BR112019024908A2 - Variantes de mananase - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a variantes de mananase, a composições compreendendo as referidas variantes, a métodos para a sua produção e a métodos de uso das referidas variantes para degradar e modificar material contendo manano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE MANANASE".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a variantes da enzima mananase. As variantes são úteis em aplicações industriais em que se deseja a degradação ou a modificação de manano, tais como em aplicações de lavanderia e de limpeza, na indústria de ração, alimentos, polpa e papel e de óleo. A invenção também proporciona enzimas mananases úteis, polinucleotídeos codificando estas enzimas, composições enzimáticas e métodos para a sua produção e utilização.

ANTECEDENTES

[002] Manaons são polissacarídeos contendo manose encontrados em várias plants. Os mananos são fracamente solúveis em ambiente aquoso e suas propriedades fisicoquímicas dão origem a dispersões viscosas. Além disso, os mananos têm alta capacidade de ligação a água. Todas estas características causam problemas em várias indústrias, incluindo aplicações de fabricação de cerveja, de panificação, de nutrição animal, e de lavanderia e de limpeza.

[003] Em dietas à base de plantas, estão presentes diferentes ß- mananos e, dependendo de suas quantidades e propriedades, podem comprometer a digestão de nutrientes, a colonização microbiana e a performance de crescimento. A degradação enzimática de mananos reduz a viscosidade da digesta de mananos altamente solúveis em água e leva à produção de mano-oligossacarídeos que podem formar mananos lineares insolúveis em água presentes nas leguminosas. A mananase aumenta o ganho médio diário, a eficiência da ração, a uniformidade de peso e a habitabilidade em todos os animais monogástricos.

[004] Para aplicações de ração animal, tais como ração para animais monogástricos com dietas de cereais, o manano é um fator contribuinte para a viscosidade do conteúdo dos intestinos e deste modo afeta de maneira adversa a digestibilidade da ração e as taxas de crescimento animal. Para os ruminantes, o manano representa um componente substancial de ingestão de fibras e uma digestão mais completa do manano vai facilitar maiores eficiências de conversão alimentar.

[005] Para aplicações de lavanderia e de limpeza, as composições enzimáticas compreendendo mananase podem ser usadas para degradar manano. No entanto, é difícil proporcionar mananases que sejam estáveis em condições variáveis de armazenamento e utilização, ao mesmo tempo que apresentando boa atividade de degradação do manano.

[006] A estabilidade das enzimas industriais é uma propriedade importante porque as enzimas frequentemente são usadas em condições que são muito diferentes do ambiente natural das enzimas. É freqüente que uma enzima selvagem apresentando boa performance em testes iniciais não seja adequada para produção em escala industrial, ou seja instável em condições típicas de aplicação ou armazenamento.

[007] Glicosilação ligada por N de proteínas é um tipo de modificação pós-translacional onde uma molécula de açúcar oligossacarídeo conhecido como glicano é anexada a um grupo de nitrogênio da amida de um resíduo asparagina (Asn, N) de uma proteína. Este tipo de ligação é importante tanto para a estrutura quanto para a função das enzimas e de outras proteínas.

[008] É um objeto da presente invenção proporcionar variantes de mananase tendo estabilidade aprimorada e apresentando atividade de mananase quando aplicadas em diferentes processos industriais, bem como composições enzimáticas para a degradação ou modificação de manano.

SUMÁRIO

[009] De acordo com o primeiro aspecto é proporcionada uma variante de mananase compreendendo pelo menos uma substituição de um aminoácido em uma posição correspondente à posição 123, 158, 180, 272, 307, ou 316, em que a variante tem atividade de mananase e é selecionada entre o grupo que consiste em: 1) um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com os resíduos 27 a 331 da SEQ ID NO: 2; 2) uma variante codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevado rigor com a) os nucleotídeos 79 a 993 da SEQ ID NO: 1 (man7) ou b) o complemento de comprimento total de a); e 3) uma variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNA genômico da mesma; e em que a numeração de aminoácidos corresponde à numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7) sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência de sinalização.

[0010] A presente variante de mananase é vantajosa por ter boa estabilidade e atividade de mananase. A variante tem estabilidade aprimorada em detergentes e em particular em temperatura elevada. Deste modo, a presente variante de mananase pode proporcionar rendimento aprimorado na produção e melhor performance em uso. A estabilidade da variante é particularmente boa em detergentes e em temperaturas tipicamente usadas em aplicações onde se usa a degradação de manano, tais como em detergentes para lavanderia.

[0011] Em uma modalidade, a variante tem pelo menos duas substituições. Isto é vantajoso para melhorar mais a estabilidade em detergentes e no uso em temperatura elevada. Alternativamente, podem ser selecionadas duas substituições de tal modo que além da estabilidade, seja aprimorada outra propriedade da variante.

[0012] De acordo com o segundo aspecto da invenção é proporcionada uma composição enzimática compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto e a. pelo menos um preservante selecionado, por exemplo, entre o grupo que consiste em ácido orgânico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido benzóico e seus sais e derivados, benzoato de sódio, benzoato, hidroxibenzoato e derivados, ácido sórbico, sorbato de sódio, sorbato, sais, tais como cloreto de sódio ou cloreto de potássio, 1,2-Benzisotiazolin-3-ona (BIT) ou uma combinação das mesmas; b. opcionalmente pelo menos um estabilizante selecionado entre poliol, propileno glicol, polietileno glicol, hexileno glicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, polissacarídeo, ácido láctico, ácido bórico, derivado do ácido bórico, éster de borato aromático, ácido 4-fornilfenil borônico, derivado do ácido fenil borônico, peptídeo, tensoativo ou uma combinação dos mesmos; c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolíticas, liases de pectato, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador, ou uma combinação das mesmas; e d. opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação das mesmas.

[0013] Conforme evidenciado pelos Exemplos, as variantes compreendidas na composição enzimática de acordo com a invenção têm uma estrutura e propriedades que permitem a produção em células hospedeiras recombinantes e as torna úteis em composições enzimáticas para aplicações industriais. A composição enzimática é particularmente boa para formulações de detergente porque a variante de mananase tem boa estabilidade, performance de lavagem e atividade específica quando usadas para degradar manano em uso de lavanderia e de lavagem.

[0014] De acordo com o terceiro aspecto é proporcionada uma composição de detergente compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto ou a composição enzimática do segundo aspecto.

[0015] A presente composição de detergente é vantajosa pelo fato de que é estável, eficaz e econômica na remoção de manchas contendo manano.

[0016] De acordo com outro aspecto é proporcionado um uso, e um método de uso, da presente composição enzimática ou da presente variante de mananase em um detergente.

[0017] De acordo com o quarto aspecto é proporcionada uma célula hospedeira recombinante compreendendo elementos genéticos que possibilitam a produção de pelo menos um polipeptídeo recombinante compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto.

[0018] De acordo com o quinto aspecto é proporcionado um método para a produção de um polipeptídeo recombinante tendo atividade de mananase e compreendendo: a. cultura de uma célula hospedeira recombinante do quarto aspecto, em que os elementos genéticos compreendem pelo menos uma sequência de controle a qual controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante;

os elementos genéticos opcionalmente compreendem pelo menos uma sequência codificando uma sequência de sinalização para transportar o polipeptídeo recombinante fora da célula hospedeira; e a cultura é realizada em condições possibilitando a produção do polipeptídeo recombinante; e b. recuperação do polipeptídeo recombinante.

[0019] O método proporciona um modo eficaz para produzir um polipeptídeo recombinante compreendendo uma variante de mananase. Como a variante de mananase é produzida em uma célula hospedeira recombinante, é proporcionado um sistema de produção, o qual pode ser otimizado, personalizado, e controlado em uma maneira desejada. A variante de mananase produzida pelo método pode diferir de mananases naturais em um nível estrutural e funcional.

[0020] De acordo com outro aspecto é proporcionada uma preparação enzimática compreendendo um polipeptídeo recombinante tendo atividade de mananase e obtenível pelo uso da presente célula hospedeira.

[0021] A preparação enzimática ou a composição enzimática pode compreender adicionalmente outra(s) enzima(s) selecionada(s) entre o grupo que consiste em proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, liases de pectato, enzimas pectinolíticas, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador, bem como aditivos adequados selecionadas entre o grupo que consiste em estabilizantes, tampões, tensoativos, agentes alvejantes, mediadores, agentes anticorrosão, agentes de construção, agentes antirredeposição, abrilhantadores óticos, corantes, pigmentos, perfumes, cáusticos, abrasivos e preservantes.

[0022] De acordo com um sexto aspecto é proporcionado um método para a degradação ou a modificação de material contendo manano compreendendo o tratamento do referido material contendo manano com uma quantidade eficaz da presente composição enzimática ou da presente variante de mananase.

[0023] De acordo com o sétimo aspecto é proporcionada uma ração animal compreendendo a presente composição enzimática ou a presente variante de mananase, e pelo menos uma fonte de proteína de origem vegetal ou um produto ou subproduto contendo manano, e a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta- glucanase, ou uma combinação das mesmas; e b. Opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação das mesmas.

[0024] De acordo com o oitavo aspecto é proporcionado um suplemento de ração compreendendo a presente composição enzimática ou a presente variante de mananase; e a. Opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação das mesmas; e b. Opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação das mesmas.

[0025] A ração e o suplemento de ração melhoram o valor nutricional da ração em comparação com uma ração sem a variante. A presente composição enzimática compreende a variante de mananase, a qual tem estabilidade aprimorada. A presente composição enzimática e a presente variante degradam o manano presente na ração e deste modo o tornam mais facilmente digerível pelo animal. Em particular para rações contendo refeição de soja,

manano-oligossacarídeos que resultam de digestão enzimática têm alguns efeitos benéficos sobre os micróbios intestinais, e conseqüentemente sobre a performance dos animais. O efeito das variantes de mananase pode ser reforçado incluindo xilanase para digerir arabinoxilanos presentes em dietas à base de milho soja. As presentes variantes também podem ser usadas para modificar as propriedades reológicas de rações a úmido.

[0026] Em uma modalidade, a ração pode compreender proteína animal, tal como refeição de carne ou refeição de osso.

[0027] De acordo com outro aspecto, é proporcionado um uso, e um método de uso, da presente ração animal ou do presente suplemento de ração em: a. alimentação de animais; b. aumento do ganho de peso dos animais.

[0028] Em uma modalidade, o animal é um animal monogástrico ou um ruminante. Em outra modalidade o animal é um frango de corte, uma galinha poedeira, um suíno, um peru, ou um organismo de aquacultura tal como um peixe. Em outra modalidade, o animal é um ruminante.

[0029] De acordo com um nono aspecto é proporcionado um uso, e um método de uso, da presente variante ou da presente composição enzimática em exploração de petróleo ou hidro-fraturamento.

[0030] A presente composição enzimática e a presente variante são vantajosas na modificação de propriedades reológicas de fluidos de exploração de petróleo e fluidos de hidro-fraturamento, e para melhorar a recuperação do óleo.

[0031] De acordo com um décimo aspecto, é proporcionado um uso, e um método de uso, da presente variante ou da presente composição enzimática no processamento do extrato de café, suco de frutas, suco de abacaxi, ou leite de soja.

[0032] O uso da presente variante e da presente composição enzimática é vantajoso no processamento do extrato de café porque reduz a viscosidade do extrato de café.

[0033] O uso da presente variante e da presente composição enzimática é vantajoso no processamento e na fabricação de suco de frutas porque reduz a viscosidade e aumenta a taxa de filtração, a estabilidade e ajuda a extrair os componentes das frutas.

[0034] O uso da presente variante e da presente composição enzimática é vantajoso no processamento e na fabricação de leite de soja porque melhora o rendimento, a cor, o teor de proteínas e o sabor do leite de soja.

[0035] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico codificando a presente variante de mananase.

[0036] Em outro aspecto, é proporcionado um vetor compreendendo a presente molécula de ácido nucleico.

[0037] Em outro aspecto, é proporcionado um fragmento funcional da presente variante de mananase, e um polinucleotídeo codificando o mesmo.

[0038] Em outro aspecto, a informação de seqüência divulgada aqui, neste requerimento de patente, relativa a uma seqüência de polinucleotídeo codificando uma mananase da invenção pode ser usada como uma ferramenta para identificar outras mananases homólogas. Por exemplo, pode ser usada reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar sequências codificando outras mananases homólogas de uma variedade de fontes biológicas. Além disso, abordagens de mineração de genoma podem ser usadas para identificar sequências codificando outras mananases homólogas de bancos de dados de genoma.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0039] A Fig 1 mostra uma representação esquemática do vetor pEV1 para replicação em Bacillus.

[0040] A Fig 2 mostra esquematicamente os cassetes de expressão usados na transformação de Trichoderma reesei.

[0041] As Fig 3A a B descrevem a performance de remoção de mancha de Man7 variantes e selvagem (produzidas em Trichoderma) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 4,4 g/l de detergente líquido para limpeza pesada comercial A a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 8,3 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0042] A Fig 3A mostra as variantes TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e selvagem.

[0043] A Fig 3B mostra as variantes TBH6, TBH10, TBH11 e selvagem.

[0044] As Fig 4A a B descrevem a performance de remoção de mancha de variantes e de Man7 selvagem (produzida em Trichoderma) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 3,8 g/l de detergente em pó colorido comercial a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 10 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0045] A Fig 4A mostra as variantes TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e selvagem.

[0046] A Fig 4B mostra as variantes TBH6, TBH10, TBH11 e selvagem.

[0047] A Fig 5 descreve a performance de remoção de mancha das variantes TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e de Man7 selvagem (produzida em Trichoderma) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 3,8 g/l de detergente em pó alvejante comercial a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 9,5 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0048] A Fig 6 descreve a performance de remoção de mancha das variantes BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 e de Man7 selvagem (produzida em Bacillus) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 4,4 g/l de detergente líquido para limpeza pesada comercial A at 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 8,3 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0049] A Fig 7 descreve a performance de remoção de mancha das variantes BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 e de Man7 selvagem (produzida em Bacillus) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 3,8 g/l de Detergente em pó colorido comercial a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 10 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0050] A Fig 8 descreve a performance de remoção de mancha das variantes BH18, BH21, BH23, BH24, BH25 e de Man7 selvagem (produzida em Bacillus) como um aumento da luminosidade (soma de ΔL* de 3 manchas) na presença de 3,8 g/l de detergente em pó alvejante comercial a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH de cerca de 9,5 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por solução de lavagem.

[0051] A Fig 9 mostra a estabilidade da variante TBH6 em detergente líquido para limpeza pesada comercial a 37°C em comparação com enzima selvagem produzida em Trichoderma.

[0052] A Fig 10 mostra a estabilidade da variante BH25 em detergente líquido para limpeza pesada comercial a 37°C em comparação com enzima selvagem produzida em Bacillus.

[0053] As Fig 11A a B mostra a estabilidade de variantes e enzima selvagem produzida em Trichoderma em detergente líquido para limpeza pesada comercial a 50°C e 7 dias.

[0054] A Fig 11A mostra as variantes TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e selvagem.

[0055] A Fig 11B mostra as variantes TBH6, TBH10, TBH11 e selvagem.

[0056] A Fig 12 mostra um fluxograma da produção de café instantâneo envolvendo o uso das variantes de mananase da invenção.

[0057] A Fig. 13 mostra a estabilidade da variante TBH14 em combinação (combinação de TBH5 e TBH6) em comparação com as variantes TBH5 e TBH6 em detergente líquido para limpeza pesada comercial a 50°C e por 7 dias.

DEPÓSITOS

[0058] Foram realizadas as seguintes deposições de cepas de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional de Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimento de Patente:

[0059] A cepa de E. coli RF12379 incluindo o plasmídeo pALK4434 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32425.

[0060] A cepa de E. coli RF12380 incluindo o plasmídeo pALK4435 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32426.

[0061] A cepa de E. coli RF12381 incluindo o plasmídeo pALK4436 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32427.

[0062] A cepa de E. coli RF12382 incluindo o plasmídeo pALK4437 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32428.

[0063] A cepa de E. coli RF12383 incluindo o plasmídeo pALK4438 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32429.

[0064] A cepa de E. coli RF12384 incluindo o plasmídeo pALK4439 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32430.

[0065] A cepa de E. coli RF12385 incluindo o plasmídeo pALK4440 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32431.

[0066] A cepa de E. coli RF12386 incluindo o plasmídeo pALK4441 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32432.

[0067] A cepa de E. coli RF12387 incluindo o plasmídeo pALK4442 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 2 de março de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32433.

[0068] A cepa de E. coli RF12456 incluindo o plasmídeo pALK4432 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 18 de maio de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32518.

[0069] A cepa de E. coli RF12457 incluindo o plasmídeo pALK4433 foi depositada junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha em 18 de maio de 2017 e foi atribuído o número de acesso DSM 32519.

LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS

[0070] SEQ ID NO: 1 Sequência de DNA da man7

[0071] SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos de comprimento total da Man7

[0072] SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da Man7

[0073] SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos de núcleo da Man7, não CMB

[0074] SEQ ID NO: 5 Sequência genética sintética da variante tbh1

[0075] SEQ ID NO: 6 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH1

[0076] SEQ ID NO: 7 Sequência genética sintética da variante tbh2

[0077] SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH2

[0078] SEQ ID NO: 9 Sequência genética sintética da variante tbh3

[0079] SEQ ID NO: 10 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH3

[0080] SEQ ID NO: 11 Sequência genética sintética da variante tbh4

[0081] SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH4

[0082] SEQ ID NO: 13 Sequência genética sintética da variante tbh5

[0083] SEQ ID NO: 14 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH5

[0084] SEQ ID NO: 15 Sequência genética sintética da variante tbh6

[0085] SEQ ID NO: 16 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH6

[0086] SEQ ID NO: 17 Sequência genética sintética da variante tbh7

[0087] SEQ ID NO: 18 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH7

[0088] SEQ ID NO: 19 Sequência genética sintética da variante tbh8

[0089] SEQ ID NO: 20 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH8

[0090] SEQ ID NO: 21 Sequência genética sintética da variante tbh9

[0091] SEQ ID NO: 22 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH9

[0092] SEQ ID NO: 23 Sequência genética sintética da variante tbh10

[0093] SEQ ID NO: 24 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH10

[0094] SEQ ID NO: 25 Sequência genética sintética da variante tbh11

[0095] SEQ ID NO: 26 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante TBH11

[0096] SEQ ID NO: 27 Sequência de DNA da variante bh18

[0097] SEQ ID NO: 28 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante BH18

[0098] SEQ ID NO: 29 Sequência de DNA da variante bh21

[0099] SEQ ID NO: 30 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante BH21

[00100] SEQ ID NO: 31 Sequência de DNA da variante bh23

[00101] SEQ ID NO: 32 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante BH23

[00102] SEQ ID NO: 33 Sequência de DNA da variante bh24

[00103] SEQ ID NO: 34 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante BH24

[00104] SEQ ID NO: 35 Sequência de DNA da variante bh25

[00105] SEQ ID NO: 36 Sequência de aminoácidos deduzida (madura) da variante BH25

[00106] SEQ ID NO: 37 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var1

[00107] SEQ ID NO: 38 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var2

[00108] SEQ ID NO: 39 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var3

[00109] SEQ ID NO: 40 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var4

[00110] SEQ ID NO: 41 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var5

[00111] SEQ ID NO: 42 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var6

[00112] SEQ ID NO: 43 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo

Man7_Var7

[00113] SEQ ID NO: 44 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var8

[00114] SEQ ID NO: 45 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var9

[00115] SEQ ID NO: 46 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var10

[00116] SEQ ID NO: 47 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var11

[00117] SEQ ID NO: 48 Sequência do iniciador de oligonucleotídeo Man7_Var12

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00118] Manano se refere a polissacarídeos que consistem em uma espinha dorsal de manose encadeados juntos por ligações β-1,4- com cadeias laterais de galactose anexadas à espinha dorsal por ligações α-1,6-. Os mananos compreendem material à base de plantas tais como goma guar e goma de alfarroba. Os glucomananos são polissacarídeos tendo uma espinha dorsal de manose e glucose β-1,4 ligadas alternando mais ou menos regularmente, galactomananos e galactoglucomananos são mananos e glucomananos com ramificações colaterais de galactose alfa-1,6- ligadas.

[00119] O termo "fragmento funcional" ou "fragmento efetivo" significa um fragmento ou uma porção da variante da SEQ ID NO: 2 que mantém cerca da mesma função enzimática ou efeito.

[00120] Os termos "variantes de mananase" e "variante de mananase" significam qualquer molécula de mananase obtida por mutagênese direcionado ao sítio ou aleatória, inserção, substituição, eliminação, recombinação e/ou qualquer outro método de engenharia de proteína, o qual leve a mananases que diferem em sua sequência de aminoácidos da mananase de origem, isto é, uma mananase selvagem. Os termos "mananase selvagem", "enzima selvagem", "selvagem", ou "wt" de acordo com a presente invenção descrevem uma enzima mananase com uma sequência de aminoácidos encontrada na natureza ou um fragmento da mesma.

[00121] O termo "atividade catalítica" ou "atividade" descreve quantitativamente a conversão de um determinado substrato sob condições de reação definidas. O termo "atividade residual" é definido como a proporção da atividade catalítica da enzima sob uma série determinada de condições para a atividade catalítica sob uma série diferente de condições. Portanto a atividade residual ai é dada por ai=vi/v0 onde v denota qualquer medida de atividade catalítica e ai *100 é a atividade relativa em percentagem. O termo "atividade específica" descreve quantitativamente a atividade catalítica por quantidade de enzima sob condições de reação definidas.

[00122] O termo "estabilidade proteolítica" descreve a propriedade de uma proteína para suportar uma exposição limitada a proteases sob condições em que as proteases estão ativas, sem perder atividade sob condições onde sua atividade pode ser medida.

[00123] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "mananase" ou "galactomananase" denota uma enzima mananase definida de acordo com o que é conhecido na arte como endo-1,4-beta-manosidase do manano e tendo os nomes alternativos beta-mananase e endo-1,4-mananase e catalisando a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-manosídicas em mananos, galactomananos, glucomananos, e galactoglucomananos. As mananases são classificadas de acordo com a Enzyme Nomenclature como EC

3.2.1.78.

[00124] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "isolada" significa uma substância em uma forma ou em um ambiente que não ocorra na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorra naturalmente, (2) qualquer substância incluindo qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes que ocorram naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância encontrada na natureza, tal como uma variante; ou (4) qualquer substância modificada por aumento ou diminuição da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está associada na natureza (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; uma ou múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e o uso de um promotor alternativo ao promotor associado na natureza com o gene codificando a substância). Em uma modalidade, é isolado um polipeptídeo, uma enzima, uma variante, um polinucleotídeo, uma célula hospedeira ou uma composição da invenção.

[00125] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "compreendendo" inclui os significados mais amplos de "incluindo", "contendo", e "abrangendo", bem como as expressões mais limitadas "consistindo em" e "consistindo essencialmente em".

[00126] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "variante" significa uma sequência ou um fragmento de uma sequência (nucleotídeo ou aminoácido) inserido, substituído ou eliminado por um ou mais nucleotídeos / aminoácidos, ou o qual é modificado quimicamente. Em uma modalidade, o termo variante também inclui uma enzima mananase recombinante.

[00127] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "substituição de aminoácido conservadora" é uma substituição na qual o resíduo aminoácido é substituído com um resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na arte. Em uma modalidade, os aminoácidos conservadores na presente descrição se referem aos aminoácidos dentro dos seguintes agrupamentos: Hidrofóbicos (F W Y H K M I L V A G C); Aromáticos (F W Y H); Alifáticos (I L V); Polar (W Y H K R E D C S T N Q); Carregados (H K R E D); Carregados positivamente (H K R); Carregados negativamente (E D); Pequenos (V C A G S P T N D); Minúsculos (A G S). Portanto, ocorre uma substituição conservadora quando um aminoácido é substituído com um aminoácido no mesmo grupo.

[00128] Em uma modalidade, a substituição é uma substituição com pelo menos um resíduo aminoácido, tal como com um aminoácido, dois aminoácidos, ou três aminoácidos. Em uma modalidade adicional, o pelo menos um aminoácido é Ala.

[00129] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma "substituição de aminoácido não conservadora" é uma substituição na qual um aminoácido é substituído com um aminoácido em um grupo diferente conforme definido acima. A substituição não conservadora pode resultar em uma modificação de um aminoácido para outro aminoácido com propriedades bioquímicas diferentes, tais como carga, hidrofobicidade e/ou tamanho. Em uma modalidade, a substituição não conservadora modifica pelo menos uma propriedade da variante, tal como estabilidade, padrão de glicosilação, dobramento, estrutura, atividade, ou afinidade.

[00130] O processo de glicosilação ligada por N ocorre em eucariotas, porém muito raramente em bactérias. A anexação de um resíduo de glicano a uma proteína requer o reconhecimento de uma sequência de consenso. Os glicanos ligados por N são quase sempre anexados a uma cadeia lateral de asparagina (Asn) que está presente como uma parte da sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido com a exceção de prolina (Pro). Além disso se descobriu que uma cadeia lateral Asn não glicosilada estruturalmente próxima ao sítio ativod da mananase é importante para obter uma variante com boa performance de degradação do manano. Sem ser limitado por qualquer teoria, açúcares de glicano são moléculas polares e quando anexados a uma Asn, eles se localizam sobre a superfície da proteína provocando modificações estruturais na Asn glicosilada e em sua vizinhança. Pode ser usada mutagênese direcionada ao sítio de resíduos Asn ou Ser/Thr na sequência de consenso Asn-Xaa-Thr(Ser) para prevenir a glicosilação dos sítios de glicosilação ligada por N desejados na variante do primeiro aspecto da invenção.

[00131] Em uma modalidade, a variante tem uma substituição de um aminoácido por um resíduo o qual evita glicosilação ligada por N do resíduo 283 quando expresso e, uma célula hospedeira capaz de glicosilação ligada por N.

[00132] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos uma sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr.

[00133] Em uma modalidade, a presente variante compreende resíduo Pro na localização X da pelo menos uma sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr.

[00134] Em uma modalidade, a substituição é ou uma substituição conservadora ou uma substituição não conservadora.

[00135] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um "peptídeo" e um "polipeptídeo" são sequências de aminoácidos incluindo uma pluralidade de resíduos de aminoácidos polimerizados consecutivos. Para os fins da presente invenção, peptídeos são moléculas incluindo até 20 resíduos de aminoácidos, e polipeptídeos incluem mais de 20 resíduos de aminoácidos. O peptídeo ou polipeptídeo pode incluir resíduos de aminoácidos modificados, resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente não codificados por um codon, e resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma "proteína" pode se referir a um peptídeo ou a um polipeptídeo de qualquer tamanho. Uma proteína pode ser uma enzima, uma proteína, um anticorpo, uma proteína de membrana, um hormônio peptídico, um regulador, ou qualquer outra proteína.

[00136] O termo "polinucleotídeo" denota um polímero de cadeia única ou de cadeia dupla de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidas da extremidade 5' para a 3'. Polinucleotídeos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas.

[00137] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "modificação", "modificado", e termos similares no contexto de polinucleotídeos se referem a modificação em uma região codificante ou uma região não codificante do polinucleotídeo, tal como uma sequência reguladora, região não traduzida 5’, região não traduzida 3’, elemento genético de regulação positiva, elemento genético de regulação negativa, região de reforçador, supressor, promotor, éxon, ou íntron. A modificação, em algumas modalidades, pode ser somente estrutural, não tendo nenhum efeito sobre o efeito biológico, a ação ou a função do polinucleotídeo. Em outras modalidades, a modificação é uma modificação estrutural, a qual proporciona uma alteração no efeito biológico, na ação ou na função do polinucleotídeo. Uma modificação semelhante pode reforçar, suprimir ou modificar a função biológica do polinucleotídeo.

[00138] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "identidade" significa a percentagem de correspondências exatas de resíduos de aminoácidos entre duas sequências alinhadas sobre o número de posições onde há resíduos presentes em ambas as sequências. Quando uma sequência tem um resíduo sem nenhum resíduo correspondente na outra sequência, o programa de alinhamento permite um intervalo no alinhamento, e aquela posição não é contada no denominador do cálculo de identidade. Identidade é um valor determinado com a ferramenta de alinhamento de sequências pareadas (Pairwise Sequence Alignment) EMBOSS Needle no website EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).

[00139] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, condições de baixo rigor significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições correspondentes a hibridização em pré-hibridização e hibridização a 55 °C em 5× SSC, 0,1 % de N-lauroilsarcosina, 0,02 % de SDS, 1% de reagente de bloqueio (Roche 11 096 176 001), seguindo procedimentos de Southern blotting de rotina por 12 a 24 horas. O material de veículo é finalmente lavado duas a três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,1% SDS a 55°C.

[00140] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, condições de alto rigos significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições correspondentes a hibridização em pré-hibridização e hibridização a 65°C em 5× SSC, 0,1% de N-lauroilsarcosina, 0,02% de SDS, 1% de reagente de bloqueio (Roche 11 096 176 001), seguindo procedimentos de Southern blotting de rotina por 12 a 24 horas. O material de veículo é finalmente lavado duas a três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.

[00141] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é suscetível a transformação, transfecção, transdução, acasalamento, cruzamento ou semelhante com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo.

O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie que não seja idêntica devido a mutações que ocorram durante a replicação.

Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de modo preferencial entre o grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste nas Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e Genera Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium, e Scedosporium; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, de modo o mais preferencial Trichoderma reesei.

Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células bacterianas, de modo preferencial Bacilos Gram positivos (por exemplo, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus), bactérias Gram negativas (por exemplo, Escherichia coli), actinomicetos (por exemplo, Streptomyces sp.) e leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica).

[00142] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula fúngica, de modo preferencial uma célula fúngica filamentosa, tal como Trichoderma ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, de modo preferencial uma célula de Bacillus Gram positivo, tal como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus.

[00143] Em uma modalidade, a célula hospedeira é capaz de glicosilação ligada por N.

[00144] Uma "célula recombinante" ou "célula hospedeira recombinante" se refere a uma célula ou célula hospedeira, a qual tenha sido geneticamente modificada ou alterada para compreender uma seqüência de ácido nucléico, a qual não é nativa para a referida célula ou célula hospedeira. A modificação genética pode compreender a integração do polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo também pode ser exógeno na célula hospedeira. Em uma modalidade, a presente célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante.

[00145] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo em uma célula hospedeira incluindo, mas não limitada a, transcrição, translação, modificação pós-translacional, e secreção. A expressão pode ser seguida por colheita, isto é, recuperação, das células hospedeiras ou do produto expressado.

[00146] O termo "vetor de expressão" denota uma molécula de DNA linear ou circular, que compreende um segmento codificando um polipeptídeo de interesse ligado operacionalmente a segmentos adicionais que proporcionam sua transcrição. Os segmentos adicionais referidos podem incluir sequências de promotor e de terminador, e opcionalmente podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um reforçador, um sinal de poliadenilação, veículo e semelhante. Vetores de expressão geralmente são derivados de DNA de plasmídeo ou viral, ou podem conter elementos de ambos. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão que seja submetido convenientemente a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor frequentemente vai depender da célula hospedeira na qual o vetor deve ser introduzido. Portanto, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor, o qual existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um vetor o qual, quando introduzido dentro de uma célula hospedeira, é integrado dentro do genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossoma ou os cromossomas nos quais tenha sido integrado. Em uma modalidade, o presente vetor é um vetor de expressão.

[00147] O termo "produzido recombinante" ou "produzido de modo recombinante" usado aqui, neste requerimento de patente, em conexão com a produção de um polipeptídeo ou uma proteína é definido de acordo com a definição de rotina na arte.

[00148] O termo "obtido a partir de" e "obtenível" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, em conexão com uma fonte microbiana específica significa que o polinucleotídeo é expresso pela fonte específica (expressão homóloga), ou por uma célua na qual um gene da fonte tenha sido inserido (expressão heteróloga).

[00149] O termo "composição enzimática" significa ou um produto da fermentação enzimática convencional, possivelmente isolado e purificado, a partir de uma única espécie de um microorganismo, a preparação referida geralmente compreendendo uma série de diferentes atividades enzimáticas; ou uma mistura de enzimas monocomponentes, de modo preferencial enzimas derivadas a partir de espécies bacterianas ou fúngicas usando técnicas recombinantes convencionais, cujas enzimas tenham sido fermentadas e possivelmente isoladas e purificadas separadamente e as quais possam se originar de diferentes espécies, de modo preferencial de espécies fúngicas ou bacterianas ou o produto da fermentação de um microorganismo, o qual age como uma célula hospedeira para produção de uma mananase recombinante, mas cujo microorganismo simultaneamente produz outras enzimas.

[00150] O termo "ligados operacionalmente", quando se refere a segmentos de DNA, denota que os segmentos são arranjados de modo a que funcionem em conjunto para seus fins pretendidos, por exemplo, a transcrição se inicia no promotor e prossegue através do segmento codificante até o terminador.

[00151] O termo "promotor" denota uma porção de sequências de DNA contendo um gene que proporcionam a ligação de polimerase de RNA e iniciação de transcrição. Sequências promotoras são comumente, mas nem sempre, encontradas nas regiões não codificantes 5' de genes.

[00152] O termo "sequência de sinalização secretora" ou "sequência de sinalização" denota uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo (um "peptídeo secretor") que, como um componente de um polipeptídeo maior, dirige o polipeptídeo maior através de uma via secretora de uma célula hospedeira na qual é produzido. A sequência de sinalização secretora pode ser nativa ou pode ser substituída com uma sequência de sinalização secretora ou com uma sequência de veículo de outra fonte. Dependendo da célula hospedeira, o peptídeo maior pode ser clivado para remover o peptídeo secretor durante o trânsito através da via secretora.

[00153] O termo "região de núcleo" ou "domínio catalítico" denota um domínio de uma enzima, a qual pode ter sido ou não modificada ou alterada, mas a qual conservou pelo menos parte de sua atividade original. A região de núcleo de uma mananase de acordo com a invenção corresponde aos aminoácidos alinhados com os aminoácidos 27 a 331 de Man7, SEQ ID NO: 2.

[00154] Pelo termo "encadeador" ou "espaçador" se indica um polipeptídeo compreendendo pelo menos dois aminoácidos os quais podem estar presentes entre os domínios de uma proteína de multidomínio, por exemplo, uma enzima compreendendo um núcleo enzimático e um domínio de ligação tal como um módulo de ligação de carboidrato (CBM) ou qualquer outro híbrido enzimático, ou entre duas proteínas ou polipeptídeos produzidos como um polipeptídeo de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo duas enzimas de núcleo. Por exemplo, a proteína de fusão de um núcleo enzimático com um CBM é proporcionada por fusão de uma sequência de DNA codificando o núcleo enzimático, uma sequência de DNA codificando o encadeador e uma sequência de DNA codificando o CBM seqüencialmente dentro de um frame de leitura aberta e expressando este constructo.

[00155] Quantidade eficaz significa uma quantidade, a qual é suficiente para degradar manose na aplicação selecionada.

[00156] São usadas as seguintes abreviações para aminoácidos: A Ala Alanina C Cys Cisteína D Asp Ácido aspártico E Glu Ácido glutâmico F Phe Fenilalanina G Gly Glicina H His Histidina

I Ile Isoleucina K Lys Lisina L Leu Leucina M Met Metionina N Asn Asparagina P Pro Prolina Q Gln Glutamina R Arg Arginina S Ser Serina T Thr Treonina V Val Valina W Trp Triptofano Y Tyr Tirosina

[00157] Substituições são descritas usando a seguinte nomenclatura: resíduo de aminoácido na armação de proteínas; posição; resíduo(s) de aminoácido substituído(s). De acordo com esta nomenclatura a substituição de, por exemplo, um resíduo de serina por um resíduo de glicina na posição 20 é indicada como Ser20Gly ou S20G.

[00158] Os termos "composição de detergente" e "detergente" incluem, a menos que indicado de modo diverso, agentes de lavagem para todos os fins ou de limpeza pesada em forma sólida, granulares ou de pó, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem para todos os fins em forma líquida, de gel ou de pasta, especialmente os chamados tipos líquidos para limpeza pesada (HDL); detergentes líquidos para tecidos finos; agentes para lavagem de louça manual ou agentes para lavagem de louça de limpeza leve, especialmente os do tipo de alta espumação; agentes para máquina de lavar louça, incluindo os vários tipos de comprimidos, granulares, líquidos e de auxílio ao enxágue para uso doméstico e institucional; agentes líquidos para limpeza e desinfecção, xampus para carro ou carpete, limpadores de banheiro; limpadores de metais; bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de alvejantes e "stain-stick" ou tipos de pré- tratamento.

Os termos "detergente", "composição de detergente" e "formulação de detergente" são usados em referência a misturas, as quais são destinadas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos.

Em algumas modalidades, o termo é usado em referência a lavagem de tecidos e/ou roupas (por exemplo, "detergentes para lavanderia"). Em modalidades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, tais como os usados para limpar louça, talheres, etc. (por exemplo, "detergentes para lavar louça"). Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação de detergente ou composição em particular.

Pretende-se que, além das mananases de acordo com a invenção, o termo englobe detergentes que possam conter, por exemplo, tensoativos, agentes de construção, quelantes ou agentes quelantes, sistema alvejante ou componentes alvejantes, polímeros, condicionadores de tecido, reforçadores de espuma, supressores de espuma, corantes, perfume, inibidores de bronzeamento, abrilhantadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujeita, agentes anticorrosão, hidrótropos, agentes matizantes de tecido, dispersants, agentes de inibição de transferência de corantes, agentes de clareamento fluorescentes, polímeros de liberação de sujeira, agentes antirredeposições, agentes antiencolhimento, agentes anti- enrugamento, bactericidas, ligantes, veículos, corantes, estabilizantes enzimáticos, amaciantes de tecido, enchimentos, reguladores de espuma, perfumes, pigmentos, supressores de espuma, solventes, e estruturantes para detergentes líquido, agentes de elasticidade da estrutura, inibidores ou estabilizantes enzimáticos, ativadores enzimáticos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, oxido redutases,

agentes azulantes e corantes fluorescentes, antioxidantes, e solubilizantes.

[00159] O termo "têxtil" significa qualquer material têxtil, incluindo fios, intermediários de fios, fibras, não tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil, tecidos feitos destes materiais e produtos feitos de tecidos (por exemplo, vestuário, roupas de cama e outros artigos). O têxtil ou tecido pode estar sob a forma de malhas, tecidos, denims, não tecidos, feltros, fios, e toalhas. O têxtil pode ser à base de celulose, tal como celulósicos incluindo algodão, linho (flax / linen), juta, rami, sisal ou fibra de coco ou celulósicos sintéticos (por exemplo, originários da polpa de madeira) incluindo viscose / rayon, rami, fibras de acetato de celulose (tricell), lyocell ou combinações das mesmas. O têxtil ou tecido também pode ser não à base de celulose tal como poliamidas naturais incluindo lã, camelo, cashmere, pelo de cabra angorá (mohair), coelho e seda ou polímero sintético tal como nylon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno e spandex / elastano, ou combinações dos mesmos bem como combinação de fibras à base de celulose e não à base de celulose. Exemplos de combinações são combinações de algodão e/ou rayon / viscose com um ou mais material de companhia tal como lã, fibras sintéticas (por exemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de álcool polivinílico, fibras de cloreto de polivinila, fibras de poliuretano, fibras de poliuréia, fibras de aramida), e fibras contendo celulose (por exemplo, fibras de rayon / viscose, rami, flax / linho, juta, fibras de acetato de celulose, lyocell). Tecido pode ser roupa lavável convencional, por exemplo, roupa de uso doméstico manchada. Quando se usa o termo tecido ou roupa, este se destina a incluir também o termo mais amplo têxteis.

[00160] O termo "estabilidade" inclui estabilidade em armazenamento e estabilidade durante o uso, por exemplo, durante um processo de lavagem (em estabilidade de lavagem) e reflete a estabilidade da mananase de acordo com a invenção em função do tempo, por exemplo, quanta atividade é conservada quando a mananase é mantida em solução, em particular em uma solução detergente. A estabilidade é influenciada por muitos fatores, por exemplo, pH, temperatura, composição de detergente por exemplo, proteases, estabilizantes, agentes de construção, tensoativos, etc. A estabilidade da mananase pode ser medida usando o ‘teste de atividade’ conforme descrito nos exemplos.

[00161] "Atividade de mananase" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à atividade de degradação de manano de um polipeptídeo. Degradação ou modificação conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa que as unidades de manose são hidrolisadas do polissacarídeo manano pela mananase. A atividade de degradação de manano dos polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser testada de acordo com procedimentos de teste de rotina conhecidos na arte. O Exemplo 5 proporciona um exemplo de um método de rotina para determinar a atividade de mananase.

[00162] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos uma substituição na posição 123, 158, 180, 272, 285, ou 307 ou uma combinação das mesmas.

[00163] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos uma substituição na posição M123, A158, F180, G272, T285, ou T307 ou uma combinação das mesmas.

[00164] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos uma substituição adicional na posição M123, A158, F180, G272, T307, ou L316, ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição adicional, duas substituições adicionais, três substituições adicionais ou quatro substituições adicionais.

[00165] Em uma modalidade, a posição 316 não é substituída. Isto é vantajoso para preservar o dobramento e a interação de resíduos próximos ao sítio em torno da posição 316. Além disso, a Fig. 8 mostra que em um detergente comercial pode ser obtida performance similar com menor quantidade de enzima quando se usa uma variante substituída ou não substituída em relação a 316.

[00166] Em uma modalidade, a variante de mananase compreende um conjunto de substituições listadas na Tabela 1.

[00167] Em uma modalidade, a substituição compreende uma substituição na posição referida para um aminoácido selecionado entre Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, e Val.

[00168] Em uma modalidade, a variante compreende pelo menos uma substituição ou um conjunto de substituições na posição ou nas posições: uma única substituição de M123, A158, F180, G272; T307, ou L316; ou M123 e G272; ou A158 e T307; ou L316; ou T307; ou M123, A158 e T307; ou M123 e L316; A158, T307, e L316; F180 e L316; ou M123, A158, G272; T307, e L316; ou uma combinação das mesmas.

[00169] Em uma modalidade, a substituição é uma substituição resultando em uma estabilidade aprimorada da variante.

[00170] Em uma modalidade, a variante compreende pelo menos uma substituição adicional selecionada entre: uma substituição a qual evita a glicosilação de N283; uma substituição de 283, ou 285; ou uma substituição de N283, T285, ou S285; ou uma substituição de T285 ou S285 para um resíduo diferente de T ou S uma substituição de T285 ou S285 para o resíduo A.

[00171] Em uma modalidade, a substituição adicional resulta em uma glicosilação alterada da variante quando produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação ligada por N. Em uma modalidade, a glicosilação alterada é um grau reduzido de glicosilação da variante.

[00172] Em uma modalidade, a variante tem atividade de mananase e compreende pelo menos uma substituição adicional de um aminoácido em uma posição correspondente à posição 123, 158, 180, 272, 307, ou 316, em que a variante tem atividade de mananase e é selecionada entre o grupo que consiste em: 1) uma variante tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com os resíduos 27 a 331 da SEQ ID NO: 2; 2) uma variante codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevado rigor com a) os nucleotídeos 79 a 993 da SEQ ID NO: 1 (man7) b) o complemento de comprimento total de a); e 3) uma variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNA genômico da mesma; e em que a numeração de aminoácidos corresponde à numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7).

[00173] Em uma modalidade, a variante compreende um resíduo P na posição 284 e/ou 286. Uma substituição para um resíduo P em qualquer uma ou em ambas as posições acima pode provocar uma modificação estrutural na variante, a qual evita glicosilação ligada por

N.

[00174] Em uma modalidade, na presente variante a posição T285 ou S285 é substituída por um resíduo diferente de T ou S.

[00175] Em uma modalidade, na presente variante a posição T285 ou S285 é substituída por uma alanina.

[00176] Em uma modalidade, a variante tem pelo menos 85% de identidade de sequência com os resíduos 27 a 331 da SEQ ID NO: 2, e um resíduo Asn não glicosilado na posição 283 quando produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação ligada por N.

[00177] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos um sítio N glicosilado adicional site, em que a posição correspondente ao N283 não é glicosilada. Uma variante semelhante é obtenível produzindo a variante em uma célula hospedeira, a qual seja capaz de N-glicosilação, resultando em pelo menos glicosilação parcial dos outros sítios de N-glicosilação, mas em que a N-glicosilação de N283 é inibida.

[00178] Em uma modalidade adicional, a presente variante não compreende qualquer sítio N glicosilado. Uma variante semelhante é obtenível produzindo a variante em uma célula hospedeira, a qual seja capaz de N-glicosilação, resultando em glicosilação da variante inibida.

[00179] Em uma modalidade, a variante tem um peso molecular previsto entre 50000 e 51000, de modo preferencial entre 50800 e 50970, sem incluir a sequência de sinalização.

[00180] Em uma modalidade, a variante tem um pI previsto entre 4,5 e 4,8, de modo preferencial entre 4,6 e 4,75.

[00181] A previsão de pI ou do peso molecular de uma variante pode ser realizada conforme descrito na Tabela 3.

[00182] Em uma modalidade adicional da invenção, a variante tem atividade de mananase. Em uma modalidade, a variante tem alguns resíduos Asn não glicosilados na posição 283 quando produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação ligada por N, e aumento da atividade específica em comparação com uma mananase selvagem quando produzida em uma célula hospedeira eucariótica.

[00183] Em uma modalidade da presente composição enzimática, a composição enzimática adicionalmente compreende uma ou mais enzimas adicionais selecionadas entre o grupo que consiste em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, liase de pectato, enzima pectinolítica, esterase, fitase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, DNAse, lacase, e/ou peroxidase, de modo preferencial selecionadas entre o grupo que consiste em proteases, amilases, celulases e lipases.

[00184] A presente composição enzimática compreendendo mananase e uma enzima adicional é vantajosa pelo fato de que proporciona efeito sinérgico. As enzimas adicionais referidas são desejadas quando a presente composição enzimática compreendendo mananase é usada em detergentes, por exemplo, ao lavar manchas. Enzimas sinérgicas particularmente vantajosas que funcionam com mananase em detergentes são amilases, proteases e celulases, ou uma combinação das mesmas, tal como uma composição compreendendo mananase, amilase e protease.

[00185] Em uma modalidade, a presente composição enzimática é proporcionada sob a forma de uma composição líquida ou uma composição sólida tal como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, torta, cristal, chorume de cristal, gel, ou pélete.

[00186] Em uma modalidade, a presente composição de detergente é sob a forma de um detergente líquido ou um detergente sólido, de modo preferencial sob a forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, um granulado, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado.

[00187] Em uma modalidade, a presente composição de detergente adicionalmente compreende uma ou mais enzimas adicionais selecionadas entre o grupo que consiste em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, liase de pectato, enzima pectinolítica, esterase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, lacase, DNAse e/ou peroxidase, de modo preferencial selecionadas entre o grupo que consiste em proteases, amilases, celulases e lipases.

[00188] A presente composição enzimática também pode ser usada em agentes de limpeza ou intensificadores que são adicionados por cima do detergente durante ou antes da lavagem e que são, por exemplo, sob a forma de líquido, gel, pó, grânulos ou comprimidos. Os componentes detergentes e a composição enzimática também podem ser encharcados em um suporte como têxteis.

[00189] A presente invenção adicionalmente se refere ao uso, e a um método de uso, da composição enzimática ou da composição de detergente conforme divulgado aqui, neste requerimento de patente, para a degradação de manano.

[00190] Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere ao uso, e a um método de uso, da composição enzimática ou da composição de detergente conforme divulgado aqui, neste requerimento de patente, em um processo de lavagem de roupa.

[00191] A presente invenção adicionalmente se refere a um método para a remoção de uma mancha de uma superfície, compreendendo por a superfície em contato com a composição enzimática ou a composição de detergente conforme divulgado aqui, neste requerimento de patente.

[00192] A presente invenção também se refere a um método para a degradação de manano compreendendo a aplicação da composição enzimática ou da composição de detergente conforme divulgado aqui, neste requerimento de patente, a manano, de modo preferencial em que o manano está sobre uma superfície de um têxtil, ou pelo menos parcialmente embutido em um têxtil.

[00193] Em geral as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) vão ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a uma ou mais enzimas vão estar presentes em quantidades efetivas.

[00194] Uma composição para uso em detergente sólido para lavar roupa, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, tal como 0,000005 a 2%, tal como 0,00001% a 1%, tal como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática por peso da composição.

[00195] Uma composição para uso em líquido para lavar roupa, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 3%, tal como 0,000005% a 1%, tal como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática por peso da composição.

[00196] Uma composição para uso em máquina de lavar louça automática, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, tal como 0,000005% a 2%, tal como 0,00001% a 1%, tal como 0,00001% a 0,1% de proteína enzimática por peso da composição.

[00197] Os componentes adicionais a a d do segundo aspecto da invenção proporcionam propriedades aprimoradas para a presente composição enzimática. A composição enzimática é compatível com os componentes adicionais e melhora a aplicabilidade da composição enzimática em vários usos.

[00198] Sais, tais como cloreto de sódio e sulfato de sódio funcionam como auxiliares de secagem.

[00199] A presente invenção adicionalmente se refere a diferentes usos da presente composição enzimática, tais como para a degradação de manano e para uso em um processo de lavanderia.

[00200] Em uma modalidade, a variante de mananase compreende uma região de núcleo.

[00201] Em uma modalidade, a variante de mananase compreende uma CBM.

[00202] É vantajoso proporcionar mananases que conservem atividade em temperaturas acima da temperatura ambiente para aplicações em que é necessária a degradação de manano em semelhantes condições. Além disso, as mananases de acordo com a invenção podem ter boa estabilidade e atividade em condições alcalinas, o que é vantajoso em uso de detergente e em processamento de biomassa.

[00203] Em uma modalidade, a variante de mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos, ou cerca de, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[00204] Em uma modalidade, a variante de mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[00205] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos, a qual não é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2 [Man7].

[00206] Em uma modalidade do terceiro aspecto, a célula hospedeira é selecionada entre o grupo que consiste em: células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de modo preferencial entre o grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse

Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste nas Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e Genera Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium, e Scedosporium; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, células bacterianas, de modo preferencial Bacilos Gram positivos, tais como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, bactérias Gram negativas, tais como Escherichia coli, actinomicetos, tais como Streptomyces sp., e leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, de modo o mais preferencial Trichoderma reesei ou Bacillus.

[00207] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica capaz de glicosilação ligada por N. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é Trichoderma reesei.

[00208] A célula hospedeira recombinante pode ser usada para produzir a variante de mananase e carregar um polinucleotídeo codificando a mesma. A célula hospedeira recombinante é útil também na preparação de variantes de mananase com diferentes propriedades. Por exemplo, pode ser selecionada uma célula hospedeira, a qual proporciona modificações pós-translacionais benéficas para estabilidade ou atividade, ou a qual facilita o pós- processamento e a formulação da variante de mananase produzida na célula hospedeira.

[00209] Em uma modalidade, a presente composição enzimática compreende a célula hospedeira recombinante do segundo aspecto.

[00210] Em uma modalidade, a presente variante de mananase é um polipeptídeo recombinante, o qual é uma proteína de fusão.

[00211] Em uma modalidade, o presente polipeptídeo recombinante é uma proteína de fusão, a qual adicionalmente compreende pelo menos uma de: uma sequência de aminoácidos proporcionando uma sequência de sinalização secretora; uma sequência de aminoácidos a qual facilita a purificação, tal como um marcador de afinidade, His-tag; uma sequência de aminoácidos, a qual aumenta a produção, tal como uma sequência de aminoácidos, a qual é um veículo, tal como CBM; uma sequência de aminoácidos tendo uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos proporcionando a proteína de fusão com afinidade de ligação, tal como uma porção de ligação a carboidrato.

[00212] A CBM, porção de ligação a carboidrato, como um veículo, é vantajosa, por exemplo, na produção de Trichoderma.

[00213] Em uma modalidade, a célula hospedeira é não patogênica.

Isto é particularmente vantajoso para utilização da célula hospedeira em ração, e em aplicações de detergente tais como em detergentes domésticos para lavar roupa.

[00214] Em uma modalidade do quinto aspecto, o material contendo manano é selecionado entre material à base de planta, têxtil, águas residuais, esgoto, óleo ou uma combinação dos mesmos.

[00215] Em uma modalidade, o material contendo manano é material têxtil ou tecido.

[00216] Em outra modalidade, o material contendo manano é papel usado reciclado; polpa mecânica, polpa química, polpa semi química, papel Kraft ou outras polpas de fabricação de papel; fibras submetidas a processo de maceração; ou material contendo goma guar ou goma de alfarroba.

[00217] Em outra modalidade, a degradação ou modificação é realizada em um ambiente aquoso em que a mananase apresenta atividade.

[00218] Em uma modalidade preferencial, o material contendo manano, o qual é degradado ou modificado no método, está sobre um têxtil ou um tecido opcionalmente com manchas de manano. Por degradação do manano anexado ao têxtil ou tecido, sujeira ou terra ligada a manano é liberada e não é capaz de se ligar de novo ao manano ou às manchas de manano. O têxtil ou tecido pode ser de qualquer material, por exemplo, algodão, linho (flax / linen), juta, rami, sisal ou fibra de coco ou celulósicos arrificiais (por exemplo, originários de polpa de madeira) incluindo viscose / rayon, modal, fibras de acetato de celulose (tricell), lyocell, cupro ou combinações dos mesmos.

[00219] Em uma modalidade, a presente ração compreende ou consiste em refeição de milho e de soja.

[00220] Em uma modalidade, a fonte de proteína de origem vegetal compreende ou consiste em soja, cereal tal como cevada, trigo, centeio, aveia, ou milho.

[00221] Em uma modalidade, o produto ou sub-produto contendo manano compreende ou consiste em palmiste, refeição de guar ou refeição de copra.

[00222] Em uma modalidade, a presente ração animal ou o presente suplemento alimentar é formulado sob a forma de uma composição a úmido ou de uma composição a seco.

[00223] Em uma modalidade, a composição compreendendo pelo menos uma variante de mananase é usada na indústria de polpa e papel, biobranqueamento, modificação de fibras, melhora da drenagem e na indústria de petróleo, isto é, em exploração de petróleo ou na indústria de serviços de petróleo para hidro-fraturamento ou controle da viscosidade dos fluidos de perfuração.

[00224] Em uma modalidade, a composição compreendendo pelo menos uma variante de mananase é usada na indústria têxtil e de detergente, processamento de biomassa e nahidrólise de biomassa, de modo preferencial nas indústrias de biocombustível, amido, polpa e papel, alimentos, panificação, ração ou bebida.

[00225] Em uma modalidade, a variante de mananase hidrolisa ligações endo-beta-1,4-manosídicas aleatoriamente.

[00226] Em uma modalidade, a variante de mananase, ou a sequência de nucleotídeos codificando a mananase selvagem correspondente, é obtenível ou derivável a partir de uma fonte bacteriana.

[00227] Em uma modalidade, a variante de mananase é fundida com pelo menos um polipeptídeo adicional, deste modo formando um polipeptídeo de fusão. O polipeptídeo de fusão ou o polipeptídeo adicional pode ter outras atividades catalíticas ou de ligação além das atividades de mananase. Em uma modalidade, o polipeptídeo adicional compreende ou consistem em módulo de ligação de carboidrato, o qual é opcionalmente um fragmento de outra proteína ou enzima derivada do mesmo organismo que a mananase ou derivada de um organismo diferente.

[00228] Em uma modalidade, a variante de mananase é conectada ao polipeptídeo adicional com um encadeador.

[00229] Em uma modalidade, é proporcionado um processo para tratamento à máquina de tecidos, cujo processo compreende o tratamento do tecido durante um ciclo de lavagem de um processo de lavagem à máquina com uma solução de lavagem contendo a variante de mananase do primeiro aspecto ou a composição enzimática do segundo aspecto.

[00230] Em uma modalidade, é proporcionado um uso da composição enzimática do segundo aspecto ou a variante de mananase do primeiro aspecto, junto com uma enzima selecionada entre protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, liase de pectato, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para a limpeza de tecido e/ou a remoção de mancha de tecidos.

[00231] Em uma modalidade, é proporcionado um uso da variante de mananase do primeiro aspecto, ou a composição enzimática do segundo aspecto, junto com uma enzima selecionada entre protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, liase de pectato, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para a limpeza de superfícies duras tais como pisos, paredes, azulejos de banheiro e semelhantes.

[00232] Em uma modalidade, é proporcionado um uso da variante de mananase do primeiro aspecto, ou a composição enzimática do segundo aspecto, junto com uma enzima selecionada entre protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, liase de pectato, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para lavagem de louça manual e à máquina.

EXEMPLOS

[00233] Os exemplos que se seguem são proporcionados para ilustrar vários aspectos da presente invenção. Eles não se destinam a limitar a invenção, a qual é definida pelas reivindicações anexadas. Exemplo 1. Esquema de variante

[00234] De modo a melhorar a estabilidade e a atividade específica da mananase Man7 selvagem, foram projetadas séries de variantes com base na análise estrutural da enzima selvagem. O modelo estrutural de Man7 foi criado usando o software Bioluminate (Schrödinger LCC) com coordenadas de Endo-Beta-D-1,4-Mananase de Bacillus sp. (1WKY). O esquema incluiu duas ou mais mutações específicas por variante. A Tabela 1 mostra uma lista de variantes. A numeração de aminoácidos corresponde à numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7) sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência de sinalização. Tabela 1. Lista de variantes de Man7 Variante Mutações TBH1: M123I, S229A, G272Q, T285A TBH2: A158S, S229A, T285A, T307R TBH3: S229A, T285A, L316K TBH4: M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R TBH5: M123I, S229A, G272Q, T285A, L316K

TBH6: A158S, S229A, T285A, T307R, L316K TBH7: F180L, S229A, T285A, L316K TBH8: S229A, T285A TBH9: S229A, T285A, N300Q, N340Q, S400A, N419A, S433A, N446Q TBH10: A158S, S229A, T307R, L316K TBH11: A158S, T285A, T307R, L316K TBH14: M123I, S229A, G272Q, T285A, L316K, A158S, T307R BH18: M123I, G272Q BH21: A158S, T307R BH23: M123I, A158S, G272Q, T307R BH24: M123I, G272Q, L316K BH25: A158S, T307R, L316K Exemplo 2. Clonagem de genes variantes de mananases sintéticas

[00235] Métodos de biologia molecular de rotina foram usados no isolamento e em tratamentos enzimáticos de DNA (por exemplo, isolamento de DNA de plasmídeo, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, sequenciamento, etc. Os métodos básicos usados foram conforme descrito pelo fabricante de enzima, reagente ou kit.

[00236] As variantes tbh1 - tbh11 foram solicitadas da GenScript como constructos sintéticos sem suas próprias sequências codificantes de peptídeo de sinal e com otimização de codon para Trichoderma reesei. DNAs de plasmídeos obtidos da GenScript incluindo os genes tbh1 - tbh11 foram ressuspensos em água estéril, digeridos com enzimas de restrição NruI e BamHI (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante e clonados em um vetor de expressão clivado com NruI e BamHI. Misturas de ligação foram transformadas em células XL1-Blue ou XL10-Gold de

Escherichia coli (AH Diagnostics) e laminadas sobre placas LB (Luria- Bertani) contendo 50 a 100 µg/ml de ampicilina.

Várias colônias de E. coli foram coletadas das placas e o DNA foi isolado com o kit GenJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific). Os clones positivos foram triados usando digestões de restrição e foi demonstrado que continham insertos de tamanhos esperados.

Os sítios de fusão ao plasmídeo de expressão de genes de mananase tbh1- tbh11 foram seqüenciados e os plasmídeos foram denominados pALK4415 - pALK4423, pALK4430 e pALK4431, respectivamente (Para detalhes, vide o Exemplo 4). Os DNAs de plasmídeo incluindo os genes thb liberados por GenScript também foram transformados em células de E. coli XL10-Gold (Agilent) e depositados junto à coleção de cepas da DSMZ.

As informações relevantes sobre os genes e as sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NOs: 5 a 36) estão resumidas na Tabela 2 e na Tabela 3, respectivamente.

As cepas de E. coli RF12379 - RF12387, RF12456 e RF12457 incluindo os plasmídeos pALK4434 - pALK4442, pALK4432 e pALK4433, respectivamente, foram depositadas junto à coleção DSMZ sob os números de acesso DSM 32425, DSM 32426, DSM 32427, DSM 32428, DSM 32429, DSM 32430, DSM 32431, DSM 32432, DSM32433, DSM 32518 e DSM 32519, respectivamente.

Tabela 2. O sumário sobre os genes sintéticos tbh1 - tbh11 codificando variantes de mananase Gene Comprimento (bp)(a SEQ ID NO tbh1 1395 5 tbh2 1395 7 tbh3 1395 9 tbh4 1395 11 tbh5 1395 13 tbh6 1395 15 tbh7 1395 17 tbh8 1395 19 tbh9 1395 21 tbh10 1395 23 tbh11 1395 25 (a O STOP códon é incluído Tabela 3. O sumário das sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências de genes codificando variantes de mananase. Proteí- No. de Compri CBM Núcleo Prevista Prevista SEQ na aas (b mento (aa - aa) (Da), ss pI, ss não ID Man de ss (a não incluída (b NO (b incluída TBH1 464 26 Sim 27 - 331 50886 4,62 6 TBH2 464 26 Sim 27 - 331 50904 4,67 8 TBH3 464 26 Sim 27 - 331 50848 4,67 10 TBH4 464 26 Sim 27 - 331 50957 4,67 12 TBH5 464 26 Sim 27 - 331 50901 4,67 14 TBH6 464 26 Sim 27 - 331 50919 4,72 16 TBH7 464 26 Sim 27 - 331 50814 4,67 18 TBH8 464 26 Sim 27 - 331 50833 4,62 20 TBH9 464 26 Sim 27 - 331 50800 4,62 22 TBH10 464 26 Sim 27 - 331 50949 4,72 24 TBH11 464 26 Sim 27 - 331 50935 4,72 26 (a A previsão sobre a sequência de sinalização foi feita usando o programa SignalP v3.0, NN/HMM (Nielsen et al., 1997; Nielsen & Krogh, 1998; Bendtsen et al., 2004). (b A sequência de sinalização prevista não foi incluída. A previsão foi feita usando Clone Manager Professional versão 9 for Windows, Sci-Ed Software. Exemplo 3. Mutagênese direcionada ao sítio de gene man7

[00237] A menos que declarado de modo diverso, foram usados os métodos de biologia molecular de rotina incluindo manipulações e transformações de DNA. As mutações foram introduzidas por mutagênese direcionada ao sítio conforme descrito em Kunkel 1985.

As mutações geradas estão listadas na Tabela 4. A numeração de aminoácidos corresponde à numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7). Tabela 4. Lista de mutações introduzidas em Man7 por mutagênese direcionada ao sítio Variante Nr. Mutação SEQ ID SEQ ID NO (nt) NO (aa) BH18 M123I, G272Q 27 28 BH21 A158S, T307R 29 30 BH23 M123I, A158S, G272Q, T307R 31 32 BH24 M123I, G272Q, L316K 33 34 BH25 A158S, T307R, L316K 25 36

[00238] Para amplificação, foi usada a Pfx Accu Prime Polymerase (Invitrogen). Foram realizadas PCRs de acordo com as instruções do fabricante. Foram usadas as seguintes condições de PCR para construção dos plasmídeos de expressão: 120 seg de desnaturação inicial a 94°C, seguida por 35 ciclos de 15 seg a 94°C, 30 seg de recozimento em um dos seguintes 50/55°C, 110/290 seg extensão a 68°C e a extensão final a 68 °C por 10 min. O pEV1 man7 foi usado como modelo para PCR. As sequências de iniciadores usados para clonagem são mostradas na Tabela 5. Os ressaltos para hibridização estão sublinhados. Tabela 5. Lista de iniciadores usados para a geração de variantes de man7 Com- Seq Modelo Iniciador pri- Sequência ID No mento

GATGCAACAGGATCTAATTCTAT pEV1 man7 Man7_Var1 30 TGCTGAC 37

GCTAGCCAACCGACTTGTCTTTG pEV1 man7 Man7_Var2 34 TTGCGAGTAGC 38 pEV1 man7 Man7_Var3 21 GATCCTGTTGCATCGTGAACC 39 pEV1 man7 Man7_Var4 20 GTCGGTTGGCTAGCTTGGTC 40 pEV1 man7/ ATGAATGGTATGGATCATGGGA pEV1 BH18 Man7_Var5 25 CGG 41 pEV1 man7/ GGCCCGTGGACAATTCTATTTCC pEV1 BH18 Man7_Var6 25 CC 42 pEV1 man7/ pEV1 BH18 Man7_Var7 22 TCCATACCATTCATTGGCAATG 43 pEV1 man7/ pEV1 BH18 Man7_Var8 20 ATTGTCCACGGGCCTAATGG 44 pEV1 Var1/ pEV1 BH21 Man7_Var9 21 GAAACATCCATTCCAAGCTCG 45 pEV1 Var1/ AATGGATGTTTCTTTTAATCCATT pEV1 BH21 Man7_Var10 31 AGGCCCG 46 pEV1 Var1/ CGGTATATCTCTGTCTTATTGGA pEV1 BH21 Man7_Var11 36 TTGTTACATGATC 47 pEV1 Var1/ pEV1 BH21 Man7_Var12 21 GACAGAGATATACCGACAGTG 48

[00239] Para fins de clonagem, foi usado NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt) de acordo com as instruções do fabricante do kit. Os plasmídeos expressão gerados (Fig. 1) foram transformados por competência induzida em Bacillus subtilis SCK6 conforme descrito em Zhang & Zhang 2011. As células transformadass foram laminadas sobre placas LB (Luria-Bertani) suplementadas com 10 mg/l de Canamicina. As placas foram incubadas por 20 horas a 37°C. As colônias em crescimento foram selecionadas e o plasmídeo foi isolado usando o kit QiaPrep MiniPrep Kit (Qiagen, Alemanha). O procedimento de isolamento foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante para preparações de plasmídeos Gram positivos. Os insertos foram seqüenciados por meio de sequencimento de Sanger (GATC, Alemanha) e divulgaram as sequências de DNA correspondentes às partes maduras das variantes 1 a 5. Foram realizadas comparações de sequências usando o alinhamenot de sequências ClustalW (Thompson et al 1994). Finalmente, os plasmídeos de expressão foram transformados em uma cepa de produção de Bacillus através de eletroporação. A cepa de produção de Bacillus foi cultivada em meio de eletroporação contendo 20 g/l de

Trypton, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 2 M de sacarose e foram colhidos 10 ml em uma OD (600 nm) de 0,4. As células foram lavadas com tampão de eletroporação contendo 0,272 M de sacarose, 1 mM de MgCl2 e 7 mM de KH2PO4 e finalmente foram ressuspensas em 250 μl de tampão de eletroporação. Foi realizada eletroporação usando as seguintes condições: 1,2 kV, 150 Ω, 50 μF. 1 ml de meio de eletroporação foi adicionado depois disso e as células foram incubadas por 3 horas a 37°C. As células foram laminadas sobre placas LB suplementadas com 20 mg/l de canamicina e incubadas por 18 horas a 37°C. Os clones foram verificados conforme descrito acima e usados para a geração de material para testes analíticos. Portanto, as cepas foram inoculadas em uma expressão padrão sob condições de indução de proteína e incubadsa por 30 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram colhidos e usados para testes analíticos e de aplicação. Exemplo 4. Produção de proteínas variantes de mananase recombinantes em Trichoderma reesei

[00240] Plasmídeos de expressão foram construídos para a produção de proteínas mananase recombinante TBH1 a TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26) em Trichoderma reesei. Os plasmídeos de expressão construídos estão listados na Tabela 6. Os genes de mananase recombinante sem suas próprias sequências de sinalização foram fundidos ao promotor de T. reesei cel7A/cbh1 com veículo e encadeador de CBM de T. reesei cel6A/cbh2 seguiro pelo sítio de reconhecimento de protease Kex2. A terminação de transcrição foi assegurada pelo terminador de T. reesei cel7A/cbh1 e o gene marcador de A. nidulans amdS foi usado para seleção dos transformantes conforme descrito em Paloheimo et al. (2003). Os cassetes de expressão lineares (Fig. 2) foram isolados das espinhas dorsais dos vetores depois de digestões por NotI e foram transformados dentro de protoplastos de T. reesei. As cepas hospedeiras usadas não produzem qualquer uma das quatro principais celulases de T. reesei (CBHI, CBHII, EGI, EGII). As transformações foram realizadas como em Penttilä et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al. (1993), selecionando acetamidase como uma única fonte de nitrogênio (gene marcador amdS). Os transformantes foram purificados sobre placas de seleção através de conídios únicos antes de esporulação dos mesmos sobre PD. Tabela 6. Os cassetes de expressão construídos para produzir proteínas recombinantes TBH1 a TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26), em Trichoderma reesei. A estrutura global dos cassetes de expressão foi conforme descrito na Fig. 2. Proteína mananase Plasmídeo de Cassete de expressão (a expressão TBH1 pALK4415 7,5 kb NotI TBH2 pALK4416 7,5 kb NotI TBH3 pALK4417 7,5 kb NotI TBH4 pALK4418 7,5 kb NotI TBH5 pALK4419 7,5 kb NotI TBH6 pALK4420 7,5 kb NotI TBH7 pALK4421 7,5 kb NotI TBH8 pALK4422 7,5 kb NotI TBH9 pALK4423 7,5 kb NotI TBH10 pALK4430 7,5 kb NotI TBH11 pALK4431 7,5 kb NotI TBH14 pALK4668 7,5 kb NotI (a O cassete de expressão para transformação em T. reesei foi isolado a partir da espinha dorsal dos vetores usando digestões por NotI.

[00241] A produção de mananase dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes da cultura das culturas dos frascos de agitação. Os transformantes foram inoculados a partir de inclinações de PD para agitar frascos contendo 50 ml de meio indutor de celulase à base de complexo de lactose (Joutsjoki at al. 1993) tamponado com 5% de KH2PO4. A produção de proteína mananase dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes da cultura depois de cultivar os mesmos por 7 dias a 30°C, 250 rpm. A produção heteróloga de proteínas recombinantes foi analisada por SDS-PAGE com coloração com Coomassie subsequente. Os sobrenadantes foram recuperados também para testes de aplicação por centrifugação.

[00242] Os melhores transformantes produtores são escolhidos para serem cultivados em biorreatores em escala laboratorial. Os transformantes foram cultivados em biorreatores quer em lote ou por tipo de processo de alimentação adicional sob condições de indução de proteína em uma temperatura de cultura fúngica mesofílica típica e condições ligeiramente acidíferas. A cultura foi continuada até o esgotamento dos açúcares do meio ou até ter sido atingido um rendimento adequado. Os sobrenadantes foram recuperados para testes de aplicação por centrifugação ou por filtração. Exemplo 5. Teste de atividade de galactomananase por método de

DNS

[00243] A atividade de mananase (MNU) foi medida como a liberação de açúcares redutores a partir de galactomanano (0,3 w/w- %) a 50°C e pH 7,0 em 5 min. A quantidade de carboidratos redutores liberados foi determinada espectrofotometricamente usando ácido dinitrosalicílico.

[00244] Substrato (0,3 w/w-%) usado no teste foi preparado como se segue: 0,6 g de goma de alfarroba (Sigma G-0753) foi em 50 mM de tampão de citrato de sódio pH 7 (ou tampão de citrato fosfato pH 7) a cerca de 80°C usando um stirrer magnético de aquecimento e aquecido até o ponto de ebulição. A solução foi arrefecida e deixada para dissolver de um dia para o outro em um ambiente a frio (2 a 8°C) com agitação contínua e resíduos insolúveis foram removidos por centrifugação. Depois daquela solução foi preenchida até 200 ml por tampão. Substrato foi armazenado à medida que congelado e fundido por aquecimento em um banho de água fervente a cerca de 80 °C, arrefecido até a temperatura ambiente e misturado cuidadosamente antes do uso.

[00245] O reagente de DNS usado no teste foi preparado dissolvendo 50 g de ácido 3,5-dinitrosalisílico (Sigma D-550) em cerca de 4 litros de água. Com agitação magnética contínua, 80,0 g de NaOH foi gradualmente adicionado e deixado para dissolver. Uma quantidade de 1500 g de Sal de Rochelle (K-Na-tartarato, Merck 8087) foi adicionada em pequenas porções com agitação contínua. A solução que foi cuidadosamente aquecida até uma temperatura máxima de 45°C., foi arrefecida até a temperatura ambiente e preenchida até 5000 ml. Depois disso, foi filtrada através de papel filtro Whatman 1 e armazenada em uma garrafa escura em temperatura ambiente.

[00246] A reação foi primeiro iniciada adicionando 1,8 ml de solução de substrato a cada um dos dois tubos de teste e deixada para equilibrar a 50°C por 5 minutos, depois do qual 200 μl de solução de enzima convenientemente diluída foi adicionada a um dos tubos, bem misturada com misturador de vórtice e incubada exatamente por 5 min a 50°C. Os vazios enzimáticos não precisam ser equilibrados ou incubados. A reação foi interrompida por adição de 3,0 ml de reagente DNS dentro de ambos os tubos e misturada. 200 μl de solução de amostra foi adicionado aos tubos de vazios enzimáticos. Ambos os tubos foram colocados em um banho de água em ebulição. Depois de ebulição por exatamente 5 minutos, os tubos foram colocados em um banho de água refrigerante e deixados para arrefecer até a temperatura ambiente. A absorbância da amostra foi medida contra o vazio enzimático a 540 nm e a atividade foi lida a partir da curva de calibração e multiplicada pelo fator de diluição. Uma amostra diluída adequada produziu uma diferença de absorbância de 0,15 a 0,4.

[00247] Foi preparada uma curva padrão 20 mM de solução de estoque de manose dissolvendo 360 mg de manose (SigmaM-6020, armazenada em um dessicante) em tampão de teste e diluída para soluções contendo 3, 6, 10 e 14 μmol/ml de manose. Os padrões foram manuseados como as amostras exceto por incubação a 50°C. As absorbâncias foram medidas contra o vazio de reagente (contendo tampão ao invés de padrão de diluição de manose) a 540 nm. Foi construída uma curva de calibração para cada série de testes.

[00248] Uma unidade de mananase (MNU) foi definida como a quantidade de enzima que produz carboidratos redutores tendo uma potência redutora correspondente a um nmol de manose de galactomanano em um segundo sob as condições de teste (1 MNU = 1 nkat). Exemplo 6. Performance de remoção de mancha de variantes de mananase produzidas em Trichoderma com detergentes comerciais

[00249] Amostras de cultura das variantes TBH1 a TBH11 produzidas em Trichoderma (conforme descrito no Exemplo 4) foram testadas para sua capacidade para remover cepas de rotina sensíveis a mananase a 40 °C e dureza da água de 16°dH com detergentes comerciais e em comparação com enzima selvagem. Foram usados os panos de teste sujos artificialmente do Center for testmaterial B.V. (Países Baixos): Pudim de chocolate sensível a mananase sobre algodão (E-165), Goma de alfarroba, com pigmento sobre algodão (C- S-73) e Goma guar com negro-de-fumo sobre algodão (C-S-43). O tecido foi cortado em amostras de 6 cm x 6 cm e foram usados 2 pedaços de cada no teste.

[00250] Detergente líquido para limpeza pesada comercial A contendo todas as outras enzimas com exceção de mananase foi usado em uma concentração de 4,4 g por litro de solução de lavagem, Detergente em pó colorido comercial sem enzimas foi usado a 3,8 g/l e detergente em pó alvejante comercial sem enzimas foi usado a 4,2 g/l. Detergente contendo soluções de lavagem foram preparados em água corrente sintética com dureza de 16 °dH. Protease Savinase® 16 L (0,5 w/w %) e amilase Stainzyme® 12 L (0,4 w/w %) foi adicionado em água dura usada com detergentes em pó comerciais coloridos e alvejantes, o detergente líquido já continha amilase e protease. O pH da solução de lavagem do detergente líquido foi de cerca de 8,3, com o detergente em pó colorido de cerca de 10 e com o detergente alvejante de cerca de 9,5.

[00251] As mananases foram dosadas como 0,025 e/ou 0,05 MNU de atividade por ml de solução de lavagem. A atividade foi medida conforme descrito no Exemplo 5. A amostra de controle continha a solução detergente sem mananase.

[00252] Para água corrente sintética com dureza de 16 °dH, as seguintes soluções de estoque foram preparadas em água desionizada (Milli-Q ou equivalente): Solução de estoque com 1000 °d Cálcio-dureza: CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Alemanha) 26,22 g/l Solução de estoque com 200 °d Magnésio-dureza: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Alemanha) 8,79 g/l de H2O Solução de estoque de NaHCO3: NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Alemanha) 29,6 g/l

[00253] 13,3 ml de solução de CaCl2, 13,3 ml de solução de MgSO4 e 10,0 ml de solução de NaHCO3 recém produzida foram adicionados em um frasco volumétrico na ordem dada, preenchidos até 1 litro com água desionizada e misturados. A dureza da água foi determinada por titulação complexométrica e considerada correta.

[00254] Foram realizados tratamentos de remoção de mancha em Atlas LP-2 Launder-Ometer como se segue. Primeiro o Launder- Ometer foi pré-aquecido até 40°C. Em seguida detergente, 250 ml de água corrente sintética com dureza de 16 °dH e enzima diluída (<1,0 ml) foram adicionados dentro de recipientes de 1,2 litro. As manchas foram adicionadas e o Launder-Ometer foi operado a 40°C por 60 min com uma velocidade de rotação de 42 rpm. Depois disso as amostras foram cuidadosamente enxaguadas sob água corrente e secas de um dia para o outro no ar interior, sobre uma grade protegida contra a luz do dia.

[00255] O efeito de remoção de mancha foi avaliado medindo a cor como valores de refletância com o espectrofotômetro Konica Minolta CM-3610A usando as coordenadas espaciais de cor L*a*b* (illuminant D65/10°, corte de 420 nm). O desbotamento das manchas, indicando a performance da mananase (eficiência da remoção de mancha) foi calculado como ΔL* (delta L*), o qual significa valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima menos valor de luminosidade L* do tecido tratado com solução de lavagem sem mananase (controle). Os resultados fionais (efeito de remoção de mancha total) foram mostrados como soma de ΔL* de cada 3 manchas. Os valores de cor de cada uma das manchas foram ponderados de 2 amostras.

[00256] Os resultados obtidos com detergente líquido comercial são mostrados na Fig 3, os resultados com detergente em pó colorido comercial, na Fig 4 e os resultados com detergente alvejante comercial, na Fig 5. Todas as variantes (TBH1 a TBH11) apresentaram excelente performance de remoção de mancha com detergentes comerciais de diferentes tipos. A performance das variantes foi similar à selvagem. Exemplo 7. Performance de remoção de mancha de variantes de mananase produzidas em Bacillus com detergente comercial

[00257] Sobrenadantes de cultura das variantes BH18, BH21, BH23, BH24 e BH25 produzida em Bacillus (conforme descrito no Exemplo 3) foram testados para sua capacidade para remover manchas de rotina sensíveis a mananase a 40°C e dureza da água de 16°dH com detergentes comerciais e em comparação com enzima selvagem. Foi usado um sistema de teste similar ao descrito no Exemplo 6.

[00258] Os resultados obtidos com detergente líquido comercial são mostrados na Fig 6, os resultados com detergente em pó colorido comercial, nas Figs 7 e os resultados com detergente alvejante comercial, na Fig 8. Todas as variantes (BH18, BH21, BH23, BH24, BH25) apresentaram excelente performance de remoção de mancha com detergentes comerciais de diferentes tipos. A performance das variantes foi similar à selvagem. Exemplo 8. Estabilidade das variantes de mananase em detergente líquido comercial a 37°C

[00259] A estabilidade dos sobrenadantes da cultura de várias variantes de mananase produzidas em Trichoderma (conforme descrito no Exemplo 4) ou Bacillus (conforme descrito no Exemplo 3) foi testada em detergente líquido para limpeza pesada comercial A contendo protease e todas as outras enzimas com a exceção de mananase e em comparação com as enzimas selvagens. Preparações de mananase foram adicionadas 4 w/w-% em detergente e as amostras foram incubadas dentro de tubos de plástico com tampas a 37°C por cerca de 16 ou 24 semanas. A atividade foi medida em determinados intervalos por teste de atividade descrito no Exemplo 5 exceto que usando um tempo de incubação de 30 min. Os resultados foram calculados como atividade residual (%), a qual foi obtida dividindo a atividade de uma amostra tomada em um determinado ponto do tempo pela atividade inicial da amostra.

[00260] A estabilidade das variantes TBH2, TBH3, TBH4, TBH5 e especialmente TBH6 foi aprimorada em comparação com a enzima selvagem de Man7 produzida em Trichoderma, quando armazenadas em temperatura elevada como 37°C por 24 semanas. Resultados de testes de estabilidade com TBH6 em comparação com a enzima selvagem são mostrados na Fig. 9.

[00261] A estabilidade das variantes BH21, BH23, BH24 e especialmente BH25 foi aprimorada em comparação com a enzima selvagem de Man7 produzida em Bacillus quando armazenadas em temperatura elevada como 37°C por várias semanas. Resultados de testes de estabilidade com com BH25 em comparação com com a enzima selvagem são mostrados na Fig. 10. Exemplo 9. Estabilidade das variantes de mananase em detergente líquido comercial a 50°C

[00262] A estabilidade de sobrenadantes da cultura das variantes TBH1 a TBH11 produzidas em Trichoderma (conforme descrito no Exemplo 4) foi testada em detergente líquido comercial para limpeza pesada A contendo protease, mas não contendo mananase e em comparação com a enzima selvagem em condições extremas. Preparações de mananase foram adicionadas 4 w/w-% em detergente e as amostras foram incubadas dentro de tubos de plástico com tampas a 50°C por 7 dias. A atividade foi medida por testes de atividade descrito no Exemplo X exceto que usando um tempo de incubação de 30 min. Os resultados foram calculados como atividade residual (%), a qual foi obtida dividindo a atividade de uma amostra tomada em um determinado ponto do tempo pela atividade inicial da amostra.

[00263] Com base nos resultados mostrados na Fig 11, a estabilidade de todas as enzimas variantes foi melhor em comparação com a enzima selvagem a 50°C por 7 dias. A estabilidade em condições extremas foi consideravelmente aprimorada especialmente com TBH1, TBH2, TBH4, TBH5 TBH6, TBH10 e TBH11 em comparação com a enzima selvagem.

[00264] Algumas das melhores produtoras de variantes foram cultivadas em biorreatores em escala laboratorial e a estabilidade foi retestada usando um sistema de teste similar conforme descrito acima, com a exceção de que a quantidade da preparação de mananase foi de 1 w/w-% em detergente. A estabilidade das variantes de mananase TBH5 e TBH6 foi consideravelmente melhor do que a selvagem também quando foi usado material de cultura em escala laboratorial (dados não mostrados).

[00265] Os resultados mostram que as variantes de mananase têm excelente performance de remoção de mancha e estabilidade consideravelmente aprimorada em comparação com a enzima selvagem, especialmente em temperaturas elevadas. Também podem ser produzidas de maneira mais econômica devido a sua maior atividade específica e rendimento da produção (dados não mostrados). Exemplo 10. Combinação das variantes TBH5 e TBH6

[00266] De modo a melhorar ainda mais as propriedades da mananase, as mutações nas variantes TBH5 e TBH6 foram combinadas (M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R e L316K). A variante de combinação TBH14 foi preparada como constructo sintético, clonado dentro do vetor de expressão e produzida em Trichoderma reesei conforme descrito nos Exemplos 2 e 4. A estabilidade da variante de combinação TBH14 foi testada a 50⁰C por 7 dias conforme descrito no Exemplo 9. As variantes TBH6 e TBH5 foram usadas para comparação. Os resultados são mostrados na Figura 13. A estabilidade da variante de combinação TBH14 foi pelo menos tão boa ou melhor do que a das variantes TBH6 ou TBH5, que apresentaram estabilidade aprimorada em comparação com a enzima selvagem no Exemplo 9, isto é, também a estabilidade de TBH14 foi aprimorada em comparação com a enzima selvagem produzida em Trichoderma quando armazenadas em temperaturas elevadas como 50⁰C por vários dias. A variante de combinação TBH14 também apresentou excelente performance de remoção de mancha (similar à enzima selvagem) com detergentes comerciais. Exemplo 10b. Estudo de eficiência com mananase isolada e em combinação com uma enzima de degração de polissacarídeo não amido (NSP) em frangos de corte

[00267] Efeitos de variantes de mananase recombinantes da invenção são estudados sobre o crescimento em frangos de corte. Ultrafiltrado do caldo de fermentação incluindo a mananase recombinante é seco e níveis alvo aplicados a uma dieta para frango de corte peletizada isolada ou em combinação com um produto comercial à base de xilanase disponível.

[00268] Uma dieta de controle à base de milho e refeição de soja extraída com solvente descascada é introduzida sem enzima ou adicoinada por níveis diferentes da mananase recombinante da invenção isolada ou em combinação com uma dose padrão de uma xilanase comercial.

[00269] O peso inicial dos frangos de corte é entre 30 g e 50 g. O teste dura entre três e cinco semanas. Cada tratamento consiste pelo menos de seis replicatas com 10 frangos de corte cada. Em cada caso a dieta é analisada para umidade, proteína crua, fibra crua, gordura, cinzas, e proteína enzimática.

[00270] São preparadas cinco dietas: 1) controle não suplementado (BD) 2) BD + mananase 1 – 500 mg/kg 3) BD + mananase 1 – 1000 mg/kg 4) BD + mananase 1 – 500 mg/kg + xilanase 1 – 10 mg/kg

5) BD + xilanase 1 – 10 mg/kg

[00271] O estado de saúde e mortalidade dos animais é checado diariamente por inspeção visual. Nos dias 0, 14, e 35 são medidos o ganho de peso corporal (BW), a ingestão de ração (FI), e a taxa de conversão de ração (FCR). A FCR é calculada como a ração total consumida dividida pelo ganho de peso durante o mesmo período. A determinação do efeito das variantes de mananase recombinantes é baseada na comparção dos animais alimentados com a mesma dieta ou com a mesma dieta porém adicionada com xilanase. Exemplo 11. Produção de café instantâneo

[00272] Manano puro é o principal componente polissacarídico de armazenamento dos endospermas do café e é responsável por sua alta viscosidade, a qual afeta negativamente o processamento tecnológico do café instantâneo e aumenta o consumo de energia durante a secagem. Esses efeitos são atribuídos ao fato do manano formar estruturas cristalinas duras e insolúveis. A β-mananase, frequentemente junto com outras enzimas, tais como a pectinase e a celulase, é adicionada durante a etapa de concentração da produção do café instantâneo de modo a reduzir a viscosidade nos extratos de café. A mananase também é empregada para hidrolisar os galactomananos presentes em um extrato de café líquido de modo a inibir a formação de gel durante a secagem por congelamento do café instantâneo. Além disso, devido ao uso de tratamento enzimático, os extratos de grãos de café podem ser concentrados por um procedimento de baixo custo, tal como evaporação.

[00273] O teste é realizado de acordo com o fluxograma da Fig. 12 em temperaturas de 10°C e uma dosagem enzimática de 0,15% d.s.

[00274] As variantes de mananase da invenção são testadas em uma mistura composta de diferentes enzimas, tais como pectinases e celulases.

[00275] A viscosidade do extrato de café aumenta significativamente ao longo do tempo sob as condições do processo de rotina. No entanto, a viscosidade é significativamente reduzida usando a mistura enzimática contendo as variantes de mananase da invenção resultando em um aprimorado processamento a jusante tal como secagem por pulverização ou por congelamento. Exemplo 12. Processamento do abacaxi

[00276] Em particular, mananase é útil para extração e clarificação de suco de abacaxi, já que o abacaxi contém uma grande fração de mananos, incluindo glucomananos e galactomananos.

[00277] A mananase ajuda a melhorar a extração de valiosos componentes da fruta, reduz a viscosidade do suco de frutas antes da concentração, e aumenta a taxa de filtração e a estabilidade do produto final.

[00278] Os abacaxis são triturados em um moedor de carne e enchem 500 g de mistura em um béquer de 1000 ml. A enzima é aplicada a 21 °C com um tempo de reação de 60 minutos. A mistura é em seguida prensada com uma pequena prensa Hafico de acordo com o protocolo da prensa: 0 bar 2 min - 50 bar 2 min - 100 bar 2 min - 150 bar 2 min - 200 bar 1 min - 300 bar 1 min - 400 bar 1min. O suco obtido é em seguida centrifugado a 4500 rpm por 5 minutos e analisado para turbidez e viscosidade.

[00279] As variantes de mananase da invenção são testadas nas misturas de enzimas A, B e C (Tabela 7).

[00280] As enzimas são primeiro diluídas com água corrente antes de serem adicionadas à mistura de abacaxi. Tabela 7. Misturas de enzimas 5 ml de Dosagem Atividade [ppm] [% de solução enzimática enzimática] Vazio 5 ml H2O

Mistura A Pectinase 50 0,50% Pectinase + Mistura B 50 0,50% Arabanase Pectinase + Mistura C 50 0,50% Mananase

[00281] A aplicação das variantes de mananase da invenção leva a uma produção aumentada e menor turbidez do suco no processamento do abacaxi. Exemplo 13. Tratamento com mananase de grãos de soja para produção de leite de soja

[00282] Para o tratamento enzimático de grãos de soja de modo a obter leite de soja, é comumente usado o "processo a quente". Para o processo do leite de soja a quente, os grãos de soja a seco foram misturados e triturados em um mixer com água corrente em ebulição em uma proporção de 1:7 (grãos embebidos: água). A pasta semifluida de soja integral é arrefecida até 50 a 55 °C antes de adição da enzima. O nível do pH para a pasta semifluida de soja deve ser de cerca de pH 6,5 e pode ser ajustado com NaHCO3. A enzima mananase é dosada a 1 kg/t de grãos de soja a seco dentro da pasta semifluida e agitada por 30 min. Depois de completar o tempo da reação, a pasta semifluida é prensada usando uma prensa de laboratório par aobter o produto final: leite de soja. De modo a assegurar o mesmo perfil de prensagem, a pressão bem como o tempo de prensagem correspondente são especificados, conforme mostrado na Tabela 8. Além da amostra para reação enzimática, é preparada uma amostra de controle sem qualquer enzima, na qual a solução enzimática foi substituída com água. Tabela 8. Esquema de pressão Pressão [bar] 0 50 100 300 Tempo [min] 2 2 2 1

[00283] Depois da prensagem, o leite de soja é aquecido em um microondas até ferver para interromper a reação enzimática. Análise do leite de soja:  Produção em grama / tempo  °Brix, o qual dá uma correlação direta da quantidade de açúcar no leite de soja, é determinado com um refractômetro  A turbidez do suco é medida com um NTU-fotômetro, o qual mede a turbidez nefelométrica.  The brightness will be measured com a LAB-measurement  O teor de proteínas é determinado com um CN-Analyser (método de combustão)  Sabor

[00284] Leite de soja tratado com as variantes de mananase da invenção apresenta um rendimento aumentado, cor mais brilhante, °Brix aumentado, uma menor turbidez, um maior teor de proteínas e um melhor sabor (remoção de ressaibo).

[00285] Sem limitar o âmbito e a interpretação de acordo com qualquer uma das reivindicações da patente, alguns efeitos técnicos de um ou mais dos aspectos ou modalidades divulgados aqui, neste requerimento de patente, são listados a seguir: Um efeito técnico é degradação ou modificação de manano. Outro efeito técnico é a provisão de mananase, a qual tem boa estabilidade de armazenamento.

[00286] A descrição precedente proporciona a título de exemplos não limitantes de implementações particulares e modalidades da invenção uma descrição completa e informativa do melhor modo presentemente contemplado pelos inventores para realizar a invenção. No9 entanto, é evidente para uma pessoa versada na arte que a invenção não é restrita a detalhes das modalidades apresentadas acima, mas que pode ser implementada em outras modalidades usando meios equivalentes sem se desviar das características da invenção.

[00287] Além disso, algumas das características dos aspectos e das modalidades acima divulgados desta invenção podem ser usadas vantajosamente, sem o uso correspondente de outras características. Deste modo, a descrição precedente deve ser considerada como meramente ilustrativa dos princípios da presente invenção, e não em limitação da mesma. Portanto, o âmbito da invenção somente é restrito pelas reivindicações de patente anexadas.

[00288] Em uma modalidade, pelo menos um componente das composições da invenção tem uma característica química, estrutural ou física diferente em comparação com o componente natural correspondente a partir do qual o pelo menos um componente é derivado. Em uma modalidade, a característica é pelo menos um enttre tamanho uniforme, dispersão homogênea, isoforma diferente, degeneração de códon diferente, modificação pós-translacional diferente, metilação diferente, estrutura terciária ou quaternária diferente, atividade enzimática diferente, afinidade diferente, atividade de ligação diferente, e imunogenicidade diferente. Referências Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G, and Brunak S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol.Biol. 340:783-795. Joutsjoki VV, Torkkeli TK, and Nevalainen KMH. (1993) Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228. Karhunen T, Mäntylä M, Nevalainen KMH, and Suominen PL. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515-522. Kunkel, T. A. (1985): Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. In Proc Natl Acad Sci U S A 82 (2), pp. 488–492.

Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, and von Heijne G. (1997) Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein. Eng. 10: 1-6. Nielsen H, and Krogh A. (1998) Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. In: Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, p. 122-130. Paloheimo M, Mäntylä A, Kallio J, and Suominen P. (2003) Highyield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appl. Env. Microbiol. 69: 7073-7082. Penttilä M, Nevalainen H, Rättö M, Salminen E, and Knowles J. (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W. Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22 (22): 4673–4680. DOI:

10.1093/nar/22.22.4673. Zhang, Xiao-Zhou; Zhang, Y-H Percival (2011): Simple, fast and high- efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. In Microb Biotechnol 4 (1), pp. 98–105. DOI:

10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de mananase, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição de um aminoácido em uma posição correspondente à posição 123, 158, 180, 272, 307, ou 316, em que a variante tem atividade de mananase e é selecionada entre o grupo que consiste em: 1) um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com os resíduos 27 a 331 da SEQ ID NO: 2; 2) uma variante codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevado rigor com a) os nucleotídeos 79 a 993 da SEQ ID NO: 1 (man7) ou b) o complemento de comprimento total de a); e 3) uma variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNA genômico da mesma; e em que a numeração de aminoácidos corresponde à numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7) sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência de sinalização.

2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição adicional na posição M123, A158, F180, G272, T307, ou L316, ou uma combinação das mesmas.

3. Variante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um conjunto de substituições na(s) posição(ões): M123 e G272; ou A158 e T307; ou L316; ou T307; ou

M123, A158 e T307; ou M123 e L316; A158, T307, e L316; F180 e L316; ou M123, A158, G272; T307, e L316; ou uma combinação das mesmas.

4. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a substituição resulta em uma estabilidade aprimorada da variante.

5. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição adicional selecionada entre: uma substituição a qual evita a glicosilação de N283; uma substituição de 283, ou 285; ou uma substituição de N283, T285, ou S285; ou uma substituição de T285 ou S285 para um resíduo diferente de T ou S uma substituição de T285 ou S285 para o resíduo A.

6. Variante de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a substituição adicional resulta em uma glicosilação alterada da variante quando produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação ligada por N.

7. Composição enzimática, caracterizada pelo fato de que compreende a variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e a. pelo menos um preservante selecionado, por exemplo, entre o grupo que consiste em ácido orgânico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido benzóico e seus sais e derivados, benzoato de sódio, benzoato, hidroxibenzoato e derivados, ácido sórbico, sorbato de sódio, sorbato, sais, tais como cloreto de sódio ou cloreto de potássio, 1,2-

Benzisotiazolin-3-ona (BIT) ou uma combinação das mesmas; b. opcionalmente pelo menos um estabilizante selecionado entre poliol, propileno glicol, polietileno glicol, hexileno glicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, polissacarídeo, ácido láctico, ácido bórico, derivado do ácido bórico, éster de borato aromático, ácido 4-fornilfenil borônico, derivado do ácido fenil borônico, peptídeo, tensoativo ou uma combinação dos mesmos; c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolíticas, liases de pectato, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases com ou sem um mediador, ou uma combinação das mesmas; e d. opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação das mesmas.

8. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser sob a forma de uma composição líquida ou uma composição sólida tal como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, torta, cristal, chorume de cristal, gel ou pélete.

9. Composição de detergente, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de mananase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou a composição enzimática como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8.

10. Composição de detergente de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de ser sob a forma de um detergente líquido ou um detergente sólido, de modo preferencial sob a forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, um granulado, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado.

11. Composição de detergente de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende uma ou mais enzimas adicionais selecionadas entre o grupo que consiste em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, liase de pectato, enzima pectinolítica, esterase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, lacase, DNAse e/ou peroxidase, de modo preferencial selecionada entre o grupo que consiste em proteases, amilases, celulases e lipases.

12. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende elementos genéticos que possibilitam a produção de pelo menos um polipeptídeo recombinante compreendendo a variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

13. Célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada entre o grupo que consiste em: células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de modo preferencial entre o grupo que consiste em membros da Classe Sordariomycetes, Subclasse Hypocreomycetidae, Ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste nas Famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e Genera Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella,

Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium, e Scedosporium; de modo mais preferencial entre o grupo que consiste em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, células bacterianas, de modo preferencial Bacilos Gram positivos, tais como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, bactérias Gram negativas, tais como Escherichia coli, actinomicetos, tais como Streptomyces sp., e leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, de modo o mais preferencial Trichoderma reesei ou Bacillus.

14. Célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo recombinante é uma proteína de fusão, a qual, além de ter a sequência de aminoácidos tendo atividade de mananase, compreende pelo menos uma de: uma sequência de aminoácidos proporcionando uma sequência de sinalização secretora; uma sequência de aminoácidos a qual facilita a purificação, tal como um marcador de afinidade ou His-tag;

uma sequência de aminoácidos, a qual aumenta a produção, tal como uma sequência de aminoácidos, a qual é um veículo, tal como CBM; uma sequência de aminoácidos tendo uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos proporcionando a proteína de fusão com afinidade de ligação, tal como uma porção de ligação a carboidrato.

15. Método para a produção de um polipeptídeo recombinante compreendendo uma variante de mananase, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultura de uma célula hospedeira recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que os elementos genéticos compreendem pelo menos uma sequência de controle a qual controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante; os elementos genéticos opcionalmente compreendem pelo menos uma sequência codificando uma sequência de sinalização para transportar o polipeptídeo recombinante fora da célula hospedeira; e a cultura é realizada em condições possibilitando a produção do polipeptídeo recombinante; e b. recuperação do polipeptídeo recombinante.

16. Método para a degradação ou a modificação de material contendo manano, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento do referido material contendo manano com uma quantidade eficaz da composição enzimática como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8 ou a variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

17. Método de acordo com a reivindicação 16,

caracterizado pelo fato de que o material contendo manano é um material à base de planta, têxtil, águas residuais, esgoto, óleo, ou uma combinação dos mesmos.

18. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende a composição enzimática como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8 ou a variante de mananase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e pelo menos uma fonte de proteína de origem vegetal ou um produto ou subproduto contendo manano, e a. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta- glucanase, ou uma combinação das mesmas; e b. opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação das mesmas.

19. Suplemento de ração, caracterizado pelo fato de que compreende a composição enzimática como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 8 ou a variante de mananase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e a. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada entre protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação das mesmas; e b. opcionalmente pelo menos um enchimento selecionado entre maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação dos mesmos.

20. Uso da variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou a composição enzimática como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizada pelo fato de que é na exploração de petróleo ou hidro-fraturamento.

21. Uso da variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou a composição enzimática como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizada pelo fato de que é para o processamento do extrato de café, suco de frutas, suco de abacaxi, ou leite de soja.