BR112020003988A2

BR112020003988A2 - anticorpos agonísticos cd40

Info

Publication number: BR112020003988A2
Application number: BR112020003988-8A
Authority: BR
Inventors: Stephan Ficher; Karsten Beckmann
Original assignee: Mab Discovery Gmbh
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-09-01
Also published as: US11702478B2; WO2019057792A1; KR20200063139A; IL272770A; CN111225924B; JP2023182583A; EP3684813A1; EA202090791A1; JP7346390B2; MX2020002984A; SG11202002366VA; CN117551197A; US20240010741A1; AU2018335828A1; US20200239583A1; ZA202001066B; CA3075221A1; CN111225924A; JP2020534292A

Abstract

  A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanizados ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente ao receptor CD40 humano e induzem a sinalização de CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fc¿. Os anticorpos da presente invenção se ligam a um epitopo CD40 que se sobrepõe ao epitopo do ligante CD40 e podem ativar APCs humanas. A presente invenção também fornece composições compreendendo os referidos anticorpos e usos para os anticorpos e as composições no tratamento de pacientes que sofrem de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS AGONÍSTICOS CD40". Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos agonísticos monoclonais humanizados ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente ao receptor CD40 humano e são capazes de induzir a sinalização de CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ. A invenção também se refere aos usos dos referidos anticorpos e composições farmacêuticas que os compreendem. Antecedentes

[0002] O sucesso recente da imunoterapia contra o câncer reviveu a hipótese de que o sistema imunológico pode controlar muitos, se não a maioria dos cânceres, em alguns casos produzindo respostas duráveis de uma maneira que não é vista em muitos medicamentos de moléculas pequenas. Os anticorpos monoclonais (mAb) agonísticos CD40 oferecem uma nova opção terapêutica que tem o potencial de gerar imunidade anticâncer por vários mecanismos.

[0003] CD40 é uma molécula de superfície celular e um membro da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral (TNF). É expressada amplamente em células apresentadoras de antígeno (APC), como células dendríticas, células B e monócitos, bem como em muitas células não imunes e em uma variedade de tumores.

[0004] O ligante natural para CD40 é CD154, que é expressado principalmente na superfície dos linfócitos T ativados e fornece um componente importante da "ajuda" das células T para respostas imunes: A sinalização via CD40 na APC medeia, em grande parte, a capacidade das células T auxiliares de licenciar a APC. A ligação de CD40 em DC, por exemplo, induz uma expressão superficial aumentada de moléculas co-estimulatórias e MHC, produção de citocinas pró-inflamatórias e aumento no desencadeamento de células T. A ligação de CD40 nas células B em repouso aumenta a função de apresentação de antígenos e a proliferação.

[0005] As consequências da sinalização de CD40 são multifacetadas e dependem do tipo de célula expressando o CD40 e do microambiente no qual o sinal de CD40 é fornecido. Como alguns outros membros da família de receptores de TNF, a sinalização de CD40 é mediada por moléculas adaptadoras, e não pela atividade de transdução de sinal inerente da cauda citoplasmática de CD40. As quinases a jusante são ativadas quando o receptor é montado, um complexo de sinalização multicomponente é translocado de CD40 para o citosol e várias vias de transdução de sinal bem caracterizadas são ativadas.

[0006] Anticorpos anti-CD40 humanos são conhecidos na técnica anterior. Os respectivos anticorpos antagonistas podem ser variantes silenciosas de Fc, mostrando uma reticulação reduzida do receptor CD40 mediado por Fcγ. As respectivas mutações da região FC de IgG1 humana são descritas em, por exemplo, US 2018/0118843.

[0007] Em abordagens imunomoduladoras recentemente projetadas, os anticorpos monoclonais (mAbs) agonistas direcionados a CD40 são usados para aumentar a capacidade do sistema imunológico de reconhecer e destruir células cancerosas. Os estudos pré-clínicos respectivos mostraram que o mAb CD40 agonístico pode ativar a APC e promover respostas antitumorais das células T e promover células mieloides citotóxicas com potencial para controlar o câncer na ausência de imunidade das células T. Assim, o mAb CD40 agonístico é fundamentalmente diferente do mAb que realiza a ativação imune ao bloquear moléculas de ponto de verificação negativas, como CTLA-4 ou PD-1.

[0008] O CP-870.893 é o primeiro mAb IgG2 totalmente humano que opera como um agonista potente e seletivo de CD40. Curiosamente, a ligação de CP-870.893 não compete com a ligação de CD154 a CD40. Em estudos pré-clínicos, o CP-870.893 demonstrou mediar os efeitos dependentes do sistema imunológico e independentes na sobrevivência das células tumorais. No primeiro estudo em humanos, foi observada atividade antitumoral promissora, especialmente em pacientes com melanoma. Farmacodinamicamente, a administração de CP-870.893 leva a uma diminuição transitória das células B do sangue periférico e à regulação positiva dos marcadores de ativação nas APCs.

[0009] Assim, mAbs CD40 agonísticos representam uma estratégia promissora para novas terapêuticas contra o câncer. No entanto, também foram levantadas preocupações em relação aos seus potenciais efeitos colaterais citotóxicos. Anticorpos CD40 monoclonais agonísticos estão em perspectiva de desencadear síndromes de liberação de citocinas, reações autoimunes, síndromes tromboembólicas (devido à expressão de CD40 por plaquetas e células endoteliais), estimulação hiperimune levando à morte ou tolerância celular induzida pela ativação e angiogênese tumoral. Esses efeitos podem causar toxicidade indesejável ou promover o crescimento de tumores. Mecanicamente, a capacidade de CD40 agonístico e de outros receptores da família TNF de interagir com os receptores Fcγ tem sido associada à ocorrência de toxicidades em estudos com animais (Li & Ravetch 2012, Xu et al. 2003, Byrne et al. 2016).

[0010] Para o agonista mais forte testado, o CP-870.893, o efeito colateral mais comum relatado é a síndrome de liberação de citocinas, manifestando-se como calafrios, febre, rigidez e outros sintomas logo após a infusão. Além disso, vários casos de eventos tromboembólicos foram observados com o CP-870.893. Com o dacetuzumabe, foram observados distúrbios oculares inflamatórios não infecciosos.

[0011] Portanto, é necessário prever mABs CD40 agonísticos, que exibam toxicidade celular reduzida, levando a menos efeitos colaterais clínicos, mantendo sua potência e eficácia clínica. Os mAbs CD40 agonísticos da presente invenção podem satisfazer esta necessidade, permitindo a exploração de todo o potencial imunomodulador de anticorpos CD40 agonísticos. Sumário da invenção

[0012] A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao receptor CD40 humano e induzem a sinalização de CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ. Mais especificamente, os anticorpos da presente invenção se ligam a um epitopo CD40 que se sobrepõe ao epitopo do ligante CD40 e são capazes de ativar APCs humanas. A presente invenção também fornece composições compreendendo os referidos anticorpos e usos para os anticorpos e as composições no tratamento de uma condição ou doença, na qual é desejada a estimulação do sistema imunológico, por exemplo, no tratamento de pacientes que sofrem de câncer. Definições

[0013] O termo "anticorpo" abrange as várias formas de estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos inteiros e fragmentos de anticorpos, desde que mostrem as propriedades de acordo com a invenção.

[0014] “Um fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula, com excepção de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno para o qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, Fv, Fab, Fab’, Fab'-SH, F(ab')2; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0015] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usados aqui referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma única composição de aminoácidos.

[0016] O termo "anticorpo humanizado" ou "versão humanizada de um anticorpo" refere-se a anticorpos para os quais as cadeias pesadas e leves são humanizadas como resultado da engenharia de anticorpos. Uma cadeia humanizada é tipicamente uma cadeia na qual a sequência de aminoácidos da região V foi alterada para que, analisada como um todo, seja mais próxima em homologia de uma sequência da linhagem germinativa humana do que da sequência da linhagem germinativa das espécies de origem. A avaliação da humanização é baseada na sequência de aminoácidos resultante e não na metodologia em si.

[0017] Os termos "ligação específica contra o alvo ou anticorpo anti- alvo", como usados aqui, referem-se à ligação do anticorpo ao respectivo antígeno (alvo) ou célula de expressão de antígeno, medido por ELISA, em que o referido ELISA preferencialmente compreende o revestimento do respectivo antígeno a um suporte sólido, adicionando o referido anticorpo sob condições para permitir a formação de um complexo imune com o respectivo antígeno ou a proteína, detectando o referido complexo imune medindo os valores de Densidade Óptica (DO) usando uma ligação ao anticorpo secundária a um anticorpo de acordo com invenção e usando um desenvolvimento de cor mediado por peroxidase.

[0018] O termo "antígeno" de acordo com a invenção refere-se ao antígeno usado para imunização ou uma proteína compreendendo o referido antígeno como parte de sua sequência de proteínas. Por exemplo, para imunização, um fragmento do domínio extracelular de uma proteína (por exemplo, os primeiros 20 aminoácidos) pode ser usado e para detecção/ensaio e similares, o domínio extracelular da proteína ou da proteína de comprimento total pode ser usado.

[0019] O termo "ligação específica" ou "especificamente reconhecido" neste documento significa que um anticorpo exibe afinidade apreciável por um antígeno e, preferencialmente, não exibe reatividade cruzada significativa.

[0020] Um anticorpo que "não apresenta reatividade cruzada significativa" é aquele que não se liga de maneira apreciável a uma outra proteína indesejável. A ligação específica pode ser determinada de acordo com qualquer meio reconhecido na técnica para determinar essa ligação, por exemplo, por ensaios competitivos de ligação, como o ELISA.

[0021] Um "anticorpo que se liga ao mesmo epitopo" como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais e, inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

[0022] A "região variável (ou domínio) de um anticorpo de acordo com a invenção" (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)), conforme usado aqui, denota cada um dos pares de regiões de cadeia leve e pesada envolvidas diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada têm a mesma estrutura geral e cada região compreende quatro regiões estruturais (FR) cujas sequências são amplamente conservadas, conectadas por três regiões determinantes de complementaridade, CDRs.

[0023] O termo "porção de ligação ao antígeno de um anticorpo" quando usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende de preferência resíduos de aminoácidos das "regiões determinantes de complementares" ou "CDRs". As sequências de CDR são definidas de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos lineares real pode conter menos ou mais aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de ou inserção em uma região variável de FR ou CDR. Por exemplo, uma região variável da cadeia pesada pode incluir um único elemento de inserção de aminoácido (resíduo 52a, de acordo com o Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc, de acordo com Kabat) depois do resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada "padrão" de Kabat.

[0024] Os "domínios constantes (partes constantes)" não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem, por exemplo, também funções efetoras. O fragmento de gene da região constante da cadeia pesada que corresponde à IgG1 humana é chamado cadeia γ1. O fragmento de gene da região constante da cadeia pesada que corresponde à IgG3 humana é chamado cadeia γ3. Cadeias pesadas γ constantes humanas são descritas em Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), e por Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178(1989): 515-527.

[0025] O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc da sequência nativa e regiões Fc variante.

[0026] Salvo indicação em contrário aqui, a numeração dos resíduos de aminoácidos em uma região Fc ou uma região constante está de acordo com o sistema de numeração UE, também chamado de índice UE, descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[0027] Uma "região da variante Fc" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência “nativa” ou do “tipo selvagem” em virtude de, pelo menos, uma "modificação de aminoácido" conforme definido aqui.

[0028] O termo "variante Fc", conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma modificação no domínio Fc. A modificação pode ser uma adição, exclusão ou substituição. As substituições podem incluir aminoácidos que ocorrem naturalmente e aminoácidos que não ocorrem naturalmente. As variantes podem compreender aminoácidos não naturais.

[0029] O termo "polipeptídeo contendo a região Fc" refere-se a um polipeptídeo, como um anticorpo que compreende uma região Fc.

[0030] Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Um FcR que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII, e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas submetidas a splicing de esses receptores. Receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor de ativação") e FcγRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente no seu domínio citoplasmático. O receptor de ativação FcγRIIA contém um motivo de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcγRIIB contém um motivo de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático (ver revisão em Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; e de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126(1995): 330-41. Outros FcRs, incluindo aqueles que devem ser identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" aqui. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117 (1976) 587 e Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

[0031] Por "ligante IgG Fc", como usado aqui, entende-se uma molécula, preferencialmente um polipeptídeo, de qualquer organismo que se ligue à região Fc de um anticorpo IgG para formar um complexo ligante Fc/Fc. Os ligantes Fc incluem, mas não estão limitados a, FcyRs, FcRn, Clq, C3, lectina de ligação ao manano, receptor de manose, proteína estafilocócica A, proteína estreptocócica G e FcyR viral. Os ligantes Fc também incluem homólogos do receptor Fc (FcRH), que são uma família de receptores Fc homólogos aos FcyRs (Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, inteiramente incorporado por referência). Os ligantes de Fc podem incluir moléculas não descobertas que se ligam a Fc. Os ligantes de IgG Fc específicos são os receptores gama FcRn e Fc. Por "ligante Fc", como usado aqui, entende-se uma molécula, preferencialmente um polipeptídeo, de qualquer organismo que se ligue à região Fc de um anticorpo IgG para formar um complexo ligante Fc/Fc.

[0032] Por "receptor gama Fc", "FcyR" ou "FcgamaR", como usado aqui, significa qualquer membro da família de proteínas que se liga à região Fc do anticorpo IgG e é codificado por um gene FcyR. Em humanos, essa família inclui, mas não se limita a, FcyRI (CD64), incluindo as isoformas FcyRIA, FcyRIB e FcyRIC; FcyRII (CD32), incluindo isoformas FcyRIIA (incluindo alotipos H131 e R131), FcyRIIB (incluindo FcyRIIB-l e FcyRIIB-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD 16), incluindo as isoformas FcyRIIIA (incluindo os alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo os alotipos FcyRIIB-NAl e FcyRIIB-NA2) (Jefferis et al., Immunol Lett 82 (2002)), bem como quaisquer outros isoformas ou alotipos não descobertos de FcyRs ou FcyR humanos. Um FcyR pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não se limitando a, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Os FcyRs de camundongo incluem, mas não se limitam a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD 16) e FCYRIII-2 (CD 16-2), bem como quaisquer isoformas ou alotipos de FcyRs ou FcyR do camundongo não descobertos.

[0033] Por "FcRn" ou "receptor Fc neonatal", como usado aqui, refere-se a uma proteína que se liga à região Fc do anticorpo IgG e é codificada pelo menos em parte por um gene FcRn. O FcRn pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não se limitando a, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Como é conhecido na técnica, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, frequentemente referidos como cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é beta-2-microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. Salvo indicação em contrário, FcRn ou uma proteína FcRn refere- se ao complexo da cadeia pesada de FcRn com beta-2-microglobulina.

[0034] A “porcentagem (%) de identidade de sequência do aminoácido” em relação a uma sequência de referência de peptídeo ou polipeptídeo é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica com os resíduos de aminoácidos na sequência específica de peptídeo ou polipeptídeo, depois do alinhamento das sequências e introduzindo lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, BLAST, BLAST- 2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR).

[0035] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas inespecíficas que expressam FcRs (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e subsequentemente causa lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcγRIII apenas, enquanto os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3, na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457- 492.

[0036] O termo "fagocitose celular dependente de anticorpos" e "ADCP" se referem a um processo pelo qual as células revestidas por anticorpos são internalizadas, no todo ou em parte, por células imunes fagocíticas (por exemplo, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas) que se ligam a uma região Fc de imunoglobulina.

[0037] O termo "função (s) efetora (s) de anticorpo" ou "função efetora", conforme usado aqui, refere-se a uma função contribuída por um domínio (s) efetor (es) de Fc de uma IgG (por exemplo, a região Fc de uma imunoglobulina). Essa função pode ser efetuada, por exemplo, pela ligação de um domínio (s) efetor (es) Fc a um receptor Fc em uma célula imune com atividade fagocítica ou lítica ou pela ligação de um domínio (s) efetor (es) Fc a componentes do sistema complemento. Funções efetoras típicas são ADCC, ADCP e CDC.

[0038] “C1q" é um polipeptídeo que inclui um sítio de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. C1q, junto com duas proteases de serina, C1r e C1s, forma o complexo C1, o primeiro componente da rota de citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0039] A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários delas podem ser divididas ainda em subclasses (isotipos), como, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ e µ, respectivamente.

[0040] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, se refere a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessário, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[0041] O termo "câncer", conforme usado aqui, pode ser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioloalviolares, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele com carcinoma pancreático avançado, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma da colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma de pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimônios, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas espinocelulares,

adenoma hipofisário, linfoma, leucemia linfocítica, incluindo versões refratárias qualquer um dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima. Descrição Detalhada da Invenção

[0042] A presente invenção atende à necessidade de fornecer mABs CD40 agonísticos que exibam uma toxicidade celular reduzida, levando a menos efeitos colaterais clínicos, enquanto sua potência de sinalização e eficácia clínica são pelo menos mantidas, se não aumentadas, em comparação com os anticorpos CD40 agonísticos da técnica anterior.

[0043] Os anticorpos ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, proporcionam essas propriedades vantajosas, pois são capazes de se ligar especificamente ao receptor CD40 humano e de induzir a sinalização do CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ.

[0044] Em modalidades preferidas, os anticorpos de acordo com a invenção são anticorpos IgG1LALA humanizados, anticorpos do tipo IgG1 humanizados, possuindo pelo menos dois aminoácidos alanina nas posições 234 e 235 da região Fc1 humana. Assim, de acordo com uma modalidade preferida, uma IgG1LALA compreende a mutação L234A e L235A da região Fc1 humana.

[0045] Ainda preferido é que os anticorpos de acordo com a invenção sejam moléculas recombinantes.

[0046] É fornecido pela presente invenção que um anticorpo monoclonal agonístico, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seja capaz de se ligar ao receptor CD40 humano e induzir a sinalização CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ (ver também Exemplo 5, Figura 6 e texto abaixo). Além disso, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode exibir capacidade de sinalização reduzida ou esgotada através do receptor

Fcγ humano quando comparado com a sinalização do receptor Fcγ da IgG do tipo selvagem ou com a sinalização Fcγ dos anticorpos da técnica anterior.

[0047] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais agonísticos CD40 da invenção, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, podem exibir uma afinidade reduzida ou esgotada para os receptores Fcγ humanos em comparação com o Fcγ da IgG de tipo selvagem. De acordo com uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção não se ligam aos receptores Fcγ - correspondentemente os anticorpos da invenção não acionam a reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ.

[0048] Numa modalidade preferida, os anticorpos da presente invenção compreendem pelo menos substituições de aminoácidos em L234A e L235A da região Fc de IgG1 humana ou S228P e L235E da região Fc de IgG4 humana.

[0049] É ainda preferido para a presente invenção que os anticorpos se liguem a um epitopo de CD40 que se sobreponha com o sítio de ligação de CD40L. As Figuras 3 e 16 demonstram essa sobreposição de epítopos para os anticorpos humanizados anti-CD40 IgG1-LALA testados. Também preferido é que os anticorpos CD40 compitam com CD40L pela ligação ao receptor CD40. Nos ensaios de competição de epítopos, os anticorpos da invenção competem, portanto, com CD40L. Tais ensaios são descritos nos Exemplos 3 e 11 e os resultados de experiências com anticorpos da invenção estão representados nas Figuras 3 e 16. Assim, de acordo com uma outra modalidade preferida, os anticorpos da invenção inibem a ligação de CD40L ao receptor de CD40. A Figura 19 demonstra que os anticorpos da invenção não competem com CP-870.893 pela ligação a CD40.

[0050] Os anticorpos de acordo com a invenção possuem uma atividade de ligação muito alta ao receptor CD40. Portanto, em um ensaio de ligação celular, conforme descrito no Exemplo 1, os anticorpos de acordo com a invenção exibem uma atividade de ligação com uma EC50 de no máximo 49,5 ng/ml. De preferência, a EC50 é menor que 25 ng/ml, mais preferencialmente menor que 15 ng/ml, menor que 9 ng/ml, 7 ng/ml, 6 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml. Mais preferido, a EC50 é de 3 ng/ml em um ensaio de ligação celular, como descrito no Exemplo 1 e como mostrado na Figura 1.

[0051] Os anticorpos anti-CD40 agonísticos humanizados de acordo com a invenção podem ser caracterizados por afinidades bioquímicas para a proteína trimérica CD40 solúvel de humanos ou de macacos cinomolgos (cf. Exemplo 13; Figura 18). Os anticorpos da invenção podem mostrar valores de KD iguais ou menores que 15,7 nM para CD40 humano. Os anticorpos da invenção podem ser reativos cruzados com a proteína CD40 de macaco cinomolgos com um valor de KD igual ou menor que 10,3 nM.

[0052] Além disso, os anticorpos da presente invenção são capazes de induzir a sinalização celular de NF-κB com alta potência. Um resumo das experiências (cf. Exemplo 2) está representado na Figura 2, mostrando valores de ligação de EC50 variando de 1127 a 6243 ng/ml. Os valores de EC50 demonstram a grande potência dos anticorpos para induzir a sinalização de NF-kB.

[0053] Também será compreendido que os anticorpos da invenção podem se ligar ao macaco cinomolgos -CD40. A atividade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados ao macaco cinomolgos (Macaca fascicularis) é mostrada em experiências ELISA usando a proteína recombinante CD40 recombinante de macaco cinomolgos (cf. Exemplo 4). Os valores de EC50 mostrados na Figura 4 indicam uma ligação potente dos anticorpos.

[0054] Outra característica dos anticorpos da presente invenção é que eles podem ativar APCs humanas. Por exemplo, os anticorpos podem ativar células selecionadas do grupo que compreende células dendríticas (DCs), células B, monócitos e células mieloides. De preferência, os anticorpos ativam DCs.

[0055] Esta potente atividade agonística de CD40 na ativação de APCs não é devida à reticulação mediada pelo receptor Fcƴ das proteínas CD40 (cf. resultados de experiências mostradas nas Figura 5, 6 e 7 e descritas no Exemplo 5).

[0056] Como tal, em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção induzem a liberação de IL-12p40 em um ensaio de maturação de células dendríticas, como descrito no Exemplo 5. Os resultados de experiências conduzidas com os anticorpos da presente invenção em tal ensaio são mostrados nas Figuras 5 a 7.

[0057] De acordo com uma outra modalidade preferida, os anticorpos da invenção induzem a maturação das células apresentadoras de antígeno, conforme determinado pela liberação de IL12p70, que é pelo menos igual à liberação induzida por estimulação com o anticorpo CP-870,893-IgG2 e com um valor de EC50 igual a ou menor que 208 ng/ml (Figura 12 e 14). Além disso, os anticorpos da invenção induzem a maturação das células apresentadoras de antígeno, conforme determinado pela indução de CD86 em pelo menos 7,5 vezes e com uma EC50 igual ou inferior a 148 ng / ml (Figura 11 e 13).

[0058] De preferência, os anticorpos induzem uma liberação de IL12p40 a partir de DCs derivados de monócitos que é pelo menos igual à liberação induzida por estimulação com o anticorpo CP-870.893-IgG2 (cf. Figura6). Como dito anteriormente, esse potencial para induzir a maturação de DC não se deve à sinalização via receptores Fc. Os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados da invenção induzem potentemente a ativação de células dendríticas derivadas de monócitos de maneira independente do receptor Fcƴ (ver

Exemplo 5 e Figura 6). A Figura 6 demonstra que os níveis de liberação de IL12p40 induzidos pelas variantes CP-870.893 se correlacionam com a capacidade das variantes de se ligarem aos receptores Fc (IgG1- LALA <IgG2 <IgG1 <IgG1-V11). Surpreendentemente, a estimulação por anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados da invenção resultou em níveis de secreção de IL12p40 independentes de Fc que cobriram e até excederam o intervalo gerado com as variantes CP-870,893. Assim, os anticorpos anti-CD40 da invenção proporcionam atividade agonística potente em células dendríticas primárias derivadas de monócitos, sem reticulação mediada pelo receptor Fc receptor de proteínas CD40.

[0059] Além disso, os anticorpos da presente invenção são muito específicos na sua ativação. Eles não induzem uma liberação geral de citocinas inflamatórias, como TNF-alfa (c.f. Exemplo 6 e Figura 8).

[0060] Outra característica dos anticorpos da presente invenção é a depuração reduzida de anticorpos da superfície celular. Sabe-se que o CP-870.893 internaliza após a ligação ao receptor CD40 nas células. Estudos clínicos mostraram que o CP-870.893 é eliminado da circulação em pacientes rapidamente, com uma meia-vida estimada em menos de 6 horas, refletindo um grande coletor de receptores de CD40 em pacientes que podem ser causados por internalização celular (Rüter et al 2010).

[0061] Os anticorpos da invenção são retidos na superfície celular em condições que permitem endocitose e internalização (c.f. Exemplo 7 e Figura 9). Por outro lado, as variantes CP-870.893 não são retidas na superfície da célula sob condições que permitem endocitose e internalização (Figura 9).

[0062] Será apreciado que os anticorpos de acordo com a invenção tenham um efeito indireto (mediado por imunidade) na morte de células tumorais. Assim, os anticorpos exibem um efeito citotóxico mediado por células imunes indiretas nas células tumorais.

[0063] Em uma modalidade específica, os anticorpos de acordo com a invenção não resultam na depleção de células imunes que expressam CD40 por mecanismos de ADCC, ADCP ou CDC.

[0064] Assim, em resumo, os anticorpos da invenção podem ser ainda caracterizados por

[0065] (a) nenhuma ligação ao receptor Fcγ;

[0066] (b) ter uma afinidade de ligação a células CD40 com um valor de EC50 igual ou menor que cerca de 49,5 ng/ml;

[0067] c) ter valores de KD iguais ou menores que cerca de 15,7 nM;

[0068] (d) ser reativo cruzado a CD40 do macaco cinomolgos com um valor de KD igual ou menor que cerca de 10,3 nM;

[0069] (e) inibindo a ligação de CD40L à CD40;

[0070] (f) evitar efeitos sinérgicos e aditivos de funções mediadas por CD40L;

[0071] (g) induzindo a maturação das células apresentadoras de antígeno, conforme determinado pela liberação de IL12p70, que é pelo menos igual à liberação induzida por estimulação com o anticorpo CP- 870,893-IgG2 e com um valor de EC50 igual a ou menor que 208 ng/ml

[0072] e/ou conforme determinado pela indução de CD86 em células dendríticas em pelo menos 7,5 vezes e com uma EC50 igual ou menor que 148 ng/ml; e/ou

[0073] (h) reduzir o nível de CD40 na superfície celular em menor extensão do que CP-870.893.

[0074] De acordo com uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são caracterizados por ter pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito ou todas as propriedades acima (a - h).

[0075] Devido às propriedades favoráveis dos anticorpos da invenção, eles são capazes de inibir o crescimento de tumores humanos.

[0076] Em certas modalidades, um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma região VH selecionada do grupo de regiões VH compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1H da SEQ ID NO: 29 + n, uma região CDR2H da SEQ ID NO: 43 + n e uma região CDR3H da SEQ ID NO: 57 + n, em que n é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13, e uma região VL selecionada do grupo de regiões VL compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1L da SEQ ID NO: 71 + m, uma região CDR2L da SEQ ID NO: 85 + m e uma região CDR3L da SEQ ID NO: 99 + m, em que m é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13 e em que as CDRs podem compreender qualquer uma ou mais mutações de aminoácidos que não diminuam sua atividade de acordo com a invenção.

[0077] De preferência, um anticorpo compreende uma região VH selecionada do grupo de regiões VH compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1H da SEQ ID NO: 29 + n, uma região CDR2H da SEQ ID NO: 43 + n e uma região CDR3H da SEQ ID NO: 57 + n, em que n é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13, e uma região VL selecionada do grupo de regiões VL compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1L da SEQ ID NO: 71 + m, uma região CDR2L da SEQ ID NO: 85 + m e uma região CDR3L da SEQ ID NO: 99 + m, em que m é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13.

[0078] Em certas modalidades, um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma região VH selecionada do grupo de regiões VH compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1H da SEQ ID NO: 29 + n, uma região

CDR2H da SEQ ID NO: 43 + n e uma região CDR3H da SEQ ID NO: 57 + m, e uma região VL selecionada do grupo de regiões VL compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1L da SEQ ID NO: 71 + n, uma região CDR2L da SEQ ID NO: 85 + n e uma região CDR3L da SEQ ID NO: 99 + n, em que n é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13 e em que as CDRs podem compreender qualquer uma ou mais mutações de aminoácidos que não diminuam sua atividade de acordo com a invenção.

[0079] De preferência, as CDRs têm uma identidade de sequência para suas respectivas SEQ ID NOs de pelo menos 91%, preferencialmente 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

[0080] Em outra modalidade, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a invenção compreendem uma região variável da cadeia pesada (VH) que é pelo menos 60% idêntica, preferencialmente pelo menos 70% idêntica, com mais preferência pelo menos 80% idêntica, com mais preferência pelo menos 85 % idêntica a uma região VH selecionada do grupo que consiste em regiões VH da SEQ ID NO: 1 a 14.

[0081] De preferência, os ditos anticorpos compreendem uma sequência de região variável de cadeia pesada (VH) com, pelo menos, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecionados do grupo das sequências VH da SEQ ID NO: 1 a 14.

[0082] Em certas modalidades, uma sequência de VH com, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, pelo o qual o anticorpo retém a capacidade de se ligar especificamente de acordo com a invenção ao respectivo antígeno.

[0083] A presente invenção também abrange um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo da SEQ ID NO: 1 a 14.

[0084] De preferência, a sequência da região variável da cadeia pesada (VH) é SEQ ID NO:1, alternativamente SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14.

[0085] A presente invenção também se refere a um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VL) que é pelo menos 60% idêntica, preferencialmente pelo menos 70% idêntica, com mais preferência pelo menos 80% idêntica, com mais preferência pelo menos 85 % idêntica a uma região VL selecionada do grupo que consiste em regiões VL da SEQ ID NO: 15 a 28.

[0086] De preferência, os ditos anticorpos compreendem uma sequência VL com, pelo menos, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos selecionados do grupo das sequências VL da SEQ ID NO: 15 a 28.

[0087] Em certas modalidades, uma sequência de VL com, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, pelo o qual o anticorpo retém a capacidade de se ligar especificamente de acordo com a invenção ao respectivo antígeno.

[0088] A presente invenção também abrange um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo da SEQ ID NO: 15 a 28.

[0089] De preferência, a sequência da região variável da cadeia leve (VL) é SEQ ID NO:15, alternativamente SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:28.

[0090] Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou suprimidos nas ditas sequências VL. Em outras modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou suprimidos nas ditas sequências VH. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou suprimidos em casa uma das ditas sequências VH ou VL. As ditas substituições, inserções ou deleções podem ocorrer em regiões fora das CDRs (isto é, nas FRs).

[0091] A invenção também compreende anticorpos amadurecidos por afinidade que podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992) descrevem a maturação de afinidade por embaralhamento do domínio VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 1 55:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 1 54(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) e WO2010/108127.

[0092] A presente invenção também engloba um anticorpo que compreende uma região VH e uma região VL compreendendo as respectivas regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo selecionado do grupo que compreende os anticorpos listados na Figura 10, isto é,

compreendendo os anticorpos MAB-16-0283, MAB-16-0377, MAB-16- 0267, MAB-16-0386, MAB-16-0451, MAB-16-0346, MAB-16-0325, MAB-16-0388, MAB-16-0464, MAB-16-0262, MAB-16-0406, MAB-16- 0484, MAB-16-0400, MAB-16-0489.

[0093] A presente invenção também engloba um anticorpo que compreende a SEQ ID NO.: 1 e 15, ou SEQ ID NO.: 2 e 16. Um anticorpo de acordo com a invenção pode também compreender SEQ ID NO.: 3 e 17, ou SEQ ID NO.: 4 e 18, ou SEQ ID NO.: 5 e 19, ou SEQ ID NO.: 6 e 20, ou SEQ ID NO.: 7 e 21, ou SEQ ID NO.: 8 e 22, ou SEQ ID NO.: 9 e 23, ou SEQ ID NO.: 10 e 24, ou SEQ ID NO.: 11 e 25, ou SEQ ID NO.: 12 e 26. Alternativamente, um anticorpo de acordo com a invenção compreende SEQ ID NO.: 13 e 27, ou SEQ ID NO.: 14 e 28.

[0094] Em outro aspecto, os anticorpos da invenção são para uso no tratamento de pacientes que sofrem de câncer.

[0095] O referido câncer pode ser um ou mais dos tipos de câncer selecionados do grupo que compreende câncer de pâncreas, câncer de pulmão de carcinoma pancreático avançado, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioloalviolares, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de rim, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de glândula salivar ou câncer uterino.

[0096] Em certas modalidades, o câncer é um tumor sólido.

[0097] Também é possível em algumas modalidades, que o câncer seja um câncer que expressa CD40. No entanto, isto não é necessário para o funcionamento eficaz dos anticorpos da invenção.

[0098] Será ainda apreciado que o anticorpo da invenção pode ser usado como um único tratamento para câncer em um paciente ou como parte de um tratamento combinado (cujo tratamento adicional pode ser um agente citotóxico ou citostático farmacêutico, radioterapia, terapia direcionada e/ou cirurgia).

[0099] Assim, o paciente também pode receber um ou mais tratamentos adicionais para o câncer, por exemplo, agentes farmacêuticos (como agentes citotóxicos ou citostáticos, terapia direcionada), radioterapia e/ou cirurgia.

[0100] Assim, em algumas modalidades, o anticorpo de acordo com a invenção é usado no tratamento de câncer em combinação com agentes citotóxicos ou citostáticos, radioterapia, terapia direcionada e/ou imunoterapia.

[0101] Os anticorpos da invenção também podem ser usados no tratamento de pacientes que respondem insuficientemente e/ou resistem a agentes citotóxicos ou citostáticos, radioterapia, terapia direcionada e/ou terapia imunológica.

[0102] A referida radioterapia pode ser selecionada do grupo que compreende radioterapia por feixe externo, braquiterapia de raios-X por contato, braquiterapia, radioisótopo sistêmico ou radioterapia intraoperatória.

[0103] Os agentes anticancerígenos citotóxicos ou citostáticos de acordo com a invenção podem ser do grupo compreendendo taxanos, antraciclinas, agentes alquilantes, inibidores de histona desacetilase, inibidores de topoisomerase, inibidores de quinase, inibidores de quinase, análogos de nucleotídeos, antibióticos peptídicos e agentes à base de platina.

[0104] De preferência, os agentes anticâncer direcionados são usadodos em terapia direcionada e selecionados dentre um dos seguintes, ou combinações dos mesmos: compostos anti-EGFR, como cetuximabe, gefitinibe, erlotinibe, lapatinibe, panitumumabe, compostos anti-HER2, como trastuzumabe, ado-trastuzumabe entansina, pertuzumabe, compostos direcionados ao VEGF, como bevacizumabe, aflibercept e pegaptanibe e inibidores de tirosina quinase como sunitinibe, pazopanibe, axitinibe, vandetanibe, cabozantinibe e regorafinibe.

[0105] Caso os pacientes estejam recebendo terapia imunológica, isso pode ser uma inibição do ponto de verificação imune e um ou mais inibidores do ponto de verificação imune podem ser usados. O um ou mais inibidores do ponto de verificação imune podem ser selecionados do grupo compreendendo anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti- CD137, anti-LAG-3, anti-TIM-3, anti-OX40 e/ou anti-GITR.

[0106] O anticorpo de acordo com a invenção também pode ser usado em combinação com um anticorpo que se liga especificamente a PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, CD137, OX40, GITR e/ou em combinação com o fármaco Nivolumabe, Pembrolizumabe, Urelumabe, Utomilumabe, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe, Tremelimumabe, Ipilimumabe.

[0107] Em algumas modalidades de acordo com a invenção, o anticorpo é usado no tratamento de câncer em um regime de dosagem semanal a mensal.

[0108] Uma das vantagens especiais desta invenção é que, devido a suas mutações na região Fc, os anticorpos exibem menos dose ou toxicidade limitadora de tratamento, em comparação com os anticorpos da técnica anterior. Os anticorpos provocam os efeitos colaterais típicos dos anticorpos CD40, se houver algum, apenas em extensão muito limitada. Tais efeitos colaterais são condições selecionadas do grupo compreendendo a síndrome de liberação de citocinas, trombose, embolia cerebral, elevações das transaminases, linfopenia, fadiga, neuropatia periférica, alopecia, constipação, náusea e neutropenia.

[0109] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuti- camente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com a invenção.

[0110] A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser usada no tratamento de pacientes que sofrem de câncer. Esse tipo de câncer pode ser um tumor sólido. O câncer pode ser ainda selecionado do grupo compreendendo câncer de pâncreas, câncer de pulmão de carcinoma pancreático avançado, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioloalviolares, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de rim, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de glândula salivar ou câncer uterino.

[0111] A composição também pode ser usada no tratamento de câncer em combinação com quimioterapia, radioterapia, terapia direcionada e/ ou imunoterapia. A referida imunoterapia pode ser uma inibição do ponto de verificação imune.

[0112] Os pacientes tratados com a referida composição podem responder insuficientemente e/ou resistir à quimioterapia, radioterapia, terapia direcionada e/ou terapia imunológica.

[0113] A composição farmacêutica de acordo com a invenção também pode ser usada no tratamento de câncer em combinação com um ou mais compostos anticâncer citotóxicos, citostáticos ou direcionados.

[0114] Ele pode ser usado no tratamento do câncer em combinação com um ou mais inibidores do ponto de verificação imune, em que tais inibidores do ponto de verificação imune podem ser selecionados do grupo compreendendo anti-PD-L1, anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-CD137, anti-LAG-3, anti-TIM-3, anti-OX40 e/ou anti-GITR.

[0115] A composição também pode ser usada em combinação com um anticorpo que se liga especificamente a PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, CD137, OX40, GITR e/ou em combinação com o fármaco Nivolumabe, Pembrolizumabe, Urelumabe, Utomilumabe, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe, Tremelimumabe, Ipilimumabe.

[0116] Também pode ser usada no tratamento do câncer em um regime de dosagem semanal a mensal.

[0117] Será particularmente apreciado pelos pacientes que o anticorpo e a composição de acordo com a invenção exibem qualquer dose ou toxicidade limitadora de tratamento, se for o caso, apenas com extensão muito limitada e, principalmente, com extensão menor do que os anticorpos e composições da técnica anterior.

[0118] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a métodos de tratamento, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com a invenção a indivíduos necessitados. Tais indivíduos podem ser pacientes que sofrem de câncer. Assim, a presente invenção também se refere a métodos de tratamento de câncer, em que o câncer pode ser um tumor sólido.

[0119] A etapa de administração a um indivíduo em necessidade do mesmo pode compreender a administração local, por exemplo, administração local a um tumor em um paciente (por exemplo, intra- tumoral ou peri-tumoral).

[0120] Como os agentes baseados em anticorpos da invenção são adequados para uso no tratamento de qualquer tipo de câncer para o qual a ativação do CD40 possa proporcionar um benefício terapêutico, os métodos que compreendem a administração dos referidos anticorpos também são adequados para o tratamento de qualquer tipo de câncer para cuja ativação do CD40 pode fornecer um benefício terapêutico.

[0121] Por exemplo, o câncer pode ser selecionado do grupo que consiste em: câncer de próstata; câncer de mama; câncer colorretal; câncer de pâncreas; câncer de ovário; câncer de pulmão; câncer cervical; rabdomiossarcoma; neuroblastoma; mieloma múltiplo; leucemia, leucemia linfoblástica aguda, melanoma, câncer de bexiga e glioblastoma.

[0122] Será ainda apreciado que os métodos de tratamento de acordo com a invenção podem compreender uma administração única de agentes a base de anticorpos da invenção para um paciente ou como parte de um tratamento combinado (cujo tratamento adicional pode ser um agente citotóxico ou citostático farmacêutico, radioterapia, terapia direcionada e/ou cirurgia).

[0123] De fato, todas as características e propriedades favoráveis dos anticorpos da invenção, como detalhado acima, também são refletidas e compreendidas nos métodos de tratamento e usos dos anticorpos de acordo com a invenção. Exemplos

[0124] Os exemplos a seguir são usados em conjunto com as figuras e tabelas para ilustrar a invenção. Exemplo 1: Ligação da célula dos anticorpos anti-CD40

[0125] Para determinar a potência dos anticorpos monoclonais anti- CD40 IgG1-LALA humanizados na ligação ao CD40 expresso em células, as células HEK-Blue-CD40L™ (InvivoGen) foram semeadas em 25 µl de DMEM contendo 10% de FBS a uma densidade celular de 1000 células/poço em uma placa de 384 poços de fundo transparente tratada com cultura de células. Os anticorpos foram adicionados a concentrações finais variando de 1,25 µg/ml a 0,01 ng/ml em 5 µl de meio. Após 24 h, as células foram lavadas três vezes com 25 µl de tampão de lavagem (PBS, Tween a 0,05%) antes da adição de IgG humano anti-cabra conjugado com Alexa-Fluor-488 (Jackson Laboratories) a uma concentração de 0,8 µg/ml em 20 µl de meio. Quatro horas depois, foram adicionados 5 µl de corante Hoechst em meio até uma concentração final de 5 µg/ml. Os sinais de ligação às células fluorescentes foram medidos usando um gerador de imagens de alto conteúdo automatizado CellInsight (Thermo Fisher Scientific). As curvas de ajuste e o cálculo de EC50 foram obtidos usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). A Figura 1 resume os valores de ligação à EC50 variando de 3 a 49,5 ng/ml. Exemplo 2: Indução de sinalização celular de NF-kB por anticorpos agonistas anti-CD40

[0126] A atividade agonística dos anticorpos monoclonais anti- CD40 IgG1-LALA humanizados foi testada por estimulação de células HEK-Blue-CD40L™ (InvivoGen) que abrigam uma construção do gene da fosfatase alcalina embrionária secreta (SEAP) induzível por NF-kB. 25000 células/poço em 20 µl de DMEM contendo 10% FBS foram semeadas em uma placa de 384 poços de fundo transparente tratada com cultura de células e cultivadas durante a noite. Os anticorpos foram então adicionados num volume de 5 µl de meio a concentrações finais variando de 20 a 0,013 µg/ml. Após 6 horas de incubação a 37 °C e 5% CO2, 5 µl de sobrenadante de meio de cada poço foram transferidos para uma placa de 384 poços branca de fundo transparente contendo 20 µl de 2x reagente QUANTI-Blue™ (InvivoGen). Após incubação durante uma hora a 37 °C e 5% CO2, a densidade ópti ca com um comprimento de onda de 620 foi medida refletindo a ativação dependente de NF-kB da secreção de fosfatase. As curvas de ajuste e o cálculo de EC50 foram obtidos usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). Os valores de EC50 na Figura 2 indicam a potência dos anticorpos anti-CD40 para induzir a sinalização de NF-kB na linhagem celular HEK-Blue-CD40L™.

Exemplo 3: Competição com ligação de CD40L

[0127] A competição de anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1- LALA humanizados com ligação de CD40L a CD40 foi testada usando um ensaio ELISA. O CD40L foi revestido à superfície de uma placa de 384 poços Nunc™ MaxiSorp™ em um volume de 25 µl de PBS e a uma concentração de 1 µg/ml por uma hora à temperatura ambiente. Os anticorpos foram pré-incubados a uma concentração de 5 µg/ml com proteína CD40 recombinante a uma concentração de 1,7 µg/ml em um volume total de 40 µl por 1,5 horas à temperatura ambiente em tampão ELISA (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween). A placa Nunc™ MaxiSorp™ foi lavada três vezes com tampão de lavagem (PBS, 0,1% Tween) e bloqueada por uma hora em temperatura ambiente com PBS, 2% BSA, 0,05% Tween. Após três lavagens em tampão de lavagem, 25 µl do complexo anticorpo-CD40 foram adicionados aos poços da placa Nunc™ MaxiSorp™ e incubados por uma hora à temperatura ambiente. Após 3 lavagens em tampão de lavagem, os poços foram incubados com 25 µl de uma diluição de 1:2000 de fragmento F(ab)2 específico de espécies ligado a peroxidase anti-humana de cabra (AbD Serotec) em tampão ELISA por uma hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados seis vezes com tampão de lavagem e foram adicionados 30 µl/poço de solução de substrato TMB (Invitrogen). Após 10 minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 30 µl de solução de bloqueio (1M HCl) por poço e a absorvância nos comprimentos de onda de 450 e 620 nm foi medida usando um leitor de microplacas Tecan M1000. O sinal ELISA para amostras incubadas com CP-870.893 indica a falta de competição com CD40L, enquanto os anticorpos monoclonais anti- CD40 IgG1-LALA humanizados de acordo com a invenção competem com a ligação de CD40L a CD40 (ver Figura 3). Exemplo 4: Atividade de ligação de CD40 do macaco cinomolgos

[0128] A ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados à proteína CD40 do macaco cinomolgos foi testada em um ELISA bioquímico. A proteína cyno-CD40 recombinante (Acro Biosystems) foi incubada em uma placa de 384 poços Nunc™ MaxiSorp™ a uma concentração de 0,5 µg/ml em PBS por uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com tampão de lavagem (PBS, 0,1% Tween), as placas foram bloqueadas com PBS, 2% BSA, 0,05% Tween por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas novamente três vezes com tampão de lavagem e anticorpos em concentrações variando de 500 a 0,03 ng/ml em PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Após 3 lavagens em tampão de lavagem, os poços foram incubados com 12,5 µl de uma diluição de 1:3000 de fragmento F(ab)2 específico de espécies ligado a peroxidase anti-humana de cabra (AbD Serotec) em tampão ELISA por uma hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados seis vezes com tampão de lavagem e foram adicionados 15 µl/poço de solução de substrato TMB (Invitrogen). Após 10 minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 15 µl de solução de bloqueio (1M HCl) por poço e a absorvância nos comprimentos de onda de 450 e 620 nm foi medida usando um leitor de microplacas Tecan M1000. As curvas de ajuste e o cálculo de EC50 foram obtidos usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). Como mostrado na Figura 4, a maioria dos anticorpos se liga ao cyno-CD40 com valores de EC50 entre 8 e 31,8 ng/ml. Exemplo 5: Indução de maturação de célula dendrítica

[0129] Células dendríticas derivadas de monócitos foram geradas para testar a capacidade de anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1- LALA humanizados para estimular a maturação de células dendríticas, medida pela secreção da citocina IL12p40. Preparações de revestimento buffy coat humano de diferentes doadores foram usadas para diferenciar células dendríticas de monócitos in vitro. O revestimento buffy recebido da Cruz Vermelha da Baviera foi diluído 1:4 com DPBS e aplicado em camadas nos gradientes de densidade Ficoll- Paque (GE Healthcare). Após centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico em interfase (CMSPs) foram lavadas três vezes com DPBS e os monócitos foram isolados usando MicroBeads CD14 magnético (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante. Os monócitos foram cultivados em RPMI-1640 contendo 10% FCS, 1xPen/Strep, 1x L-Glutamina, 50 ng/ml de GM-CSF humano recombinante (R&D Sytems) e 10 ng/ml de IL-4 humano recombinante (R&D Systems) a densidade celular de 1,2x106 células /ml em frascos de cultura de células T-175. A cada 48 horas, 90% do meio foi substituído por meio fresco contendo citocina. No dia cinco, as células dendríticas imaturas (iDCs) diferenciadas in vitro foram colhidas e distribuídas para uma placa de 96 poços de cultura de células a uma densidade celular de 106 células/ml em 100 µl do mesmo meio.

[0130] Em um experimento, as iDCs foram estimuladas pela adição de anticorpos anti-CD40 a uma concentração de 5 µg/ml. 48 horas após a estimulação, a citocina IL12p40 secretada foi quantificada no sobrenadante médio usando um kit ELISA disponível no mercado (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 5 mostra que os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados estimularam a liberação de IL12p40 pelas células dendríticas derivadas de monócitos em diferentes extensões, variando de menos de 1 ng/ml a mais de 24 ng/ml, enquanto um anticorpo IgG1-LALA de controle não ligado a CD40 não levou à estimulação de níveis detectáveis de IL12p40.

[0131] Os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados da invenção não são capazes de se ligar a receptores Fcϒ que são expressados em células dendríticas derivadas de monócitos.

Para comparar estes anticorpos com anticorpos que abrigam diferentes atividades de ligação ao receptor Fcϒ, construímos anticorpos CP-

870.893 anti-CD40 de referência contendo partes Fc de IgG1, IgG1- LALA, IgG2 e IgG1-V11 humanas e células dendríticas derivadas de monócitos estimuladas com diferentes concentrações desses anticorpos. A forma IgG1-V11 abriga quatro mutações (G237D, H268D, P271G, A330R) na parte Fc da cadeia pesada. Essas mutações foram descritas para aumentar seletivamente a afinidade com o receptor Fcϒ RIIB (Mimoto et al. 2013). A Figura 6 demonstra que as variantes de CP-

870.893 estimulam a liberação de IL12p40 de maneira dependente de Fc (IgG1-LALA <IgG2 <IgG1 <IgG1-V11). Surpreendentemente, a estimulação por anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados da invenção resultou em níveis de secreção de IL12p40 independentes de Fc que cobriram e até excederam o intervalo gerado com as variantes CP-870,893. Os anticorpos anti-CD40 da invenção proporcionam atividade agonística potente em células dendríticas primárias derivadas de monócitos, sem reticulação mediada pelo receptor Fcϒ de proteínas CD40.

[0132] Em outra experiência, a potência dos anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados para induzir a secreção de IL12p40 por células dendríticas derivadas de monócitos foi determinada por estimulação com concentrações de anticorpos variando de 0,005 a 10 µg/ml. A Figura 7 mostra que os valores de EC50 para diferentes anticorpos variaram entre 380 e 743 ng/ml. Exemplo 6: Liberação de TNF alfa em um ensaio de CMSPs de alta densidade

[0133] Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados induzem a liberação geral de citocinas nas células sanguíneas, os CMSPs foram estimulados com os anticorpos de acordo com o protocolo de Römer et al. 2011. Os CMSPs foram isolados como descrito anteriormente e cultivados em RPMI-1640 contendo soro AB humano a 10% e 1x aminoácidos não essenciais (NEAA) a uma densidade celular de 1x107 células/ml em um balão de cultura de células T175. Após dois dias, as células foram colhidas e semeadas a uma densidade de 1x106 células/ml em triplicados numa placa de cultura de células de 96 poços. Os anticorpos foram adicionados a uma concentração de 10 µg/ml e incubados com CMSPs por três dias a 37 °C, 5% CO2 e 95% umidade. Como controle positivo , um anticorpo OKT-3 (Abcam) foi incluído nos experimentos. A liberação de TNF-alfa foi quantificada no sobrenadante de cultura de células usando um kit ELISA de TNF-alfa humano disponível comercialmente (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 8 mostra que os anticorpos anti-CD40 da invenção e um anticorpo de controle IgG1- LALA não ligado a CD40 não estimularam a liberação significativa de TNF-alfa por CMSPs, em contraste com o anticorpo OKT-3. Exemplo 7: Ensaio de pulse-chase celular

[0134] A ligação celular e a dinâmica de internalização de anticorpos anti-CD40 foram analisadas em um ensaio de pulse-chase usando células HEK-Blue-CD40L™ (InvivoGen). 2000 células/poço foram semeadas em duas placas pretas de 384 poços com fundo claro em meio DMEM contendo 10% FCS. Após a cultura da noite para o dia, os anticorpos anti-CD40 da invenção e os anticorpos variantes Fc CP- 870,893, como descrito acima, foram adicionados a uma placa a uma concentração de 0,8 µg/ml e incubados por 15 min a 37 °C e 5% CO2. Subsequentemente, ambas as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem celular (PBS 0,05% Tween) e incubadas por uma hora em meio de cultura. Nos últimos 15 minutos, os anticorpos foram adicionados à placa 2 a uma concentração de 0,8 µg/ml. Ambas as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem celular, colocadas em gelo e incubadas com 0,8 µg/ml de anticorpo secundário acoplado Alexa-Fluor-488 anti-humano (Jackson Laboratories) e 5 µg/ml de corante Hoechst (Invitrogen) por 30 minutos no gelo. Os sinais fluorescentes de superfície celular foram quantificados usando um gerador de imagens de alto conteúdo CellInsight (Thermo Fisher Scientific). A Figura 9 mostra que os anticorpos variantes CP-870.893 apresentam sinais de superfície celular fortemente reduzidos após uma hora de incubação em condições que permitem a internalização. Em contraste, a incubação de muitos dos anticorpos anti-CD40 de acordo com a invenção nas mesmas condições resulta em apenas uma pequena redução dos sinais da superfície celular, indicando taxas limitadas de internalização. Exemplo 8: Correlação da indução do gene-repórter e atividade de maturação de células dendríticas de anticorpos anti-CD40 humanizados

[0135] Ensaios de maturação de gene-repórter celular (HEK-Blue- CD40LTM) e célula dendrítica (DC) foram realizados como descrito nos exemplos 2 e 5, respectivamente. Os anticorpos foram usados a 5 µg/ml para o ensaio de DC e a concentrações variando de 13 a 20000 ng/ml no ensaio de gene-repórter HEK-Blue-CD40L™. A Figura 10 compara a indução máxima observada no ensaio de gene-repórter com a liberação de citocina IL12p40 pelas DCs após estimulação com 5 µg/ml dos anticorpos. Enquanto todos os 88 anticorpos humanizados anti-CD40- IgG1-LALA induzem a expressão de genes-repórter a extensões similares, alguns anticorpos mostram uma estimulação muito alta da liberação de IL12p40 pelas DCs. As células HEK-Blue-CD40L™ não expressam os receptores Fc. O ensaio está capturando atividades agonísticas básicas de anticorpos CD40, independentemente da ligação ao receptor Fc. As DCs expressam receptores Fc e atividades agonísticas de anticorpos anti-CD40, como CP-870.893, são dependentes da ligação ao receptor Fc (Exemplo 5). No entanto,

enquanto a maioria dos 88 anticorpos IgG1-LALA não possui forte ativação de DCs, uma fração menor pode induzir uma ativação muito forte de DCs sem reticulação mediada pelo receptor Fc. Portanto, um anticorpo anti-CD40 altamente agonístico, cuja atividade nas células dendríticas primárias é independente da reticulação do receptor Fc, é um caso raro e a identificação requer a triagem de um grande número de anticorpos candidatos com atividades agonísticas básicas. Exemplo 9: Estimulação de receptores coestimulatórios e liberação de citocinas em células dendríticas por anticorpos agonísticos anti-CD40

[0136] a. Para testar a atividade de anticorpos humanizados e agonísticos anti-CD40 lgG1-LALA na estimulação da expressão do receptor co-estimulatório e liberação de citocinas inflamatórias por DCs, as DCs imaturas derivadas de monócitos (iDCs) foram geradas a partir de três doadores independentes, conforme descrito nos Exemplos 5. As iDCs foram tratadas com os anticorpos a uma concentração de 2 µg/ml ou CD40L (R&D Systems 6245-CL-050) a 20 µg/ml por 48 h. As DCs maduras estimuladas foram colhidas, coradas usando anticorpos marcados com fluoróforo contra HLA-DR, CD86, CD80, CD83, CD54 e CD95 (todos da Miltenyi Biotech) e analisadas por citometria de fluxo em um dispositivo BD FACSVerse. A Figura 11 exibe a estimulação da expressão do receptor como dobra de indução sobre o tratamento de controle de anticorpos isotípicos. Os dados demonstram forte indução de receptores coestimulatórios, em particular CD86. O CP-870.893 mostra uma atividade geral mais baixa em comparação com os anticorpos MAB-16-0262, MAB-16-0451, MAB-16-0464 e MAB-16-0406 da invenção. Uma redução adicional da atividade é observada quando uma variante CP-870.893 contendo uma parte constante de lgG1-LALA é usada, confirmando a dependência de ligação ao receptor Fc deste anticorpo.

[0137] b. A Figura 12 mostra os resultados das medições de citocinas nos sobrenadantes das culturas DC, usando um kit de matriz de grânulos citométricos inflamatórios humanos BD (BD # 551811) de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos MAB-16-0262, MAB-16-0451, MAB-16-0464 e MAB-16-0406 da invenção mostram níveis muito altos de liberação de IL-12-p40 e IL-12p70, enquanto outras citocinas, por exemplo, TNF-, IL-1, IL-10 e IL-6 são produzidas e secretadas em uma extensão muito menor. A liberação de IL-12p40 e IL12p70 de DCs tratadas com as variantes lgG2 e lgG1 de CP-870.893 é significativamente menor em comparação com a liberação observada com os anticorpos da invenção. Em experimentos in vitro similares, as iDCs diferenciadas de três doadores independentes foram tratadas com anticorpos anti-CD40 agonísticos por 48 horas em concentrações variando de 10000 a 5 ng/ml. A expressão do receptor e a liberação de citocina foram analisadas como descrito acima. As curvas de ajuste e o cálculo de EC50 foram obtidos usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). Os dados apresentados nas figuras 13 e 14 exemplificam os efeitos dependentes da dose observados em um doador. Resultados de outros dois doadores mostraram efeitos qualitativamente similares. Em resumo, a potência dos anticorpos anti-CD40 humanizados da invenção, conforme determinado pelos valores de EC50, é semelhante à do CP-870.893, enquanto o efeito máximo induzido, em particular na liberação de citocinas IL-12 e na expressão do correceptor, é significativamente maior que o do CP-870.893. Exemplo 10: Estimulação de receptores coestimulatórios em células B por anticorpos agonísticos anti-CD40

[0138] a. A estimulação dos receptores coestimulatórios por anticorpos anti-CD40 IgG1-LALA também foi testada em células B. CMSPs de três doadores diferentes foram isolados do revestimento buffy humano por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll e as células B intocadas foram purificadas por enriquecimento magnético negativo usando um kit de isolamento de células B II (Miltenyi Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. 2x105 células B em 100 µL de RPMI-1640 + 10% soro AB humano foram estimuladas com concentração de anticorpos variando de 500 a 0,2 ng/ml por 48 h. As células B estimuladas foram colhidas, coradas usando anticorpos marcados com fluoróforo contra HLA-DR, CD86 e CD80 (todos da Miltenyi Biotech) e analisadas por citometria de fluxo em um dispositivo FACSVerse BD. A Figura 15 exibe a estimulação dose dependente da expressão do receptor em células B de um doador como dobra de indução sobre o tratamento de controle de anticorpos isotípicos. As curvas de ajuste e o cálculo de EC50 foram obtidos usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). Os resultados demonstram que os anticorpos da invenção também estimulam receptores coestimulatórios nas células B, no entanto, o nível de regulação positiva é mais baixo do que o observado nas DCs. Exemplo 11: Competição de CD40L com anticorpo anti-CD40 ligado ao CD40 nas células

[0139] a. A ligação de anticorpos anti-CD40 da invenção a células HEK-Blue-CD40L™ na presença de CD40L foi testada para verificar se os anticorpos se ligam ao local de ligação de CD40L da superfície celular de CD40. As células HEK-Blue-CD40LTM foram pré-incubadas com anticorpos em sua concentração de ligação a EC90 por 30 minutos a 40 °C. CD40L contendo uma etiqueta Fc de IgG2a de camundongo (AB Biosciences) a uma concentração que varia de 10000 a 9,8 ng/ml e as células foram incubadas durante 60 minutos a 4 °C. Anticorpos anti- CD40 e CD40L ligados ao CD40 expressado por células foram detectados usando lgG anticamundongo conjugada com DyLight 405 secundário e lgG anti-humana conjugada com Alexa Fluor 488 (Jackson Laboratories) e analisados usando o instrumento FACSVerse (BD). A

Figura 16A mostra a ligação estável das concentrações de anti-CD40, exceto por CP-870,893, cujo sinal de ligação ao anticorpo diminui ligeiramente em concentrações mais altas de CD40L. O CD40L se liga às células de uma maneira dependente da dose e o CP-870.893 não interfere significativamente na ligação ao CD40L (Figura 16B). Em contraste, os anticorpos da invenção impedem fortemente a ligação do CD40L ao CD40 expressado por células, indicando que esses anticorpos se ligam ao local de ligação do CD40L do CD40 e bloqueiam o CD40L da ligação do CD40 (Figura 16B). Exemplo 12: Indução da expressão do receptor de morte FasR (CD95) por anticorpos agonísticos de CD40 em combinação com CD40L

[0140] a. Para testar a interferência de CD40L com efeitos mediados por anticorpos anti-CD40 nas células, as células Ramos foram tratadas com CD40L isoladamente ou em combinação com anticorpos anti-CD40 agonísticos. As células Ramos foram semeadas em placas de 96 poços em RPMI contendo 10% FCS a uma densidade celular de 1,25 x 106 células/ml. Os anticorpos foram adicionados aos poços a uma concentração de 10 µg/ml e incubados por 10 minutos a 37 °C, 5% CO2, 95% umidade. CD40L (R&D Systems) foi então adicionado aos poços a uma concentração final de 10 µg/ml e incubado durante a noite a 37 °C, 5% CO2, 95% umidade. As células foram lavadas com DPBS e coradas com um anticorpo marcado com FITC contra CD95 (Miltenyi Biotech). A Figura 17 mostra que a indução de CD95 por CP-870.893 é fortemente aumentada pela adição de CD40L, enquanto o co-tratamento de todos os anticorpos anti-CD40 testados da invenção reduz o efeito de CD40L. Os dados indicam que os anticorpos agonísticos anti-CD40 da invenção que liga a ligação de CD40L a CD40 impedem efeitos sinérgicos e aditivos por CD40L e, portanto, permitem farmacologia controlada e segura.

Exemplo 13: Afinidades de anticorpos humanizados e agonísticos anti-CD40 lgG1-LALA

[0141] a. As afinidades bioquímicas dos anticorpos da invenção foram determinadas por medições de ressonância de plásmon de superfície. Os anticorpos foram imobilizados reversivelmente numa superfície de chip sensor CM5 através de um anticorpo Fc anti-humano. A cinética da interação de anticorpos imobilizados com a proteína monomérica CD40 solúvel humana ou de macaco cinomolgos (Acro Biosystems) foi analisada em um instrumento Biacore T200 SPR. Os dados cinéticos foram determinados usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. A Figura 18 demonstra que os anticorpos MAB-16-0451 e MAB-16-0464 têm um KD de 1,2 e 2,6, enquanto MAB-16-0262 e CP- 870,893 mostram valores de KD de 15,7 ou 8,9, respectivamente. Os valores de KD gerados usando a proteína CD40 de macaco cinomolgos demonstram afinidades similares. Exemplo 14: Ligação de competitividade de anticorpos anti- CD40 para CD40

[0142] Para testar se os anticorpos anti-CD40 humanizados e agonísticos da invenção se ligam a regiões sobrepostas na molécula CD40, foi realizado um ELISA de ligação competitivo. Os anticorpos foram revestidos em placas Maxisorp de 384 poços a uma concentração de 625 ng/ml em PBS por 60 minutos, seguido por uma etapa de bloqueio com PBS, 2% BSA, 0,05% Tween por 70 minutos. Todos os anticorpos foram incubados separadamente a uma concentração de 10 µg/ml em tubos, junto com 330 ng/ml da proteína recombinante CD40 marcada com HIS (Acro Biosystems) e 4 µg/ml de anticorpo de detecção anti-HIS acoplado à peroxidase (Sigma-Aldrich) para 60 minutos em tampão ELISA (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween). A placa foi lavada três vezes com PBS, 0,1% Tween antes da adição das misturas anticorpo/HIS-CD40/anti-HIS-peroxidase aos poços da placa. A placa foi incubada por 60 minutos. Os poços foram lavados seis vezes com PBS, 0,1% Tween e foram adicionados 15 µl/poço de solução de substrato TMB (Invitrogen). A reação foi bloqueada com 15 µl/poço de solução de bloqueio (1M HCl) e a absorvância nos comprimentos de onda de 450 e 620 nm foi medida usando um leitor de microplacas Tecan M1000. A Figura 19 demonstra que os anticorpos da invenção não competem com CP-870.893 pela ligação a CD40. Cada anticorpo, no entanto, compete com qualquer outro anticorpo da invenção, o que demonstra que esses anticorpos se ligam à mesma região no CD40. Importante, uma vez que as atividades agonísticas dos anticorpos da invenção abrangem uma ampla faixa (Exemplos 9 e 10), isso mostra que os parátopos dos anticorpos agonísticos anti-CD40 determinam principalmente a atividade agonística dos anticorpos anti-CD40. Exemplo 15: Função efetora mediada por anticorpo de anticorpos lgG1-LALA anti CD40

[0143] a. Para testar a potência de uma mutação de LALA na parte constante de um anticorpo IgG1 na diminuição da função efetora mediada por anticorpos, por exemplo, ADCC, um ensaio baseado em linhagem celular de células efetoras repórter da Jurkat (Bioensaio de ADCC Promega, # G701A) foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante e usando células HEK-Blue-CD40L™ como células-alvo. 5000 células HEK-Blue-CD40L™ foram semeadas por poço em uma placa de ensaio de 384 poços de fundo plano branco em 25 µL DMEM + 10% FCS e incubadas 20 h a 37 °C, 5% CO2. O meio foi substituído por 8 µl de meio RPMI contendo 4% FCS com baixo nível de IgG, antes que 4000 células efetoras por poço fossem adicionadas em 8 µl do mesmo meio. Finalmente, os anticorpos CP-870.893 anti-CD40, contendo uma parte Fc IgG1 ou IgG1-LALA, foram adicionados em 8 µl de meio em concentrações variando de 10000 a 0,002 ng/ml. A placa foi incubada por 6 h a 37 °C, 5% CO2. A atividade d a luciferase de células efetoras foi medida usando reagentes de ensaio de Luciferase BioGlo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A luminescência foi lida usando um leitor de microplacas Tecan M1000. A dobra de indução foi calculada com a fórmula RLU (tratamento com anticorpo - fundo) / RLU (veículo - fundo). As curvas de ajuste foram obtidas usando Excel (Microsoft) e XLfit (IDBS). A Figura 20 demonstra que a mutação LALA na IgG1 anula a sinalização mediada pelo receptor Fc em células efetoras. Exemplo 16: Segurança da terapia de anticorpo anti-CD40 agonístico em um modelo de camundongo humanizado

[0144] a. Para avaliar a segurança, um modelo de camundongo humanizado com células-tronco foi aplicado. Os camundongos Nod/Scid/ gama (c) (nulo) FcRg -/- não possuem receptores Fc de ativação de camundongo. Portanto, a ligação ao receptor Fc de anticorpos terapêuticos por células imunes humanas não é comprometida pela ligação ao receptor Fc de camundongo neste modelo. Os camundongos foram irradiados sub-letalmente com 1,4 Gy nas primeiras 24 horas após o nascimento. Após 4-6 horas, os camundongos foram enxertados i.v. com 20000 - 50000 células estaminais hematopoiéticas humanas isoladas do sangue do cordão umbilical. 12 semanas após o enxerto, a presença de células imunes humanas foi validada por citometria de fluxo de células sanguíneas periféricas. Camundongos humanizados com sucesso foram injetados uma vez i.v. com 3 µg/g de CP-870.893, MAB-16-0451 ou anticorpo de controle de isotipo. O peso corporal e a temperatura foram medidos antes do tratamento e em diferentes momentos após a injeção do anticorpo (Figura 21). Os dados mostram uma redução significativa na temperatura corporal em 3 de 6 camundongos tratados com CP-870.893 e esses camundongos tiveram que ser sacrificados devido ao comprometimento grave das condições do organismo. Por outro lado,

camundongos tratados com MAB-16-0451 não mostraram efeitos significativos na temperatura corporal, nem houve outros sinais evidentes de condição corporal prejudicada. Isso indica que os anticorpos anti-CD40-IgG1-LALA altamente agonísticos, sem atividade de ligação ao receptor Fc, podem ser aplicados terapeuticamente sem sinais óbvios de toxicidade, enquanto os efeitos tóxicos do anticorpo CP-870,893-IgG2 agonístico menos ativo podem ser demonstrados in vivo neste modelo. Legendas das figuras Figura1: Ligação celular

[0145] Os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA foram testados quanto à ligação ao antígeno CD40 expressado em células HEK-Blue-CD40L™ (InvivoGen). Os valores de EC50 demonstram uma ligação potente dos anticorpos testados. Figura 2: Determinação de EC50 de HEK-Blue na análise de 8 pontos

[0146] A atividade agonística de anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados foi testada em um ensaio repórter de gene NF- kB baseado em células. As células HEK-Blue-CD40L™ (InvivoGen) foram incubadas por 24 horas com diferentes concentrações dos anticorpos. Os valores de EC50 demonstram a potência dos anticorpos para induzir a sinalização de NF-kB. Figura 3: Competição de epitopo ligante a CD40

[0147] Para testar se os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1- LALA humanizados se ligam a um epitopo que se sobrepõe ao local de ligação a CD40L, foi realizado um ELISA de competição por CD40L. Diferentes concentrações de anticorpos anti-CD40 foram pré-incubadas com proteína recombinante CD40 para formar um complexo de ligação. Subsequentemente, o complexo foi adicionado a placas de microtitulação revestidas com CD40L recombinante. Após a lavagem,

os complexos CD40-anti-CD40 ligados foram detectados usando um anticorpo anti-humano F(ad)2 ligado à peroxidase. Os sinais ELISA como para o anticorpo de referência CP-870.893 indicam nenhuma competição com CD40L e, portanto, se ligam a um epitopo distinto do local de ligação a CD40L. Os dados demonstram que os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados testados se ligam a um epitopo que se sobrepõe ao local de ligação ao CD40L. Figura 4: Atividade de ligação de CD40 do macaco cinomolgos

[0148] A atividade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados ao macaco cinomolgos (Macaca fascicularis) foi testada em um ELISA usando a proteína recombinante CD40 recombinante de macaco cinomolgos (Acro Biosystems). Os valores de EC50 indicam uma ligação potente dos anticorpos. n.d. = não detectável na faixa de concentração testada Figura 5 a) b): Indução de maturação de célula dendrítica

[0149] Para testar a atividade agonística de anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados em células-alvo primárias, foi analisada maturação de células dendríticas imaturas derivadas de monócitos. Células dendríticas imaturas, que foram diferenciadas in vitro de monócitos, foram incubadas por 48 h com anticorpos anti-C40 agonísticos a uma concentração de 5 µg/ml. IL12p40 secretada derivada de células dendríticas foi subsequentemente quantificada no meio sobrenadante por ELISA bioquímico. Figura 6: Maturação de célula dendrítica

[0150] A atividade de anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados para estimular a secreção de IL12p40 por células dendríticas foi determinada em diferentes concentrações de anticorpos e a atividade foi comparada aos anticorpos CP-870.893 que transportam diferentes partes Fc (IgG1, IgG1-LALA, IgG2 e IgG1-V11). Os anticorpos foram incubados por 48 h com células dendríticas imaturas diferenciadas in vitro. A liberação de IL12p40 foi medida por ELISA. Figura 7: Determinação de EC50 de anticorpos anti-CD40 na maturação de células dendríticas

[0151] Os valores de EC50 de anticorpos monoclonais humanizados anti-CD40 IgG1-LALA na secreção de IL12p40 mediada por células dendríticas foram determinados testando concentrações de anticorpos variando de 10 - 0,005 µg/ml. Os anticorpos foram incubados por 48 h com células dendríticas imaturas diferenciadas in vitro. A liberação de IL12p40 foi medida por ELISA. Figura 8: Ensaio de liberação de citocinas

[0152] Os anticorpos monoclonais anti-CD40 IgG1-LALA humanizados foram testados no ensaio de liberação de citocinas de CMSP de alta densidade a 10 µg/ml para determinar a indução geral de citocinas inflamatórias, como TNF-alfa. Os dados indicam que, ao contrário de um anticorpo anti-CD3 (OKT3), os anticorpos anti-CD40 não induzem secreção significativa de TNF-alfa. Figura 9: Ensaio celular de pulse-chase de anticorpos

[0153] A dinâmica de ligação ao anticorpo e a internalização foram testadas em um ensaio celular de pulse-chase. Os anticorpos foram incubados com culturas de células HEK-Blue-CD40L™ por 15 min a uma concentração de 0,8 µg/ml. Após a lavagem, os anticorpos foram deixados internalizar por 60 minutos antes das células serem lavadas novamente e o anticorpo anti-CD0 localizado na superfície celular restante foi detectado por um anticorpo secundário marcado com Alexa-

488. Em condições que não permitem a internalização, as células foram tratadas de maneira semelhante, mas os anticorpos foram incubados apenas por 15 minutos, seguidos de lavagem e incubação secundária de anticorpos. Os dados mostram que em condições que permitem a internalização, os sinais dos anticorpos localizados na superfície são reduzidos a diferentes extensões para os anticorpos monoclonais anti-

CD40 IgG1-LALA humanizados testados. Uma forte redução de sinal é observada para todas as isoformas de anticorpo CP-870.893. Figura 10: Correlação da indução do gene-repórter e atividade de maturação de células dendríticas de anticorpos anti-CD40 humanizados

[0154] Foram testados 88 anticorpos anti-CD40 IgG1-LALA quanto à sua atividade em um repórter do gene HEK-Blue e um ensaio de maturação de células dendríticas. A atividade do gene-repórter do HEK- Blue é quantificada por OD@ 655 correlacionado com a secreção SEAP induzida, a maturação das células dendríticas é quantificada pela liberação de IL12p40 (ELISA). Figura 11: Estimulação de receptores coestimulatórios em células dendríticas por anticorpos agonísticos anti-CD40

[0155] iDCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com anticorpos CD40 agonísticos, anticorpos de controle de isotipo ou CD40L por 48 horas. A expressão de moléculas receptoras co- estimulatórias foi medida por citometria de fluxo. As intensidades médias de fluorescência foram normalizadas para tratamentos de controle de isotipo ou, no caso de CD40L, para amostras não tratadas. A indução da expressão é expressada como dobra de indução (FOI) sobre o tratamento de controle. Figura 12: Liberação de citocinas por células dendríticas tratadas com anti-CD40

[0156] iDCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com anticorpos CD40 agonísticos, anticorpos de controle de isotipo ou CD40L por 48 horas. A liberação de citocinas foi medida por ELISA (IL- 12p40) ou por citometria de fluxo, usando uma matriz de microesferas citométricas BD Figura 13: Estimulação dependente de dose de receptores coestimulatórios em células dendríticas por anticorpos agonísticos anti-CD40

[0157] iDCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com anticorpos CD40 agonísticos ou anticorpos de controle de isotipo por 48 horas em concentrações variando de 10000 a 5 ng/ml. A expressão de moléculas receptoras coestimulatórias foi medida por citometria de fluxo. As intensidades médias de fluorescência foram normalizadas para tratamentos de controle de isotipo. A indução da expressão é expressada como dobra de indução (FOI) sobre o tratamento de controle. Os valores calculados de EC50 são apresentados na tabela. Figura 14: Liberação de citocinas dependente de dose por células dendríticas tratadas com anti-CD40

[0158] iDCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com anticorpos CD40 agonísticos e anticorpos de controle de isotipo por 48 horas. A liberação de citocinas foi medida por citometria de fluxo, usando uma matriz de microesferas citométricas BD Figura 15: Estimulação dependente de dose de receptores coestimulatórios em células B por anticorpos agonísticos anti- CD40

[0159] iAs células B foram estimuladas com anticorpos CD40 agonísticos ou anticorpos de controle de isotipo por 48 horas em concentrações variando de 500 a 0,2 ng/ml. A expressão de moléculas receptoras co-estimulatórias foi medida por citometria de fluxo. As intensidades médias de fluorescência foram normalizadas para tratamentos de controle de isotipo. A indução da expressão é expressada como dobra de indução (FOI) sobre o tratamento de controle. Os valores calculados de EC50 são apresentados na tabela. Figura 16: Competição de anticorpos anti-CD40 com CD40L de ligação a CD40 expressado em células

[0160] As células HEK-Blue-CD40L™ foram pré-incubadas com anticorpos anti-CD40-IgG1-LALA nas concentrações de EC90 antes da adição de CD40L em concentrações variando de 10000 a 9,8 ng/ml. Os anticorpos anti-CD40 e a ligação de CD40L a CD40 expressado na superfície celular foram detectados usando diferentes anticorpos secundários acoplados a fluoróforo. Figura 17: Indução da expressão do receptor de morte FasR (CD95) por anticorpos agonísticos de CD40 em combinação com CD40L

[0161] As células do linfoma B Ramos foram estimuladas durante a noite com CD40L sozinho ou em combinação com anticorpos agonísticos anti-CD40 ou anticorpos de controle de isotipo. A expressão de CD95 foi quantificada por citometria de fluxo, a regulação positiva da expressão é expressada como dobra de indução (FOI) sobre o tratamento de controle. Figura 18: Afinidades de anticorpos humanizados e agonísticos anti-CD40 lgG1-LALA

[0162] As afinidades bioquímicas foram medidas por ressonância de plásmon de superfície em um instrumento Biacore T200 SPR. Os dados cinéticos foram determinados usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. Figura 19: Competição de anticorpos na ligação de CD40

[0163] Ligação de uma mistura pré-incubada de proteína CD40 marcada com HIS e diferentes anticorpos anti-CD40 a placas revestidas com diferentes anticorpos anti-CD40. A ligação consecutiva de ambos os anticorpos anti-CD40 é detectada por anticorpos marcados com anti- HIS POD. Figura 20: Função efetora mediada por anticorpo de anticorpos lgG1-LALA anti-CD40

[0164] A função efetora mediada por anticorpo anti-CD40 foi analisada usando uma linhagem celular do gene-repórter de luciferase efetor Jurkat e HEK-Blue-CD40L™ como células alvo. Os anticorpos IgG1-LALA ou IgG1 anti-CD40 foram incubados em doses variando de

10000 a 0,002 ng/ml com células alvo e efetoras por 6 horas. A dobra de indução da atividade da luciferase medida indica ativação de células efetoras mediadas por anticorpos anti-CD40. Figura 21: Segurança da terapia de anticorpo anti-CD40 agonístico em um modelo de camundongo humanizado

[0165] Os camundongos Nod/Scid/gama (c) (nulo) FcRg -/- foram injetados com 3 µg/g de anticorpos MAB-16-0451 ou CP-870.893 anti- CD40 no dia 0. A temperatura foi medida antes e em diferentes momentos após a injeção. Três camundongos tratados com CP-

870.893, que mostraram uma impressionante redução da temperatura corporal, tiveram que ser sacrificados após 3 dias. Figura 22: Sequências (aminoácidos no código de uma letra)

[0166] Sequências completas de regiões variáveis (VR):

[0167] Cadeia pesada: VH completa: SEQ ID NO: 1-14

[0168] Cadeia leve: VL completa: SEQ ID NO: 15-28

[0169] Região determinante de complementaridade (CDR):

[0170] Cadeia pesada:

[0171] CDR-H1: SEQ ID NO: 29-42

[0172] CDR-H2: SEQ ID NO: 43-56

[0173] CDR-H3: SEQ ID NO: 57-70

[0174] Cadeia leve:

[0175] CDR-L1: SEQ ID NO: 71-84

[0176] CDR-L2: SEQ ID NO: 85-98

[0177] CDR-L3: SEQ ID NO: 99-112

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal agonista ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de se ligar especificamente ao receptor CD40 humano e ser capaz de induzir a sinalização de CD40 independente da reticulação do receptor CD40 mediado por Fcγ.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1LALA humanizado.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos substituições de aminoácidos em L234A e L235A da região Fc de IgG1 humana ou S228P e L235E da região Fc de IgG4 humana.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epitopo que está sobreposto com o sítio de ligação ao CD40L.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ativa as APCs humanas.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ativa as células selecionadas do grupo compreendendo células dendríticas (DCs), células B, monócitos, células mieloides e células tumorais.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo tem um efeito citotóxico mediado pela célula imune indireta nas células tumorais.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma das características a seguir (a) nenhuma ligação ao receptor Fcγ;

(b) tem uma afinidade de ligação a células CD40 com um valor de EC50 igual ou menor que 49,5 ng/ml; c) tem valores de KD iguais ou menores que 15,7 nM; (d) é reativo cruzado a CD40 do macaco cinomolgos com um valor de KD igual ou menor que 10,3 nM; (e) inibindo a ligação de CD40L à CD40; (f) evitar efeitos sinérgicos e aditivos de funções mediadas por CD40L; (g) induz a maturação das células apresentadoras de antígeno, como determinado pela liberação de Il12p70 com um valor de EC50 igual ou menor que 208 ng/ml e/ou conforme determinado pela indução de CD86 em células dendríticas em pelo menos 7,5 vezes e com uma EC50 igual ou menor que 148 ng/ml; e/ou (h) reduz o nível de CD40 na superfície celular por menos que 50%.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a) uma região VH selecionada do grupo de regiões VH compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1H da SEQ ID NO: 29 + n, uma região CDR2H da SEQ ID NO: 43 + n e uma região CDR3H da SEQ ID NO: 57 + n, em que n é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13, e b) uma região VL selecionada do grupo de regiões VL compreendendo as regiões CDR selecionadas do grupo consistindo em uma região CDR1L da SEQ ID NO: 71 + m, uma região CDR2L da SEQ ID NO: 85 + m e uma região CDR3L da SEQ ID NO: 99 + m, em que m é um número selecionado do grupo que consiste em 0 a 13, em que as CDRs podem compreender qualquer uma ou mais mutações de aminoácidos que não diminuam sua atividade de acordo com a invenção.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que é pelo menos 85% idêntica a uma região VH selecionada do grupo que consiste nas regiões VH da SEQ ID NO: 1 a 14.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve (VL) que é pelo menos 85% idêntica a uma região VL selecionada do grupo que consiste nas regiões VL da SEQ ID NO: 15 a 28.

12. Anticorpo, de acordo com as reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de pacientes que sofrem de câncer.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.

14. Anticorpo, de acordo com as reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo compreendendo câncer de pâncreas, câncer de pulmão de carcinoma pancreático avançado, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioloalviolares, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de rim, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncer de glândula salivar ou câncer uterino.

15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é usado no tratamento de câncer em combinação com agentes citotóxicos ou citostáticos, radioterapia, terapia direcionada, imunoterapia ou cirurgia.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.