BR112020005631A2 - Composições e métodos para eliciar uma resposta imune contra o clostridium difficile - Google Patents

Abstract

em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que inclui um toxoide a de clostridium difficile a e/ou um toxoide b de c. difficile e métodos de uso dos mesmos. em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para eliciar uma resposta imune em um ser humano contra uma infecção por c. difficile. o método inclui administrar ao ser humano uma dose eficaz de uma composição, que inclui um toxoide de c. difficile, em que a composição é administrada pelo menos duas vezes, em que a segunda administração é cerca de 30 dias após a primeira administração, e em que a resposta imune contra toxina a e/ou toxina b de c. difficile é sustentada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-

POSIÇÕES E MÉTODOS PARA ELICIAR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA O CLOSTRIDIUM DIFFICILE". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US No. 62/577.661, depositado em 28 de Setembro de 2017, Pedido Pro- visório US No. 62/576.603, depositado em 24 de Outubro de 2017, Pedido Provisório US No. 62/577.661, depositado em 26 de Outubro de 2017, e Pedido Provisório US No. 62/720.617, depositado em 21 de Agosto de 2018. Cada um destes pedidos de patente está aqui incor- porado por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] A presente invenção é direcionada a composições e méto- dos relativos a toxoides de Clostridium difficile e seus métodos.

ANTECEDENTE

[003] A Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria anaeróbica Gram-positiva associada a doenças gastrointestinais em humanos. A colonização de C. difficile geralmente ocorre no cólon se a flora intesti- nal natural é diminuída pelo tratamento com antibióticos. Uma infecção pode levar à diarreia associada a antibióticos e, às vezes, colite pseu- domembranosa através da secreção de toxinas de glicosilação, toxina A e toxina B (308 e 270 kDa, respectivamente), que são os principais fatores de virulência de C. difficile.

[004] Na última década, o número e a gravidade de surtos de C. difficile em hospitais, lares de idosos e outras instituições de assistên- cia a longo prazo aumentaram dramaticamente. Os fatores-chave nes- sa escalada incluem o surgimento de cepas patogênicas hipervirulen- tas, aumento do uso de antibióticos, métodos aprimorados de detec- ção e aumento da exposição a esporos no ar em unidades de saúde.

[005] Metronidazol e vancomicina representam o padrão de tra-

tamento atualmente aceito para o tratamento com antibióticos da do- ença associada a C. difficile (CDAD). No entanto, cerca de 20% dos pacientes que recebem esse tratamento experimentam uma recorrên- cia da infecção após um primeiro episódio de CDI, e até cerca de 50% desses pacientes sofrem de recorrências adicionais. O tratamento de recorrências representa um desafio muito significativo, e a maioria das recorrências geralmente ocorre dentro de um mês do episódio anterior.

[006] As respostas imunes humorais às toxinas de C. difficile de- sempenham um papel significativo na prevenção de um resultado mais grave ou na recorrência da doença em humanos. Os estudos clínicos sugerem uma correlação entre altas concentrações séricas de imuno- globulina antitoxina A (medida pelo ensaio imunossorvente enzimático) e proteção contra CDI ou recorrência após CDI primária. A imunização ativa com toxinas inativadas e a imunização passiva com anticorpos antitóxicos foram demonstradas para proteger os animais do desafio letal. Além disso, os hamsters tratados apenas com vancomicina apre- sentam uma taxa de mortalidade mais alta em comparação com os tratados com vancomicina mais anticorpos antitóxicos, indicando que a vacinação pode proporcionar uma vantagem sobre os antibióticos.

[007] Não existe um tratamento não invasivo altamente eficaz e aprovado para infecção complicada por C. difficile (CDI). Por conse- guinte, existe uma necessidade de composições imunogênicas e/ou terapêuticas e seus métodos direcionados a C. difficile.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[008] Para atender a essas e outras necessidades, a presente invenção refere-se a toxoides de C. difficile e métodos de uso dos mesmos. Quando aqui usado, os termos "toxoide", "toxina mutante" e "polipeptídeo" são sinônimos e são usados de forma intercambiável, a menos que indicado de outra forma. Em um aspecto, a invenção refe- re-se a uma vacina contra C. difficile atualmente sendo avaliada quan-

to à eficácia e segurança em indivíduos que estão em risco de CDI. A seleção de uma dose e regime ótimos de vacinação foi baseada em estudos, levando em consideração a imunogenicidade, a segurança e o potencial de proteção a curto e longo prazo.

[009] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um ser humano contra uma infecção por Clostridium difficile. O método inclui administrar ao ser humano uma dose eficaz de uma composição, que inclui um toxoide de C. diffi- cile, isto é, um polipeptídeo, em que a composição é administrada pelo menos duas vezes. Em uma modalidade, a segunda administração é pelo menos 7 dias após a primeira administração e a terceira adminis- tração é cerca de 30 dias após a primeira administração. Em uma mo- dalidade, a terceira administração é de cerca de 180 dias após a pri- meira administração. Em uma modalidade, a composição é adminis- trada pelo menos três vezes. Em uma modalidade, a segunda adminis- tração é de cerca de 30 dias após a primeira administração e a terceira administração é de cerca de 180 dias após a primeira ou a segunda administração. Em uma modalidade, a terceira administração é pelo menos 180 dias após a primeira administração.

[0010] Em uma modalidade, a resposta imune evocada inclui um anticorpo monoclonal neutralizante antitoxina A. Em uma modalidade, a resposta imune evocada inclui um anticorpo monoclonal neutralizan- te antitoxina B. Em uma modalidade, a resposta imune evocada inclui um anticorpo monoclonal neutralizante antitoxina A e um anticorpo monoclonal neutralizante antitoxina B, em que a concentração de anti- corpo monoclonal neutralizante é de pelo menos 10 µg/mL.

[0011] Em uma modalidade, a composição inclui um toxoide de C. difficile A e/ou um toxoide B de C. difficile, cada um com uma pureza de pelo menos 90% ou mais. Em uma modalidade, a composição in- clui um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, em uma proporção de cerca de 3 : 1 a cerca de 1 : 1. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição inclui um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, na relação de 1 : 1. Em uma modalidade, a composição inclui um adjuvante. Em uma modalidade, a composição inclui um adjuvante de alumínio.

[0012] Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 60 dias. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 180 dias após a pri- meira dose. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 180 dias após a segunda dose. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 365 dias após a primeira dose. Em uma modalidade, a res- posta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 365 dias após a segunda dose. Em uma mo- dalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. diffici- le é mantida por pelo menos cerca de 540 dias após a primeira dose. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 540 dias após a se- gunda dose.

[0013] Em uma modalidade, a segunda administração é pelo me- nos 7 dias após a primeira administração e a terceira administração é pelo menos 30 dias após a primeira administração. Em uma modalida- de, a terceira administração é pelo menos 30 dias após a primeira ad- ministração. Em uma modalidade, a segunda administração é pelo menos 7 dias após a primeira administração e a terceira administração é pelo menos 180 dias após a primeira ou a segunda administração. Em uma modalidade, a terceira administração é pelo menos 180 dias após a primeira administração. Em uma modalidade, a composição inclui um toxoide A de C. difficile A e/ou um toxoide B de C. difficile, cada um com uma pureza de pelo menos 90% ou mais.

[0014] Em uma modalidade, a composição inclui um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, em uma relação de cerca de 3 : 1 a cerca de 1 : 1. Em uma modalidade, a composição inclui um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, na relação de 1 : 1. Em uma modalidade, a composição inclui um adjuvante. Em uma modalidade, a composição inclui um adjuvante de alumínio. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 60 dias. Em uma modali- dade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 180 dias. Em uma modalidade, a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 365 dias.

[0015] Em uma modalidade, o toxoide A de C. difficile está ligado ao adjuvante de alumínio. Em uma modalidade, o toxoide B de C. diffi- cile está ligado ao adjuvante de alumínio. Em uma modalidade, o to- xoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile são liofilizados.

[0016] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina A que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de rece- ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0017] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe-

cífico para a toxina B que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de rece- ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0018] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina A que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de rece- ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0019] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina B que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de rece- ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que está pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0020] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina A que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de rece-

ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0021] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 4 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina B que é pelo menos 8 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de rece- ber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 16 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de cito- toxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0022] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose quando medida cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citoto- xicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose quando medida cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a segunda dose que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose quando medida cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a terceira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose quando medida cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a primeira dose que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma mo- dalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose quando medida cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a segunda dose que uma con- centração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz uma concentração de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a terceira dose quando medida em cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365, ou 540 dias após a terceira dose do que uma concentra- ção de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condi- ções idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0023] Em uma modalidade, a composição induz uma concentra- ção de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser huma- no após receber a terceira dose quando medida em cerca de 7, 30, 60, 90, 120, 365 ou 540 dias após a terceira dose que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idên-

ticas em um ensaio de citotoxicidade.

[0024] Em uma modalidade, o ser humano é soronegativo para a toxina B. Em uma modalidade, o ser humano é soronegativo para a toxina A. Em uma modalidade, o ser humano é soronegativo para a toxina A e a toxina B. Em uma modalidade, o ser humano é soropositi- vo para a toxina B Em uma modalidade, o ser humano é soropositivo para a toxina A. Em uma modalidade, o ser humano é soropositivo pa- ra a toxina A e toxina B.

[0025] Em uma modalidade, o toxoide é um polipeptídeo que inclui a SEQ ID NO: 4, em que a metionina está ausente. Em uma modali- dade, o toxoide é um polipeptídeo que inclui a SEQ ID NO: 6, em que a metionina está ausente. Em uma modalidade, o toxoide inclui uma toxina de C. difficile em contato com formaldeído. Em uma modalidade, o toxoide inclui uma toxina de C. difficile em contato com formaldeído. Em outra modalidade, o toxoide não é um polipeptídeo em contato com formaldeído.

[0026] Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 002 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 003 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 004 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 012 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 015 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 017 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 020 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 023 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 027 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 029 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 046 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 053 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 059 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 070 de

C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 075 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 078 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 081 de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um C. difficile Ribótipo

087. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 106 de C. diffi- cile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 117 de C. diffi- cile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 126 de C. diffi- cile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 131 de C. diffi- cile. Em uma modalidade, a infecção é de um Ribótipo 154 de C. diffi- cile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo 0 de C. diffici- le. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo I de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo VIII de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo IV de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo III de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo XIII de C. difficile. Em uma modalidade, a infecção é de um Toxinótipo V de C. difficile.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] FIG. 1A-D: A FIG. 1A-B - Proporção de indivíduos acima do limite* - Meses 0, 1, 6 do regime (população de imunogenicidade avaliada). Asterisco (*) ≥ 219 unidades de neutralização/mL para toxi- na A (FIG. 1A) e ≥ 2586 unidades de neutralização/mL para toxina B (FIG. 1B). Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses. FIG. 1C e FIG. 1D - Proporção de indivíduos acima do limiar * - regime de dias 1, 8, 30 (população de imunogenicidade avaliada). Asterisco (*) ~ 219 unidades de neutralização/mL para toxi- na A (FIG. 1C) e ~ 2586 unidades de neutralização/mL para toxina B (FIG. 1D). Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses.

[0028] FIG. 2A-2D -FIG. 2A-B Concentrações médias geométricas - regime de meses 0, 1, 6 (população de imunogenicidade avaliada). A linha tracejada (--) representa 219 unidades de neutralização/mL para a toxina A (FIG. 2A) e 2586 unidades de neutralização/mL para a toxi- na B (FIG. 2B). Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses. FIG. 2C-D Concentrações médias geométricas - Regime do dia 1, 8, 30 (população de imunogenicidade avaliada). A linha tracejada (--) representa 219 unidades de neutralização/mL para a toxina A (FIG. 2C) e 2586 unidades de neutralização/mL para a toxi- na B (FIG. 2D). Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses.

[0029] FIG. 3A-B - Visão geral dos eventos adversos (população de segurança). O painel superior refere-se ao regime do mês 0, 1, 6 (FIG. 3A). O painel inferior refere-se ao regime dos Dias 1, 8, 30 (FIG. 3B). Observe os períodos de notificação de eventos adversos especifi- cados pelo protocolo: não graves até 1 mês após a dose 3, graves até 6 meses após a dose 3 (isto é, os períodos de notificação foram 5 me- ses a mais para o regime de meses).

[0030] FIG. 4A-B - Concentrações médias geométricas - Toxina A (população de imunogenicidade avaliável). O painel superior refere-se ao regime do mês 0, 1, 6 (FIG. 4A). O painel inferior refere-se ao regi- me dos Dias 1, 8, 30 (FIG. 4B). A linha tracejada representa 219 uni- dades de neutralização/mL para a toxina A; Os soros não foram cole- tados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses; Os soros não fo- ram coletados no mês 6 e no dia 187 no regime de dias.

[0031] FIG. 5A-B - Concentrações médias geométricas - Toxina B (população de imunogenicidade avaliável). O painel superior refere-se ao regime do mês 0, 1, 6 (FIG. 5A). O painel inferior refere-se ao regi- me dos Dias 1, 8, 30. A linha tracejada representa 2586 unidades de neutralização/mL para a toxina B (FIG. 5B). Os soros não foram cole- tados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses; Os soros não fo- ram coletados no mês 6 e no dia 187 no regime de dias.

[0032] FIG. 6A-B - Concentrações médias geométricas por soros- tato basal - Toxina A (população de imunogenicidade avaliada). O pai- nel superior refere-se ao regime do mês 0, 1, 6 (FIG. 6A). O painel in- ferior refere-se ao regime dos dias 1, 8, 30 (FIG. 6B). A linha tracejada representa 219 unidades de neutralização/mL para a toxina A; Os so- ros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses; Os soros não foram coletados no mês 6 e no dia 187 no regime de di- as.

[0033] FIG. 7A-B - Concentrações médias geométricas por soros- tato basal - Toxina B (população de imunogenicidade avaliada). O pai- nel superior refere-se ao regime do mês 0, 1, 6 (FIG. 7A). O painel in- ferior refere-se ao regime dos Dias 1, 8, 30 (FIG. 7B). A linha tracejada representa 2586 unidades de neutralização/mL para a toxina B. Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de me- ses; Os soros não foram coletados no mês 6 e no dia 187 no regime de dias.

[0034] FIG. 8A-B - Concentrações médias geométricas por soros- tato de linha de base - (Regime do mês) - toxina A e toxina B (popula- ção de imunogenicidade avaliada). O painel superior refere-se à toxina A (FIG. 8A). A linha tracejada representa 219 unidades de neutraliza- ção/mL para a toxina A. O painel inferior refere-se à toxina B (FIG. 8B). A linha tracejada representa 2586 unidades de neutralização/mL para a toxina B. Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses; Os soros não foram coletados no mês 6 e no dia 187 no regime de dias.

[0035] FIG. 9A-B - Concentrações médias geométricas por soros- tato basal - (Regime diurno) - toxina A e toxina B (população de imu- nogenicidade avaliada). O painel superior refere-se à toxina A (FIG. 9A). A linha tracejada representa 219 unidades de neutralização/mL para a toxina A. O painel inferior refere-se à toxina B (FIG. 9B). A linha tracejada representa 2586 unidades de neutralização/mL para a toxina B. Os soros não foram coletados nos dias 8 e 15 e mês 4 no regime de meses; Os soros não foram coletados no mês 6 e no dia 187 no regi- me de dias.

IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA

[0036] A SEQ ID NO: 1 apresenta a sequência de aminoácidos para a toxina A de C. difficile 630 do tipo selvagem (TcdA).

[0037] A SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de aminoácidos para a toxina B de C. difficile 630 do tipo selvagem (TcdB).

[0038] A SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante com uma mutação nas posições 285 e 287, em comparação com a SEQ ID NO: 1.

[0039] A SEQ ID NO: 4 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante com uma mutação nas posições 285, 287 e 700, em comparação com a SEQ ID NO: 1.

[0040] A SEQ ID NO: 5 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante com uma mutação nas posições 286 e 288, em comparação com a SEQ ID NO: 2.

[0041] A SEQ ID NO: 6 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante com uma mutação nas posições 286, 288 e 698, em comparação com a SEQ ID NO: 2.

[0042] A SEQ ID NO: 7 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante com uma mutação nas posições 269, 272, 285, 287, 460, 462 e 700, em comparação com a SEQ ID NO: 1

[0043] A SEQ ID NO: 8 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante com uma mutação nas posições 270, 273, 286, 288, 461, 463 e 698, em comparação com a SEQ ID NO: 2

[0044] A SEQ ID NO: 9 apresenta uma sequência de DNA que co- difica uma toxina A de C. difficile 630 do tipo selvagem (TcdA).

[0045] A SEQ ID NO: 10 apresenta uma sequência de DNA que codifica uma toxina B de C. difficile 630 do tipo selvagem (TcdB).

[0046] SEQ ID NO: 11 apresenta uma sequência de DNA que co- difica SEQ ID NO: 3

[0047] SEQ ID NO: 12 apresenta uma sequência de DNA que co- difica SEQ ID NO: 4

[0048] SEQ ID NO: 13 apresenta uma sequência de DNA que co- difica SEQ ID NO: 5

[0049] SEQ ID NO: 14 apresenta uma sequência de DNA que co- difica SEQ ID NO: 6

[0050] A SEQ ID NO: 15 apresenta a sequência de aminoácidos para R20291 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[0051] A SEQ ID NO: 16 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 15.

[0052] A SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência de aminoácidos para CD196 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[0053] A SEQ ID NO: 18 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 17.

[0054] A SEQ ID NO: 19 apresenta a sequência de aminoácidos para VPI10463 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[0055] A SEQ ID NO: 20 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 19.

[0056] A SEQ ID NO: 21 apresenta a sequência de aminoácidos para R20291 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[0057] A SEQ ID NO: 22 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 21.

[0058] A SEQ ID NO: 23 apresenta a sequência de aminoácidos para CD196 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[0059] A SEQ ID NO: 24 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 23.

[0060] A SEQ ID NO: 25 apresenta a sequência de aminoácidos para VPI10463 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[0061] A SEQ ID NO: 26 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 25.

[0062] A SEQ ID NO: 27 apresenta uma sequência de DNA de um locus de patogenicidade do VPI10463 de C. difficile do tipo selvagem.

[0063] A SEQ ID NO: 28 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 101 a 293 da SEQ ID NO: 1.

[0064] A SEQ ID NO: 29 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 1 a 542 da SEQ ID NO: 1.

[0065] A SEQ ID NO: 30 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 101 a 293 da SEQ ID NO: 2.

[0066] A SEQ ID NO: 31 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 1 a 543 da SEQ ID NO: 2.

[0067] A SEQ ID NO: 32 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 543 a 809 da SEQ ID NO: 1.

[0068] A SEQ ID NO: 33 apresenta a sequência de aminoácidos para os resíduos 544 a 767 da SEQ ID NO: 2.

[0069] A SEQ ID NO: 34 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante, em que os resíduos 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 e 700 podem ser qualquer aminoá- cido.

[0070] A SEQ ID NO: 35 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante, em que 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 e 751 podem qualquer aminoá- cido.

[0071] A SEQ ID NO: 36 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável de um anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0072] A SEQ ID NO: 37 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0073] A SEQ ID NO: 38 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia leve variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0074] A SEQ ID NO: 39 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia leve variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0075] A SEQ ID NO: 40 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia leve variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0076] A SEQ ID NO: 41 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia pesada variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0077] A SEQ ID NO: 42 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia pesada variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0078] A SEQ ID NO: 43 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia pesada variável de anticorpo neutralizante de TcdA de C. difficile (mAb A3-25).

[0079] A SEQ ID NO: 44 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 3.

[0080] A SEQ ID NO: 45 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 4.

[0081] A SEQ ID NO: 46 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 5.

[0082] A SEQ ID NO: 47 apresenta uma sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 6.

[0083] A SEQ ID NO: 48 apresenta a sequência nucleotídica do oligonucleotídeo imunoestimulador ODN CpG 24555.

[0084] SEQ ID NO: 49 apresenta a sequência de aminoácidos pa-

ra a cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0085] A SEQ ID NO: 50 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia pesada variável de um anticorpo neu- tralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0086] A SEQ ID NO: 51 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0087] A SEQ ID NO: 52 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0088] A SEQ ID NO: 53 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0089] A SEQ ID NO: 54 apresenta a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0090] A SEQ ID NO: 55 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0091] A SEQ ID NO: 56 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia leve variável de um anticorpo neutrali- zador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0092] A SEQ ID NO: 57 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0093] A SEQ ID NO: 58 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0094] A SEQ ID NO: 59 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B8-26).

[0095] A SEQ ID NO: 60 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[0096] A SEQ ID NO: 61 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia pesada variável de um anticorpo neu- tralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[0097] A SEQ ID NO: 62 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[0098] A SEQ ID NO: 63 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[0099] A SEQ ID NO: 64 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00100] A SEQ ID NO: 65 apresenta a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00101] A SEQ ID NO: 66 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00102] A SEQ ID NO: 67 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia leve variável de um anticorpo neutrali- zador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00103] A SEQ ID NO: 68 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00104] A SEQ ID NO: 69 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00105] A SEQ ID NO: 70 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B59-3).

[00106] A SEQ ID NO: 71 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B9-30).

[00107] A SEQ ID NO: 72 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia pesada variável de um anticorpo neu- tralizador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00108] A SEQ ID NO: 73 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B9-30).

[00109] A SEQ ID NO: 74 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00110] A SEQ ID NO: 75 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizante de TcdB de C. difficile (mAb B9-30).

[00111] A SEQ ID NO: 76 apresenta a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00112] A SEQ ID NO: 77 apresenta a sequência de aminoácidos para a cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B9-30).

[00113] A SEQ ID NO: 78 apresenta a sequência de aminoácidos para o peptídeo sinal da cadeia leve variável de um anticorpo neutrali- zador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00114] A SEQ ID NO: 79 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR1 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00115] A SEQ ID NO: 80 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR2 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (B9-30 mAb).

[00116] A SEQ ID NO: 81 apresenta a sequência de aminoácidos para CDR3 da cadeia leve variável de um anticorpo neutralizador de TcdB de C. difficile (mAb B9-30).

[00117] A SEQ ID NO: 82 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante, em que um resíduo nas posições 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 584, 600, 653, 698 e 751 podem ser qualquer aminoácido.

[00118] SEQ ID NO: 83 estabelece a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante tendo uma mutação nas posições 269, 272, 285, 287, 460, 462 e 700, em comparação com a SEQ ID NO: 1, em que a metionina na posição 1 está ausente.

[00119] A SEQ ID NO: 84 apresenta a sequência de aminoácidos para uma toxina A de C. difficile mutante com uma mutação nas posi- ções 285, 287 e 700, em comparação com a SEQ ID NO: 1, em que a metionina na posição 1 está ausente.

[00120] A SEQ ID NO: 85 estabelece a sequência de aminoácidos para uma toxina B de C. difficile mutante tendo uma mutação nas po- sições 270, 273, 286, 288, 461, 463 e 698, em comparação com a SEQ ID NO: 2, em que a a metionina na posição 1 está ausente.

[00121] A SEQ ID NO: 86 apresenta a sequência de aminoácidos para uma toxina B de C. difficile mutante com uma mutação nas posi- ções 286, 288 e 698, em comparação com a SEQ ID NO: 2, em que a metionina na posição 1 está ausente.

[00122] A SEQ ID NO: 87 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004013 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00123] A SEQ ID NO: 88 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004111 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00124] A SEQ ID NO: 89 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004118 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00125] A SEQ ID NO: 90 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004205 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00126] A SEQ ID NO: 91 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004206 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00127] A SEQ ID NO: 92 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005022 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00128] A SEQ ID NO: 93 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005088 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00129] A SEQ ID NO: 94 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005283 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00130] A SEQ ID NO: 95 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005325 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00131] A SEQ ID NO: 96 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005359 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00132] A SEQ ID NO: 97 apresenta a sequência de aminoácidos para 2006017 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00133] A SEQ ID NO: 98 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007070 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00134] A SEQ ID NO: 99 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007217 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00135] A SEQ ID NO: 100 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007302 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00136] A SEQ ID NO: 101 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007816 de C. difficile TcdA do tipo selvagem.

[00137] A SEQ ID NO: 102 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007838 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00138] A SEQ ID NO: 103 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007858 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00139] A SEQ ID NO: 104 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007886 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00140] A SEQ ID NO: 105 apresenta a sequência de aminoácidos para 2008222 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00141] A SEQ ID NO: 106 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009078 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00142] A SEQ ID NO: 107 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009087 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00143] A SEQ ID NO: 108 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009141 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00144] A SEQ ID NO: 109 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009292 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00145] A SEQ ID NO: 110 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004013 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00146] A SEQ ID NO: 111 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004111 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00147] A SEQ ID NO: 112 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004118 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00148] A SEQ ID NO: 113 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004205 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00149] A SEQ ID NO: 114 apresenta a sequência de aminoácidos para 2004206 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00150] A SEQ ID NO: 115 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005022 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00151] A SEQ ID NO: 116 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005088 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00152] A SEQ ID NO: 117 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005283 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00153] A SEQ ID NO: 118 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005325 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00154] A SEQ ID NO: 119 apresenta a sequência de aminoácidos para 2005359 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00155] A SEQ ID NO: 120 apresenta a sequência de aminoácidos para 2006017 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00156] A SEQ ID NO: 121 apresenta a sequência de aminoácidos para 2006376 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00157] A SEQ ID NO: 122 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007070 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00158] A SEQ ID NO: 123 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007217 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00159] A SEQ ID NO: 124 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007302 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00160] A SEQ ID NO: 125 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007816 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00161] A SEQ ID NO: 126 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007838 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00162] A SEQ ID NO: 127 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007858 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00163] A SEQ ID NO: 128 apresenta a sequência de aminoácidos para 2007886 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00164] A SEQ ID NO: 129 apresenta a sequência de aminoácidos para 2008222 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00165] A SEQ ID NO: 130 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009078 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00166] A SEQ ID NO: 131 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009087 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00167] SEQ ID NO: 132 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009141 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00168] A SEQ ID NO: 133 apresenta a sequência de aminoácidos para 2009292 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00169] A SEQ ID NO: 134 apresenta a sequência de aminoácidos para 014 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00170] A SEQ ID NO: 135 apresenta a sequência de aminoácidos para 015 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00171] A SEQ ID NO: 136 apresenta a sequência de aminoácidos para 020 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00172] A SEQ ID NO: 137 apresenta a sequência de aminoácidos para 023 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00173] A SEQ ID NO: 138 apresenta a sequência de aminoácidos para 027 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00174] A SEQ ID NO: 139 apresenta a sequência de aminoácidos para 029 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00175] A SEQ ID NO: 140 apresenta a sequência de aminoácidos para 046 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00176] A SEQ ID NO: 141 apresenta a sequência de aminoácidos para 014 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00177] A SEQ ID NO: 142 apresenta a sequência de aminoácidos para 015 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00178] A SEQ ID NO: 143 apresenta a sequência de aminoácidos para 020 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00179] A SEQ ID NO: 144 apresenta a sequência de aminoácidos para 023 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00180] A SEQ ID NO: 145 apresenta a sequência de aminoácidos para 027 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00181] A SEQ ID NO: 146 apresenta a sequência de aminoácidos para 029 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00182] A SEQ ID NO: 147 apresenta a sequência de aminoácidos para 046 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00183] A SEQ ID NO: 148 apresenta a sequência de aminoácidos para 001 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00184] A SEQ ID NO: 149 apresenta a sequência de aminoácidos para 002 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00185] A SEQ ID NO: 150 apresenta a sequência de aminoácidos para 003 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00186] A SEQ ID NO: 151 apresenta a sequência de aminoácidos para 004 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00187] A SEQ ID NO: 152 apresenta a sequência de aminoácidos para 070 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00188] A SEQ ID NO: 153 apresenta a sequência de aminoácidos para 075 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00189] A SEQ ID NO: 154 apresenta a sequência de aminoácidos para 077 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00190] A SEQ ID NO: 155 apresenta a sequência de aminoácidos para 081 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00191] A SEQ ID NO: 156 apresenta a sequência de aminoácidos para o 117 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00192] A SEQ ID NO: 157 apresenta a sequência de aminoácidos para 131 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00193] A SEQ ID NO: 158 apresenta a sequência de aminoácidos para 001 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00194] A SEQ ID NO: 159 apresenta a sequência de aminoácidos para 002 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00195] A SEQ ID NO: 160 apresenta a sequência de aminoácidos para 003 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00196] A SEQ ID NO: 161 apresenta a sequência de aminoácidos para 004 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00197] A SEQ ID NO: 162 apresenta a sequência de aminoácidos para 070 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00198] A SEQ ID NO: 163 apresenta a sequência de aminoácidos para 075 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00199] A SEQ ID NO: 164 apresenta a sequência de aminoácidos para 077 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00200] A SEQ ID NO: 165 apresenta a sequência de aminoácidos para 081 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00201] A SEQ ID NO: 166 apresenta a sequência de aminoácidos para o 117 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00202] A SEQ ID NO: 167 apresenta a sequência de aminoácidos para o 131 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00203] A SEQ ID NO: 168 apresenta a sequência de aminoácidos para 053 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00204] A SEQ ID NO: 169 apresenta a sequência de aminoácidos para 078 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00205] A SEQ ID NO: 170 apresenta a sequência de aminoácidos para 087 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00206] A SEQ ID NO: 171 apresenta a sequência de aminoácidos para 095 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00207] A SEQ ID NO: 172 apresenta a sequência de aminoácidos para o 126 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00208] A SEQ ID NO: 173 apresenta a sequência de aminoácidos para 053 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00209] A SEQ ID NO: 174 apresenta a sequência de aminoácidos para 078 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00210] A SEQ ID NO: 175 apresenta a sequência de aminoácidos para 087 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00211] A SEQ ID NO: 176 apresenta a sequência de aminoácidos para 095 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00212] A SEQ ID NO: 177 apresenta a sequência de aminoácidos para o 126 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00213] A SEQ ID NO: 178 apresenta a sequência de aminoácidos para 059 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00214] A SEQ ID NO: 179 apresenta a sequência de aminoácidos para 059 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00215] A SEQ ID NO: 180 apresenta a sequência de aminoácidos para 106 TcdA de C. difficile do tipo selvagem.

[00216] A SEQ ID NO: 181 apresenta a sequência de aminoácidos para 106 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00217] A SEQ ID NO: 182 apresenta a sequência de aminoácidos para 017 TcdB de C. difficile do tipo selvagem.

[00218] A SEQ ID NO: 183 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdA mutante com uma mutação nas posições 285, 287, 700, 972 e 978 em comparação com a SEQ ID NO: 1.

[00219] A SEQ ID NO: 184 apresenta a sequência de aminoácidos para um TcdB mutante tendo uma mutação nas posições 286, 288, 698, 970 e 976 em comparação com a SEQ ID NO: 2.

[00220] As SEQ ID NO: 185 a SEQ ID NO: 195 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina mutante exemplar.

[00221] As SEQ ID NO: 196 a SEQ ID NO: 212 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina A mutante exem- plar.

[00222] As SEQ ID NO: 213 a SEQ ID NO: 222 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00223] As SEQ ID NO: 223 a SEQ ID NO: 236 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00224] As SEQ ID NO: 237 a SEQ ID NO: 243 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00225] As SEQ ID NO: 244 a SEQ ID NO: 245 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00226] As SEQ ID NO: 246 a SEQ ID NO: 249 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00227] As SEQ ID NO: 250 a SEQ ID NO: 253 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina A mutante exem- plar.

[00228] A SEQ ID NO: 254 apresenta a sequência de aminoácidos para uma toxina mutante exemplar.

[00229] As SEQ ID NO: 255 a SEQ ID NO: 263 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00230] As SEQ ID NO: 264 a SEQ ID NO: 269 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00231] As SEQ ID NO: 270 a SEQ ID NO: 275 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina mutante exemplar.

[00232] As SEQ ID NO: 276 a SEQ ID NO: 323 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00233] As SEQ ID NO: 324 a SEQ ID NO: 373 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00234] As SEQ ID NO: 374 a SEQ ID NO: 421 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00235] As SEQ ID NO: 422 a SEQ ID NO: 471 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00236] As SEQ ID NO: 472 a SEQ ID NO: 519 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina A mutante exem- plar.

[00237] As SEQ ID NO: 568 a SEQ ID NO: 615 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00238] As SEQ ID NO: 520 a SEQ ID NO: 567 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina A mutante exem- plar.

[00239] As SEQ ID NO: 616 a SEQ ID NO: 663 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

[00240] As SEQ ID NO: 664 a SEQ ID NO: 711 apresentam a se- quência de aminoácidos para uma toxina A mutante exemplar.

[00241] As SEQ ID NO: 712 a SEQ ID NO: 761 apresentam cada uma a sequência de aminoácidos para uma toxina B mutante exemplar

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00242] Os inventores descobriram surpreendentemente composi- ções e métodos altamente imunogênicos e bem tolerados que podem ser usados para tratar, melhorar, reduzir o risco de e/ou prevenir a in- fecção por C. difficile. Mais especificamente, por exemplo, os invento- res descobriram, entre outras coisas, a imunogenicidade de dois níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina con- tra C. difficile quando administrada como um regime de três doses (di- as 1, 8 e 30) a adultos saudáveis com idade entre 65 e 85 anos, con- forme medido pelos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e da toxina B de C. difficile no dia 37 (7 dias após a dose 3). Os inventores também descobriram, entre outras coisas, a imunogeni- cidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile quando administrada como um regi- me de 3 doses (meses 0, 1 e 6) a adultos saudáveis com idades entre 65 e 85 anos, conforme medido pelos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e da toxina B de C. difficile no mês 7 (1 mês após a dose 3). Os inventores descobriram ainda, entre outras coisas, a imunogenicidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile quando administrada em um regime de 3 doses (dias 1, 8 e 30 ou meses 0), 1 e 6) a adultos saudáveis com idades entre 65 e 85 anos, conforme medido pelos ní- veis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e da toxina B de C. difficile em vários momentos após a vacinação; a cinética da resposta imune em adultos saudáveis com idade entre 65 e 85 anos por pelo menos até 12 meses após a administração de 3 doses da va-

cina contra C. difficile; a imunogenicidade de uma quarta dose da va- cina contra C. difficile, medida pelos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e da toxina B de C. difficile, em vários mo- mentos após a vacinação; e a cinética da resposta imune em adultos saudáveis com idade entre 65 e 85 anos por pelo menos até 36 meses após a administração de uma quarta dose de uma vacina contra C. difficile.

[00243] São fornecidas composições exemplares. Por exemplo, composições compreendendo uma quantidade eficaz de toxoide A e toxoide B de C. difficile (por exemplo, de cerca de 40 a cerca de 500 μg/dose, como cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 ou 500 µg/dose, como cerca de 50 a cerca de 100 μg/dose (p/p, quantidade total de toxoides A e B na composição)) em uma relação eficaz de toxoide A : B (por exemplo, cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 3 : 1, 3 : 2 ou 1 : 1 do toxoide A ao toxoide B em peso) e com pureza suficiente (por exem- plo, pelo menos cerca de 80 a cerca de 100%, como cerca de 80, 85, 90, 95 ou 90 - 100% (p/p)), usando uma ou mais administrações (por exemplo, pelo menos duas, três administrações ou doses) por qual- quer via adequada (por exemplo, intramuscular), cada dose de um re- gime de administração de doses múltiplas sendo adequadamente se- parada uma da outra (por exemplo, por pelo menos cerca de um a cerca de dez dias, como qualquer um de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez, como cerca de sete dias). O período de tempo (intervalo de tempo) entre as doses deve ser entendido pelos versados na técnica que variam dependendo do indivíduo e que esse intervalo deve ser longo o suficiente (por exemplo, medido em dias), de modo que a resposta imune da dose anterior tem tempo para se desenvolver (por exemplo, para ser preparado) e não é de forma al- guma inibida pela dose subsequente (por exemplo, a dose ou doses de reforço).

[00244] Em uma modalidade, a composição utilizada no regime de vacinação da presente invenção inclui de cerca de 40 a cerca de 500 μg/dose de toxoide A de C. difficile. Em uma modalidade, a composi- ção inclui de cerca de 50 a cerca de 400 μg/dose de toxoide A de C. difficile. Em uma modalidade, a composição inclui de cerca de 50 a cerca de 200 µg/dose de toxoide A de C. difficile. Em uma modalidade, a composição inclui de cerca de 50 a cerca de 150 µg/dose. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, ou 500 µg/dose de toxoide A de C. difficile. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 50 µg/dose de toxoide A de C. difficile. Em outra modalidade, a composição inclui cerca de 100 µg/dose de toxoide A de C. difficile.

[00245] Em uma modalidade, a composição usada no regime de vacinação da presente invenção inclui de cerca de 40 a cerca de 500 μg/dose de toxoide B de C. difficile. Em uma modalidade, a composi- ção inclui de cerca de 50 a cerca de 400 μg/dose de toxoide B de C. difficile. Em uma modalidade, a composição inclui de cerca de 50 a cerca de 200 µg/dose do toxoide B de C. difficile. Em uma modalidade, a composição inclui de cerca de 50 a cerca de 150 µg/dose. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, ou 500 µg/dose de toxoide B de C. difficile. Em uma modalidade, a composi- ção inclui cerca de 50 µg/dose de toxoide B de C. difficile. Em outra modalidade, a composição inclui cerca de 100 µg/dose de toxoide B de C. difficile.

[00246] Em uma modalidade, a composição utilizada no regime de vacinação da presente invenção inclui toxoide A e B de C. difficile nas doses aqui descritas. Em uma modalidade, a relação toxoide A para B é 3 : 1, 3 : 2 ou 1 : 1 toxoide A para toxoide B em peso. Em uma moda- lidade, a relação toxoide A para B é 1 : 3, 2: 3 ou 1 : 1 toxoide A para toxoide B em peso. Em uma modalidade, a relação toxoide A para B é 1 : 1 toxoide A para toxoide B em peso.

[00247] Em uma modalidade, a composição utilizada no regime de vacinação da presente invenção inclui toxoide A e B de C. difficile com uma pureza de pelo menos cerca de 80 a cerca de 100%. Em uma modalidade, a composição utilizada no regime de vacinação da pre- sente invenção inclui toxoide A e B de C. difficile com uma pureza de pelo menos cerca de 90 a cerca de 100%. Em uma modalidade, a composição usada no regime de vacinação da presente invenção in- clui toxoide A e B de C. difficile com uma pureza de cerca de 80, 85, 90, 95 ou 100% (p/p).

[00248] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas uma vez. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes.

[00249] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes na mesma dose. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes na mesma dose. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são admi- nistradas quatro vezes na mesma dose.

[00250] Em uma modalidade, a composição da presente invenção é administrada por qualquer via adequada. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas por vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas por via subcutânea ou intramuscular. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas por via intramuscular.

[00251] Em uma modalidade da presente invenção, cada dose de um regime de administração de doses múltiplas é adequadamente se- parada uma da outra. Em uma modalidade, as composições aqui des- critas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de um a cerca de dez dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de dois a nove dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de seis di- as. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são adminis- tradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de sete dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de oito dias. Em uma modalidade, as composições aqui des- critas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de um a cerca de quatro meses. Em uma modali- dade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de um, dois, três ou quatro meses. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de um mês. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas duas vezes cada dose sendo separadas uma da outra por cerca de dois meses.

[00252] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separa- das uma da outra por cerca de um a cerca de dez dias e a terceira do- se sendo separada da primeira dose por cerca de 15 a 45 dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas uma da ou- tra por cerca de 5 a cerca de 8 dias e a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 20 a 35 dias. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas umas das outras por cerca de 6 a cerca de 7 dias e a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 25 a 35 dias. Em uma modalidade, as composições aqui des- critas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas uma da outra por cerca de sete dias e a terceira dose sen- do separada da primeira dose por cerca de 30 dias.

[00253] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separa- das uma da outra por cerca de um a cerca de quatro meses e a tercei- ra dose sendo separada da primeira dose por cerca de 5 a 10 meses. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administra- das três vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas umas das outras por cerca de um a dois meses e a terceira dose sendo se- parada da primeira dose por cerca de 5 a 8 meses. Em uma modalida- de, as composições aqui descritas são administradas três vezes a pri- meira e a segunda dose sendo separadas uma da outra por cerca de um mês e a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 6 meses. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separa-

das uma da outra por cerca de um mês e a terceira dose sendo sepa- rada da primeira dose por cerca de 5 meses. Em uma modalidade, as composições descritas aqui são administradas três vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas uma da outra por cerca de um mês e a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 7 me- ses.

[00254] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a segunda dose sendo sepa- radas uma da outra por cerca de um a cerca de dez dias, a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 15 a 45 dias e a quarta e terceira dose sendo separada uma da outra por cerca de 6 meses a cerca de 2 anos. Em uma modalidade, as composições des- critas aqui são administradas quatro vezes a primeira e a segunda do- se sendo separadas umas das outras por cerca de 5 a cerca de 8 dias, a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 20 a 35 dias e a quarta e terceira dose sendo separada uma da outra por cerca de 10 meses a cerca de 1,5 anos. Em uma modalidade, as composi- ções aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a se- gunda dose sendo separadas umas das outras por cerca de 6 a cerca de 7 dias, a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 25 a 35 dias e a quarta e terceira dose sendo separada uma da ou- tra por cerca de 11 meses a cerca de 13 meses. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a pri- meira e a segunda dose sendo separadas uma da outra por cerca de sete dias, a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 30 dias e a quarta e terceira dose sendo separadas de uma outro por 1 ano.

[00255] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a segunda dose sendo sepa- radas uma da outra por cerca de um a cerca de quatro meses, a ter-

ceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 5 a 10 me- ses e a quarta dose sendo separada da terceira dose por cerca de 6 meses a 2 anos. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas umas das outras por cerca de um a dois meses, a terceira dose sendo separada da primeira dose por cerca de 5 a 8 meses e a quarta dose sendo separada da terceira dose em cerca de 10 meses a 1,5 anos. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a segunda dose sendo sepa- radas uma da outra por cerca de um mês, a terceira dose sendo sepa- rada da primeira dose por cerca de 6 meses e a quarta dose sendo separada da terceira dose por cerca de 11 meses a 13 meses. Em uma modalidade, as composições aqui descritas são administradas quatro vezes a primeira e a segunda dose sendo separadas uma da outra por cerca de um mês, a terceira dose sendo separada da primei- ra dose por cerca de 6 meses e a quarta dose sendo separada da ter- ceira dose por cerca de 12 meses.

[00256] Em uma modalidade, as composições dadas em qualquer regime multidose aqui descrito são dadas na mesma dose (isto é, mesma quantidade de toxoide A e/ou B de C. difficile). Em uma moda- lidade, as composições dadas em qualquer um dos regimes de doses múltiplas descritas aqui são dadas na mesma (isto é, na mesma dose e nos mesmos ingredientes).

[00257] Em uma modalidade, as composições dadas em qualquer um dos regimes de doses múltiplas descritas aqui são dadas em do- ses diferentes. Em uma modalidade, as composições dadas em qual- quer um dos regimes de doses múltiplas aqui descritas são dadas na mesma dose de antígeno (isto é, a mesma quantidade de toxoide A e/ou B de C. difficile), mas podem compreender ingredientes diferentes (por exemplo, adjuvantes diferentes).

[00258] Em algumas modalidades, a segunda administração é pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dias após a primeira administração (por exemplo, dia 0) e a terceira admi- nistração é pelo menos cerca de 20 - 200 (por exemplo, cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200, como cerca de 30 ou aproximadamente 180 dias) dias após a primeira administração. Por exemplo, o método pode compre- ender primeira, segunda e/ou terceira administração em que a segun- da administração é pelo menos 7 dias após a primeira administração e a terceira administração é pelo menos cerca de 30 dias e/ou pelo me- nos cerca de 180 dias após a primeira ou segunda administração. Em algumas modalidades, a segunda administração é cerca de sete dias após a primeira administração e a terceira administração é cerca de 30 dias após a primeira administração.

[00259] Após a administração de tais composições usando esses métodos a um hospedeiro/indivíduo, é normalmente observada uma resposta imune, que normalmente inclui uma resposta imune humoral e pode envolver uma resposta imune celular.

[00260] Em certas modalidades, o método pode compreender a administração da composição imunogênica a um ser humano, indiví- duo a risco de infecção. Em algumas modalidades, o indivíduo huma- no pode ter pelo menos cerca de 40, 50, 65 anos ou mais. Em algu- mas modalidades, o indivíduo humano pode ter cerca de 40 a cerca de 65 anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo humano pode ter 65 a 75 anos de idade. Assim, também são fornecidos métodos pa- ra administrar as composições. Os métodos para fabricar as composi- ções são descritos aqui e estão disponíveis para aqueles de experiên- cia ordinária na técnica.

[00261] Em um aspecto, a invenção refere-se a métodos para imu- nizar um indivíduo (por exemplo, um ser humano) contra C. difficile,

administrando-o a uma composição compreendendo um ou mais antí- genos de C. difficile. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição aqui descrita para uso em um método para imunizar um indivíduo contra C. difficile. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição aqui descrita para uso em um método para imunizar um indivíduo humano contra C. difficile. Em uma modalidade, o indiví- duo humano tem 40-90 anos de idade. Em uma modalidade, o indiví- duo humano tem 50-85 anos de idade. Em uma modalidade, o indiví- duo humano tem 60 a 85 anos de idade. Em uma modalidade, o indi- víduo humano tem 65 a 85 anos de idade. Em uma modalidade, o in- divíduo humano tem 65 a 69 anos de idade. Em uma modalidade, o indivíduo humano tem 70 a 79 anos de idade. Em uma modalidade, o indivíduo humano tem 75-79 anos de idade. Em uma modalidade, o indivíduo humano é pelo menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90 anos de idade. Em uma modalidade, o indivíduo humano é pelo menos 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 ou 85 anos de idade.

[00262] Por exemplo, uma composição adequada pode compreen- der um total de cerca de 50 ou cerca de 100 µg (ou cerca de 50-100 µg) de toxoide de C. difficile (toxoide A e toxoide B) em uma relação aproximada de toxoide A para toxoide B de cerca de 3 : 2, com ou sem adjuvante (por exemplo, hidróxido de alumínio). Para fins de compara- ção, a composição contendo antígeno pode ser administrada a um grupo de indivíduos e uma composição de placebo (por exemplo, solu- ção salina normal a 0,9%) administrada (por exemplo, na mesma pro- gramação) a outro grupo. Os dados imunológicos e de segurança po- dem ser obtidos dos indivíduos em dias específicos (por exemplo, dias 0, 14, 30, 60, 180 e/ou 210 e/ou até 1000 dias após a primeira admi- nistração). A administração da composição pode ocorrer, por exemplo,

dias 0 (primeira administração), cerca do dia 7 (segunda administra- ção), cerca do dia 30 (terceira administração) e/ou cerca do dia 180 (terceira administração alternativa ou quarta administração).

[00263] A composição pode compreender o toxoide A e o toxoide B de C. difficile a uma relação eficaz do toxoide A : B (por exemplo, cer- ca de 3 : 1, 3 : 2 ou 1 : 1 do toxoide A para o toxoide B em peso) com uma pureza suficiente (por exemplo, pureza de cerca de 90% ou mais (p/p)). Por exemplo, a composição pode compreender uma preparação altamente purificada (por exemplo, > 90% (p/p /)) de toxoides de C. difficile A & B em uma relação aproximada de toxoide A para toxoide B de cerca de 3 : 2. Tais composições podem ser preparadas utilizando qualquer um dos métodos de preparação disponíveis, por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Pa- tente US No. 9187536 e Pedido de Patente WIPO WO/2014/060898, que são incorporados por referência aqui em suas respectivas totali- dades.

[00264] O termo "toxoide de C. difficile" é aqui utilizado para se re- ferir a uma toxina de C. difficile (Toxina A ou Toxina B) que foi parcial ou completamente inativada. Uma toxina é inativada se tiver menos toxicidade (por exemplo, 100%, 99%, 98%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 30%, 20%, 10% ou menos de toxicidade ou qualquer valor entre elas) do que a toxina não tratada, medida por exemplo por um ensaio de citotoxicidade in vitro ou por toxicidade animal. Os toxoides de C. difficile podem ser produzidos por purificação de toxinas de cul- turas de C. difficile e inativação de toxinas por produtos químicos (por exemplo, tratamento com formaldeído, glutaraldeído, peróxido ou oxi- gênio). Alternativamente, podem ser produzidas toxinas de C. difficile do tipo selvagem ou mutantes que não possuem ou apresentam toxi- cidade reduzida usando métodos recombinantes e/ou agentes de reti- culação químicos alternativos. Por exemplo, mutações genéticas que resultam em toxicidade reduzida podem ser feitas. Também podem ser produzidas toxinas de C. difficile do tipo selvagem ou mutantes sem regiões específicas para reduzir a toxicidade.

[00265] O toxoide de C. difficile ou toxina de C. difficile mutante re- fere-se a uma molécula que exibe uma estrutura ou sequência que di- fere da estrutura ou sequência do tipo selvagem correspondente, por exemplo, tendo reticulações em comparação à estrutura do tipo selva- gem correspondente e/ou por ter pelo menos uma mutação, em com- paração com a sequência do tipo selvagem correspondente, quando alinhada de maneira ideal, como nos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo padrão. O termo toxoide ou toxina mutante, conforme usado aqui, exibe ainda uma propriedade funcional (por exemplo, glucosiltransferase revogada e/ou atividade de protease de cisteína revogada) que difere da molécula correspondente do tipo sel- vagem.

[00266] O toxoide quando aqui utilizado pode ser qualquer um dos toxoides ou toxinas mutantes de C. difficile, conforme descrito no Pe- dido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente US No. 9187536 e Pedido de Patente WIPO WO/2014/060898, que são incorporados por referência aqui em suas respectivas totalidades. Ou seja, o toxoide quando aqui utilizado pode ser qualquer um dos polipeptídeos descri- tos no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente U.S. No. 9187536 e Pedido de Patente WIPO WO/2014/060898, cada um deles incorporado por referência aqui em suas respectivas totalidades. Uma toxina de C. difficile de qualquer uma das cepas do tipo selvagem des- critas acima pode ser usada como fonte a partir da qual é produzido um toxoide ou toxina de C. difficile mutante. De preferência, C. difficile 630 é a fonte a partir da qual é produzido um toxoide de C. difficile.

[00267] Em uma modalidade, o toxoide refere-se a um polipeptídeo que possui qualquer sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ

ID NO: 761, em que a metionina inicial está ausente e em que o poli- peptídeo foi contatado com um reticulador químico, como, por exem- plo, formaldeído ou EDC, como descrito aqui e/ou foi geneticamente mutado. Mais especificamente, em uma modalidade, o toxoide é um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos estabelecida em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761 .

[00268] A mutação pode envolver uma substituição, exclusão, trun- camento ou modificação do resíduo de aminoácido do tipo selvagem normalmente localizado nessa posição. De preferência, a mutação é uma substituição de aminoácidos não conservativa. As toxinas mutan- tes da invenção podem ser preparadas por técnicas conhecidas na técnica para preparar mutações, como, por exemplo, mutagênese di- recionada ao local, mutagênese utilizando um mutagênico (por exem- plo, luz UV), etc. Preferencialmente, a mutagênese direcionada ao lo- cal é usava. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico com uma sequência objetiva pode ser diretamente sintetizada. Tais méto- dos de síntese química são conhecidos na técnica.

[00269] Na presente invenção, a toxina de C. difficile mutante inclui pelo menos uma mutação no domínio glicosiltransferase, em relação à correspondente toxina de C. difficile do tipo selvagem. Em uma moda- lidade, o domínio glicosiltransferase inclui pelo menos duas mutações. Preferencialmente, a mutação diminui ou revoga a atividade da enzima glucosiltransferase da toxina, em comparação com a atividade da en- zima glucosiltransferase da correspondente toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente.

[00270] Um exemplo de toxoide A de C. difficile inclui um domínio de glucosiltransferase incluindo SEQ ID NO: 29 com uma substituição de aminoácidos nas posições 285 e 287, e um domínio de cisteína protease compreendendo SEQ ID NO: 32 com uma substituição de aminoácidos na posição 158, em relação a a correspondente toxina de

C. difficile do tipo selvagem A. Por exemplo, esse TcdA de C. difficile mutante inclui a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4, em que a metionina inicial não está presente. Em outra modali- dade, a toxina A de C. difficile mutante inclui a sequência de aminoáci- dos estabelecida na SEQ ID NO: 84. Outros exemplos de um toxoide A de C. difficile A incluem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7, que possui uma mutação D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A e C700A, em comparação com a SEQ ID NO: 1, em que a metionina inicial não está opcionalmente presente. Em outra modalidade, a toxina A de C. difficile mutante inclui a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 83.

[00271] Um exemplo de toxoide B de C. difficile inclui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6, em que a metionina inicial não está presente. Em outra modalidade, a toxina A do de C. difficile mutante inclui a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 86. Outros exemplos de um TcdB de C. difficile mutante incluem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8, que possui uma mutação D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A e C698A, em comparação com a SEQ ID NO: 2, e em que a metionina inicial da SEQ ID NO: 8 não está opcionalmente presente. Em outra modalidade, a toxina B de C. difficile mutante inclui a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 85.

[00272] Além de gerar uma resposta imune em um mamífero, os toxoides aqui descritos também têm citotoxicidade reduzida em com- paração com a correspondente toxina de C. difficile do tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, as composições imunogênicas são seguras e têm uma mínima (por exemplo, uma redução de 6-8 log10) a nenhuma citotoxicidade, em relação à citotoxicidade de uma respectiva toxina do tipo selvagem, para administração em mamíferos.

[00273] Quando aqui usado, o termo citotoxicidade é um termo en-

tendido na técnica e refere-se à morte celular apoptótica e/ou um es- tado no qual uma ou mais funções bioquímicas ou biológicas usuais de uma célula são aberrantemente comprometidas, em comparação com uma célula idêntica sob idêntica condições, mas na ausência do agen- te citotóxico. A toxicidade pode ser quantificada, por exemplo, em célu- las ou mamíferos como a quantidade de um agente necessário para induzir 50% de morte celular (isto é, EC50 ou ED50, respectivamente) ou por outros métodos conhecidos na técnica.

[00274] Os ensaios para indicar citotoxicidade são conhecidos na técnica, tais como ensaios de arredondamento celular. Ensaios de ci- totoxicidade exemplificativos adicionais conhecidos na técnica incluem ensaios de glicosilação relacionados à imagem fosforescente de Ras marcada com ensaios de glicose [14C] e preferencialmente o ensaio de citotoxicidade in vitro descrito no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente US No. 9187536 e Patente WIPO O pedido WO/2014/060898, que são cada um incorporados por referência aqui em suas respectivas totalidade, em que EC50 pode se referir a uma concentração de uma composição imunogênica que exibe pelo menos cerca de 50% de efeito citopatogênico (CPE) em uma célula, preferen- cialmente uma célula fibroblástica diploide humana (por exemplo, célu- la IMR90 (ATCC CCL-186TM), em comparação com uma célula idênti- ca sob condições idênticas na ausência da toxina. O ensaio de citoto- xicidade in vitro também pode ser usado para avaliar a concentração de uma composição que inibe pelo menos cerca de 50% de uma indu- zida por efeito citopatogênico (CPE) induzido por toxina de C. difficile do tipo selvagem em uma célula, preferencialmente uma célula fi- broblástica diploide humana (por exemplo, célula IMR90 (ATCC CCL- 186TM), em comparação com uma célula idêntica sob condições idên- ticas na ausência da toxina.

[00275] Em uma modalidade, a citotoxicidade da composição imu-

nogênica é reduzida em pelo menos cerca de 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 vezes, 14000 vezes, 15000 vezes ou mais, em comparação com a corres- pondente toxina de C. difficile do tipo selvagem.

[00276] Em outra modalidade, a citotoxicidade da composição imu- nogênica é reduzida em pelo menos cerca de 2-log10, mais preferenci- almente em cerca de 3-log10 e mais preferencialmente em cerca de 4- log10 ou mais, em relação à toxina do tipo selvagem correspondente em condições idênticas. Por exemplo, um TcdB de C. difficile mutante pode ter um valor de EC50 de cerca de 10-9 g/ml, medido em um ensaio de efeito citopático padrão (CPE), em comparação com um TcdB de C. difficile do tipo selvagem exemplar que pode ter um valor de EC50 de pelo menos cerca de 10-12 g/ml.

[00277] Em ainda outra modalidade, a citotoxicidade da toxina de C. difficile mutante tem uma EC50 de pelo menos cerca de 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1000 μg/ml ou mais, medido por, por exemplo, um ensaio de citotoxicidade in vitro. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, as composições imunogênicas e toxinas mutantes são biologicamente seguras para administração a mamífe- ros.

[00278] Em uma modalidade, o toxoide é um polipeptídeo que pos- sui qualquer sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761, mais especificamente, o toxoide é um polipeptídeo com a se- quência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, em que a metionina inicial está ausente e em que o polipeptídeo foi contatado com um reti- culador químico, como, por exemplo, formaldeído ou EDC, quando aqui descrito. A reticulação (também referida como "inativação quími- ca" ou "inativação" aqui) é um processo de união química de duas ou mais moléculas por uma ligação covalente. Os termos "reagentes de reticulação", "agentes de reticulação" e "reticuladores" se referem a moléculas que são capazes de reagir com e/ou se ligam quimicamente a grupos funcionais específicos (aminas primárias, sulfidrilas, carboxi- las, carbonilas, etc.) nos peptídeos, polipeptídeos e/ou proteínas. Em uma modalidade, a molécula pode conter duas ou mais extremidades reativas que são capazes de reagir com e/ou se ligar quimicamente a grupos funcionais específicos (aminas primárias, sulfidrilas, carboxilas, carbonilas, etc.) em peptídeos, polipeptídeos e/ou proteínas. De prefe- rência, o agente de reticulação química é solúvel em água. Em outra modalidade preferida, o agente de reticulação química é um reticulador heterobifuncional. Em outra modalidade, o agente de reticulação quí- mica não é um reticulador bifuncional. Os agentes de reticulação quí- mica são conhecidos na técnica.

[00279] Agentes de reticulação química adequados exemplificativos incluem formaldeído; formalina; acetaldeído; propionaldeído; carbodii- midas solúveis em água (RN = C = NR'), que incluem cloridrato de 1- etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), 1-etil-3-(3-dimetilami- nopropil)-carbodiimida, metil-p-toluenossulfonato de 1-ciclo-hexil-3-(2- morfolinil-(4-etil)carbodiimida (CMC), N,N′-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) e N,N′-diisopropilcarbodiimida (DIC) e seus derivados; e N-hi- droxissuccinimida (NHS); fenilglioxal; e/ou dialeto de UDP.

[00280] De preferência, o agente de reticulação é EDC. Quando um polipeptídeo da toxina de C. difficile mutante é quimicamente modifica- do por EDC (por exemplo, entrando em contato com o polipeptídeo com EDC), em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (a) pelo menos um reticulado entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspárti- co do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do po- lipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (b) pelo menos um reticulado entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâ-

mico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (c) pelo menos uma reticulação entre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e o grupo amino do terminal N do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (d) pelo menos um reticulado entre o grupo carboxi- la no terminal C do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (e) pelo menos cadeia ide de um resíduo de ácido aspártico do polipeptí- deo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo poli- peptídeo isolado. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui (f) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de áci- do glutâmico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídeo isolado. Em uma modalidade, o po- lipeptídeo inclui (g) pelo menos uma reticulação entre o grupo carboxi- la no terminal C do polipeptídeo e o grupo amino do terminal N de um segundo polipeptídeo isolado. Em uma modalidade, o polipeptídeo in- clui (h) pelo menos uma reticulação entre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídeo isolado.

[00281] O "segundo polipeptídeo isolado" refere-se a qualquer poli- peptídeo isolado que está presente durante a reação com EDC. Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo isolado é um polipeptídeo da toxina de C. difficile mutante com uma sequência idêntica ao primeiro polipeptídeo isolado. Em outra modalidade, o segundo polipeptídeo isolado é um polipeptídeo da toxina de C. difficile mutante com uma sequência diferente do primeiro polipeptídeo isolado.

[00282] Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui pelo menos duas modificações selecionadas dentre as modificações (a)-(d). Em uma modalidade exemplar, o polipeptídeo inclui (a) pelo menos uma reticu- lação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptí- deo e (b) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o poli- peptídeo inclui pelo menos três modificações selecionadas dentre as modificações (a)-(d). Em ainda uma outra modalidade, o polipeptídeo inclui as modificações (a), (b), (c) e (d).

[00283] Quando mais de um polipeptídeo mutante está presente durante a modificação química por EDC, em uma modalidade, a com- posição resultante inclui pelo menos uma das modificações (a)-(h). Em uma modalidade, a composição inclui pelo menos duas modificações selecionadas dentre as modificações (a)-(h). Em uma modalidade adi- cional, a composição inclui pelo menos três modificações selecionadas dentre as modificações (a)-(h). Em ainda uma outra modalidade, a composição inclui pelo menos quatro modificações selecionadas den- tre as modificações (a)-(h). Em outra modalidade, a composição inclui pelo menos uma de cada uma das modificações (a)-(h).

[00284] Em uma modalidade exemplar, a composição resultante inclui (a) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo; e (b) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipep- tídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo. Em uma modalidade, a composição inclui ainda (c) pelo menos uma reti- culação entre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e o gru- po amino do terminal N do polipeptídeo; e (d) pelo menos uma reticu- lação entre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e uma ca- deia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo.

[00285] Em outra modalidade exemplar, a composição resultante inclui (e) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídeo isolado; (f) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glu- tâmico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídeo isolado; (g) pelo menos uma reticulação en- tre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e o grupo amino do terminal N de um segundo polipeptídeo isolado; e (h) pelo menos uma reticulação entre o grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptí- deo isolado.

[00286] Em uma outra modalidade exemplar, a composição resul- tante inclui (a) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo; (b) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipep- tídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo; (e) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um segundo polipeptídeo isolado; e (f) pelo menos uma reti- culação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina de um se- gundo polipeptídeo isolado.

[00287] Em uma modalidade preferida, o agente de reticulação química inclui formaldeído, mais preferencialmente, um agente incluin- do formaldeído na ausência de lisina. A glicina ou outro composto apropriado com uma amina primária pode ser usada como inibidor nas reações de reticulação. Por conseguinte, em outra modalidade preferi- da, o agente químico inclui formaldeído e uso de glicina.

[00288] Ainda em outra modalidade preferida, o agente de reticula- ção química inclui EDC e NHS. Como é conhecido na técnica, o NHS pode ser incluído nos protocolos de acoplamento EDC. No entanto, os inventores descobriram surpreendentemente que o NHS pode facilitar ainda mais a citotoxicidade da toxina de C. difficile mutante, em com- paração com a toxina do tipo selvagem correspondente, em compara- ção com uma toxina geneticamente mutada e em comparação com uma toxina geneticamente mutada que possui foi reticulado quimica- mente pela EDC. Veja, por exemplo, o Exemplo 22 descrito no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente U.S. No. 9187536 e Pe- dido de Patente WIPO WO/2014/060898, que são incorporados por referência aqui em suas respectivas totalidades. Por conseguinte, sem estar vinculado por mecanismo ou teoria, um polipeptídeo de toxina mutante tendo uma fração beta-alanina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídeo (por exemplo, resul- tante de uma reação do polipeptídeo de toxina mutante, EDC e NHS) pode facilitar ainda mais a citotoxicidade decrescente da toxina mutan- te, em comparação com, por exemplo, uma toxina de C. difficile (tipo selvagem ou mutante) em que uma porção beta-alanina está ausente.

[00289] O uso de EDC e/ou NHS também pode incluir o uso de gli- cina ou outro composto apropriado com uma amina primária como ini- bidor. Qualquer composto possuindo uma amina primária pode ser uti- lizado como inibidor, tal como, por exemplo, éster metílico de glicina e alanina. Em uma modalidade preferida, o composto inibidor é uma amina primária hidrofílica não polimérica. Exemplos de uma amina primária hidrofílica não polimérica incluem, por exemplo, açúcares amino, amino alcoóis e amino polióis. Exemplos específicos de uma amina primária hidrofílica não polimérica incluem glicina, etanolamina, glicamina, polietileno glicol funcionalizado com amina e oligômeros de etileno glicol funcionalizados com amina. Em uma modalidade, o agen- te de reticulação química não inclui formaldeído. Em uma modalidade, o agente de reticulação química não inclui formalina.

[00290] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, possuindo pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos quimicamente modificada por EDC e uma amina primária hidrofílica não polimérica, preferencialmente glici- na. Os aduzidos de glicina resultantes (por exemplo, a partir de uma reação de toxinas triplas mutantes tratadas com EDC, NHS e extintas com glicina) podem facilitar a diminuição da citotoxicidade da toxina mutante em comparação com a toxina do tipo selvagem corresponden- te.

[00291] Em uma modalidade, quando uma toxina de C. difficile mu- tante, isto é, um polipeptídeo, é quimicamente modificada por EDC e glicina, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídeo é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma das modificações (a)-(h) descritas acima), e pelo menos uma das seguin- tes modificações exemplares: (i) uma fração de glicina ligada ao grupo carboxila no terminal C do polipeptídeo; (j) uma porção de glicina liga- da a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo; e (k) uma porção de glicina ligada a uma cadeia late- ral de pelo menos um resíduo de ácido glutâmico do polipeptídeo.

[00292] Em uma modalidade, pelo menos um aminoácido do TcdA de C. difficile mutante, isto é, o polipeptídeo, é reticulado quimicamen- te e/ou pelo menos um aminoácido do TcdB de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, é reticulado quimicamente. Qualquer uma das to- xinas mutantes, isto é, polipeptídeos aqui descritos, pode ser reticula- da quimicamente. Em outra modalidade, pelo menos um aminoácido do polipeptídeo que possui a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8 é reticulado quimicamente. Em uma modali- dade, pelo menos um resíduo de aminoácido de um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a SEQ ID NO: 761 é reticulado. Por exemplo, em uma modali-

dade, pelo menos um resíduo de aminoácido de um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35 82-761, está reticulado. Em outra modalidade, pelo menos um resíduo de aminoácido de um poli- peptídeo que possui a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 183 a SEQ ID NO: 761 inclui uma modificação como descrito acima, por exemplo, qualquer uma das (a)-(k ) modificações, como (a) pelo menos uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do polipeptídeo e uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do polipeptídeo.

[00293] Por exemplo, o pelo menos um aminoácido pode ser reticu- lado quimicamente por um agente que inclui uma carbodiimida, como EDC. As carbodiimidas podem formar uma ligação covalente entre carboxila livre (por exemplo, das cadeias laterais de ácido aspártico e/ou ácido glutâmico) e grupos amino (por exemplo, na cadeia lateral de resíduos de lisina) para formar ligações amidas estáveis.

[00294] Como outro exemplo, o pelo menos um aminoácido pode ser reticulado quimicamente por um agente que inclui NHS. Reticula- dores ativados por éster NHS podem reagir com aminas primárias (por exemplo, no terminal N de cada cadeia polipeptídica e/ou na cadeia lateral de resíduos de lisina) para produzir uma ligação amida.

[00295] Em outra modalidade, o pelo menos um aminoácido pode ser reticulado quimicamente por um agente que inclui EDC e NHS. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4, em que o resíduo de metionina na posição 1 não está opcionalmen- te presente, em que o polipeptídeo inclui pelo menos um lado de ami- noácido cadeia quimicamente modificada por EDC e NHS. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um polipeptídeo isolado com a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6, em que o re-

síduo de metionina na posição 1 não está opcionalmente presente, em que o polipeptídeo de inclui pelo menos uma cadeia lateral de aminoá- cidos quimicamente modificada por EDC e NHS. Em ainda outra mo- dalidade, a invenção se refere a um polipeptídeo isolado com a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8. O polipeptídeo é modificado entrando em contato com o polipeptídeo com EDC e NHS.

[00296] Quando uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um poli- peptídeo, é quimicamente modificada por (por exemplo, entrando em contato) com EDC e NHS, em uma modalidade, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídeo é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma das modificações (a)-(h) descritas acima) e (l) uma porção beta-alanina ligada a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídeo.

[00297] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, em que o polipeptídeo inclui pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos quimicamente modifi- cada por EDC, NHS e uma amina primária hidrofílica não polimérica, preferencialmente glicina. Em uma modalidade, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação quando o polipeptídeo é modificado por EDC (por exemplo, pelo menos uma das modificações (a)-(h) descritas acima), pelo menos uma modificação quando o polipeptídeo é modifi- cado por glicina (por exemplo, pelo menos uma das modificações (i)- (k) descritas acima) e (l) uma fração de beta-alanina ligada a uma ca- deia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídeo.

[00298] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, em que uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de lisina do polipeptídeo está ligada a uma fração de beta-alanina. Em uma modalidade, uma cadeia lateral de um segundo resíduo de lisina do polipeptídeo está ligada a uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico e/ou a uma cadeia lateral de um resíduo de ácido glutâmico. O "segundo" resíduo de lisina do poli- peptídeo inclui um resíduo de lisina do polipeptídeo que não está liga- do a uma fração de beta-alanina. A cadeia lateral de um ácido aspárti- co e/ou a cadeia lateral de um ácido glutâmico ao qual o segundo re- síduo de lisina está ligado pode ser a do polipeptídeo para formar uma reticulação intra-molecular, ou a de um segundo polipeptídeo para formar uma reticulação intermolecular. Em outra modalidade, uma ca- deia lateral de pelo menos um resíduo de ácido aspártico e/ou uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de ácido glutâmico do poli- peptídeo está ligada a uma fração de glicina. O resíduo de ácido aspá- rtico e/ou o resíduo de ácido glutâmico que está ligado a uma fração de glicina também não está ligado a um resíduo de lisina.

[00299] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, em que pelo menos uma ca- deia lateral de aminoácido de uma toxina de C. difficile do tipo selva- gem é quimicamente modificada. Em uma modalidade, pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos de uma toxina de C. difficile do tipo selvagem A e/ou pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos de uma toxina B de C. difficile do tipo selvagem é quimicamente modifica- da por EDC. Por exemplo, em uma modalidade, TcdA (SEQ ID NO: 1) e/ou Tcdb (SEQ ID NO: 2) é quimicamente modificado por EDC. Em outra modalidade, a toxina do tipo selvagem é quimicamente modifica- da por EDC e NHS. Em uma modalidade, a toxina mutante, isto é, po- lipeptídeo, inclui uma toxina A do tipo selvagem quimicamente modifi- cada, em que a toxina A do tipo selvagem é qualquer uma descrita na Tabela 1. Em outra modalidade, a toxina mutante, isto é, polipeptídeo, inclui uma toxina do tipo selvagem B quimicamente modificada, em que a toxina do tipo selvagem B é qualquer uma descrita na Tabela 2.

Tabela 1: Cepas de C. difficile do Tipo selvagem Cepas ID de C. difficile Toxina A, SEQ ID NO: 2004013 SEQ ID NO: 87 2004111 SEQ ID NO: 88 2004118 SEQ ID NO: 89 2004205 SEQ ID NO: 90 2004206 SEQ ID NO: 91 2005022 SEQ ID NO: 92 2005088 SEQ ID NO: 93 2005283 SEQ ID NO: 94 2005325 SEQ ID NO: 95 2005359 SEQ ID NO: 96 2006017 SEQ ID NO: 97 2006376 N/A 2007070 SEQ ID NO: 98 2007217 SEQ ID NO: 99 2007302 SEQ ID NO: 100 2007816 SEQ ID NO: 101 2007838 SEQ ID NO: 102 2007858 SEQ ID NO: 103 2007886 SEQ ID NO: 104 2008222 SEQ ID NO: 105 2009078 SEQ ID NO: 106 2009087 SEQ ID NO: 107 2009141 SEQ ID NO: 108 2009292 SEQ ID NO: 109 001 SEQ ID NO: 148 002 SEQ ID NO: 149 003 SEQ ID NO: 150 012 (004) SEQ ID NO: 151 014 SEQ ID NO: 134 015 SEQ ID NO: 135 017 020 SEQ ID NO: 136 023 SEQ ID NO: 137 027 SEQ ID NO: 138 029 SEQ ID NO: 139 046 SEQ ID NO: 140 053 SEQ ID NO: 168 059 SEQ ID NO: 178 070 SEQ ID NO: 152 075 SEQ ID NO: 153 077 SEQ ID NO: 154 078 SEQ ID NO: 169 081 SEQ ID NO: 155 087 SEQ ID NO: 170 095 SEQ ID NO: 171

106 SEQ ID NO: 180 117 SEQ ID NO: 156 126 SEQ ID NO: 172 131 SEQ ID NO: 157 SE844 SEQ ID NO: 196 12087 SEQ ID NO: 197 K14 SEQ ID NO: 198 BI6 SEQ ID NO: 199 BI17 SEQ ID NO: 200 CH6230 SEQ ID NO: 201 SE881 SEQ ID NO: 202

Tabela 2 Cepas de C. difficile do Tipo selvagem Cepas ID de C. difficile Toxina B, SEQ ID NO: 2004013 SEQ ID NO: 110 2004111 SEQ ID NO: 111 2004118 SEQ ID NO: 112 2004205 SEQ ID NO: 113 2004206 SEQ ID NO: 114 2005022 SEQ ID NO: 115 2005088 SEQ ID NO: 116 2005283 SEQ ID NO: 117 2005325 SEQ ID NO: 118 2005359 SEQ ID NO: 119 2006017 SEQ ID NO: 120 2006376 SEQ ID NO: 121 2007070 SEQ ID NO: 122 2007217 SEQ ID NO: 123 2007302 SEQ ID NO: 124 2007816 SEQ ID NO: 125 2007838 SEQ ID NO: 126 2007858 SEQ ID NO: 127 2007886 SEQ ID NO: 128 2008222 SEQ ID NO: 129 2009078 SEQ ID NO: 130 2009087 SEQ ID NO: 131 2009141 SEQ ID NO: 132 2009292 SEQ ID NO: 133 001 SEQ ID NO: 158 002 SEQ ID NO: 159 003 SEQ ID NO: 160 012 (004) SEQ ID NO: 161 014 SEQ ID NO: 141 015 SEQ ID NO: 142 017 SEQ ID NO: 182 020 SEQ ID NO: 143 023 SEQ ID NO: 144

027 SEQ ID NO: 145 029 SEQ ID NO: 146 046 SEQ ID NO: 147 053 SEQ ID NO: 173 059 SEQ ID NO: 179 070 SEQ ID NO: 162 075 SEQ ID NO: 163 077 SEQ ID NO: 164 078 SEQ ID NO: 174 081 SEQ ID NO: 165 087 SEQ ID NO: 175 095 SEQ ID NO: 176 106 SEQ ID NO: 181 117 SEQ ID NO: 166 126 SEQ ID NO: 177 131 SEQ ID NO: 167

[00300] Como ainda outro exemplo de uma toxina de C. difficile mu- tante quimicamente reticulada, isto é, um polipeptídeo, pelo menos um aminoácido pode ser reticulado quimicamente por um agente que in- clui formaldeído. O formaldeído pode reagir com o grupo amino de um resíduo de aminoácido de terminal N e as cadeias laterais de arginina, cisteína, histidina e lisina. O formaldeído e a glicina podem formar um aduzido à base de Schiff, que pode se ligar a grupos amino primários de terminais N, resíduos de arginina e tirosina e, em menor grau, resí- duos de asparagina, glutamina, histidina e triptofano.

[00301] Diz-se que um agente de reticulação química reduz a cito- toxicidade de uma toxina se a toxina tratada tiver menos toxicidade (por exemplo, cerca de 100%, 99%, 95%, 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 25%, ou 10% menos toxicidade) do que a toxina não tratada em con- dições idênticas, conforme medido, por exemplo, por um ensaio de citotoxicidade in vitro ou por toxicidade animal.

[00302] De preferência, o agente de reticulação química reduz a citotoxicidade da toxina de C. difficile mutante em pelo menos cerca de uma redução de 2-log10, mais preferencialmente cerca de uma redu- ção de 3-log10 e mais preferencialmente cerca de 4-log10 ou mais, em relação à toxina mutante em condições idênticas, mas na ausência do agente de reticulação química. Em comparação com a toxina do tipo selvagem, o agente de reticulação química reduz preferencialmente a citotoxicidade da toxina mutante em pelo menos cerca de uma redu- ção de 5-log10, cerca de uma redução de 6-log10, cerca de uma redu- ção de 7-log10, cerca de uma redução de 8-log10, ou mais.

[00303] Em outra modalidade preferida, a toxina de C. difficile mu- tante quimicamente inativada, isto é, um polipeptídeo, exibe um valor de EC50 maior ou pelo menos cerca de 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml, 1000 μg/ml ou mais, medido por exemplo por um ensaio de cito- toxicidade in vitro, como quando aqui descrito.

[00304] As condições de reação para o contato da toxina mutante com o agente de reticulação química estão dentro do escopo de co- nhecimento de alguém versado na técnica, e as condições podem va- riar dependendo do agente utilizado. No entanto, os inventores desco- briram surpreendentemente condições ótimas de reação para o conta- to de uma toxina de C. difficile mutante, isto é, um polipeptídeo, com um agente de reticulação química, mantendo os epítopos funcionais e diminuindo a citotoxicidade da toxina mutante, em comparação com a toxina do tipo selvagem correspondente.

[00305] De preferência, as condições de reação são selecionadas para o contato de uma toxina mutante com o agente de reticulação, em que a toxina mutante tem uma concentração mínima de cerca de 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 mg/ml a um máximo de cerca de 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 ou 1,25 mg/ml. Qualquer valor mínimo pode ser combina- do com qualquer valor máximo para definir uma faixa de concentra- ções adequadas de uma toxina mutante para a reação. Mais preferen- cialmente, a toxina mutante tem uma concentração de cerca de 1,0 - 1,25 mg/ml para a reação.

[00306] Em uma modalidade, o agente usado na reação tem uma concentração mínima de cerca de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM ou 50 mM, e uma concentra- ção máxima de cerca de 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM ou 50 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer va- lor máximo para definir uma faixa de concentrações adequadas do agente químico para a reação.

[00307] Em uma modalidade preferida em que o agente inclui for- maldeído, a concentração utilizada é preferencialmente qualquer con- centração entre cerca de 2 mM a 80 mM, mais preferencialmente cer- ca de 40 mM. Em outra modalidade preferida em que o agente inclui EDC, a concentração utilizada é preferencialmente qualquer concen- tração entre cerca de 1,3 mM a cerca de 13 mM, mais preferencial- mente cerca de 2 mM a 3 mM, mais preferencialmente cerca de 2,6 mM. Em uma modalidade, a concentração de EDC é no máximo 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2,5 g/L, 2 g/L, 1,5 g/L, 1,0 g/L, 0,5 g/L com base no volu- me total da reação, preferencialmente no máximo 1 g/L, mais prefe- rencialmente no máximo 0,5 g/L.

[00308] Tempos de reação exemplares nos quais a toxina mutante é contatada com o agente de reticulação química incluem um mínimo de cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 36, 48 ou 60 horas e um máxi- mo de cerca de 14 dias, 12 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia ou 12 horas, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 hora. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de tempos de reação adequados.

[00309] Em uma modalidade preferida, a etapa de contato da toxina mutante com o agente de reticulação química ocorre por um período de tempo suficiente para reduzir a citotoxicidade da toxina de C. diffici- le mutante a um valor de EC50 de pelo menos cerca de 1000 µg/ml em uma célula humana adequada, por exemplo, células IMR-90, em um ensaio padrão de citotoxicidade in vitro, em comparação com uma toxina mutante idêntica na ausência do agente de reticulação. Mais preferencialmente, a etapa de reação é realizada por um tempo que é pelo menos duas vezes mais longo e, mais preferencialmente, pelo menos três vezes mais ou mais, como o período de tempo suficiente para reduzir a citotoxicidade da toxina mutante a um valor de EC50 de pelo menos cerca de 1000 µg/ml em uma célula humana adequada. Em uma modalidade, o tempo de reação não excede cerca de 168 ho- ras (ou 7 dias).

[00310] Por exemplo, em uma modalidade em que o agente inclui formaldeído, a toxina mutante é preferencialmente contatada com o agente por cerca de 12 horas, o que demonstrou ser um período de tempo exemplar que foi suficiente para reduzir a citotoxicidade da toxi- na de C. difficile mutante para um valor de EC50 de pelo menos cerca de 1000 µg/ml em uma célula humana adequada, por exemplo, células IMR-90, em um ensaio padrão de citotoxicidade in vitro, em compara- ção com uma toxina mutante idêntica na ausência do agente de reticu- lação. Em uma modalidade mais preferida, a reação é realizada duran- te cerca de 48 horas, o que é pelo menos cerca de três vezes enquan- to um período de tempo suficiente para a reação. Em tal modalidade, o tempo de reação é preferencialmente não superior a cerca de 72 ho- ras.

[00311] Em outra modalidade em que o agente inclui EDC, a toxina mutante é preferencialmente contatada com o agente por cerca de 0,5 horas, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 hora ou mais preferencialmente cerca de 2 horas. Em uma modalidade, a toxina mu- tante é contatada com EDC por no máximo cerca de 5 horas, prefe- rencialmente no máximo cerca de 3 horas, mais preferencialmente no máximo cerca de 2 horas. Em tal modalidade, o tempo de reação é preferencialmente não superior a cerca de 6 horas.

[00312] Exemplos de pH no qual a toxina mutante é contatada com o agente de reticulação química incluem um mínimo de pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ou 7,5 e um máximo de pH 8,5, 8,0, 7,5, 7,0 ou 6,5. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de pH adequado. Preferencialmente, a reação ocorre em pH 6,5 a 7,5, preferencialmente em pH 7,0.

[00313] Temperaturas exemplares às quais a toxina mutante é con- tatada com o agente de reticulação química incluem um mínimo de cerca de 2 °C, 4 °C, 10 °C, 20 °C, 25 °C ou 37 °C e uma temperatura máxima de cerca de 40 °C, 37 °C, 30 °C, 27 °C, 25 °C ou 20 °C. Qual- quer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir uma faixa de temperatura de reação adequada. De prefe- rência, a reação ocorre entre cerca de 20 °C e 30 °C, mais preferenci- almente entre cerca de 25 °C.

[00314] As composições imunogênicas descritas acima podem in- cluir uma toxina de C. difficile mutante (A ou B), isto é, polipeptídeos. Por conseguinte, as composições imunogênicas podem ocupar frascos separados (por exemplo, um frasco separado para uma composição incluindo a toxina A de C. difficile mutante A e um frasco separado pa- ra uma composição incluindo a toxina B de C. difficile mutante) na pre- paração ou kit. As composições imunogênicas podem ser destinadas ao uso simultâneo, sequencial ou separado.

[00315] Em outra modalidade, as composições imunogênicas des- critas acima podem incluir ambas as toxinas mutantes de C. difficile (A e B), isto é, polipeptídeos. Qualquer combinação da toxina A de C. dif- ficile mutante A e da toxina B de C. difficile mutante descrita pode ser combinada para uma composição imunogênica. Por conseguinte, as composições imunogênicas podem ser combinadas em um único fras- co (por exemplo, um único frasco contendo uma composição que inclui o TcdA de C. difficile mutante e uma composição que inclui o TcdB de

C. difficile mutante). Preferencialmente, as composições imunogênicas incluem um TcdA de C. difficile mutante e um TcdB de C. difficile mu- tante, isto é, polipeptídeos.

[00316] Por exemplo, em uma modalidade, a composição imunogê- nica inclui SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, em que pelo menos um aminoácido de cada uma das SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6 é reticu- lado quimicamente. Em outra modalidade, a composição imunogênica inclui uma toxina A de C. difficile mutante, que inclui a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7, e uma toxina B de C. difficile mutante, que compre- ende a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, em que pelo menos um ami- noácido de cada uma das toxinas mutantes de C. difficile é reticulado quimicamente.

[00317] Em outra modalidade, a composição imunogênica inclui qualquer sequência selecionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 83 e qualquer sequência selecionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 85. Em outra modalidade, a composi- ção imunogênica inclui a SEQ ID NO: 84 e uma composição imunogê- nica incluindo a SEQ ID NO: 86. Em outra modalidade, a composição imunogênica inclui a SEQ ID NO: 83 e uma composição imunogênica incluindo a SEQ ID NO: 85. Em outra modalidade, a composição imu- nogênica inclui SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 85.

[00318] Em outra modalidade, a composição imunogênica inclui um polipeptídeo com qualquer sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761 e um segundo polipeptídeo com qualquer sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 761, em que o polipeptí- deo foi contatado com um reticulador químico, como, por exemplo, formaldeído ou EDC, como descrito aqui. Por exemplo, em uma moda- lidade, a composição imunogênica inclui um primeiro polipeptídeo com a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ

ID NOs: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82 -761 e um segundo poli- peptídeo com a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo foram contata- dos com um reticulador químico, como, por exemplo, formaldeído ou EDC, quando aqui descrito.

[00319] Em certas modalidades, é preferido que as composições aqui descritas exibam propriedades imunogênicas (por exemplo, indu- zindo uma resposta imune detectável e/ou neutralizante e/ou proteto- ra) após administração apropriada a um indivíduo. A presença de res- posta imune neutralizante e/ou protetora pode ser demonstrada con- forme descrito acima e/ou mostrando que a infecção por um patógeno (por exemplo, C. difficile) é afetada (por exemplo, diminuída) em indi- víduos (por exemplo, ser humano ou outro animal) a quem os materi- ais descritos aqui foram administrados em comparação com indivíduos a quem os materiais não foram administrados. Por exemplo, um ou mais indivíduos de teste (por exemplo, humanos ou não humanos) po- dem ser administrados por qualquer rotina adequada e agendar uma composição aqui descrita e depois de um período de tempo adequado (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas) desafia- dos por um organismo patogênico. Os animais podem ser monitorados quanto à função imune (por exemplo, produção de anticorpos, ativida- de de células T) após administração e/ou desafio. Os soros podem ser analisados quanto à resposta total de anticorpos ou à expressão de subtipos específicos, utilizando, por exemplo, um ELISA de anticorpos e/ou um ensaio de neutralização de patógenos. A atividade das células T pode ser medida medindo, por exemplo, a produção de IFN-γ após re-estimulação com o antígeno. A análise estatística (por exemplo, tes- te exato de Fisher, teste de Wilcoxon, teste de Mann-Whitney) pode ser realizada nos dados para determinar se a eficácia do material afeta a resposta imune.

[00320] Os toxoides de C. difficile A e/ou B, quando aqui descritos, podem ser combinados com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis para fornecer uma composição antes da administração a um hospedeiro. Um transportador farmaceuticamente aceitável é um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo, sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira prejudicial com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica em que está contido. O veículo seria naturalmente selecionado para mini- mizar qualquer degradação do ingrediente ativo e para minimizar quaisquer efeitos colaterais adversos no indivíduo, como seria bem conhecido de alguém versado na técnica. Veículos farmacêuticos ade- quados e suas formulações são descritos, por exemplo em, Reming- ton's: The Science and Practice of Pharmacy, 274ª. Edição, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005), e pode ser apropriado. Tipicamente, uma quantidade apropriada de sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tornar a formulação isotônica. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, água estéril, solução salina, soluções tamponadas como a so- lução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é geralmente de cerca de 5 a cerca de 8 ou de cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos incluem preparações de libertação prolongada, tais como ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo po- lipeptídeos ou seus fragmentos. As matrizes podem estar na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Será evidente para aqueles versados na técnica que certos veículos podem ser mais preferíveis dependendo, por exemplo, da via de admi- nistração e da concentração da composição sendo administrada. Os veículos são aqueles adequados para administração a seres humanos ou outros indivíduos.

[00321] Como mencionado acima, uma composição imunológica é tipicamente aquela que compreende o (s) antígeno (s) de C. difficile e, após administração a um hospedeiro (por exemplo, um animal), induz ou melhora uma resposta imune direcionada contra o antígeno (por exemplo, C. difficile). Tais respostas podem incluir a geração de anti- corpos (por exemplo, através da estimulação de células B) ou uma resposta baseada em células T (por exemplo, uma resposta citolítica), como descrito acima, que pode ser protetor e/ou neutralizante. Uma resposta imune protetora ou neutralizante pode ser prejudicial para o organismo infeccioso correspondente ao antígeno (por exemplo, do qual o antígeno foi derivado) e benéfica para o hospedeiro (por exem- plo, reduzindo ou prevenindo a infecção). Quando aqui utilizado, os anticorpos protetores ou neutralizantes e/ou as respostas celulares podem ser reativos com os antígenos de C. difficile aqui descritos, es- pecialmente quando administrados em quantidade e/ou ponto de tem- po eficazes. Esses anticorpos e/ou respostas celulares podem reduzir ou inibir a gravidade, tempo e/ou letalidade da infecção por C. difficile quando testados em animais. Como mostrado nos exemplos, as com- posições aqui descritas podem ser usadas para induzir uma resposta imune contra C. difficile. Uma composição imunológica que, mediante administração a um hospedeiro, resulta em uma resposta imune tera- pêutica (por exemplo, tipicamente administrada durante uma infecção ativa) e/ou protetora (por exemplo, tipicamente administrada antes ou após uma infecção ativa) e/ou neutralizante, pode ser considerada uma vacina.

[00322] Em uma modalidade, a composição induz uma resposta imune. Em uma modalidade preferida, o uso da composição reduz a incidência de um primeiro episódio primário de uma infecção por C. difficile. A incidência pode ser reduzida após a primeira administração da composição, após a segunda administração da composição e/ou após a terceira administração da composição, em comparação com a incidência anterior à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o uso da composição reduz a incidência de infecção re- corrente por C. difficile. A incidência de infecção recorrente pode ser reduzida após a primeira administração da composição, após a se- gunda administração da composição e/ou após a terceira administra- ção da composição.

[00323] Em outra modalidade, o uso da composição reduz a gravi- dade de uma infecção por C. difficile. Por exemplo, a duração de um episódio de uma infecção por C. difficile pode ser reduzida após a pri- meira administração da composição, após a segunda administração da composição e/ou após a terceira administração da composição, em comparação com a incidência anterior a uma primeira administração da composição. Um episódio de uma infecção por C. difficile pode in- cluir, por exemplo, pelo menos dois dias após a passagem de pelo menos três fezes não formadas e/ou a necessidade de tratamento com antibióticos para a infecção por C. difficile. A duração de um episódio de uma infecção por C. difficile pode ser considerada reduzida se o paciente tiver passado pelo menos dois dias sem passagem de pelo menos três ou mais fezes não formadas e/ou não houver mais neces- sidade de tratamento com antibióticos para a infecção por C. difficile.

[00324] Em algumas modalidades, métodos para prevenir, melho- rar, reduzir o risco e/ou tratar (por exemplo, afetar) a infecção por C. difficile também são fornecidos. Métodos para o tratamento de uma ou mais condições de doença causadas por ou envolvendo C. difficile em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo pelo menos uma ou mais doses efetivas de uma composição aqui descrita (por exemplo, compreendendo antígenos de C. difficile, por exemplo, toxoi- de A, toxoide B) Os antígenos podem ser administrados em uma quan-

tidade de dosagem de cerca de 1 a cerca de 300 µg (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 5, 20, • 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 e/ou 300 µg). Os antígenos podem ser administrados mais de uma vez na mesma ou em diferentes quantidades de dosagem.

Em certas mo- dalidades, os antígenos de C. difficile podem ser administrados ao in- divíduo pela (s) mesma (s) via (s) adequada (s) uma ou duas vias ade- quadas uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais vezes.

Quando doses múltiplas são administradas, as doses po- dem compreender aproximadamente o mesmo ou diferente tipo e/ou quantidade de antígenos de C. difficile em cada dose.

As doses tam- bém podem ser separadas no tempo uma da outra por intervalos iguais ou diferentes.

Por exemplo, as doses podem ser separadas por cerca de 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 ou 96 horas, sete dias, 14 dias, 21 dias, 21 dias, 30 dias, 40 dias, 50 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias, 100 dias, 1 10 dias, 120 dias, 130 dias, 140 dias, 150 dias, 160 dias, 170 dias, 180 dias, 190 dias, 190 dias, 200 dias, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove me- ses, 10 meses, 1 mês, 12 meses, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos ou qualquer período antes, depois e/ou entre qualquer um des- ses períodos.

Em algumas modalidades, os antígenos de C. difficile podem ser administrados sozinhos ou em conjunto com outros agen- tes (por exemplo, antibióticos). Esses outros agentes podem ser admi- nistrados simultaneamente (ou quase simultaneamente) com o mesmo ou diferentes antígenos de C. difficile ou em um momento diferente e/ou frequência.

Outras modalidades de tais métodos também podem ser apropriadas, pois podem ser prontamente determinadas por al- guém de experiência ordinária na técnica.

[00325] Também são fornecidos métodos para imunizar um indiví- duo (como um ser humano), administrando-o quaisquer dessas com- posições. Em algumas modalidades, os métodos podem compreender a administração ao indivíduo de uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) compreendendo uma quantidade eficaz (por exemplo, pelo menos cerca de 40 a cerca de 500, tal como cerca de 50 a cerca de 100 μg) de toxoide A e toxoide B de C. difficile (combi- nado p/p) em uma relação eficaz de toxoide A : B (por exemplo, 3 : 1, 3 : 2, 1 : 1 em peso (p/p)) e com pureza suficiente (por exemplo, pelo menos 90% (p/p)), usando uma ou mais administrações (por exemplo, pelo menos três vezes, cada dose sendo adequadamente separada uma da outra (por exemplo, pelo menos cerca de 7 dias)). Uma rela- ção A : B eficaz do toxoide é qualquer relação que possa ser incluída em uma composição e induzir uma resposta imune eficaz contra a to- xina A e/ou toxina B de C. difficile.

[00326] Em uma modalidade, o método pode compreender primei- ra, segunda e terceira administrações, em que a segunda administra- ção é pelo menos 7 dias após a primeira administração e a terceira administração é pelo menos cerca de 30 dias e/ou pelo menos cerca de 180 dias após a primeira e/ou segunda administração.

[00327] Em algumas modalidades, os métodos podem realçar e/ou induzir uma resposta imune existente em um ser humano previamente exposto a C. difficile (por exemplo, um ser humano soropositivo, uma resposta imune anamnéstica).

[00328] Em uma modalidade, o ser humano teve uma hospitaliza- ção não planejada nos 12 meses anteriores à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano teve uma instala- ção de enfermagem qualificada (uma instituição residencial que forne- ce serviços profissionais de assistência e reabilitação de enfermagem, geralmente após a alta do hospital) permanecer nos 12 meses anterio-

res à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano teve um lar de idosos (por exemplo, uma instituição resi- dencial que fornece serviços profissionais de assistência e reabilitação de enfermagem, geralmente após a alta de um hospital) permanecer nos 12 meses anteriores à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano teve duas ou mais consultas no pron- to-socorro nos 12 meses anteriores à primeira administração da com- posição. Em outra modalidade, o ser humano teve 10 ou mais consul- tas ambulatoriais (consultas de cuidados primários e/ou secundários, mas excluindo consultas de farmácia e saúde mental) nos 12 meses anteriores à primeira administração da composição.

[00329] Em outra modalidade, o ser humano foi administrado uso de antibiótico sistêmico dentro das 12 semanas anteriores à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano tem uma co-morbidade ou contato significativo com os sistemas de saúde nos 12 meses anteriores à primeira administração da composi- ção. Em outra modalidade, o ser humano teve 1 internação hospitalar em paciente ≥ 2 noites nos 12 meses anteriores à primeira administra- ção da composição. Em outra modalidade, o ser humano teve ≥ 2 con- sultas no pronto-socorro nos 12 meses anteriores à primeira adminis- tração da composição. Em outra modalidade, o ser humano teve ≥ 10 consultas ambulatoriais nos 12 meses anteriores à primeira adminis- tração da composição. Em outra modalidade, o ser humano tem resi- dência em uma instalação de enfermagem especializada nos 12 me- ses anteriores à primeira administração da composição. Em outra mo- dalidade, o ser humano tem residência em um lar de idosos nos 12 meses anteriores à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano tem uma internação hospitalar ≥ 2 noites programadas ≥ 37 dias após a randomização nos 12 meses anteriores à primeira administração da composição. Em outra modalidade, o ser humano recebeu antibióticos sistêmicos a qualquer momento nas 12 semanas anteriores antes da primeira administração da composição.

[00330] Em certas modalidades, o ser humano trabalha ou tem con- tato com qualquer uma das seguintes instalações nos 12 meses ante- riores à primeira administração da composição: um hospital, instalação de enfermagem especializada (uma instituição residencial que fornece serviços profissionais de assistência e reabilitação de enfermagem, geralmente após a alta hospitalar), um lar de idosos (por exemplo, uma instituição residencial que fornece serviços profissionais de assis- tência e reabilitação de enfermagem, geralmente após a alta do hospi- tal), pronto-socorro e unidade ambulatorial (visitas de cuidados primá- rios e/ou secundários, mas excluindo visitas a farmácia e saúde men- tal).

[00331] Em certas modalidades, os seres humanos podem ter tido, no período de 12 meses antes da primeira administração, pelo menos uma ou duas internações hospitalares, cada uma com duração de pelo menos cerca de 24, 48 ou 72 horas ou mais e/ou recebido antibióticos sistêmicos (não tópicos); e/ou, espera-se uma internação hospitalar para um procedimento cirúrgico planejado dentro de cerca de 60 dias após a primeira administração. Em algumas modalidades, a interna- ção/hospitalização antecipada/iminente pode ser planejada para ser de cerca de 24, 48 a 72 horas ou mais e pode ser para uma cirurgia en- volvendo pelo menos um dos rins/bexiga/sistema urinário, sistema músculo-esquelético, respiratório sistema circulatório e sistema nervo- so central.

[00332] É preferível que a resposta imune evocada por esses mé- todos seja suficiente para prevenir e/ou melhorar e/ou reduzir o risco de infecção sintomática por C. difficile. Em certas modalidades, o mé- todo pode compreender a administração da composição imunogênica a um indivíduo humano em risco de uma infecção sintomática que te-

nha pelo menos cerca de 40, 50 ou 65, 70, 75, 80 ou 85 anos de ida- de.

Em algumas modalidades, o método pode compreender a adminis- tração da composição a cada indivíduo de um grupo com idade entre cerca de 40 e 65 anos e/ou entre 65 e 75 anos.

Em algumas modali- dades, o método pode induzir um aumento de duas a quatro vezes de uma resposta imune baseada em anticorpos contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile em cerca de 80, 85, 90, 95 ou 100% de uma po- pulação de indivíduos considerados soropositivos antes da primeira administração, medida por, por exemplo, ELISA e/ou TNA.

Em algu- mas modalidades, o método pode induzir um aumento de duas a qua- tro vezes de uma resposta imune baseada em anticorpos contra a to- xina A e/ou toxina B de C. difficile em cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% de uma população de indivíduos considerados soronegativos antes da administração da composição, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA 14 dias após a primeira administração (por exemplo, após a administração nos dias 0, sete e 30). Em algumas modalidades, o método pode induzir um aumento de duas a quatro vezes de uma resposta imune baseada em anticorpos contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile em cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80% de uma população de indivíduos considerados so- ronegativos antes da administração da composição, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA 60 dias após a primeira administra- ção (por exemplo, após a administração nos dias 0, sete e 30). Em al- gumas modalidades, os indivíduos nessas populações têm entre 40 e 65 anos de idade.

Em algumas modalidades, os indivíduos nessas po- pulações têm cerca de 50 a 75 anos ou cerca de 50 anos a cerca de 65 anos.

Em algumas modalidades, esse aprimoramento é observado cerca de 30 dias após a primeira administração (no dia 0), normalmen- te segue uma segunda administração por volta do dia 7 e é normal- mente observado antes da terceira administração (por exemplo, cerca do dia 30 ou dia 180). Em algumas modalidades, a resposta imune pode ser detectável contra a toxina A e/ou toxina B por até cerca de 30 meses (por exemplo, cerca de 1000 dias) após a primeira, segunda e/ou terceira administração em um protocolo de administração de múl- tiplos regimes.

Em algumas modalidades, a administração de uma composição aqui descrita a um indivíduo humano no dia 0 (primeira administração), cerca do dia 7 (segunda administração) e cerca do dia 30 (terceira administração) melhora ou induz uma resposta imune con- tra a toxina A e C. difficile/ou toxina B por até cerca de 30 meses, ou cerca de 1000 dias, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA, preferencialmente por um ensaio de citotoxicidade.

Em algumas modalidades, o nível da resposta imune pode ser pelo menos tão alto no dia 1000 após a primeira administração quanto no dia 14 após a primeira administração de um regime de administração de três doses, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA, preferencialmen- te por um ensaio de citotoxicidade.

Em algumas modalidades, o nível da resposta imune pode ser pelo menos tão alto em qualquer um dos dias 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1000 após a primei- ra administração, como no dia 14 após a primeira administração medi- da por, por exemplo, ELISA e/ou TNA, preferencialmente por um en- saio de citotoxicidade.

Em algumas modalidades, a resposta imune pode estar cerca de duas a oito vezes acima da linha de base (por exemplo, níveis de anticorpo antitoxina A e/ou toxina B no dia 0, antes da primeira administração, conforme medido por exemplo, ELISA e/ou TNA.

Em algumas modalidades, a resposta imune pode estar de cerca de 2,5 a 6,8 vezes acima da linha de base, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA, preferencialmente por um ensaio de citoto- xicidade.

Em algumas modalidades, a resposta imune em indivíduos soropositivos (por exemplo, não -naive) é aumentada da linha de base por um fator de cerca de três no dia 7; cerca de 10 a cerca de 70 no dia 14; cerca de 30 a cerca de 200 no dia 30; e cerca de 100 a cerca de 200 no dia 60, como medido por ELISA para as toxinas A e/ou B (por exemplo, após a administração nos dias 0, 7 e 30) Em algumas modalidades, a resposta imune em indivíduos soropositivos (por exemplo, não ingênuos) é aumentada da linha de base por um fator de cerca de três por volta do dia 7; cerca de 10 a cerca de 100 no dia 14; cerca de 1 5 a cerca de 1 30 aproximadamente dia 30; e cerca de 100 a cerca de 130 por volta do dia 60, conforme medido por TNA para to- xinas A e/ou B (por exemplo, após administração nos dias 0, sete e 30). Em algumas modalidades, a resposta imune em indivíduos soro- negativos (por exemplo, ingênuos) é aumentada a partir da linha de base por um fator de cerca de dois por volta do dia 14; cerca de cinco a cerca de 10 por volta do dia 30; e cerca de 25 a cerca de 60 por vol- ta do dia 60, conforme medido por ELISA para as toxinas A e/ou B (por exemplo, após administração nos dias 0, sete e 30). Em algumas mo- dalidades, a resposta imune em indivíduos soronegativos (por exem- plo, ingênuos) é aumentada da linha de base por um fator de cerca de dois a cerca de três por volta do dia 14; cerca de duas a cerca de cin- co no dia 30; e cerca de cinco a cerca de 40 por volta do dia 60, con- forme medido por TNA para as toxinas A e/ou B (por exemplo, após administração nos dias 0, 7 e 30). Em algumas modalidades, as res- postas imunes aqui descritas são detectadas em indivíduos considera- dos soropositivos ou soronegativos no dia 0 (por exemplo, antes da primeira administração). Em algumas modalidades, essa resposta imune é detectada tanto para a toxina A de C. difficile quanto para a toxina B, conforme medido por, por exemplo, ELISA e/ou TNA, prefe- rencialmente por um ensaio de citotoxicidade.

Métodos (por exemplo, in vitro ou in vivo) para produzir esses antígenos de C. difficile (por exemplo, toxoides A e/ou B) e composições compreendendo os mes- mos, também são fornecidos.

Tais métodos podem incluir, por exem-

plo, qualquer um dos disponíveis e/ou conhecidos por aqueles de ex- periência ordinária na técnica e/ou os métodos descritos no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente US No. 9187536 e Patente WIPO Pedido WO/2014/060898, que são cada um incorporados por referência aqui em suas respectivas totalidades.

[00333] Quando aqui utilizado, um indivíduo ou hospedeiro é desti- nado a ser um indivíduo. O indivíduo pode incluir animais domestica- dos, como gatos e cães, criação (por exemplo, gado, cavalos, porcos, ovelhas e cabras), animais de laboratório (por exemplo, camundongos, coelhos, ratos, porquinhos da índia) e pássaros. Em um aspecto, o in- divíduo é um mamífero, como um primata ou um humano.

COMPOSIÇÃO E VACINA

[00334] Em uma modalidade, a composição é uma composição imunogênica. Em uma modalidade, a composição é uma composição imunogênica para um humano. Em outra modalidade, a composição é uma vacina. Uma "vacina" refere-se a uma composição que inclui um antígeno, que contém pelo menos um epítopo que induz uma resposta imune específica para esse antígeno. A vacina pode ser administrada diretamente no indivíduo por via subcutânea, oral, oronasal ou intrana- sal. De preferência, a vacina é administrada por via intramuscular. Em uma modalidade, a composição é uma vacina humana. Em uma mo- dalidade, a composição é uma composição imunogênica contra C. dif- ficile.

[00335] Em certas modalidades, as composições podem ainda compreender um ou mais antígenos de C. difficile, um ou mais veícu- los farmaceuticamente aceitáveis e/ou um ou mais adjuvantes (por exemplo, sal de alumínio, emulsão, lipossoma catiônico, polímero aniônico, agonista de receptores semelhantes ao dobre de sino, e uma combinação dos mesmos).

[00336] Em uma modalidade, a composição, que pode ser uma va-

cina, pode ser fornecida como uma formulação liofilizada que pode ser reconstituída no sítio clínico com diluente e misturada com qualquer adjuvante (por exemplo, um adjuvante de alumínio como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio ou água para injeção (WFI), quando especificado.

[00337] Em uma modalidade, a composição inclui um veículo far- maceuticamente aceitável, que se refere a quaisquer solventes, meios de dispersão, estabilizadores, diluentes e/ou tampões que são fisiolo- gicamente adequados. Estabilizadores exemplares incluem carboidra- tos, como sorbitol, manitol, amido, dextrano, sacarose, trealose, lacto- se e/ou glicose; proteínas inertes, como albumina e/ou caseína; e/ou outras macromoléculas grandes de metabolismo lento, como polissa- carídeos como quitosana, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos e co- polímeros (como agarose SEPHAROSE™ funcionalizada com látex, agarose, celulose, etc.), aminoácidos, aminoácidos poliméricos, ami- noácidos copolímeros e agregados lipídicos (como gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).

[00338] De preferência, a composição inclui trealose. As quantida- des preferidas de trealose (% em peso) incluem de um mínimo de cer- ca de 1%, 2%, 3% ou 4% a um máximo de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5%. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qual- quer valor máximo para definir um intervalo adequado. Em uma moda- lidade, a composição inclui cerca de 3% - 6% de trealose, mais prefe- rencialmente, 4,5% de trealose, por exemplo, por dose de 0,5 mL.

[00339] Exemplos de diluentes adequados incluem água destilada, solução salina, solução salina fisiológica tamponada com fosfato, glice- rol, álcool (como etanol), soluções de Ringer, solução de dextrose, so- luções salinas balanceadas de Hanks e/ou um excipiente de liofiliza- ção. O diluente pode ser, por exemplo, qualquer diluente farmaceuti-

camente aceitável (por exemplo, 20 mM de citrato de sódio, 5% de sa- carose e 0,016% de formaldeído; 10 niM de citrato, 4% de sacarose, 0,008% de formaldeído, 0,57% de cloreto de sódio). Em uma modali- dade preferida, a composição inclui 10 mM de Tris, 4,5%, trealose, 0,01% de polissorbato 80 (PS80), pH 7,4

[00340] Tampões exemplares incluem fosfato (como fosfato de po- tássio, fosfato de sódio); acetato (como acetato de sódio); succinato (como succinato de sódio); glicina; histidina; tampões de carbonato, Tris (tris (hidroximetil)aminometano) e/ou bicarbonato (como bicarbo- nato de amônio). De preferência, a composição inclui tampão tris. Quantidades preferidas de tampão tris incluem de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM ou 11 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir um intervalo adequado. Em uma modalidade, a composição inclui cerca de 8 mM a 12 mM de tampão tris, mais preferencialmente, 10 mM de tampão tris, por exemplo, por dose de 0,5 mL.

[00341] Em outra modalidade preferida, a composição inclui tampão histidina. Quantidades preferidas de tampão histidina incluem de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM ou 11 mM. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir um intervalo adequado. Em uma modalidade, a composição inclui cer- ca de 8 mM a 12 mM de tampão histidina, mais preferencialmente, 10 mM de tampão histidina, por exemplo, por dose de 0,5 mL.

[00342] Em ainda outra modalidade preferida, a composição inclui tampão fosfato. Quantidades preferidas de tampão fosfato incluem de um mínimo de cerca de 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM a um máximo de cerca de 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM ou 11 mM. Qual- quer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo para definir um intervalo adequado. Em uma modalidade, a composi- ção inclui cerca de 8 mM a 12 mM de tampão fosfato, mais preferenci- almente, 10 mM de tampão fosfato, por exemplo, por dose de 0,5 mL.

[00343] O pH do tampão será geralmente escolhido para estabilizar o material ativo de escolha e pode ser determinado pelos especialistas na técnica por métodos conhecidos. De preferência, o pH do tampão estará na faixa do pH fisiológico. Assim, os intervalos de pH preferidos são de cerca de 3 a cerca de 8; mais preferencialmente, de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; ainda mais preferencialmente, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5; e mais preferencialmente, entre cerca de 7,0 e cerca de 7,2.

[00344] Em outra modalidade, as composições aqui descritas po- dem incluir um adjuvante, como descrito abaixo. Os adjuvantes prefe- ridos aumentam a resposta imune intrínseca a um imunogênio sem causar alterações conformacionais no imunogênio que podem afetar a forma qualitativa da resposta imune. Exemplos de adjuvantes incluem 3 monofosforil lipídico A De-O-acilado (MPL™) (veja, GB 2220211 (GSK)); um gel de hidróxido de alumínio como ALHYDROGEL™ (Brenntag Biosector, Denmark); sais de alumínio (como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio), que podem ser usados com ou sem um agente imunoestimulante, como MPL ou 3- DMP, QS-21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos, como ácido poliglutâmico ou polilisina. Ainda outro adjuvante exemplar é um oligo- nucleotídeo imunoestimulador, como um oligonucleotídeo CpG (veja, por exemplo, WO 1998/040100, WO2010/067262), ou uma saponina e um oligonucleotídeo imunoestimulador, como um oligonucleotídeo CpG (veja, por exemplo, WO 00/062800). Em uma modalidade preferi-

da, o adjuvante é um oligonucleotídeo CpG, mais preferencialmente um oligodesoxinucleotídeo CpG (CpG ODN). CpG ODN preferidos são da classe B que ativam preferencialmente células B.

Em aspectos da invenção, o CpG ODN possui a sequência de ácidos nucleicos 5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3’ (SEQ ID NO: 48) em que * indica uma ligação de fosforotioato.

O CpG ODN desta se- quência é conhecido como CpG 24555, descrito em WO2010/067262. Em uma modalidade preferida, o CpG 24555 é usado em conjunto com um sal de hidróxido de alumínio, como o ALHYDROGEL.

Uma classe adicional de adjuvantes exemplares inclui adjuvantes de sapo- nina, como STIMULON™ (QS-21, que é um glicosídeo triterpeno ou saponina, Aquila, Framingham, Mass.) ou partículas geradas a partir dele, como ISCOMs (complexos de estimulação imune) e adjuvante ISCOMATRIX ®. Por conseguinte, as composições da presente inven- ção podem ser liberados na forma de ISCOMs, ISCOMS contendo CTB, lipossomas ou encapsulados em compostos como acrilatos ou poli (DL-lactido-co-glicosídeo) para formar microesferas de um tama- nho adequado para adsorção.

Normalmente, o termo "ISCOM" refere- se a complexos imunogênicos formados entre glicosídeos, como sa- poninas triterpenoides (particularmente Quil A) e antígenos que con- têm uma região hidrofóbica.

Em uma modalidade preferida, o adjuvan- te é um adjuvante ISCOMATRIX.

Outros adjuvantes exemplares inclu- em RC-529, GM-CSF e Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adju- vante Incompleto de Freund (IFA). Ainda outra classe de adjuvantes exemplares são os análogos glicolipídicos incluindo N-glicosilamidas, N-glicosilureias e N-glicosilcarbamatos, cada um dos quais é substituí- do no resíduo de açúcar por um aminoácido.

Opcionalmente, a com- posição farmacêutica inclui dois ou mais adjuvantes diferentes.

As combinações preferidas de adjuvantes incluem qualquer combinação de adjuvantes, incluindo, por exemplo, pelo menos dois dos seguintes adjuvantes: alúmen, MPL, QS-21, ISCOMATRIX, CpG e ALHYDRO- GEL. Uma combinação exemplar de adjuvantes inclui uma combina- ção de CpG e ALHYDROGEL.

[00345] O adjuvante pode compreender, por exemplo, uma concen- tração adequada (por exemplo, cerca de 800 a 1600 μg/mL) de um adjuvante, como um adjuvante compreendendo alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio) em WFI. Por exemplo, o adjuvante (por exemplo, 800 - 1600 g/mL de hidróxido de alumínio em cloreto de sódio a 0,57%) pode ser usado como diluente para reconsti- tuir a formulação liofilizada. O WFI pode ser utilizado para diluir a vaci- na liofilizada para as formulações não adjuvadas. A solução de dosa- gem final pode compreender, por exemplo, composição/vacina, diluen- te e adjuvante.

[00346] Alternativamente, em uma modalidade, a composição é administrada ao mamífero na ausência de um adjuvante. Ou seja, a composição não compreende um adjuvante.

[00347] Em algumas modalidades, a composição inclui um tensoa- tivo. Qualquer tensoativo é adequado, seja anfotérico, não iônico, ca- tiônico ou aniônico. Os tensoativos exemplificativos incluem os tensoa- tivos dos ésteres de polioxietileno sorbitano (por exemplo, TWEEN ®), como o polissorbato 20 e/ou o polissorbato 80; éteres graxos de poli- oxietileno derivados dos alcoóis lauril, cetil, estearil e oleílico (conheci- dos como tensoativos BRIJ), como éter monolauril trietilenoglicol (BRIJ 30); TRITON X 100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol; e ésteres de sorbi- tano (comumente conhecidos como SPANs), como trioleato de sorbi- tano (SPAN 85) e monolaurato de sorbitano e combinações dos mes- mos. Os tensoativos preferidos incluem o polissorbato 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano).

[00348] O polissorbato 80 (PS-80) é um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, a composição inclui uma concentração de PS-80 que varia de 0,0005% a 1%. Por exemplo, a concentração de PS-80 na composição pode ser de pelo menos 0,0005%, 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% ou 1,1% PS-80. Em uma modalidade, a concentração do PS-80 na composição pode ser no máximo 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8% ou 0,7% PS-80. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo descrito aqui para definir um intervalo. De preferência, a composição compreende 0,01% de PS-

80.

[00349] Em uma modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose e fosfato 80. Em outra modalidade exemplar, a compo- sição imunogênica inclui tampão tris e polissorbato 80. Em outra mo- dalidade exemplar, a composição imunogênica inclui tampão histidina e polissorbato 80. Em ainda outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui tampão fosfato e polissorbato 80.

[00350] Em uma modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão tris e polissorbato 80. Em outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão histidina e polissorbato 80. Em ainda outra modalidade exemplar, a composição imunogênica inclui trealose, tampão fosfato e polissorbato 80

[00351] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica in- clui ainda formaldeído. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica que inclui ainda formaldeído tem uma composição imunogênica, em que a toxina de C. difficile mutante da composição imunogênica foi contatada com um agente de reticulação química que inclui formaldeído. A quantidade de formaldeído presente na composição farmacêutica pode variar de um mínimo de cerca de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,010%, 0,013% ou 0,015%, até um máximo de cerca de

0,020%, 0,019%, 0,018%, 0,017% 0,016%, 0,015%, 0,014%, 0,013%, 0,012% 0,011% ou 0,010%. Qualquer valor mínimo pode ser combina- do com qualquer valor máximo para definir um intervalo adequado. Em uma modalidade, a composição farmacêutica inclui cerca de 0,010% de formaldeído.

[00352] Em algumas modalidades alternativas, as composições farmacêuticas aqui descritas não incluem formaldeído. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica que não inclui formaldeído tem uma composição imunogênica, em que pelo menos um aminoácido da toxina de C. difficile mutante é quimicamen- te reticulado por um agente que inclui EDC. Mais preferencialmente, em tal modalidade, a toxina de C. difficile mutante não foi contatada com um agente de reticulação química que inclui formaldeído. Como outra modalidade exemplar, uma composição farmacêutica que está em uma forma liofilizada não inclui formaldeído.

[00353] Também são aqui fornecidos kits para administrar os antí- genos de C. difficile. Em uma modalidade, um ou mais antígenos de C. difficile podem formar parte e/ou ser fornecidos como um kit para ad- ministração a um indivíduo. Instruções para administrar os antígenos de C. difficile também podem ser fornecidas pelo kit. As composições compreendendo antígenos de C. difficile quando aqui descritos podem ser incluídas em um kit (por exemplo, um kit de vacina). Por exemplo, o kit pode compreender um primeiro recipiente contendo uma compo- sição aqui descrita na forma seca ou liofilizada e um segundo recipien- te contendo uma solução aquosa para reconstituir a composição. O kit pode opcionalmente incluir o dispositivo para administração da forma líquida reconstituída da composição (por exemplo, seringa hipodérmi- ca, conjunto de microagulhas) e/ou instruções de uso. O dispositivo para administração pode ser fornecido pré-cheio com uma solução aquosa para reconstituir a composição.

[00354] O volume de cada dose administrada do fármaco do estudo (vacina ou placebo) pode ser de cerca de 0,5 mL. O volume de cada dose liberada da composição aqui descrita pode ser de cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7; 0,8, 0,9 ou 1 mL. O volume de cada dose libera- da da composição aqui descrita pode ser de cerca de 0,4, 0,5, 0,6 ml. O volume de cada dose liberada da composição aqui descrita pode ser de cerca de 0,5 mL. O volume de cada dose liberada da composição descrita aqui pode ser de cerca de 1 mL. As formulações podem ser administradas por qualquer via adequada (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, intranodal, in- tranasal, oral).

ATIVIDADE NEUTRALIZADORA DA TOXINA

[00355] A resposta imune induzida pela administração da composi- ção a um ser humano pode ser determinada usando um ensaio de neutralização de toxinas (TNA), ELISA ou, mais preferencialmente, um ensaio de citotoxicidade, como o descrito no Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente US No. 9187536 e Pedido de Patente WI- PO WO/2014/060898, que são cada um incorporados por referência aqui em suas respectivas totalidades.

[00356] O ensaio de citotoxicidade in vitro é um ensaio segurança essencial desenvolvido para testar qualquer potencial citotoxicidade residual em material de substância farmacêutica. A medição de qual- quer citotoxicidade residual potencial no toxoide A é realizada usando um ensaio baseado em células IMR-90. A toxina A de C. difficile do tipo selvagem exibe citotoxicidade potente in vitro, com pequenas quantidades da toxina sendo suficientes para causar vários efeitos nas células de mamíferos, como arredondamento de células (efeito citopá- tico ou CPE) e falta de atividade metabólica (medida pelos níveis de ATP). O ensaio de CPE é realizado incubando material toxoide com as células IMR90 em cultura a 500 mcg/mL a 37 °C e avaliando o arre-

dondamento de células 24 horas depois. O ensaio CPE requer uma avaliação visual subjetiva do CPE por analistas treinados e, portanto, não pode ser facilmente validado. O ensaio de liberação de citotoxici- dade foi desenvolvido com base na medição da quantidade de sinal de luminescência gerado a partir do ATP, que é proporcional ao número de células metabolicamente ativas após o tratamento com o toxoide A ou com a toxina do tipo selvagem. Os resultados são expressos como EC50, que é definido como a quantidade de toxina ou toxoide que causa uma redução de 50% nos níveis de ATP, conforme medido em unidades de luz relativas. O toxoide é testado a uma concentração de 100 mcg/mL. Este método foi escolhido para testes de liberação e es- tabilidade (pontos de tempo limitados) porque é mais robusto, objetivo e adequado para testes de GMP do que um ensaio de efeito citopato- gênico alternativo (CPE). O ensaio de citotoxicidade é realizado ape- nas no toxoide, porque pode ser testado em uma concentração mais alta em comparação com o material do fármaco sem interferência da matriz. Isso garante que a medição seja feita no estágio mais concen- trado durante o ciclo de produção da vacina contra C. difficile. Além disso, o ensaio de citotoxicidade será conduzido com estabilidade para monitorar qualquer potencial reversão à toxicidade.

[00357] O ensaio de citotoxicidade in vitro é um teste de segurança essencial desenvolvido para testar qualquer potencial citotoxicidade residual em material de substância farmacêutica. A medição de qual- quer potencial citotoxicidade residual no toxoide B é realizada utilizan- do um ensaio baseado em células IMR-90. A toxina B de C. difficile do tipo selvagem exibe citotoxicidade potente in vitro, com pequenas quantidades da toxina sendo suficientes para causar vários efeitos nas células de mamíferos, como arredondamento de células (efeito citopá- tico ou CPE) e falta de atividade metabólica (medida pelos níveis de ATP). O ensaio de CPE é realizado incubando material DS com as cé-

lulas IMR90 em cultura a 500 mcg/mL a 37 °C e avaliando o arredon- damento de células 24 horas depois. O ensaio CPE requer uma avali- ação visual subjetiva do CPE por analistas treinados e, portanto, não pode ser facilmente validado. O ensaio de liberação de citotoxicidade foi desenvolvido com base na medição da quantidade de sinal de lu- minescência gerado a partir do ATP, que é proporcional ao número de células metabolicamente ativas após o tratamento com o toxoide B ou a toxina do tipo selvagem B. Os resultados são expressos em EC50, que é definida como a quantidade de toxina ou toxoide que causa uma redução de 50% nos níveis de ATP, conforme medido em unidades de luz relativa. A concentração máxima de toxoide que foi originalmente testada neste ensaio foi de 200 mcg/mL. No entanto, o desempenho do método ao longo do tempo sugeriu que uma concentração superior de apenas 100 mcg/mL pode ser consistentemente suportada. Esse método foi escolhido para testes de liberação e estabilidade (pontos de tempo limitados) porque é mais robusto, objetivo e adequado para tes- tes de BPF do que um teste CPE alternativo. O ensaio de citotoxicida- de é realizado apenas no material da substância farmacológica do to- xoide B, porque pode ser testado em uma concentração mais alta em comparação com o material do fármaco, sem interferência da matriz. Isso garante que a medição seja feita no estágio mais concentrado du- rante o ciclo de produção da vacina contra C. difficile. Além disso, o ensaio de citotoxicidade será conduzido com estabilidade para monito- rar qualquer potencial reversão à toxicidade.

[00358] Para qualificar o ensaio de 50% de título de neutralização para uso clínico, fornecer maior robustez ao ensaio e garantir desem- penho consistente a longo prazo no desenvolvimento clínico, um pa- drão de referência e controles apropriados foram adicionados ao en- saio, permitindo assim a leitura de uma neutralização título como uni- dades de neutralização/mL definidas pelo padrão de referência. Antes da análise do presente estudo, amostras de soro de seres humanos vacinados foram usadas para demonstrar uma relação linear entre 50% de títulos de neutralização e unidades de neutralização/mL ao realizar o ensaio de neutralização. Com base nesses estudos de corre- lação, os valores limiares de neutralização "protetores" foram calcula- dos e usados para analisar os dados clínicos deste estudo.

[00359] Em uma modalidade, o TNA é um ensaio automatizado e sensível com base na leitura da luminescência. Os títulos de neutrali- zação das amostras de teste são calculados com base em um padrão de referência. Em uma modalidade, o ensaio LLOQ para Txd A é 158,0 U/ml; Txd B = 249,5 U/ml. De preferência, o TNA

[00360] Para as análises de imunogenicidade, os limiares "proteto- res" para as respostas de anticorpos neutralizantes da antitoxina A e toxina B foram 219 e 2586 unidades de neutralização/mL, respectiva- mente. Vários dos objetivos de imunogenicidade para o Estudo B5091009 foram avaliados com base nesses limiares "protetores".

[00361] Quando aqui usado, a menos que seja expressamente de- finido de outra forma, o valor de "limite especificado" é definido como 219 unidades de neutralização/mL para toxina A e 2586 unidades de neutralização/mL para toxina B.

[00362] Em uma modalidade, a resposta imune induzida no ser hu- mano é neutralizante contra uma cepa de C. difficile que expressa uma toxina A com uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade para o toxoide A da composição.

[00363] Em outra modalidade, a resposta imune induzida no ser humano é neutralizante contra uma cepa de C. difficile que expressa uma toxina B, incluindo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade para o toxoide B da composição.

[00364] A utilidade (por exemplo, imunogenicidade) de qualquer um dos materiais (por exemplo, composições) e/ou métodos aqui descritos pode ser testada por qualquer uma das várias formas de métodos co- nhecidas pelos versados na técnica. Qualquer um ou mais dos ensaios aqui descritos, ou qualquer outro ou mais ensaios adequados, podem ser usados para determinar a adequação de qualquer um dos materi- ais aqui descritos para uma finalidade pretendida. Deve ser entendido que esses métodos são exemplares e não limitativos; outros ensaios também podem ser adequados. Por exemplo, as composições aqui descritas tipicamente induzem e/ou aumentam a produção de anticor- pos contra C. difficile após administração a um indivíduo. Tais anticor- pos podem ser detectados no indivíduo usando qualquer um dos mé- todos disponíveis para aqueles versados na técnica. Por exemplo, conforme descrito na seção Exemplos, o soro pode ser obtido de um indivíduo e testado por ELISA para detectar anticorpos da imunoglobu- lina tipo G (IgG) contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile (por exemplo, "dados primários de imunogenicidade") . Os anticorpos pre- sentes nos soros de teste podem reagir com antígenos das toxinas A ou B adsorvidos em poços individuais de uma placa de microtitulação. A quantidade de anticorpo ligado aos poços revestidos com antígeno pode ser determinada usando uma reação de substrato colorimétrico após a ligação de um conjugado anticorpo-enzima anti-IgG (por exem- plo, IgG anti-humano) secundário. O substrato para a enzima é nor- malmente adicionado que causa alteração colorimétrica diretamente proporcional ao anticorpo ligado ao antígeno. A concentração de anti- corpos no soro pode ser derivada por extrapolação de uma curva pa- drão, que foi gerada a partir de múltiplas diluições de um soro padrão de referência com unidades de IgG definidas (unidade ELISA

(EU)/mL)). Um ensaio de neutralização de toxinas (TNA) também pode ser usado para quantificar anticorpos neutralizantes da toxina de C. difficile.

Neste ensaio, o soro diluído em série pode ser incubado com uma quantidade fixa de toxina A de C. difficile ou B.

As células de teste (por exemplo, células Vero) podem então ser adicionadas, e a mistura de células toxina-soro incubada sob condições apropriadas (por exemplo, 37 °C por 6 dias). A capacidade dos soros de neutralizar o efeito citotóxico da toxina de C. difficile pode ser determinada e corre- lacionada com a viabilidade das células.

O ensaio utiliza a acumulação de metabólitos ácidos em poços de cultura fechados como uma indi- cação da respiração celular normal.

Nas células expostas a toxinas, o metabolismo e a produção de CO2 são reduzidas; consequentemente, o pH aumenta (por exemplo, para 7,4 ou superior), conforme indicado pelo indicador de pH vermelho de fenol no meio de cultura de células.

Nesse pH, o meio aparece vermelho.

Os controles celulares, ou célu- las expostas a toxinas que foram neutralizadas por anticorpos, meta- bolizam e produzem CO2 em quantidades normais; como resultado, o pH é mantido (por exemplo, em 7,0 ou abaixo) e nesse pH, o meio aparece amarelo.

Portanto, os anticorpos neutralizantes da toxina por C. difficile se correlacionam com a capacidade do soro de neutralizar os efeitos metabólicos da toxina por C. difficile nas células, conforme evidenciado por sua capacidade de manter um certo pH (por exemplo, 7,0 ou menos). A mudança de cor do meio pode ser medida (por exemplo, a 562 nm a 630 nm) usando um leitor de placas para calcular ainda mais o título de anticorpo neutralizador de antitoxina com 50% de inibição da citotoxicidade mediada por toxina de C. difficile.

Em uma modalidade, a composição induz um título de anticorpo neutralizador de toxinas que é pelo menos maior que 1 vez, como, por exemplo, pe- lo menos 1,01 vezes, 1,1 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou mais no ser humano após receber uma dose da composição do que um título de anticorpo neutralizador de toxinas no ser humano antes de receber a referida dose, quando medido sob condições idênticas em um ensaio de neutralização de toxinas.

TÍTULOS

[00365] Em uma modalidade, a composição induz um aumento no título de anticorpos neutralizantes de toxinas no ser humano, em com- paração com o título de anticorpos neutralizantes de toxinas no ser humano antes da administração de uma dose da composição, quando medida em condições idênticas, por exemplo, em um ensaio de citoto- xicidade. Em uma modalidade, o aumento no título de neutralização de toxinas é comparado ao título de neutralização de toxinas no ser hu- mano antes da administração da primeira dose da composição, em comparação com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da primeira dose da composição, quando me- dido em condições idênticas, por exemplo, em um ensaio de citotoxici- dade. Em outra modalidade, o aumento no título é observado após uma segunda dose da composição, em comparação com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da primeira dose da composição, quando medido sob condições idênti- cas, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade. Em outra modali- dade, o aumento no título de neutralização de toxinas é observado após uma terceira dose da composição, em comparação com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da primeira dose da composição, quando medido em condições idênticas, por exemplo, um ensaio de citotoxicidade. Em outra modalidade, o aumento no título é observado após uma segunda dose da composi- ção, em comparação com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da segunda dose da composição,

quando medido em condições idênticas, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade. Em outra modalidade, o aumento no título de neutra- lização de toxinas é observado após uma terceira dose da composi- ção, em comparação com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da terceira dose da composição, quando medido em condições idênticas, por exemplo, um ensaio de citotoxicidade.

[00366] Em uma modalidade, a composição induz um título de neu- tralização de toxinas no ser humano após a administração de uma do- se, em que o título de neutralização de toxinas é pelo menos maior que 1 vez maior que o título de neutralização de toxinas no ser huma- no antes da administração da dose, quando medido em condições idênticas, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade. Por exemplo, o título de neutralização da toxina pode ser pelo menos 1,01 vezes, 1,1 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou 64 vezes mais no ser humano após receber uma dose de a composição, em compara- ção com o título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da dose, quando medida em condições idênticas, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade.

[00367] Em uma modalidade, um "respondedor" refere-se a um humano, em que a composição induz um título de neutralização de toxinas no ser humano após a administração de uma dose, em que o título de neutralização de toxinas é pelo menos maior que 1 vez maior que o título de neutralização de toxinas em o ser humano antes da administração da dose. Em uma modalidade preferida, o respondedor atinge pelo menos um aumento ≥ 4 vezes no título de neutralização de toxinas, em comparação com um título de neutralização de toxinas no ser humano antes da administração da dose. Esse respondedor pode ser chamado de título de proteção.

[00368] Em uma modalidade, a composição induz um título de neu- tralização de toxinas no ser humano depois de receber a primeira dose que é pelo menos 2 vezes maior que o título de neutralização de toxi- nas no ser humano antes de receber a primeira dose (por exemplo, maior que o título de neutralização de toxinas no ser humano na au- sência da primeira dose), quando medida em condições idênticas no ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a composição induz um título de neutralização de toxinas no ser humano que é pelo menos 4 vezes maior que o título de neutralização de toxinas no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idên- ticas em um ensaio de citotoxicidade. Em uma modalidade, a compo- sição induz um título de neutralização de toxinas no ser humano que é pelo menos 8 vezes maior que o título de neutralização de toxinas no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

[00369] Em uma modalidade, o ser humano tem, por exemplo, um título neutralizador de toxinas igual ou superior ao limite inferior de quantificação (LLOQ) do ensaio de citotoxicidade após administração da primeira dose da composição. Em outra modalidade, o ser humano tem, por exemplo, um título de ensaio de citotoxicidade igual ou supe- rior ao LLOQ do ensaio de citotoxicidade após administração da se- gunda dose da composição. Em outra modalidade, o ser humano tem, por exemplo, um título neutralizador de toxinas igual ou superior ao LLOQ do ensaio de citotoxicidade após administração da terceira dose da composição.

MÉTODOS E ADMINISTRAÇÃO

[00370] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune contra C. difficile em um ser humano. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de vacinar um hu-

mano. Em uma modalidade, o método inclui administrar ao ser huma- no pelo menos uma dose da composição descrita acima. Em uma mo- dalidade preferida, o método inclui administrar ao ser humano no má- ximo uma dose da composição descrita acima. Em outra modalidade, o método inclui administrar ao ser humano pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose da composição descrita acima.

[00371] Em uma modalidade, a segunda dose é administrada pelo menos 20, 30, 50, 60, 100, 120, 160, 170 ou 180 dias após a primeira dose e no máximo 250, 210, 200 ou 190 dias após a primeira dose. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máxi- mo descrito aqui para definir um intervalo.

[00372] Em outra modalidade, a segunda dose é administrada cer- ca de 30 dias após a primeira dose. Em outra modalidade, a segunda dose é administrada cerca de 60 dias após a primeira dose, como, por exemplo, em um esquema de imunização de 0, 2 meses. Em outra modalidade, a segunda dose é administrada cerca de 180 dias após a primeira dose, como, por exemplo, em um esquema de imunização de 0, 6 meses. Em ainda outra modalidade, a segunda dose é adminis- trada cerca de 120 dias após a primeira dose, como, por exemplo, em um esquema de imunização de 2, 6 meses.

[00373] Em uma modalidade, o método inclui administrar ao ser humano duas doses da composição e no máximo duas doses. Em uma modalidade, as duas doses são administradas dentro de um perí- odo de cerca de 6 meses após a primeira dose. Em uma modalidade, o método não inclui administração adicional de um reforço ao ser hu- mano. Um "reforço", quando aqui utilizado, refere-se a uma adminis- tração adicional da composição ao ser humano. Administrar ao ser humano no máximo duas doses da composição pode ser vantajoso. Tais vantagens incluem, por exemplo, facilitar um ser humano a cum- prir um cronograma de administração completo e facilitar a relação custo-benefício do cronograma.

[00374] Em uma modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano por um período de cerca de 5 dias, 7 dias, 14 dias, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 dias e a maioria dos 400, 390, 380, 370, 365, 350, 340, 330, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210 ou 200 dias após a primeira dose. Em uma modalidade, a segunda dose é administrada ao ser humano pelo me- nos 8, 14, 21, 25 ou 30 dias e no máximo 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 ou 30 dias após administração da primeira dose. Por exemplo, em uma modalidade, a segunda dose é administrada ao ser humano pelo menos 21 dias e no máximo 40 dias após a administração da pri- meira dose. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo descrito aqui para definir um intervalo. De preferência, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano du- rante um período de cerca de 8 dias. Mais preferencialmente, a primei- ra dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de cerca de 30 dias. Mais preferencialmente, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de pelo menos cerca de 30 dias.

[00375] Em uma modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de cerca de 30 dias. Em outra modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de cerca de 60 dias. Em outra modalidade, a primeira dose e a segunda dose são adminis- tradas ao ser humano durante um período de cerca de 180 dias.

[00376] Em uma modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de no máximo 30 dias. Em outra modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de no máximo 60 dias. Em outra modalidade, a primeira dose e a segunda dose são administradas ao ser humano durante um período de no máximo 180 dias.

DOSES

[00377] Em uma modalidade, o método inclui administrar ao ser humano três doses da composição. Em outra modalidade, o método inclui administrar no máximo três doses da composição. Em uma mo- dalidade, as três doses são administradas dentro de um período de cerca de 6 meses após a primeira dose. Em uma modalidade, o méto- do inclui uma administração de uma dose de reforço ao ser humano após a terceira dose. Em outra modalidade, o método não inclui a ad- ministração de uma dose de reforço ao ser humano após a terceira dose. Em outra modalidade, o método não inclui ainda a administração de uma quarta dose ou dose de reforço da composição ao ser huma- no. Em uma outra modalidade, no máximo três doses dentro de um período de cerca de 6 meses são administradas ao ser humano.

[00378] Em uma modalidade exemplar, a segunda dose é adminis- trada cerca de 30 dias após a primeira dose e a terceira dose é admi- nistrada cerca de 150 a 180 dias após a segunda dose, como, por exemplo, em um esquema de imunização de 0, 1, 6 meses. Em outra modalidade exemplar, a segunda dose é administrada cerca de 60 di- as após a primeira dose e a terceira dose é administrada cerca de 120 dias após a segunda dose, como, por exemplo, em um esquema de imunização de 0, 2, 6 meses.

[00379] Em uma modalidade, a primeira dose, a segunda dose e a terceira dose são administradas ao ser humano durante um período de cerca de 150, 160, 170 ou 180 dias e, no máximo, 240, 210 200 ou 190 dias. Qualquer valor mínimo pode ser combinado com qualquer valor máximo descrito aqui para definir um intervalo. De preferência, a primeira dose, a segunda dose e a terceira dose são administradas ao ser humano durante um período de cerca de 180 dias ou 6 meses. Por exemplo, a segunda dose pode ser administrada ao ser humano cerca de 60 dias após a primeira dose e a terceira dose pode ser administra- da ao ser humano cerca de 120 dias após a segunda dose. Por con- seguinte, um esquema de administração exemplar inclui a administra- ção de uma dose ao ser humano por cerca dos meses 0, 2 e 6.

[00380] Como descrito acima, doses múltiplas da composição imu- nogênica podem ser administradas ao ser humano, e o número de di- as entre cada dose pode variar. Uma vantagem do método inclui, por exemplo, flexibilidade para um ser humano cumprir com os cronogra- mas de administração.

[00381] Em uma modalidade, o método inclui administrar ao ser humano no máximo três doses da composição imunogênica idêntica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, o método não inclui ad- ministrar ao ser humano uma primeira dose de uma primeira composi- ção, administrar ao ser humano uma segunda dose de uma segunda composição e administrar ao ser humano uma terceira dose de uma terceira composição, em que a primeira, segunda e terceira composi- ções não são idênticas. Em outra modalidade, o método inclui adminis- trar ao ser humano no máximo quatro doses da composição imunogê- nica idêntica.

EXEMPLOS

[00382] Os exemplos a seguir ilustram modalidades da invenção. A menos que indicado de outra maneira aqui, é feita referência nos Exemplos a seguir a uma composição imunogênica ou candidata de vacina, incluindo uma mistura de toxoide A de C. difficile geneticamen- te modificado, isto é, polipeptídeo (compreendendo SEQ ID NO: 4, em que a metionina inicial não está presente) e toxoide B de C. difficile geneticamente modificado, isto é, polipeptídeo (compreendendo a SEQ ID NO: 6, em que a metionina inicial não está presente) que fo-

ram também quimicamente inativados por 1-etil-3-(3-dimetilamino- propil)carbodiimida) (EDC) e N-Hidroxissuccinimida (NHS) para elimi- nar a citotoxicidade residual, porém, manter a estrutura antigênica na- tiva e gerar uma resposta de anticorpo neutralizante, como descrito no Exemplo 21 do Pedido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente U.S.

No. 9187536, e Pedido de Patente WIPO WO/2014/060898, Pe- dido de Patente WIPO WO/2012/143902, Patente US No. 9187536, e Pedido de Patente WIPO WO/2014/060898, que são cada qual incor- porado por referência aqui em suas respectivas totalidades.

Resumi- damente, após a purificação, as toxinas mutantes genéticas (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6) são inativadas por 2 horas a 25 °C usando 0,5 mg de EDC e 0,5 mg de NHS por mg de toxina A e B mutante genética purificada (aproximadamente 2,6 mM e 4,4 mM, respectivamente). A reação é extinta pela adição de glicina a uma concentração final de 100 mM e as reações são incubadas por mais 2 horas a 25 °C.

A inati- vação é realizada en pH 7,0 ± 0,5 em tampão de fosfato 10 mM, clore- to de sódio 150 mM.

O período de inativação é ajustado para exceder três vezes o período necessário para a redução na EC50 em células IMR90 para mais de 1000 ug/mL.

Após 2 horas, a atividade biológica é reduzida de 7 a 8 log10 em relação à toxina nativa.

Após a incubação de 4 horas, a toxina mutante inativada é trocada no tampão da subs- tância de fármaco final por diafiltração.

Por exemplo, usando um cas- sete de ultrafiltração de acetato de celulose regenerado de 100 kD, a toxina inativada é concentrada para 1-2 mg/mL e trocada por tampão.

Mais especificamente, a composição da vacina inclui (a) um primeiro polipeptídeo, que inclui a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 4, em que o resíduo de metionina na posição 1 da SEQ ID NO: 4 não está presente, em que uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do primeiro polipeptídeo é reticulada a uma porção beta- alanina, e em que o primeiro polipeptídeo inclui ainda uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do primeiro polipeptídeo e uma porção de glicina, e uma reticulação entre uma ca- deia lateral de um resíduo de ácido glutâmico do primeiro polipeptídeo e uma porção de glicina; e (b) um segundo polipeptídeo, que inclui a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 6, em que o resíduo de metionina na posição 1 da SEQ ID NO: 6 não está presen- te, em que uma cadeia lateral de um resíduo de lisina do segundo po- lipeptídeo é reticulada a uma porção beta-alanina, e em que o segun- do polipeptídeo inclui ainda uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resíduo de ácido aspártico do segundo polipeptídeo e uma por- ção de glicina, e uma reticulação entre uma cadeia lateral de um resí- duo de ácido glutâmico do segundo polipeptídeo e uma porção glicina.

[00383] A vacina contra C. difficile experimental é composta por 2 toxoides (A e B) em quantidades iguais. A vacina foi fornecida como um pó liofilizado estéril com intensidades de dosagem de 100 µg e 200 µg de toxoides A e B combinados por dose. A vacina foi preparada pa- ra injeção por ressuspensão da vacina liofilizada com o diluente de hi- dróxido de alumínio imediatamente antes do uso. O diluente de hidró- xido de alumínio foi fornecido como uma suspensão líquida de 1 mg de alumínio/mL (como hidróxido de alumínio).

[00384] Em experiências pré-clínicas, o candidato à vacina foi estu- dado sozinho ou em combinação com um adjuvante. No modelo de hamster, todas as formulações de vacina demonstraram um benefício de sobrevivência, fornecendo pelo menos 90% de proteção contra um desafio letal com esporos de C. difficile nos hamsters imunizados. Em primatas não humanos, todas as formulações de vacinas de toxoide testadas induziram respostas de anticorpo antitoxina neutralizante for- tes igualmente para a toxina A de C. difficile e toxina B de C. difficile. EXEMPLO 1 - FASE 1, PRIMEIRO NO ESTUDO HUMANO, REGIME DE 3 DOSES NOS MESES 0, 1 e 6 (B5091001)

[00385] O exemplo de candidato à vacina contra C. difficile foi ava- liado no estudo de Fase 1 primeiro em humanos (FIH) B5091001 reali- zado nos EUA, no qual foram inscritos 192 adultos saudáveis com ida- des entre 50 e 85 anos. Este foi um estudo cego ao observador, ran- domizado, controlado por placebo, com escalonamento da dose, para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade da vacina contra C. difficile, administrada como um regime de três doses nos Meses 0, 1 e 6. Três (3) níveis de dose de antígeno (50, 100 e 200 µg) do can- didato à vacina foram avaliados isoladamente ou em combinação com o hidróxido de alumínio.

[00386] A análise de segurança demonstrou que ambas as formula- ções e todos os três níveis de dose foram geralmente bem tolerados. As reações locais foram predominantemente leves ou moderadas e compreenderam principalmente a dor no sítio da injeção. Nenhuma reação local grave ou Grau 4 real foi relatada. Na coorte de 65 a 85 anos de idade, no nível de dose de 200 µg, as reações locais tendem a ocorrer com mais frequência apenas no toxoide, em comparação aos grupos de dose contendo hidróxido de alumínio. Após todas as 3 do- ses, a frequência e gravidade das reações locais não aumentaram com o aumento do nível da dose ou do número de doses para qual- quer um dos grupos de doses. Os eventos sistêmicos foram predomi- nantemente leves a moderados e compreenderam principalmente do- res de cabeça e fadiga. Não houve evidência de frequência aumenta- da de eventos sistêmicos com o aumento do nível da dose ou número de doses para quaisquer dos grupos de doses.

[00387] A análise da imunogenicidade demonstrou uma resposta limitada de anticorpos após a Dose 1, porém, após a Dose 2 houve aumentos acentuados nos títulos de anticorpo contra a toxina A e a toxina B, que foram geralmente 7 dias máximos após a Dose 2 e 1 mês estável após a Dose 2. Sete (7) dias após a Dose 3, uma respos-

ta de reforço substancial foi evidente, que foi ligeiramente mais acen- tuada novamente 1 mês após a Dose 3. No geral, respostas fortes neutralizantes antitoxina foram eliciadas por ambas as formulações, embora houvesse uma tendência para maiores respostas em recepto- res da formulação apenas de toxoide. Por exemplo, 1 mês após a Do- se 3 na coorte de 65 a 85 anos de idade, os aumentos da duplicação da média geométrica (GMFRs) da linha de base (antes da Dose 1) nos títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A variaram de 131 a 254 nos grupos de dose apenas de toxoide e de 42 a 80 nos grupos de dose contendo hidróxido de alumínio. As faixas correspon- dentes para os títulos de anticorpo neutralizante específico para a to- xina B foram de 2953 a 4922 e de 136 a 484, respectivamente.

[00388] Dados pré-clínicos gerados em macacos resos apóiam o uso de um regime de 3 doses da vacina contra C. difficile, administra- da com ou sem hidróxido de alumínio nas Semanas 0, 2 e 4. Além dis- so, em um estudo de toxicologia em coelhos, um regime de 4 doses da vacina contra C. difficile (níveis de dose de até 400 μg) administrado nos Dias 1, 8, 22 e 36 não demonstrou achados toxicológicos adver- sos, e resultou em um aumento nos títulos de anticorpo neutralizante antitoxina A e antitoxina B, confirmando a resposta imunológica ante- cipada pelos animais ao imunogênio administrado.

[00389] Estes dados pré-clínicos e toxicológicos, bem como a res- posta imune encorajadora observados após 3 doses no estudo de Fa- se 1 B5091001, apoiaram o estudo de Fase 2 B5091003. EXEMPLO 2 - ESTUDO DA FASE 2, REGIME DE 3 DOSES NOS DI- AS 1, 8 E 30 (B5091003)

[00390] O Estudo de Fase 2 B5091003 foi designado para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade dos níveis de dose de antígeno de 100 e 200 µg (total para os toxoides A e B) de uma vacina contra C. difficile de apenas toxoide em um regime de 3 doses admi-

nistrado nos Dias 1, 8 e 30 em adultos saudáveis com idade entre 50 e 85 anos.

[00391] As vacinações no Estudo B5091003 foram interrompidas após a ocorrência de eritema no sítio da injeção. Não houve sintomas sistêmicos graves acompanhantes nos indivíduos, não houve relato de que a vermelhidão impactasse suas atividades diárias, e todas as rea- ções locais fossem totalmente resolvidas. A reatogenicidade local ob- servada com a formulação apenas de toxoide pode ter sido devido ao toxoide livre interagindo com a resposta imune eliciada. EXEMPLO 3 - ESTUDO DA FASE 2, REGIME de 3 DOSES NOS DI- AS 1, 8 E 30 (regime diário) ou MESES 0, 1 E 6 (regime mensal) (B5091009)

[00392] A absorção no alumínio foi demonstrada ligar e liberar len- tamente os constituintes da vacina do sítio da injeção. Além disso, existe uma necessidade potencial de indução rápida da resposta imu- ne e duração prolongada da proteção contra CDI. Consequentemente, o estudo B5091009 avaliou a segurança, tolerabilidade e imunogenici- dade de 2 níveis de dose de antígeno da vacina contendo hidróxido de alumínio (isto é, 100 µg e 200 µg de toxoides totais) selecionadas no estudo FIH B5091001 em 2 regimes de dosagem diferentes: Dias 1, 8 e 30 ou Meses 0, 1 e 6.

[00393] O objetivo primário da imunogenicidade foi avaliado com base na capacidade da vacina de induzir níveis de anticorpo neutrali- zante específico para as toxinas A e B superiores ou iguais a uma es- timativa de limiar especificada para cada toxoide da vacina contra C. difficile. Estes limiares específicos foram derivados de um estudo de eficácia da Fase 2, demonstrando que a administração passiva de 2 mAbs contra a toxina A e toxina B estava associada à proteção contra CDI. Além de mostrar eficácia dos mAbs antitoxina contra CDI recor- rente, o estudo de eficácia da Fase 2 também sugeriu que os níveis de mAb neutralizante antitoxina A e antitoxina B acima de um limiar de 10 µg/mL (nível limiar "protetor") fossem associados à proteção contra a recorrência do CDI.

[00394] Para transformar o limiar "protetor" da toxina A e da toxina B do estudo de eficácia da Fase 2 em títulos de neutralização de 50% eliciados pelo candidato à vacina, vantagem foi tomada da observação de que (1) o mesmo ensaio de citotoxicidade foi usado para medir a neutralização de toxina e (2) a concentração inibidora de mAb que neutraliza 50% das toxinas (IC50 [concentração inibidora de 50%]) foi publicada (valores de IC50 para mAbs de toxina A e toxina B são 100 ng/mL e 15 ng/mL, respectivamente). O título de neutralização de 50% "protetor" para cada anticorpo antitoxina é, portanto, calculado como sendo a concentração de anticorpos no limiar de proteção de 10 μg/mL dividido pela IC50 de mAb respectivo.

[00395] Para qualificar o ensaio de título de neutralização de 50% para uso clínico, fornecer maior robustez ao ensaio, e garantir desem- penho consistente a longo prazo no desenvolvimento clínico, um pa- drão de referência e controles apropriados foram adicionados ao en- saio, permitindo assim a leitura de um título de neutralização como unidades neutralizantes/mL definidas pelo padrão de referência. Antes da análise do presente estudo, amostras de soro de seres humanos vacinados foram usadas para demonstrar uma relação linear entre títu- los de neutralização de 50% e unidades neutralizantes/mL ao realizar o ensaio de neutralização. Com base nestes estudos de correlação, os valores limiares de neutralização "protetores" foram calculados e usa- dos para analisar os dados clínicos deste estudo.

[00396] Para as análises de imunogenicidade, os limiares "proteto- res" para as respostas de anticorpo neutralizante antitoxina A e da to- xina B foram 219 e 2586 unidades neutralizantes/mL, respectivamente. Vários objetivos de imunogenicidade para o Estudo B5091009 foram avaliados com base nestes limiares "protetores".

[00397] Quando aqui usado, a menos que expressamente definido de outra maneira, o valor "limiar especificado" é definido como 219 unidades neutralizantes/mL para toxina A e 2586 unidades neutralizan- tes/mL para toxina B.

[00398] Como será importante fornecer aos indivíduos vacinados com proteção prolongada contra CDI, e como os indivíduos direciona- dos à vacinação podem ter capacidade reduzida para montar e manter uma resposta imune, os indivíduos no presente estudo foram monito- rados após sua terceira vacinação para avaliar a persistência de anti- corpo e a resposta a uma quarta vacinação. Portanto, os indivíduos de ambos os regimes de dosagem que receberam as 3 primeiras doses da vacina contra C. difficile (100 µg ou 200 µg) foram solicitados a en- trar em um estágio de extensão e foram randomizados em uma rela- ção de 1 : 1 para receber vacina ou placebo contra C. difficile. Estes indivíduos receberão uma quarta dose de qualquer vacina contra C. difficile no mesmo nível de dose de antígeno (100 µg ou 200 µg) que receberam anteriormente ou placebo, aproximadamente 1 ano após a terceira dose. Estes indivíduos serão seguidos para avaliar a persis- tência do anticorpo. Indivíduos originalmente randomizados para pla- cebo em qualquer regime de dosagem não serão continuados no es- tágio de extensão.

[00399] As análises para este estudo clínico foram realizadas quan- do todos os indivíduos concluíram a Visita 9 (Mês 13 para os indiví- duos nos regimes dos Dias 1, 8 e 30 [regime diário] e Mês 18 para os indivíduos no regime de Mês 0, 1 e 6 [ regime mensal)] e todos os da- dos de imunogenicidade e segurança até e incluindo a Visita 9 esta- vam disponíveis.

[00400] Métodos de análise. Para qualquer nível de anticorpo neu- tralizante específico para a toxina A ou toxina B de C. difficile, que es-

tivesse abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ), o LOD, defi- nido como 0,5 × LLOQ foi atribuído. Os LLOQs para os ensaios de neutralização específicos da toxina A e B foram de 158,0 unidades neutralizantes/mL e 249,5 unidades neutralizantes/mL, respectivamen- te. Nenhum outro dado de ensaio ausente foi imputado nas análises. Todas as análises de imunogenicidade foram realizadas após a impu- tação dos níveis de anticorpo que estavam abaixo do LLOQ. Se o nível de anticorpo neutralizante específico para a toxina A foi > LLOQ para a toxina-A, o indivíduo era considerado soropositivo para a toxina A. Se o nível de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foi > LLOQ para a toxina B, o sujeito foi considerado soropositivo para a toxina B. Por outro lado, se um nível de anticorpo foi < LLOQ, o indiví- duo foi considerado soronegativo. Os dados de imunogenicidade fo- ram resumidos de acordo com a dose da vacina como randomizados. Para o estágio planejado original, todos os dados de imunogenicidade foram resumidos separadamente para cada regime de dosagem de- signado (Dias 1, 8 e 30 e Meses 0, 1 e 6). Dentro de cada regime de dosagem designado, havia 3 grupos de vacinas (100 µg de C difficile, 200 µg de C. difficile e placebo). EXEMPLO 4: ESTUDO DA FASE 2, REGIMES DE 3 DOSES NOS DIAS 1, 8 E 30 (regime diário) OU MESES 0, 1 e 6 (regime mensal) (B5091009) – Projeto e Plano de Estudo Gerais

[00401] Aproximadamente 854 adultos saudáveis, com idades entre 65 e 85 anos, foram planejados para serem matriculados em aproxi- madamente 15 sítios nos EUA. Os indivíduos foram atribuídos a 1 dos 2 regimes de dosagem e depois randomizadamente designados em paralelo em uma relação de 3 : 3 : 1, para receber a vacina contra C. difficile (100 µg ou 200 µg) ou placebo (solução salina) (Tabela 3).

Tabela 3. Grupos de Vacina e Número Planejado de Indivíduos por Grupo e por Regime de Dose Grupo de Descrição da Formulação da Vacina Regime Número de Vacina de Dosagem Indivíduos a 1 Vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio (100-µg Dias 1, 8, e 30 183 de dose de antígeno) 2a Vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio (200-µg Dias 1, 8, e 30 183 de dose de antígeno) 3 Placebo (solução salina) Dias 1, 8, e 30 61 4a Vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio (100-µg Meses 0, 1, e 6 183 de dose de antígeno) 5a Vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio (200-µg Meses 0, 1, e 6 183 de dose de antígeno) 6 Placebo (solução salina) Meses 0, 1, e 6 61 Total 854 a. Os indivíduos destes grupos foram convidados a entrar no estágio de extensão. Fonte: Plano de análise estatística (Versão 2.0), Tabela 4.

[00402] Este foi um estudo de Fase 2, controlado por placebo, ran- domizado, cego aos observadores para avaliar a segurança, tolerabili- dade e imunogenicidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio administrada como um regime de 3 doses nos Dias 1, 8 e 30 ou Meses 0, 1 e 6 em adultos saudáveis com idades entre 65 e 85 anos. O nível de dose de antígeno de 100 µg (total para toxoides A e B) e o nível de dose de antígeno de de 200 µg (total para toxoides A e B) foram escolhidos para este estudo porque os resultados de imuno- genicidade e segurança do estudo FIH (B5091001) mostraram que ní- veis de dose de antígeno de 100 e 200 µg induziram respostas imunes similares. Para o grupo controle, o placebo consistiu em uma solução salina estéril normal para injeção (cloreto de sódio a 0,9%) em uma dose de 0,5 mL. O hidróxido de alumínio foi escolhido como um diluen- te, uma vez que a absorção em alumínio demonstrou ligar e liberar lentamente os constituintes da vacina do sítio de injeção.

[00403] O estudo foi controlado com placebo (embora a randomiza-

ção no estágio planejado original tenha sido ponderada em relação às formulações ativas) para fornecer uma avaliação comparativa da segu- rança e tolerabilidade da formulação da vacina experimental, bem co- mo para controlar qualquer alteração potencial ao longo do tempo nos títulos antecedentes naturais de anticorpos para toxinas A e B de C. difficile.

[00404] Os indivíduos no regime diário receberam 1 dose da vacina contra C. difficile/placebo nas Visitas 1 (Dia 1), 2 (Dia 8) e 4 (Dia 30). Os indivíduos no regime mensal receberam 1 dose da vacina contra C. difficile/placebo nas Visitas 1 (Dia 1), 2 (Dia 30) e 5 (Mês 6).

[00405] Objetivos de Imunogenicidade Primários - No Dia 37 (7 dias após a Dose 3 para os indivíduos no regime diário) e no Mês 7 (1 mês após a Dose 3 para indivíduos no regime mensal), as proporções de indivíduos em cada grupo de vacina com: nível de anticorpo neutra- lizante específico para a Toxina A (unidades neutralizantes/mL) > o limiar especificado para a toxina A; nível de anticorpo neutralizante es- pecífico para a Toxina B (unidades neutralizantes/mL) > o limiar espe- cificado para a toxina B; e ambos os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B (unidades neutralizantes/mL) > o limiar especificado para a toxina A e o limiar especificado para a toxina B, respectivamente. Os limiares foram definidos como 219 unidades neutralizantes/mL para toxina A e 2586 unidades neutralizantes/mL para toxina B.

[00406] Objetivos de Imunogenicidade Secundária - No Dia 37 (7 dias após a dose 3 para os indivíduos no regime diário) e no Mês 7 (1 mês após a Dose 3 para indivíduos no regime mensal): níveis de anti- corpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B, expressos como concentrações médias geométricas (GMCs) (unidades neutrali- zantes/mL).GMFRs da linha de base (antes da Dose 1) em: níveis de anticorpo neutralizante específico para a Toxina A; e específico para

Toxina B (unidades neutralizantes/mL). As proporções de indivíduos em cada grupo de vacinas com > 4 vezes, > 8 vezes, > 16 vezes e > 32 vezes aumentam da linha de base em: níveis de anticorpo neutrali- zante específico específico para a toxina A; específico para a toxina B; e específico igualmente para a toxina A e toxina B (unidades neutrali- zantes/mL). Para os indivíduos do regime diário, no Dia 1 (imediata- mente antes da Dose 1), Dia 8 (imediatamente antes da Dose 2), Dia 15 (7 dias após a Dose 2), Dia 30 (imediatamente antes da Dose 3), Mês 2 (1 mês após a Dose 3), Mês 4 (3 meses após a Dose 3), Mês 7 (6 meses após a Dose 3) e Mês 13 (12 meses após a Dose 3); ou para indivíduos no regime mensal, no Dia 1 (imediatamente antes da Dose 1), Dia 30 (imediatamente antes da Dose 2), Dia 37 (7 dias após a Do- se 2), Mês 2 (1 mês após a Dose 2), Mês 6 (imediatamente antes da Dose 3), Dia 187 (7 dias após a Dose 3), Mês 12 (6 meses após a Do- se 3) e Mês 18 (12 meses após a Dose 3): Proporções de indivíduos em cada grupo de vacinas com: nível de anticorpo neutralizante espe- cífico para a Toxina A (unidades neutralizantes/mL) > o limiar especifi- cado para a toxina A; nível de anticorpo neutralizante específico para a Toxina B (unidades neutralizantes/mL) > o limiar específico para a to- xina B; e níveis de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B (unidades neutralizantes/mL) ≥ o limiar específico para a toxina A e o limiar específico para a toxina B, respectivamente (estes parâmetros também serão avaliados na linha de base). Os limi- ares foram definidos como 219 unidades neutralizantes/mL para toxina A e 2586 unidades neutralizantes/mL para toxina B.

Níveis de anticor- po neutralizante específico para a toxina A e toxina B, expressos como GMCs (unidades neutralizantes/mL). GMFRs da linha de base em: níveis de anticorpo neutralizante específico para a Toxina A; e especí- fico para Toxina a B (unidades neutralizantes/mL). As proporções de indivíduos em cada grupo de vacinas com > 4 vezes, > 8 vezes, > 16 vezes e > 32 vezes aumentam da linha de base em: níveis de anticor- po neutralizante específico para a Toxina A; específico para Toxina a B; e específco igualmente para a toxina A e toxina B (unidades neutra- lizantes/mL) (unidades neutralizantes/mL). A linha de base nos obveti- vos acima foi a última medida associada antes da primeira vacinação no Dia 1.

[00407] Análises de imunogenicidade. As análises aqui foram realizadas quando todos os indivíduos concluíram a Visita 9 (Mês 13 para indivíduos no regime diário e Mês 18 para os indivíduos no regi- me mensal) e todos os dados de imunogenicidade e segurança até e incluindo a Visita 9 estavam disponíveis. Nesta seção, os resultados da imunogenicidade são apresentados separadamente para o regime mensal e o regime diário.

[00408] Os objetivos de imunogenicidade primários foram as pro- porções de indivíduos em cada grupo de vacina com títulos de anticor- po neutralizante específico para a toxina A–, toxina B– e igualmente para toxina A– e toxina B > limiares específicos (219 unidades neutra- lizantes/mL para anticorpo específico para a toxina A e 2586 unidades neutralizantes/mL para anticorpo específico para a toxina B) no Dia 37 (7 dias após a Dose 3 para indivíduos no regime diário) e no Mês 7 (1 mês após a Dose 3 para indivíduos no regime mensal). Os objetivos de imunogenicidade secundários foram como segue: Níveis de anti- corpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B em todos os pontos de tempo de amostragem, expressos como GMC. Níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B em todos os pontos de tempo da amostragem, expressos como GMFRs. As pro- porções de indivíduos em cada grupo de vacina que alcançam aumen- tos de duplicação definidos da linha de base nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A, toxina B e igualmente toxina A e toxina B em todos os pontos de tempo de amostragem.

[00409] Conclusões de Imunogenicidade. Comparado com o re- gime diário, o regime mensal alcançou uma resposta imune mais alta no Dia 187 e no Mês 7, igualmente para a toxina A e toxina B. Em comparação ao regime mensal, o regime diário obteve uma resposta imune mais cedo mais alta no Dia 37 e no Mês 2 para toxina A, po- roém, as respostas foram semelhantes nestes pontos de tempo para a toxina B. O nível de dose de 200 µg foi mais imunogênico do que o nível de dose de 100 µg em ambos os regimes. Para a toxina A, a so- ropositividade da linha de base pode ter realçado a magnitude da res- posta imune logo após a Dose 1 (particularmente para o nível de dose de 100 µg), porém, em ambos os regimes, houve pouca diferença na resposta imune após a Dose 3 em comparação à resposta para indiví- duos que eram soronegativos para a toxina A na linha de base. Para a toxina B, a soropositividade da linha de referência realçou a magnitude da resposta imune em ambos os regimes. As proporções de indivíduos que atingiram os níveis de anticorpo neutralizante específico igualmen- te para a toxina A e toxina B > limiar, no Mês 7 no regime mensal ou Dia 37 no regime diário, foram semelhantes quando estratificadas por quintil etário de 65 a 85 anos (embora o número de indivíduos com idades entre 80 a 85 anos seja pequeno).

[00410] Este foi um estudo de Fase 2, controlado por placebo, ran- domizado e cego aos observadores para avaliar a segurança, tolerabi- lidade e imunogenicidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio administrada como um regime de 3 doses: nos Dias 1, 8 e 30 (regime diário) ou Meses 0, 1 e 6 (regime mensal). No geral, a vaci- na contra C. difficile era altamente imunogênica, bem tolerada e exibia um perfil de segurança aceitável.

[00411] Discussão da Imunogenicidade. Os objetivos da imuno- genicidade primários deste estudo foram para descrever a imunogeni-

cidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile quando administrada em regime de 3 doses (Dias 1, 8 e 30 ou Meses 0, 1 e 6) a adultos saudáveis com ida- de entre 65 e 85 anos, conforme medido pelos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B de C. difficile no Dia 37 (7 dias após a Dose 3) para o regime diário e conforme medido por níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B de C. difficile no Mês 7 (1 mês após a Dose 3) para o regime mensal. A imunogenicidade foi avaliada através da medição dos títulos de anti- corpo neutralizante específico para a toxina A e B ao longo do estudo. Os resultados foram expressos como GMCs, proporções de indivíduos atingindo vários aumentos de duplicação, e proporções de indivíduos atingindo títulos acima do nível limiar especificado para cada toxina.

[00412] Tanto no regime mensal como no regime diário, os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile eram imunogênicos quando compa- rados ao placebo. O nível de dose de 200 µg foi mais imunogênico do que o nível de dose de 100 µg, com base na magnitude e durabilidade da resposta.

[00413] As proporções de indivíduos no regime mensal que atingi- ram títulos acima do nível limiar específico para cada toxina foram maiores no Dia 187 (1 semana após a Dose 3) e Mês 7 (1 mês após a Dose 3) igualmente para a toxina A e toxina B.

[00414] As proporções de indivíduos no regime diário que atingiram títulos acima do nível limiar específico para a toxina A foram maiores no Dia 37 e no Mês 2 para toxina A, porém, as proporções foram se- melhantes nestes pontos de tempo para a toxina B.

[00415] Antes da vacinação, a maioria dos indivíduos em ambos os regimes de dosagem foi soronegativa para a toxina A e toxina B. No regime mensal, 69,8% dos indivíduos eram soronegativos, 8,7% dos indivíduos eram soropositivos apenas para a toxina A, 19,0% dos indi-

víduos eram soropositivos apenas para a toxina B e 2,6% dos indiví- duos eram soropositivos tanto para a toxina A quanto para a toxina B. No regime diário, 75,4% dos indivíduos eram soronegativos, 4,9% dos indivíduos eram soropositivos apenas para a toxina A, 16,4% dos indi- víduos eram soropositivos apenas para a toxina B e 3,0% dos indiví- duos eram soropositivos tanto para a toxina A quanto para a toxina B.

[00416] Para a toxina A, a soropositividade da linha de base pode ter realçado a magnitude da resposta imune logo após a Dose 1 (parti- cularmente para o nível de dose de 100 µg), porém, em ambos os re- gimes, houve pouca diferença na resposta imune após a Dose 3 em comparação com a resposta para indivíduos que eram soronegativos para a toxina A na linha de base.

[00417] Para a toxina B, a soropositividade da linha de base realçou a magnitude da resposta imune em ambos os regimes. Para os indiví- duos que eram soronegativos para a toxina B na linha de base, ape- nas a terceira dose administrada no Mês 6 resultou em uma proporção substancial de indivíduos que atingiram o limiar específico.

[00418] As proporções de indivíduos que atingiram os níveis de an- ticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > limiar, no Mês 7 no regime mensal ou Dia 37 no regime diário, foram semelhantes quando estratificadas por quintil etário de 65 a 85 anos (embora o número de indivíduos com idades entre 80 a 85 anos seja pequeno).

[00419] O nível de dose de 200 µg foi numericamente mais imuno- gênico do que o nível de dose de 100 µg em ambos os regimes de do- sagem.

[00420] O regime mensal resultou em uma resposta pós-Dose 3 mais alta para ambos os níveis de dose de 100 µg e 200 µg, particu- larmente para a toxina B em indivíduos que eram soronegativos na linha de base.

[00421] As proporções de indivíduos que atingiram os níveis de an- ticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B foram semelhantes quando estratificadas por quintil etário de 65 a 85 anos (embora o número de indivíduos com idades entre 80 a 85 anos seja pequeno). EXEMPLO 5: ESTUDO DA FASE 2, REGIME DE 3 DOSES NOS DI- AS 1, 8 E 30 (regime diário) ou MESES 0, 1 e 6 (regime mensal) (B5091009) - AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE, Regime mensal

[00422] Regime mensal. As proporções de indivíduos que atingi- ram os títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A, toxina B e igualmente para toxina A e toxina B > os limiares específi- cos pelos estados sorológicos da linha de base dos indivíduos foram avaliadas para o regime mensal. Todos os indivíduos (100,0%) ran- domizados foram avaliados quanto ao estado sorológico da linha de base. A maioria era soronegativa da linha de base igualmente para a toxina A e toxina B. Entre os indivíduos soronegativos da linha de ba- se, a proporção que atingiu títulos de anticorpo neutralizante específi- co para a toxina A > o limiar específico atingiu 98,0% no Mês 7 no gru- po de 100 µg de C. difficile e 95,0% no Mês 7 no grupo de 200 µg de C. difficile. A proporção que atingiu títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina B > o limiar específico atingiu 69,4% no Mês 7 no grupo de 100 µg de C. difficile e 85,0% no Mês 7 no grupo de 200 µg de C. difficile. Para indivíduos soropositivos da linha de base, as proporções que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A > o limiar específico atingiu 100,0% no Mês 7 no grupo de 100 µg de C. difficile e 100,0% no Mês 7 no grupo de 200 µg de C. difficile. As proporções que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina B > o limiar específico atingiu 100,0% no Dia 187 e no Mês 7 no grupo de 100 µg de C. difficile e 96,8% no Dia 37, Mês 2 e Mês 7 no grupo de 200 µg de C. difficile.

[00423] Para a toxina A, no Mês 7 do regime mensal, 160 indiví- duos (CI 95%: 94,7%; 99,6%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 151 indivíduos (CI 95%: 91,1%; 98,2%) no grupo de 200 μg de C. difficile atingiu o limiar específico, em comparação a 1 indivíduo (CI 95%: 0,0%; 10,1%) no grupo placebo.

[00424] Para a toxina B, no Mês 7 do regime mensal, 122 (74,8%) indivíduos (CI 95%: 67,5%; 81,3%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 138 (87,3%) indivíduos (CI 95%: 81,1%; 92,1%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram o limiar específico, em comparação a 4 (7,5%) in- divíduos (CI 95%: 2,1%; 18,2%) no grupo placebo.

[00425] Igualmente para a toxina A e toxina B, no Mês 7 do regime mensal, 121 (74,2%) indivíduos (CI 95%: 66,8%; 80,8%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 136 (86,1%) indivíduos (CI 95%: 79,7%; 91,1%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram o limiar específico, em comparação a nenhum indivíduo (CI 95%: 0,0%; 6,7%) no grupo pla- cebo

[00426] No regime mensal, 1 indivíduo no grupo de 100 µg de C. difficile, 2 (1,3%) indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile e 1 indi- víduo no grupo placebo apresentaram níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A > o limiar específico na linha de base. Após as Doses 1 e 2, porém, antes da Dose 3, as proporções de indivíduos que atingiram o valor limiar específico para a toxina A foram limitadas, com 71 (43,6%) indivíduos (CI 95%: 35,8%; 51,5%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 89 (56,7%) indivíduos (CI 95%: 48,6%; 64,6%) no grupo de 200 µg de C. difficile no Dia 37. Após a Dose 3, as propor- ções de indivíduos que atingiram este valor limiar aumentaram no Dia

187. Para o grupo de 100 µg de C. difficile no Mês 7, 160 (98,2%) indi- víduos atingiram o valor limiar específico para a toxina A e a proporção de indivíduos que atingiram o valor limiar diminuiu para 75 (48,7%) in- divíduos no Mês 18. Para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 7,

151 (95,6%) dos indivíduos atingiram o valor limiar específico para a toxina A e a proporção de indivíduos que atingiram este valor limiar diminuiu para 81 (53,3%) indivíduos no Mês 18.

[00427] No regime mensal, 4 (2,5%) indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile, 7 (4,4%) indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile e 2 (3,8%) indivíduos no grupo placebo tiveram níveis de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B > o limiar específico na linha de ba- se. Após as Doses 1 e 2, porém, antes da Dose 3, 47 (28,8%) indiví- duos (CI 95%: 22,0%; 36,4%) no grupo de 100 µg de C. difficile atingi- ram o valor limiar no Dia 37 e no Mês 2, e 60 (38,2%) indivíduos (CI 95%: 30,6%; 46,3%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram o va- lor limiar no Dia 37. Após a Dose 3, as proporções de indivíduos que atingiram este valor limiar aumentaram no Dia 187. Para o grupo de 100 µg de C. difficile no Mês 7, 122 (74,8%) indivíduos atingiram o va- lor limiar específico para a toxina B e a proporção de indivíduos que atingiram o valor limiar diminuiu para 53 (34,4%) indivíduos no Mês 18. Para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 7, 138 (87,3%) indiví- duos atingiram o valor limiar específico para a toxina B e a proporção de indivíduos que atingiram este valor limiar diminuiu para 72 (47,4%) indivíduos no Mês 18.

[00428] No geral, os resultados para as proporções de indivíduos que atingiram ambos os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e B > os limiares específicos foram semelhantes aos da toxina B.

[00429] As Concentrações Médias Geométricas (GMCs) de anticor- po neutralizante específico para a toxina A e toxina B para cada ponto de tempo foram avaliadas. Para o regime mensal, na linha de base, a GMC do anticorpo neutralizante específico para a toxina A estava abaixo do LLOQ (158,0 unidades neutralizantes/mL) para indivíduos nos grupos de 100 µg de C. difficile, 200 µg de C. difficile e placebo.

Em comparação à linha de base, para indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile, foi observado um aumento nas GMCs no Dia 30 (137 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Mês 7 (1245 unidades neutralizantes/mL) e diminuiu para 214 unidades neutralizantes/mL no Mês 18. Em comparação à linha de base, para indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile, foi observado um aumento nas GMCs no Dia 30 (149 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Mês 7 (1380 unida- des de neutralização)/mL) e diminuiu para 257 unidades neutralizan- tes/mL no Mês 18. As GMCs de anticorpo neutralizante específico pa- ra a toxina A para o grupo placebo foram < 93 unidades neutralizan- tes/mL em todos os pontos de tempo.

[00430] Para o regime mensal, na linha de base, A GMC do anti- corpo neutralizante específico para a toxina B estava abaixo do LLOQ (249,5 unidades neutralizantes/mL) para indivíduos nos grupos de 100 µg de C. difficile, 200 µg de C. difficile e placebo. Em comparação à linha de base, para indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile, um aumento nas GMCs foi observado no Dia 30 (570 unidades neutrali- zantes/mL), foi máximo no Mês 7 (6255 unidades neutralizantes/mL) e diminuiu para 1248 unidades neutralizantes/mL no Mês 18. Em com- paração à linha de base, para indivíduos no grupo de 200 µg de C. dif- ficile, foi observado um aumento nas GMCs no Dia 30 (909 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Mês 7 (9549 unidades de neutrali- zação)/mL) e diminuiu para 2178 unidades neutralizantes/mL no Mês

18. As GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A pa- ra o grupo placebo foram < 263 unidades neutralizantes/mL em todos os pontos de tempo.

[00431] Para o regime mensal, em todas as visitas pós-linha de ba- se, as GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A fo- ram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Os grupos de 100 µg e 200 µg de C.

difficile tiveram GMCs pós-linha de base mais elevadas que o grupo placebo; no entanto, nenhuma resposta clara à dose foi evidente entre os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile. Para o regime mensal, em todas as visitas pós-linha de base, as GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Ambos os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile tiveram GMCs pós-linha de base mais elevadas do que o grupo placebo. Uma clara resposta à do- se foi evidente entre os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile após a Dose 3 (Mês 12 e Mês 18). As GMCs de anticorpo neutralizante es- pecífico para a toxina A e toxina B pelos estados sorológicos da linha de base do indivíduo foram resumidas para o regime mensal. As GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B pelo estado sorológico da linha de base e idade do indivíduo foram re- sumidas para o regime diário.

[00432] Para o regime mensal, os Aumentos da Duplicação da Mé- dia Geométrica (GMFRs) do anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B da linha de base foram calculados no Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 6, Dia 187, Mês 7, Mês 12 e Mês 18.

[00433] Após a Dose 2, um aumento em GMFRs de anticorpo neu- tralizante específico para a toxina A foi observado no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,70; grupo de 200 µg de C. difficile, 3,78). Após a Dose 3, uma resposta de reforço foi evidente no Dia 187 (grupo de 100 µg de C. difficile, 5,85; grupo de 200 µg de C. difficile, 8,54). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7 (1 mês após a Dose 3), com GMFRs de 14,58 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 15,85 para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram para 2,51 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 2,95 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 18.

[00434] Após a Dose 2, um aumento nos GMFRs de anticorpo neu-

tralizante específico para a toxina B foi observado no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 3,75; grupo de 200 µg de C. difficile, 5,59). Após a Dose 3, uma resposta de reforço substancial foi evidente no Dia 187 (grupo de 100 µg de C. difficile, 15,85; grupo de 200 µg de C. difficile, 24,44). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7 (1 mês após a Dose 3), com GMFRs de 35,43 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 49,98 para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram para 7,07 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 11,21 no grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 18.

[00435] Entre o Dia 30 e o Mês 18, os GMFRs de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A e toxina B foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. dif- ficile.

[00436] Os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a to- xina A e toxina B, pelo estado sorológico da linha de base dos indiví- duos, para cada ponto no tempo, foram avaliados para o regime men- sal. Entre os indivíduos soronegativos da linha de base, um aumento nos GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A foi observado no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,74; grupo de 200 µg de C. difficile, 4,07). Após a Dose 3, uma resposta de reforço foi evidente no Dia 187 (grupo de 100 µg de C. difficile, 6,29; grupo de 200 µg de C. difficile, 9,37). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7, com GMFRs de 15,88 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 17,32 para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram para 2,59 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 3,12 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 18. Após a Dose 2, o GMFR de anticorpo neutralizante específico para a toxina B se estabilizou para os grupos de 100 µg de C. difficile (Dia 30: 2,45; Dia 37: 2,67; Mês 2: 2,79) e de 200 µg de C. difficile (Dia 30: 3,40; Dia 37: 3,95; Mês 2: 3,94). Após a Dose 3, uma resposta de reforço substancial foi evidente no Dia 187 (grupo de 100 µg de C. difficile, 16,00; grupo de 200 µg de C. difficile, 26,67). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7, com GMFRs de 39,29 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 61,04 para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram para 6,95 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 11,57 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 18.

[00437] Entre os indivíduos soropositivos da linha de base, um au- mento nos GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A foi observado no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,37; grupo de 200 µg de C. difficile, 2,13). Após a Dose 3, uma resposta de refor- ço foi evidente no Dia 187 (grupo de 100 µg de C. difficile, 3,03; grupo de 200 µg de C. difficile, 4,18). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7, com GMFRs de 6,65 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 7,96 para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram pa- ra 1,87 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 1,91 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 18. Após a Dose 2, um aumento em GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foi ob- servado no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 17,97; grupo de 200 µg de C. difficile, 23,01). Após a Dose 3, uma resposta de reforço substancial foi evidente no Mês 7 (grupo de 100 µg de C. difficile, 21,96; grupo de 200 µg de C. difficile, 21,99). Esta resposta de reforço foi máxima no Mês 7. Os GMFRs diminuíram para 7,68 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 9,91 para o grupo de 200 µg de C. diffi- cile no Mês 18.

[00438] Entre o Dia 30 e o Mês 18, os GMFRs de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile, exce- to no Dia 30 e no Dia 37 para os indivíduos soropositivos da linha de base. Após o dia 187, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A foram maiores para os indivíduos soronegativos da li-

nha de base em ambos grupos de dose, em comparação aos indiví- duos soropositivos da linha de base. Entre o Dia 30 e o Mês 18, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B para in- divíduos soronegativos e soropositivos da linha de base foram maiores para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Entre o Dia 30 e o Mês 6, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foram maiores nos indivíduos soropositivos da linha de base em comparação aos indivíduos sorone- gativos da linha de base, porém, do Dia 187 ao Mês 18, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foram maiores nos indivíduos soronegativos da linha de base em comparação aos indiví- duos soropositivos da linha de base.

[00439] As proporções de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos da linha de base em níveis de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A e toxina B e igualmente para a toxina A e toxina B no Dia 37 e nos outros pontos de tempo de amostragem sanguínea são resumidas.

[00440] No geral, as proporções maiores de indivíduos que atingi- ram aumentos de duplicação definidos a partir dos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A da linha de base foram obser- vadas para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, aumen- tos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram observados a partir do Dia 37, com 125 (76,7%) indivíduos que atingiram um aumento > 8 vezes no Mês 7. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, 77 (47,2%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 33 (20,2%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Mês 7. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, aumentos em proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram observados a partir do Dia

37, com um aumento acentuado na proporção de indivíduos que atin- giram um aumento > 8 vezes no Dia 187. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, 89 (56,3%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 34 (21,5%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes em níveis de anticorpo neutralizante específico para toxina no Mês 7.

[00441] No geral, proporções maiores de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos a partir dos níveis de anticorpo neu- tralizante específico para a toxina B da linha de base foram observa- das para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, aumentos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram observados a partir do Dia 37, com 138 (84,7%) indivíduos que atingiram um aumento > 8 vezes no Mês 7. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, 85 (52,5%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 52 (32,1%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no Dia 187. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, aumentos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento de > 4 vezes foram observados a partir do Dia 187, com aumentos acentuados nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 8 vezes no Dia 187. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, 105 (66,5%) indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizan- te específico para a toxina B no Mês 7.

[00442] No geral, os resultados para as proporções de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos da linha de base para os níveis de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxi- na A e toxina B, foram semelhantes aos da toxina A.

[00443] As Curvas de Distribuição Cumulativa Reversas (RCDCs) que exibem dados para os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A, medidos no Dia 1, Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 6, Dia

187, Mês 7, Mês 12 e Mês 18 por grupo de vacina foram avaliadas pa- ra o regime mensal. As RCDCs que exibem dados para níveis de anti- corpo neutralizante específico para a toxina B medidos no Dia 1, Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 6, Dia 187, Mês 7, Mês 12 e Mês 18 por grupo de vacina foram avaliadas para o regime mensal. No geral, a curva observada mudou para a direita para os grupos vacinados, indicando que a imunização com a vacina toxoide aumentou os níveis de título em relação à observada com o placebo. Isto é consistente com os pa- drões mostrados em GMCs e as proporções de indivíduos que atingi- ram > os limiares especificados. EXEMPLO 6: ESTUDO DA FASE 2, REGIME DE 3 DOSES NOS DI- AS 1, 8 E 30 (regime diário) ou MESES 0, 1 e 6 (regime mensal) (B5091009) - AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE, Regime diário

[00444] Regime Diário. As proporções de indivíduos que atingiram os títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A, toxina B e igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos pe- lo estado sorológico da linha de base dos indivíduos foram avaliados para o regime diário. A maioria era soronegativa da linha de base igualmente para a toxina A e toxina B. Entre os indivíduos soronegati- vos da linha de base, a proporção que atinge os títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A > o limiar específico atingiu 67,7% no Dia 37 no grupo de 100 µg de C. difficile e 85,2% no Dia 37 e Mês 2 no grupo de 200 µg de C. difficile. A proporção que atinge os títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina B > o limiar específico atingiu 14,0% no Dia 15 e no Dia 37 no grupo de 100 µg de C. difficile e 25,2% no Dia 37 no grupo de 200 µg de C. difficile. Para indivíduos soropositivos da linha de base, as proporções que atingiram os títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina A > o limi- ar específico atingiu 80,0% no Dia 37 no grupo de 100 µg de C. difficile e 86,7% no Dia 37 e no Mês 2 no grupo de 200 µg de C. difficile. As proporções que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico para a toxina B > o limiar específico atingiu 97,1% no Dia 30 no grupo de 100 µg de C. difficile e 93,9% no Dia 37 e no Mês 2 no grupo de 200 µg de C. difficile.

[00445] Para a toxina A, no Dia 37 do regime diário, 117 (68,4%) indivíduos (CI 95%: 60,9%; 75,3%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 141 (85,5%) indivíduos (CI 95%: 79,1%; 90,5%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram o limiar específico, em comparação com 7 (12,5%) indivíduos (CI 95%: 5,2%; 24,1%) no grupo placebo.

[00446] Para a toxina B, no Dia 37 no regime diário, 51 (29,8%) in- divíduos (CI 95%: 23,1%; 37,3%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 64 (38,8%) indivíduos (CI 95%: 31,3%; 46,7%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiram o limiar específico, em comparação com 1 indiví- duo (CI 95%: 0,0%; 9,6%) no grupo placebo.

[00447] Igualmente para a toxina A e toxina B, no Dia 37 do regime diário, 45 (26,3%) indivíduos (CI 95%: 19,9%; 33,6%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 64 (38,8%) indivíduos (CI 95%: 31,3%; 46,7%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiu o limiar específico, em compara- ção a nenhum indivíduo (CI 95%: 0,0%; 6,4%) no grupo placebo.

[00448] No regime diário, 2 (1,2%) indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile e 1 indivíduo no grupo de 200 µg de C. difficile apresen- taram níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A > o limiar específico na linha de base. Após as Doses 1 e 2, porém, antes da Dose 3, as proporções de indivíduos que atingiram o valor limiar específico para a toxina A foram limitadas, com 29 (17,0%) indivíduos (CI 95%: 11,7%; 23,4%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 41 (25,0%) indivíduos (CI 95%: 18,6%; 32,3%) no grupo de 200 µg de C. difficile no Dia 15. Após a Dose 3, as proporções de indivíduos que atingiram este valor limiar aumentaram no Dia 37. Para o grupo de 100 µg de C. difficile no Dia 37, 117 (68,4%) indivíduos atingiram o valor limiar específico para a toxina A e a proporção de indivíduos que atin- giram o valor limiar diminuiu para 16 (10,1%) indivíduos no Mês 13. Para o grupo de 200 µg de C. difficile no Dia 37 e no Mês 2, 141 (85,5%) indivíduos atingiram o valor limiar específico para a toxina A e a proporção de indivíduos que atingiram este valor limiar diminuiu para 40 (25,8%) indivíduos no Mês 13 .

[00449] No regime diário, 8 (4,7%) indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile, 6 (3,7%) indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile e 3 (5,4%) indivíduos no grupo placebo apresentaram níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina B > o limiar específico na linha de base. Após as Doses 1 e 2, porém, antes da Dose 3, 52 (30,4%) indivíduos (CI 95%: 23,6%; 37,9%) no grupo de 100 µg de C. difficile e 61 (37,2%) indivíduos (CI 95%: 29,8 45,1%) no grupo de 200 µg de C. difficile atingiu o valor limiar no Dia 15. Após a Dose 3, as proporções de indivíduos que atingiram este valor limiar permaneceram estáveis até o Dia 37. Para o grupo de 100 µg de C. difficile no Dia 30 e Dia 37, 51 (29,8%) indivíduos atingiram o valor limiar específico para a toxina B e a proporção de indivíduos que atingiram o valor limiar diminuiu pa- ra 31 (19,6%) indivíduos no Mês 13. Para o grupo de 200 μg de C. dif- ficile no Dia 37, 64 (38,8%) indivíduos atingiram o valor limiar específi- co para a toxina B e a proporção de indivíduos que atingiram este va- lor limiar diminuiu para 48 (31,0%) indivíduos no Mês 13.

[00450] No geral, os resultados para as proporções de indivíduos que atingiram os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram similares aos da toxina B.

[00451] As GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxi- na A e toxina B para cada ponto no tempo foram avaliadas. Para o re- gime diário, na linha de base, a GMC de anticorpo neutralizante espe- cífico para a toxina A estava abaixo do LLOQ (158,0 unidades neutra-

lizantes/mL) para indivíduos nos grupos de 100 µg de C difficile, 200 µg de C. difficile e placebo. Em comparação à linha de base, para indi- víduos no grupo de 100 µg de C. difficile, um aumento nas GMCs foi observado no Dia 15 (143 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Dia 37 (368 unidades neutralizantes/mL) e diminuiu para 105 unidades neutralizantes/mL no Mês 13. Em comparação à linha de base, para indivíduos do grupo de 200 µg de C. difficile, um aumento nas GMCs foi observado no Dia 15 (192 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Dia 37 (556 unidades de neutralização)/mL) e diminuiu para 138 unidades neutralizantes/mL no Mês 13. As GMCs de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A para o grupo placebo foram < 102 unidades neutralizantes/mL em todos os pontos de tempo.

[00452] Para o regime diário, na linha de base, a GMC de anticorpo neutralizante específico para a toxina B estava abaixo do LLOQ (249,5 unidades neutralizantes/mL) para indivíduos nos grupos de 100 µg de C. difficile, 200 µg de C. difficile e placebo. Em comparação à linha de base, para indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile, um aumento nas GMCs foi observado no Dia 8 (273 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Dia 15 (807 unidades neutralizantes/mL) e diminuiu pa- ra 447 unidades neutralizantes/mL no Mês 13. Em comparação à linha de base, para indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile, um aumen- to nas GMCs foi observado no Dia 8 (290 unidades neutralizantes/mL), foi máximo no Dia 37 (1219 unidades neutralizantes/mL) e diminuiu para 828 unidades neutralizantes/mL no Mês 13. As GMCs de anticor- po neutralizante específico para a toxina A para o grupo placebo foram < 211 unidades neutralizantes/mL em todos os pontos de tempo.

[00453] Para o regime diário, em todas as visitas pós-linha de base, as GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Ambos grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile apresentaram GMCs pós-linha de base mais elevadas do que o grupo placebo, e uma resposta clara à dose foi evidente entre os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile.

[00454] Para o regime diário, em todas as visitas pós-linha de base, as GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Ambos grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile apresentaram GMCs pós-linha de base mais elevadas que o grupo placebo; no entanto, nenhuma resposta clara à dose foi evidente entre os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile.

[00455] As GMCs de anticorpo neutralizante específico para a toxi- na A e toxina B pelo estado sorológico da linha de base do indivíduo foram resumidas para o regime diário. As GMCs de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A e toxina B pela idade dos indivíduos e pelo estado sorológico da linha de base foram resumidas para o regi- me diário.

[00456] Para o regime diário, os Aumentos da Duplicação da Média Geométrica (GMFRs) do anticorpo neutralizante específico para a toxi- na A e toxina B da linha de base foram calculados no Dia 8, Dia 15, Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 4, Mês 7 e Mês 13. Após a dose 2, um aumento em GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxi- na A foi observado no Dia 15 (grupo de 100 µg de C. difficile, 1,73; grupo de 200 µg de C. difficile, 2,27). Após a Dose 3, uma resposta de reforço foi evidente no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 4,45; grupo de 200 µg de C. difficile, 6,56). Esta resposta de reforço foi má- xima no Dia 37 (7 dias após a Dose 3) e foi de 3,56 para o grupo de 100 µg de C. difficile e 5,71 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 2. Os GMFRs diminuíram para 1,26 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 1,64 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 13.

[00457] Após a Dose 2, um aumento acentuado nos GMFRs de an-

ticorpo neutralizante específico para a toxina B foi observado no Dia 15 (grupo de 100 µg de C. difficile, 4,31; grupo de 200 µg de C. diffici- le, 5,86). Após a Dose 3, uma resposta de reforço foi evidente no Dia 37 para o grupo de 200 µg de C. difficile (GMFR de 6,57), porém, o GMFR se estabilizou para o grupo de 100 µg de C. difficile (Dia 30: 3,76; Dia 37: 3,89 ; Mês 2: 3,61). Esta resposta de reforço foi máxima no Dia 37 (7 dias após a Dose 3) para o grupo de 200 µg de C. difficile. Os GMFRs diminuíram para 2,40 no grupo de 100 µg de C. difficile e para 4,44 no grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 13.

[00458] Entre o Dia 8 e o Mês 13, os GMFRs de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A e B foram maiores no grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile.

[00459] Os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a to- xina A e da toxina B, pelo estado sorológico de linha de base dos indi- víduos, para cada ponto do tempo, foram avaliados para o regime diá- rio. Entre os indivíduos soronegativos da linha de base, foi observado um aumento nos GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Dia 30 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,01; grupo de 200 µg de C. difficile, 2,95). Após a dose 3, foi evidente uma resposta de reforço no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 4,48; grupo de 200 µg de C. difficile, 6,95). Esta resposta de reforço foi máxima no Dia 37. Os GMFRs diminuíram para 1,28 no grupo de 100 µg de C. difficile e para 1,75 no grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 13. Após a Dose 2, um aumento nos GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foi observado no Dia 15 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,57; grupo de 200 µg de C. difficile, 3,81). Após a Dose 3, os GMFRs esta- bilizaram para o grupo de 100 µg de C. difficile (dia 30: 2,37; dia 37: 2,56; mês 2: 2,42) e o grupo de 200 µg de C. difficile (dia 30: 3,68; dia 37: 4,55; Mês 2: 4,22). Os GMFRs diminuíram para 2,01 no grupo de 100 µg de C. difficile e para 4,00 no grupo de 200 µg de C. difficile no

Mês 13.

[00460] Entre os indivíduos soropositivos da linha de base, foi ob- servado um aumento nos GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Dia 30 (grupo de 100 µg de C. difficile, 2,47; grupo de 200 µg de C. difficile, 1,20). Após a Dose 3, uma resposta de refor- ço foi evidente no Dia 37 (grupo de 100 µg de C. difficile, 3,97; grupo de 200 µg de C. difficile, 3,68). Esta resposta de reforço foi máxima no Dia 37. Os GMFRs diminuíram para 0,99 para o grupo de 100 µg de C. difficile e para 0,81 para o grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 13. Após a dose 2, um aumento acentuado em GMFRs de anticorpo neu- tralizante específico para toxina B foi observado no Dia 15 (grupo de 100 µg de C. difficile, 32,18; grupo de 200 µg de C. difficile, 32,14). Uma resposta de reforço não foi evidente após a Dose 3 uma vez que os GMFRs estabilizaram para o grupo de 100 µg de C. difficile (Dia 30: 22,86; Dia 37: 19,74; Mês 2: 17,23) e o grupo de 200 µg de C. difficile (Dia 30: 27,50; Dia 37: 28,23; Mês 2: 25,54). Os GMFRs diminuíram para 4,72 no grupo de 100 µg de C. difficile e para 6,70 no grupo de 200 µg de C. difficile no Mês 13.

[00461] Entre o Dia 8 e o Mês 13, os GMFRs de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A para os indivíduos soronegativos da linha de base foram maiores para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Entre o Dia 8 e o Mês 13, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina A para os indivíduos soropositivos da linha de base foram mais baixos para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile, exceto no Mês 4. Os GMFRs de anticorpo neutrali- zante específico para toxina A foram mais altos para os indivíduos so- ronegativos da linha de base em ambos grupos de dose em compara- ção aos indivíduos soropositivos da linha de base. Entre o Dia 8 e o Mês 13, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina

B para indivíduos soronegativos e soropositivos da linha de base fo- ram maiores para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile, exceto no Dia 15 para os indivíduos soropositivos da linha de base. Entre o Dia 8 e o Mês 13, os GMFRs de anticorpo neutralizante específico para a toxina B foram maiores nos indivíduos soropositivos da linha de base em comparação aos in- divíduos soronegativos da linha de base.

[00462] As proporções de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos da linha de base em níveis de anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A, toxina B e igualmente para toxina A e toxina B e no Dia 37 e nos outros pontos de tempo de amostragem sanguínea.

[00463] No geral, maiores proporções de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos de níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A da linha de base foram observadas para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. difficile. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, aumentos nas pro- porções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram ob- servados a partir do Dia 15, com 43 (25,1%) indivíduos que atingiram um aumento > 8 vezes no Dia 37. Para o grupo de 100 µg de C. diffici- le, 15 (8,8%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 6 (3,5%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Dia 37. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, aumentos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento de > 4 vezes foram observados a partir do dia 15, com um aumento acentuado na proporção de indivíduos (67 [40,0%]) que atingiram um aumento de > 8 vezes no Dia 37. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, 23 (14,1%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 15 (9,2%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina

A no Dia 15.

[00464] No geral, proporções similares de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos a partir dos níveis de anticorpo neu- tralizante específico para a toxina B da linha de base para os grupos de 100 µg e 200 µg de C. difficile até o Mês 4. Nos Meses 7 e 13, as proporções maiores de indivíduos que atingiram aumentos de duplica- ção definidos a partir dos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A da linha de referência foram observadas para o grupo de 200 µg de C. difficile em comparação ao grupo de 100 µg de C. dif- ficile. Para o grupo de 100 µg de C. difficile, aumentos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram observados a partir do Dia 15, com 57 (33,3%) indivíduos que atingiram um au- mento > 8 vezes no dia 15 e no Dia 30. Para os grupo de 100 µg de C. difficile, 45 (26,3%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 35 (20,5%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Dia 15. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, aumentos nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento > 4 vezes foram observados a partir do Dia 15, com um aumento acentuado na proporção de indivíduos (66 [40,2%]) que atingiram um aumento de > 8 vezes no Dia 37. Para o grupo de 200 µg de C. difficile, 61 (37,4%) indivíduos atingiram um aumento > 16 vezes e 45 (27,4%) indivíduos atingiram um aumento > 32 vezes nos níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no Dia 30 e no Dia 37.

[00465] N o geral, os resultados para as proporções de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos da linha de base, pa- ra os níveis de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B foram similares aos da toxina A.

[00466] As Curvas de Distribuição Cumulativa Reversas (RCDCs) que exibem dados para os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A medidos no Dia 1, Dia 8, Dia 15, Dia 15, Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 4, Mês 7 e mês 13 por grupo de vacina foram avalia- das para o regime diário. As RCDCs que exibem dados para níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina B medidos no Dia 1, Dia 8, Dia 15, Dia 30, Dia 37, Mês 2, Mês 4, Mês 7 e Mês 13 por grupo de vacina foram avaliados para o regime diário. No geral, a curva ob- servada mudou para a direita para os grupos vacinados, indicando que a imunização com a vacina toxoide aumentou os níveis de título em relação à observada com o placebo. Isto é consistente com os padrões mostrados nas GMCs e as proporções de indivíduos que atingiram > os limiares especificados. EXEMPLO 7: ESTUDO DA FASE 2, REGIME DE 3 DOSES NOS DI- AS 1, 8 e 30 (regime diário) ou MESES 0, 1 e 6 (regime mensal) (B5091009) - AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE, Resultados por Faixa Etária

[00467] A resposta imune por faixa etária (65 a 69 anos, 70 a 74 anos, 75 a 79 anos e 80 a 85 anos) também foi avaliada.

[00468] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e B > os limiares específicos foram 80,0% de 70 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos 68,8% dos 48 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 73,5% dos 34 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 63,6% dos 11 indi- víduos com idades entre 80 e 85 anos. As proporções corresponden- tes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 90,6% de 64 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 83,9% de 56 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 89,7% de 29 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 55,6% de 9 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00469] No regime mensal, no Mês 7, as GMCs de anticorpo neu-

tralizante específico para a toxina A para os indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile foram 1304 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 1182 unidades neutralizan- tes/mL para o grupo indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 1254 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 1132 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As GMCs correspondentes para os indiví- duos do grupo de 200 μg de C. difficile foram 1690 unidades neutrali- zantes/mL para os indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 1073 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 1627 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com ida- des entre 75 a 79 anos e 925 unidades neutralizantes/mL para os indi- víduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00470] No regime mensal, no Mês 7, as GMCs de anticorpo neu- tralizante específico para a toxina B para os indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile foram 7608 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 5446 unidades neutralizan- tes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 4178 uni- dades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As GMCs correspondentes para os indivíduos do grupo de 200 µg de C. difficile foram 11835 unidades neutralizantes/mL para os indi- víduos com idades entre 65 a 69 anos, 8750 unidades neutralizan- tes/mL para os indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 10533 uni- dades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 2608 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com ida- des entre 80 a 85 anos.

[00471] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 73,9% dos 46 in-

divíduos com idades entre 65 e 69 anos, 64,1% dos 39 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 67,9% de 28 indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 62,5% de 8 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 91,3% de 46 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 81,1% de 37 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 86,4% de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 55,6% de 9 indiví- duos com idades entre 80 a 85 anos.

[00472] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 100,0% de 2 indi- víduos com idades entre 65 e 69 anos, 100,0% de 1 indivíduo com idade entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades en- tre 75 a 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 66,7% de 3 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 100,0% de 2 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e inesti- máveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00473] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 73,9% dos 46 in- divíduos com idades entre 65 e 69 anos, 64,1% dos 39 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 67,9% de 28 indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 62,5% de 8 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 91,3% de 46 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 81,1% de 37 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 86,4%

de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 55,6% de 9 indiví- duos com idades entre 80 a 85 anos.

[00474] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 100,0% de 2 indi- víduos com idades entre 65 e 69 anos, 100,0% de 1 indivíduo com idade entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades en- tre 75 a 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 66,7% de 3 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 100,0% de 2 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e inesti- máveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00475] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram um aumento > quatro vezes da linha de base nos títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 84,8% dos 46 indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 87,2% dos 39 de 70 a 74 anos, 78,6% de 28 de 75 a 79 anos e 100,0% de 8 de 80 a 85 anos. As proporções correspon- dentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 91,3% de 46 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 81,1% de 37 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 100,0% de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 77,8% de 9 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00476] No regime mensal, no Mês 7, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 μg de C. difficile que atingiram um aumento > 4 vezes da linha de base nos títulos de anti- corpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 100,0% de 2 indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 100% de 1 indivíduo com idade entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e inesti- máveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 66,7% de 3 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 50,0% de 2 in- divíduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos entre 75 e 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00477] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neu- tralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limia- res específicos foram 23,0% de 74 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 30,2% de 53 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 28,6% de 28 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 25,0% de 16 indivíduos com idades entre 80 e 85 anos. As proporções correspon- dentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram de 38,0% de 71 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 30,0% de 50 indiví- duos com idades entre 70 e 74 anos, 48,3% de 29 indivíduos com ida- des entre 75 e 79 anos e 53,3% de 15 indivíduos com idades entre 80 e 85 anos.

[00478] No regime diário, no Dia 37, as GMCs de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A para os indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile foram 422 unidades neutralizantes/mL para os indiví- duos com idades entre 65 a 69 anos, 389 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idade entre 70 a 74 anos, 282 unidades neu- tralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 262 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As GMCs correspondentes para os indivíduos do grupo de 200 μg C. difficile foram 569 unidades neutralizantes/mL para os indi-

víduos com idades entre 65 a 69 anos, 558 unidades neutralizan- tes/mL para os indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 496 unida- des neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 616 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00479] No regime diário, no Dia 37, as GMCs de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B para os indivíduos do grupo de 100 µg de C. difficile foram 653 unidades neutralizantes/mL para os indiví- duos com idades entre 65 e 69 anos, 809 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idade entre 70 a 74 anos, 566 unidades neu- tralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 1309 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As GMCs correspondentes para os indivíduos do grupo de 200 μg de C. difficile foram 1192 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 805 unidades neutrali- zantes/mL para os indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 2404 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 1449 unidades neutralizantes/mL para os indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00480] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram os títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 11,9% dos 59 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 13,2% de 38 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 9,1% de 22 indivíduos com idades en- tre 75 a 79 anos e 9,1% de 11 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 22,4% de 49 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 21,1% de 38 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 36,4% de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 46,2% de 13 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00481] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 100,0% de 2 indi- víduos com idades entre 65 e 69 anos, 50,0% de 2 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 100,0% de 3 indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 100,0% de 3 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e inesti- máveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00482] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram os títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 11,9% dos 59 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 13,2% de 38 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 9,1% de 22 indivíduos com idades en- tre 75 a 79 anos e 9,1% de 11 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 22,4% de 49 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 21,1% de 38 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 36,4% de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 46,2% de 13 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00483] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram títulos de anticorpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 100,0% de 2 indi- víduos com idades entre 65 e 69 anos, 50,0% de 2 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 100,0% de 3 indivíduos com idades entre 65 a 69 anos, 100,0% de 3 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos entre 75 e 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00484] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soronegativos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram um aumento > 4 vezes da linha de base nos títulos de anti- corpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B > os limiares específicos foram 15,3% dos 59 indivíduos com idades en- tre 65 a 69 anos, 18,4% de 38 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, 18,2% de 22 indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e 18,2% de 11 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções cor- respondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 24,5% de 49 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 26,3% de 38 indivíduos com idades entre 70 e 74 anos, 36,4% de 22 indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e 46,2% de 13 indivíduos com idades entre 80 a 85 anos.

[00485] No regime diário, no Dia 37, as proporções de indivíduos soropositivos da linha de base no grupo de 100 µg de C. difficile que atingiram um aumento > 4 vezes da linha de base nos títulos de anti- corpo neutralizante específico igualmente para a toxina A e toxina B, os limiares específicos foram 100,0% de 2 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 50,0% de 2 indivíduos com idades entre 70 a 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 a 79 anos e inesti- máveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. As proporções correspondentes de indivíduos no grupo de 200 µg de C. difficile foram 33,3% de 3 indivíduos com idades entre 65 e 69 anos, 0,0% de 3 indi-

víduos com idades entre 70 e 74 anos, inestimáveis para indivíduos com idades entre 75 e 79 anos e inestimáveis para indivíduos com idades entre 80 a 85 anos. EXEMPLO 8: Um Estudo de Fase 2, Controlado por placebo, Ran- domizado e Cego ao observador para Avaliar a Segurança, Tole- rabilidade e Imunogenicidade de Dois Regimes de Três Doses de uma Vacina de Clostridium difficile em Adultos Saudáveis com Idade entre 65 e 85 anos, 12 meses Após a Dose 3)

[00486] Clostridium difficile (C. difficile) é uma causa comum de di- arreia nosocomial associada a antibióticos. Até o momento, não há vacina disponível para prevenir a infecção por C. difficile (CDI). Neste estudo de fase 2, exploramos a segurança, tolerabilidade e imunoge- nicidade de uma vacina contra C. difficile baseada em toxoides em 855 adultos imunocompetentes saudáveis com idades entre 65 e 85 anos nos Estados Unidos.

[00487] Métodos. A fase originalmente planejada deste estudo foi conduzida de 16 de julho de 2015 a 7 de março de 2017. Os indiví- duos foram inscritos e randomizados para receber um dos dois níveis de dose de antígeno (100 µg ou 200 µg) ou placebo e um dos dois re- gimes de três doses: Dias 1, 8 e 30 (regime do dia) ou mês 0, 1 e 6 (regime do mês). O teste de imunogenicidade foi realizado em amos- tras de sangue obtidas em cada uma das nove visitas de estudo. A reatogenicidade local e sistêmica foi coletada após cada vacinação. A notificação de eventos adversos não graves (AE) ocorreu 1 mês após a dose 3. A notificação de eventos adversos graves (SAE) ocorreu 6 meses após a dose 3. 855 indivíduos saudáveis e imunocompetentes foram incluídos no estudo e distribuídos aleatoriamente em paralelo, na relação de 3 : 3 : 1, para receber 3 doses da vacina contra C. diffici- le (100 µg ou 200 µg de toxoide total) ou placebo (solução salina) em 1 de 2 regimes de dosagem: Dias 1, 8 e 30 (regime do dia) ou meses 0,

1 e 6 (regime do mês). O teste de imunogenicidade foi realizado em amostras de sangue obtidas em cada uma das 9 visitas do estudo: di- as 1, 8, 15, 30, 37, meses 2, 4, 7 e 13 para o regime do dia e dias 1, 30, 37, 187, meses 2, 6, 7, 12 e 18 para o regime do mês. As concen- trações de imunoglobulina neutralizadora G (IgG) neutralizadora da toxina A e específica da toxina B (unidades de neutralização/mL) fo- ram medidas em cada visita de estudo programada. As concentrações médias geométricas (GMC) foram calculadas e os limiares de neutrali- zação estabelecidos para a toxina A e toxina B - (FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C e FIG. 2D) As reações locais e os eventos sistêmicos foram coletados por e-diário durante 14 dias após cada vacinação (7 dias após a dose 1 para o regime diário). A notificação de eventos adversos ocorreu após a assinatura do consentimento informado até 1 mês após a dose 3. A notificação de eventos adversos graves (SAE) ocorreu 6 meses após a dose 3. A segurança, a reatogenicidade e a imunogeni- cidade foram analisadas descritivamente em cada regime de vacina- ção por dose (100 µg e 200 µg) e placebo.

[00488] Resultados. A imunogenicidade geral foi maior no regime de 200 µg Mês após 3 doses. A reatogenicidade local demonstrou um aumento após a dose # 2 no regime diário. As taxas de eventos adver- sos no regime mensal foram numericamente mais altas devido a um acompanhamento adicional de 5 meses em comparação ao regime diário.

[00489] A resposta imune de pico de anticorpos à vacinação foi ob- servada no mês 7 e no dia 37 após a dose 3 para o regime mensal e diário, respectivamente -(FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C e FIG. 2D).

[00490] 12 meses após a dose 3, o regime do mês demonstra uma proporção maior de indivíduos acima do limiar de neutralização prede- finido em comparação com o regime do dia, independentemente do grupo de doses -(FIG. 1A, FIG. 1B, FIG. 1C e FIG. 1D).

[00491] Aos 12 meses após a dose 3, as Concentrações médias geométricas (GMCs) para o regime do mês são mais altas em compa- ração aos GMCs do regime diário para a toxina B (4 vezes maior) e a toxina A (2 vezes maior)-(FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C e FIG. 2D).

[00492] Aos 12 meses após a dose 3, as GMCs da toxina A perma- necem acima do limiar de neutralização no regime de 200 µg de mês - (FIG. 2A e FIG. 2B).

[00493] As GMCs da toxina B estão acima do limiar de neutraliza- ção no regime mensal de 200 µg até aproximadamente 9 meses após a dose 3 -(FIG. 2A e FIG. 2B).

[00494] A dor é a reação local mais comum relatada; a incidência de qualquer vermelhidão e inchaço foi < 10% após cada dose em am- bos os regimes

[00495] Não foi relatada a reatogenicidade local ou sistêmica de Grau 4 durante o estudo

[00496] No regime do mês, não foi observada diferença numérica significativa entre os eventos adversos agregados entre os grupos de dose e o placebo -(FIG. 3A e FIG. 3B).

[00497] Não foram relatados eventos adversos sérios (SAE) relaci- onados à vacinação com C. difficile durante o estudo entre qualquer regime ou grupo de doses -(FIG. 3A e FIG. 3B).

[00498] Conclusões. O regime é mais imunogênico do que o regi- me diário, após 3 doses da vacinação com C. difficile. A reatogenici- dade local aumentada foi observada após a dose 2, quando adminis- trada no dia 8, particularmente no nível de dose de 200μg. Efeitos ad- versos relacionados, eventos adversos graves e abstinências devido a eventos adversos foram numericamente maiores nos grupos de vaci- nas ativas, mas não havia padrões discerníveis para sugerir uma pre- ocupação de segurança. A frequência e tipo geral de eventos adversos foram característicos dessa coorte etária na população em geral. A vacinação contra C. difficile foi imunogênica e bem tolerada. A candi- data a vacina contra Clostridium difficile é altamente imunogênica, bem tolerada e demonstra um perfil de segurança aceitável. O regime de 200 µg de mês demonstrou maior imunogenicidade em geral e foi se- lecionado para o desenvolvimento da fase 3.

[00499] O nível de dose de 200 µg era consistentemente mais imu- nogênico do que o nível de dose de 100 µg.

[00500] O regime diário gera uma resposta imune anterior superior no Dia 37/Mês 2 para a toxina A, mas não para a toxina B. Ver, por exemplo, a FIG. 4A, a FIG. 4B, a FIG. 5A e FIG.5B. Para a toxina A, a soropositividade basal contribui para a magnitude da resposta imune precoce (particularmente para o nível de dose de 100 µg), mas, em ambos os regimes, há pouca diferença após a dose 3. Nos indivíduos soronegativos basais da toxina B (~ 80% do total), é apenas a terceira dose administrada no mês 6 que resulta em relação significativa atin- gindo o limiar. Veja, por exemplo, a FIG. 6A, a FIG. 6B, a FIG. 7A e FIG.7B. Para todos os eventos sistêmicos, não foram observadas dife- renças significativas entre o placebo e a vacina contra C. difficile, ou entre os níveis de dose de 100 μg e 200 μg. Eventos adversos relacio- nados, eventos adversos graves e abstinências devido a eventos ad- versos foram numericamente maiores nos grupos ativos da vacina, mas não havia padrões discerníveis para sugerir uma preocupação de segurança. O nível de dose de 200 µg administrado aos 0, 1 e 6 me- ses foi selecionado para a Fase 3.

[00501] Com relação aos resultados no mês 12 após a dose 3, aos 12 meses após a dose nº 3, aproximadamente 50% dos indivíduos es- tão acima dos limiares predefinidos em ambos os grupos de doses pa- ra neutralização contra a toxina A. O regime do mês, as concentrações médias geométricas (GMCs) do grupo de dose de 200 µg estão acima do limiar de neutralização contra a toxina A aos 12 meses após a dose

# 3. Aos 12 meses após a dose nº 3, 47% dos indivíduos estão acima dos limiares predefinidos no grupo de doses de 200 µg do regime mensal para neutralização contra a toxina B. GMC (s) de soropositivos estão acima do limiar de neutralização em ambos os regimes para neutralização contra a toxina B. Com relação ao regime do mês, as GMCs da toxina B estão acima do limiar de neutralização 6 meses após a dose # 3 (2993 unidades de neutralização/mL) e permanecem semelhantes (2178 unidades de neutralização/mL) 12 meses após a dose # 3. Veja, por exemplo, as FIGs. 1A-D, as FIGs. 2A-D, FIG. 8A, a FIG. 8B e FIG. 9A e FIG. 9B. EXEMPLO 9: Um Estudo de Fase 1, Controlado por Placebo, Ran- domizado e Cego ao Observador para Avaliar a Segurança, Tole- rabilidade e Imunogenicidade de Dois Regimes de Três Doses da Vacina contra Clostridium difficile Administrada em Adultos Ja- poneses Saudáveis com Idades entre 65 e 85 anos (B5091010)

[00502] Este foi um estudo randomizado, controlado por placebo, de Fase 1, para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade de 2 níveis de dose de antígeno da vacina contendo hidróxido de alu- mínio (ou seja, 100 µg e 200 µg) em 2 regimes diferentes de dosagem. (Meses 0, 1 e 6 [regime mensal] ou Dias 1, 8 e 30 [regime diário]) em adultos japoneses saudáveis com idades entre 65 e 85 anos.

[00503] Um total de 128 adultos japoneses saudáveis, com idades entre 65 e 85 anos, deveria ser matriculado. Os indivíduos foram divi- didos aleatoriamente em uma relação de 3 : 3 : 2 para receber vacina contra C. difficile (100 µg ou 200 µg de toxoide total) ou placebo (solu- ção salina) em cada regime de dosagem.

[00504] Os indivíduos foram acompanhados por 6 meses após o recebimento da última vacinação. Portanto, os indivíduos designados para o regime do mês participaram por aproximadamente 12 meses e os designados para e completando o regime do dia participaram por aproximadamente 7 meses. Este estudo foi planejado para ser conclu- ído em aproximadamente 14 meses. O final do estudo foi a última visi- ta do último indivíduo.

[00505] A vacina contra C. difficile não havia sido previamente ava- liada em indivíduos japoneses. Portanto, o presente primeiro estudo em japonês B5091010 foi projetado de forma semelhante ao estudo B5091009 para avaliar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade de 2 níveis de dose de antígeno (100 µg e 200 µg de toxoide total) da vacina contra C. difficile contendo hidróxido de alumínio quando admi- nistrada como dois regimes de três doses (dias 1, 8 e 30 ou meses 0, 1 e 6) para adultos japoneses saudáveis com idades entre 65 e 85 anos.

[00506] Durante o período em que o Estudo B5091010 estava em andamento, o Estudo de Fase 2 B5091009 foi analisado e demonstrou que ambos os regimes e os dois níveis de dose administrados eram geralmente bem tolerados. As reações locais foram predominantemen- te leves a moderadas, sendo a dor no local da injeção a manifestação mais frequente. Após a Dose 2, a reatogenicidade local foi maior quando o A vacina foi administrada no dia 8 em comparação com o mês 1, particularmente para o nível de dose de 200 µg. Os eventos sistêmicos também foram predominantemente leves a moderados e as incidências de eventos individuais foram semelhantes entre o grupo placebo, o grupo com dose de 100 µg e o grupo com dose de 200 µg. Dentro de cada regime, as taxas gerais de incidência de eventos ad- versos (AE) também foram semelhantes entre os grupos de doses de placebo, 100 µg e 200 µg. Para ambos os regimes, os eventos adver- sos graves (SAEs) foram numericamente mais altos nos grupos de do- ses de 100 µg e 200 µg do que no grupo placebo. No entanto, não houve um padrão para esses eventos e nenhuma preocupação com segurança foi identificada. Ambos os níveis de dose estudados resulta-

ram em títulos de antitoxina A e B neutralizantes substanciais, sendo preferido o perfil de imunogenicidade após 3 doses administradas nos meses 0, 1 e 6. Além disso, o nível de dose de 200 µg foi mais imuno- gênico do que o nível de dose de 100 µg. Com base nisso, decidiu-se progredir no desenvolvimento da Fase 3 com o nível de dose de 200 µg administrado nos meses 0, 1 e 6.

[00507] Para cada regime de dosagem, os indivíduos foram rando- mizados para 1 de 3 grupos de estudo, conforme listado na Tabela 4. Aproximadamente 24 indivíduos foram planejados para receber a va- cina contra C. difficile com um nível total de dose de toxoide de 100 ou 200 µg e aproximadamente 16 indivíduos para receber placebo (sali- na). Tabela 4. Grupos de vacinas e número planejado de indivíduos por grupo e por regime de doses Grupo de Descrição da Formulação de Vacina Regime de Número Vacina Dosagem de Indivíduos 1 vacina contra Clostridium difficile contendo hidróxi- Meses 0, 1, 6 24 do de alumínio (dose de antígeno de 100 µg) 2 vacina contra C. difficile contendo hidróxido de Meses 0, 1, 6 24 alumínio (dose de antígeno de 200 µg) 3 Placebo (solução salina) Meses 0, 1, 6 16 4 vacina contra C. difficile contendo hidróxido de Dias 1, 8, 30 24 alumínio (dose de antígeno de 100 µg) 5 vacina contra C. difficile contendo hidróxido de Dias 1, 8, 30 24 alumínio (dose de antígeno de 200 µg) 6 Placebo (solução salina) Dias 1, 8, 30 16 Total 128

[00508] Amostras de soro foram obtidas para testes de imunogeni- cidade. Para o regime mensal, no dia 1 (antes da administração da vacina), dia 15 (14 dias após a dose 1), dia 30 (imediatamente antes da dose 2), dia 37 (7 dias após a dose 2), mês 2 (1 mês após a dose 2), mês 6 (imediatamente antes da dose 3), dia 187 (7 dias após a do- se 3), mês 7 (1 mês após a dose 3) e mês 12 (6 meses após a dose 3).

[00509] Para o regime diário, no dia 1 (antes da administração da vacina), dia 8 (imediatamente antes da dose 2), dia 15 (7 dias após a dose 2), dia 30 (imediatamente antes da dose 3), dia 37 (7 dias após Dose 3), Mês 2 (1 mês após a Dose 3), Mês 4 (3 meses após a Dose 3) e Mês 7 (6 meses após a Dose 3).

[00510] Os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxi- na A e B foram medidos.

[00511] Concentrações Médias Geométricas dos Anticorpos Neutra- lizantes Específicos da Toxina A e B - Para o regime mensal, o Mês 7 (1 mês após a Dose 3) foi especificado como o ponto primário do tem- po, pois refletia a resposta imune após a terceira dose da vacina. No geral, as GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A e toxina B aumentaram após a Dose 2, mas foram mais altos após a Dose 3 (Mês 7) para os grupos de 100 e 200 µg. As GMCs de anticor- pos neutralizantes específicos para a toxina A e B foram maiores no grupo de dose de 200 µg em comparação com o grupo de doses de 100 µg no mês 7. As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A e toxina B diminuíram do mês 7 até o mês 12 para ambos os níveis de dose. No mês 12, as GMCs permaneceram acima do limite para os anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A e B para o grupo de dose de 200 µg e também para o anticorpo neu- tralizante específico para a toxina A para o grupo de dose de 100 µg. As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A no grupo de dose de 200 µg aumentaram após a Dose 2 (dia 37) para 347,17 unidades neutralizantes/mL e para 125,46 unidades neutrali- zantes/mL no grupo de 100 µg no dia 37. As GMCs de anticorpos neu- tralizantes específicas para toxina A nos grupos de doses de 100 e 200 µg diminuíram no Mês 6 (antes da Dose 3) para 88,89 unidades neutralizantes/mL e 148,44 unidades neutralizantes/mL, respectiva- mente. Após a Dose 3, as GMCs de anticorpos neutralizantes especí- ficos para a toxina A aumentaram novamente para os grupos de doses de 100 e 200 µg e no Mês 7 foram numericamente mais altas no grupo de doses de 200 µg (1692,38 unidades neutralizantes/mL) quando comparados ao grupo de dose de 100 µg (1137,50 unidades neutrali- zantes/mL). As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A diminuíram até o Mês 12 (6 meses após a Dose 3), embora ambos os grupos de doses de 100 e 200 µg permanecessem geral- mente altos (248,97 unidades neutralizantes/mL e 587,46 unidades neutralizantes/mL, respectivamente) em comparação com GMCs no mês 6. As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxi- na B nos grupos de 100 e 200 µg aumentaram após a Dose 2 (dia 37) para 337,54 unidades neutralizantes/mL e 901,16 unidades neutrali- zantes/mL, respectivamente.

As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B diminuíram no Mês 6 (antes da Dose 3) para 274,13 unidades neutralizantes/mL e 689,74 unidades neutrali- zantes/mL, respectivamente.

Após a Dose 3 (dia 187), as GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B aumentaram no- vamente para o grupo de doses de 100 e 200 µg e no mês 7 as GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B foram numeri- camente mais altos no grupo de doses de 200 µg (13756,54 unidades neutralizantes/mL) quando comparado ao grupo de dose de 100 µg (7903,68 unidades neutralizantes/mL). No mês 12, as GMCs de anti- corpos neutralizantes específicos para a toxina B diminuíram, mas permaneceram geralmente altos no grupo de doses de 200 µg (6298,18 unidades neutralizantes/mL), mas não no grupo de doses de 100 µg (1887,24 unidades neutralizantes/mL) em comparação aos GMCs de Mês 6. As GMCs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A e B permaneceram inalterados desde o início até o Mês 12 no grupo placebo.

Para o regime mensal, as GMCs de anticor- pos neutralizantes específicos para as toxinas A e B foram basicamen- te semelhantes entre os indivíduos com 65 a 69 anos e 70 a 74 anos na população de imunogenicidade avaliável.

[00512] No regime mensal, o anticorpo neutralizante específico para toxinas A e B (GMFRs) da linha de base foi calculado em cada ponto de tempo pós-linha de base disponível: dia 15 (14 dias após a dose 1), dia 30 (imediatamente antes da dose 2)), Dia 37 (7 dias após a dose 2), mês 2 (1 mês após a dose 2), mês 6 (imediatamente antes da dose 3), dia 187 (7 dias após a dose 3), mês 7 (1 mês após a dose 3) tem- po) e Mês 12 (6 meses após a Dose3).

[00513] Observou-se um aumento no GMFR do anticorpo neutrali- zante específico para a toxina A no grupo de 200 µg após a Dose 2 (dia 37; 4,26), mas diminuiu para 1,82 no mês 6. Após a Dose 3, hou- ve um aumento adicional na toxina A específica GMFRs de anticorpos neutralizantes para os grupos de doses de 100 e 200 µg no dia 187 (7,42 e 16,07, respectivamente), e um aumento adicional no mês 7 (12,58 e 20,77, respectivamente). No mês 12, os GMFRs de anticor- pos neutralizantes específicos para a toxina A diminuíram para 2,70 e 7,20 nos grupos de doses de 100 e 200 µg, respectivamente. Os GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A no grupo de dose de 200 µg foram consistentemente superiores aos do grupo de doses de 100 µg em cada ponto do tempo de colheita de sangue. Os GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A permaneceram inalterados no grupo placebo durante o estu- do.

[00514] Foram observados aumentos nos GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B para os grupos de doses de 100 e 200 µg após a Dose 1 (Dia 15; 2,81 e 5,21, respectivamente) e Dose 2 (Dia 37; 2,53 e 5,35, respectivamente), com discretas diminui- ções observado no mês 6 (2,06 e 4,10, respectivamente). Um aumento adicional nos GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B foi observado após a Dose 3 para os grupos de doses de 100 e 200 µg no dia 187 (32,00 e 54,81, respectivamente), e um aumento adicional no mês 7 (59,28 e 81,71, respectivamente). No mês 12, os GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B dimi- nuíram para 14,01 e 36,90 para os grupos de doses de 100 e 200 µg, respectivamente. Os GMFRs de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B no grupo de dose de 200 µg foram consistentemente mais altos do que os do grupo de dose de 100 µg em cada ponto do tempo de amostragem no sangue. Os GMFRs de anticorpos neutrali- zantes específicos para a toxina B permaneceram inalterados no gru- po placebo durante o estudo.

[00515] As proporções de indivíduos no regime mensal que atingi- ram os níveis de anticorpo neutralizante específico para as toxinas A e B acima dos valores-limite especificados (219 unidades neutralizan- tes/mL [toxina A] e 2586 unidades neutralizantes/mL [toxina B]) foram avaliadas para a população de imunogenicidade avaliável.

[00516] No geral, as proporções de indivíduos que atingiram os ní- veis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A e B acima do limiar foram maiores no grupo de dose de 200 µg quando comparado ao grupo de dose de 100 µg em todos os momentos de amostragem sanguínea. Para os dois grupos de doses, as proporções de indivíduos com níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A, toxina B, e igualmente para toxina A e toxina B acima do limiar aumentaram após a dose 2 e foram mais altas após a dose 3 (mês 7).

[00517] Para anticorpo neutralizante específico para a toxina A, após a Dose 3 (dia 187), 78,3% (18/23, IC 95%: 56,3, 92,5) dos indiví- duos no grupo da dose de 100 µg e 95,7% (22/23, 95% CI: 78,1, 99,9) dos indivíduos no grupo de dose de 200 µg atingiu níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A acima do limite, em compara- ção com nenhum indivíduo no grupo placebo. No mês 7, 91,3% (21/23, IC 95%: 72,0, 98,9) dos indivíduos no grupo da dose de 100 µg e 100,0% (23/23, IC 95%: 85,2, 100,0) dos 200 µg grupo de dose atingiu níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A acima do limiar, em comparação com nenhum indivíduo no grupo placebo. As proporções de indivíduos acima do limiar para os níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A permaneceram altas no Mês 12 para o grupo de dose de 200 µg (95,5% [21/22] dos indivíduos, IC 95%: 77,2, 99,9), mas diminuíram em o grupo de 100 doses (55,0% [9/20] dos indivíduos, IC 95%: 31,5, 76,9). Nenhum indivíduo do grupo placebo apresentou níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina A acima do limite no mês 12.

[00518] Para anticorpos neutralizantes específicos para a toxina B, após a Dose 3 (dia 187), 52,2% (12/23, IC 95%: 30,6, 73,2) dos indiví- duos no grupo de 100 µg e 91,3% (21/23, 95% CI: 72.0, 98.9) indiví- duos no grupo de dose de 200 µg atingiram níveis de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B acima do limite, em comparação com nenhum indivíduo no grupo placebo. No mês 7, 91,3% (21/23, IC 95%: 72,0, 98,9) dos indivíduos no grupo da dose de 100 µg e 100,0% (23/23, IC 95%: 85,2, 100,0) dos indivíduos no grupo de dose de 200 µg atingiram níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina B acima do limiar, em comparação com nenhum indivíduo no grupo placebo. As proporções de indivíduos acima do limiar para níveis de anticorpo neutralizante específico para a toxina B permaneceram altas no Mês 12 para o grupo de dose de 200 µg (81,8% [18/22] dos indiví- duos, IC95%: 59,7, 94,8), mas diminuíram em o grupo de 100 doses (45,0% [11/20] dos indivíduos, IC 95%: 23,1, 68,5). Nenhum indivíduo do grupo placebo apresentou níveis de anticorpo neutralizante especí- fico para a toxina B acima do limite no mês 12.

[00519] Para o regime mensal, as proporções de indivíduos que atingem aumentos da duplicação definidos (≥ 4 vezes, ≥ 8 vezes, ≥ 16 vezes e ≥ 32 vezes) em relação à linha de base na toxina A, toxina B, e igualmente os níveis de anticorpo neutralizante específico para a to-

xina A e toxina B foram avaliados para a população de imunogenicida- de avaliável. No geral, uma proporção maior de indivíduos que atingi- ram aumentos de duplicação definidos dos níveis de anticorpo neutra- lizante específico da toxina A da linha de base foi observada no grupo de dose de 200 µg em comparação ao grupo de dose de 100 µg. Foi observado um aumento nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento de 32 vezes da linha de base nos grupos de doses de 100 e 200 µg após a Dose 3 (Dia 187). No mês 7, 69,6% (16/23) dos indivíduos no grupo da dose de 100 µg e 91,3% (21/23) dos indivíduos no grupo da dose de 200 µg atingiram um aumento de 8 vezes da li- nha de base. Além disso, no mês 7, 69,6% (16/23) dos indivíduos no grupo de dose de 200 µg também atingiram um aumento de 16 vezes da linha de base. Os aumentos de duplicação de anticorpo neutralizan- te específico para a toxina A da linha de base no grupo placebo per- maneceu inalterado a cada momento. As proporções de indivíduos que atingem aumentos de duplicação definidos sobem dos níveis ba- sais de anticorpos neutralizantes específicos para a toxina A diminuí- ram no mês 12 em comparação ao mês 7, com 5,0% (1/20) de indiví- duos no grupo de 100 µg e 13,6% (3/22) de indivíduos no grupo de dose de 200 µg, atingindo um aumento de 16 vezes a partir da linha de base.

[00520] No geral, foi observada uma proporção maior de indivíduos que atingiram aumentos de duplicação definidos dos níveis de anticor- po neutralizante específico para a toxina B de linha de base no grupo de dose de 200 µg em comparação ao grupo de dose de 100 µg. Foi observado um aumento nas proporções de indivíduos que atingiram um aumento de 32 vezes da linha de base nos grupos de dose de 100 e 200 µg após a Dose 3 (dia 187). No mês 7, 73,9% (17/23) dos indiví- duos no grupo da dose de 100 µg e 82,6% (19/23) dos indivíduos no grupo da dose de 200 µg atingiram um aumento de 32 vezes da linha

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um toxoide de Clostridium difficile, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição ou kit para eliciar uma resposta imune em um ser humano contra uma infecção por C. difficile, em que a composição é para administração ao ser humano pelo menos duas vezes, em que a segunda administração é cerca de 30 dias após a primeira administração e em que a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 60 dias.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada pelo menos três vezes.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a terceira administração é cerca de 180 dias após a primeira administração.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune eliciada compreende um anticorpo mono- clonal neutralizante antitoxina A.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune eliciada compreende um anticorpo mono- clonal neutralizante antitoxina B.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune eliciada compreende um anticorpo mono- clonal neutralizante antitoxina A e um anticorpo monoclonal neutrali- zante antitoxina B, em que a concentração de anticorpo monoclonal neutralizante é de pelo menos 10 µg/mL.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, cada qual tendo uma pureza de pelo menos 90 % ou mais.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, em uma relação de cerca de 3 : 1 a cerca de 1 : 1.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um toxoide A de C. difficile e/ou um toxoide B de C. difficile, em uma relação de 1 : 1.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um adjuvante.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um adjuvante de alumínio.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. diffi- cile é mantida por pelo menos cerca de 180 dias.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. diffi- cile é mantida por pelo menos cerca de 365 dias.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. diffi- cile é mantida por pelo menos cerca de 540 dias.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o toxoide A de C. difficile e o toxoide B de C. difficile são liofilizados.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a primeira dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina A que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina A no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B que é pelo menos 2 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição induz uma concentração de anticorpo neutra- lizante específico para a toxina B que é pelo menos 32 vezes maior no ser humano após receber a segunda dose do que uma concentração de anticorpo neutralizante específico para a toxina B no ser humano antes de receber a primeira dose, quando medida em condições idênticas em um ensaio de citotoxicidade.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soronegativo para a toxina B.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soronegativo para a toxina A.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soronegativo para a toxina A e toxina B.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soropositivo para a toxina B.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soropositivo para a toxina A.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ser humano é soropositivo para a toxina A e toxina B.

30. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição compreendendo um toxoide de Clostridium difficile, e ins- truções para administração da composição ao ser humano pelo menos duas vezes, em que a segunda administração é cerca de 30 dias após a primeira administração e em que a resposta imune contra a toxina A e/ou toxina B de C. difficile é mantida por pelo menos cerca de 60 dias.

31. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concreti- zações ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exem- plo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente re- velada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.