BR112019022066B1

BR112019022066B1 - Dispositivo de vitrificação, e, método para preparar uma amostra

Info

Publication number: BR112019022066B1
Application number: BR112019022066-6A
Authority: BR
Inventors: Sabrina C. Lin; Hsiao-Tzu Ni
Original assignee: Fujifilm Irvine Scientific, Inc
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2024-04-30
Also published as: CN114532329A; KR102615574B1; EP3612025B1; KR20230172627A; CN114532329B; RU2019136692A3; WO2018195496A1; JP7295028B2; EP4233542A2; RU2019136692A; EP3612025A1; CN110769690B; US20200093122A1; KR20190140978A; BR112019022066A2; EP4233542A3; JP2020517269A; JP2023123549A; CN110769690A

Abstract

Dispositivos e métodos relacionados que servem para congelar rapidamente uma amostra usando, por exemplo, nitrogênio líquido são providos. O dispositivo inclui uma porção de entrada com uma porta de entrada, uma câmara de amostra, um reservatório de refugo em comunicação fluídica com a câmara de amostra, e um mecanismo de filtragem que permite, de modo seletivo, que um fluido introduzido através da porta de entrada passe através da câmara de amostra e para dentro do reservatório de refugo, enquanto retém uma amostra dentro da câmara de amostra. A câmara de amostra, o reservatório de refugo e o mecanismo de filtragem são configurados para extrair fluido a partir da câmara de amostra através do mecanismo de filtragem e para dentro do reservatório de refugo através de ação capilar.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade, de acordo com 35 USC § 119 (e) sobre o Pedido Provisório US 62/488.655, depositado em 21 de abril de 2017, que é incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] A presente descrição refere-se geralmente a dispositivos de vitrificação e métodos para preparar amostras.

FUNDAMENTOS

[003] A criopreservação de oócitos humanos (congelamento de óvulos) é uma das técnicas utilizadas na preservação da fertilidade feminina. Os oócitos de uma mulher são extraídos, congelados e armazenados. No futuro, os óvulos podem ser descongelados, fertilizados e transferidos para o útero como embriões. Alternativamente, um embrião fertilizado pode ser congelado e armazenado e, posteriormente, descongelado e transferido para o útero de uma mulher.

[004] A vitrificação é um processo de congelamento rápido, em que uma amostra biológica é congelada em segundos, por exemplo, com uso de nitrogênio líquido. Demonstrou-se que a vitrificação de oócitos ou embriões produz resultados muito superiores aos obtidos com técnicas de congelamento lento, em termos de preservação da fertilidade e viabilidade de oócitos e embriões.

[005] Uma amostra biológica a ser preservada por vitrificação geralmente tem um tamanho pequeno e é muito delicada e suscetível a danos e perda de atividade durante a manipulação humana, como durante a transferência por micropipetagem. Convencionalmente, as amostras são pré- tratadas e preparadas para vitrificação com uso de vários agentes ou soluções, antes de serem transferidas para uma ferramenta de vitrificação a ser retida e exposta ao nitrogênio líquido. Da mesma forma, para descongelar, a amostra congelada também é tratada com vários agentes ou soluções quentes. Cada etapa da manipulação envolve a transferência da amostra, como um oócito ou embrião, de uma solução para outra com uso de uma micropipeta. Assim, o processo e as ferramentas convencionais correm um risco substancial de danificar a amostra, e erros e variações humanos, associados a essa manipulação, não podem ser evitados.

[006] Assim, existe uma necessidade, nesse campo, de novos dispositivos e processos de vitrificação associados aos mesmos para vitrificação de amostras biológicas, com riscos substancialmente reduzidos de danos à amostra e erros humanos.

SUMÁRIO

[007] Um aspecto da presente descrição refere-se a um dispositivo de vitrificação. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende uma porção de entrada com uma porta de entrada, uma câmara de amostra, um reservatório de refugo em comunicação fluídica com a câmara de amostra e um mecanismo de filtragem que permite seletivamente que um fluido introduzido através da porta de entrada passe através da câmara de amostra e para o reservatório de refugo, enquanto retém uma amostra dentro da câmara de amostra. Em algumas modalidades, a câmara de amostra, o reservatório de refugo e o mecanismo de filtragem são configurados para aspirar fluido da câmara de amostra, através do mecanismo de filtragem, e para o reservatório de refugo por ação capilar.

[008] Em algumas modalidades, o dispositivo de vitrificação compreende adicionalmente pelo menos uma janela de visualização, em que a janela de visualização é configurada de modo que a amostra, dentro da câmara de amostra, seja visível através da janela de visualização.

[009] Em algumas modalidades, o dispositivo de vitrificação compreende adicionalmente uma tampa capaz de acoplar reversivelmente à porção de entrada para fechar a porta de entrada. Em algumas modalidades, a tampa é configurada para vedar a porta de entrada de modo a inibir o fluxo de fluido dentro do dispositivo de vitrificação, quando a tampa é acoplada à porção de entrada. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem compreende um filtro com uma pluralidade de poros dimensionados e configurados para formar uma pluralidade de canais microfluídicos para promover a ação capilar.

[0010] Em algumas modalidades, a câmara de amostra compreende um material resistente ao nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, a câmara de amostra compreende um material condutor térmico. Em algumas modalidades, a câmara de amostra é formada por pelo menos um dentre: um material à base de acrílico, um material à base de polipropileno, um material à base de policarbonato e um material à base de copoliéster. Em algumas modalidades, a câmara de amostra tem uma parede com uma espessura menor ou igual a 0,005 centímetro (0,002 polegada).

[0011] Outro aspecto da presente descrição refere-se a um método para preparar uma amostra. Em algumas modalidades, o método compreende entregar uma amostra em uma câmara de amostra, e adjacente a um mecanismo de filtragem, e tratar a amostra com um primeiro fluido empurrando-se o primeiro fluido através da câmara de amostra e em um reservatório de refugo com uma força fluídica, enquanto a filtragem mecanismo retém a amostra dentro da câmara de amostra. Empurrar o primeiro fluido para dentro do reservatório de refugo inicia uma ação capilar, para aspirar os líquidos subsequentes através da câmara de amostra e para dentro do reservatório de refugo

[0012] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente tratar a amostra com um segundo fluido aspirando-se o segundo fluido através da câmara de amostra, e para dentro do reservatório de refugo, por ação capilar, enquanto o mecanismo de filtragem retém a amostra dentro da câmara de amostra. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente visualizar a amostra na câmara de amostra através de uma janela de visualização na câmara de amostra.

[0013] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente vedar uma porta de entrada para fluir fluido para a câmara de amostra, acoplando-se uma tampa. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente vitrificar a amostra na câmara de amostra. Em algumas modalidades, a amostra é vitrificada entrando-se em contato com a câmara de amostra com nitrogênio líquido.

[0014] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente descongelar a amostra, entrando-se em contato com a câmara de amostra com uma solução quente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0015] A Figura 1 é uma vista em perspectiva de uma porção de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0016] A Figura 2A é uma vista em perspectiva de uma tampa do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0017] A Figura 2B uma vista em seção transversal da tampa da Figura 2A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0018] A Figura 2C é uma vista frontal da tampa da Figura 2A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0019] A Figura 3 é uma vista em perspectiva de uma porção de entrada do dispositivo de vitrificação coberto com a tampa, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0020] A Figura 4A é uma vista em perspectiva de uma porção frontal do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0021] A Figura 4B é uma vista superior de uma porção frontal do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0022] A Figura 5A é uma vista em seção transversal longitudinal de uma porção do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição, com a tampa acoplada a uma porção de entrada do dispositivo.

[0023] A Figura 5B é uma vista em seção transversal da porção de entrada do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0024] A Figura 5C é uma vista frontal da porção de tampa da Figura 5B, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0025] A Figura 6A é uma vista em perspectiva de uma porção da porção de entrada do dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0026] A Figura 6B é uma vista lateral de uma porção da grade de filtragem, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0027] As Figuras 7A a 7C são vistas parciais de várias modalidades de uma porção de entrada de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0028] As Figuras 8A a 8B são vistas de topo de várias modalidades de uma porção de entrada de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0029] A Figura 9A é uma vista superior de uma porção de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0030] A Figura 9B é uma vista em seção transversal do dispositivo de vitrificação obtida ao longo da linha AA da Figura 9A

[0031] A Figura 9C é uma vista ampliada da área D, como mostrado na Figura 9B, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0032] A Figura 10A é uma vista em perspectiva de uma porção de uma porção de entrada de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0033] A Figura 10B é uma vista em seção transversal do dispositivo de vitrificação da Figura 10A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0034] A Figura 10C é uma vista frontal do dispositivo de vitrificação da Figura 10A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0035] A Figura 11A mostra procedimentos exemplificativos para congelar uma amostra de embrião com uso de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0036] A Figura 11B mostra procedimentos exemplificativos para descongelar uma amostra de embrião com uso de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0037] As Figuras 12A a 12B ilustram modalidades exemplificativas para empilhar várias unidades do dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição.

[0038] A Figura 13A é uma vista em perspectiva de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0039] A Figura 13B é uma vista em perspectiva de uma porção de entrada do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0040] A Figura 14A é uma vista superior do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição, com uma tampa na porção de entrada.

[0041] A Figura 14B é uma vista superior do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição, com a tampa removida.

[0042] A Figura 14C é uma vista em seção transversal ao longo da linha AA da Figura 14B.

[0043] A Figura 14D é uma vista em seção transversal do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0044] A Figura 15A é uma vista em seção transversal parcial do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0045] A Figura 15B é uma vista em seção transversal parcial do dispositivo de vitrificação da Figura 13A, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0046] A Figura 16 é uma vista em perspectiva superior de um dispositivo de vitrificação, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0047] A Figura 17 é uma vista em seção transversal do dispositivo de vitrificação da Figura 16, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0048] A Figura 18 é uma vista em perspectiva de uma porção de entrada do dispositivo de vitrificação da Figura 16, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0049] A Figura 19 é uma vista em seção transversal da porção da porção de entrada, mostrada na Figura 18, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0050] A Figura 20 é uma vista em seção transversal de uma porção do dispositivo de vitrificação da Figura 16, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0051] A Figura 21 é uma vista em seção transversal de uma porção do dispositivo de vitrificação da Figura 16, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

[0052] As Figuras 22A a 22D são vistas em perspectiva de modalidades alternativas de uma porção de entrada do dispositivo de vitrificação da Figura 16, de acordo com algumas modalidades da presente descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0053] São providos, no presente documento, dispositivos e métodos para congelar rapidamente uma amostra, por exemplo, com uso de nitrogênio líquido. Em certas modalidades preferenciais, forças de baixa pressão, como aquelas geradas por ação capilar, podem ser usadas para empurrar ou aspirar fluido através do dispositivo, sem danificar a(s) amostra(s) no dispositivo.

[0054] Em referência à Figura 1, uma vista em perspectiva do dispositivo de vitrificação 101, de acordo com uma modalidade da presente descrição, é mostrada. O dispositivo de vitrificação 101 compreende um formato alongado e duas extremidades. Em uma extremidade, o dispositivo 101 compreende uma porção de entrada (não mostrada) acoplada reversivelmente a uma tampa removível 103. Na outra extremidade, o dispositivo 101 compreende uma pega 102. A tampa 103 é acoplada à porção de entrada e é capaz de rotacionar em torno do eixo geométrico longitudinal da tampa 103. O dispositivo de vitrificação 101 tem uma configuração fechada e pelo menos uma configuração aberta. Em algumas modalidades, a alternância entre as configurações fechada e aberta é alcançada rotacionando- se a tampa 103. Em algumas modalidades, o acoplamento entre a tampa 103 e a porção de entrada pode ser reversível, e a tampa 103 pode ser removida da porção de entrada se um usuário desejar.

[0055] A Figura 2A mostra uma ilustração em perspectiva da tampa 103. A tampa 103 tem uma extremidade aberta 103a e uma extremidade fechada 103b. Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende pelo menos uma porta de entrada 104 e pelo menos uma janela de visualização 105. Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende adicionalmente uma ou mais aberturas (não mostradas). Em algumas modalidades, a extremidade fechada 103b forma um cabo 106 para fácil retenção e rotação da tampa 103.

[0056] Figura 2B mostra a tampa 103, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente descrição. A tampa 103 assume aproximadamente o formato de um cilindro oco com várias reentrâncias e/ou aberturas na lateral do cilindro. A tampa 103 tem uma extremidade aberta 103a e uma extremidade fechada 103b. A Figura 2B mostra a seção transversal da tampa 103 ao longo da linha AA da Figura 2C, que é uma vista frontal da tampa 103 obtida da extremidade fechada 103b. Como mostrado nessa vista, a tampa 103 tem uma extremidade aberta 103a, uma extremidade fechada 103b e um espaço oco 103c. Há pelo menos uma porta de entrada 104 que conecta o espaço oco 103c com a parte externa da tampa 103. Nessa modalidade exemplificativa, a porta de entrada 104 compreende uma reentrância 104a na parede da tampa 103 e um canal de entrada 104b que assume um ângulo agudo com o eixo geométrico longitudinal da tampa 103, de modo que um agente fluídico, como uma solução, entregue através da porta de entrada 104 flua diretamente para uma área de amostra localizada dentro do espaço oco 103c. Em algumas modalidades, o ângulo entre o canal de entrada 104b e o eixo geométrico longitudinal da tampa 103 se encontra na faixa de cerca de 20° a cerca de 70°. Em algumas modalidades, o ângulo é 20°, 30°, 40°, 50°, 60° ou 70°.

[0057] Em algumas modalidades, a tampa 103 também compreende pelo menos uma janela de visualização 105 na parede. Em algumas modalidades, a janela de visualização 105 é produzida a partir de um material transparente, de modo que um usuário do dispositivo possa facilmente visualizar através da mesma, para examinar as condições de uma amostra localizada dentro do espaço oco 103c. Em várias modalidades, a janela de visualização 105 pode ser produzida a partir de um material igual ou diferente, em comparação com as partes restantes da tampa 103. Em algumas modalidades, a janela de visualização 105 pode formar uma reentrância na parede, de modo que a espessura na área da janela de visualização 105 seja menor que a espessura média da parede.

[0058] Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende adicionalmente uma ou mais aberturas. Na modalidade exemplificativa, como mostrado na Figura 2B, a tampa 103 tem duas aberturas 107, 108 que conectam o espaço oco 103c com a parte externa. Em algumas modalidades, quando a tampa 103 está em contato com nitrogênio líquido, o nitrogênio líquido flui através das aberturas para o espaço oco 103c e fica próximo de uma amostra localizada no mesmo. Em algumas modalidades, o número de tais aberturas na tampa 103 não é limitado a dois. Em várias modalidades, a tampa 103 pode ter uma, duas ou mais de duas aberturas. É observado que, em algumas modalidades, ter várias aberturas na tampa 103 permite um fluxo rápido de nitrogênio líquido para a proximidade da área da amostra e, portanto, uma rápida vitrificação da amostra, visto que o ar preso no espaço oco 103c pode escapar através de uma abertura, enquanto o nitrogênio líquido entra através de outro.

[0059] Na modalidade exemplificativa, mostrada na Figura 2B, a espessura do cabo 106, medida pela distância entre o par de setas B, encontra- se na faixa de cerca de 0,15 centímetro (0,06 polegada) a cerca de 0,30 centímetro (0,12 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a espessura do cabo 106 é de 0,29 centímetro (0,114 polegada).

[0060] Em algumas modalidades, o diâmetro do espaço oco 103c, conforme medido pela distância entre o par de setas D, encontra-se na faixa de cerca de 0,15 centímetro (0,06 polegada) a cerca de 0,33 centímetro (0,13 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, o diâmetro é de 0,32 centímetro (0,126 polegada). Em algumas modalidades, o espaço oco 103c é configurado para alojar uma porção de entrada cônica do dispositivo de vitrificação. Por exemplo, em algumas modalidades, a porção de entrada tem cerca de 1° de ângulo de saída, e a tampa 103 tem um ângulo de saída correspondente de 1° no espaço oco interno 103c. Quando a tampa 103 é acoplada à porção de entrada, os formatos cônicos criam uma força de encunhamento que ajuda a engatar e/ou vedar as duas partes. Em várias modalidades, a porção de entrada e a tampa 103 podem ter um ângulo de saída correspondente na faixa de 1° a 5°.

[0061] Em algumas modalidades, o comprimento da tampa 103, conforme medido pela distância E, encontra-se na faixa de cerca de 0,76 centímetro (0,3 polegada) a cerca de 1,78 centímetro (0,7 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, o comprimento da tampa 103 é de 1,63 centímetro (0,64 polegada).

[0062] A Figura 3 mostra uma vista em perspectiva da porção frontal do dispositivo de vitrificação 101, que mostra o acoplamento entre a tampa 103 e a porção de entrada 110 do dispositivo. Particularmente, é mostrada, nessa vista, uma primeira configuração aberta do dispositivo de vitrificação 101. Nessa configuração, a tampa 103 é posicionada em relação à porção de entrada 110, de modo que a porta de entrada 104 esteja em comunicação fluídica com a câmara de amostra 111, e a janela de visualização 105 se situa sobre a câmara de amostra 111. Em algumas modalidades, a porção de entrada 110 compreende adicionalmente um reservatório de refugo 112a e um canal de refugo 113 para retenção e disposição de refugo.

[0063] Com uso da primeira configuração aberta, um usuário pode entregar um agente fluídico, como uma amostra, ou soluções para preparar ou tratar a amostra, na câmara de amostra 111, através da porta de entrada 104, enquanto monitora o teor e/ou as atividades dentro da câmara de amostra 111, através da janela de visualização 105. O reservatório de refugo 112a está em comunicação fluídica com a câmara de amostra 111. Os refugos são então coletados no reservatório de refugo 112a e dispostos através do canal de refugo 113. Em várias modalidades, a câmara de amostra 111 pode compreender diferentes mecanismos para reter a amostra, enquanto deixa os refugos passarem para atingir o reservatório de refugo 112.

[0064] As Figuras 4A e 4B mostram uma vista em perspectiva e uma vista superior, respectivamente, do dispositivo de vitrificação 101, em uma segunda configuração aberta. Nessa configuração, a tampa 103 é posicionada em relação à porção de entrada 110, de modo que uma ou mais das aberturas 107, 108 na tampa 103 se situem sobre a câmara de amostra 111. Assim, com uso dessa configuração, um usuário pode manipular e/ou recuperar uma amostra da câmara de amostra 111 através de pelo menos uma das aberturas 107, 108. Em várias modalidades, as dimensões das aberturas 107, 108 na tampa 103 podem ser iguais ou diferentes. Sem estar limitado pela teoria, é observado que pelo menos uma abertura 107 seja grande o suficiente para permitir fácil manipulação e recuperação de amostras através da mesma. Opcionalmente, a(s) outra(s) abertura(s) 108 podem ser menores, desde que o fluxo de nitrogênio líquido, através da(s) abertura(s), não seja prejudicado pelo tamanho.

[0065] A Figura 5A mostra uma vista em seção transversal do dispositivo de vitrificação 101, como mostrado na primeira configuração aberta da Figura 3. Como mostrado na vista em seção transversal na Figura 5A, a porção de entrada 110 compreende uma câmara de amostra 111 em comunicação fluídica com um reservatório de refugo 112a/112b. Em algumas modalidades, o reservatório de refugo 112b se estende para a pega 102 do dispositivo. Como mostrado na Figura 5A, a câmara de amostra 111 está localizada na porção de entrada 110 e um reservatório de refugo da porção de entrada 112a se conecta a um reservatório de refugo 112b localizado dentro da pega 102 através de um canal de refugo 113. Em algumas modalidades, o dispositivo dispõe um refugo fluídico no reservatório de refugo 112b na pega 102. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente um mecanismo, como uma válvula de retenção, que impede que o refugo se mova do reservatório de refugo 112a/112b de volta para a câmara de amostra 111. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente um mecanismo, como um filtro, na pega 102, que permite que o ar preso seja liberado, à medida que os fluidos entram no reservatório de refugo 112b, e impede que o nitrogênio líquido entre no reservatório de refugo 112b.

[0066] Em algumas modalidades, a porção de entrada 110 compreende adicionalmente pelo menos uma reentrância 114 em proximidade com a câmara de amostra 111. Particularmente, na modalidade exemplificativa, como mostrado na Figura 5A, a reentrância 114 é separada da câmara de amostra 111 por uma parede fina 150. Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende adicionalmente pelo menos uma abertura 107, 108. Quando a tampa é acoplada à porção de entrada, na configuração fechada, as aberturas 107, 108 estão em comunicação fluídica com a reentrância 114, de modo que o nitrogênio líquido possa fluir para a reentrância através das aberturas. Em algumas modalidades, o dispositivo está configurado para ser imerso em nitrogênio líquido em sua configuração fechada. Assim, as aberturas na tampa permitem que o nitrogênio líquido flua para a reentrância 114 da porção de entrada 110, aproximando-se, desse modo, da câmara de amostra 111 para uma vitrificação mais rápida das amostras contidas na mesma. Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende pelo menos duas aberturas 107, 108, que permitem que o nitrogênio líquido flua para a reentrância 114 com mais facilidade, visto que o ar preso na reentrância pode escapar por uma abertura, enquanto o nitrogênio líquido entra por outra.

[0067] Em algumas modalidades, a dimensão da porção de entrada 110, em posições diferentes ao longo de seu eixo geométrico longitudinal, pode ser a mesma ou diferente. Particularmente, em algumas modalidades, a porção de entrada 110 é cônica. Em algumas modalidades, o espaço interno da tampa 103 também é cônico para corresponder ao formato da porção de entrada 110. Os formatos cônicos criam uma força de encunhamento que ajuda a engatar e vedar a porção de entrada 110 à tampa 103. Em algumas modalidades, a porção de entrada 110 e a tampa 103 têm um ângulo de saída correspondente no intervalo de 1° a 5°.

[0068] A Figura 5B mostra a seção transversal da porção de entrada 110 ao longo da linha AA da Figura 5C, que é uma vista frontal da porção de entrada 110. Como mostrado, nessa modalidade exemplificativa, a dimensão da porção de entrada 110 se torna gradualmente menor a partir de onde se conecta à pega 102 (a base da porção de entrada 110), em direção à outra extremidade da porção de entrada 110 (a extremidade frontal da porção de entrada 110). Particularmente, a dimensão na base, conforme medida na distância entre o par de setas D, se encontra na faixa de cerca de 0,25 centímetro (0,1 polegada) a cerca de 0,51 centímetro (0,2 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a dimensão na base da porção de entrada 110 é de 0,32 centímetro (0,127 polegada). A dimensão na extremidade frontal da porção de entrada 110, medida na distância entre o par de setas B, se encontra na faixa de cerca de 0,25 centímetro (0,1 polegada) a cerca de 0,51 centímetro (0,2 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a dimensão na extremidade frontal é de cerca de 0,29 centímetro (0,116 polegada).

[0069] Em algumas modalidades, o comprimento da porção de entrada 110, conforme medido na distância entre o par de setas E, se encontra na faixa de cerca de 0,25 centímetro (0,1 polegada) a cerca de 1,02 centímetro (0,4 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, o comprimento da porção de entrada 110 é de cerca de 0,81 centímetro (0,351 polegada). Em algumas modalidades, o comprimento do dispositivo, que inclui a pega 102 e a porção de entrada 110, conforme medido pela distância F na Figura 5B, se encontra na faixa de cerca de 1,27 centímetro (0,5 polegada) a cerca de 7,62 centímetros (3 polegadas).

[0070] As Figuras 6A e 6B ilustram uma modalidade exemplificativa de uma porção de entrada do dispositivo de vitrificação. Particularmente, a Figura 6A mostra uma vista em perspectiva de uma estrutura parcial da porção de entrada 110. É mostrada, nessa vista, parte da pega 102, do reservatório de refugo 112a e da abertura do canal de refugo 113, que são localizados na porção de entrada 110. Também são localizados na porção de entrada 110 a câmara de amostra 111 e um bloco 115 que separa a câmara de amostra 111 e o reservatório de refugo 112a. Em algumas modalidades, quando a tampa (não mostrada) é acoplada à porção de entrada 110, a parte superior do bloco 115 se engata à parede interna da tampa. Em algumas modalidades, como mostrado na Figura 6A, a parte superior do bloco 115 compreende um mecanismo de filtragem, como grades de filtragem 151, que mantém a câmara de amostra 111 em comunicação fluídica com o reservatório de refugo 112, quando a tampa (não mostrada) é acoplada à porção de entrada 110.

[0071] Figura 6B é uma vista ampliada que mostra as estruturas parciais das grades de filtragem 151, como mostrado na Figura 6A. Também são mostradas estruturas parciais da pega 102 e da porção de entrada 110 do dispositivo. Nessa modalidade, as grades de filtragem 151 compreendem uma pluralidade de segmentos inferiores alternados 151a e mais altos 151b. Assim, quando a porção de entrada 110 se engata à tampa (não mostrada), a parte superior dos segmentos mais altos 151b se engata à parede interna da tampa, formando canais nos segmentos inferiores 151a que conectam o reservatório de refugo 112a e a câmara de amostra 111 em comunicação fluídica.

[0072] Em algumas modalidades, quando a tampa está aberta, um dispositivo de entrega de fluido, como uma micropipeta, pode ser usado para empurrar um fluido de refugo através dos canais, para o reservatório de refugo, enquanto uma amostra, como um oócito ou embrião, é retida na área de amostra. Assim, em algumas modalidades, a dimensão das grades de filtragem 151 depende do tipo de amostra a ser usada com o dispositivo de vitrificação. Em algumas modalidades, a dimensão é selecionada de modo que os canais deixem passar o refugo, mas retenham uma amostra. Por exemplo, nas modalidades em que a amostra é oócito ou embrião humano, uma dimensão (como um diâmetro, uma largura ou comprimento, o que depende do formato do canal) de cada canal se encontra na faixa de 0,0013 a 0,0038 centímetro (0,0005 a 0,0015 polegada).

[0073] Além disso, sem pretensão de ser limitado por teoria, é observado que a dimensão dos canais também afeta a pressão do líquido na amostra localizada na câmara da amostra. O número de canais não é crítico, e o dispositivo funciona com um ou mais de um canal. Em algumas modalidades, é observado que o projeto de múltiplos canais auxilia na diminuição de uma contrapressão que permite o rápido enchimento de fluido e menos tensão na amostra na área da amostra.

[0074] Em algumas modalidades, as grades de filtragem 151 formam um único canal que conecta a câmara de amostra e o reservatório de refugo, e a área de fluxo (definida como a área de seção transversal perpendicular ao eixo geométrico longitudinal do canal) se encontra na faixa de cerca de 7 x 10-7-in2 (1 in2 = 6,45 cm2) a 1,5 x 10-6 in2. Em outras modalidades, as grades de filtragem 151 formam múltiplos canais que conectam a câmara de amostra e o reservatório de refugo, e a área de fluxo total de todos os canais combinados se encontra na faixa de cerca de 7 x 10-7 in2 a 1,5 x 10-6 in2.

[0075] Como pode ser observado agora, em algumas modalidades, as grades de filtragem 151 facilitam a separação de um refugo fluídico de uma amostra específica contida na câmara de amostra 111. Em algumas modalidades, as grades de filtragem 151 facilitam a remoção do refugo da câmara de amostra. Particularmente, em algumas modalidades, o refugo fluídico flui para o reservatório de refugo 112a através dos canais formados pelas grades de filtragem 151, enquanto amostras com tamanhos de partículas maiores do que o diâmetro dos canais são retidas na câmara de amostra 111. O fluxo dos fluidos dentro do presente dispositivo pode ser acionado por vários mecanismos. Por exemplo, em algumas modalidades, quando a tampa se engata à porção de entrada, um dispositivo de entrega de fluido, como uma micropipeta, pode entregar uma pressão fluídica à câmara de amostra através da porta de entrada e empurrar o fluxo fluídico em direção ao reservatório de refugo. Em modalidades alternativas, um mecanismo de sucção pode aspirar o fluxo de fluidos em direção ao reservatório de refugo. Além disso, em algumas modalidades, os canais microfluídicos formados pelas portas de filtragem 151 são configurados para prover uma potência de capilaridade que facilita a aspiração do refugo líquido em direção ao reservatório de refugo. A ação capilar é iniciada quando uma primeira solução é introduzida através da porta de entrada 104 com uma força fluídica, tal como usando-se uma pipeta. O fluido é empurrado através da câmara de amostra 111, através das portas de filtragem 151 e para dentro do reservatório de refugo 112. A presença de fluido no reservatório de refugo 112, em combinação com os canais microfluídicos de tamanho particular, na totalidade do dispositivo, gera uma força forte o suficiente para puxar fluidos subsequentes através do dispositivo 101 com uso de ação capilar.

[0076] As Figuras 7A a 7C ilustram modalidades exemplificativas adicionais do dispositivo de vitrificação. Particularmente, a Figura 7A é uma vista em perspectiva de uma estrutura parcial da porção de entrada 710. Nessa modalidade, uma ilha 719 separa a câmara de amostra 711 e o reservatório de refugo 712. Os canais de desvio 718 em ambos os lados da ilha 719 conectam a câmara de amostra 711 e a reservatório de refugo 712 em comunicação fluídica. Em algumas modalidades, a ilha 719 compreende adicionalmente uma bolsa de captura 716 configurada para capturar e reter uma amostra na mesma. A bolsa de captura 716 tem uma extremidade aberta em direção à câmara de amostra 711 e uma extremidade fechada em direção ao reservatório de refugo 712. Como mostrado na Figura, em algumas modalidades, a bolsa de captura 716 assume um formato de “U”.

[0077] Em algumas modalidades, o topo da ilha 719 compreende adicionalmente um mecanismo de filtragem, como uma pluralidade de canais de filtragem 717, que se conecta, em uma extremidade, com a bolsa de captura 716 e, na outra extremidade, com o reservatório de refugo 712. Quando a tampa (não mostrada) é acoplada à porção de entrada 710, a superfície superior da ilha 719 se engata à parede interna da tampa, e os canais de filtragem 717 conectam a bolsa de captura 716 ao reservatório de refugo 712 em comunicação fluídica.

[0078] De acordo com a presente descrição, a dimensão dos canais de filtragem e canais de desvio pode variar. A Figura 7B ilustra uma modalidade exemplificativa, em que os canais de desvio 718 são parcialmente preenchidos ao longo do fundo, restringindo, assim, os canais 718 a uma dimensão menor. Sem pretensão de ser limitado por teoria, é observado que as dimensões dos canais de desvio 718 e dos canais de filtragem 717 afetam a quantidade de fluxo fluídico sobre a amostra localizada na bolsa de captura 716, bem como a pressão do líquido na amostra. Não é crítico definir o número de canais de desvio 718 ou canais de filtragem 717. O presente dispositivo pode trabalhar com pelo menos um canal de desvio 718 e pelo menos um canal de filtragem 717. Como utilizado no presente documento, a área de fluxo de um canal é definida como a área da seção transversal perpendicular ao eixo geométrico longitudinal do canal. Em algumas modalidades, a área de fluxo total do(s) canal(is) de desvio se encontra na faixa de cerca de 5 x 10-6 in2 a 2 x 10-5 in2. Em algumas modalidades, a área de fluxo total do(s) canal(is) de filtragem se encontra na faixa de cerca de 7 x 10-7 in2 a 1,5 x 10-6 in2.

[0079] Em algumas modalidades, uma razão entre a área de fluxo total dos canais de desvio e a área de fluxo total dos canais de filtragem é selecionada para alcançar fluxo ideal e a pressão fluídica sobre a amostra na bolsa de captura. É observado que uma maior razão de desvio para filtragem leva mais fluidos a fluírem através dos canais de desvio (isto é, desviando-se a bolsa de captura) e, assim, a amostra na bolsa de captura recebe menos tratamento fluídico. Uma razão inferior leva mais fluidos a fluírem através da bolsa de captura e dos canais de filtragem, criando, assim, uma pressão de líquido mais alta na amostra. Por conseguinte, em algumas modalidades, a razão de desvio para filtragem se encontra na faixa de cerca de 6:1 a cerca de 4:1. Particularmente, em algumas modalidades, a razão de desvio para filtragem é de cerca de 5:1.

[0080] Em algumas modalidades, a dimensão do canal de filtragem também é selecionada com base no tipo de amostra a ser usada com o dispositivo de vitrificação. Particularmente, em algumas modalidades, a dimensão do canal de filtragem é selecionada, de modo a deixar o refugo passar, mas reter uma amostra dentro da bolsa de captura. Por exemplo, nas modalidades em que a amostra é oócito ou embrião humano, o diâmetro de cada canal de filtragem se encontra na faixa de 0,0013 a 0,0038 centímetro (0,0005 a 0,0015 polegada).

[0081] De acordo com a presente descrição, o tamanho da bolsa de captura pode variar. Por exemplo, a Figura 7C ilustra uma modalidade exemplificativa, na qual o comprimento da bolsa de captura 916 é aumentado, em comparação com a modalidade mostrada na Figura 7A Em outras modalidades, a espessura e/ou largura da bolsa de captura 716 pode variar. Em algumas modalidades, o volume da bolsa de captura é suficiente para reter alguns oócitos ou embriões de humanos ou animais. Em algumas modalidades, o tamanho da câmara de amostra 711 na porção de entrada 910 pode variar. Por exemplo, as Figuras 8A e 8B ilustram duas modalidades exemplificativas, em que, na Figura 8A, o comprimento da porção de entrada 810 que aloja a câmara de amostra 811 é alongado, em comparação com a Figura 8B.

[0082] As Figuras 9A a 9C são ilustrações esquemáticas de uma modalidade do dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição. A Figura 9A mostra a pega 902, a porção de entrada 910 e várias estruturas localizadas na porção de entrada 910, que incluem a câmara de amostra 911, o reservatório de refugo 912, a abertura do canal de refugo 913 e a ilha 919. Nessa modalidade, a ilha 919 tem uma bolsa de captura em formato de U 916 e mecanismo de filtragem, como uma pluralidade de canais de filtragem 917, que conecta a bolsa de captura em formato de U 916 com o reservatório de refugo 912. A Figura 9B mostra uma vista em seção transversal ao longo da linha AA da Figura 9A. São mostradas, na vista em seção transversal, a pega 902, a porção de entrada 910 e várias estruturas localizadas na porção de entrada 910, que incluem uma reentrância 914, a bolsa de captura 916 e uma pluralidade de canais de filtragem 917. A Figura 9C é uma vista ampliada da área D, como mostrado na Figura 9B. Visíveis nessa vista, estão inclusos adicionalmente os canais de desvio 918.

[0083] Em algumas modalidades, o comprimento da bolsa de captura em formato de U 916, como medido pela distância entre o par de setas D da Figura 9A, encontra-se na faixa de cerca de 0,051 centímetro (0,02 polegada) a cerca de 0,102 centímetro (0,04 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, o comprimento da bolsa de captura 916 é de 0,097 centímetro (0,038 polegada).

[0084] Em algumas modalidades, a largura da bolsa de captura 916, como medido pela distância entre o par de setas B da Figura 9A, encontra-se na faixa de cerca de 0,013 centímetro (0,005 polegada) a cerca de 0,051 centímetro (0,02 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a largura da bolsa de captura 916 é de 0,038 centímetro (0,015 polegada).

[0085] Em algumas modalidades, o comprimento da ilha 919, conforme medido pela distância entre o par de setas C da Figura 9A, encontra-se na faixa de cerca de 0,076 centímetro (0,03 polegada) a cerca de 0,178 centímetro (0,07 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, o comprimento da ilha 919 é de 1,73 centímetro (0,68 polegada).

[0086] Em algumas modalidades, a profundidade da bolsa de captura 916, medida pela distância entre o par de setas E da Figura 9C, encontra-se na faixa de cerca de 0,025 centímetro (0,01 polegada) a cerca de 0,076 centímetro (0,03 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a profundidade da bolsa de captura 916 é de 0,053 centímetro 0,021 polegada).

[0087] Em algumas modalidades, a profundidade do canal de desvio 918, medida pela distância entre o par de setas F da Figura 9C, encontra-se na faixa de cerca de 0,0025 centímetro (0,001 polegada) a cerca de 0,013 centímetro (0,005 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a profundidade do canal de desvio 918 é de 0,013 centímetro (0,005 polegada).

[0088] Em algumas modalidades, quando o dispositivo de vitrificação está na primeira configuração aberta, a porta de entrada da tampa é colocada em relação à porção de entrada, de modo que pelo menos uma extremidade da porta de entrada esteja próxima da bolsa de captura. Assim, um usuário pode facilmente entregar uma amostra na bolsa de captura através da porta de entrada, com uso de uma micropipeta, por exemplo.

[0089] Em algumas modalidades, os canais de filtragem 717, 917 facilitam a separação de um refugo fluídico a partir de uma amostra específica contida na bolsa de captura 716, 916. Particularmente, em algumas modalidades, o refugo fluídico flui para o reservatório de refugo 712, 912 através dos canais de filtragem 717, 917, enquanto amostras com tamanhos de partículas maiores que os do diâmetro dos canais são retidas na bolsa de captura 716, 916. O fluxo dos refugos fluídicos pode ser acionado por vários mecanismos. Por exemplo, em algumas modalidades, quando a tampa se engata à porção de entrada, um dispositivo de entrega de fluido, como uma micropipeta, pode entregar uma pressão fluídica na câmara de amostra, através da porta de entrada, e empurrar o fluxo de fluidos em direção ao reservatório de refugo. Em modalidades alternativas, um mecanismo de sucção pode aspirar o fluxo dos fluidos em direção ao reservatório de refugo. Além disso, em algumas modalidades, os canais microfluídicos são configurados para prover uma potência de capilaridade que facilita a aspiração dos refugos líquidos em direção ao reservatório de refugo. A ação capilar é iniciada quando uma primeira solução é introduzida na câmara de amostra 711, 911 com uma força fluídica, como o uso de uma pipeta. O fluido é empurrado através da câmara de amostra 711, 911, através dos canais de filtragem 717, 917 e para dentro do reservatório de refugo 712, 912 e do canal de refugo 713, 913. A presença de fluido no canal de refugo 713, 913, em combinação com os canais microfluídicos de tamanho particular, através da totalidade do dispositivo, gera uma força forte o suficiente para puxar fluidos subsequentes através do dispositivo 701, 901 com uso de ação capilar.

[0090] As Figuras 10A a 10C mostram uma modalidade adicional do dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição. Particularmente, a Figura 10A é uma vista em perspectiva de estruturas parciais do dispositivo, que mostra partes da pega 1002 e a porção de entrada 1010. A porção de entrada 1010 compreende uma câmara de amostra 1011, um mecanismo de filtragem que inclui um filtro 1021 e uma inclinação 1020 posicionada entre a câmara de amostra 1011 e o filtro 1021. A Figura 10B é uma vista em seção transversal da modalidade, como mostrado na Figura 10A, obtida ao longo da linha AA da Figura 10C, que mostra a porção de entrada 1010 e a pega 1002. Mostrado na Figura 10B, o filtro 1021 cobre um canal de refugo 1013 que se liga a um reservatório de refugo 1012 localizado na pega 1002.

[0091] Em algumas modalidades, a espessura do filtro 1021, medida na distância entre o par de setas B da Figura 10B, encontra-se na faixa de cerca de 0,025 centímetro (0,01 polegada) a cerca de 0,076 centímetro (0,03 polegada). Em uma modalidade exemplificativa, a espessura do filtro 1021 é de 0,56 centímetro (0,22 polegada).

[0092] A inclinação 1020 conecta a câmara de amostra 1011 com o filtro 1021. A Figura 10B mostra o dispositivo de vitrificação (sem tampa) colocado horizontalmente, com a câmara de amostra 1021 voltada para cima. Como mostrado, a inclinação 1020 assume um ângulo de inclinação com a superfície da câmara de amostra 1011 e se estende para cima, a partir de uma extremidade da câmara de amostra 1011. Em algumas modalidades, para coletar os refugos, uma micropipeta é usada para empurrar os fluidos na amostra câmara 1011, para que fluam através da inclinação 1020 e em direção ao filtro 1021. Os refugos fluídicos fluem através do filtro 1021 para o reservatório de refugo 1012, enquanto uma amostra de tamanho maior é impedida de fluir. Assim, a amostra é retida na câmara de amostra. Sem pretensão de ser limitado por teoria, também é observado que a inclinação 1020 auxilia no impedimento de que a amostra, como oócitos ou embriões, afixe-se ao filtro 1021, porque a gravidade atua sobre as amostras, puxando-se as mesmas para baixo, na inclinação 1020, e afastando-se as mesmas do filtro 1021.

[0093] Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, a inclinação 1020 forma pelo menos um canal microfluídico, provendo, assim, uma potência de capilaridade para mover um refugo líquido da câmara de amostra 1011 em direção ao filtro 1021. A ação capilar se inicia quando uma primeira solução é introduzida na câmara de amostra 1011 com uma força fluídica, como usando-se uma pipeta. O fluido é empurrado através da câmara de amostra 1011, ao longo da inclinação 1020 e para dentro do reservatório de refugo 1012. A presença de fluido no reservatório de refugo 1012, em combinação com os canais microfluídicos de tamanho particular, através da totalidade do dispositivo, gera uma força forte o suficiente para puxar fluidos subsequentes através do dispositivo 1001 com uso de ação capilar. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, o filtro 1021 é produzido a partir de um material absorvente, como uma esponja ou um papel de filtro, provendo, também, assim, um poder de capilaridade que facilita a remoção de um refugo líquido da câmara de amostra 1011.

[0094] Em algumas modalidades, o filtro 1021 deixa seletivamente passar o refugo para o canal de refugo 1013, enquanto impede que uma amostra passe. Por exemplo, em algumas modalidades, o filtro 1021 compreende um mecanismo que separa o refugo e a amostra, com base em seus respectivos tamanhos. Em algumas modalidades, o mecanismo deixa passar um componente líquido, mas retém um componente sólido de uma mistura. Em algumas modalidades, o filtro 1021 tem poros pequenos o suficiente para bloquear a passagem de uma amostra sólida, como oócitos ou embriões. Em várias modalidades, o tamanho dos poros pode variar, dependendo do tipo de amostras. Em algumas modalidades, o filtro 1021 é produzido a partir de um material de filtragem. Os materiais de filtragem adequados que podem ser utilizados em conexão com a presente descrição incluem, mas sem limitação, esferas de polietileno sinterizado, malha de polímero e papel fibroso. Em algumas modalidades, o material de filtragem impede a aderência de uma amostra ao filtro 1021.

[0095] Em algumas modalidades, o dispositivo de vitrificação tem adicionalmente uma configuração fechada (não mostrada). Na configuração fechada, a tampa é colocada em relação à porção de entrada, de modo que nenhuma das aberturas da tampa esteja em comunicação fluídica com a câmara de amostra, e a câmara de amostra é vedada pela parede da tampa. Em algumas modalidades, na configuração fechada, a uma ou mais reentrância, ou abertura na tampa, é colocada próxima à câmara de amostra. Em algumas modalidades, na configuração fechada, as uma ou mais aberturas da tampa estão em comunicação fluídica com a reentrância na porção de entrada.

[0096] O dispositivo de vitrificação, na configuração fechada, pode ser submerso em um fluido, sem expor o teor da câmara de amostra diretamente ao fluido. Em algumas modalidades, o dispositivo de vitrificação é configurado para ser imerso, pelo menos a porção de entrada e as porções de tampa, em nitrogênio líquido para vitrificação de uma amostra contida na câmara de amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo é adicionalmente configurado para ser imerso em um meio quente para descongelamento de uma amostra contida no mesmo. Nessas modalidades, o nitrogênio líquido ou o meio quente pode facilmente se aproximar da amostra, como através das aberturas na tampa, mas sem entrar em contato direto com a amostra, quando o dispositivo estiver na configuração fechada. Em algumas modalidades, pelo menos a porção de entrada e as porções de tampa do dispositivo são produzidas a partir de um material resistente ao nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, o material é condutor térmico, de modo que a vitrificação e o degelo rápidos da amostra possam ser alcançados. Os materiais exemplificativos que podem ser usados em conexão com a presente descrição incluem, mas sem limitação, um material à base de acrílico, um material à base de polipropileno, um material à base de policarbonato e um material à base de copoliéster.

[0097] Em algumas modalidades, a alternância entre as configurações aberta e fechada é alcançada rotacionando-se a tampa ao longo de seu eixo geométrico longitudinal, por exemplo, cerca de 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°, 110°, 120°, 130°, 140°, 150°, 160°, 170° ou 180°. Em particular, em referência à modalidade exemplificativa, como mostrado na Figura 2B, a porta de entrada 104 e as aberturas 107, 108 são localizadas nos lados opostos da tampa 103. Nessa modalidade, é possível alternar entre a primeira configuração aberta e a configuração fechada rotacionando-se a tampa 103 em cerca de 90° em torno de seu eixo geométrico longitudinal, e a alternância entre a primeira configuração aberta e a segunda configuração aberta pode ser alcançada rotacionando-se a tampa 103 em cerca de 180° em torno de seu eixo geométrico longitudinal. Em algumas modalidades, a tampa 103 compreende adicionalmente um cabo 106 que facilita a retenção e rotação da tampa.

[0098] As Figuras 11A e 11B ilustram procedimentos exemplificativos para congelar e descongelar embriões com uso do presente dispositivo de vitrificação. Como mostrado na Figura 11A, para congelamento, o dispositivo é colocado, primeiro, na primeira configuração aberta. Um meio de cultura é entregue na câmara de amostra através da porta de entrada na tampa, seguido pela entrega da amostra de embrião na câmara de amostra. Em seguida, uma solução de equilíbrio adequada é adicionada através da porta de entrada, e se permite que os embriões se equilibrem na solução de equilíbrio por um período de tempo, antes que o refugo seja coletado. Depois disso, uma solução de vitrificação é adicionada através da porta de entrada, e os embriões são incubados na solução de vitrificação por um período de tempo, antes que os refugos sejam coletados. Em seguida, a tampa é rotacionada para a configuração fechada, e a porção de entrada do dispositivo é rapidamente mergulhada em um tanque de nitrogênio líquido para vitrificação dos embriões.

[0099] Como mostrado na Figura 11B, para descongelar, o dispositivo congelado em configuração fechada é rapidamente mergulhado em um banho quente a 37°C e incubado por um período de tempo. Em seguida, a tampa é rotacionada para a primeira configuração aberta. Uma solução descongelamento a 37°C é aplicada, através da porta de entrada, à câmara da amostra, e se permite que os embriões sejam aquecidos durante um período de tempo. Em seguida, é adicionada uma solução de diluição à temperatura ambiente, e se permite que os embriões estejam em equilíbrio na solução de diluição por um período de tempo, antes que o refugo seja coletado. Depois disso, uma solução de lavagem à temperatura ambiente é adicionada à câmara de amostra, e se permite que os embriões estejam em equilíbrio por um período de tempo, antes que o refugo seja coletado. A etapa de lavagem pode ser repetida, conforme necessário, antes da adição de um meio de cultura a 37°C à câmara da amostra. Em seguida, a tampa é rotacionada para a segunda configuração aberta, e os embriões são recuperados através de uma abertura na tampa.

[00100] É observado que os procedimentos para congelar e/ou descongelar uma amostra com uso do presente dispositivo podem reduzir o número de manipulações de micropipetas em pelo menos quatro vezes, sem comprometer a qualidade da amostra preparada. Além disso, através do mecanismo embutido de coleta de refugo, a quantidade de solução transportada em cada etapa úmida é reduzida e se torna mais consistente, de usuário para usuário. Assim, as vantagens do presente dispositivo incluem a redução do risco de dano associado à manipulação humana de amostras frágeis, bem como a redução do erro humano associado à preparação da amostra, melhorando assim a consistência da qualidade da amostra.

[00101] Os procedimentos de congelamento e descongelamento acima são apenas a título de exemplo e, de forma alguma, limitam o uso do presente dispositivo de vitrificação aos exemplos específicos descritos. Por exemplo, amostras que podem ser usadas em conexão com o presente dispositivo não estão limitadas a amostras de embriões, mas também incluem, por exemplo, oócitos, células somáticas e outros tipos de amostras adequados. Além disso, os agentes químicos a serem utilizados para tratar as amostras não se limitam àqueles descritos acima, ao contrário, é observado que o presente dispositivo é versátil e pode ser utilizado com diferentes kits de vitrificação comercialmente disponíveis. Além disso, o presente dispositivo pode ser usado para processamento e preservação de amostras fora do contexto de congelamento e descongelamento. Aqueles versados na técnica devem ser capazes de prever modificações e variações adicionais que não se desviem do princípio da presente descrição, e aquelas modalidades modificadas ou variadas são, ainda, englobadas pelo escopo do presente pedido.

[00102] A Figura 12A e Figura 12B ilustram modalidades exemplificativas em que várias unidades do dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição, podem ser empilhadas em conjunto, por exemplo, para armazenamento ou transporte conveniente. A Figura 12A ilustra a modalidade exemplificativa em que cada unidade do dispositivo de vitrificação 1201 tem um plugue 1202 em uma extremidade e um receptáculo 1203 na outra extremidade. O plugue 1202 de uma unidade se engata ao receptáculo 1203 de outra unidade, de modo que as duas unidades possam ser empilhadas em conjunto. A Figura 12B ilustra outra modalidade exemplificativa, em que cada unidade do dispositivo de vitrificação 1201 tem ímãs 1202, 1203 em ambas as extremidades. Os ímãs 1202, 1203 se engatam, empilhando, assim, várias unidades em conjunto.

[00103] A Figura 13A ilustra uma modalidade alternativa do dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição. Como mostrado, o dispositivo de vitrificação 1301 compreende um membro alongado com uma porção de pega 1302 e uma porção de entrada 1310. A porção de entrada 1310 pode ser acoplada reversivelmente a uma tampa 1303. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 é cilíndrica e pode se engatar a um espaço oco cilíndrico dentro da tampa 1303. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 é cônica, com uma dimensão maior na extremidade próxima à pega 1302 e uma dimensão menor na extremidade distal da pega 1302. Em algumas modalidades, a entrada a porção 1310 é cônica, com um ângulo de saída de cerca de 1° a cerca de 5°. Em algumas modalidades, o espaço oco na tampa 1303 também é cônico com um ângulo de saída correspondente, de modo que as formas cônicas da porção de entrada 1310 e da tampa 1303 criem uma força de encunhamento que ajude a engatar e/ou vedar as duas partes em conjunto. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente um batente de tampa 1323 para impedir que a tampa 1303 se mova adicionalmente em direção à porção de entrada 1310, impedindo, assim, que a tampa 1303 cubra a janela de visualização 1305 ou a reentrância 1314. Em algumas modalidades, a tampa 1303 compreende adicionalmente um cabo 1306 para fácil retenção e rotação da tampa 1303.

[00104] A Figura 13B é uma vista em perspectiva da porção de entrada 1310 do dispositivo de vitrificação. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 encerra uma câmara de amostra (não mostrada) que está em comunicação fluídica com um reservatório de refugo (não mostrado) fechado dentro da pega 1302. Uma porta de entrada 1304 conecta a câmara de amostra com a parte externa. A porção de entrada compreende adicionalmente uma janela de visualização 1305 e pelo menos uma porção da câmara de amostra pode ser visível do lado de fora, através da janela de visualização 1305. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente uma ou mais reentrâncias 1314 que estão próximas à câmara de amostra. Em algumas modalidades, quando em contato com nitrogênio líquido, a reentrância 1314 permite que o nitrogênio líquido se aproxime da câmara de amostra para melhor vitrificação de uma amostra contida na mesma. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente uma reentrância 1315 próxima à abertura da porta de entrada 1304. A reentrância1315 permite que ferramentas de entrega de amostras, como uma micropipeta, aproximem-se da abertura da porta de entrada 1304 com mais facilidade. A reentrância 1315 também impede que o ar entre na câmara de amostra e forme bolhas de ar, quando a tampa 1303 é empurrada para a porção de entrada 1310.

[00105] As Figuras 14A a 14D ilustram o dispositivo de vitrificação 1301, que mostra a pega 1302, a porção de entrada 1310 e a tampa 1303. Como mostrado na vista superior da Figura 14A, a porção da porção de entrada 1310, que é distal à porção de pega 1302, é inserida na tampa 1303. Em algumas modalidades, um batente de tampa 1323 ajuda a impedir que a tampa 1303 bloqueie a janela de visualização 1305. Particularmente, em algumas modalidades, o batente da tampa 1303 está localizado mais distal à pega 1302 do que a janela de visualização 1305. Em algumas modalidades, a tampa compreende adicionalmente um cabo 1306 para fácil manutenção e manuseio da tampa 1303. A Figura 14B também ilustra a vista superior do dispositivo de vitrificação 1301. Nessa vista, a tampa 1303 é removida da porção de entrada 1310, e a porta de entrada 1304 é exposta.

[00106] A Figura 14C ilustra a seção transversal ao longo da linha AA da Figura 14B. Como mostrado, a porção de entrada 1310 compreende uma câmara de amostra 1311, que é conectada à parte externa através da porta de entrada 1304. A câmara de amostra 1311 compreende pelo menos uma superfície 1321 em que uma amostra pode ser depositada. A janela de visualização 1305 se situa sobre a câmara de amostra 1311, de modo que o teor e/ou a atividade dentro da câmara de amostra 1311 possa ser visível do lado de fora. A reentrância 1314 está próxima à câmara de amostra 1311. Nessa modalidade exemplificativa, a câmara de amostra 1311 e a reentrância 1314 são separadas por uma parede fina que permite uma transferência térmica mais rápida, por exemplo, entre uma amostra na câmara de amostra 1311 e o nitrogênio líquido na reentrância 1314. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente uma reentrância 1315 próxima à abertura da porta de entrada 1304.

[00107] A câmara de amostra 1311 está em comunicação fluídica com um reservatório de refugo 1312, que se estende para a porção de alça 1302 do dispositivo. Um mecanismo de filtragem 1320 fica entre a câmara de amostra 1311 e o reservatório de refugo 1312. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem 1320 deixa seletivamente passar um refugo para o reservatório de refugo 1312, enquanto retém a amostra dentro da câmara de amostra 1311. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem 1320 separa o refugo e a amostra com base em seus respectivos tamanhos. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem 1320 deixa passar um componente líquido, mas retém um componente sólido de uma mistura. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem 1320 tem poros pequenos o suficiente para bloquear a passagem de uma amostra sólida, como oócitos ou embriões. Em várias modalidades, o tamanho dos poros pode variar dependendo do tipo de amostras.

[00108] Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem 1320 é uma malha. Em algumas modalidades, os orifícios através da malha são pequenos o suficiente para permitir que uma potência de capilaridade aspire o fluido por meio de ação capilar. Em algumas modalidades, quando em uso, uma pressão fluídica é provida, primeiro, na câmara de amostra 1311 para empurrar um líquido através da malha. A presença de fluido no reservatório de refugo 1312 gera uma força forte o suficiente para puxar fluidos subsequentes através do dispositivo 1301 com uso de ação capilar. Além disso, o líquido que flui através da malha para umedecer os orifícios pode aumentar a potência de capilaridade para mover o líquido e/ou líquidos adicionais subsequentes através da malha, mesmo sem a pressão fluídica. De acordo com a presente descrição, os materiais adequados para o mecanismo de filtragem 1320 incluem, mas sem limitação, esferas de polietileno sinterizado, malha de polímero e papel fibroso. Em algumas modalidades, o material tem uma superfície lisa e evita a aderência ou afixação de uma amostra.

[00109] A Figura 14D mostra a vista em seção transversal de todo o dispositivo. A tampa 1303 tem um espaço oco interno 1324 para alojar a porção de entrada 1310. Em algumas modalidades, quando a tampa 1303 é acoplada à porção de entrada 1310, a porta de entrada 1304 é vedada. Uma bolsa de ar se forma na reentrância 1315, quando a tampa 1303 é empurrada para a porção de entrada 1310. Assim, a reentrância 1315 impede que o ar seja empurrado para dentro da porta de entrada 1304 e forme bolhas na câmara de amostra 1311, quando a tampa 1303 é acoplada à porção de entrada 1310. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente um batente de tampa 1323 para impedir que a tampa 1303 bloqueie a janela de visualização 1305. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente um mecanismo que impede que o refugo se mova do reservatório de refugo 1312 de volta para a câmara de amostra 1311. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente um mecanismo, como um filtro 1322, que permite que o ar no reservatório de refugo 1312 seja ventilado, quando o refugo entra, e impede que o nitrogênio líquido entre no reservatório de refugo 1312. Em algumas modalidades, o filtro 1322 também impede que um refugo líquido vaze para fora do reservatório de refugo 1312. Em algumas modalidades, o filtro 1322 tem um tamanho de poro que é pequeno o suficiente para impedir a passagem de líquido, mas grande o suficiente para permitir a passagem do ar. Em algumas modalidades, o filtro 1322 tem um tamanho de poro de cerca de 20 mícrons. Em algumas modalidades, o filtro 1322 é produzido a partir de PTFE, polietileno ou polipropileno.

[00110] As Figuras 15A e 15B ilustram modalidades alternativas do dispositivo de vitrificação 1301 em uma vista em perspectiva. Uma seção transversal ao longo do eixo geométrico longitudinal do dispositivo também é mostrada. Particularmente, é mostrada, na Figura 15A, uma estrutura parcial do dispositivo de vitrificação 1301, que inclui a pega 1302 (parcialmente mostrada) e a porção de entrada 1310 (parcialmente mostrada). A porção de entrada 1310 compreende uma câmara de amostra 1311. Uma porta de entrada 1304 conecta a câmara de amostra 1311 com a parte externa. A porção de entrada 1310 compreende adicionalmente um reservatório de refugo 1312 que se estende para a pega 1302. Nessa modalidade exemplificativa, um mecanismo de filtragem 1320, como uma malha, é posicionado entre a câmara de amostra 1311 e o reservatório de refugo 1312. Uma janela de visualização 1305 se situa sobre a câmara de amostra 1311, de modo que um usuário possa ver o teor e/ou as atividades dentro da câmara de amostra 1311 através da janela de visualização 1305. A porção de entrada 1310 compreende adicionalmente pelo menos duas reentrâncias 1314 na proximidade da câmara de amostra 1311. Quando em contato com nitrogênio líquido, as reentrâncias 1314 permitem que o nitrogênio líquido entre nas proximidades da câmara de amostra 1311, para melhor efeito de vitrificação. Quando a tampa (não mostrada) se engata à porção de entrada 1310, a porta de entrada 1304 é vedada. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1310 compreende adicionalmente uma reentrância 1315 próxima à abertura da porta de entrada 1304. A reentrância 1315 permite que ferramentas de entrega de amostra, como uma micropipeta, aproximem-se da abertura da porta de entrada 1304 com mais facilidade. A reentrância 1315 também impede que o ar entre na câmara de amostra 1311 e forme bolhas de ar, quando a tampa é empurrada para a porção de entrada 1310.

[00111] Como mostrado na Figura 15A, a câmara de amostra 1311 tem pelo menos uma superfície 1321 em que uma amostra pode ser descartada. A superfície de recebimento de amostras 1321 pode assumir um ângulo com a porta de entrada 1304 para facilitar a entrega da amostra na superfície 1321. Em algumas modalidades, o ângulo entre a porta de entrada 1304 e a superfície de recebimento de amostra 1321 se encontra na faixa de cerca de 20° a cerca de 70°. De acordo com a presente descrição, as dimensões da superfície de recebimento de amostra 1321 e da porta de entrada 1304 não são críticas, visto que uma amostra pode ser facilmente entregue. A Figura 15B mostra uma modalidade alternativa, em que a área da superfície de recebimento de amostra 1321 é reduzida. Nessa modalidade exemplificativa, a porta de entrada 1304 tem dois segmentos. O primeiro segmento próximo à abertura da porta de entrada 1304 tem um diâmetro maior em comparação com o segundo segmento próximo à câmara de amostra. Em outras modalidades, a porta de entrada 1304 pode ser cônica, com uma dimensão maior na abertura e uma dimensão menor em direção à câmara de amostra 1311.

[00112] As Figuras 16 a 21 ilustram uma modalidade alternativa de um dispositivo de vitrificação, de acordo com a presente descrição. A Figura 16 é uma vista em perspectiva do dispositivo de vitrificação 1601. O dispositivo de vitrificação 1601 compreende um formato alongado com duas extremidades. Em uma extremidade, o dispositivo 1601 compreende uma porção de entrada (não mostrada) que pode ser acoplada reversivelmente a uma tampa removível 1603. Em algumas modalidades, a porção de entrada 1610 é cilíndrica e pode se engatar a um espaço oco cilíndrico, dentro da tampa 1603. O dispositivo inclui adicionalmente uma porção de alça 1602 e uma tampa 1630 na segunda extremidade. O dispositivo 1601 também inclui pelo menos uma janela de visualização 1605. O dispositivo de vitrificação tem uma configuração fechada (mostrada na Figura 16) e uma configuração aberta (mostrada nas Figuras 18 a 19). A alternância entre as configurações fechada e aberta é alcançada acoplando-se ou desacoplando-se, respectivamente, a tampa 1603 da porção de entrada 1610. Na modalidade mostrada, a tampa 1603 tem uma pluralidade de cumes, formando um cabo para fácil manutenção e manuseio da tampa 1603.

[00113] A Figura 17 é uma vista em seção transversal longitudinal do dispositivo de vitrificação 1601 na configuração fechada, com a tampa 1603 acoplada à porção de entrada 1610. Nessa configuração, a porta de entrada 1604 e, assim, a câmara de amostra 1611 é vedada pela parede da tampa 1603. O dispositivo de vitrificação 1601, na configuração fechada, pode ser submerso em um fluido, sem expor o teor da câmara de amostra 1611, diretamente ao fluido, como descrito acima.

[00114] Quando na configuração aberta, a porta de entrada 1604 é configurada para receber uma amostra e agentes fluídicos para entrega à câmara de amostra 1611. A porta de entrada 1604 está em comunicação fluídica com a câmara de amostra 1611, que também está em comunicação fluídica com um reservatório de refugo 1612 através de um mecanismo de filtragem que inclui um filtro 1621. A janela de visualização 1605 está localizada na área ao redor da câmara de amostra 1611. Uma abertura 1607 é formada na porção de pega 1602, diametralmente oposta à janela de visualização 1605.

[00115] A Figura 18 ilustra a porção de entrada 1610 e uma porção da pega 1602 do dispositivo de vitrificação 1601. O dispositivo de vitrificação 1601 é mostrado na configuração aberta (a tampa 1603 é removida), de modo que a porta de entrada 1604 seja exposta. A porta de entrada 1604 compreende uma reentrância do tipo calha 1604a na parede da porção de entrada 1610 e um canal de entrada 1604b que leva à câmara de amostra 1611. A reentrância 1604a permite que ferramentas de entrega de amostra, como uma micropipeta, aproximem-se da abertura do canal de entrada 1604b mais facilmente. Os agentes fluídicos entregues por meio da reentrância 1604a fluem através do canal de entrada 1604b diretamente para uma amostra na câmara de amostra 1611.

[00116] A janela de visualização 1605 permite que um usuário do dispositivo visualize e examine as condições de uma amostra localizada dentro da câmara de amostra 1611. Em algumas modalidades, a janela de visualização 1605 pode ser formada por uma abertura na parede, de modo que uma parede externa da câmara de amostra 1611 seja exposta. Em outras modalidades, a janela de visualização 1605 é produzida a partir de um material transparente, de modo que um usuário do dispositivo possa ver facilmente através da mesma, para examinar as condições de uma amostra localizada dentro da câmara de amostra 1611. Em várias modalidades, a janela de visualização 1605 pode ser produzida a partir de um material igual ou diferente das partes restantes do dispositivo 1601. A câmara de amostra 1611 é encerrada por um material transparente para permitir a visualização da amostra na câmara. Em algumas modalidades, a parede da câmara de amostra 1611 é inferior a 0,013 centímetro (0,005 polegada) e, de preferência, menor ou igual a 0,0051 centímetro (0,002 polegada), o que permite que a amostra se descongele na taxa preferencial.

[00117] A Figura 19 é uma vista em seção transversal da porção de entrada 1610 e da porção da alça 1602 mostrada na Figura 18. Nessa vista, é mostrada uma abertura 1607 diametralmente oposta à janela de visualização 1605. A abertura 1607 expõe o espaço ao redor da câmara de amostra 1611. Quando a porção de entrada 1610 é submersa em nitrogênio líquido, por exemplo, o nitrogênio líquido flui através da abertura 1607 e na proximidade da amostra na câmara de amostra 1611. Em algumas modalidades, o número de tais aberturas não se limita a um. Em várias modalidades, a janela de visualização 1605 também serve como uma abertura de maneira semelhante. É observado que, em algumas modalidades, ter pelo menos duas aberturas permite o fluxo rápido de nitrogênio líquido para a proximidade da área da amostra e, assim, a vitrificação rápida da amostra, visto que o ar preso no espaço ao redor da câmara de amostra 1611 pode escapar através de uma abertura, enquanto o nitrogênio líquido entra através de outro.

[00118] Um usuário pode entregar um agente fluídico, como uma amostra, ou soluções para preparar ou tratar a amostra, na câmara de amostra 1611, através da porta de entrada 1604, enquanto monitora o teor e/ou as atividades dentro da câmara de amostra 1611, através da janela de visualização 1605. O refugo, então, é coletado no reservatório de refugo 1612. Em várias modalidades, o dispositivo 1601 compreende um mecanismo, como um mecanismo de filtragem, para reter a amostra, enquanto deixa o refugo passarem para o reservatório de refugo 1612. Por exemplo, nessa modalidade, o filtro 1621 separa a câmara de amostra 1611 do reservatório de refugo 1612.

[00119] O filtro 1621 é mostrado em detalhes na vista em seção transversal em perspectiva da Figura 20. Em algumas modalidades, o filtro 1621 permite seletivamente que o refugo flua para o reservatório de refugo 1612, enquanto impede que uma amostra passe. Por exemplo, em algumas modalidades, o filtro 1621 compreende um mecanismo de filtragem que separa o refugo e a amostra, com base em seus respectivos tamanhos. Em algumas modalidades, o mecanismo de filtragem deixa passar um componente líquido, mas retém um componente sólido de uma mistura. Assim, a amostra é retida na câmara de amostra 1611. Em algumas modalidades, o filtro 1621 tem poros pequenos o suficiente para bloquear a passagem de uma amostra sólida, como oócitos ou embriões. Em várias modalidades, o tamanho dos poros pode variar, dependendo do tipo de amostras. Em algumas modalidades, o filtro 1621 tem uma pluralidade de poros, por exemplo, orifícios perfurados a laser em um componente moldado por injeção. O tamanho, número e/ou a disposição dos poros é selecionado para promover a ação capilar (descrita abaixo). Em algumas modalidades, o componente de filtro 1621 inclui uma matriz 7x9 de poros com um diâmetro de aproximadamente 0,005 centímetro (0,002 polegada), com espaçamento 0,0076 (0,003) entre os centros dos poros. Em outras modalidades, o filtro 1621 pode ter um número diferente de poros na matriz, poros de diâmetro diferente e/ou um espaçamento diferente entre os poros.

[00120] Em outras modalidades, o filtro 1621 é produzido a partir de um material de filtragem. Os materiais de filtragem adequados que podem ser utilizados em conexão com a presente descrição incluem, mas sem limitação, esferas de polietileno sinterizado, malha de polímero e papel fibroso. Em algumas modalidades, o material de filtragem impede a aderência de uma amostra ao filtro 1621.

[00121] O dispositivo de vitrificação 1601 é dimensionado e configurado para extrair fluido da porta de entrada 1604 através do mecanismo de filtragem e para o reservatório de refugo 1612 por meio de ação capilar. Dessa maneira, os fluidos de amostra fluem da porta de entrada 1604, através da câmara de amostra 1611, e para o reservatório de refugo 1612, sem a assistência, ou mesmo em oposição às forças externas. Em algumas modalidades, as pequenas passagens através da porta de entrada 1604, a câmara de amostra 1611, os poros no filtro 1621 e/ou o reservatório de refugo 1612 formam canais microfluídicos, provendo, assim, uma potência de capilaridade para mover um refugo líquido da câmara de amostra 1611 em direção ao filtro 1621. A ação capilar é iniciada quando uma primeira solução é introduzida através da porta de entrada 1604 com uma força fluídica, tal como com uso de uma pipeta. O fluido é empurrado através da câmara de amostra 1611, além dos poros do filtro 1621, e para dentro do reservatório de refugo 1612. A presença de fluido no reservatório de refugo 1612, em combinação com os canais microfluídicos de tamanho particular, através da totalidade do dispositivo, gera uma força forte o suficiente para puxar fluidos subsequentes através do dispositivo 1621, com uso de ação capilar. Além disso, em algumas modalidades, o filtro 1621 é produzido a partir de um material absorvente, como uma esponja, um papel de filtro ou uma malha que, quando molhada, também provê uma potência de capilaridade que facilita a remoção de refugo líquido da câmara de amostra 1611. Em algumas modalidades, uma vez que um fluxo de líquido atravessa o material e umedece os furos, é iniciada a ação capilar, e a potência de capilaridade auxilia no movimento dos líquidos e/ou dos líquidos adicionais subsequentes, através do material, mesmo sem a pressão de fluidos.

[00122] O refugo líquido é coletado no reservatório de refugo 1612, que está contido na porção de pega 1602. Em algumas modalidades, o reservatório de refugo é dimensionado e configurado para ter a capacidade de reter todos os fluidos usados durante o pré-tratamento e a preparação de uma amostra para vitrificação, de modo que o reservatório de refugo 1612 não atinja a capacidade máxima e não precise ser esvaziado. O reservatório de refugo 1612 tem uma tampa 1630 na extremidade oposta à porção de entrada 1610, como mostrado na Figura 21, que permite que o reservatório seja ventilado quando o fluido é puxado para dentro da câmara de amostra 1611. Além disso, a tampa 1630 ajuda a manter a posição do reservatório de refugo 1612 na linha central axial do dispositivo 1601 para prover folga igual ao redor do reservatório de refugo 1612, para que o nitrogênio líquido (para congelamento) e a água quente (para descongelamento) passem pelo reservatório de refugo 1612. Em algumas modalidades, a tampa 1630 provê um identificador de cor exclusivo ao usuário, que é moldado em várias cores; exclusivo para vários tamanhos, usos, etc. do dispositivo 1621.

[00123] O dispositivo 1621 é adicionalmente configurado para vedar a câmara de amostra 1611 para submersão em nitrogênio líquido. Particularmente, a tampa 1603 veda a extremidade da porção de entrada 1610 do dispositivo 1621, e a outra extremidade é vedada por meio de solução congelada no reservatório de refugo 1612, que atua como um plugue.

[00124] As Figuras 22A a 22D representam modalidades alternativas da porção de entrada 1610 do dispositivo de vitrificação 1601. Como mostrado nessas Figuras, a porção de entrada 1610 inclui a porta de entrada 1604 com vários recursos de projeto para impedir ou limitar a passagem de bolhas de ar na câmara de amostra 1611, durante congelamento ou descongelamento da amostra. Quando a tampa 1603 é colocada no dispositivo 1621 após a introdução das soluções, uma bolha se forma sob a tampa 1603, à medida que o nível do líquido fica abaixo da parte superior da porta de entrada 1604. Como resultado, a bolha é empurrada em direção à abertura do o canal de entrada 1604b. Uma bolha de ar pode danificar a amostra na câmara de amostra 1611, por isso, os recursos das Figuras 22A a 22D auxiliam na limitação de potenciais danos à amostra.

[00125] Na Figura 22A, a porta de entrada 1604 tem a abertura para o canal de entrada 1604b separada da extremidade da reentrância de entrada 1604a pela parte elevada 1622. Quando a tampa (não mostrada) é colocada na porção de entrada 1610, qualquer bolha formada permanecerá acima do canal de entrada 1604b, na parte superior da porção elevada 1622. Uma vez congelada, a contração do líquido congelado não será capaz de sugar a bolha para dentro da câmara. Por isso, uma vez descongelada, a câmara permanecerá livre de bolhas.

[00126] Na Figura 22B, a porta de entrada 1604 inclui porções em diferentes elevações, em relação à abertura do canal de entrada 1604b. A segunda porção rebaixada 1624 é mais baixa que a reentrância da porta de entrada 1604a, mas é mais alta em relação à abertura do canal de entrada 1604b. Dessa forma, o nível de fluido permanece acima da segunda porção rebaixada 1624 (e acima da abertura para o canal de entrada 1604b) com uma quantidade menor de líquido. A porção de inclinação que separa a reentrância da porta de entrada 1604a e a segunda porção de reentrância 1624 ajuda a manter o nível de fluido acima da abertura do canal de entrada 1604b. Dessa maneira, o processo de descongelamento pode ser mais rápido do que se toda a profundidade da reentrância 1604a fosse a mesma, exigindo que uma grande quantidade de fluido se descongele. O descongelamento levaria mais tempo, o que poderia comprometer a viabilidade das amostras.

[00127] Em relação às Figuras 22C a 22D, a reentrância da porta de entrada 1604a inclui uma parte estreita 1626. A bolha, que é tão larga quanto a reentrância da porta 1604a, não pode ser espremida através da parte estreita 1626. Por isso, a bolha é mantida afastada da abertura do canal de entrada 1604b. Além disso, na Figura 22C, a reentrância de entrada 1604a é inclinada, o que permite o uso de uma quantidade mínima de fluido presente na reentrância 1604a, garantindo, ainda, que o nível do líquido não caia muito (isto é, permaneça acima da abertura do canal de entrada 1604b). Ter menos líquido para descongelar permite que a solução quente alcance a amostra mais rapidamente, o que promove a viabilidade da amostra.

[00128] Na Figura 22D, há uma calha 1628 dentro da reentrância de entrada 1604a. A calha 1628 provê uma via de passagem para o líquido que permite o fluxo, mesmo se houver uma bolha presa perto da abertura do canal de entrada 1604b após o degelo. Pretende-se que a calha 1628 seja sempre preenchida com líquido. Por isso, por haver uma passagem para o líquido fluir, mesmo quando houver formação de bolhas, ainda haverá movimento do líquido, o que é muito importante durante o descongelamento da amostra. Se uma bolha se tornar uma obstrução o trajeto de fluxo, a viabilidade da amostra será comprometida.

[00129] Em algumas modalidades, pelo menos a porção de entrada e as porções de tampa do dispositivo são produzidas a partir de um material resistente ao nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, o material é condutor térmico, de modo que a vitrificação e o degelo rápidos da amostra possam ser alcançados. Os materiais exemplificativos que podem ser usados em conexão com a presente descrição incluem, mas sem limitação, um material à base de acrílico, um material à base de polipropileno, um material à base de policarbonato e um material à base de copoliéster.

[00130] Os dispositivos de vitrificação descritos acima, de acordo com as várias modalidades descritas, incluem recursos semelhantes, e operam de acordo com princípios semelhantes, e números de referência semelhantes se referem aos elementos semelhantes. Deve ser entendido que certos componentes ou detalhes podem ser omitidos das descrições de certas modalidades, mas elementos semelhantes podem executar a mesma funcionalidade ou incluir os mesmos recursos descritos acima, em conexão com outras modalidades do dispositivo de vitrificação.

EQUIVALENTES

[00131] A presente tecnologia não deve ser limitada, em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que são destinadas a ilustrações únicas de aspectos individuais da presente tecnologia. Muitas modificações e variações da presente tecnologia podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e escopo, como será evidente para as pessoas versadas na técnica. Os métodos e os aparelhos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da presente tecnologia, além dos enumerados no presente documento, serão evidentes para as pessoas versadas na técnica, a partir das descrições anteriores. Tais modificações e variações devem estar dentro do escopo da presente tecnologia. Deve-se entender que essa presente tecnologia não se limita aos métodos, reagentes, às composições de compostos ou aos sistemas biológicos particulares que podem, certamente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitante.

[00132] Como será entendido por uma pessoa versada na técnica, para todo e qualquer objetivo, particularmente em termos de prover uma descrição escrita, todos as faixas descritas no presente documento também abrangem toda e qualquer possível subfaixa e combinação de subfaixas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo suficientemente e permitindo que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades iguais, terços, quartos, quintos, décimos, etc. Como exemplo sem limitação, cada faixa discutida no presente documento pode ser facilmente dividida em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Como também será entendido por uma pessoa versada na técnica, toda a linguagem, como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que” e, por exemplo, inclui o número recitado e se refere às faixas que podem ser posteriormente divididas em subfaixas, conforme discutido acima. Por fim, como será entendido por uma pessoa versada na técnica, uma faixa inclui cada membro individual.

[00133] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração, quantidades e peso molecular, o que inclui faixas, são aproximações variadas (+) ou (-) em 10%, 1% ou 0,1%, conforme apropriado. Deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que todas as designações numéricas podem ser precedidas pelo termo “sobre”. Também deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que os reagentes descritos no presente documento são meramente exemplificativos, e que seus equivalentes são conhecidos na técnica.

Claims

1. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601), compreendendo: uma porção de entrada (110, 710, 810, 910, 1010, 1310, 1610) com uma porta de entrada (104, 1304, 1604); uma câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611); um reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) em comunicação fluídica com a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611); um mecanismo de filtragem (1320) que permite, de modo seletivo, que um fluido introduzido através da porta de entrada (104, 1304, 1604) passe através da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) e para dentro do reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612), enquanto retém uma amostra dentro da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611); e caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma tampa (103, 1303, 1603) capaz de se acoplar, de modo reversível, à porção de entrada (110, 710, 810, 910, 1010, 1310, 1610) para fechar a porta de entrada (104, 1304, 1604), em que a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611), o reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) e o mecanismo de filtragem (1320) são configurados para extrair fluido da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) através do mecanismo de filtragem (1320) e para dentro do reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) através de ação capilar.

2. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos uma janela de visualização (105, 1305, 1605), em que a janela de visualização (105, 1305, 1605) é configurada de modo que a amostra dentro da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) seja visualizável através da janela de visualização (105, 1305, 1605).

3. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a tampa (103, 1303, 1603) é configurada para vedar a porta de entrada (104, 1304, 1604) a fim de inibir a vazão de fluido dentro do dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) quando a tampa (103, 1303, 1603) estiver acoplada à porção de entrada (110, 710, 810, 910, 1010, 1310, 1610).

4. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de filtragem (1320) compreende um filtro (1021, 1322, 1621) dotado de uma pluralidade de poros dimensionados e configurados para formarem uma pluralidade de canais microfluídicos para promover uma ação capilar.

5. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) compreende um material resistente a nitrogênio líquido.

6. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) compreende um material termicamente condutor.

7. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) é formada por pelo menos um dentre um material à base de acrílico, um material à base de polipropileno, um material à base de policarbonato e um material à base de copoliéster.

8. Dispositivo de vitrificação (101, 1201, 1301, 1601) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) tem uma parede com uma espessura menor ou igual a 0,0508 mm (0,002 polegada).

9. Método para preparar uma amostra em um dispositivo de vitrificação como definido na reivindicação 1, compreendendo: entregar uma amostra em uma câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) e adjacente a um mecanismo de filtragem (1320); tratar a amostra com um primeiro fluido, empurrando o primeiro fluido através da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) e para dentro de um reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) com uma força fluídica, enquanto o mecanismo de filtragem (1320) retém a amostra dentro da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611); e caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente vedar uma porta de entrada (104, 1304, 1604) para vazão de fluido para dentro da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) por acoplamento de uma tampa (103, 1303, 1603), em que empurrar o primeiro fluido para dentro do reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) inicia uma ação capilar, para extrair fluidos subsequentes através da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) e para dentro do reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612).

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente tratar a amostra com um segundo fluido, atraindo o segundo fluido através da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) e para dentro do reservatório de refugo (112, 712, 912, 1012, 1312, 1612) através de ação capilar, enquanto o mecanismo de filtragem (1320) retém a amostra dentro da câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611).

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente visualizar a amostra na câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) através de uma janela de visualização (105, 1305, 1605) na câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611).

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente vitrificar uma amostra na câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611).

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é vitrificada colocando-se a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) em contato com nitrogênio líquido.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente descongelar a amostra colocando-se a câmara de amostra (111, 711, 811, 911, 1011, 1311, 1611) em contato com uma solução aquecida.