de aminoácido 272 na proteína codificada em uma tirosina e que está ligada operacionalmente a um promotor que expressa mais fracamente a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o gene da via de resposta osmótica possui a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 14 ou 76 que está ligada operacionalmente a um promotor que expressa mais fracamente a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 14 ou 76. Além de qualquer uma das modalidades acima, o promotor heterólogo pode ser selecionado de um promotor listado na Tabela 2. Em uma modalidade, o promotor heterólogo é um promotor de manB ou de amyB. Além dessa modalidade, o promotor heterólogo pode ter a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2. Em uma modalidade, o promotor pode ser um promotor induzível. Um promotor induzível pode ser usado para assegurar a expressão adequada de um gene como, por exemplo, o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae (por exemplo, o gene nikA de A. niger) durante esporulação, mas expressão reduzida do referido gene sob condições específicas necessárias para a produção de um produto de interesse desejado (por exemplo, sob condições de fermentação) a fim de promover o fenótipo de pellet, não-micélio, sob essas condições. O promotor de amyB é um exemplo de um promotor induzível que também pode assim ser utilizado. O marcador selecionável pode ser selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional, como fornecidos nesse relatório descritivo.

[00101]Em uma modalidade, uma célula hospedeira fúngica filamentosa fornecida nesse relatório descritivo ou gerada usando os métodos fornecidos nesse relatório descritivo possui uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa de um ortólogo funcional de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae e ainda compreende uma ruptura ou alteração genética em um ou mais genes adicionais que são parte da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) que o ortólogo da proteína SLN1 de S. cerevisiae.

Os (um ou mais) genes que são parte da mesma via podem ser ortólogos de qualquer um dos genes da via de resposta osmótica de leveduras listados na Tabela 7. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa ainda compreende um ortólogo do gene de Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 de S. cerevisiae ou qualquer combinação destes.

A sequência de ácidos nucleicos do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 pode ser selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 50-75. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e os ortólogos dos genes SLN1, Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 de S. cerevisiae são ortólogos de A. niger ou mutantes destes.

Por exemplo, os ortólogos de A. niger podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9- 32 ou 76. Além dessa modalidade, os (um ou mais) genes que são parte da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ainda compreender uma ruptura ou alteração genética em um ou mais genes que são parte de uma via ou vias diferentes que sabidamente ou supostamente participam do controle da morfologia fúngica filamentosa. Os (um ou mais) genes que são parte da via ou de vias diferentes podem ser selecionados de ortólogos de genes com sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8 ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e os (um ou mais) genes que são parte da via ou de vias diferentes são os genes de A. niger com sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8 ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e os (um ou mais) genes que são parte da via ou de vias diferentes são as versões que não contêm SNP dos genes de A. niger com sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8 ou qualquer combinação destes. As versões que não contêm SNP dos genes de A. niger com sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8 podem ser as sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 77-79, respectivamente.

[00102]A ruptura ou alteração genética nos (um ou mais) genes que são parte da via ou de vias diferentes que sabidamente ou supostamente participam do controle da morfologia fúngica filamentosa pode ser substituição da forma do tipo selvagem do gene com uma forma mutada do gene, substituição do promotor nativo do gene com um promotor heterólogo que altera a expressão (por exemplo, maior ou menor) do gene, comparado com o promotor nativo, ou uma combinação destes. O promotor pode ser um promotor listado na Tabela 2. Em uma modalidade, o promotor pode ser um promotor induzível. Alternativamente, a ruptura ou alteração genética nos (um ou mais) genes que são parte da via diferente que sabidamente participa do controle da morfologia fúngica filamentosa pode ser a remoção do gene e substituição com um gene marcador selecionável. O marcador selecionável pode ser selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional, como fornecidos nesse relatório descritivo.

[00103]Também são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para a geração de uma célula hospedeira de fungo filamentoso que possui uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional ou diversas proteínas que são parte da referida via de resposta osmótica da célula hospedeira fúngica filamentosa. Em uma modalidade, a referida célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional ou diversas proteínas que são ortólogos de proteína(s) da via de resposta osmótica de leveduras, como conhecido na técnica e/ou mostrado na Tabela 7. Em uma modalidade, a referida célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional que é um ortólogo da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa. Em uma modalidade, a referida célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional de cada um dos vários genes da via de resposta osmótica de leveduras, como mostrado na Tabela 7. Em uma modalidade, a referida célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e a referida célula hospedeira possuem uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional que é um ortólogo de A. niger de cada um dos vários genes da via de resposta osmótica de leveduras.

Os referidos ortólogos de A. niger podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 9- 32 ou 76. Os métodos podem compreender a realização de um método de troca PRO, um método de troca de SNP ou uma combinação de um método de troca PRO e um método de troca de SNP, como fornecidos nesse relatório descritivo.

A quantidade de proteína funcional na célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparada com uma quantidade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle.

A quantidade de proteína funcional (por exemplo, quantidade molar) pode ser medida com o uso de qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, ELISA, ensaios Luminex®, espectrometria de massa e/ou análise quantitativa por Western blot. A atividade (por exemplo, atividade específica) de proteína funcional na célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparada com a atividade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle. A atividade de proteína funcional pode ser medida com o uso de qualquer método de determinação da atividade enzimática conhecido na técnica como, por exemplo, ensaios de quinase. A medição da atividade enzimática pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, ensaios bioquímicos disponíveis comercialmente de atividade de quinase disponíveis por Life Technologies, EMD Millipore, eBioscience, Abcam ou Promega.

[00104]É um objetivo adicional da presente invenção fornecer uma célula hospedeira de fungo filamentoso que compreende uma modificação heteróloga do ortólogo da célula hospedeira de um gene de A. niger com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, 77, 78, 79 ou qualquer combinação destes, em que o ortólogo modificado do gene de A. niger com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, 77, 78, 79 ou qualquer combinação destes possui atividade reduzida e/ou expressão reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação (ou modificações) heteróloga.

O hospedeiro fúngico filamentoso pode possuir um fenótipo de formação de pellets, não-micélio, comparado com as células da cepa parental quando desenvolvidas em uma cultura submersa em decorrência do fato de que a célula hospedeira filamentosa possui uma modificação heteróloga para o ortólogo de um gene de A. niger com sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, 77, 78, 79 ou qualquer combinação destes.

A presença de um ortólogo de um gene de A. niger com uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes, pode fazer com que as células da célula hospedeira produzam uma quantidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou uma forma menos ou substancialmente menos ativa da proteína funcional codificada por ortólogos dos genes de A. niger com os referidos IDS.

DE SEQ.

Nos, comparadas com células de uma célula hospedeira parental quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

A célula hospedeira filamentosa e a cepa parental da referida célula hospedeira fúngica filamentosa podem ser qualquer fungo filamentoso conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, A. niger.

Em uma modalidade, a cepa da célula hospedeira filamentosa esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos.

Em alguns casos, os ortólogos dos genes de A. niger com os IDS.

DE SEQ.

Nos; 5,

6, 8, 77, 78 ou 79 são adicionalmente alterados geneticamente.

A alteração genética adicional pode ser substituição do promotor nativo do gene com um promotor heterólogo que expressa mais fracamente o gene, comparado com o promotor nativo.

Alternativamente, a alteração genética adicional pode ser a remoção dos ortólogos dos genes de A. niger com o ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8, 77, 78 ou 79 e substituição com um gene marcador selecionável.

O marcador selecionável pode ser selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional, como fornecidos nesse relatório descritivo.

O promotor heterólogo pode ser selecionado de um promotor listado na Tabela 2. Em uma modalidade, o promotor heterólogo é um promotor de manB ou de amyB.

Além dessa modalidade, o promotor heterólogo pode ter a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 1 ou ID.

DE SEQ.

Nº: 2. Em uma modalidade, o promotor é um promotor induzível.

As condições de cultura submersa podem compreender o crescimento da cepa variante em meio CAP.

Os meios CAP podem compreender manganês e podem ser substancialmente livres ou livres de agentes quelantes.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 13 ppb ou maior.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 14 ppb ou maior.

Deve ser subentendido que, em modalidades nas quais a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger, o gene de A. niger com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6, 8 ou versões do tipo selvagem deste (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos com os IDS.

DE SEQ.

Nos: 77-79), pode compreender as modificações heterólogas detalhadas nesse relatório descritivo.

[00105]A célula hospedeira fúngica filamentosa que possui uma quantidade substancialmente reduzida ou reduzida e/ou uma forma substancialmente menos ativa ou menos ativa da proteína funcional codificada por ortólogos dos genes de A. niger com sequências selecionadas dos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8, 77, 78 ou 79 pode ainda compreender uma ruptura ou alteração genética em um ou mais genes que são parte da mesma via. A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ainda compreender uma ruptura ou alteração genética em um ou mais genes que são parte da via diferente que sabidamente participa do controle da morfologia fúngica filamentosa. Os (um ou mais) genes que são parte da via diferente podem ser qualquer um dos genes fornecidos nesse relatório descritivo, por exemplo, os genes que são parte de uma via de resposta osmótica das células hospedeiras. A ruptura ou alteração genética nos (um ou mais) genes que são parte da mesma via ou são parte da via diferente que sabidamente participa do controle da morfologia fúngica filamentosa pode ser substituição da forma do tipo selvagem do gene com uma forma mutada do gene, substituição do promotor nativo do gene com um promotor heterólogo que altera a expressão (por exemplo, maior ou menor) do gene, comparado com o promotor nativo, ou uma combinação destes. O promotor pode ser um promotor listado na Tabela 2. Em uma modalidade, o promotor é um promotor induzível. Alternativamente, a ruptura ou alteração genética nos (um ou mais) genes que são parte da mesma via ou são parte da via diferente que sabidamente participa do controle da morfologia fúngica filamentosa pode ser a remoção do gene e substituição com um gene marcador selecionável. O marcador selecionável pode ser selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional, como fornecidos nesse relatório descritivo.

[00106]Também são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para a geração da cepa variante de fungo filamentoso que possui uma quantidade substancialmente reduzida ou reduzida e/ou uma forma substancialmente menos ativa ou menos ativa da proteína funcional codificada por ortólogos dos genes de A. niger com os IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8, 77, 78 ou 79. Os métodos podem compreender a realização de um método de troca PRO, um método de troca de SNP ou uma combinação de um método de troca PRO e um método de troca de SNP, como fornecidos nesse relatório descritivo. A quantidade de proteína funcional codificada pelos ortólogos dos genes de A. niger com os IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8, 77, 78 ou 79 na cepa variante pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparada com uma quantidade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle. A quantidade de proteína funcional (por exemplo, quantidade molar) pode ser medida com o uso de qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo,

ELISA, ensaios Luminex®, espectrometria de massa e/ou análise quantitativa por Western blot. A atividade (por exemplo, atividade específica) de proteína funcional codificada pelos ortólogos dos genes de A. niger com os IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 8, 77, 78 ou 79 na cepa variante pode ser reduzida por pelo menos, no máximo, exatamente ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, comparada com a atividade da respectiva proteína funcional em uma cepa parental ou de controle. A atividade de proteína funcional pode ser medida com o uso de qualquer método de determinação da atividade enzimática conhecido na técnica como, por exemplo, ensaios de quinase. A medição da atividade enzimática pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, ensaios bioquímicos disponíveis comercialmente de atividade de quinase disponíveis por Life Technologies, EMD Millipore, eBioscience, Abcam ou Promega.

[00107]É ainda outro objetivo dessa invenção fornecer uma célula hospedeira fúngica filamentosa que compreende um promotor ligado operacionalmente a um gene que regula uma morfologia da célula hospedeira, em que o promotor é heterólogo para o gene, e em que o promotor possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS.

DE SEQ.

Nos: 1-4. A célula hospedeira de fungo filamentoso pode ser qualquer fungo filamentoso conhecido na técnica e/ou fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, A. niger.

Em alguns casos, a célula hospedeira fúngica esporula normalmente, quando comparada com uma cepa parental da célula hospedeira quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas como, por exemplo, em meios sólidos, mas forma uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

Em alguns casos, a célula hospedeira pode compreender um ou mais genes que regulam morfologia, de modo que cada um dos referidos (um ou mais) genes possui um promotor heterólogo ligado a eles.

Os (um ou mais) genes que regulam uma morfologia da célula hospedeira podem ser genes como fornecidos nesse relatório descritivo como, por exemplo, as sequências de genes que contêm SNP representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 5, 6, 7 ou 8 ou ortólogos destes da Tabela 4, isoladamente ou em combinação.

Em alguns casos, as sequências de genes que contêm SNP representadas pelos IDS.

DE SEQ.

Nos: 5, 6, 7 ou 8 ou ortólogos destes da Tabela 4, podem estar combinadas com um ou mais genes da mesma via que a respectiva sequência de gene que contém SNP.

Em uma modalidade, os (um ou mais) genes é uma versão do tipo selvagem ou que não contém SNP do gene com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS.

DE SEQ.

Nos: 5, 6, 7 ou 8 (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos dos IDS.

DE SEQ.

Nos: 76-79) ou ortólogos destes, isoladamente ou em combinação.

Em outra modalidade, a versão do tipo selvagem ou que não contém SNP do gene com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 7 ou 8 (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos dos IDS. DE SEQ. Nos: 76-79) ou ortólogos destes pode estar combinada com um ou mais genes da mesma via que a respectiva sequência de gene do tipo selvagem ou que não contém SNP. Em uma modalidade, o gene que regula uma morfologia da célula hospedeira pode ser um gene da via de resposta osmótica da célula hospedeira. Em outra modalidade, vários genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira são usados em combinação para regular a morfologia da célula hospedeira. Em uma modalidade, o gene que regula uma morfologia da célula hospedeira pode ser um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou um ortólogo de um gene de uma via de resposta osmótica de leveduras como mostrado na Tabela 7. Em outra modalidade, vários ortólogos de uma via de resposta osmótica de leveduras como mostrado na Tabela 7 são usados em combinação para regular a morfologia da célula hospedeira. Em uma modalidade, o ortólogo de um gene de uma via de resposta osmótica de leveduras pode ser selecionado de ortólogos de genes de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, o ortólogo de um gene de uma via de resposta osmótica de leveduras pode ter uma sequência que é um ortólogo de uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 50-75.

[00108]Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa está ligado operacionalmente a um promotor que possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS.

DE SEQ.

Nos: 1-4. Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa está ligado operacionalmente a um promotor que possui uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 1. Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa está ligado operacionalmente a um promotor que possui uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 2. O ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa pode ser uma forma do tipo selvagem ou mutante do gene.

Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa possui a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e o ortólogo do tipo selvagem de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa possui a sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 14 ou 76. As condições de cultura submersa podem compreender o crescimento da cepa variante em meio CAP.

Os meios CAP podem compreender manganês e podem ser livres ou substancialmente livres (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em meios de fermentação conhecidos na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico) ou livres de agentes quelantes.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 13 ppb ou maior.

O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 14 ppb ou maior.

[00109]Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ou mais ortólogos de uma via de resposta osmótica de leveduras estão ligados operacionalmente a um promotor que possui uma sequência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-4. Em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ou mais de ortólogos de uma via de resposta osmótica de leveduras estão ligados operacionalmente a um promotor que possui uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1. Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger e um ou mais de ortólogos de uma via de resposta osmótica de leveduras estão ligados operacionalmente a um promotor que possui uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 2. Os (um ou mais) ortólogos podem ser selecionados dos ortólogos de A. niger listados na Tabela 7. Por exemplo, os ortólogos de A. niger podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 14-32, 76 ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, os (um ou mais) ortólogos são selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes. As condições de cultura submersa podem compreender o crescimento da cepa variante em meio CAP. Os meios CAP podem compreender manganês e podem ser livres ou substancialmente livres (por exemplo, menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em meios de fermentação conhecidos na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico) ou livres de agentes quelantes. O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 13 ppb ou maior. O manganês pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos 14 ppb ou maior. Micróbios eucarióticos filamentosos

[00110]Em uma modalidade, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para gerar as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada usam elementos fúngicos derivados de fungo filamentoso que são capazes de serem prontamente separados de outros elementos desse tipo em um meio de cultura, e são capazes de autorreprodução. Por exemplo, os elementos fúngicos podem ser um esporo, propágulo, fragmento hifal, protoplasto ou micropellet. Em uma modalidade preferida, os sistemas e métodos fornecidos nesse relatório descritivo utilizam protoplastos derivados de fungo filamentoso. Células hospedeiras de fungos filamentosos adequadas incluem, por exemplo, quaisquer formas filamentosas da divisão Ascomycota, Deuteromycota, Zygomycota ou Fungi imperfecti. Células hospedeiras de fungos filamentosos adequadas incluem, por exemplo, quaisquer formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. (veja, por exemplo, Hawksworth e cols., Em “Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi”, 8ª Edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência). Em certas modalidades ilustrativas, mas não limitantes, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de uma espécie de: Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium,

Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella, ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é selecionado do grupo que consiste em A. nidulans, A. oryzae, A. sojae e Aspergilli do Grupo de A. niger. Em uma modalidade preferida, o fungo filamentoso é Aspergillus niger.

[00111]Em uma modalidade, o fungo filamentoso é uma cepa de produção selecionada de Aspergillus foetidus ACM 3996 (=FRR 3558), Magnaporthe grisea Guy-11 ou Phanerochaete chrysosporium RP78. Em uma modalidade separada, o fungo filamentoso é uma cepa de A. niger de produção conhecida na técnica. Exemplos de cepas de produção de A. niger para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem incluir A. niger ATCC 11414, ATCC 1015, ACM 4992 (=ATCC 9142), ACM 4993 (=ATCC 10577), ACM 4994 (=ATCC 12846), ATCC26550, ATCC 11414, N402, CBS 513.88 ou NRRL3 (ATCC 9029, CBS 120.49).

[00112]Em outra modalidade, mutantes específicos das espécies fúngicas são usados para os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para gerar as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada. Em uma modalidade, são usados mutantes específicos das espécies fúngicas que são adequados para os métodos e sistemas de alto rendimento e/ou automatizados fornecidos nesse relatório descritivo. Exemplos desses mutantes podem ser cepas que produzem protoplasto muito bem; cepas que produzem principalmente protoplastos com um único núcleo; cepas que se regeneram eficientemente em placas de microtitulação, cepas que se regeneram mais rápido e/ou cepas que recolhem moléculas de polinucleotídeos (por exemplo, DNA) eficientemente, cepas que possuem integração aleatória reduzida (por exemplo, via de união de extremidade não homóloga desabilitada) ou combinações destas. Ainda em outra modalidade, uma cepa mutante específica para uso nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser cepas desprovidas de um gene marcador selecionável como, por exemplo, cepas mutantes que necessitam de uridina. Essas cepas mutantes podem ser deficientes em orotidina 5 fosfato descarboxilase (OMPD) ou orotato p-ribosil transferase (OPRT) codificada pelo gene pyrG ou pyrE, respectivamente (T. Goosen e cols., Curr. Genet. 1987, 11: 499 503; J. Begueret e cols., Gene. 1984 32: 487-92.

[00113]Ainda em outra modalidade, cepas mutantes para uso nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para gerar as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada são modificadas em seu sistema de reparo de DNA de tal forma que sejam extremamente eficientes em recombinação homóloga e/ou extremamente ineficientes em integração aleatória. A eficiência da integração direcionada de uma construção de ácido nucleico no genoma da célula hospedeira por recombinação homóloga, ou seja, integração em um lócus-alvo predeterminado, pode ser aumentada por habilidades aumentadas de recombinação homóloga e/ou habilidades diminuídas de recombinação não homóloga da célula hospedeira.

O aumento da recombinação homóloga pode ser obtido pela superexpressão de um ou mais genes envolvidos em recombinação homóloga (por exemplo, proteína Rad51 e/ou Rad52). A remoção, ruptura ou redução na recombinação não homóloga ou da via de união de extremidade não homóloga (NHEJ) nas células hospedeiras da presente revelação pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, por uso de um anticorpo, um inibidor químico, uma inibidor de proteína, um inibidor físico, um inibidor peptídico, ou uma molécula anti-senso ou de RNAi dirigida contra a componente da via de recombinação não homóloga (NHR) ou NHEJ (por exemplo, levedura KU70, levedura KU80 ou homólogos destas). A inibição da via de NHEJ pode ser obtida com o uso de inibidores químicos, por exemplo, como descrito em Arras S.M.D., Fraser J.A. (2016), “Chemical Inhibitors of Non-Homologous End Joining Increase Targeted Construct Integration in Cryptococcus neoformans” PloS ONE 11 (9): e0163049, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência.

O tratamento com o inibidor (ou inibidores) químico para facilitar a neutralização ou redução da via de NHEJ pode ser antes e/ou durante a geração de protoplastos.

Alternativamente, uma célula hospedeira para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo pode ser deficiente em um ou mais genes (por exemplo, ku70, ku80 de levedura ou homólogos destes) da via de NHR.

Exemplos desses mutantes são células com um gene hdfA ou hdfB deficiente, como descrito em WO 05/95624. Exemplos de inibidores químicos para uso na inibição de NHR em células hospedeiras para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem ser W7, clorpromazina, vanilina, Nu7026, Nu7441, mirina, SCR7, AG14361 ou uma combinação destes, como descrito em Arras S.D.M. e cols. (2016) “Chemical Inhibitors of Non-Homologous End Joining Increase Targeted Construct Integration in Cryptococcus neoformans”. PloS One 11 (9).

[00114]Em uma modalidade, uma cepa mutante de célula fúngica filamentosa produzida pelos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo possui uma via de união de extremidade não homóloga (NHEJ) desabilitada ou reduzida e possui um fenótipo de não formação de micélio, do tipo levedura, quando desenvolvida em cultura (por exemplo, cultura submersa). O fenótipo de não formação de micélio, do tipo levedura, quando desenvolvido em cultura submersa, é consequência da ruptura de um ou mais genes que comprovadamente participam do controle ou que afetam a morfologia fúngica como fornecidos nesse relatório descritivo (por exemplo, genes com os IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 7 ou 8). Os (um ou mais) genes que comprovadamente participam do controle ou que afetam a morfologia fúngica como fornecidos nesse relatório descritivo podem ser parte da via de resposta osmótica ao estresse osmótico de uma célula hospedeira. A via de NHEJ na referida cepa mutante pode ser reduzida ou desabilitada em consequência do tratamento com um inibidor químico (por exemplo, W7, clorpromazina, vanilina, Nu7026, Nu7441, mirina, SCR7, AG14361 ou qualquer combinação destes). Em uma modalidade, o inibidor químico é W7. A célula hospedeira fúngica filamentosa (por exemplo, A. niger) pode ser tratada com uma concentração inibidora mínima (MIC) de W7 que pode ser dependente da cepa hospedeira. A referida cepa (ou cepas) mutante pode ser subsequentemente usada para produzir um produto de interesse desejado como, por exemplo, qualquer um dos produtos listados na Tabela 1. Genes relacionados à morfologia

[00115]Os genes relacionados à morfologia para uso nos métodos, cepas e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser qualquer gene conhecido na técnica que demonstrou ou suspeito de participação no controle ou que afeta a morfologia de um micróbio eucariótico filamentoso (por exemplo, célula ou cepa hospedeira fúngica filamentosa). O gene que regula uma morfologia da célula hospedeira pode ser qualquer gene desse tipo como fornecido nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, um gene que participa ou regula uma morfologia da célula hospedeira pode ser qualquer gene que seja parte de uma via da célula hospedeira que governa a resposta das referidas células hospedeiras ao estresse osmótico. Consequentemente, o gene pode ser qualquer gene da via de resposta osmótica da célula hospedeira fúngica filamentosa ou uma combinação dos referidos genes. Em uma modalidade, o gene é um ortólogo de um gene da via de resposta osmótica de leveduras como mostrado na Tabela 7 como, por exemplo, ortólogos de um gene de levedura (por exemplo, S. cerevisiae) Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 ou qualquer combinação destes. A sequência de ácidos nucleicos do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1,

Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 pode ser selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 50-

75. Em uma modalidade, o gene é um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um Aspergillus (por exemplo, A. niger) e um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae pode ser selecionado dos ortólogos de SLN1 listados na Tabela 6 ou a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 76. Em uma modalidade, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 14-17. Em uma modalidade, o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 76. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um Aspergillus (por exemplo, A. niger) e o gene é um ortólogo de A. niger de um gene da via de resposta osmótica de levedura como listado na Tabela 7. Em uma modalidade, o gene é um ortólogo do nik1 de Neurospora crassa (N. crassa). Em uma modalidade, a célula hospedeira é um Aspergillus (por exemplo, A. niger) e o ortólogo do gene nik1 de N. crassa pode ser o ortólogo de nik1 listado na Tabela 6. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um Aspergillus (por exemplo, A. niger) e o gene é o gene nikA de Aspergillus. Em outra modalidade, o gene relacionado à morfologia pode ser qualquer gene da mesma via que o ortólogo do gene nik1 de N. crassa ou do gene nikA de Aspergillus. Em outra modalidade, o gene é um ortólogo do gene de A. niger com ácido nucleico ID. DE SEQ. Nº: 5 ou 77 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do referido ortólogo do gene de

A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 5 ou 77. Em outra modalidade, o gene é um ortólogo do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 6 ou 78 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do referido ortólogo do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 6 ou 78. Em outra modalidade, o gene é um ortólogo do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 8 ou 79 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do referido ortólogo do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 8 ou 79. Em outra modalidade, a célula hospedeira é A. niger e o gene é o gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 5 ou 77 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 5 ou 77. Em outra modalidade, a célula hospedeira é A. niger e o gene é o gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 6 ou 78 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 6 ou 78. Em outra modalidade, a célula hospedeira é A. niger e o gene é o gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 8 ou 79 e/ou qualquer gene na mesma via bioquímica do gene de A. niger com ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 8 ou 79. Tabela 6. Ortólogos de SLN1 de S. cerevisiae e nik1 de N. crassa em A. niger ATCC 1015. Ortólogos de S. cerevisiae Query Identidade de SLN1 na cepa de A. niger Coverage percentual ATCC 1015 ASPNIDRAFT_183029 41% 32,20% (ID.

DE SEQ.

Nº: 15) ASPNIDRAFT_41708 53% 21,62% (ID.

DE SEQ.

Nº: 16) ASPNIDRAFT_37188 33% 31,90% (ID.

DE SEQ.

Nº: 17) ASPNIDRAFT_39736 33% 30,93% (ID.

DE SEQ.

Nº: 14)

Ortólogos de Nik1 de N. crassa na cepa de A. niger ATCC 1015 ASPNIDRAFT_39736 95% 68,86% (ID.

DE SEQ.

Nº: 14)

Tabela 7. Genes da via osmótica, Genes da via de Ortólogos em ATCC Nº DO ID.

DE SEQ. resposta osmótica 1015 de ortólogos em de levedura (ID em ATCC 1015 (Espécie do fungidb.org) gênero) Sln1 (S.

ASPNIDRAFT_39736; ID.

DE SEQ.

Nº: 14; cerevisiae; ID.

ASPNIDRAFT_183029; ID.

DE SEQ.

Nº: 15; DE SEQ.

Nº: 50) ASPNIDRAFT_41708; ID.

DE SEQ.

Nº: 16; ASPNIDRAFT_37188 ID.

DE SEQ.

Nº: 17

Ste11 (S.

ASPNIDRAFT_214017 ID.

DE SEQ.

Nº: 18 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 51) Bck1 (S.

ASPNIDRAFT_55574 ID.

DE SEQ.

Nº: 19 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 52) Ssk2 (S.

ASPNIDRAFT_38443 ID.

DE SEQ.

Nº: 20 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 53); Ssk22 (S. cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 73); Ste7 (S.

ASPNIDRAFT_209137 ID.

DE SEQ.

Nº: 21 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 54) Mkk2/22 (S.

ASPNIDRAFT_211983 ID.

DE SEQ.

Nº: 22 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 55) Pbs2 (S.

ASPNIDRAFT_51782 ID.

DE SEQ.

Nº: 23 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 56) Fus1/Kss3 (S.

ASPNIDRAFT_207710 ID.

DE SEQ.

Nº: 24 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 57) Mpk1 (S.

ASPNIDRAFT_205706 ID.

DE SEQ.

Nº: 25 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 58) Hog1 (S.

ASPNIDRAFT_52673 ID.

DE SEQ.

Nº: 26 cerevisiae; ID.

DE SEQ.

Nº: 59) Phk1 (S. pombe; ASPNIDRAFT_37188 ID.

DE SEQ.

Nº: 27 ID.

DE SEQ.

Nº:

74); Phk2 (S. pombe; ID. DE SEQ. Nº: 75); Chk1 (C. albicans; ID. DE SEQ. Nº: 60) Phk3 (S. pombe; ASPNIDRAFT_174806 ID. DE SEQ. Nº: 28 ID. DE SEQ. Nº: 61) Ypd1p (S. ASPNIDRAFT_214261 ID. DE SEQ. Nº: 29 cerevisiae; ID. DE SEQ. Nº: 62); Spy1 (S. pombe; ID. DE SEQ. Nº: 63) Ssk1p (S. ASPNIDRAFT_120745 ID. DE SEQ. Nº: 30 cerevisiae; ID. DE SEQ. Nº: 64); Mcs4 (S. pombe; ID. DE SEQ. Nº: 65); SskA (C. albicans; ID. DE SEQ. Nº: 66) Skn7 (S. ASPNIDRAFT_37857 ID. DE SEQ. Nº: 31 cerevisiae; ID. DE SEQ. Nº: 67); Prr1 (S. pombe; ID. DE SEQ. Nº: 68); Skn7 (C. albicans; ID. DE SEQ. Nº: 69) Rim15p (S. ASPNIDRAFT_200656 ID. DE SEQ. Nº: 32 cerevisiae; ID. DE SEQ. Nº: 70); Cek1 (S. pombe; ID. DE SEQ. Nº: 71); Rim15 (C. albicans; ID. DE SEQ. Nº: 72)

[00116]Os genes relacionados à morfologia para uso nos métodos, cepas e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser qualquer gene conhecido na técnica que demonstrou ou suspeito de participação no controle ou que afeta a morfologia de A. niger. Em uma modalidade, o gene é um gene que contém SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 7 ou 8 (veja Tabela

4). Em uma modalidade, o gene consiste em vários genes. Os vários genes podem ser qualquer combinação dos genes que contêm SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 7 ou 8. Os vários genes podem ser qualquer combinação dos genes que contêm SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 e qualquer gene presente dentro da mesma via bioquímica. Os vários genes podem ser qualquer combinação dos genes que contêm SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 6 e qualquer gene presente dentro da mesma via bioquímica. Os vários genes podem ser qualquer combinação dos genes que contêm SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 7 e qualquer gene presente dentro da mesma via bioquímica (ou seja, via de resposta osmótica). Os vários genes podem ser qualquer combinação dos genes que contêm SNP com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 8 e qualquer gene presente dentro da mesma via bioquímica. Em uma modalidade, o gene é uma versão do tipo selvagem ou que não contém SNP do gene com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6, 7 ou 8 (veja Tabela 4). Em uma modalidade, o gene é uma versão do tipo selvagem ou que não contém SNP do gene com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 76-79.

[00117]Em uma modalidade, o gene que regula uma morfologia de uma célula hospedeira de A. niger é um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae. O ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae pode ser uma forma do tipo selvagem ou uma forma mutante. A forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae pode ser FungiSNP_18 da Tabela 3 ou 4 ou com uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7. Em outra modalidade, o gene relacionado à morfologia pode ser qualquer gene da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae. Os genes que são parte da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) podem ser selecionados de ortólogos de A. niger dos genes de Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 de S. cerevisiae ou qualquer combinação destes. A sequência de ácidos nucleicos do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 pode ser selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 50-75. Os genes que são parte da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) que um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae (ou o gene nik1 de N. crassa) podem ter uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 18-32. Os genes que são parte da mesma via (ou seja, da via de resposta osmótica) podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00118]Os genes relacionados à morfologia podem ser qualquer um dos genes ou ortólogos destes que são revelados em Dai e cols. (“Identification of Genes Associated with Morphology in Aspergillus niger by Using Suppression Subtractive Hybridization” Applied and Environmental Microbiology, abril de 2004, páginas 2.474-2.485), cujo conteúdo é incorporado por referência em sua totalidade. O gene relacionado à morfologia pode ser selecionado do gene gas1, do gene sfb3, do gene seb1, do gene mpg1, do gene crz1 e do gene tps2. A expressão de qualquer um dos genes relacionados à morfologia pode ser inserido ou diminuído dependendo de se o gene promove uma morfologia filamentosa ou micelial ou morfologia de pellet.

[00119]Como descrito nesse relatório descritivo, a expressão de qualquer um dos genes relacionados à morfologia ou mutante destes (por exemplo, FungiSNPs 9, 12, 18 ou 40 da Tabela 4) fornecidos nesse relatório descritivo pode ser controlada por substituição do promotor nativo do gene com um promotor heterólogo que confere expressão em um nível (por exemplo, maior ou menor) diferente do promotor nativo. O promotor heterólogo pode ser selecionado da Tabela 2. A substituição do promotor nativo pode ser realizada com o uso de um método de troca PRO como fornecido nesse relatório descritivo. Promotor Ladders

[00120]Promotores regulam a taxa na qual genes são transcritos e podem influenciar a transcrição de várias formas. Promotores constitutivos, por exemplo, dirigem a transcrição de seus genes associados em uma taxa constante independentemente das condições celulares internas ou externas, enquanto promotores reguláveis, ajustáveis ou induzíveis, aumentam ou diminuem a taxa na qual um gene é transcrito, dependendo das condições celulares internas e/ou externas, por exemplo, taxa de crescimento, temperatura, respostas a substâncias químicas ambientais específicas e semelhantes. Promotores podem ser isolados de seus contextos celulares normais e modificados geneticamente para regular a expressão de praticamente qualquer gene, permitindo a modificação eficaz do crescimento celular, rendimento de produto e/ou outros fenótipos de interesse.

[00121]Sequências promotoras podem estar ligadas operacionalmente aos terminais 5' de quaisquer sequências (por exemplo, genes relacionados à morfologia) fornecidas nesse relatório descritivo a serem expressas em uma célula hospedeira fúngica filamentosa como fornecida nesse relatório descritivo. Diversos promotores fúngicos conhecidos têm probabilidade de serem funcionais nas cepas hospedeiras da revelação como, por exemplo, as sequências promotoras de C1 endoglucanases, os promotores de celobiohidrolase de 55 kDa (CBH1), de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase A, C. lucknowense GARG 27K e xilanase de 30 kDa (Xy1F) de Chrysosporium, bem como os promotores de Aspergillus descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos

4.935.349, 5.198.345, 5.252.726, 5.705.358 e 5.965.384; e Pedido PCT WO 93/07277.

[00122]Em uma modalidade, os promotores para uso nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para a geração de cepas ou células hospedeiras que compreendem a morfologia de pellet desejada sob condições de crescimento específicas (ou seja, culturas submersas) são promotores induzíveis. Os promotores induzíveis podem ser qualquer promotor cuja atividade transcricional seja regulada pela presença ou ausência de uma substância química como, por exemplo, álcool, tetraciclina, esteroides, metais ou outros compostos conhecidos na técnica. Os promotores induzíveis podem ser qualquer promotor cuja atividade transcricional seja regulada pela presença ou ausência de luz ou temperaturas baixas ou altas. Em uma modalidade, os promotores induzíveis são selecionados de genes fúngicos filamentosos como, por exemplo, o gene srpB, o gene amyB, o gene manB ou o gene mbfA. Em uma modalidade, o promotor induzível é selecionado dos promotores listados na Tabela 2. Em uma modalidade, o promotor induzível é um catabólito reprimido de glicose. O catabólito reprimido de glicose pode ser o promotor de amyB de A. oryzae.

[00123]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina a geração de promotores ladders para o controle da expressão de um ou mais genes que controlam e/ou participam no controle do crescimento e/ou morfologia fúngica filamentosa. Em algumas modalidades, os promotores ladders da presente revelação compreendem uma coleção de promotores que exibem uma faixa contínua de perfis de expressão. Por exemplo, em algumas modalidades, promotores ladders são criados por: identificação de promotores naturais, nativos ou do tipo selvagem que exibem uma gama de potências de expressão em resposta a estímulos, ou por meio de expressão constitutiva (veja, por exemplo, a FIG. 2). Esses promotores identificados podem ser agrupados juntos como um promotor ladder.

[00124]Em outras modalidades, a presente revelação ensina a criação de promotores ladders que exibem uma gama de perfis de expressão através de diferentes condições. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente revelação ensina a criação de um ladder de promotores com picos de expressão que se espalham por estágios diferentes de uma fermentação. Em outras modalidades, a presente revelação ensina a criação de um ladder de promotores com diferentes dinâmicas de pico de expressão em resposta a um estímulo específico (veja, por exemplo, a FIG. 2). Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que os promotores ladders regulatórios da presente revelação podem ser representativos de qualquer um ou mais perfis regulatórios.

[00125]Em algumas modalidades, os promotores ladders da presente revelação são projetados para perturbar a expressão gênica de uma forma previsível através de uma faixa contínua de respostas. Em algumas modalidades, a natureza contínua de um promotor ladder confere programas de aprimoramento de cepas com força preditiva adicional. Por exemplo, em algumas modalidades, a troca promotores para um gene que comprovadamente ou com suspeição de controlar ou afetar a morfologia pode produzir uma curva de desempenho da célula hospedeira com relação à morfologia, que identifica a proporção ou perfil de expressão ótimo de um gene específico para a produção de uma cepa ou célula hospedeira com a morfologia de pellet desejada sob as condição de crescimento desejadas; a produção de uma cepa na qual o gene visado não seja mais um fator limitante para uma reação ou cascata genética particular evita, ao mesmo tempo, a superexpressão desnecessária ou expressão errônea sob circunstâncias inadequadas. Em algumas modalidades, os promotores ladders são criados por: identificação de promotores naturais, nativos ou do tipo selvagem que exibem os perfis desejados. Em outras modalidades, os promotores ladders são criados por mutação de promotores de ocorrência natural para derivar múltiplas sequências promotoras mutadas. Cada um desses promotores mutados é testado para o efeito sobre a expressão do gene-alvo e para os fenótipos morfológicos resultantes. Em algumas modalidades, os promotores editados são testados para atividade de expressão através de diversas condições, de modo que a atividade de cada variante do promotor seja documentada/caracterizada/anotada e armazenada em um banco de dados. As variantes de promotores editados resultantes são subsequentemente organizadas nos promotores ladders dispostos com base na força de sua expressão (por exemplo, com variantes que expressam altamente perto do topo, e expressão atenuada perto da parte inferior levando, portanto, ao termo “ladder”).

[00126]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina a geração e/ou uso de promotores ladders que são uma combinação de promotores de ocorrência natural identificados e promotores variantes mutados.

[00127]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina métodos de identificação de promotores naturais, nativos ou do tipo selvagem que atendem a ambos os seguintes critérios: 1) representassem um ladder de promotores constitutivos; e 2) pudessem ser codificados por sequências de DNA curtas, idealmente com menos do que 100 pares de bases. Em algumas modalidades, os promotores constitutivos da presente revelação exibem expressão gênica constante através de duas condições de crescimento selecionadas (tipicamente comparadas entre condições apresentadas durante cultivo industrial). Em algumas modalidades, os promotores da presente revelação consistirão em um promotor central de aproximadamente 60 pares de bases, e uma UTR 5’ entre 26 e 40 pares de bases de comprimento.

[00128]Em algumas modalidades, uma ou mais das sequências promotoras de ocorrência natural identificadas mencionadas anteriormente são escolhidas para edição gênica. Em algumas modalidades, os promotores naturais são editados por meio de qualquer um dos métodos de mutação descritos supra. Em outras modalidades, os promotores da presente revelação são editados por síntese de novas variantes de promotores com a sequência desejada.

[00129]Uma lista não limitada dos promotores para uso nos métodos e sistemas para a geração de cepas ou células hospedeiras que compreendem a morfologia de pellet desejada é fornecida na Tabela 2. Cada uma das sequências promotoras pode ser referida como um promotor heterólogo ou polinucleotídeo de promotor heterólogo. Tabela 2. Sequências promotoras selecionadas da presente revelação. ID. Nome curto Nome do promotor DE do promotor SEQ. Nº: promotor de manB de Aspergillus 1 manBp niger 2 amyBp gene amyB de Aspergillus oryzae promotor de srpB de Aspergillus 3 srpBp niger promotor de mbfA d Aspergillus niger 4 mbfAp

[00130]Em algumas modalidades, os promotores da presente revelação exibem pelo menos 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76% ou 75% de identidade de sequência com um promotor da tabela acima. Troca de promotor

[00131]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina métodos de seleção de promotores com propriedades de expressão ótimas para produzir efeitos benéficos sobre o fenótipo global da cepa hospedeira (por exemplo, morfologia de pellet, não-micélio sob condições de crescimento desejadas (ou seja, cultura submersa em meios de fermentação)).

[00132]Por exemplo, em algumas modalidades, a presente revelação ensina métodos de identificação de um ou mais promotores e/ou de geração de variantes de um ou mais promotores dentro de uma célula hospedeira, que exibem uma gama de potências de expressão (por exemplo, promotores ladders discutidos infra), ou propriedades regulatórias superiores (por exemplo, controle regulatório mais apertado para genes selecionados). Uma combinação particular desses promotores identificados e/ou gerados pode ser agrupada como um promotor ladder.

[00133]Também são fornecidos nesse relatório descritivo métodos de troca de promotores para modificar geneticamente células fúngicas filamentosas para produzir ou expressar um traço desejado como, por exemplo, uma morfologia de pellet desejada. Em geral, a troca de promotor (ou seja, troca PRO) envolve a associação sistemática de cada promotor de um promotor ladder como descrito com certo gene de interesse. Dessa forma, por exemplo, caso haja promotores P1-P8 (que representam oito promotores que foram identificados e/ou gerados por exibirem uma gama de potências de expressão) e se associe o promotor ladder com um único gene de interesse em um micróbio (ou seja, modifica-se geneticamente um micróbio com certo promotor ligado operacionalmente a certo gene-alvo), então o efeito de cada combinação dos oito promotores pode ser verificado por caracterização de cada uma das cepas modificadas geneticamente que resultam de cada esforço combinatório, considerando que os micróbios modificados geneticamente possuem uma base genética de outro modo idêntica, exceto o promotor (ou promotores) particular associado ao gene-alvo. Os micróbios resultantes que são modificados geneticamente por meio desse processo podem formar bibliotecas de design genético HTP.

[00134]Em uma modalidade específica, os métodos de troca de promotor (Troca PRO) fornecidos nesse relatório descritivo acarretam a associação sistemática de cada promotor do promotor ladder retratado na Tabela 2 com um gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar ou afetar a morfologia de células fúngicas filamentosas quando desenvolvidas sob condições específicas (referidos como genes morfológicos-alvo). A perturbação do gene pode causar um fenótipo morfológico desejado. O fenótipo desejado pode ser uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvido em culturas submersas de um meio de produção (por exemplo, meios CAP). Dessa forma, caso haja promotores P1-P4 (que representam os quatro promotores da Tabela 2 que foram identificados e/ou gerados por exibirem uma gama de potências de expressão) e se associe o promotor ladder com um único gene morfológico-alvo de interesse em um micróbio (ou seja, modificando-se geneticamente um micróbio com certo promotor ligado operacionalmente a certo gene morfológico- alvo), então o efeito de cada combinação dos quatro promotores pode ser verificado por caracterização de cada uma das cepas modificadas geneticamente que resultam de cada esforço combinatório, considerando que os micróbios modificados geneticamente possuem uma base genética de outro modo idêntica, exceto o promotor (ou promotores) particular associado ao gene morfológico-alvo específico. Os micróbios resultantes que são modificados geneticamente por meio desse processo podem formar bibliotecas de design genético morfológico HTP.

[00135]Além disso, pode-se utilizar o mesmo promotor ladder que compreende os promotores P1-P4 para modificar geneticamente micróbios, em que cada um dos 4 promotores está ligado operacionalmente a diversos genes morfológicos- alvo diferentes, como fornecidos nesse relatório descritivo. Por exemplo, os diversos genes podem ser 10 genes morfológicos-alvo diferentes. O resultado desse procedimento seria 40 micróbios que são, fora isso, supostamente geneticamente idênticos, exceto pelos promotores particulares ligados operacionalmente a um gene morfológico- alvo de interesse. Esses 40 micróbios poderiam ser adequadamente avaliados e caracterizados e dar origem a outra biblioteca de design genético HTP. A caracterização das cepas microbianas na biblioteca de design genético HTP produz informação e dados que podem ser armazenados em qualquer construção de armazenamento de dados, incluindo um banco de dados relacional, um banco de dados orientado por objeto ou um banco de dados NoSQL altamente distribuído. Esses dados/informação poderiam ser, por exemplo, o efeito de certo promotor (por exemplo, P1-P4) quando ligado operacionalmente a certo gene morfológico-alvo. Esses dados/informação também podem ser o conjunto mais amplo de efeitos combinatórios que resultam da ligação operacional de dois ou mais dos promotores P1-P4 a certo gene morfológico-alvo.

[00136]Os exemplos mencionados anteriormente de quatro promotores e 10 genes-alvo é meramente ilustrativo, na medida em que o conceito pode ser aplicado com qualquer número de promotores que foram agrupados juntos com base na exibição de uma gama de potências de expressão e qualquer número de genes morfológicos-alvo. Aqueles habilitados na técnica também reconhecerão a habilidade para ligar operacionalmente dois ou mais promotores em frente de qualquer gene-alvo. Dessa forma, em algumas modalidades, a presente revelação ensina bibliotecas de troca de promotor nas quais 1, 2, 3 ou mais promotores de um promotor ladder estão ligados operacionalmente a um ou mais genes.

[00137]Em resumo, a utilização de vários promotores para dirigir a expressão de vários genes em um organismo é uma ferramenta poderosa para otimizar um traço de interesse (por exemplo, morfologia de pellet sob condições de cultura submersa). A ferramenta molecular de troca de promotor, como descrito nesse relatório descritivo, usa um ladder de sequências promotoras (por exemplo, Tabela 2) que demonstraram variar a expressão de pelo menos um lócus (por exemplo, FungiSNP_9, FungiSNP_12, FungiSNP_18 ou FungiSNP_40) sob pelo menos uma condição (por exemplo, cultura submersa em meios CAP). Esse ladder é então sistematicamente aplicado a um grupo de genes (por exemplo, dentro da mesma via que FungiSNP_18, como fornecido nesse relatório descritivo) no organismo com o uso de modificação por engenharia genética de alto rendimento do genoma. Esse grupo de genes é determinado como tendo uma probabilidade elevada de impactar o traço de interesse com base em qualquer um de diversos métodos. Isso poderia incluir a seleção com base na função conhecida, ou impacto sobre o traço de interesse (ou seja, morfologia), ou seleção algorítmica com base na diversidade genética benéfica previamente determinada. Em algumas modalidades, a seleção de genes pode incluir todos os genes morfológicos em certo hospedeiro. Em outras modalidades, a seleção de genes pode ser um subconjunto de todos os genes morfológicos em certo hospedeiro, escolhidos aleatoriamente ou selecionados especificamente com base na função conhecida ou suspeita na via.

[00138]A biblioteca de cepas microbianas de design genético HTP resultante de organismos que contêm um sequência promotora ligada a um gene morfológico é então avaliada quanto ao desempenho em um modelo de avaliação de alto rendimento, e ligações promotor-gene que levam ao desempenho aumentado são determinadas e a informação armazenada em um banco de dados. A coleção de perturbações genéticas (ou seja, certo promotor x ligado operacionalmente a certo gene y) forma uma “biblioteca de troca de promotor”, que pode ser utilizada como uma fonte de alterações genéticas potenciais para serem utilizadas no processamento de modificações genéticas microbianas. Ao longo do tempo, à medida que um conjunto maior de perturbações genéticas é implementado contra uma diversidade maior de fundos de células hospedeiras, cada biblioteca se torna mais poderosa, na medida em que um corpo de dados confirmados experimentalmente pode ser usado para o design mais preciso e mais preditivo de alterações direcionadas contra qualquer fundo de interesse.

[00139]Os níveis de transcrição de genes em um organismo são um ponto de controle crucial para afetar o comportamento do organismo. A transcrição está intimamente acoplada à tradução (expressão de proteína), e quais proteínas são expressas em quais quantidades determina o comportamento do organismo. As células expressam milhares de tipos diferentes de proteínas, e essas proteínas interagem de várias formas complexas para criar a função. Variando-se os níveis de expressão de um conjunto de proteínas sistematicamente, a função pode ser alterada em formas que, por causa da complexidade, são difíceis de prever. Algumas alterações podem aumentar o desempenho e, assim, acopladas a um mecanismo para avaliação de desempenho, essa técnica permite a geração de organismos com função aprimorada.

[00140]Em algumas modalidades, a ferramenta de troca de promotor da presente revelação é usada para identificar a expressão ótima de um gene morfológico-alvo selecionado. Em algumas modalidades, o objetivo da troca de promotor pode ser aumentar a expressão de um gene morfológico-alvo para reduzir gargalos em uma via metabólica ou genética. Em outras modalidades, o objetivo da troca de promotor pode ser reduzir a expressão do gene morfológico-alvo para evitar gastos de energia desnecessários na célula hospedeira, quando a expressão do referido gene morfológico-alvo não é necessária.

[00141]No contexto de outros sistemas celulares como transcrição, transporte ou sinalização, vários métodos racionais podem ser usados para tentar e descobrir, a priori, quais proteínas são alvos para alteração da expressão e o que aquela alteração deve ser. Esses métodos racionais reduzem o número de perturbações que devem ser testadas para encontrar uma que aumente o desempenho, mas isso tem um custo significante. Estudos de deleção de genes identificam proteínas cuja presença é crucial para uma função particular, e genes importantes podem então ser superexpressos. Em função da complexidade de interações de proteínas, isso é frequentemente ineficaz no aumento do desempenho. Foram desenvolvidos diferentes tipos de modelos que tentam descrever, desde os primeiros princípios, o comportamento da transcrição ou sinalização em função dos níveis de proteína na célula. Esses modelos frequentemente sugerem alvos nos quais alterações da expressão possam levar a uma função diferente ou aprimorada. Os pressupostos subjacentes a esses modelos são simplistas e os parâmetros de difícil medição e, portanto, das predições que eles fazem são frequentemente incorretas, especialmente para organismos não-modelo. Com deleção e modelagem de genes, os experimentos necessários para determinar como afetar certo gene são diferentes em relação ao trabalho subsequente para fazer a alteração que aumenta o desempenho. A troca de promotor se desvia desses desafios, pois a cepa construída que realça a importância de uma perturbação particular também é, já, a cepa aprimorada.

[00142]Em modalidades particulares, a troca de promotor para uso na geração de uma cepa fúngica filamentosa ou célula hospedeira que compreende uma morfologia de pellet desejada é um processo multietapas que compreende:

1. Seleção de um conjunto de promotores “x” para atuarem como um “ladder”. Idealmente esses promotores demonstraram que levam à expressão altamente variável através de múltiplos loci genômicos, mas a única exigência é que eles perturbem a expressão gênica de alguma forma. Em uma modalidade, o conjunto de promotores “x” que atua como um ladder compreende os promotores na Tabela 2.

[00143]2. Seleção de um conjunto de genes “n” para visar. Esse conjunto pode ser cada um dos quadros de leitura aberta (ORF) em um genoma, ou um subconjunto de ORFs que participam do controle ou que afetam a morfologia. O subconjunto pode ser escolhido usando anotações em ORFs relacionadas à função, por relação com perturbações benéficas previamente demonstradas (trocas de promotor prévias ou trocas de SNP prévias), por seleção algorítmica com base nas interações epistáticas entre perturbações geradas previamente, outros critérios de seleção com base nas hipóteses em relação à ORF benéfica para direcionar, ou por meio de seleção aleatória. Em uma modalidade, o conjunto de genes “n” pode consistir em ortólogos do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa (por exemplo, ortólogos de A. niger listados na Tabela 6) e/ou ortólogos de um ou mais genes que são parte da mesma via (por exemplo, genes da via de resposta osmótica listados na Tabela 7). Os ortólogos do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa (por exemplo, ortólogos de A. niger listados na Tabela 6) e/ou um ou mais genes que são parte da mesma via (por exemplo, genes da via de resposta osmótica listados na Tabela 7) podem ser do tipo selvagem ou formas mutantes dos referidos genes. Em uma modalidade, a cepa fúngica filamentosa ou célula hospedeira é A. niger, e o conjunto de genes “n” selecionados consiste nos genes que contêm SNP encontrados na Tabela 3 ou Tabela 4. Em outra modalidade na qual A. niger é a célula hospedeira, o conjunto de genes “n” selecionado consiste nas versões não-SNPs ou do tipo selvagem dos genes que contêm SNP encontrados na Tabela 3 ou Tabela

4. Quando A. niger é a célula hospedeira, o conjunto de genes “n” pode consistir no gene para FungiSNP_9 encontrado nas Tabelas 3 e 4 em adição a um ou mais genes que são parte da mesma via.

Quando A. niger é a célula hospedeira, o conjunto de genes “n” pode consistir no gene para FungiSNP_12 encontrado nas Tabelas 3 e 4 em adição a um ou mais genes que são parte da mesma via.

Quando A. niger é a célula hospedeira, o conjunto de genes “n” pode consistir no gene para FungiSNP_40 encontrado nas Tabelas 3 e 4 em adição a um ou mais genes que são parte da mesma via.

Em outra modalidade, quando A. niger é a célula hospedeira, o conjunto de genes “n” pode consistir no gene para FungiSNP_18 (ou seja, uma forma mutante do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa) das Tabelas 3 e 4 em adição a um ou mais genes que são parte da mesma via (por exemplo, genes de A. niger da via de resposta osmótica listados na Tabela 7). O ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae (ou gene nik1 de N. crassa) e/ou os (um ou mais) genes na mesma via podem ser do tipo selvagem ou formas mutantes do gene (por exemplo, genes de A. niger da via de resposta osmótica listados na Tabela 7). Uma forma mutante do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa pode ser a forma com o ID.

DE SEQ.

Nº: 7. Os (um ou mais) genes na via pode ser um ortólogo de A. niger dos genes de levedura (por exemplo, S. cerevisiae) Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2, Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 ou qualquer combinação destes.

A sequência de ácidos nucleicos do gene de levedura Ypd1, Skn7, Ssk1, Ste11, Bck1, Ste7, Mkk2/22, Pbs2,

Fus1/Kss3, Mpk1, Hog1, Phk1/2, Chk1, Phk3, Spy1, Mcs4, SskA, Prr1, Rim15, Cek1, Rim15 e Ssk2/22 pode ser selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 50-75. Os (um ou mais) genes que são parte da mesma via podem ser selecionados das sequências de ácidos nucleicos representadas pelos IDS. DE SEQ. Nos: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00144]3. Modificação por engenharia genética de alto rendimento da cepa para realizar rapidamente e, em algumas modalidades, em paralelo, as seguintes modificações genéticas: Quando um promotor nativo existe em frente de gene morfológico-alvo n e sua sequência é conhecida, substituir o promotor nativo com cada um dos x promotores no ladder (por exemplo, o promotor ladder encontrado na Tabela 2). Quando o promotor nativo não existe, ou sua sequência é desconhecida, inserir cada um dos x promotores no ladder em frente do gene n (veja, por exemplo, FIG. 1). Dessa forma, uma “biblioteca” (também denominada uma biblioteca de design genético HTP) de cepas morfologicamente fenotípicas é construída, em que cada membro da biblioteca é um caso de promotor x ligado operacionalmente ao gene morfológico-alvo n, em um contexto genético de outro modo idêntico. Como descrito previamente, combinações de promotores podem ser inseridas, estendendo a faixa de possibilidades combinatórias sobre a qual a biblioteca é construída.

[00145]4. Avaliação de alto rendimento da biblioteca de cepas em um contexto no qual seu desempenho contra uma ou mais métricas é indicativo do desempenho que está sendo otimizado. O contexto pode ser crescimento em culturas submersas em meios para um produto de interesse desejado como, por exemplo, meios CAP para a produção de ácido cítrico.

[00146]Esse processo fundamental pode ser estendido para fornecer aprimoramentos adicionais no desempenho da cepa por, inter alia: (1) Consolidação de múltiplas perturbações benéficas em uma única cepa de fundo, uma de cada vez em um processo repetitivo, ou como múltiplas alterações em uma única etapa. Múltiplas perturbações podem ser um conjunto específico de alterações definidas ou uma biblioteca combinatória, parcialmente randomizada, de alterações. Por exemplo, se o conjunto de alvos é cada um dos genes em uma via, a regeneração sequencial da biblioteca de perturbações em um membro ou membros aprimorados da biblioteca de cepas prévia pode otimizar o nível de expressão de cada gene em uma via independentemente de quais genes são limitantes em certa repetição; (2) Alimentação dos dados de desempenho que resultam do indivíduo e geração combinatória da biblioteca em um algoritmo que usa aqueles dados para prever um conjunto ótimo de perturbações com base na interação de cada perturbação; e (3) Implementação de uma combinação das duas abordagens acima.

[00147]A ferramenta, ou técnica, molecular discutida acima é caracterizada como troca de promotor, sem limitação, promotores, e pode incluir outras alterações de sequências que variam sistematicamente o nível de expressão de um conjunto de alvos. Outros métodos para variação do nível de expressão de um conjunto de genes poderiam incluir: a) um ladder de sítios de ligação ao ribossomo (ou sequências de Kozak em eucariotas); b) substituição do códon de início de cada alvo com cada um dos outros códons de início (ou seja, trocas de códon de início/parada discutidas infra); c) adesão de várias sequências estabilizantes ou desestabilizantes de mRNA à extremidade 5’ ou 3’, ou em qualquer outra localização, de um transcrito, d) adesão de várias sequências estabilizantes ou desestabilizantes de proteína em qualquer localização na proteína.

[00148]A abordagem é exemplificada na presente revelação com micro-organismos industriais, mas é aplicável a qualquer organismo no qual traços desejados podem ser identificados em uma população de mutantes genéticos. Por exemplo, isso poderia ser usado para o aumento do desempenho de células CHO, levedura, células de inseto, algas, bem como organismos multicelulares, por exemplo, plantas. Troca de SNP

[00149]Em uma modalidade, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo são utilizados para troca de SNP a fim de gerar bibliotecas fúngicas filamentosas que compreendem fungos filamentosos com SNPs individuais ou combinações de SNPs. A troca de SNP não é uma abordagem mutagênica aleatória para o aprimoramento de uma cepa microbiana, mas sim envolve a introdução ou remoção sistemática de mutações de nucleotídeos individuais de Polimorfismo Nuclear Pequeno (ou seja, SNPs) (daí o nome “troca de SNP”) através de cepas. Cada um dos SNPs ou combinação SNPs pode estar em genes que demonstraram ou que são suspeitos de controlar ou afetar a morfologia fúngica filamentosa.

[00150]Os micróbios resultantes que são modificados geneticamente por meio desse processo formam bibliotecas de design genético morfológico HTP. A biblioteca de design genético HTP pode se referir à coleção física real da cepa microbiana que é formada por meio desse processo, com cada cepa membro sendo representativa da presença ou ausência de certo SNP, em uma base genética de outro modo idêntica, a referida biblioteca sendo denominada uma “biblioteca de cepas microbianas de troca de SNP”. No contexto específico de fungos filamentosos (por exemplo, A. niger), a biblioteca pode ser denominada uma “biblioteca de cepa fúngica filamentosa de troca de SNP” ou “biblioteca de cepa de A. niger de troca de SNP”, mas os termos podem ser usados de forma sinônima, na medida em que fungo filamentoso é um exemplos específico de um micróbio ou organismo cenocítico.

[00151]Além disso, a biblioteca de design genético HTP pode se referir à coleção de perturbações genéticas - nesse caso certo SNP estando presente ou certo SNP estando ausente - a referida coleção sendo denominada uma “biblioteca de troca de SNP”. Uma biblioteca de troca de SNP para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo pode ser a biblioteca de SNP da Tabela 3 ou Tabela 4. Tabela 3. Genes que contêm SNP potencialmente envolvidos na produção de ácido cítrico em A. niger. Nome da Alteração de mutação Localização sequência Orientação Contig FungiSNP_01 50669-680224 ~>~ 680224 chr_1_1 FungiSNP_02 1172974 G>A + chr_1_1 FungiSNP_03 367948 C>T + chr_1_2 FungiSNP_04 549014 C>G - chr_1_2 FungiSNP_05 1330718 G>A + chr_1_2 FungiSNP_06 662258 G> + chr_2_1 FungiSNP_07 673547 G>A - chr_2_1 FungiSNP_08 946654 T> + chr_2_1 FungiSNP_09 641661 T>A - chr_2_2 FungiSNP_10 2316591 G>A + chr_2_2 FungiSNP_11 935908 A>G - chr_3_1 FungiSNP_12 205638 T>A + chr_3_2 FungiSNP_13 268107 T>C + chr_3_3 FungiSNP_14 186943 A>T + chr_3_4

FungiSNP_15 276232 C>T + chr_3_4 FungiSNP_16 1287891 T>C - chr_4_1 FungiSNP_17 1639965 A>T + chr_4_1 FungiSNP_18 1826343 G>A - chr_4_1 FungiSNP_19 1358794 C>A + chr_4_2 FungiSNP_20 1466380 CTA> + chr_4_2 FungiSNP_21 1700330 C>A - chr_4_2 FungiSNP_22 2873296 A>G + chr_4_2 FungiSNP_23 815022 G>A + chr_5_2 FungiSNP_24 831672 G>A - chr_5_2 FungiSNP_25 1507652 >A + chr_5_2 FungiSNP_26 442488 T>C + chr_6_1 FungiSNP_27 93202-103239 ~>~ + chr_6_2 FungiSNP_28 972833 A>T + chr_6_2 FungiSNP_29 972932 A> + chr_6_2 FungiSNP_30 1183094 G> + chr_6_2 FungiSNP_31 1701762 T>G + chr_6_2 FungiSNP_32 236406 G>A - chr_7_1 FungiSNP_33 2350056 A> + chr_7_1 FungiSNP_34 375013 C>T + chr_8_1 FungiSNP_35 1272037 C>T + chr_8_1 FungiSNP_36 281612 T>C + chr_8_2 FungiSNP_37 565087 A>G + chr_8_2 FungiSNP_38 865958 A> + chr_8_2 FungiSNP_39 947633 A> + chr_8_2 FungiSNP_40 2482267 G>A + chr_8_2 FungiSNP_41 2486601 G> + chr_8_2 FungiSNP_42 2709491 T>C + chr_8_2 FungiSNP_43 2708043 >A ~ chr_8_2

Tabela 4. Descrição do gene/suposta função para o subconjunto de genes que contêm SNP da Tabela 3 com SNPs que estão localizadas dentro de domínios codificadores.

ATCC 1015 Nome Descrição/suposta Fenótipo (ID.

Em função morfoló-gico fungidb.org) alterado em SNPSWP, experimentos de knock-out e/ou knock-in ASPNIDRAFT_212500 FungiSNP_02 Aminoácido (ID.

DE SEQ.

Nº: aromático 46) aminotransferase e proteína relacionada ASPNIDRAFT_44864 FungiSNP_06 Catabolismo de (ID.

DE SEQ.

Nº: taurina dioxigenase 33) TauD/TfdA

ASPNIDRAFT_44868 FungiSNP_07 Hidrolase alfa/beta (ID. DE SEQ. Nº: 45) ASPNIDRAFT_196832 FungiSNP_09 Atividade de x (ID. DE SEQ. Nº: (ID. DE SEQ. pseudouridilato 42) Nº: 5; A>T SNP sintase (PUS4 em no nucleotídeo levedura) 706) ASPNIDRAFT_212853 FungiSNP_11 Serina/treonina (ID. DE SEQ. Nº: proteína quinase 41) ASPNIDRAFT_119127 FungiSNP_12 Fator de x (ID. DE SEQ. Nº: (ID. DE SEQ. transcrição 47) Nº: 6; T>A SNP no nucleotídeo 2728) ASPNIDRAFT_123785 FungiSNP_16 Serina/treonina (ID. DE SEQ. Nº: proteína quinase 40) ASPNIDRAFT_39736 FungiSNP_18 Transdução x (ID. DE SEQ. Nº: (ID. DE SEQ. sensorial 14) Nº: 7; C>T SNP histidina- no nucleotídeo quinase/histidina- 814) quinase de dois componentes ASPNIDRAFT_55560 FungiSNP_20 Manitol-1-fosfato (ID. DE SEQ. Nº: 5-desidrogenase 36) ASPNIDRAFT_206922 FungiSNP_21 Timosina e proteína (ID. DE SEQ. Nº: de interação com 48) SNARE relacionada ASPNIDRAFT_53655 FungiSNP_23 Função desconhecida (ID. DE SEQ. Nº: 39) ASPNIDRAFT_121820 FungiSNP_24 Sítio de ligação ao (ID. DE SEQ. Nº: Citocromo c heme 44) ASPNIDRAFT_131243 FungiSNP_30 Monooxigenase (ID. DE SEQ. Nº: envolvida na 37) biossíntese de coenzima Q (ubiquinona) ASPNIDRAFT_127977 FungiSNP_32 Proteína (ID. DE SEQ. Nº: extracelular 38) desconhecida ASPNIDRAFT_38583 FungiSNP_36 Função desconhecida (ID. DE SEQ. Nº: 43) ASPNIDRAFT_52574 FungiSNP_40 Proteína coiled- x (ID. DE SEQ. Nº: (ID. DE SEQ. coil conservada não 49) Nº: 8; G>A SNP caracterizada no nucleotídeo 3680) ASPNIDRAFT_47328 FungiSNP_41 Fosfatase magnésio- (ID. DE SEQ. Nº: dependente 34) ASPNIDRAFT_37842 FungiSNP_43 Proteína de (ID. DE SEQ. Nº: ativação de GTPase 35)

[00152]Em algumas modalidades, a troca de SNP envolve a reconstrução de organismos hospedeiros com combinações ótimas de “blocos de construção” de SNP-alvo com efeitos benéficos sobre o desempenho identificados. Em uma modalidade, a troca de SNP envolve a reconstrução de uma célula hospedeira fúngica filamentosa (por exemplo, A. niger) com combinações ótimas de genes morfológicos-alvo com efeitos benéficos de morfologia fúngica identificados em condições de cultura definidas (por exemplo, culturas submersas). Dessa forma, em algumas modalidades, a troca de SNP envolve a consolidação de múltiplas mutações benéficas em uma única cepa de fundo, uma de cada vez em um processo repetitivo, ou como múltiplas alterações em uma única etapa. Múltiplas alterações podem ser um conjunto específico de alterações definidas ou uma biblioteca combinatória, parcialmente randomizada, de mutações.

[00153]Em outras modalidades, a troca de SNP também envolve a remoção de múltiplas mutações identificadas como prejudiciais de uma cepa, uma de cada vez em um processo repetitivo, ou como múltiplas alterações em uma única etapa. Em uma modalidade, a troca de SNP envolve a remoção de múltiplas mutações em genes morfológicos-alvo que são identificados como sendo prejudiciais a uma cepa que formam uma morfologia desejada (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção). Múltiplas alterações podem ser um conjunto específico de alterações definidas ou uma biblioteca combinatória, parcialmente randomizada, de mutações. Em algumas modalidades, os métodos de troca de SNP da presente revelação incluem tanto a adição de SNPs benéficos, quanto a remoção de mutações prejudiciais e/ou neutras.

[00154]A troca de SNP é uma ferramenta poderosa para identificar e explorar mutações tanto benéficas quanto prejudiciais em uma linhagem de cepas submetida à mutagênese e seleção para um traço aprimorado de interesse (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção). A troca de SNP utiliza técnicas de modificação por engenharia genética de alto rendimento do genoma para determinar sistematicamente a influência de mutações individuais em genes morfológicos-alvo em uma linhagem mutagênica. São determinadas sequências do genoma para cepas através de uma ou mais gerações de uma linhagem mutagênica com aumentos de desempenho conhecidos. A modificação por engenharia genética de alto rendimento do genoma é então usada sistematicamente para recapitular mutações de cepas aprimoradas em cepas de linhagem anterior, e/ou reverter mutações em sequências de cepas mais tardias para sequências da cepa anterior. O desempenho dessas cepas é então avaliado e a contribuição de cada mutação individual sobre o aprimoramento do fenótipo de interesse (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção) pode ser determinada. Como mencionado anteriormente, as cepas microbianas que resultam desse processo são analisadas/caracterizadas e formam a base para as bibliotecas de troca de SNP de design genético que podem informar aprimoramento da cepa microbiana através de cepas hospedeiras.

[00155]A remoção de mutações prejudiciais pode fornecer aumentos de desempenho imediatos, e a consolidação de mutações benéficas em um fundo de cepa não submetida à carga mutagênica pode aprimorar rapidamente e acentuadamente o desempenho da cepa. As várias cepas microbianas produzidas por meio do processo de troca de SNP formam as bibliotecas de design genético HTP de troca de SNP, que são cepas microbianas que compreendem os vários SNPs adicionados/deletados/ou consolidados, mas com fundos genéticos de outro modo idêntico.

[00156]Como discutido previamente, a mutagênese aleatória e subsequente avaliação para aumentos de desempenho é uma técnica comumente usada para aprimoramento de cepas industriais, e muitas cepas atualmente usadas para fabricação em larga escala foram desenvolvidas usando esse processo iterativamente ao longo de um período de muitos anos, algumas vezes décadas. Abordagens aleatórias para a geração de mutações genômicas como, por exemplo, exposição à radiação UV ou mutágenos químicos, por exemplo, etil metanossulfonato, eram um método preferido para aprimoramentos de cepas industriais, pois: 1) organismos industriais podem ser pobremente caracterizados geneticamente ou metabolicamente, tornando a seleção de alvo para abordagens de aprimoramentos dirigidos difícil ou impossível; 2) até mesmo em sistemas relativamente bem caracterizados, alterações que resultam em aumentos de desempenho industrial são difíceis de prever e podem necessitar de perturbação de genes que não possuem função conhecida, e 3) ferramentas genéticas para a produção de mutações genômicas dirigidas em certo organismo industrial podem não estar disponíveis ou muito lentas e/ou difíceis de usar.

[00157]No entanto, apesar dos benefícios desse processo mencionados anteriormente, há também diversas desvantagens conhecidas. Mutações benéficas são eventos relativamente raros e, a fim de encontrar essas mutações com uma capacidade de avaliação fixa, as taxas de mutações devem ser suficientemente altas. Isso frequentemente resulta na incorporação de mutações neutras e parcialmente prejudiciais indesejadas em cepas, juntamente com alterações benéficas. Ao longo do tempo, essa ‘carga mutagênica’ se acumula, resultando em cepas com deficiências na robustez global e traços cruciais como, por exemplo, taxas de crescimento. Eventualmente, a ‘carga mutagênica’ torna a obtenção de aprimoramentos adicionais no desempenho por meio de mutagênese aleatória cada vez mais difícil ou impossível. Sem ferramentas adequadas, é impossível consolidar mutações benéficas encontradas em ramificações distintas e paralelas de linhagens de cepas.

[00158]A troca de SNP é uma abordagem para superar essas limitações recapitulando ou revertendo sistematicamente algumas ou todas as mutações observadas quando se comparam cepas dentro de uma linhagem mutagênica. Dessa forma, mutações benéficas (‘causativas’) podem ser identificadas e consolidadas, e/ou mutações prejudiciais podem ser identificadas e removidas. Isso permite aprimoramentos rápidos no desempenho da cepa que não poderiam ser obtidos por mutagênese aleatória adicional ou engenharia genética direcionada.

[00159]A remoção da carga genética ou consolidação de alterações benéficas em uma cepa sem carga genética também fornece um novo ponto de partida, robusto, para mutagênese aleatória adicional que pode permitir aprimoramentos adicionais.

[00160]Além disso, como alterações benéficas ortogonais são identificadas através de várias ramificações distintas de uma linhagem de cepa mutagênica, elas podem ser rapidamente consolidadas em cepas com melhor desempenho. Essas mutações também podem ser consolidadas em cepas que não são parte de linhagens mutagênicas, por exemplo, cepas com aprimoramentos obtidos por engenharia genética dirigida.

[00161]Existem outras abordagens e tecnologias para recombinar aleatoriamente mutações entre cepas dentro de uma linhagem mutagênica. Essas incluem técnicas como, por exemplo, fusão de protoplasto e embaralhamento de genoma completo, que facilitam a recombinação genômica através de cepas mutadas. Para alguns micro-organismos industriais como, por exemplo, leveduras e fungos filamentosos, ciclos de acasalamento naturais também podem ser explorados para recombinação genômica pareada. Dessa forma, mutações prejudiciais podem ser removidas por ‘retrocruzamento’ de mutantes com cepas parentais e mutações benéficas consolidadas. No entanto, essas abordagens estão sujeitas a muitas limitações que são contornadas com o uso dos métodos de troca de SNP da presente revelação.

[00162]Por exemplo, como essas abordagens se baseiam em uma número relativamente pequeno de eventos aleatórios de cruzamento por recombinação para troca de mutações, podem ser necessários muitos ciclos de recombinação e avaliação para otimizar o desempenho da cepa. Além disso, embora eventos de recombinação naturais sejam basicamente aleatórios, eles também estão sujeitos a propensões posicionais do genoma e algumas mutações podem ser de difícil realização. Essas abordagens também fornecem pouca informação sobre a influência de mutações individuais sem sequenciamento e análise do genoma adicionais. A troca de SNP supera essas limitações fundamentais, na medida em que não é uma abordagem aleatória, mas sim a introdução ou remoção sistemática de mutações individuais através de cepas.

[00163]Em algumas modalidades, os métodos de troca de SNP da presente revelação compreendem a etapa de introdução de um ou mais SNPs identificados em uma cepa mutada em uma cepa de referência ou cepa do tipo selvagem (“wave up”). Isso pode ser feito a fim de determinar se um SNP específico e/ou o gene que o contém contribui ou não para cepas que exibem um traço desejado (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção).

[00164]Em outras modalidades, os métodos de troca de SNP da presente revelação compreendem a etapa de remoção de um ou mais SNPs identificados em uma cepa mutada (“wave down”). Isso pode ser feito a fim de determinar se um SNP específico e/ou o gene que o contém contribui ou não para cepas que exibem um traço desejado (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção).

[00165]Em algumas modalidades, cada cepa gerada que compreende uma ou mais alterações de SNP (introdução ou remoção) é cultivada e analisada sob um ou mais critérios da presente revelação (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção). Dados de cada uma das cepas hospedeiras analisadas são associados, ou correlacionados, com o SNP particular, ou grupo de SNPs presente na cepa hospedeira, e são registrados para uso futuro. Dessa forma, a presente revelação permite a criação de bibliotecas grandes e altamente anotadas de cepas microbianas de design genético HTP que são capazes de identificar o efeito de certo SNP sobre qualquer número de traços genéticos ou fenotípicos microbianos de interesse (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção). A informação armazenada nessas bibliotecas de design genético HTP informa os algoritmos de aprendizado de máquina da plataforma de modificação genômica HTP por engenharia genética e dirige repetições futuras do processo, o que, por fim, leva a organismos microbianos desenvolvidos que possuem propriedades/traços altamente desejáveis.

[00166]Em outra modalidade, as bibliotecas de cepas microbianas de design genético HTP que compreendem cepas de células fúngicas filamentosas que compreendem um ou mais SNPs de genes morfológicos-alvo gerados com o uso dos métodos de troca de SNP fornecidos nesse relatório descritivo são submetidas aos métodos de troca com bibliotecas de elementos de controle genético como fornecidos nesse relatório descritivo. Os elementos de controle genético podem ser promotores ou terminadores. Os promotores ou terminadores podem ser parte de bibliotecas de promotores ou terminadores. Em uma modalidade, as bibliotecas de cepas microbianas de design genético HTP que compreendem cepas de células fúngicas filamentosas que compreendem um ou mais SNPs de genes morfológicos-alvo gerados com o uso dos métodos de troca de SNP fornecidos nesse relatório descritivo são submetidas aos métodos de troca de promotores como fornecidos nesse relatório descritivo com o uso de bibliotecas de promotores. As bibliotecas de promotores podem ser a biblioteca de promotores da Tabela 2. Além dessa modalidade, o método de troca de promotores realizado nas bibliotecas de cepas microbianas de design genético HTP que compreendem cepas de células fúngicas filamentosas que compreendem um ou mais SNPs de genes morfológicos-alvo gerados com o uso dos métodos de troca de SNP fornecidos nesse relatório descritivo gera novas bibliotecas de cepas microbianas de design genético HTP que podem ser avaliadas quanto à expressão de um traço desejado (por exemplo, morfologia de pellet em culturas submersas de meios de produção). Métodos de formação de protoplastos

[00167]Em uma modalidade, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para gerar as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada exigem a geração de protoplastos de células fúngicas filamentosas. Procedimentos adequados para a preparação de protoplastos podem ser quaisquer procedimentos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, aqueles descritos em EP 238.023 e Yelton e cols. (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470-1.474). Em uma modalidade, protoplastos são gerados por tratamento de uma cultura de células fúngicas filamentosas com uma ou mais enzimas líticas ou uma mistura destas. As enzimas líticas podem ser uma beta- glucanase e/ou uma poligalacturonase. Em uma modalidade, a mistura de enzimas para a geração de protoplastos é concentrado de VinoTaste. Muitos dos parâmetros utilizados para pré-cultivo de culturas de organismos cenocíticos (por exemplo, células fúngicas filamentosas) e subsequentemente geração e utilização de protoplastos a partir delas para uso nos métodos e composições fornecidas nesse relatório descritivo podem ser variados.

Por exemplo, pode haver variações de tamanho do inóculo, método do inóculo, meios de pré-cultivo, tempos de pré-cultivo, temperaturas de pré- cultivo, condições de misturação, composição do tampão de lavagem, proporções de diluição, composição do tampão durante tratamento com enzima lítica, do tipo e/ou concentração de enzima lítica usada, do tempo de incubação com enzima lítica, dos procedimentos e/ou tampões de lavagem dos protoplastos, da concentração de protoplastos e/ou polinucleotídeo e/ou reagentes de transformação durante a transformação real, dos parâmetros físicos durante a transformação, dos procedimentos após a transformação até os transformantes obtidos.

Em alguns casos, essas variações podem ser utilizadas para otimizar o número de protoplastos e a eficiência de transformação.

Em uma modalidade, o organismo cenocítico é uma célula fúngica filamentosa como fornecida nesse relatório descritivo (por exemplo, A. niger). Além dessa modalidade, os meios de pré-cultivo podem ser YPD ou meios completos.

O volume de meios de pré-cultivo pode ser pelo menos, no máximo ou cerca de 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 650 ml, 700 ml, 750 ml, 800 ml, 850 ml, 900 ml, 950 ml ou 1.000 ml.

O volume de meios de pré-cultivo pode ser de cerca de 50 ml até cerca de 100 ml, cerca de 100 ml até cerca de 150 ml, cerca de 150 ml até cerca de 200 ml, cerca de 200 ml até cerca de 250 ml, cerca de 250 ml até cerca de 300 ml, cerca de 300 ml até cerca de 350 ml, cerca de 350 ml até cerca de 400 ml, cerca de 400 ml até cerca de 450 ml, cerca de 450 ml até cerca de 500 ml, cerca de 500 ml até cerca de 550 ml, cerca de 550 ml até cerca de 600 ml,

cerca de 600 ml até cerca de 650 ml, cerca de 650 ml até cerca de 700 ml, cerca de 700 ml até cerca de 750 ml, cerca de 750 ml até cerca de 800 ml, cerca de 800 ml até cerca de 850 ml, cerca de 850 ml até cerca de 900 ml, cerca de 900 ml até cerca de 950 ml ou cerca de 950 ml até cerca de 1.000 ml.

Em alguns casos, diversas culturas são cultivadas e subsequentemente submetidas à protoplastização.

As diversas culturas podem ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou mais.

Em uma modalidade, uma preparação de pré-cultivo é preparada por inoculação de 100 ml de meios ricos (por exemplo, YPD ou meios completos) com 106 esporos/ml e incubação da preparação de pré-cultivo entre 14-18 horas a 30°C.

Em outra modalidade, uma preparação de pré-cultivo é preparada por inoculação de 500 ml de meios ricos (por exemplo, “Yeast Mold Broth”, YPD ou meios completos) com pelo menos 106 esporos/ml e incubação da preparação de pré-cultivo entre 14-18 horas a 30°C.

Antes da protoplastização, o organismo cenocítico pode ser isolado por qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, centrifugação.

Em uma modalidade, o organismo cenocítico é fungo filamentoso (por exemplo, A. niger). Além dessa modalidade, “Yeast Mold Broth” (YMB) é inoculado com 106 esporos/ml das células fúngicas filamentosas e desenvolvido por 16 horas a 30°C.

Ainda além dessa modalidade, as células fúngicas filamentosas desenvolvidas na preparação de pré- cultivo podem ser isoladas por centrifugação.

As preparações de pré-cultivo fornecidas nesse relatório descritivo para uso nos métodos e composições fornecidas nesse relatório descritivo podem produzir uma quantidade de hifas para subsequente protoplastização de cerca de, pelo menos ou mais do que 0,5 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5 g, 3 g, 3,5 g, 4 g ou 5 g de peso líquido.

O pré-cultivo/cultivo do organismo cenocítico (por exemplo, fungo filamentoso) pode ser parte de um fluxo de trabalho em um sistema de alto rendimento (HTP), por exemplo, como descrito em 62/515.907, depositado em 6 de junho de 2017. O sistema HTP pode ser automatizado ou semiautomatizado.

O pré-cultivo do organismo pode envolver a inoculação de um volume em pequena escala (por exemplo, 100 ml) de meios de esporulação (meio PDA) com 106 esporos/ml do organismo (por exemplo, A. niger) e crescimento por 14-16 horas a 30°C.

Durante o pré-cultivo, o fluxo de trabalho pode conter uma etapa pela qual uma solução de enzima para a geração de protoplastos do organismo pré- cultivado (por exemplo, A. niger) é gerada.

A solução de enzima pode consistir em uma mistura de enzima Vinotaste Pro (Novozymes) em tampão-fosfato que compreende 1,2 M de MgSO4. Após o pré-cultivo, as hifas podem ser coletadas após filtração através de um Miracloth e uma cultura em larga escala pode ser cultivada por inoculação de cerca de 500 ml de meios completos em um frasco de 2,8 litros com 10 µl até 20 ml das hifas coletadas.

O tamanho do inóculo pode ser variável com base na OD da cultura obtida da etapa de pré- cultivo.

A cultura em larga escala pode ser desenvolvida por 6-18 horas a 30°C ou 18°C a 80% de umidade com agitação a 200 rpm.

Após o cultivo, a cultura (ou culturas) pode ser isolada por centrifugação após uma ou mais lavagens e ressuspensa.

Em uma modalidade, as culturas são ressuspensas em um tampão de protoplastização como descrito nesse relatório descritivo e submetidas à protoplastização como descrito nesse relatório descritivo.

A centrifugação pode ser realizada em tubos de centrífuga de 500 ml a 4°C por 10- 15 minutos a 5.500-6.100 x g. Cada uma das uma ou mais lavagens pode ser realizada em 10-50 ml de tampão de lavagem (por exemplo, água com glicerol 10%), seguidas por centrifugação a 4°C por 10-15 minutos a 5.500-6.100 x g.

[00168]Após isolamento como descrito acima, o organismo cenocítico (por exemplo, células fúngicas filamentosas como, por exemplo, A. niger) pode ser ressuspenso em tampão de protoplastização, de modo que o tampão de protoplastização compreenda uma ou mais enzimas como fornecidas nesse relatório descritivo (por exemplo, concentrado de VinoTaste Pro (Novozymes)) para a geração de protoplastos. Em uma modalidade, o tampão de protoplastização possui uma concentração elevada de osmólito (por exemplo, maior ou igual a 1 M de um osmólito como, por exemplo, MgSO4). Em modalidades que utilizam um tampão de protoplastização com uma concentração elevada de osmólito (por exemplo, 1,2 M de MgSO4), o tempo de incubação para o tratamento enzimático (por exemplo, concentrado de VinoTaste Pro (Novozymes)) pode ser de cerca de 14-16 horas a cerca de 30°C. O volume de tampão de protoplastização usado para ressuspensão pode ser 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 650 ml, 700 ml, 750 ml, 800 ml, 850 ml, 900 ml, 950 ml ou 1.000 ml. O volume de tampão de protoplastização usado para ressuspensão pode ser de cerca de 50 ml até cerca de 100 ml, cerca de 100 ml até cerca de 150 ml, cerca de 150 ml até cerca de 200 ml, cerca de 200 ml até cerca de 250 ml, cerca de 250 ml até cerca de 300 ml, cerca de 300 ml até cerca de 350 ml, cerca de 350 ml até cerca de 400 ml, cerca de 400 ml até cerca de 450 ml,

cerca de 450 ml até cerca de 500 ml, cerca de 500 ml até cerca de 550 ml, cerca de 550 ml até cerca de 600 ml, cerca de 600 ml até cerca de 650 ml, cerca de 650 ml até cerca de 700 ml, cerca de 700 ml até cerca de 750 ml, cerca de 750 ml até cerca de 800 ml, cerca de 800 ml até cerca de 850 ml, cerca de 850 ml até cerca de 900 ml, cerca de 900 ml até cerca de 950 ml ou cerca de 950 ml até cerca de 1.000 ml. Em uma modalidade, as células fúngicas filamentosas são desenvolvidas em 500 ml de meios ricos (por exemplo, YPD ou meios completos) e hifas (pode ser cerca de 1 g de massa úmida) são isoladas por filtração através de um Miracloth, enxaguando com 100 ml de tampão de lavagem (por exemplo, 100 mM de tampão de fosfato de sódio com 1,2 M de MgSO4, pH 5,5) e ressuspensas em cerca de 500 ml de tampão de protoplastização (por exemplo, 100 mM de tampão de fosfato de sódio com 1,2 M de MgSO4 pH 5,5) que compreende uma mistura de enzimas de protoplastização (por exemplo, concentrado de VinoTaste Pro (Novozymes)) em uma garrafa de 1 litro. As hifas na solução de enzima podem ser incubadas por 14-16 horas a 30°C com agitação a 140 rpm com monitoramento contínuo da formação de protoplasto por meio de exame microscópico.

[00169]Em uma modalidade, um ou mais inibidores químicos da via de NHEJ são adicionados a um tampão de protoplastização como fornecido. Os (um ou mais) inibidores químicos podem ser selecionados de W7, clorpromazina, vanilina, Nu7026, Nu7441, mirina, SCR7, AG14361 ou qualquer combinação destes. A adição dos (um ou mais) inibidores químicos ao tampão de protoplastização pode ocorrer em qualquer ponto durante o procedimento de protoplastização.

Em uma modalidade, o tratamento com os (um ou mais) inibidores químicos é por todo o procedimento de protoplastização. Em uma modalidade separada, o tratamento com os (um ou mais) inibidores químicos é por menos do que todo o procedimento de protoplastização. O tratamento com os (um ou mais) inibidores químicos pode ser por cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 ou 300 minutos. Em uma modalidade, as células cenocíticas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) são tratadas com W-

7. Em outra modalidade, as células cenocíticas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) são tratadas com SCR-7.

[00170]Após o tratamento enzimático, os protoplastos podem ser isolados com o uso de métodos conhecidos na técnica. Antes do isolamento de protoplastos, fragmentos hifais não digeridos podem ser removidos por filtração da mistura através de uma barreira porosa (por exemplo, Miracloth) na qual os poros variam de tamanho de 20-100 mícrons a fim de produzir um filtrado de protoplastos filtrados. Em uma modalidade, os protoplastos filtrados são então centrifugados em níveis moderados de força centrípeta para fazer com que os protoplastos formem pellets no fundo do tubo da centrífuga. A força centrípeta pode ser de cerca de 500-1.500 x g. Em uma modalidade preferida, a força centrípeta usada é geralmente abaixo de 1.000 x g (por exemplo, 800 x g por 5 minutos). Em uma modalidade separada, um tampão de força osmótica substancialmente menor é gentilmente aplicado à superfície dos protoplastos (por exemplo, protoplastos filtrados) após a geração de protoplastos em um tampão de protoplastização que compreende uma concentração elevada de osmólito. Exemplos de tampões de força osmótica substancialmente menor incluem tampões (por exemplo, tampão Tris) que compreendem 1 M de Sorbitol, 1 M de NaCl, 0,6 M de sulfato de amônio ou 1 M de KCl.

Em uma modalidade, o tampão de força osmótica menor para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo é um tampão de Sorbitol-Tris (ST) que compreende 0,4 M de sorbitol e possui um pH de 8. Essa preparação estratificada pode então ser centrifugada, o que faz com que os protoplastos se acumulem em uma camada no tubo na qual eles flutuam de forma neutra.

Os protoplastos podem então ser isolados dessa camada para processamento adicional (por exemplo, armazenamento e/ou transformação). Ainda em outra modalidade, os protoplastos (por exemplo, protoplastos filtrados) gerados em um tampão de protoplastização que compreende uma concentração elevada de osmólito (por exemplo, 100 mM de tampão-fosfato que compreende 1,2 M de MgSO4, pH 5,5) são transferidos para um vaso de coleta alongado (por exemplo, cilindro graduado) e um tampão de osmolaridade menor como fornecido nesse relatório descritivo (por exemplo, 0,4 M de tampão ST, pH 8) é sobreposto na superfície dos protoplastos (por exemplo, protoplastos filtrados) para gerar uma camada na qual os protoplastos flutuam de forma neutra.

A combinação dos tampões de osmolaridades diferentes no vaso de coleta alongado (por exemplo, cilindro graduado) pode facilitar a ‘flutuação’ dos protoplastos até a superfície do vaso de coleta alongado (por exemplo, cilindro graduado). Uma vez no topo do vaso de coleta, os protoplastos podem ser isolados.

Em uma modalidade, uma preparação de pré-cultivo de 500 ml de organismos cenocíticos (por exemplo, células fúngicas filamentosas como, por exemplo, A. niger) desenvolvidos e submetidos à protoplastização como fornecidas nesse relatório descritivo gera cerca de 25 ml de protoplastos.

[00171]Após isolamento dos protoplastos, o tampão restante contendo enzima pode ser removido por ressuspensão dos protoplastos em um tampão osmótico (por exemplo, 1 M de sorbitol tamponado usando 10 mM de TRIS, pH 8) e coletado novamente por centrifugação. Essa etapa pode ser repetida. Após a remoção suficiente do tampão contendo enzima, os protoplastos podem ser adicionalmente lavados em tampão osmoticamente estabilizado que também contém cloreto de cálcio (por exemplo, sorbitol 1 M tamponado usando TRIS 10 mM, pH 8, 50 mM de CaCl2) uma ou mais vezes.

[00172]Após isolamento e lavagem, os protoplastos podem ser ressuspensos em um tampão de estabilização osmótica. A composição desses tampões pode variar dependendo da espécie, aplicação e necessidades. No entanto, tipicamente esses tampões contêm um componente orgânico como sacarose, citrato, manitol ou sorbitol entre 0,5 e 2 M. Mais preferivelmente, entre 0,75 e 1,5 M; principalmente, 1 M. Além disso, esses tampões contêm um componente de estabilização osmótica inorgânico como KCl, (NH4)2SO4, MgSO4, NaCl ou MgCl2, em concentrações entre 0,1 e 1,5 M. De preferência entre 0,2 e 0,8 M; mais preferivelmente entre 0,3 e 0,6 M, principalmente, 0,4 M. Os tampões estabilizantes mais preferidos são STC (sorbitol, 0,8 M; CaCl2, 25 mM; Tris, 25 mM; pH 8,0) ou KCl-citrato (KCl, 0,3-0,6 M; citrato, 0,2% (p/v)). Os protoplastos podem ser usados em uma concentração entre 1 x 105 e 1 x 1010 células/ml ou entre 1-3 x 107 protoplastos por ml. De preferência, a concentração está entre 1 x 106 e 1 x 109; mais preferivelmente, a concentração está entre 1 x 107 e 5 x 108; principalmente, a concentração é de 1 x 108 células/ml. Para aumentar a eficiência de transfecção, DNA carreador (como DNA de esperma de salmão ou DNA de vetor não-codificador) pode ser adicionado à mistura de transformação. O DNA é usado em uma concentração entre 0,01 e 10 µg; preferivelmente, entre 0,1 e 5 µg, ainda mais preferivelmente, entre 0,25 e 2 µg; principalmente, entre 0,5 e 1 µg.

[00173]Em uma modalidade, após a geração e isolamento e lavagem subsequentes, os protoplastos são misturados com um ou mais crioprotetores. Os crioprotetores podem ser glicóis, sulfóxido de dimetila (DMSO), polióis, açúcares, 2- Metil-2,4-pentanodiol (MPD), polivinilpirrolidona (PVP), metilcelulose, glicoproteínas ligadas ao C anticongelamento (C-AFGP) ou combinações destes. Glicóis para uso como crioprotetores nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser selecionados de etileno glicol, propileno glicol, polipropileno glicol (PEG), glicerol, ou combinações destes. Polióis para uso como crioprotetores nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser selecionados de propano-1,2- diol, propano-1,3-diol, 1,1,1-tris-(hidroximetil)etano (THME), e 2-etil-2-(hidroximetil)-propano-1,3-diol (EHMP), ou combinações destes. Açúcares para uso como crioprotetores nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ser selecionados de trehalose, sacarose, glicose, rafinose, dextrose ou combinações destas. Em uma modalidade, os protoplastos são misturados com DMSO. DMSO pode ser misturado com os protoplastos em uma concentração final de pelo menos, no máximo, menor do que, maior do que, igual a,

ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12,5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ou 75% p/v ou v/v. A mistura de protoplastos/crioprotetor (por exemplo, DMSO) pode ser distribuída às placas de microtitulação antes do armazenamento. A mistura de protoplasto/crioprotetor (por exemplo, DMSO) pode ser armazenada em qualquer temperatura fornecida nesse relatório descritivo para armazenamento de longo prazo (por exemplo, várias horas, dia(s), semana(s), mês (ou meses), ano(s)), como fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, -20°C ou -80°C. Em uma modalidade, um crioprotetor adicional (por exemplo, PEG) é adicionado à mistura de protoplastos/DMSO. Ainda em outra modalidade, o crioprotetor adicional (por exemplo, PEG) é adicionado à mistura de protoplastos/DMSO antes do armazenamento. O PEG pode ser qualquer PEG fornecido nesse relatório descritivo e pode ser adicionado em qualquer concentração (por exemplo, p/v ou v/v) como fornecida nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, a solução de PEG é preparada como 40% p/v em tampão STC. Vinte por cento v/v desse PEG-STC 40% podem então ser adicionados aos protoplastos. Por exemplo, 800 microlitros de 1,25 x 107 protoplastos teriam 200 microlitros de PEG-STC 40%, gerando um volume final de 1 ml. Setenta microlitros de DMSO podem então ser adicionados a esse 1 ml para levar essa preparação até 7% v/v DMSO.

[00174]Qualquer protocolo de pré-cultivo, cultivo e/ou protoplastização fornecido nesse relatório descritivo pode ser realizado em um modo de alto rendimento. Por exemplo, o pré-cultivo, cultivo e protoplastização podem ser realizados como parte de um fluxo de trabalho, de modo que o referido fluxo de trabalho represente uma porção de um protocolo de alto rendimento (HTP), por exemplo, aquele descrito em 62/515.907, depositado em 6 de junho de 2017. O protocolo de alto rendimento pode utilizar manuseio automatizado de líquidos para qualquer uma e/ou todas as etapas. Métodos de transformação

[00175]Em algumas modalidades, os vetores ou construções da presente revelação podem ser introduzidos nas células hospedeiras (por exemplo, células fúngicas filamentosas ou protoplastos delas derivadas) usando qualquer uma de diversas técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção viral, pistolas de genes ou transferência de genes mediada por Ti (veja Christie, P.J., e Gordon, J.E., 2014 “The Agrobacterium Ti Plasmids” Microbiol SPectr. 2014; 2 (6); 10.1128). Métodos particulares incluem transfecção co, fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana, lipofecção ou eletroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., 1986 “Basic Methods in Molecular Biology”). Outros métodos de transformação incluem, por exemplo, transformação com acetato de lítio e eletroporação; veja, por exemplo, Gietz e cols., Nucleic Acids Res. 27: 69-74 (1992); Ito e cols., J. Bacterol. 153: 163-168 (1983); e Becker e Guarente, Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991). Em algumas modalidades, as células hospedeiras transformadas são referidas como cepas hospedeiras recombinantes.

[00176]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina a transformação de células de alto rendimento com o uso de uma plataforma robótica em placa de 96 poços e máquinas de manuseio de líquidos como, por exemplo, aquela descrita em 62/515.907, depositado em 6 de junho de 2017.

[00177]Em uma modalidade, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo require a transferência de ácidos nucleicos (por exemplo, fusão promotor heterólogo-gene de morfologia-alvo ou SNP como, por exemplo, da Tabela 3 ou Tabela 4) para protoplastos derivados de células fúngicas filamentosas como descritas nesse relatório descritivo. Em outra modalidade, a transformação utilizada pelos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo é do tipo alto rendimento e/ou é parcialmente ou totalmente automatizada, como descrito nesse relatório descritivo. O método parcialmente ou totalmente automatizado pode envolver o uso de manuseio automatizado de líquidos em uma ou mais etapas de manuseio de líquidos, como fornecido nesse relatório descritivo. Além dessa modalidade, a transformação é realizada por adição de construções ou construções de expressão como descritas nesse relatório descritivo aos poços de uma placa de microtitulação, seguida por divisão em alíquotas dos protoplastos gerados pelos métodos fornecidos nesse relatório descritivo a cada poço da placa de microtitulação. Procedimentos adequados para transformação/transfecção de protoplastos podem ser qualquer um conhecido na técnica incluindo, por exemplo, aqueles descritos nos Pedidos internacionais de Patente PCT/NL99/00618, PCT/EP99/202516, Finkelstein e Ball (eds.), “Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and products”, Butterworth-Heinemann (1992), Bennett e Lasure (eds.) “More Gene Manipulations in Fungi”, Academic Press (1991), Turner, em: Puhler (ed), “Biotechnology”, Segunda Edição Completamente Revisada, VHC (1992); fusão de protoplasto, e a transformação de protoplastos mediada por Ca-PEG, como descrito em EP635574B. Alternativamente, a transformação das células hospedeiras fúngicas filamentosas ou protoplastos delas derivados também pode ser realizada por eletroporação como, por exemplo, a eletroporação descrita por Chakraborty e Kapoor, Nucleic Acids Res. 18:

6.737 (1990); transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens , introdução biolística de DNA como, por exemplo, como descrito em Christiansen e cols., Curr. Genet. 29: 100 102 (1995); Durand e cols., Curr. Genet. 31: 158-161 (1997); e Barcellos e cols., Can. J. Microbiol. 44: 1.137-1.141 (1998) ou transfecção “magneto-biolística” de células como, por exemplo, descrito nas Patentes U.S. Nos 5.516.670 e

5.753.477. Em uma modalidade, o procedimento de transformação usado nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo é um passível de ser de alto rendimento e/ou automatizado, como fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, transformação mediada por PEG.

[00178]A transformação dos protoplastos gerados usando os métodos descritos nesse relatório descritivo pode ser facilitada por meio do uso de qualquer reagente de transformação conhecido na técnica. Reagentes de transformação adequados podem ser selecionados de Polietileno Glicol (PEG), FUGENE® HD (de Roche), Lipofectamina® ou OLIGOFECTAMINE® (de Invitrogen), TRANSPASS®D1 (de New England Biolabs), LYPOVEC® ou LIPOGEN® (de Invivogen). Em uma modalidade, PEG é o reagente de transformação/transfecção mais preferido. PEG está disponível em diferentes pesos moleculares e pode ser usado em diferentes concentrações. De preferência, PEG 4000 é usado entre 10% e 60%, mais preferivelmente entre 20% e 50%, principalmente a 40%. Em uma modalidade, o PEG é adicionado aos protoplastos antes do armazenamento, como descrito nesse relatório descritivo. Looping Out de sequências selecionadas

[00179]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina métodos de looping out de regiões de DNA selecionadas dos organismos hospedeiros. O método de looping out pode ser como descrito em Nakashima e cols. 2014 “Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing”. Int. J. Mol. Sci. 15(2), 2.773-2.793. Em algumas modalidades, a presente revelação ensina o looping out de marcadores de seleção de transformantes positivos. As metodologias de deleção looping out são conhecidas na técnica, e são descritas em (Tear e cols. 2014 “Excision of Unstable Artificial Gene-Specific Inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli”. Appl. Biochem. Biotech. 175: 1.858-1.867). Os métodos de looping out usados nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem ser realizados usando recombinação homóloga de cruzamento único ou recombinação homóloga de cruzamento duplo. Em uma modalidade, o looping out de regiões selecionadas, como descrito nesse relatório descritivo, pode envolver o uso de recombinação homóloga de cruzamento único, como descrito nesse relatório descritivo.

[00180]Primeiro, construções de loop out são inseridas em regiões-alvo selecionadas dentro do genoma do organismo hospedeiro (por exemplo, por meio de recombinação homóloga, CRISPR, ou outra técnica de edição gênica). Em uma modalidade, recombinação homóloga de cruzamento duplo é usada entre uma construção ou construções e o genoma da célula hospedeira a fim de integrar a construção ou construções, como retratado na FIG. 6. A construção ou construções inseridas podem ser projetadas com uma sequência que é uma repetição direta de uma sequência do hospedeiro existente ou introduzida nas proximidades, de modo que as repetições diretas flanqueiem a região de DNA coberta para looping-out e deleção.

Em uma modalidade, a construção para uso no processo de retirada da alça compreende uma forma mutada de um gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar no controle ou que afeta a divisão de morfologia entre repetições diretas que flanqueiam um gene marcador selecionável (por exemplo, gene pyrG na FIG. 6). Em outra modalidade, a construção para uso no processo de retirada da alça compreende um gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar no controle ou que afeta a morfologia ligado operacionalmente a uma divisão de promotor heterólogo entre repetições diretas que flanqueiam um gene marcador selecionável (por exemplo, gene pyrG na FIG. 6). Ainda em outra modalidade, a construção para uso no processo de retirada da alça compreende uma forma mutada de um gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar no controle ou que afeta a morfologia ligado operacionalmente a uma divisão de promotor heterólogo entre repetições diretas que flanqueiam um gene marcador selecionável (por exemplo, gene pyrG na FIG. 6). Em cada uma das modalidades, como mostrado na FIG. 6, as repetições diretas podem ser flanqueadas por uma sequência que facilita que a sequência seja integrada em um lócus específico (por exemplo, o lócus para o gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar no controle ou que afeta a morfologia) no genoma da célula hospedeira.

O gene que comprovadamente participa ou suspeito de participar no controle ou que afeta a morfologia pode ser qualquer gene desse tipo fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, o gene SLN1 de S. cerevisiae, o gene nik1 de N. crassa ou um ortólogo destes (por exemplo, um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa). Em uma modalidade, o gene SLN1/nik1 ou ortólogo deste pode compreender uma perturbação genética.

A perturbação genética pode ser uma mutação como, por exemplo, um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Em uma modalidade, a forma mutada desse gene pode ser o ortólogo de A. niger do gene de S. cerevisiae ou N. crassa com a sequência de ácidos nucleicos de FungiSNP_18 (ou seja, ID.

DE SEQ.

Nº: 7). Em outra modalidade, o gene ou cada um dos vários genes que comprovadamente participam ou suspeitos de participar no controle ou que afetam a morfologia pode ser qualquer gene ou genes de uma via de resposta osmótica de uma célula hospedeira fúngica filamentosa como, por exemplo, um ortólogo ou ortólogos de um gene ou genes de uma via de resposta osmótica de leveduras listados na Tabela 7. Outros exemplos de genes que comprovadamente participam ou suspeitos de participar no controle ou que afetam a morfologia podem ser as versões do tipo selvagem dos genes de A. niger com uma sequência de ácidos nucleicos do ID.

DE SEQ.

Nº: 5, 6 ou 8 (por exemplo, ácido nucleico ID.

DE SEQ.

Nº: 77, 78 ou 79) ou ortólogos destes.

O promotor heterólogo pode ser qualquer promotor fornecido nesse relatório descritivo.

Em uma modalidade, o promotor heterólogo é selecionado da Tabela 2. Uma vez inserida, as células que contêm a construção ou construções de loop out podem ser contra-selecionadas para deleção da região de seleção (por exemplo, veja a FIG. 7; ausência de resistência ao gene marcador selecionável).

[00181]Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a descrição do procedimento de loop out representa apenas um método ilustrativo para a deleção de regiões indesejadas de um genoma. Na verdade, os métodos da presente revelação são compatíveis com qualquer método para deleções de genoma incluindo, sem limitação, edição gênica por meio de CRISPR, TALENS, FOK, ou outras endonucleases. Aqueles habilitados na técnica também reconhecerão a habilidade para substituir regiões indesejadas do genoma por meio de técnicas de recombinação homóloga. Construções para transformação

[00182]Em uma modalidade, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo englobam a transformação ou transfecção de células fúngicas filamentosas ou protoplastos delas derivados com pelo menos um ácido nucleico. A transformação ou transfecção pode ser por utilização dos métodos e reagentes descritos nesse relatório descritivo. A geração dos protoplastos pode ser realizada com o uso de qualquer um dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo. A geração e/ou transformação de protoplastos pode ser de alto rendimento e/ou automatizada, como fornecido nesse relatório descritivo. O ácido nucleico pode ser DNA, RNA ou cDNA. O ácido nucleico pode ser um polinucleotídeo. O ácido nucleico ou polinucleotídeo para uso na transformação de uma célula fúngica filamentosa ou protoplasto dela derivado usando os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo pode ser um gene endógeno ou um gene heterólogo em relação à cepa variante e/ou à cepa parental.

O gene endógeno ou gene heterólogo pode compreender uma mutação e/ou estar sob o controle ou ligado operacionalmente a um ou mais elementos de controle genético ou regulatórios.

Como fornecido nesse relatório descritivo, o gene endógeno ou gene heterólogo pode codificar uma proteína que comprovadamente participa ou suspeita de participar no controle ou que afeta a morfologia.

Por exemplo, o gene pode ser um gene SLN1 de S. cerevisiae, um gene nik1 de N. crassa ou um ortólogo destes (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa) e/ou qualquer gene dentro da mesma via (por exemplo, qualquer gene ou ortólogo deste selecionado dos genes da via de resposta osmótica encontrados na Tabela 7). A mutação pode ser qualquer mutação fornecida nesse relatório descritivo como, por exemplo, uma inserção, deleção, substituição e/ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Os (um ou mais) elementos de controle genético ou regulatórios podem ser uma sequência promotora e/ou uma sequência terminadora.

O gene endógeno ou gene heterólogo pode estar presente em uma construção de expressão ou dividido através de múltiplas construções de expressão.

Quando dividido através de múltiplas construções de expressão, cada porção do gene endógeno ou gene heterólogo pode compreender uma mutação e/ou estar sob o controle ou ligado operacionalmente a um ou mais elementos de controle genético ou regulatórios.

Em uma modalidade, um gene endógeno ou gene heterólogo é bipartite, em que o referido gene endógeno ou gene heterólogo é dividido em duas porções, de modo que cada uma das referidas duas porções esteja presente em uma construção separada. Em uma modalidade, o gene é FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5), FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 6), FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) ou FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 8). Em outra modalidade, o gene é FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5), FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 6), FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) ou FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 8) fundido ou ligado operacionalmente a qualquer um dos promotores da Tabela 2. Em uma modalidade, o gene é FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7). Em outra modalidade, o gene é FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) fundido ou ligado operacionalmente ao promotor man8p ou amy8p da Tabela 2. Em outra modalidade, o gene é wt ou não-SNP FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 77), wt ou não-SNP FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 78), wt ou não-SNP FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 76) ou wt ou não-SNP FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 79). Em outra modalidade, o gene é wt ou não-SNP FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 77), wt ou não-SNP FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 78), wt ou não-SNP FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 76) ou wt ou não-SNP FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 79) fundido ou ligado operacionalmente a qualquer um dos promotores da Tabela 2. Em uma modalidade, o gene é wt ou não-SNP FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 14 ou 76). Em outra modalidade, o gene é FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 14 ou 76) fundido ou ligado operacionalmente ao promotor man8p ou amy8p da Tabela 2.

[00183]Em uma modalidade, um protoplasto gerado por uma célula fúngica filamentosa é co-transformado com dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos. Além dessa modalidade, pelo menos um dos dois ou mais polinucleotídeos é um gene endógeno ou um gene heterólogo em relação à cepa fúngica filamentosa da qual o protoplasto foi gerado e pelo menos um dos dois ou mais polinucleotídeos é um gene para um marcador selecionável. Como fornecido nesse relatório descritivo, o gene endógeno ou gene heterólogo pode codificar uma proteína que comprovadamente participa ou suspeita de participar no controle ou que afeta a morfologia. Por exemplo, o gene pode ser um gene SLN1 de S. cerevisiae, um gene nik1 de N. crassa ou um ortólogo destes (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa) e/ou qualquer gene dentro da mesma via (por exemplo, qualquer gene ou ortólogo deste selecionado dos genes da via de resposta osmótica encontrados na Tabela 7). O gene marcador selecionável pode ser qualquer marcador selecionável como fornecido nesse relatório descritivo. Como descrito nesse relatório descritivo, cada um dos dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos pode ser dividido em porções separadas, de modo que cada porção separada esteja presente em uma construção separada.

[00184]Em uma modalidade, cada ácido nucleico ou polinucleotídeo para uso na transformação ou transfecção de uma célula fúngica filamentosa ou protoplasto dela derivado compreende uma sequência homóloga à sequência de DNA presente em um lócus-alvo predeterminado do genoma da célula fúngica filamentosa ou protoplasto dela derivado que deve ser transformado em uma extremidade 5’, uma extremidade 3’ ou tanto uma extremidade 5’ quanto uma extremidade 3’ do ácido nucleico ou polinucleotídeo. O ácido nucleico ou polinucleotídeo pode ser um gene endógeno ou gene heterólogo em relação à célula fúngica filamentosa usada para transformação ou um gene marcador selecionável, de modo que a sequência homóloga a um lócus predeterminado na célula hospedeira fúngica filamentosa genoma flanqueie o gene endógeno, heterólogo ou de marcador selecionável.

Como fornecido nesse relatório descritivo, o gene endógeno ou gene heterólogo pode codificar uma proteína que comprovadamente participa ou suspeita de participar no controle ou que afeta a morfologia.

Por exemplo, o gene pode ser um gene SLN1 de S. cerevisiae, gene nik1 de N. crassa ou um ortólogo destes (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa) e/ou qualquer gene dentro da mesma via (por exemplo, qualquer gene ou ortólogo deste selecionado dos genes da via de resposta osmótica encontrados na Tabela 7). Em uma modalidade, cada ácido nucleico ou polinucleotídeo é clonado em um vetor de clonagem com o uso de qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, pBLUESCRIPT® (Stratagene). Vetores de clonagem adequados podem ser aqueles que são capazes de se integrar no lócus-alvo predeterminado nos cromossomos da célula hospedeira fúngica filamentosa usada.

Vetores de clonagem integrativos preferidos podem compreender um fragmento de DNA, que é homólogo à sequência de DNA a ser deletada ou substituída para direcionamento da integração do vetor de clonagem a esse lócus predeterminado.

A fim de promover a integração direcionada, o vetor de clonagem pode ser linearizado antes da transformação da célula hospedeira ou protoplastos dela derivados.

De preferência, a linearização é realizada de tal modo que pelo menos uma, mas preferivelmente uma das extremidades do vetor de clonagem seja flanqueada por sequências homólogas à sequência de DNA a ser deletada ou substituída.

Em alguns casos, trechos homólogos curtos de DNA podem ser adicionados, por exemplo, por meio de PCR, em ambos os lados do ácido nucleico ou polinucleotídeo a ser integrado.

O comprimento das sequências homólogas que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos ou de polinucleotídeos a ser integrada é preferivelmente menor do que 2 kb, ainda mais preferivelmente menor do que 1 kb, ainda mais preferivelmente menor do que 0,5 kb, ainda mais preferivelmente, menor do que 0,2 kb, ainda mais preferivelmente, menor do que 0,1 kb, ainda mais preferivelmente, menor do que 50 bp e, principalmente, menor do que 30 bp.

O comprimento das sequências homólogas que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos ou de polinucleotídeos a ser integrada pode variar de cerca de 30 bp até cerca de 1.000 bp, de cerca de 30 bp até cerca de 700 bp, de cerca de 30 bp até cerca de 500 bp, de cerca de 30 bp até cerca de 300 bp, de cerca de 30 bp até cerca de 200 bp, e de cerca de 30 bp até cerca de 100 bp.

Os ácidos nucleicos ou polinucleotídeos para uso na transformação de células fúngicas filamentosas ou protoplastos delas derivados pode estar presente como cassetes de expressão.

Em uma modalidade, o vetor de clonagem é pUC19. Além dessa modalidade, um vetor de clonagem que contém uma sequência marcadora como fornecida nesse relatório descritivo pode estar associado com a sequência de direcionamento por produção da construção por meio da utilização de uma montagem de Gibson, como conhecida na técnica.

Alternativamente, a sequência de direcionamento pode ser adicionada por PCR de fusão.

A sequência de direcionamento para co-transformação que não está ligada a um marcador pode ser amplificada a partir de DNA genômico.

[00185]Em teoria, todos os loci no genoma de fungos filamentosos poderiam ser escolhidos para integração direcionada dos cassetes de expressão que compreendem ácidos nucleicos ou polinucleotídeos fornecidos nesse relatório descritivo. De preferência, o lócus no qual o direcionamento ocorrerá é tal que, quando o gene do tipo selvagem presente nesse lócus foi substituído pelo gene contido na cassete de expressão, o mutante obtido exibirá uma alteração detectável por certo ensaio como, por exemplo, um esquema de seleção/contra-seleção como descrito nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, os protoplastos gerados de células fúngicas filamentosas como descritas nesse relatório descritivo são co-transformados com uma primeira construção ou cassete de expressão e uma segunda construção ou cassete de expressão, de modo que a primeira construção ou cassete de expressão é projetada para se integrar em um primeiro lócus do genoma do protoplasto, enquanto a segunda construção ou cassete de expressão é projetada para se integrar em um segundo lócus do genoma do protoplasto. Para facilitar a integração no primeiro lócus e segundo lócus, a primeira construção ou cassete de expressão é flanqueado por uma sequência homóloga ao primeiro lócus, enquanto a segunda construção ou cassete de expressão é flanqueado por uma sequência homóloga ao segundo lócus. Em uma modalidade, a primeira construção ou cassete de expressão compreende uma sequência para um gene endógeno, enquanto a segunda construção compreende uma sequência para um gene marcador selecionável. Além dessa modalidade, o segundo lócus contém uma sequência para um gene marcador selecionável adicional presente no genoma do protoplasto usado nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo, enquanto o primeiro lócus contém uma sequência para o gene endógeno- alvo presente no genoma do protoplasto usado nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo.

Em uma modalidade separada, a primeira construção ou cassete de expressão compreende uma sequência para um gene endógeno ou um gene heterólogo, enquanto a segunda construção compreende uma sequência para um primeiro gene marcador selecionável.

Além dessa modalidade separada, o segundo lócus contém uma sequência para um segundo gene marcador selecionável que está presente no genoma do protoplasto usado nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo, enquanto o primeiro lócus contém uma sequência para um terceiro gene marcador selecionável que está presente no genoma do protoplasto usado nos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo.

Em cada uma das modalidades acima, o gene endógeno e/ou gene heterólogo pode compreender uma mutação (por exemplo, SNP) e/ou um elemento de controle genético ou regulatório como fornecido nesse relatório descritivo.

Como fornecido nesse relatório descritivo, o gene endógeno ou gene heterólogo pode codificar uma proteína que comprovadamente participa ou suspeita de participar no controle ou que afeta a morfologia.

Por exemplo, o gene pode ser um gene SLN1 de S. cerevisiae, gene nik1 de N. crassa ou um ortólogo destes (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa) e/ou qualquer gene dentro da mesma via (por exemplo, qualquer gene ou ortólogo deste selecionado dos genes da via de resposta osmótica encontrados na Tabela 7).

Purificação de protoplastos homocarióticos

[00186]Como será observado por aqueles habilitados na técnica, protoplastos derivados de fungos filamentosos podem frequentemente conter mais do que um núcleo, de modo que a transformação subsequente com uma construção (por exemplo, inserto de fragmento de DNA) como fornecida nesse relatório descritivo pode produzir protoplastos que são heterocarióticos, de modo que a construção (por exemplo, inserto de fragmento de DNA) seja incorporada somente em um subconjunto dos vários núcleos presentes no protoplasto. A fim de reduzir o número ou percentagem de protoplastos heterocarióticos após transformação, podem ser empregadas estratégias para aumentar a percentagem de protoplastos mononucleares em uma população de protoplastos derivados de células hospedeiras fúngicas filamentosas antes da transformação como, por exemplo, usando o método descrito em Roncero e cols., 1984, Mutat. Res. 125: 195, cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00187]Ao lado ou em adição ao emprego de estratégias para aumentar o número ou percentagem de protoplastos mononucleares antes da transformação, podem ser empregadas estratégias para dirigir os protoplastos (e as colônias deles derivadas após regeneração dos referidos protoplastos) para serem homocarióticos pós-transformação, independentemente de se eles são mono- ou multinucleados. Como fornecido nesse relatório descritivo, o aumento do número ou da percentagem de protoplastos (e das colônias deles derivadas) que são homocarióticos para um gene-alvo desejado ou de interesse (por exemplo, um gene de morfologia-alvo) pode envolver a submissão das colônias derivadas do protoplasto transformado ou da população de protoplastos transformados à seleção e/ou contra-seleção com base na presença e/ou ausência de um ou mais marcadores selecionáveis. Os (um ou mais) marcadores selecionáveis podem ser qualquer marcador selecionável ou combinação de marcadores selecionáveis, como fornecidos nesse relatório descritivo, e o esquema de seleção e/ou contra-seleção pode ser qualquer esquema desse tipo, como fornecido nesse relatório descritivo. Identificação de transformantes homocarióticos

[00188]Transformantes homocarióticos produzidos pelos métodos fornecidos nesse relatório descritivo podem ser identificados por meio do uso de avaliação fenotípica, avaliação baseada em sequência ou uma combinação destas. Em outras palavras, avaliação fenotípica, avaliação baseada em sequência ou uma combinação destas pode ser usada para detectar a presença ou ausência de um genótipo parental em uma colônia derivada de um protoplasto após transformação do referido protoplasto com uma construção (por exemplo, inserto de fragmento de DNA). A identificação ou detecção de transformantes homocarióticos pode ocorrer antes e/ou depois da submissão dos referidos transformantes a um esquema de seleção e/ou contra-seleção, como fornecido nesse relatório descritivo, em conjunto com a introdução e/ou perda de um ou mais genes marcadores selecionáveis. A avaliação fenotípica pode ser usada para identificar um transformante com um fenótipo discernível (alteração no crescimento e/ou alteração colorimétrica), enquanto a avaliação baseada em sequência pode ser usada para identificar transformantes com ou sem um fenótipo discernível após transformação e integração de uma construção ou construções, como fornecidas nesse relatório descritivo. Avaliação baseada em sequência

[00189]Como descrita nesse relatório descritivo, a avaliação baseada em sequência pode ser usada para determinar a presença ou ausência de uma construção desejada ou -alvo em um transformante. Dessa forma, o sequenciamento baseado em sequência pode ser usado para avaliar se ocorreu ou não a integração de um gene ou construção desejada em um transformante específico. A avaliação baseada em sequência pode ser usada para determinar a percentagem de núcleos em uma célula multinucleada ou população de células multinucleadas que contêm um gene, mutação ou construção desejada. Além disso, a avaliação baseada em sequência pode ser usada para determinar a percentagem de uma população de transformantes que apresentaram a integração de um alvo desejado. A construção pode ser qualquer construção ou diversas construções, como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, os resultados da avaliação baseada em sequência podem ser usados para selecionar esquemas de purificação (por exemplo, purificação homocariótica) se a percentagem ou proporção de núcleos que compreendem um gene, mutação ou construção desejada vs. núcleos desprovidos do referido gene, mutação ou construção desejada está abaixo de certo limiar.

[00190]Em geral, a avaliação baseada em sequência pode envolver o isolamento de transformantes que podem conter uma mutação ou construção desejada. Cada transformante pode conter um ou diversos núcleos, de modo que um ou cada um dos diversos núcleos contém fragmentos de ácido nucleico (por exemplo, uma ou mais construções ou genes que compreendem uma mutação) introduzidos durante a transformação. A transformação pode consistir em transformações direcionadas de protoplastos com fragmentos de DNA específicos (por exemplo, uma ou mais construções ou genes que compreendem uma mutação), como fornecido nesse relatório descritivo.

[00191]Em alguns casos, após isolamento, a avaliação baseada em sequência envolve a propagação dos transformantes que contêm uma mistura de núcleos tanto com o gene-alvo (construção introduzida) quanto com o gene do tipo selvagem ou parental em meio que transmite a pureza do gene-alvo (ou seja, meios seletivos), ou pode ser completamente não seletiva para qualquer fenótipo ou traço particular gerando, dessa forma, colônias derivadas dos transformantes. Em uma modalidade, cada transformante isolado ou uma porção de uma colônia dele derivada é transferido ou colocado em um poço de uma placa de microtitulação como, por exemplo, uma Omnitray que compreende ágar, em que o transformante ou uma porção de uma colônia dele derivada esporula. A placa de microtitulação pode ser uma placa de microtitulação de 96 poços, 384 poços ou 1.536 poços.

[00192]Após isolamento, isoladamente ou em combinação com propagação, ácido nucleico (por exemplo, DNA) pode ser extraído do transformante ou colônias ou esporos dele derivadas. O isolamento de ácido nucleico pode ser de esporos derivados de transformantes e pode ser realizado em um formato de placa de microtitulação, e pode utilizar manuseio automatizado de líquidos. A extração do ácido nucleico pode ser realizada usando qualquer método conhecido de extração de ácido nucleico conhecido na técnica e/ou um kit disponível comercialmente como, por exemplo, PrepmanTM (Thermo Fischer Scientific). Em uma modalidade, a extração do ácido nucleico de esporos derivados de transformantes é realizada usando um método preparativo por fervura que permite a amplificação de DNA. O método preparativo por fervura pode incluir a inoculação de esporos em uma pequena quantidade de meio de crescimento. Em uma modalidade, os esporos são separados em 96 poços e uma placa adequada para PCR, em que cada poço compreende uma pequena quantidade de meio de crescimento. Pode ser permitido que os esporos cresçam por 10 a 16 horas, o que pode ajudar a fazer com que os esporos descartem pigmentos que possam inibir a PCR. Adicionalmente, o crescimento também pode facilitar várias rodadas de divisão nuclear, o que pode servir para aumentar o teor de DNA genômico de cada poço. Subsequentemente, as “mini culturas” de um dia para o outro podem então ser suplementadas com um tampão que ajuda na lise da célula, bem como estabiliza o DNA que será liberado durante a lise. Um exemplo de um tampão adequado pode ser PrepMan Ultra (Thermo Fisher). Outros exemplos de tampões adequados podem incluir soluções tamponadas Tris que contêm uma pequena quantidade de detergente iônico. As misturas de mini cultura-tampão podem então ser aquecidas em um termociclador até 99°C por qualquer um de uma faixa de tempos de incubação entre 15 minutos e 1 hora.

[00193]Após extração de ácido nucleico, avaliação baseada em sequência pode ser realizada para avaliar a percentagem ou proporção de núcleos-alvo ou mutantes que compreendem um gene-alvo ou construção introduzida em núcleos parentais (ou seja, núcleos não transformados). A avaliação baseada em sequência pode ser qualquer método conhecido na técnica que possa ser usado para determinar ou detectar a sequência de um ácido nucleico. O método usado para realizar a avaliação baseada em sequência pode ser selecionado de métodos de sequenciamento de ácido nucleico ou ensaios e métodos baseados em hibridização. O ensaio ou técnica de sequenciamento de ácido nucleico utilizado pelos métodos fornecidos nesse relatório descritivo pode ser um sistema ou ensaio de sequenciamento de próxima geração (NGS). O ensaio baseado em hibridização para detecção de uma sequência de ácidos nucleicos particular pode englobar o uso de microarranjos ou do sistema nCounter (Nanostring). Antes da realização da avaliação baseada em sequência, o ácido nucleico extraído pode ser amplificado usando PCR com par (ou pares) de iniciadores dirigidos ao gene-alvo.

[00194]Em modalidades que utilizam metodologias de sequenciamento de ácido nucleico, os pares de iniciadores utilizados na PCR podem compreender sequências adaptadoras que podem ser subsequentemente usadas em uma amplificação secundária com o uso de iniciadores de indexação codificada. Os amplicons gerados pela reação de amplificação secundária podem então ser sequenciados com o uso de sequenciamento multiplex com iniciadores de sequenciamento direcionados aos iniciadores indexados codificados. O sequenciamento pode ser realizado usando qualquer tipo de sequenciamento conhecido na técnica. Em uma modalidade, o sequenciamento é sequenciamento de próxima geração (NGS). O NGS pode ser qualquer método de NGS conhecido na técnica como, por exemplo, Illumina NGS. Os dados das reações de sequenciamento multiplex podem então ser usados para determinar a presença ou ausência dos núcleos-alvo. Em alguns casos, os dados das reações de sequenciamento multiplex também podem ser usados para determinar a proporção de núcleos parentais para núcleos mutantes para um transformante dentro do poço-alvo. Além dessa modalidade, uma curva-padrão pode ser gerada a fim de quantificar a percentagem ou proporção de núcleos parentais para mutantes. A curva-padrão pode ser gerada por amplificação e sequenciamento de ácido nucleico isolado de cepas que contêm proporções conhecidas núcleos parentais para mutantes e subsequentemente utilização da proporção de amplicons parentais para mutantes que aparecem na proporção conhecida para determinar uma aproximação da pureza de uma amostra de teste. As cepas usadas para gerar a curva-padrão podem ser processadas (por exemplo, isoladas, propagadas e extraídas) no mesmo conjunto de placas que a amostra de teste.

[00195]Em uma modalidade, o sequenciamento baseado em sequência é usado após seleção e/ou contra-seleção a fim de avaliar ou determinar o estado homocariótico de cada transformante. O sequenciamento baseado em sequência pós- seleção e/ou -contra-seleção pode usar sequenciamento multiplex como descrito nesse relatório descritivo e pode ser automatizado ou semiautomatizado. O sequenciamento baseado em sequência pós-seleção e/ou -contra-seleção também pode utilizar a geração de uma curva-padrão como descrito nesse relatório descritivo como um meio para determinar a presença e/ou quantidade (por exemplo, proporção) em que um transformante é heterocariótico. Uso de avaliação baseada em sequência para determinar a pureza de transformantes

[00196]Como discutido nesse relatório descritivo, protoplastos gerados por células hospedeiras cenocíticas (por exemplo, células hospedeiras fúngicas filamentosas) nos métodos, sistemas e fluxos de trabalho fornecidos nesse relatório descritivo podem ser multinucleados.

Subsequentemente, protoplastos transformados com uma ou mais construções, tais como aquelas fornecidas nesse relatório descritivo, podem conter apenas uma porção ou percentagem de seus vários núcleos com uma construção ou construções particulares integradas em seu genoma.

Dependendo da natureza das construções transformadas, colônias derivadas do protoplasto transformado podem não produzir um fenótipo discernível em função da presença da população mista de núcleos presente na colônia.

Consequentemente, o uso de avaliação baseada em sequência pode ser essencial para determinação da percentagem dos núcleos em uma população mista de núcleos que contêm uma construção ou construções desejadas vs. aqueles que não contêm uma construção ou construções desejadas.

Em uma modalidade, avaliação baseada em NGS é usada para identificar transformantes ou cepas deles derivadas que contêm uma percentagem desejada de núcleos com uma construção ou construções introduzidas.

A percentagem desejada pode ser uma percentagem-limite, pela qual transformantes ou cepas deles derivadas na referida percentagem-limite ou acima dela produzem um traço desejado (por exemplo, morfologia de pellet). A percentagem desejada pode ser 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%. A percentagem pode ser determinada por utilização de uma curva-padrão, como descrito nesse relatório descritivo.

Avaliação fenotípica

[00197]Como descrito nesse relatório descritivo, a avaliação fenotípica pode ser usada em combinação com a avaliação baseada em sequência ou transformantes. Em alguns casos, os resultados da avaliação baseada em sequência podem ser usados para determinar esquemas de purificação a fim de assegurar o isolamento de transformantes homocarióticos. Além disso, a avaliação baseada em sequência pode ser utilizada após avaliação fenotípica/purificação a fim de avaliar se os isolados obtidos por avaliação fenotípica/purificação são homocarióticos.

[00198]A avaliação fenotípica de transformantes gerados com o uso dos métodos, composições ou sistemas fornecidos nesse relatório descritivo pode empregar o uso de um ou mais marcadores selecionáveis. Um marcador selecionável pode frequentemente codificar um produto gênico que fornece um tipo específico de resistência estranho à cepa não transformada. Esta pode ser resistência a metais pesados, antibióticos ou biocidas em geral. Prototrofia também pode ser um marcador selecionável útil da variedade não- antibiótica. Marcadores auxotróficos podem gerar deficiências nutricionais nas células hospedeiras, e genes que corrigem essas deficiências podem ser usados para seleção.

[00199]Há uma gama faixa de marcadores de seleção em uso na técnica e qualquer um ou todos esses podem ser aplicados aos métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo. Os genes marcadores selecionáveis para uso nesse relatório descritivo podem ser marcadores auxotróficos, marcadores prototróficos, marcadores dominantes, marcadores recessivos, marcadores de resistência antibiótica, marcadores catabólicos, marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, ou combinações destes. Exemplos desses incluem, sem limitação: amdS (acetamida/fluoracetamida), ble (resistência à bleomicina- fleomicina), hyg (higromicina R), nat (nourseotricina R), pyrG (uracil/5FOA), niaD (nitrato/clorato), sutB (sulfato/selenato), eGFP (Proteína Fluorescente Verde) e todas as diferentes variantes de cor, aygA (marcador colorimétrico), met3 (metionina/selenato), pyrE (orotato P- ribosil transferase), trpC (antranilato sintase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), acetolactato mutante sintase (resistência à sulfoniluréia) e neomicina fosfotransferase (resistência ao aminoglicosídeo).

[00200]Outra modalidade da presente revelação envolve o uso de dois ou mais marcadores de seleção ativos em fungos filamentosos. Há uma ampla gama de combinações de marcadores de seleção que podem ser usados e todos esses podem ser aplicados no esquema de seleção/contra-seleção fornecido nesse relatório descritivo. Por exemplo, o esquema de seleção/contra-seleção pode utilizar uma combinação de marcadores auxotróficos, marcadores prototróficos, marcadores dominantes, marcadores recessivos, marcadores de resistência antibiótica, marcadores catabólicos, marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes e marcadores luminescentes. Um primeiro marcador pode ser usado para selecionar no modo para frente (ou seja, se ocorreu a integração ativa), enquanto marcadores adicionais podem ser usados para selecionar no modo reverso (ou seja, se a integração ativa no lócus correto ocorreu). A seleção/contra-seleção pode ser realizada por co- transformação, de modo que um marcador de seleção possa estar em um vetor separado ou possa estar o mesmo fragmento de ácido nucleico ou vetor que o gene endógeno ou heterólogo, como descrito nesse relatório descritivo.

[00201]Em uma modalidade, o esquema de purificação de protoplasto homocariótico da presente revelação envolve a co-transformação de protoplastos gerados por células hospedeiras fúngicas filamentosas com uma primeira construção que compreende uma sequência para um gene morfológico endógeno ou um gene morfológico heterólogo e uma segunda construção que compreende uma sequência para um primeiro gene marcador selecionável, de forma que a primeira construção é dirigida a um primeiro lócus do genoma do protoplasto que compreende uma sequência para um gene-alvo a ser removido ou inativado, enquanto a segunda construção é dirigida a um segundo lócus do genoma do protoplasto que compreende uma sequência para um segundo gene marcador selecionável. Em uma modalidade, a primeira construção compreende uma sequência para um gene endógeno ou um gene heterólogo e o gene-alvo a ser removido ou inativado é para um terceiro gene marcador selecionável. Em uma modalidade separada, a primeira construção compreende uma sequência para um gene endógeno e o gene-alvo a ser removido ou inativado é a cópia do gene endógeno presente no genoma do protoplasto antes da transformação. Como descrito nesse relatório descritivo, o gene endógeno ou gene heterólogo da primeira construção pode compreender uma mutação (por exemplo, SNP) e/ou um elemento regulatório genético ou de controle (por exemplo, promotor e/ou terminador). O primeiro, segundo e/ou terceiro marcadores selecionáveis podem ser quaisquer marcadores auxotróficos, marcadores prototróficos, marcadores dominantes, marcadores recessivos, marcadores de resistência antibiótica, marcadores catabólicos, marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes conhecidos na técnica e/ou descritos nesse relatório descritivo. Para serem direcionadas a um lócus específico, cada uma das construções é flanqueada por nucleotídeos homólogos ao lócus desejado no genoma do protoplasto, como descrito nesse relatório descritivo.

[00202]Em uma modalidade, a segunda construção compreende um cassete de expressão que codifica um marcador reciclável ou reversível. O marcador reciclável ou reversível pode ser um cassete de expressão de ruptura neo- pyrG-neo. A construção neo-pyrG-neo pode ser co-transformada com a primeira construção, como descrito nas modalidades acima, em uma cepa ura- da célula hospedeira fúngica filamentosa (por exemplo, A. niger) e transformantes homocarióticos podem ser selecionados por plaqueamento em meio deficiente em uracil e seleção de prototróficos de uracil amarelos puros, como descrito acima. Subsequentemente, o uso de seleção de pyrG pode ser regenerado por plaqueamento dos referidos transformantes homocarióticos em meio contendo 5-FOA e seleção de transformantes que cresceram no referido meio de 5-FOA, o que indica que os referidos transformantes passaram por recombinação intracromossômica entre as repetições neo que resulta na excisão do gene pyrG.

[00203]Em uma modalidade adicional, ao invés de utilização de co-transformação, como fornecido nesse relatório descritivo, o esquema de purificação de protoplasto homocariótico da presente revelação envolve a transformação de protoplastos gerados por células hospedeiras fúngicas filamentosas com uma construção de deleção que compreende uma sequência para um gene específico, de modo que a construção é dirigida a um lócus desejado do genoma do protoplasto que compreende uma sequência para um gene-alvo a ser removido ou inativado.

Para serem dirigidas a um lócus específico, as construções são flanqueadas por nucleotídeos homólogos ao lócus desejado no genoma do protoplasto, como descrito nesse relatório descritivo.

O lócus desejado pode ser o lócus de um gene morfológico-alvo ou mutante deste, como fornecido nesse relatório descritivo (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou um mutante deste como, por exemplo, FungiSNP_18 ou qualquer ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae). O uso desse tipo de construção/transformação pode ser feito para fornecer informação sobre o papel que um gene particular desempenha na morfologia da célula ou cepa hospedeira transformada.

Em uma modalidade, a confirmação da integração correta da construção de deleção no genoma do protoplasto é feita por sequenciamento do genoma do protoplasto usando, por exemplo, sequenciamento de próxima geração (NGS). O sistema ou método de NGS usado pode ser qualquer sistema ou método de NGS conhecido na técnica como, por exemplo, Illumina NGS.

Em um caso, a célula hospedeira fúngica filamentosa é pyrG-negativa e a construção de deleção compreende um gene marcador selecionável, enquanto o gene-

alvo é um gene morfológico-alvo ou mutante deste, como fornecido nesse relatório descritivo (por exemplo, ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou um mutante deste, por exemplo, FungiSNP_18 ou qualquer ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae). Consequentemente, a purificação de protoplasto transformantes homocarióticos envolve o crescimento dos referidos transformantes em meios mínimos desprovidos de uracil. Em outro caso, a célula hospedeira fúngica filamentosa é pyrG-positiva e a construção de deleção compreende um SNP (por exemplo, SNP da Tabela 3 ou Tabela 4 de uma fusão entre um promotor da Tabela 2 e um SNP da Tabela 3 ou Tabela 4), enquanto o gene-alvo é um gene marcador selecionável. Consequentemente, a purificação de protoplasto transformantes homocarióticos envolve o crescimento dos referidos transformantes em meios mínimos que compreendem FOA.

[00204]Ainda em outra modalidade, um gene morfológico- alvo mutado (por exemplo, um SNP da Tabela 3 ou Tabela 4) é integrado em um lócus-alvo (por exemplo, o lócus do gene morfológico-alvo) no genoma de um organismo cenocítico (por exemplo, fungos filamentosos como, por exemplo, A. niger) por meio de transformação e integração de múltiplas porções do gene mutado, de forma que as múltiplas porções do gene mutado estejam presentes em uma construção separada. Cada uma das múltiplas construções pode compreender uma porção única do gene mutado mais uma porção sobreposta do gene mutado que também está presente em uma das outras múltiplas construções a fim de facilitar a recombinação dos múltiplas construções para produzir uma cópia funcional do gene mutado no genoma do organismo. Para facilitar a integração de cada porção do gene mutado no lócus desejado do organismo, cada uma das múltiplas construções pode ainda compreender nucleotídeos homólogos ao lócus desejado no genoma do organismo que flanqueiam a porção do gene mutado na construção.

Em alguns casos, o gene mutado é dividido através de duas construções e é introduzido no organismo por meio de transformação bipartite das duas construções.

Um exemplo desse conceito é retratado na FIG. 6. Como mostrado na FIG. 6, o gene marcador pyrG é dividido em duas construções, de modo que cada uma das construções compreenda uma porção única do pyrG e uma porção que se sobrepõe à outra construção.

Além disso, cada construção ainda compreende uma sequência homóloga ao gene marcador aygA no genoma do organismo hospedeiro que flanqueia uma repetição terminadora (por exemplo, repetição direta (DR)) que compreende uma sequência de um gene morfológico-alvo que flanqueia a porção única do gene marcador pyrG.

O gene morfológico-alvo pode ser uma forma mutante (por exemplo, compreender um SNP) ou uma forma do tipo selvagem.

O gene morfológico-alvo pode ser uma forma mutante (por exemplo, compreender um SNP) ou uma forma do tipo selvagem que pode ser fundida a um promotor heterólogo (por exemplo, promotor da Tabela 2). A recombinação das duas construções após transformação com o uso de qualquer um dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo resulta na inserção do gene marcador pyrG inteiro compreendendo as duas DRs.

Transformantes que contêm o gene marcador pyrG totalmente integrado e transformantes que perderam o gene marcador pyrG por meio de retirada da alça (como mostrado na FIG. 7) podem ser detectados por meio de seleção/contra- seleção, como descrito nesse relatório descritivo.

Em particular, os loop outs podem ser selecionados por crescimento dos transformantes em meios com FOA.

[00205]Como pode ser compreendido por aqueles habilitados na técnica, os conceitos retratados nas FIGS. 6 e 7 podem ser usados para introduzir combinações de mutações (por exemplo, SNPs) em um gene-alvo e subsequentemente testagem dos efeitos fenotípicos da referida combinação. O efeito fenotípico pode ser a geração de uma cepa ou célula hospedeira que possui um fenótipo morfológico desejado. O fenótipo morfológico desejado pode ser que a referida cepa ou célula hospedeira exiba uma morfologia de pellet, não- micélio, quando desenvolvida em meios de produção sob condições de cultura submersa. A referida cepa ou célula hospedeira pode crescer e esporular normalmente quando desenvolvida em meios sólidos. Além disso, como descrito nesse relatório descritivo, é contemplado que mutações adicionais podem ser introduzidas usando uma técnica similar a fim de construir cepas que contêm combinações de mutações específicas.

[00206]Em uma modalidade adicional, SNPSWP combinatória em fungos (por exemplo, A. niger) é realizada, pela qual múltiplas mutações de um gene-alvo são introduzidas em várias combinações com promotores induzíveis em um genoma do protoplasto pela integração no gene parental de duas construções separadas, cada uma compreendendo uma mutação fundida a um promotor induzível e uma porção de um gene marcador dividido (genes pyrG divergentes) em uma única transformação. Mediante recombinação bem-sucedida entre as porções sobrepostas do respectivo gene pyrG que contém construções e entre as porções homólogas do gene-alvo nas construções e genoma do hospedeiro, a expressão de cada um dos genes pyrG inteiros pode ser controlada por meio de repressão de catabólito por glicose. Consequentemente, os transformantes podem ser selecionados por crescimento dos transformantes em glicose, de modo que o crescimento de transformantes nos quais os eventos de recombinação e integração desejados ocorreram será favorecido. Além disso, os loop outs podem ser facilitados por crescimento dos transformantes em meios com FOA.

[00207]Outra modalidade envolve a integração de uma mutação (por exemplo, SNP) em um gene-alvo (por exemplo, aygA) usando um evento de cruzamento de alça única com uma construção que compreende uma cópia do gene-alvo com uma mutação e um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, gene de resistência a antibiótico (ampR) e gene de marcador auxotrófico (pyrG)). Sistemas automatizados HTP

[00208]Em algumas modalidades, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo para a geração de cepas fúngicas filamentosas ou célula hospedeira que possuem a morfologia de pellet desejada sob condições de cultura submersa compreendem etapas automatizadas. Por exemplo, a geração de protoplastos, transformação de protoplastos e/ou purificação de protoplastos homocarióticos por meio de seleção/contra-seleção como descrito nesse relatório descritivo pode ser automatizada. Como descrito nesse relatório descritivo, os métodos e sistema podem conter uma etapa adicional de avaliação de transformantes homocarióticos purificados para a exibição de morfologia de pellet desejada sob condições de cultura submersa. Os métodos automatizados da revelação podem compreender um sistema robótico. Os sistemas descritos nesse relatório descritivo podem ser geralmente dirigidos ao uso de placas de microtitulação de 96 ou 384 poços, mas, como será observado por aqueles habilitados na técnica, diversas placas ou configurações diferentes podem ser usadas. Além disso, qualquer uma ou todas as etapas descritas nesse relatório descritivo podem ser automatizadas; dessa forma, por exemplo, os sistemas podem ser completamente ou parcialmente automatizados. Os métodos e sistemas automatizados podem ser de alto rendimento. Para os objetivos dessa revelação, avaliação de alto rendimento pode se referir a qualquer método parcial ou totalmente automatizado que seja capaz de avaliar cerca de 1.000 ou mais transformantes por dia e, particularmente, àqueles métodos capazes de avaliar 5.000 ou mais transformantes por dia e, mais particularmente ainda, aos métodos capazes de avaliar 10.000 ou mais transformantes por dia.

[00209]Como descrito nesse relatório descritivo, os métodos e sistema fornecidos nesse relatório descritivo podem compreender uma etapa de avaliação, de modo que um transformante gerado e purificado como descrito nesse relatório descritivo seja avaliado ou testado para a morfologia de pellet desejada em culturas submersas. As cepas ou células hospedeiras geradas que compreendem a morfologia de pellet desejada podem ser subsequentemente usadas para gerar produtos de interesse. O produto de interesse pode ser qualquer produto de interesse fornecido nesse relatório descritivo como, por exemplo, um álcool, produto farmacêutico, metabólito, proteína, enzima, aminoácido ou ácido (por exemplo, ácido cítrico). Consequentemente, os métodos e sistemas fornecidos nesse relatório descritivo podem ainda compreender o cultivo de uma colônia ou cultura clonal que compreende a morfologia de pellet desejada purificada de acordo com os métodos da invenção, sob condições que permitem a expressão e secreção do produto de interesse e recuperação do produto de interesse subsequentemente produzido. Como descrito nesse relatório descritivo, o produto de interesse pode ser uma proteína exógena e/ou heteróloga ou um metabólito produzido como o resultado da expressão de uma proteína exógena e/ou heteróloga.

[00210]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação compreendem um ou mais módulos de trabalho. Por exemplo, em algumas modalidades, o sistema automatizado da presente revelação compreende um módulo de síntese de DNA, um módulo de clonagem de vetor, um módulo de transformação de cepa, um módulo de avaliação e um módulo de sequenciamento.

[00211]Como será observado por aqueles habilitados na técnica, um sistema automatizado pode incluir uma ampla variedade de componentes incluindo, sem limitação: manipuladores de líquidos; um ou mais braços robóticos; manipuladores de placas para o posicionamento de microplacas; seladoras de placas, perfuradores de placas, manipuladores automatizados de tampas para remover e substituir as tampas para poços em placas de não contaminação cruzada; montagens de pontas descartáveis para distribuição de amostra com pontas descartáveis; montagens laváveis de pontas para distribuição de amostra; blocos de carregamento de 96 poços; cicladores térmicos integrados; prateleiras de reagentes resfriadas; posições de pipeta de placa de microtitulação (opcionalmente resfriadas); torres de empilhamento para placas e pontas; estações de processamento de glóbulos magnéticos; sistemas de filtrações; agitadoras de placas; leitores e aplicadores de códigos de barras; e sistemas de computador.

[00212]Em algumas modalidades, os sistemas robóticos da presente revelação incluem o manuseio automatizado de líquidos e partículas que permite a pipetagem de alto rendimento para a realização de todas as etapas no processo de direcionamento gênico e aplicações de recombinação. Isso inclui manipulações de líquidos e partículas como, por exemplo, aspiração, dispensa, misturação, diluição, lavagem, transferências volumétricas precisas; recuperação e descarte de pontas de pipetas; e pipetagem repetitiva de volumes idênticos para múltiplas liberações da aspiração de uma única amostra. Essas manipulações são transferências de líquidos, partículas, células e organismos livres de contaminação cruzada. Os instrumentos realizam replicação automatizada de amostras de microplacas para filtros, membranas e/ou placas- filhas, transferências de alta densidade, diluições seriais de placa cheia e operação de alta capacidade.

[00213]O sistema automatizado pode ser qualquer sistema automatizado de alto rendimento conhecido na técnica. Por exemplo, o sistema automatizado pode ser a ferramenta automatizada de manuseio de micro-organismos descrita no Publicação de Pedido de Patente Japonesa número 11-304666. Esse dispositivo é capaz de realizar da transferência de microgotículas contendo células individuais, e antecipa-se que as cepas fúngicas da presente invenção, em virtude de sua morfologia, serão passíveis de micromanipulação de clones individuais com esse dispositivo. Um exemplo adicional de um sistema automatizado para uso nos métodos e sistema da presente revelação é o sistema automatizado de alto rendimento de avaliação microbiológica descrito em Beydon e cols., J. Biomol. Screening 5: 13 21 (2000). O sistema automatizado para uso nesse relatório descritivo pode ser um sistema automatizado customizado de manuseio de líquidos. Em uma modalidade, o sistema automatizado customizado de manuseio de líquidos da revelação é uma máquina TECAN (por exemplo, uma TECAN Freedom Evo customizada).

[00214]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação são compatíveis com plataformas para placas multipoços, placas de poço profundo, placas de poço quadrado, gamelas de reagentes, tubos de ensaio, mini tubos, tubos de microcentrífuga, criofrascos, filtros, chips de microarranjo, fibras ópticas, glóbulos, géis de agarose e acrilamida, e outras matrizes ou plataformas de fase sólida são acomodadas em um deck modular atualizável. Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação contêm pelo menos um deck modular para superfícies de trabalho multiposição para a colocação de amostras-fonte e de saída, reagentes, diluição de amostras e reagentes, placas de ensaio, reservatórios de amostras e reagentes, pontas de pipetas e uma estação de lavagem de ponta ativa.

[00215]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação incluem sistemas de eletroporação de alto rendimento para transformação dos protoplastos. Em algumas modalidades, os sistemas de eletroporação de alto rendimento são capazes de transformar células em placas de 96 ou 384 poços. Em algumas modalidades, os sistemas de eletroporação de alto rendimento incluem VWR® High-Throughput Electroporation Systems, BTX™, Bio-Rad® Gene Pulser MXcell™ ou outros sistemas de eletroporação multipoços.

[00216]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados compreendem um ciclador térmico integrado e/ou reguladores térmicos que são usados para estabilização da temperatura de trocadores de calor como, por exemplo, blocos ou plataformas controladas para fornecer controle preciso da temperatura da incubação de amostras de 0°C até 100°C.

[00217]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação são compatíveis com cabeças de máquina intercambiáveis (únicas ou multicanais) com sondas magnéticas únicas ou múltiplas, sondas de afinidade, replicadores ou pipetadores, capazes de manipular roboticamente líquidos, partículas células, e organismos multicelulares. separadores magnéticos multipoços ou multitubos e estações de filtração manipulam líquidos, partículas, células e organismos em formatos de amostra única ou múltiplas.

[00218]Em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação são compatíveis com visão de câmera e/ou sistemas espectrométricos. Dessa forma, em algumas modalidades, os sistemas automatizados da presente revelação são capazes de detectar e documentar alterações de cor e absorção em culturas celulares em andamento.

[00219]Em algumas modalidades, o sistema automatizado da presente revelação que gera as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada é projetado para ser flexível e adaptável com múltiplos acessórios de hardware para permitir que o sistema realize múltiplas aplicações. O sistema automatizado para uso nos métodos fornecidos nesse relatório descritivo pode compreender módulos de programas de software. Os módulos de programas de software podem permitir a criação, modificação e execução de métodos. Os sistemas podem ainda compreender módulos diagnósticos. Os módulos diagnósticos podem permitir a configuração, alinhamento do instrumento e operações motoras. Os sistemas podem ainda compreender ferramentas customizadas, produtos de laboratório, padrões de transferência de líquidos e partículas e/ou um banco (ou bancos) de dados. As ferramentas customizadas, produtos de laboratório e padrões de transferência de líquidos e partículas podem permitir que diferentes aplicações sejam programadas e realizadas. O banco de dados pode permitir o armazenamento do método e de parâmetros. Além disso, as interfaces robóticas e de computador presentes no sistema podem permitir a comunicação entre instrumentos.

[00220]Aqueles habilitados na técnica reconhecerão as várias plataformas robóticas capazes de realizar os métodos de HTP da presente revelação para gerar as células hospedeiras ou cepas fúngicas filamentosas com a morfologia de pellet desejada. Hardware do sistema de computador

[00221]A FIG. 10 ilustra um exemplo de um sistema de computador 800 que pode ser usado para executar código de programa armazenado em um meio legível por computador não transitório (por exemplo, memória) de acordo com modalidades da revelação. O sistema de computador inclui um subsistema de entrada/saída (I/O) 802, que pode ser usado como interface com usuários humanos e/ou outros sistemas de computador, dependendo da aplicação. O subsistema I/O 802 pode incluir, por exemplo, um teclado, mouse, interface gráfica do usuário, tela sensível ao toque, ou outras interfaces para entrada e, por exemplo, um LED ou outro monitor de tela plana, ou outras interfaces para saída, incluindo interfaces de aplicativo (APIs). Outros elementos de modalidades da revelação, por exemplo, os componentes do sistema LIMS, podem ser implementados com um sistema de computador como aquele do sistema de computador 800.

[00222]O código de programa pode ser armazenado em meios não-transitórios como, por exemplo, armazenamento persistente em memória secundária 810 ou memória principal 808, ou ambas. A memória principal 808 pode incluir memória volátil como, por exemplo, memória de acesso aleatório (RAM), ou memória não-volátil como, por exemplo, memória somente de leitura (ROM), bem como diferentes níveis de memória-cache para acesso mais rápido às instruções e dados. A memória secundária pode incluir armazenamento persistente como, por exemplo, drives em estado sólido, drives de disco rígido ou discos ópticos. Um ou mais processadores 804 lêem o código de programa dos (um ou mais) meios não-transitórios e executa o código para permitir que o sistema de computador execute os métodos realizados pelas modalidades desse relatório descritivo. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que o processador (ou processadores) pode ingerir o código- fonte, e interpretar ou compilar o código-fonte em código de máquina que é compreensível no nível de entrada de hardware do processador (ou processadores) 804. O processador (ou processadores) 804 pode incluir unidades de processamento gráfico (GPUs) para o manuseio de tarefas computacionalmente intensivas. Particularmente no aprendizado de máquina, uma ou mais CPUs 804 podem descarregar o processamento de grandes quantidades de dados a uma ou mais GPUs 804.

[00223]O processador (ou processadores) 804 pode se comunicar com redes externas por meio de uma ou mais interfaces de comunicações 807, por exemplo, um cartão de interface de rede, transceptor WiFi etc. Um barramento 805 acopla comunicativamente o subsistema I/O 802, o processador (ou processadores) 804, dispositivos periféricos 806, interfaces de comunicações 807, memória 808 e armazenamento persistente 810. As modalidades da revelação não estão limitadas a essa arquitetura representativa. Modalidades alternativas podem empregar arranjos e tipos de componentes diferentes, por exemplo, barramentos separados para componentes de entrada-saída e subsistemas de memória.

[00224]Aqueles habilitados na técnica compreenderão que alguns ou todos os elementos de modalidades da revelação, e suas operações acompanhantes, podem ser implementados totalmente ou parcialmente pelos (um ou mais) sistemas de computador que incluem um ou mais processadores e um ou mais sistemas de memória, como aqueles do sistema de computador

800. Em particular, quaisquer sistemas ou dispositivos robóticos e outros sistemas ou dispositivos automatizados descritos nesse relatório descritivo podem ser implementados por computador. Alguns elementos e funcionalidades podem ser implementados localmente e outros podem ser implementados de forma distribuída sobre uma rede por meio de diferentes servidores, por exemplo, do tipo cliente-servidor, por exemplo. Em particular, operações colaterais de servidor podem se tornar disponíveis a múltiplos clientes em um software do tipo serviço (SaaS).

[00225]O termo “componente”, nesse contexto, se refere amplamente aos componentes de software, hardware ou firmware (ou qualquer combinação destes). Componentes são tipicamente componentes funcionais que podem gerar dados úteis ou outra saída com o uso de entrada (ou entradas) especificada. Um componente pode ou não ser independente. Um aplicativo (também chamado “aplicação”) pode incluir um ou mais componentes, ou um componente pode incluir um ou mais aplicativos.

[00226]Algumas modalidades incluem alguns, todos ou nenhum dos componentes, juntamente com outros módulos ou componentes de aplicativo. Além disso, várias modalidades podem incorporar dois ou mais desses componentes em um único módulo e/ou associar uma porção da funcionalidade de um ou mais desses componentes com um componente diferente.

[00227]A “memória” pode ser qualquer dispositivo ou mecanismo usado para o armazenamento de informação. De acordo com algumas modalidades da presente revelação, o termo “memória” visa englobar qualquer tipo de memória incluindo, sem limitação: memória volátil, memória não-volátil e memória dinâmica. Por exemplo, “memória” pode ser memória de acesso aleatório, dispositivos de armazenamento de memória, dispositivos ópticos de memória, meios magnéticos,

disquetes, fitas magnéticas, discos rígidos, SIMMs, SDRAM, DIMMs, RDRAM, DDR RAM, SODIMMS, memórias somente de leitura apagáveis e programáveis (EPROMs), memórias somente de leitura eletricamente apagáveis e programáveis (EEPROMs), CDs, DVDs e/ou semelhantes. De acordo com algumas modalidades, “memória” pode incluir uma ou mais unidades de disco, flash drives, bancos de dados, memórias-cache locais, memórias-cache de processador, bancos de dados relacional, bancos de dados plano, servidores, plataformas baseadas na nuvem e/ou semelhantes. Além disso, aqueles habilitados na técnica observarão que muitos dispositivos e técnicas adicionais para o armazenamento de informação podem ser usados como memória.

[00228]A memória pode ser usada para armazenar instruções para execução de um ou mais aplicativos ou módulos em um processador. Por exemplo, a memória poderia ser usada, em algumas modalidades, para abrigar todas ou algumas das instruções necessárias para executar a funcionalidade de um ou mais dos módulos e/ou aplicativos discutidos nesse pedido. Cultura de células e fermentação

[00229]As células da presente revelação podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para quaisquer reações biossintéticas ou seleções desejadas. Em algumas modalidades, a presente revelação ensina o cultivo em meios de indução para a ativação de promotores. Em algumas modalidades, a presente revelação ensina meios com agentes de seleção, incluindo agentes de seleção de transformantes (por exemplo, antibióticos), ou a seleção de organismos adequados para crescer sob condições de inibição (por exemplo, condições elevadas de etanol). Em algumas modalidades, a presente revelação ensina o crescimento de culturas de células em meios otimizados para o crescimento celular. Em outras modalidades, a presente revelação ensina o crescimento de culturas de células em meios otimizados para rendimento de produto. Em algumas modalidades, a presente revelação ensina o crescimento de culturas em meios capazes de induzir o crescimento celular e que também contêm os precursores necessários para produção do produto final (por exemplo, níveis elevados de açúcares para a produção de etanol).

[00230]As condições de cultura, por exemplo, temperatura, pH e semelhantes, são aquelas adequadas para uso com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para aqueles habilitados na técnica. Como observado, muitas referências estão disponíveis para o cultivo e produção de muitas células, incluindo células de origem bacteriana, vegetal, animal (incluindo de mamíferos) e de arquéias-bactérias. Veja, por exemplo, Sambrook, Ausubel (todos supra), bem como Berger, “Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology”, volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; e Freshney (1994) “Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique”, Terceira Edição, Wiley-Liss, Nova York e as referências neles citadas; Doyle e Griffiths (1997) “Mammalian Cell Culture: Essential Techniques”, John Wiley e Sons, NY; Humason (1979) “Animal Tissue Techniques”, 4ª Edição W.H. Freeman e Company; e Ricciardelle e cols., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 1.016-1.024, todos incorporados nesse relatório descritivo por referência. Para cultura e regeneração de células vegetais, Payne e cols.

(1992) “Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems”, John Wiley & Sons, Inc. Nova York, N.Y.; Gamborg e Phillips (eds) (1995) “Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods - Springer Lab Manual”, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg N.Y.); Jones, ed. (1984) “Plant Gene Transfer and Expression Protocols”, Humana Press, Totowa, N.J. e “Plant Molecular Biology” (1993), R.R.D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6, todos incorporados nesse relatório descritivo por referência. Meios de cultura de células em geral são apresentados em Atlas e Parks (eds.) “The Handbook of Microbiological Media” (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla., que é incorporado nesse relatório descritivo por referência. Informações adicionais para cultura de células são encontradas na literatura comercial disponível como, por exemplo, “Life Science Research Cell Culture Catalogue” de Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, Mo.) (“Sigma-LSRCCC”) e, por exemplo, “The Plant Culture Catalogue” e suplemento, também de Sigma- Aldrich, Inc. (St Louis, Mo.) (“Sigma-PCCS”), todos incorporados nesse relatório descritivo por referência.

[00231]O meio de cultura a ser usado deve satisfazer de uma forma adequada às demandas das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura para vários micro-organismos estão presentes no “Manual of Methods for General Bacteriology” da “American Society for Bacteriology” (Washington D.C., EUA, 1981).

[00232]Além disso, a presente revelação fornece um processo para a preparação fermentativa de um produto de interesse, que compreende as etapas de: a) cultivo de um micro-organismo de acordo com a presente revelação em um meio adequado, resultando em um caldo de fermentação; e b) concentração do produto de interesse no caldo de fermentação de a) e/ou nas células do micro-organismo.

[00233]Em algumas modalidades, a presente revelação ensina que os micro-organismos produzidos podem ser cultivados continuamente - como descrito, por exemplo, em WO 05/021772 - ou descontinuamente em um processo de batelada (cultivo de batelada) ou em um processo de batelada alimentada ou de batelada alimentada repetida com o objetivo de produzir o composto químico orgânico desejado. Um resumo de uma natureza geral sobre os métodos de cultivo conhecidos está disponível no livro-texto por Chmiel (“Bioprozeßtechnik. 1: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) no livro-texto por Storhas (“Bioreaktoren and periphere Einrichtungen” (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

[00234]Em algumas modalidades, as células da presente revelação são desenvolvidas sob condições de batelada ou fermentações contínuas.

[00235]A fermentação de batelada clássica é um sistema fechado, no qual a composição do meio é ajustada no começo da fermentação e não está sujeita a mudanças artificiais durante a fermentação. Uma variação do sistema de batelada é uma fermentação de batelada alimentada que também tem utilidade na presente revelação. Nessa variação, o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Sistemas de batelada alimentada são úteis quando a repressão de catabólito tem probabilidade de inibir o metabolismo das células e quando é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. Fermentações de batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica.

[00236]A fermentação contínua é um sistema no qual um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento e colheita de produtos de biomolécula de interesse desejados. Em algumas modalidades, a fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade elevada constante na qual as células estão primariamente em fase log de crescimento. Em algumas modalidades, a fermentação contínua geralmente mantém as culturas em crescimento em fase estacionária ou log tardia/estacionária. Sistemas de fermentação contínua tentam manter as condições de crescimento em estado de equilíbrio.

[00237]Métodos para a modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximização da taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00238]Por exemplo, uma lista não limitante de fontes de carbono para as culturas da presente revelação inclui, açúcares e carboidratos como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, soluções que contêm sacarose do processamento de beterraba ou cana de açúcar, amido, hidrolisado de amido e celulose; óleos e gorduras como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco; ácidos graxos como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico;

álcoois como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol; e ácidos orgânicos como, por exemplo, acético ácido ou ácido lático.

[00239]Uma lista não limitante das fontes de nitrogênio para as culturas da presente revelação inclui, compostos orgânicos que contêm nitrogênio como, por exemplo, peptonas, extrato de leveduras, extrato de carne, extrato de malte, licor da maceração de milho, farinha de soja e uréia; ou compostos inorgânicos como, por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

[00240]Uma lista não limitante das possíveis fontes de fósforo para as culturas da presente revelação inclui, ácido fosfórico, diidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais que contêm sódio correspondentes.

[00241]O meio de cultura pode adicionalmente compreender sais, por exemplo, na forma de cloretos ou sulfatos de metais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento.

[00242]Finalmente, fatores de crescimento essenciais como, por exemplo, aminoácidos, por exemplo, homoserina, e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser empregados além das substâncias mencionadas anteriormente.

[00243]Em algumas modalidades, o pH da cultura pode ser controlado por qualquer ácido ou base, ou sal de tampão incluindo, sem limitação, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa; ou compostos ácidos como, por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, de uma forma adequada. Em algumas modalidades, o pH é geralmente ajustado até um valor de 6,0 a 8,5, preferivelmente 6,5 a 8.

[00244]Em algumas modalidades, as culturas da presente revelação podem incluir um agente antiespumante como, por exemplo, ésteres de ácido graxo de poliglicol. Em algumas modalidades, as culturas da presente revelação são modificadas para estabilizar os plasmídeos das culturas por adição de substâncias seletivas adequadas como, por exemplo, antibióticos.

[00245]Em algumas modalidades, a cultura é realizada sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio como, por exemplo, ar, são introduzidas na cultura. Da mesma forma, também é possível usar líquidos enriquecidos com peróxido de hidrogênio. A fermentação é realizada, quando apropriado, em pressão elevada, por exemplo, em uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e preferivelmente de 25°C a 40°C, particularmente preferivelmente de 30°C a 37°C. Em processos de batelada ou batelada alimentada, o cultivo preferivelmente continua até que uma quantidade do produto de interesse desejado (por exemplo, um composto químico orgânico) suficiente para ser recuperada tenha se formado. Esse objetivo pode normalmente ser atingido dentro de 10 horas até 160 horas. Em processos contínuos, tempos de cultivo mais longos são possíveis. A atividade dos micro-organismos resulta em uma concentração (acúmulo) do produto de interesse no meio de fermentação e/ou nas células dos referidos micro-organismos.

[00246]Em algumas modalidades, a cultura é realizada sob condições anaeróbicas.

[00247]Em algumas modalidades, é fornecido nesse relatório descritivo um meio de fermentação para o crescimento de cepas fúngicas filamentosas ou células hospedeiras geradas usando os métodos fornecidos nesse relatório descritivo que compreende manganês e é substancialmente livre (menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% da quantidade ou concentração de agente quelante encontrada em meios de fermentação conhecidos na técnica para a produção de um produto de interesse como, por exemplo, ácido cítrico) ou livre de agentes quelantes, de modo que as referidas cepas fúngicas filamentosas ou células hospedeiras mantenham uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvidas nos referidos meios de fermentação. Os meios de fermentação podem ser meios de produção de ácido cítrico. O manganês pode estar presente a cerca de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 250, 500, 750 ou 1.000 ppb. O manganês pode estar presente em mais do que 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 250, 500, 750 ou 1.000 ppb. Os meios de fermentação podem não compreender nenhum agente quelante. Os meios de fermentação podem compreender cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% menos agentes quelantes do que meios de fermentação normais. Os agentes quelantes podem ser quelantes de manganês. A cepa fúngica filamentosa ou célula hospedeira pode compreender um ou mais genes de morfologia-alvo geneticamente alterados. Os genes de morfologia-alvo podem ser quaisquer genes relacionados à morfologia fornecidos nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, o gene de morfologia-alvo é um gene histidina- quinase de dois componentes de A. niger (por exemplo, gene nikA de A. niger; ID. DE SEQ. Nº: 14). A alteração genética pode ser uma forma mutante do gene-alvo relacionado à morfologia e/ou substituição de promotor nativo ou terminador com um promotor heterólogo ou terminador. Em uma modalidade, a forma mutante do gene-alvo de morfologia é FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5), FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 6), FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) ou FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 8). Em outra modalidade, a forma mutante do gene- alvo de morfologia é FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5), FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 6), FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) ou FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 8) fundido ou ligado operacionalmente a qualquer um dos promotores da Tabela 2. Em uma modalidade, o gene de morfologia-alvo é a forma mutante de um ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou proteína Nik1 de N. crassa codificada pelo ID. DE SEQ. Nº: 7. Além dessa modalidade, o gene para a forma mutante do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou gene nik1 de N. crassa é fundido a um promotor man8p ou amy8p. O promotor man8p ou promotor amy8p pode ser da Tabela

2.

EXEMPLOS

[00248]Os exemplos seguintes são apresentados com o objetivo de ilustrar várias modalidades da revelação e não visam limitar a presente revelação de modo algum. Alterações nestas e outros usos que estão englobados dentro do espírito da revelação, como definido pelo escopo das reivindicações, serão reconhecidas por aqueles habilitados na técnica.

[00249]Um breve índice (ou seja, a Tabela 5) é fornecido abaixo unicamente com o objetivo de ajudar ao leitor. Nada nesse índice visa limitar o escopo dos exemplos ou da revelação desse pedido. Tabela 5 - Índice para s seção de Exemplos. Nº do Título Descrição breve Exemplo Descreve método de troca Engenharia genômica HTP de de SNP para a geração de fungos filamentosos: cepas fúngicas 1 identificação de genes que filamentosas com fenótipo afetam a morfologia fúngica de pellet, não-micélio, filamentosa em cultura CAP submersa Descreve a confirmação de genes que desempenham um Engenharia genômica HTP de papel na morfologia de fungos filamentosos: cepas fúngicas confirmação do papel que os 2 filamentosas em cultura genes identificados desempenham CAP submersa por knockout na morfologia fúngica dos supostos genes filamentosa morfologicamente relacionados Descreve uma biblioteca Engenharia genômica HTP de PROSWP que é utilizada em fungos filamentosos: alteração fungos filamentosos para 3 da morfologia da célula fúngica controlar a expressão de filamentosa por alteração da supostos genes expressão gênica morfologicamente relacionados Descreve crescimento de Exame do crescimento de cepa mutante morfológico fúngica filamentosa morfológica 4 gerado nos Exemplos 1-3 mutante em cultura submersa sem em meio CAP sem agentes agentes quelantes quelantes Descreve método de troca de SNP para a geração de Engenharia genômica HTP de cepas fúngicas fungos filamentosos: exame de filamentosas com fenótipo gene que afeta a morfologia de pellet, não-micélio, 5 fúngica filamentosa e seu papel em cultura CAP submersa na produção de ácido cítrico e por alteração da resposta ao estresse osmótico expressão de gene da via de resposta osmótica candidato Exemplo 1: Engenharia genômica HTP de fungos filamentosos: identificação de genes que afetam a morfologia fúngica filamentosa

[00250]Esse exemplo demonstra o uso de bibliotecas de troca de SNP em um método de SNPSWAP nos fungos filamentosos, Aspergillus niger, a fim de identificar genes que participam do controle da morfologia da célula fúngica. Em particular,

esse exemplo descreve a identificação de um grupo de genes que conferem um fenótipo morfológico do tipo pellet, formador de não-micélio, em cepas de A. niger mutantes, no qual as células mantêm um fenótipo menos alongado, mais apertado, com cada célula tendo múltiplas pontas quando desenvolvida em culturas submersas. Esse tipo de crescimento pode ser favorável à fermentação em tanque agitado.

[00251]Aspergillus niger é uma espécie de fungo filamentoso usada para a produção em larga escala de ácido cítrico por meio de fermentação. Múltiplas cepas dessa espécie foram isoladas e demonstraram ter capacidade variável para produção de ácido cítrico e outros ácidos orgânicos. A cepa de A. niger ATCC 1015 foi identificada como uma produtora de ácido cítrico no início do século vinte. Foi constatado mais tarde que um isolado dessa cepa denominado ATCC 11414 exibe rendimento aumentado de ácido cítrico em relação à cepa parental. Por exemplo, a cepa de A. niger ATCC 1015 na média produz 7 gramas de ácido cítrico a partir de 140 gramas de glicose em meios que contêm nitrato de amônio, mas desprovidos cátions tanto de ferro quanto de manganês. O isolado da cepa ATCC 11414, por outro lado, exibe um aumento de rendimento de 10 vezes (70 gramas de ácido cítrico) sob as mesmas condições. Além disso, os esporos da cepa ATCC 11414 germinam e crescem melhor em meios de produção de ácido cítrico do que os esporos da cepa 1015.

[00252]A fim de identificar fontes genéticas potenciais para essas diferenças fenotípicas, os genomas das cepas ATCC 1015 e ATCC 11414 foram sequenciados e analisados. A análise resultante identificou 43 SNPs que distinguem as cepas 1015 e 11414 (veja Tabela 3). Desses 43 SNPs, foi verificado que

18 estão nos domínios codificadores de seus respectivos genes (veja Tabela 4).

[00253]A fim de identificar genes que desempenham um papel potencial no controle da morfologia/crescimento de fungos filamentosos sob diferentes condições de cultura, os 43 SNPs da Tabela 3 foram usados em um processo de troca de SNP como descrito nesse relatório descritivo a fim de introduzir sistematicamente cada SNP individual da Tabela 3 na cepa de base 1015 e examinar diferenças de fenótipo de um ponto de vista morfológico entre as cepas parentais e as cepas mutantes resultantes. Inversamente, o mesmo tipo de processo foi realizado na cepa de produção 11414, pelo qual cada um dos SNPs da Tabela 3 já presentes no genoma de 11414 foi sistematicamente substituído com versões do tipo selvagem de cada gene e qualquer diferença resultante na morfologia entre as cepas parentais e mutantes foi anotada. Construções para a transformação de protoplastos

[00254]Nesse Exemplo, cada cepa (ou seja, 1015 e 11414) foi co-transformada com duas construções (“construções de marcador dividido”), em que cada uma das duas construções continha uma porção sobreposta de um marcador selecionável (ou seja, pyrG na FIG. 4 e 5) e eram flanqueadas por sequência de repetição direta, como mostrado nas FIGS. 4 e 5. As construções de marcador dividido foram geradas usando PCR de fusão e tiveram a qualidade controlada (QC’d) usando um analisador de fragmentos, como mostrado na FIG. 5. Além disso, cada uma dessas construções ainda compreendia uma sequência que flanqueia as porções da repetição direta de cada construção a fim de dirigir a integração no genoma da célula hospedeira no respectivo gene-alvo para cada SNP da

Tabela 3. Para os protoplastos da cepa de base 1015, as repetições diretas nas construções divididas compreendiam um dos SNPs da Tabela 3 (veja a FIG. 6). Em contraste, para os protoplastos da cepa de produção 11414, AS repetições diretas NÃO compreendiam um SNP da Tabela 3.

[00255]A cepa de A. niger de base 1015 e a cepa de produção 11414 foram cultivadas, convertidas em protoplastos, transformadas e avaliadas como descrito em 62/515.907, depositado em 6 de junho de 2017. Em resumo, cada uma dessas etapas foi da seguinte forma: Geração de protoplastos

[00256]Quinhentos mililitros de meios completos foram inoculados com 106 conídios/ml e desenvolvidos de um dia para o outro a 150 rpm a 30°C tanto para a cepa de A. niger de base 1015 quanto para a cepa de A. niger de produção 11414. Após o crescimento de um dia para o outro, os micélios foram colhidos por filtração de cada cultura através de Miracloth. Subsequentemente, os micélios foram enxaguados cuidadosamente com água estéril. Os micélios colhidos e lavados de ambas as cepas, cada um separadamente, foram então submetidos à digestão enzimática com um coquetel enzimático VinoTaste Pro (VTP).

[00257]A digestão enzimática dos micélios para ambas as cepas foi realizada produzindo-se primeiramente 50 ml de 60 mg/ml de VTP em tampão de protoplastização (1,2 M de sulfato de magnésio, 50 mM de tampão-fosfato, pH 5). Após dissolução do VTP, o tampão foi colocado em tubos Oakridge limpos e centrifugado a 15.000 x g por 15 minutos. A solução foi então esterilizada por filtração após centrifugação. Uma vez feitos, alguns dos micélios colhidos foram adicionados à solução de VTP e os micélios foram digeridos a 30°C a 80 rpm por aproximadamente 2-4 horas. Em vários intervalos durante a digestão por VTP, pequenas amostras foram examinadas sob ampliação de 400x quanto à presença de protoplastos (ou seja, células redondas grandes que são maiores do que conídios e são sensíveis à lise osmótica). Quando a maior parte ou todos os micélios para cada cepa foram digeridos, a cultura de cada cepa foi filtrada através de Miracloth estéril e os filtrados foram coletados em um cilindro graduado. Os protoplastos filtrados foram transferidos para um cilindro graduado e um tampão de concentração menor de osmólito (5 ml de 0,4 M de tampão ST (0,4 M de Sorbitol, 100 mM de Tris, pH 8) foi gentilmente sobreposto. As amostras sobrepostas foram então centrifugadas a 800 x g por 15 minutos a 4°C e os protoplastos foram então removidos com uma pipeta e misturados gentilmente com 25 ml de solução ST (1,0 M de sorbitol, 50 mM de Tris, Ph 8,0) e centrifugados novamente a 800 x g por 10 minutos. Os protoplastos devem peletizar no fundo do tubo. Cada um dos protoplastos de cada cepa foi então separadamente ressuspenso em 25 ml de solução ST e coletado por centrifugação a 800 x g por 10 minutos. Transformação de protoplastos

[00258]Após centrifugação, os protoplastos de ambas as cepas foram por fim ressuspensos em um tampão contendo cloreto de cálcio. Subsequentemente, os protoplastos de ambas as cepas foram submetidos às transformações mediadas por PEG-Cálcio tradicionais usando manipuladores de líquidos automatizados, que combinaram o DNA das construções divididas descritas acima com as misturas de protoplasto-PEG no 96 poços.

Avaliação quanto aos transformantes

[00259]Como descrito acima, as construções de marcador dividido utilizadas nesse Exemplo continham repetições diretas que flanqueiam o gene marcador pyrG, que foram subsequentemente usadas para looping out do gene marcador. Como resultado, cepas que contêm a construção de loop out foram contra-selecionadas para deleção da região de seleção (por exemplo, veja a FIG. 4 e a FIG. 7; ausência de gene pyrG). A integração correta foi adicionalmente avaliada por avaliação baseada em sequência como descrito nesse relatório descritivo. Além disso, as cepas mutantes foram avaliadas usando NGS a fim de avaliar a natureza homocariótica dos transformantes, como fornecido nesse relatório descritivo. As cepas mutantes homocarióticas ou substancialmente homocarióticas foram plaqueadas em meios mínimos com (veja as FIGS. 13 e 14) ou sem (veja a FIG. 15) vários suplementos a fim de avaliar a habilidade das referidas cepas para crescer sob pH baixo (FIG. 13) ou estresse osmótico (FIG. 14) ou esporular (FIG. 15). Além disso, as cepas mutantes foram desenvolvidas como culturas submersas em meios CAP a fim de avaliar seu fenótipo em meios de produção submersos. Resultados

[00260]A integração individual de 4 dos SNPs compartilhados entre as Tabelas 3 e 4 na cepa de base de A. niger 1015 gerou um fenótipo morfológico. Em particular, a integração de FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5), FungiSNP_12 (ID. DE SEQ. Nº: 6), FungiSNP_18 (ID. DE SEQ. Nº: 7) ou FungiSNP_40 (ID. DE SEQ. Nº: 8) nas cepas mutantes geradas do genoma de 1015 produziu uma morfologia de pellet, não- micélio, quando desenvolvidas como uma cultura submersa em meios CAP.

[00261]O papel dos genes que contêm os 4 SNPs para afetar a morfologia fúngica foi adicionalmente demonstrado nos experimentos de wave down, pelo qual a remoção de cada um desses 4 SNPs resgatou os fenótipos morfológicos observados. As sequências dos 4 SNPs podem ser encontradas na listagem de sequências em anexo, enquanto a função suposta ou comprovada de sua proteína pode ser encontrada na Tabela

4.

[00262]Como mostrado na FIG. 13, cepas que contêm a SNP18 de Base crescem mais rápido em meios com pH baixo. A presença de FungiSNP_18 da cepa de produção (11414) na cepa de base (ou seja, snp18prod de Base na FIG. 13) reduziu o crescimento radial da colônia resultante em meios pH2, comparado com a base (ou seja, Base da FIG. 13). Em contraste, a presença da versão do tipo selvagem de FungiSNP_18 da cepa de base na cepa de produção (ou seja, Produção SNP18Base na FIG. 13) permitiu o crescimento radial na referida cepa, comparado com as cepas de Base e de Produção da FIG. 13. Além disso, parece que outros SNPs presentes na cepa de produção também contribuem para o crescimento radial menor (veja Produção em menor do que snp18prod na FIG. 13).

[00263]Como mostrado na FIG. 14, cepas que contêm a SNP18 de base (ou seja, versão do tipo selvagem de FungiSNP_18) crescem mais rápido em meios que fornecem estresse osmótico. A presença de FungiSNP_18 da cepa de produção (11414) na cepa de base (ou seja, snp18prod de Base na FIG. 14) reduziu o crescimento radial da colônia resultante sob estresse osmótico, comparada com a base (ou seja, Base a FIG. 14). Em contraste, a presença da versão do tipo selvagem de FungiSNP_18 da cepa de base na cepa de produção (ou seja, Produção SNP18Base na FIG. 14) permitiu o crescimento radial na referida cepa, comparada com as cepas de Base e de Produção da FIG. 14. Além disso, parece que outros SNPs presentes na cepa de produção também contribuem para o crescimento radial menor (veja Produção em menor do que snp18prod de Base na FIG. 14).

[00264]Curiosamente, cepas de base que contêm cada um de FungiSNP_9, FungiSNP_12 ou FungiSNP_40 cresceram normalmente e esporularam normalmente quando não desenvolvidas em culturas submersas (por exemplo, em placas). A expressão de FungiSNP_18 na cepa de base (ou seja, 1015) não mostrou um efeito sobre a taxa de crescimento radial (reduzida) e esporulação, como mostrado na FIG. 15. Exemplo 2: Engenharia genômica HTP de fungos filamentosos: confirmação do papel que os genes identificados desempenham na morfologia fúngica filamentosa- deleção dos genes de controle morfológico identificados

[00265]Esse exemplo demonstra a confirmação do papel dos 4 genes identificados no Exemplo 1 como participantes da morfologia fúngica. Em particular, esse exemplo descreve o knocking out ou deleção de cada um dos 4 genes usando métodos de HTP como descritos nesse relatório descritivo em cepas de A. niger 1015 e 11414.

[00266]A cepa de A. niger de base 1015 e a cepa de produção 11414 foram cultivadas, convertidas em protoplastos, transformadas e avaliadas como descrito no Exemplo 1. Construções para transformação de protoplastos

[00267]Nesse Exemplo, protoplastos de cada cepa (ou seja, 1015 e 11414) foram transformados com uma série de construções únicas, em que cada construção na série continha um gene marcador selecionável (ou seja, pyrG) flanqueado por uma sequência complementar à sequência genômica que flanqueia um dos 4 genes de interesse identificados no Exemplo 1 a fim de dirigir a integração do gene marcador no genoma da célula hospedeira. Como mostrado na FIG. 8, a integração do gene marcador no lócus de um dos 4 genes (um dos 4 do genes do tipo selvagem na cepa 1015 e um dos 4 SNPs na cepa 11414) basicamente serviu para remover o referido gene do tipo selvagem ou gene que contém SNP do lócus da respectiva cepa.

[00268]Após crescimento, as cepas mutantes foram avaliadas usando NGS a fim de avaliar a natureza homocariótica dos transformantes, como fornecido nesse relatório descritivo. As cepas mutantes homocarióticas ou substancialmente homocarióticas foram plaqueadas em meios a fim de avaliar a habilidade das referidas cepas para esporular ou crescer como culturas submersas em meios CAP a fim de avaliar seu fenótipo em meios de produção submersos. Resultados

[00269]A remoção de cada um dos 4 genes da cepa de base 1015, bem como da cepa de produção 11414, confirmou os resultados do Exemplo 1, na medida em que cada um dos referidos 4 genes nitidamente participa na influência sobre a morfologia fúngica. Em particular, como no Exemplo 1, a remoção da versão que não contém SNP do gene que contém FungiSNP_18 na cepa 1015 ou do gene que contém FungiSNP_18 na cepa 11414 produziu o fenótipo mais impressionante, pelo qual, sob condições de cultura submersa, as referidas cepas tinham uma morfologia do tipo pellet. Além disso, como mostrado na FIG. 16, a deleção dos genes FungiSNP18 e FungiSNP40 resultou em uma morfologia apertada sob todas as condições. Esses dados podem indicar que os SNPs não são mutações de perda de função, considerando que os fenótipos de deleção são mais pronunciados (impacto mais forte sobre a morfologia) do que os próprios SNPs. Dessa forma, parece que a alteração da expressão desses genes pode impactar a morfologia de uma forma que é desejável para o crescimento em fermentadores.

[00270]Curiosamente, a deleção da versão que não contém SNP do gene que contém FungiSNP_18 na cepa 1015 produziu um fenótipo de esporulação negativo na cepa 1015 variante resultante, de modo que a referida cepa 1015 variante perdeu a habilidade para esporular (veja a FIG. 17). Essa perda de esporulação não foi observada na cepa 11414, na qual o gene FungiSNP_18 foi removido. Considerando que as bases genéticas das cepas 11414 e 1015 são idênticas, com exceção dos SNPs presentes nas Tabelas 3 e 4, isso sugeriu que a presença de um, todos ou alguma combinação dos SNPs da Tabela 3 ou 4 na base genética de 11414 é suficiente para resgatar o fenótipo de esporulação negativo produzido quando FungiSNP_18 é removido. Colocado de outra forma, há outras mutações (SNPs) que atuam epistaticamente para manter a esporulação na cepa de produção na ausência de atividade de SNP18.

[00271] Deve ser observado que a perda de esporulação não foi observada nem nas cepas 11414 ou 1015 variantes produzidas por remoção de FungiSNP_9, FungiSNP_12 ou

FungiSNP_40, ou suas versões que não contêm SNP, respectivamente.

[00272]Deve ainda ser observado que os fenótipos morfológicos observados sob condições de cultura submersa nesse Exemplo foram mais surpreendentes do que no Exemplo 1 para cada um dos 4 genes, o que poderia ser causado pelo design experimental pelo qual transformantes bem-sucedidos basicamente exibiam um fenótipo de deleção. Além disso, os fenótipos na cepa 11414 também eram mais pronunciados, o que poderia ser causado pelas contribuições ao fenótipo por um ou mais dos outros SNPs presentes nessa cepa vs. a cepa de base 1015. Exemplo 3: Engenharia genômica HTP de fungos filamentosos: alteração da morfologia da célula fúngica filamentosa por alteração da expressão gênica

[00273]Esse exemplo demonstra o uso de um método PROSWP HTP automatizado em células fúngicas filamentosas a fim de testar os efeitos da modulação da expressão dos genes FungiSNP_9, FungiSNP_12, FungiSNP_18 e FungiSNP_40 identificados dos Exemplos 1 e 2 que supostamente participam do controle da morfologia fúngica filamentosa.

[00274]Nesse Exemplo, a expressão do gene FungiSNP_18 (ou seja, ID. DE SEQ. Nº: 7) identificado nos Exemplos 1 e 2 foi modulada tanto na cepa de A. niger de base 1015 quanto na cepa de A. niger de produção 11414 por substituição do promotor nativo anotado com um dos quatro promotores da Tabela 2 usando o método PROSWP descrito nesse relatório descritivo. Mais especificamente, para cada uma das cepas (ou seja, a cepa 1015 parental ou a cepa parental 11414) para cada FungiSNP, um conjunto de (4) cepas variantes ou mutantes foi gerado, em que uma 1ª cepa variante expressa uma primeira construção que compreende o referido gene FungiSNP candidato (FungiSNP_9 (ID. DE SEQ. Nº: 5); _12 (ID. DE SEQ. Nº: 6); _18 (ID. DE SEQ. Nº: 7); _40 (ID. DE SEQ. Nº: 8)) sob o controle do promotor srp8p descrito na Tabela 2, uma 2ª cepa variante tinha o referido gene FungiSNP candidato sob o controle do promotor amy8p descrito na Tabela 2, uma 3ª cepa variante tinha o referido gene FungiSNP candidato sob o controle do promotor man8p descrito na Tabela 2 e uma 4ª cepa variante tinha o referido gene FungiSNP candidato sob o controle do promotor mbfAp descrito na Tabela

2. Cada uma das construções usadas para gerar as variantes ainda compreendia uma sequência que flanqueia o gene FungiSNP candidato e promotor que serviu para dirigir a integração da construção no lócus do respectivo FungiSNP candidato. Uma descrição geral do design de construção bipartite e do esquema de integração usado nesse Exemplo é mostrada na FIG.

18.

[00275]Após sua geração, cada construção para cada FungiSNP candidato usado para gerar as (4) cepas variantes foi individualmente transformada em protoplastos gerados tanto para a cepa de A. niger de base 1015 quanto para a cepa de A. niger de produção 11414. Os protoplastos para ambas as cepas foram cultivados, convertidos em protoplastos, transformados e avaliados para selecionar protoplastos substancialmente homocarióticos usando avaliação fenotípica e/ou baseada em sequência como descrito nos Exemplos acima. Consequentemente, a transformação de cada construção individual levou à geração das 4 cepas variantes ou mutantes para cada uma das cepas parentais para cada FungiSNP candidato, como retratado geralmente na FIG.

3. O fenótipo morfológico de cada uma dessas cepas foi então observado e comparado com o fenótipo morfológico de uma cepa mutante que compreende o gene identificado sob o controle do promotor nativo para o referido gene. Um nível de expressão ideal foi então determinado para cada um dos genes identificados. Resultados

[00276]No geral, a troca de promotor para cada gene de controle da morfologia-alvo (ou seja, FungiSNP_9, _12, _18 e _40) com os diferentes promotores da Tabela 2 revelou que o controle da expressão desses genes impactou a morfologia (veja a FIG. 19). A cepa que contém SNP18 sob o promotor fraco de manB teve uma morfologia de colônia mais apertada do que cepas que contêm outras combinações de promotores. O impacto do controle de SNP18 foi mais pronunciado sob estresse osmótico do que sob pH baixo. Além disso, a cepa que contém SNP40 sob o promotor fraco de manB teve um efeito drástico sobre a morfologia de colônia em relação às cepas que contêm outras combinações de promotores sob todas as condições de crescimento testadas.

[00277]Como mostrado na FIG. 20, a troca de promotor do gene de controle da morfologia-alvo 12 (FungiSNP_12; ID. DE SEQ. Nº: 6) com os diferentes promotores da Tabela 2 revelou que promotores de força menor resultaram em pigmento amarelo nas hifas e alguma morfologia alterada observada na borda de colônias. A presença do pigmento amarelo indicava que as cepas variantes ou mutantes estavam apresentando estresse metabólico.

[00278]Além disso, a troca de promotor do gene de controle da morfologia-alvo 18 (FungiSNP_18; ID. DE SEQ. Nº: 7) com os diferentes promotores da Tabela 2 revelou que o controle da expressão desse gene com os dois promotores mais fracos impactou a morfologia (veja as FIGS. 9,11 e 21). Por exemplo, as cepas que contêm a fusão de manB e a fusão de amyB retiveram uma ponta múltipla, fenótipo de pellet, enquanto aquelas com expressão maior de srpB e mbfA não tinham o fenótipo de pontas múltipla e, ao invés disso, mostraram inchação anormal (veja a FIG. 9). As imagens na FIG. 11 são de cepas desenvolvidas em meios de produção de ácido cítrico a 30°C por 24 horas. As imagens na FIG. 9 são das cepas 11414 parentais, bem como das cepas 11414 que expressam várias fusões de promotor-FungiSNP_18 não-nativas desenvolvidas em meios de produção de ácido cítrico a 30°C por 48 horas. Quando permitidas que fiquem em incubação por 168 horas, as cepas com promotores de expressão maior, bem como o controle de cepa parental, todas continham hifas filamentosas longas. As cepas com o nível de expressão menor pela fusão de promotor, amyB e manB, permaneceram peletizadas. Deve ser observado que, como mostrado na FIG. 21, quando dirigido por promotores mais fracos, SNP_18 possui fenótipo morfológico mais severo na cepa de base do que na cepa de produção.

[00279]Similar aos resultados dos experimentos de deleção do Exemplo 2, a redução da expressão do gene FungiSNP_18 na cepa 1015 resultou em células que apresentaram uma perda de esporulação, como mostrado na FIG. 12. Essa perda de esporulação não foi observada nas cepas 11414 mutantes. Novamente, considerando que as bases genéticas das cepas 11414 e 1015 são idênticas, com exceção dos SNPs presentes nas Tabelas 3 e 4, isso sugeriu que a presença de um, todos ou alguma combinação dos SNPs da Tabela 3 ou 4 na base genética de 11414 é suficiente para resgatar o fenótipo de esporulação negativo produzido quando expressão do FungiSNP_18 é reduzida. Exemplo 4: Exame do crescimento de cepa fúngica filamentosa morfológica mutante em cultura submersa sem agentes quelantes

[00280]Esse exemplo demonstra a habilidade de cepas de A. niger que expressam o gene FungiSNP_18 sob o controle de um promotor de expressão menor (ou seja, promotor man8p) para crescer em morfologia de pellet em meios CAP que compreendem níveis variáveis de manganês e desprovidos de agentes quelantes sob condições de cultura submersa.

[00281]A morfologia de cepas de produção de ácido cítrico de Aspergillus niger é sensível a diversos fatores, incluindo à concentração de manganês (Mn2+). Mediante crescimento da concentração de Mn2+ em culturas A. niger (ATCC 11414) até 14 ppb ou maior, a morfologia muda de peletizada para filamentosa, acompanhada por um declínio rápido na produção de ácido cítrico. Inversamente, concentrações baixas e/ou a omissão de Mn2+ do meio nutriente de Aspergillus niger podem resultar em desenvolvimento morfológico anormal que é caracterizado por inchação de esporo aumentado, e hifas bolhosas, atarracadas. Como resultado, agentes quelantes são frequentemente adicionados aos meios de produção a fim de manter a concentração em uma faixa aceitável; no entanto, a presença de agentes quelantes pode frequentemente limitar a produção de produtos finais desejados e frequentemente é necessário subsequentemente remover os referidos agentes quelantes com custos adicionais acrescentados.

[00282]Consequentemente, nesse Exemplo, cepas de A. niger 11414 e 1015 mutantes que compreendem o gene FungiSNP_18 sob o controle do promotor man8p (ID. DE SEQ. Nº: 1), bem como cepas de A. niger 11414 e 1015 parentais, são desenvolvidas sob condições de cultura submersa em meios que contêm níveis variáveis de Mn2+ e desprovidos de agentes quelantes a fim de determinar se a fusão man8p-FungiSNP_18 confere na cepa resultante a habilidade para manter uma morfologia de pellet na presença de Mn2+.

[00283]As cepas 11414 e 1015 mutantes que compreendem o gene da fusão man8p-FungiSNP_18 são geradas como descrito nos Exemplos acima. Além disso, as cepas mutantes, nem como as cepas parentais, são desenvolvidas em meios CAP suplementados sem Mn2+, ou Mn2+ a 10 ppb, 11 ppb, 12 ppb, 13 ppb, 14 ppb, 15 ppb ou 1.000 ppb por 72 horas a 30°C com agitação a 250 rpm a fim de avaliar os efeitos de Mn2+ sobre o desenvolvimento morfológico de cada cepa. Exemplo 5: Engenharia genômica HTP de fungos filamentosos: confirmação do gene que afeta a morfologia fúngica filamentosa

[00284]Esse exemplo demonstra o uso do método de SNPSWAP nos fungos filamentosos, Aspergillus niger, a fim de confirmar que o gene nikA de Aspergillus desempenha um papel em uma via de resposta osmótica e pode afetar a morfologia da célula fúngica, bem como ajuda na produção de ácido cítrico. Além disso, esse exemplo foi usado para confirmar que fungiSNP_18 na Tabela 4 é nikA de Aspergillus, que é o ortólogo de A. niger de N. crassa nik1. Métodos

[00285]Nesse Exemplo, protoplastos de uma cepa de A. niger de base (ou seja, ATCC 1015) e cepa de produção (ou seja, ATCC 11414) foram gerados, transformados e submetidos a um SNPSWP como descrito no Exemplo 1 e WO 2018/226900, depositado em 6 de junho de 2018, que é incorporado por referência nesse relatório descritivo. Em resumo, protoplastos gerados da cepa de base foram transformados com uma única construção que continha um gene marcador selecionável (ou seja, pyrG) flanqueado por uma sequência complementar à sequência genômica que flanqueia o gene nikA na cepa de base a fim de dirigir a integração do gene marcador no genoma da cepa de base ou co-transformados com duas construções (“construções de marcador dividido”) como descrito no Exemplo 1. Como descrito no Exemplo 1, cada uma das duas construções continha uma porção sobreposta de um marcador selecionável (ou seja, pyrG nas FIGS. 4 e 5) e era flanqueada por uma sequência de repetição direta, como mostrado nas FIGS. 4 e 5, que continha a mutação pontual SNP18 (ou seja, nikAPROD na FIG. 22 e Base_nikA- na FIG. 23A- B). As construções de marcador dividido foram geradas usando PCR de fusão e tiveram a qualidade controlada (QC’d) usando um analisador de fragmentos, como mostrado na FIG. 5. Além disso, cada uma dessas construções ainda compreendia uma sequência que flanqueia as porções da repetição direta de cada construção a fim de dirigir a integração no genoma da cepa de base no lócus nikA.

[00286]Adicionalmente, a fim de examinar o efeito do nikA do tipo selvagem na base genômica da cepa de produção (veja a FIG. 23A-B), o gene nikA do tipo selvagem foi introduzido em protoplastos gerados da cepa de produção (ou seja, A. niger ATCC 11414) usando um construção de marcador dividido com repetições diretas que não compreendiam a mutação pontual SNP18 e uma sequência que flanqueia as porções da repetição direta a fim de dirigir a integração no genoma da cepa de produção no lócus nikA. Produção de ácido cítrico

[00287]As cepas ATCC 1015 do tipo selvagem, cepas ATCC 1015 com as mutações SNP18 (ou seja, nikAPROD) ou cepas ATCC 1015 sem nikA (ou seja, nikAΔpyrG) , bem como cepas de produção ATCC 11414 com a mutação pontual nikA (ou seja, SNP18; Prod na FIG. 23A-B) ou com gene nikA do tipo selvagem (ou seja, Prod_nikA+ na FIG. 23A-B) foram desenvolvidas em 100 ml de Meios de Produção de Ácido Cítrico (CAP; 140 g de glicose, 3,1 g de NH4NO3, 0,15 g de KH2PO4, 0,15 g de NaCl, 2,2 g de MgSO4_7H2O, 6,6 mg de ZnSO4_7H2O, 0,1 mg de FeCl3) para induzir níveis elevados de produção de ácido cítrico. As culturas foram desenvolvidas em triplicata, em frascos de 250 ml em agitação a 250 rotações por minuto, a 30°C por 96 horas. Os micélios foram removidos do sobrenadante usando Miracloth (Millipore; #475855), e as titulações de ácido cítrico foram determinadas do sobrenadante usando um ensaio enzimático (Megazyme; K-CITR). Resposta ao estresse osmótico

[00288]Para exame microscópico, cepa ATCC 1015 do tipo selvagem, cepas ATCC 1015 com as mutações SNP18 (ou seja, nikAPROD) ou cepas ATCC 1015 sem nikA (ou seja, nikAΔpyrG) foram inoculadas pontualmente com 1.000 esporos em lâminas sobrepostas com meio ágar. O meio usado foi Meio Mínimo (MM; contém glicose, fonte de nitrogênio, e somente os sais necessários; estresse osmótico baixo) e MM com 1,0 M de

Sorbitol (estresse osmótico alto). As lâminas foram desenvolvidas de um dia para o outro a 3°C, e tiveram imagens obtidas usando um microscópio Olympus (BX53) perpendicular. As imagens foram obtidas sob ampliação de 400x.

[00289]Para exame da resposta ao estresse osmótico em placas, a cepa ATCC 1015 do tipo selvagem, cepas ATCC 1015 com as mutações SNP18 (ou seja, nikAPROD) ou cepas ATCC 1015 sem nikA (ou seja, nikAΔpyrG) foram inoculadas pontualmente com 1.000 esporos em MM com 0,05 g/litro de Verde Bromocresol (BGC), que é um indicador de pH usado para visualizar alterações no pH. BGC é azul em pH 6,5, e gradualmente fica amarelo à medida que o pH cai para pH 2. As placas foram desenvolvidas a 3°C por 48 horas. As regiões amarelas nas placas foram confirmadas como contendo ácido cítrico por extração de fragmentos de ágar e análise com ensaio enzimático (Megazyme). Resultados

[00290]Com relação à resposta ao estresse osmótico, como mostrado na FIG. 22, por meio de microscopia, a mutação do gene nikA resulta em um aumento nas células da ponta hifal, com a deleção de nikA resultando no maior aumento. As cepas examinadas em placas que contêm meios mínimos com um corante indicador de pH que pode visualizar uma queda no pH que corresponde à produção de ácido cítrico, surpreendentemente, mostraram que, sob as condições testadas, a cepa de deleção foi a que mais produziu ácido cítrico. Isso, muito provavelmente, foi consequência do aumento nas células da ponta hifal observado nessas cepas. Em contraste, quando as cepas testadas foram submetidas ao estresse osmótico (lado direito da FIG. 22) a cepa de deleção formou uma colônia menor e o aumento na produção de ácido cítrico não foi mais observado. Curiosamente, a mutação pontual resultou em uma diminuição na atividade de nikA mantendo, ao mesmo tempo, a habilidade para responder ao estresse osmótico. Isso mostrou que a redução da atividade de nikA (por redução da expressão gênica ou mutação) levou a uma alteração indesejável na morfologia mantendo, ao mesmo tempo, a habilidade para responder ao estresse osmótico. No entanto, esses dados também mostraram que a deleção de nikA pode aprimorar as fermentações daquelas células não colocadas sob estresse osmótico.

[00291]Com relação à produção de ácido cítrico, como mostrado na FIG. 23A-B, a mutação pontual do gene nikA/sln1 (ou seja, SNP18; ID. DE SEQ. Nº: 7) na cepa de base foi suficiente para levar a um aumento de 33% na titulação de ácido cítrico ao longo da evolução da fermentação. Esse aumento parece resultar de uma alteração na morfologia, levando a números maiores de células da ponta hifal. Modalidades numeradas adicionais da revelação

[00292]Outro tema contemplado pela presente revelação é apresentado nas modalidades numeradas seguintes:

1. Uma cepa variante de fungo filamentoso derivada de uma cepa parental, em que as células da cepa variante possuem um fenótipo de formação de pellets, não-micélio, comparadas com as células da cepa parental quando desenvolvidas em uma cultura submersa, causado pelo fato de que a cepa variante possui uma alteração genética em um ortólogo de Aspergillus niger (A. niger) de um gene SLN1 de Saccharomyces Cerevisiae (S. cerevisiae) ou um gene nik1 Neurospora crassa (N. crassa) que faz com que as células da cepa variante produzam uma quantidade reduzida e/ou uma forma menos ativa do ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

[00293]2. A cepa variante da modalidade 1, em que a cepa variante esporula normalmente, quando comparada com a cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas.

[00294]3. A cepa variante da modalidade 1 ou 2, em que a alteração genética compreende a substituição de um promotor nativo para o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um promotor que expressa mais fracamente o gene para o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa, comparado com o promotor nativo.

[00295]4. A cepa variante da modalidade 3, em que o promotor que expressa mais fracamente o gene para o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00296]5. A cepa variante da modalidade 3 ou 4, em que o promotor que expressa mais fracamente o gene para o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é selecionado do promotor do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00297]6. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que a alteração genética compreende a substituição de uma forma nativa do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa, em que o ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa codifica um ortólogo mutado de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa.

[00298]7. A cepa variante da modalidade 6, em que o ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

[00299]8. A cepa variante da modalidade 6 ou 7, em que o ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00300]9. A cepa variante da modalidade 1 ou 2, em que a alteração genética compreende a substituição de uma forma nativa do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um gene marcador selecionável e, dessa forma, remoção da forma nativa do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa do genoma da cepa variante.

[00301]10. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, que compreende ainda a ruptura de um ou mais genes dentro de uma cascata de sinalização da qual o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é um componente.

[00302]11. A cepa variante da modalidade 10, em que os (um ou mais) genes são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00303]12. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, que compreende ainda uma ruptura de um ou mais genes selecionados de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00304]13. A variante de qualquer uma das modalidades 10-12, em que a ruptura é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00305]14. A variante da modalidade 13, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00306]15. A cepa variante da modalidade 13 ou 14, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo é selecionado do promotor do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00307]16. A variante da modalidade 13, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes é selecionado da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

[00308]17. A variante de qualquer uma das modalidades acima, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00309]18. A variante da modalidade 17, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00310]19. A variante da modalidade 17, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00311]20. A variante da modalidade 17, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00312]21. A variante da modalidade 17, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00313]22. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que o fungo filamentoso é selecionado das espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00314]]23. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que o fungo filamentoso é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00315]24. A célula hospedeira fúngica filamentosa que compreende um promotor ligado operacionalmente a um gene que regula uma morfologia da célula hospedeira, em que o promotor é heterólogo para o gene, em que o promotor possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-4.

[00316]25. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 24, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação, quando comparada com uma célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira.

[00317]26. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 25, em que o meio de fermentação compreende pelo menos 14 ppb de manganês.

[00318]27. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 25 ou 26, em que o meio de fermentação é livre de agentes quelantes.

[00319]28. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-27, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa produz uma quantidade de um produto de interesse que é pelo menos igual à quantidade produzida pela célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira.

[00320]29. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-28, em que o gene que regula uma morfologia é selecionado de um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00321]30. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-29, em que o gene que regula uma morfologia é uma forma do tipo selvagem ou uma forma mutada do gene.

[00322]31. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-30, em que o gene que regula uma morfologia é o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa e o promotor é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

[00323]32. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-30, em que o gene que regula uma morfologia é o ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00324]33. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-32, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada das espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00325]34. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 24-33, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00326]35. Um caldo de fermentação que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e uma célula fúngica filamentosa que compreende um fenótipo de pellet não-micélio, em que o caldo é livre de um agente quelante, e em que os fungos filamentosos compreendem um ortólogo geneticamente alterado de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

[00327]36. O caldo de fermentação da modalidade 35, em que o ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende um promotor heterólogo ligado operacionalmente ao ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00328]37. O caldo de fermentação da modalidade 36, em que o promotor heterólogo é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

[00329]38. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 35-37, em que o ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende uma mutação.

[00330]39. O caldo de fermentação da modalidade 38, em que a mutação é um SNP.

[00331]40. O caldo de fermentação da modalidade 38 ou 39, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa possui uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00332]41. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 35-40, que compreende ainda ruptura de um ou mais genes dentro de uma cascata de sinalização da qual o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é um componente, em que os (um ou mais) genes são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00333]42. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 35-40, que compreende ainda uma ruptura de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00334]43. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 35-42, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada das espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00335]44. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 35-43, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00336]45. Um método para a geração de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa, que compreende as etapas de: a. fornecimento de um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; e b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos (um ou mais genes)-alvo que desempenham um papel na morfologia para a cepa fúngica filamentosa de base.

[00337]46. O método da modalidade 45, em que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

[00338]47. O método da modalidade 45 ou 46, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

[00339]48. O método da modalidade 47, em que a ruptura é um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), mutação missense, mutação nonsense, deleção e/ou inserção.

[00340]49. O método de qualquer uma das modalidades 45- 48, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8 ou qualquer combinação destes.

[00341]50. O método de qualquer uma das modalidades 45- 49, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia é o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00342]51. O método de qualquer uma das modalidades 45- 50, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia é o gene representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00343]52. O método de qualquer uma das modalidades 45- 51, em que a cepa fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00344]53. O método de qualquer uma das modalidades 45- 52, em que a cepa fúngica filamentosa é uma cepa de A. niger.

[00345]54. Um método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, que compreende as etapas de: a. fornecimento de diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para a cepa fúngica filamentosa de base; c. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação a uma cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, variações genéticas únicas que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos; d. fornecimento de diversos micróbios fúngicos filamentosos subsequentes nos quais, cada um deles, compreende uma combinação de variações genéticas únicas das variações genéticas presente em pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais selecionadas na etapa precedente para, dessa forma, criar uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente; e. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação à cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, combinações únicas de variação genética que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos adicionais; e f. repetição das etapas d)-e) uma ou mais vezes, de uma forma linear ou não linear, até que uma cepa fúngica filamentosa exiba um nível desejado de fenótipo morfológico aprimorado, comparado com o fenótipo morfológico da cepa fúngica filamentosa de produção, em que cada repetição subsequente cria uma nova biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa de cepas microbianas, em que cada cepa na nova biblioteca compreende variações genéticas que são uma combinação de variações genéticas selecionadas entre pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais de uma biblioteca precedente.

[00346]55. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 54, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

[00347]56. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 54, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

[00348]57. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 54, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

[00349]58. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 54, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

[00350]59. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54- 58, em que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

[00351]60. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54- 59, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

[00352]61. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54- 60, em que a ruptura é um SNP, mutação missense, mutação nonsense, deleção e/ou inserção.

[00353]62. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54-

60, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8 ou qualquer combinação destes.

[00354]63. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 62, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende a sequência do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00355]64. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54- 63, em que a cepa fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00356]65. O método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54-64, em que a cepa fúngica filamentosa é uma cepa de A. niger.

[00357]66. O método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 54-65, em que o aprimoramento fenotípico morfológico compreende a conferência da habilidade para formar uma morfologia de pellet não-micélio quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

[00358]67. O método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 66, em que as condições de cultura submersa compreendem um meio de cultura que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e é livre de agentes quelantes.

[00359]68. Uma célula hospedeira de fungo filamentoso que compreende uma modificação heteróloga do ortólogo da célula hospedeira de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, pela qual a proteína codificada pelo ortólogo modificado do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa possui atividade reduzida e/ou expressão reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga.

[00360]69. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 68, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação.

[00361]70. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 68 ou 69, em que a modificação heteróloga compreende substituição de um promotor nativo para o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um promotor que expressa mais fracamente o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa, comparado com o promotor nativo.

[00362]71. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-70, em que a modificação heteróloga compreende a substituição do ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com uma versão mutada do ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00363]72. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 71, em que a versão mutada do ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).

[00364]73. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 68 ou 69, em que a modificação heteróloga compreende a substituição do ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um gene marcador selecionável, pela qual a remoção do ortólogo do gene SLN1 nativo de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa do genoma da célula hospedeira de fungo filamentoso.

[00365]74. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-73 que compreende ainda uma modificação heteróloga de um ou mais genes dentro de uma via bioquímica da qual o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é um componente.

[00366]75. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 74, em que os (um ou mais) genes são selecionados do ortólogo do gene Ssk1 de S. cerevisiae, do ortólogo do gene Ssk2 de S. cerevisiae, do ortólogo do gene Ypd1 de S. cerevisiae, do ortólogo do gene Skn7 S. cerevisiae ou qualquer combinação destes.

[00367]76. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 68 ou 69, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00368]77. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 68 ou 69, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00369]78. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 77, em que a modificação heteróloga compreende substituição de um promotor nativo para o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um promotor que expressa mais fracamente o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa, comparado com o promotor nativo.

[00370]79. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 78, em que o promotor que expressa mais fracamente o gene para o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00371]80. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 78, em que o promotor que expressa mais fracamente o gene para o ortólogo de A. niger da proteína SLN1 de S. cerevisiae ou da proteína Nik1 de N. crassa é selecionado do promotor do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00372]81. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 77 ou 78, em que a modificação heteróloga compreende a substituição do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com uma versão mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00373]82. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 81, em que a versão mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende um SNP.

[00374]83. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 82, em que o ortólogo mutado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa compreende a sequência do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00375]84. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 77, em que a modificação heteróloga compreende a substituição do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa com um gene marcador selecionável, pela qual a remoção do ortólogo nativo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa do genoma da célula hospedeira de fungo filamentoso.

[00376]85. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 77, que compreende ainda uma modificação heteróloga de um ou mais genes dentro de uma via bioquímica da qual o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é um componente.

[00377]86. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 85, em que os (um ou mais) genes são selecionados do ortólogo de A. niger do gene Ypd1 de S. cerevisiae com o ID. DE SEQ. Nº: 9, do ortólogo de A. niger do gene Ssk1 de S. cerevisiae com o ID. DE SEQ. Nº: 10, do ortólogo de A. niger do gene Skn7 de S. cerevisiae com o ID. DE SEQ. Nº: 11 ou 12, do ortólogo de A. niger do gene Ssk2 de S. cerevisiae com o ID. DE SEQ. Nº: 13 ou qualquer combinação destes.

[00378]87. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 77, que compreende ainda uma ruptura de um ou mais genes selecionados de uma versão que não contém SNP de um gene com sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00379]88. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 87, em que a ruptura é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00380]89. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 88, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00381]90. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 88, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo é selecionado do promotor do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ.

Nº: 2.

[00382]91. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 88, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

[00383]92. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 73, 84 ou 88, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00384]93. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 92, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00385]94. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 92, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00386]95. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 92, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00387]96. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 92, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00388]97. Uma cepa variante de fungo filamentoso derivada de uma cepa parental, em que células da cepa variante possuem um fenótipo de formação de pellets, não- micélio, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas em uma cultura submersa, causado pelo fato de que a cepa variante possui uma alteração genética em um ou mais genes de uma via de resposta osmótica que faz com que as células da cepa variante produzam uma quantidade reduzida e/ou forma menos ativa da proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

[00389]98. A cepa variante da modalidade 97, em que a cepa variante esporula normalmente, quando comparada com a cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas.

[00390]99. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que o fungo filamentoso é selecionado espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00391]100. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que o fungo filamentoso é Aspergillus niger (A. niger) ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00392]101. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00393]102. A cepa variante da modalidade 100, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00394]103. A cepa variante da modalidade 100, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00395]104. A cepa variante da modalidade 100, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ou um gene nik1 Neurospora crassa (N. crassa).

[00396]105. A variante da modalidade 104, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00397]106. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, em que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00398]107. A cepa variante da modalidade 106, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes,

comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00399]108. A cepa variante da modalidade 106 ou 107, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00400]109. A cepa variante da modalidade 106, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00401]110. A cepa variante da modalidade 109, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00402]111. A cepa variante da modalidade 109, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00403]112. A cepa variante da modalidade 109, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00404]113. A cepa variante da modalidade 109, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00405]114. A cepa variante da modalidade 106, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

[00406]115. A cepa variante da modalidade 114, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00407]116. A cepa variante de qualquer uma das modalidades acima, que compreende ainda uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00408]117. A cepa variante da modalidade 116, em que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00409]118. A cepa variante da modalidade 117, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00410]119. A cepa variante da modalidade 117 ou 118, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00411]120. A cepa variante da modalidade 117, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00412]121. A cepa variante da modalidade 120, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00413]122. A cepa variante da modalidade 120, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00414]123. A cepa variante da modalidade 120, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00415]124. A cepa variante da modalidade 120, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00416]125. A cepa variante da modalidade 117, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

[00417]126. A cepa variante da modalidade 125, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

[00418]127. Uma célula hospedeira fúngica filamentosa que compreende um promotor ligado operacionalmente a um gene que regula uma morfologia da célula hospedeira, em que o promotor é heterólogo para o gene, em que o promotor possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-4.

[00419]128. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 127, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação, quando comparada com uma célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira.

[00420]129. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 128, em que o meio de fermentação compreende pelo menos 14 ppb de manganês.

[00421]130. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 127 ou 128, em que o meio de fermentação é livre de agentes quelantes.

[00422]131. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-130, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa produz uma quantidade de um produto de interesse que é pelo menos igual à quantidade produzida pela célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula uma morfologia da célula hospedeira.

[00423]132. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 131, em que o produto de interesse é ácido cítrico ou uma enzima de interesse.

[00424]133. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-132, em que o gene que regula uma morfologia é selecionado de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00425]134. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-133, em que o gene que regula uma morfologia é uma forma do tipo selvagem ou uma forma mutada do gene.

[00426]135. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-134, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera,

Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00427]136. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-135, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00428]137. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 133-136, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00429]138. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 136, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00430]139. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 136, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00431]140. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 136, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

[00432]141. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 140, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00433]142. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 140, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00434]143. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 127-142, em que o promotor é selecionado da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

[00435]144. Uma célula hospedeira de fungo filamentoso que compreende uma modificação heteróloga de um ou mais genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira, em que uma proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados possuem atividade reduzida e/ou expressão reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira.

[00436]145. A célula hospedeira de fungo filamentoso da modalidade 144, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação.

[00437]146. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 144 ou 145, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00438]147. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 144 ou 145, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00439]148. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 144-147, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00440]149. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 147, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00441]150. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 147, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00442]151. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 147, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00443]152. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 151, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP de uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00444]153. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 144-152, em que a modificação heteróloga é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00445]154. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 153, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00446]155. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 153 ou modalidade 154, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00447]156. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 153, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00448]157. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 156, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00449]158. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 156, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00450]159. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 156, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00451]160. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 156, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00452]161. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 153, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

[00453]162. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 161, em que os (um ou mais) genes da via do estresse osmótico consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae do gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00454]163. A célula hospedeira fúngica filamentosa de qualquer uma das modalidades 144-162, que compreende ainda uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00455]164. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 163, em que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos (um ou mais) genes com um promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos (um ou mais) genes com uma forma mutada dos (um ou mais) genes, substituição dos (um ou mais) genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

[00456]165. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 164, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

[00457]166. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 164 ou modalidade 165, em que o promotor que expressa fracamente os (um ou mais) genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

[00458]167. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 164, em que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

[00459]168. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 167, em que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

[00460]169. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 167, em que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

[00461]170. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 167, em que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

[00462]171. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 167, em que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

[00463]172. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 164, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

[00464]173. A célula hospedeira fúngica filamentosa da modalidade 172, em que a forma mutada dos (um ou mais) genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

[00465]174. Um caldo de fermentação que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e uma célula fúngica filamentosa que compreende um fenótipo de pellet não-micélio, em que o caldo é livre de um agente quelante, e em que a célula fúngica filamentosa compreende um ou mais genes geneticamente alterados de uma via de resposta osmótica da célula fúngica filamentosa.

[00466]175. O caldo de fermentação da modalidade 174, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica estão ligados operacionalmente a um promotor heterólogo.

[00467]176. O caldo de fermentação da modalidade 175, em que o promotor heterólogo é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

[00468]177. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 174-176, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica compreende uma mutação.

[00469]178. O caldo de fermentação da modalidade 177, em que a mutação é um SNP.

[00470]179. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 174-178, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00471]180. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 174-178, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00472]181. O caldo de fermentação de qualquer uma das modalidades 174-180, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos geneticamente alterados de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00473]182. O caldo de fermentação da modalidade 180, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos geneticamente alterados de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00474]183. O caldo de fermentação da modalidade 180, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são formas geneticamente alteradas de genes com sequências de ácidos nucleicos selecionadas do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00475]184. O caldo de fermentação da modalidade 180, em que os (um ou mais) genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

[00476]185. O caldo de fermentação da modalidade 184, em que o ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é um gene com uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00477]186. Um método para a geração de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa, que compreende as etapas de: a. fornecimento de um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; e b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos (um ou mais genes)-alvo que desempenham um papel na resposta ao estresse osmótico para a cepa fúngica filamentosa de base.

[00478]187. O método da modalidade 186, em que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

[00479]188. O método da modalidade 186 ou 187, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

[00480]189. O método da modalidade 188, em que a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou uma inserção.

[00481]190. O método de qualquer uma das modalidades 186-189, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00482]191. O método de qualquer uma das modalidades 180-190, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium,

Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00483]192. O método de qualquer uma das modalidades 180-190, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00484]193. O método de qualquer uma das modalidades 190-192, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00485]194. O método da modalidade 192, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00486]195. O método da modalidade 192, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00487]196. O método da modalidade 192, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

[00488]197. O método da modalidade 196, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00489]198. O método da modalidade 192, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00490]199. Um método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, que compreende as etapas de: a. fornecimento de diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para a cepa fúngica filamentosa de base; c. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação a uma cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, variações genéticas únicas que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos; d. fornecimento de diversos micróbios fúngicos filamentosos subsequentes nos quais, cada um deles, compreende uma combinação de variações genéticas únicas das variações genéticas presente em pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais selecionadas na etapa precedente para, dessa forma, criar uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente; e. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação à cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, combinações únicas de variação genética que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos adicionais; e f. repetição das etapas d)-e) uma ou mais vezes, de uma forma linear ou não linear, até que uma cepa fúngica filamentosa exiba um nível desejado de fenótipo morfológico aprimorado, comparado com o fenótipo morfológico da cepa fúngica filamentosa de produção, em que cada repetição subsequente cria uma nova biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa de cepas microbianas, em que cada cepa na nova biblioteca compreende variações genéticas que são uma combinação de variações genéticas selecionadas entre pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais de uma biblioteca precedente.

[00491]200. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 199, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

[00492]201. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 199, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

[00493]202. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 199, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

[00494]203. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 199, em que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

[00495]204. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 203, em que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

[00496]205. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 204, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

[00497]206. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 205, em que a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou inserção.

[00498]207. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 205, em que os (um ou mais) genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

[00499]208. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 207, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum,

Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

[00500]209. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199- 207, em que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

[00501]210. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 207- 209, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00502]211. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 209, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

[00503]212. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 209, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

[00504]213. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 209, em que os (um ou mais) genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

[00505]214. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 213, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00506]215. O método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 213, em que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

[00507]216. O método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção de qualquer uma das modalidades 199-215, em que o aprimoramento fenotípico morfológico compreende a conferência da habilidade para formar uma morfologia de pellet não-micélio quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

[00508]217. O método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção da modalidade 216, em que as condições de cultura submersa compreendem um meio de cultura que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e é livre de agentes quelantes.

[00509]218. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 1-23, em que a quantidade de ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida pela cepa variante é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% comparada com uma quantidade de ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida por células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

[00510]219. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 1-23 ou 218, em que a quantidade de ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida pela cepa variante e/ou cepa parental é medida usando espectrometria de massa quantitativa ou um imunoensaio, em que o imunoensaio é selecionado de um ensaio Luminex, um ELISA ou uma análise quantitativa por Western blot.

[00511]220. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 1-23, em que a atividade do ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida pela cepa variante é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99%, comparada com a atividade do ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida por células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

[00512]221. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 1-23 ou 220, em que a atividade do ortólogo funcional de A. niger de uma proteína SLN1 de S. cerevisiae ou uma proteína Nik1 de N. crassa produzida pela cepa variante e/ou cepa parental é medida usando um ensaio de quinase.

[00513]222. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-96, em que a expressão da proteína codificada pelo ortólogo modificado do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em relação à expressão de uma proteína codificada por um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga.

[00514]223. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-96 ou 222, em que a expressão da proteína codificada pelo ortólogo modificado do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa ou o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa na célula hospedeira de fungo filamentoso e/ou na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga é medida usando espectrometria de massa quantitativa ou um imunoensaio, em que o imunoensaio é selecionado de um ensaio Luminex, um ELISA ou uma análise quantitativa por Western blot.

[00515]224. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-96, em que a atividade da proteína codificada pelo ortólogo modificado do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em relação à atividade de uma proteína codificada por um ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga.

[00516]225. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 68-96 ou 224, em que a atividade da proteína codificada pelo ortólogo modificado do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa ou o ortólogo do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene Nik1 de N. crassa na célula hospedeira de fungo filamentoso e/ou na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui a modificação heteróloga é medida usando um ensaio de quinase.

[00517]226. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 97-126, em que a quantidade de proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica que é produzida pela cepa variante é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% comparada com uma quantidade de proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica que é produzida pela cepa parental quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

[00518]227. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 97-126 ou 226, em que a quantidade de proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica produzida pela variante e/ou cepa parental é medida usando espectrometria de massa quantitativa ou um imunoensaio, em que o imunoensaio é selecionado de um ensaio Luminex, um ELISA ou uma análise quantitativa por Western blot.

[00519]228. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 97-126, em que a atividade de proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica que é produzida pela cepa variante é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99%,

comparada com a atividade de proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica que é produzida pela cepa parental quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

[00520]229. A cepa variante de qualquer uma das modalidades 97-126 ou 228, em que a atividade de uma proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica produzida pela cepa variante e/ou pela cepa parental é medida usando um ensaio de quinase.

[00521]230. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 144-173, em que a expressão da proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em relação à expressão de uma proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira.

[00522]231. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 144-173 ou 230, em que a expressão da proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados na célula hospedeira de fungo filamentoso e/ou na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira é medida usando espectrometria de massa quantitativa ou um imunoensaio, em que o imunoensaio é selecionado de um ensaio Luminex, um ELISA ou uma análise quantitativa por Western blot.

[00523]232. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 144-173, em que a atividade da proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados é reduzida por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em relação à atividade de uma proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira.

[00524]233. A célula hospedeira de fungo filamentoso de qualquer uma das modalidades 144-173 ou 232, em que a atividade da proteína codificada pelos (um ou mais) genes modificados na célula hospedeira de fungo filamentoso e/ou na célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os (um ou mais) genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira é medida usando a atividade de quinase. SEQUÊNCIAS DA REVELAÇÃO COM IDENTIFICADORES ID. DE SEQ. Nº NOME (NOME CURTO) FONTE ÁCIDO DESCRIÇÃO

NUCLEICO ID. DE SEQ. Nº: Aspergillus 1 Promotor de manB de manBp niger Aspergillus niger Aspergillus 2 Gene amyB de amyBp oryzae Aspergillus oryzae Aspergillus 3 Promotor srpB de srpBp niger Aspergillus niger 4 Promotor mbfA de Aspergillus mbfAp Aspergillus niger niger FungiSNP_9 Aspergillus 5 SNP contendo niger sequências para gene relacionado à morfologia FungiSNP_12 Aspergillus 6 SNP contendo niger sequências para gene relacionado à morfologia FungiSNP_18 Aspergillus 7 Ortólogo de A. niger niger que contém SNP do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa; Versão de A. niger que contém SNP do gene nikA (o SNP é uma mutação missense que converte uma histidina na posição de aminoácido 272 em uma tirosina) FungiSNP_40 Aspergillus 8 SNP contendo niger sequências para gene relacionado à morfologia Aspergillus 9 Sequência para uma niger versão de um ortólogo Ortólogo de Ypd1 de A. niger do gene Ypd1 de S. cerevisiae Aspergillus 10 Sequência para uma niger versão de um ortólogo Ortólogo de Ssk1 de A. niger do gene Ssk1 de S. cerevisiae Aspergillus 11 Sequência para uma niger versão de um ortólogo Ortólogo de Skn7 #1 de A. niger do gene Skn7 de S. cerevisiae Aspergillus 12 Sequência para uma niger versão de um ortólogo Ortólogo de Skn7 #2 de A. niger do gene Skn7 de S. cerevisiae Aspergillus 13 Sequência para uma niger versão de um ortólogo Ortólogo de Ssk2 de A. niger do gene Ssk2 de S. cerevisiae Aspergillus 14 Ortólogo de A. niger niger do gene SLN1 de S. cerevisiae; ortólogo de A. niger do gene nik1 de N. crassa; versão que não contém Ortólogo de SNP do gene nikA de SLN1/nik1 A. niger (ASPNIDRAFT_39736) (ASPNIDRAFT_39767); sequências que não contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_18 Aspergillus 15 Ortólogo de A. niger Ortólogo de SLN1 niger do gene SLN1 de S. (ASPNIDRAFT_183029) cerevisiae Aspergillus 16 Ortólogo de A. niger Ortólogo de SLN1 niger do gene SLN1 de S. (ASPNIDRAFT_41708) cerevisiae Aspergillus 17 Ortólogo de A. niger Ortólogo de SLN1 niger do gene SLN1 de S. (ASPNIDRAFT_37188) cerevisiae ASPNIDRAFT_214017 Aspergillus 18 Ortólogo de A. niger niger do gene Ste11 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_55574 Aspergillus 19 Ortólogo de A. niger niger do gene Bck1 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_38443 Aspergillus 20 Ortólogo de A. niger niger do gene Ssk2/22 de S.

cerevisiae ASPNIDRAFT_209137 Aspergillus 21 Ortólogo de A. niger niger do gene Ste7 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_211983 Aspergillus 22 Ortólogo de A. niger niger do gene Mkk2/22 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_51782 Aspergillus 23 Ortólogo de A. niger niger do gene Pbs2 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_207710 Aspergillus 24 Ortólogo de A. niger niger do gene Fus1/Kss3 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_205706 Aspergillus 25 Ortólogo de A. niger niger do gene Mpk1 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_52673 Aspergillus 26 Ortólogo de A. niger niger do gene Hog1 de S. cerevisiae ASPNIDRAFT_37188 Aspergillus 27 Ortólogo de A. niger niger de Phk1/2 de S. pombe (S. pombe); gene Chk1 de C. albicans ASPNIDRAFT_174806 Aspergillus 28 Ortólogo de A. niger niger do gene Phk3 de S. pombe ASPNIDRAFT_214261 Aspergillus 29 Ortólogo de A. niger niger do gene Ypd1 de S. cerevisiae; gene Spy1 de S. pombe.

ASPNIDRAFT_120745 Aspergillus 30 Ortólogo de A. niger niger do gene Ssk1 de S. cerevisiae; gene Mcs4 de S. pombe; gene SskA de C. albicans ASPNIDRAFT_37857 Aspergillus 31 Ortólogo de A. niger niger do gene Skn7 de S. cerevisiae; gene Prr1 de S. pombe; gene Skn7 de C. albicans ASPNIDRAFT_200656 Aspergillus 32 Ortólogo de A. niger niger do gene Rim15 de S. cerevisiae; gene Cek1 de S. pombe; gene Rim15 de C. albicans Aspergillus 33 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_44864 relacionado à morfologia para FungiSNP_06 Aspergillus 34 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_47328 relacionado à morfologia para FungiSNP_41 Aspergillus 35 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_37842 relacionado à morfologia para FungiSNP_43 ASPNIDRAFT_55560 Aspergillus 36 Sequências que não niger contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_20 Aspergillus 37 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_131243 relacionado à morfologia para FungiSNP_30 Aspergillus 38 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_127977 relacionado à morfologia para FungiSNP_32 Aspergillus 39 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_53655 relacionado à morfologia para FungiSNP_23 Aspergillus 40 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_123785 relacionado à morfologia para FungiSNP_16 Aspergillus 41 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_212853 relacionado à morfologia para FungiSNP_11 Aspergillus 42 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_196832 relacionado à morfologia para FungiSNP_09 Aspergillus 43 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_38583 relacionado à morfologia para FungiSNP_36 Aspergillus 44 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_121820 relacionado à morfologia para FungiSNP_24 Aspergillus 45 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_44868 relacionado à morfologia para FungiSNP_07 Aspergillus 46 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_212500 relacionado à morfologia para FungiSNP_02 Aspergillus 47 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_119127 relacionado à morfologia para FungiSNP_12 Aspergillus 48 Sequências que não ASPNIDRAFT_206922 niger contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_21 Aspergillus 49 Sequências que não niger contêm SNP para gene ASPNIDRAFT_52574 relacionado à morfologia para FungiSNP_40 SLN1 S. cerevisiae 50 Ste 11 S. cerevisiae 51 Bck 1 S. cerevisiae 52 Ssk2 S. cerevisiae 53 Ste7 S. cerevisiae 54 Mkk2/22 S. cerevisiae 55 Pbs2 S. cerevisiae 56 Fus1/Kss3 S. cerevisiae 57 Mpk1 S. cerevisiae 58 Hog1 S. cerevisiae 59 Chk1 C. albicans 60 Phk3 S. pombe 61 Ypd1 S. cerevisiae 62 Spy1 S. pombe 63 Ssk1 S. cerevisiae 64 Mcs4 S. pombe 65 SskA C. albicans 66 Skn7 S. cerevisiae 67 Prr1 S. pombe 68 Skn7 C. albicans 69 Rim15 S. cerevisiae 70 Cek1 S. pombe 71 Rim15 C. albicans 72 Ssk22 S. cerevisiae 73 Phk1 S. pombe 74 Phk22 S. pombe 75 Aspergillus 76 Outra versão de niger sequências que não FungiSNP_18 que não contêm SNP para gene contém SNP relacionado à morfologia para FungiSNP_18 FungiSNP_09 que não Aspergillus 77 Outra versão de contém SNP niger sequências que não contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_09 FungiSNP_12 que não Aspergillus 78 Outra versão de contém SNP niger sequências que não contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_12 FungiSNP_40 que não Aspergillus 79 Outra versão de contém SNP niger sequências que não contêm SNP para gene relacionado à morfologia para FungiSNP_40

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00525]Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publicações de patente e pedidos de patente citados nesse relatório descritivo são incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos.

[00526]No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente citados nesse relatório descritivo não é, e não deve ser considerado como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que eles constituem técnica estabelecida válida ou formem parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.

[00527]Além disso, os seguintes pedidos particulares são incorporados nesse relatório descritivo por referência: Pedido U.S. Nº 15/396.230 (Publicação U.S. Nº US 2017/0159045 A1), depositado em 30 de dezembro de 20016; PCT/US2016/065465 (WO 2017/100377 A1), depositado em 07 de dezembro de 2016; Pedido U.S. Nº 15/140,296 (US 2017/0316353 A1), depositado em 27 de abril de 2016; PCT/US2017/029725 (WO 2017/189784 A1), depositado em 26 de abril de 2017; PCT/US2016/065464 (WO 2017/100376 A2), depositado em 07 de dezembro de 2016; Pedido U.S. Provisório Nº 62/431.409, depositado em 07 de dezembro de 2016; Pedido U.S. Provisório Nº 62/264.232, depositado em 07 de dezembro de 2015; e Pedido U.S. Provisório Nº 62/368.786, depositado em 29 de julho de 2016. Além disso, os seguintes pedidos particulares são incorporados nesse relatório descritivo por referência: PCT/US2017/069086 (WO 2018/12607), depositado em 29 de dezembro de 2017; PCT/US2018/036360 (WO 2018/226900), depositado em 6 de junho de 2018; Pedido U.S. Provisório Nº 62/441.040, depositado em 30 de dezembro de 2016 e Pedido

U.S. Provisório Nº 62/515.907, depositado em 6 de junho de

2017.

Claims (121)

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa variante fúngica filamentosa derivada de uma cepa parental, caracterizada pelo fato de que células da cepa variante possuem um fenótipo de formação de pellets, não-micélio, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas em uma cultura submersa, causado pelo fato de que a cepa variante possui uma alteração genética em um ou mais genes de uma via de resposta osmótica que faz com que as células da cepa variante produzam uma quantidade reduzida e/ou forma menos ativa da proteína funcional codificada por um ou mais genes da via de resposta osmótica, comparadas com células da cepa parental quando desenvolvidas sob condições de cultura submersa.

2. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa variante esporula normalmente, quando comparada com a cepa parental quando desenvolvida sob condições de crescimento não submersas.

3. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o fungo filamentoso é selecionado de espécies Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

4. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o fungo filamentoso é Aspergillus niger (A. niger) ou teleomorfos ou anamorfos deste.

5. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

6. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

7. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

8. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ou um gene nik1 Neurospora crassa (N. crassa).

9. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

10. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizada pelo fato de que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos genes com um promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos um ou mais genes com uma forma mutada dos um ou mais genes, substituição dos um ou mais genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

11. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

12. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

13. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

14. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

15. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

16. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

17. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à feomicina.

18. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

19. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

20. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada ainda por compreender uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

21. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos um ou mais genes com um promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos um ou mais genes com uma forma mutada dos um ou mais genes, substituição dos um ou mais genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

22. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

23. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

24. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

25. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

26. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

27. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

28. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 24,

caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à neomicina.

29. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

30. Cepa variante, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

31. Célula hospedeira fúngica filamentosa, caracterizada por compreender um promotor ligado operacionalmente a um gene que regula a morfologia da célula hospedeira, em que o promotor é heterólogo para o gene, em que o promotor possui uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-4.

32. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação, quando comparada com uma célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula a morfologia da célula hospedeira.

33. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o meio de fermentação compreende pelo menos 14 ppb de manganês.

34. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que o meio de fermentação é livre de agentes quelantes.

35. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa produz uma quantidade de um produto de interesse que é pelo menos igual à quantidade produzida pela célula hospedeira fúngica filamentosa de referência sem o promotor ligado operacionalmente ao gene que regula a morfologia da célula hospedeira.

36. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o produto de interesse é ácido cítrico ou uma enzima de interesse.

37. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o gene que regula a morfologia é selecionado de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

38. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o gene que regula a morfologia é uma forma do tipo selvagem ou uma forma mutada do gene.

39. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor,

Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

40. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

41. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37-40, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

42. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

43. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

44. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

45. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

46. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

47. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

48. Célula hospedeira fúngica filamentosa caracterizada por compreender uma modificação heteróloga de um ou mais genes da via de resposta osmótica da célula hospedeira, em que os um ou mais genes modificados possuem atividade reduzida e/ou expressão reduzida em relação a uma célula hospedeira fúngica filamentosa parental que não possui os um ou mais genes modificados da via de resposta osmótica da célula hospedeira.

49. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa possui uma morfologia de pellet, não-micélio, quando desenvolvida sob condições de cultura submersa em meios de fermentação.

50. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium,

Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

51. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

52. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

53. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

54. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

55. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

56. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP de uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

57. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a modificação heteróloga é selecionada da substituição de um promotor nativo dos um ou mais genes com um promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos um ou mais genes com uma forma mutada dos um ou mais genes, substituição dos um ou mais genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

58. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

59. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

60. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

61. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

62. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

63. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

64. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à feomicina.

65. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes da via da resposta ao estresse osmótico compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

66. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via do estresse osmótico consistem em um ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae do gene nik1 de N. crassa, em que a forma mutada do ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N.

crassa é a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº:

7.

67. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada ainda por compreender uma alteração genética de um ou mais genes selecionada de uma versão que não contém SNP dos genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

68. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a alteração genética é selecionada da substituição de um promotor nativo dos um ou mais genes com um promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, substituição dos um ou mais genes com uma forma mutada dos um ou mais genes, substituição dos um ou mais genes com um marcador selecionável, ou uma combinação destes.

69. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, é selecionado de um promotor de amyB ou um promotor de manB.

70. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizada pelo fato de que o promotor que expressa fracamente os um ou mais genes, comparado com o promotor nativo, compreende, consiste basicamente ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2.

71. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável é selecionado de um gene de marcador auxotrófico, um gene de marcador colorimétrico, gene de resistência a antibiótico ou um gene de marcador direcional.

72. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador colorimétrico é um gene aygA.

73. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador auxotrófico é selecionado de um gene argB, um gene trpC, um gene pyrG ou um gene met3.

74. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que o gene de marcador direcional é selecionado de um gene de acetamidase (amdS) ou um gene de nitrato redutase (niaD).

75. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a antibiótico é um gene ble, em que o gene ble confere resistência à feomicina.

76. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes compreende um polimorfismo de nucleotídeo único.

77. Célula hospedeira fúngica filamentosa, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que a forma mutada dos um ou mais genes é uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do ID. DE SEQ. Nº: 5, 6 ou 8.

78. Caldo de fermentação caracterizado por compreender pelo menos 14 ppb de manganês e uma célula fúngica filamentosa que compreende um fenótipo de pellet não- micélio, em que o caldo é livre de um agente quelante, e em que a célula fúngica filamentosa compreende um ou mais genes geneticamente alterados de uma via de resposta osmótica da célula fúngica filamentosa.

79. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica estão ligados operacionalmente a um promotor heterólogo.

80. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é selecionado do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.

81. Caldo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78-80, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica compreende uma mutação.

82. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a mutação é um SNP.

83. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

84. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

85. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos geneticamente alterados de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

86. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são ortólogos geneticamente alterados de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela

7.

87. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica são formas geneticamente alteradas de genes com sequências de ácidos nucleicos selecionadas do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

88. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes geneticamente alterados da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa.

89. Caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o ortólogo geneticamente alterado de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é um gene com uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

90. Método para a geração de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecimento de um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; e b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos (um ou mais genes)-alvo que desempenham um papel na resposta ao estresse osmótico para a cepa fúngica filamentosa de base.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

92. Método, de acordo com a reivindicação 90 ou 91, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

93. Método, de acordo com a reivindicação 92,

caracterizado pelo fato de que a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou uma inserção.

94. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

95. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

96. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94-96, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

99. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

100. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

102. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

103. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecimento de diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para uma cepa fúngica filamentosa de base, e um promotor ladder, em que o referido promotor ladder compreende diversos promotores que exibem perfis de expressão diferentes na cepa fúngica filamentosa de base; b. modificação por engenharia genética do genoma da cepa fúngica filamentosa de base para, dessa forma, criar um biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial que compreende diversas cepas fúngicas filamentosas individuais com variações genéticas únicas encontradas dentro de cada cepa das referidas diversas cepas fúngicas filamentosas individuais, em que cada uma das referidas variações genéticas únicas compreende um ou mais dos promotores do promotor ladder ligados operacionalmente a um dos diversos genes-alvo que desempenham um papel na morfologia para a cepa fúngica filamentosa de base; c. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial para aprimoramentos fenotípicos morfológicos over a cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma, variações genéticas únicas que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos; d. fornecimento de diversos micróbios fúngicos filamentosos subsequentes nos quais, cada um deles, compreende uma combinação de variações genéticas únicas das variações genéticas presente em pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais selecionadas na etapa precedente para, dessa forma, criar uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente; e. avaliação e seleção de cepas fúngicas filamentosas individuais da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente para aprimoramentos fenotípicos morfológicos em relação à cepa fúngica filamentosa de referência identificando, dessa forma,

combinações únicas de variação genética que conferem aprimoramentos fenotípicos morfológicos adicionais; e f. repetição das etapas d)-e) uma ou mais vezes, de uma forma linear ou não linear, até que uma cepa fúngica filamentosa exiba um nível desejado de fenótipo morfológico aprimorado, comparado com o fenótipo morfológico da cepa fúngica filamentosa de produção, em que cada repetição subsequente cria uma nova biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa de cepas microbianas, em que cada cepa na nova biblioteca compreende variações genéticas que são uma combinação de variações genéticas selecionadas entre pelo menos duas cepas fúngicas filamentosas individuais de uma biblioteca precedente.

104. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

105. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa da biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa inicial.

106. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

107. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa subsequente é um subconjunto de uma biblioteca combinatória completa de uma biblioteca de troca de promotor de cepa fúngica filamentosa precedente.

108. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 103- 107, caracterizado pelo fato de que o promotor ladder compreende os promotores encontrados na Tabela 2.

109. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia compreendem uma ruptura.

110. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a ruptura é um SNP, uma mutação missense, uma mutação nonsense, uma deleção e/ou inserção.

111. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes-alvo que desempenham um papel na morfologia são selecionados de um ou mais genes de uma via de resposta osmótica, versões que não contêm SNP de genes com sequências de ácidos nucleicos ID. DE SEQ. Nº: 5, 6, 8, ou qualquer combinação destes.

112. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é selecionada de espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora (por exemplo, Myceliophthora thermophila), Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tramates, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella ou teleomorfos ou anamorfos, e sinônimos ou equivalentes taxonômicas destas.

113. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa é A. niger ou teleomorfos ou anamorfos deste.

114. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111- 113, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos fúngicos filamentosos de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

115. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são ortólogos de A. niger de genes da via de resposta osmótica de levedura encontrados na Tabela 7.

116. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica são selecionados de genes com sequências de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 9, 10, 11, 12, 13 ou qualquer combinação destes.

117. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes da via de resposta osmótica consistem em um ortólogo de A. niger de um gene SLN1 de S. cerevisiae ou um gene nik1 de N. crassa.

118. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma versão que não contém SNP da sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

119. Método de troca de promotor para aprimoramento do fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o ortólogo de A. niger do gene SLN1 de S. cerevisiae ou do gene nik1 de N. crassa é uma sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 7.

120. Método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o aprimoramento fenotípico morfológico compreende a conferência da habilidade para formar uma morfologia de pellet não-micélio quando desenvolvida sob condições de cultura submersa.

121. Método de troca de promotor para o fenótipo morfológico de uma cepa fúngica filamentosa de produção, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura submersa compreendem um meio de cultura que compreende pelo menos 14 ppb de manganês e é livre de agentes quelantes.