BR112019018272A2 - marcadores metilação para diagnosticar hepatocelular carcinoma e câncer - Google Patents

Abstract

Aqui divulgado, em certas formas de realização, são métodos e kits para o diagnóstico de um indivíduo como tendo carcinoma hepatocelular (HCC) ou cancro do pulmão. Em alguns casos, também são aqui descritos métodos de determinação do prognóstico do HCC sujeito tendo ou cancro do pulmão. Em casos adicionais, aqui descritos são os métodos para determinar o estádio específico do HCC ou cancro do pulmão de um sujeito.

Description

MARCADORES DE METILAÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO DE CARCINOMA HEPATOCELULAR E CÂNCER DE PULMÃO REFERÊNCIA CRUZADA

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório Nº 62/466.328, depositado em 2 de março de 2017, Pedido U.S. Provisório Nº 62/466.329, depositado em 2 de março de 2017 e Pedido U.S. Provisório Nº 62/569.462, depositado em 6 de outubro 2017, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência em suas totalidades.

FUNDAMENTOS DA REVELAÇÃO

[002] O câncer é uma causa importante de mortes em todo o mundo, esperando-se que os casos anuais aumentem de 14 milhões em 2012 para 22 milhões durante as próximas duas décadas (OMS - Organização Mundial de Saúde). Procedimentos diagnósticos para o câncer hepático, em alguns casos, só começam após um paciente já apresentar sintomas, levando a procedimentos custosos, invasivos e algumas vezes demorados. Além disso, áreas inacessíveis algumas vezes impedem um diagnóstico preciso. Além disso, as altas morbidades e mortalidades do câncer estão associadas ao diagnóstico tardio.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[003] São revelados nesse relatório descritivo, em certas modalidades, métodos e kits para o diagnóstico de um indivíduo como tendo carcinoma hepatocelular (HCC) ou câncer de pulmão. Em alguns casos, também são descritos nesse relatório descritivo métodos de determinação do prognóstico do indivíduo que possui HCC ou câncer de pulmão. Em casos adicionais, são descritos nesse relatório descritivo métodos de determinação do estadiamento específico de HCC ou câncer de pulmão em um indivíduo.

[004] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) ou câncer de pulmão para tratamento, que compreende (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado das Tabelas 2, 6, 7, 9 ou 10 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC ou câncer de pulmão; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HC ou câncer de pulmão; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC ou câncer de pulmão.

[005] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SOCS2, EPSTIl, TIAl, Cromossomo 4, Cromossomo 6, ZNF323, FOXP4 e GRHL2 do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[006] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui câncer de pulmão ou de monitoramento da progressão de câncer de pulmão no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de NPBWR1, Cromossomo 2, AAK1I, SIM1, ClO0orf46 Cl7orfl101, DEPDC5, ZNF323, GABRAZ, PLAC8 e ADRAZB do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[007] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um kit que compreende um conjunto de sondas de ácidos nucleicos que hibridiza para sequências-alvo de SOCS2, EPSTIl, TIAl, Cromossomo 4, Cromossomo 6, ZNF323, FOXP4, GRHL2, NPBWR1, Cromossomo 2, AAKI, SIM1, Cl0Oorf46

Cl7orfl101, DEPDC5, ZNF323, GABRAZ2, PLAC8 e ADRAZBE.

[008] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um kit que compreende um conjunto de sondas de ácidos nucleicos que hibridiza para um ou mais genes selecionados das Tabelas 2, 6, 7, 9 ou 10.

[009] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) para tratamento, que compreende: (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXNI1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC.

[010] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) para tratamento, que compreende: (a) contato do DNA tratado com diversas sondas para gerar produtos amplificados, em que cada sonda hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em

BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20, e cada sonda é diferente, e em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise dos produtos amplificados para gerar um perfil de metilação dos genes do painel de genes; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC.

[011] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAlI, Cromossomo 17:78, SERPINBS5, NOTCH3, GRHL2 e TMEM8B do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[012] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de detecção do estado de metilação de um ou mais genes de um painel de genes em um indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; e (b) detecção do estado de metilação em um gene selecionado do painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 por contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo do gene para gerar um produto amplificado; e análise do produto amplificado para determinar o estado de metilação do gene.

[013] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de detecção do estado de metilação de um ou mais genes de um painel de genes em um indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; e (b) detecção do estado de metilação em um gene selecionado do painel de genes que consiste em SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAI, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEM8B por contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo do gene para gerar um produto amplificado; e análise do produto amplificado para determinar o estado de metilação no gene.

[014] Em certas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um kit que compreende um conjunto de sondas de ácidos nucleicos que hibridiza para sequências-alvo de

BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2, Cromossomo 8:20, SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAl, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMSB.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[015] Vários aspectos da revelação são apresentados com particularidade nas reivindicações em anexo. O arquivo dessa patente contém pelo menos um desenho/fotografia executado em cores. Cópias dessa patente com desenho(s)/fotografia(s) colorida (s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente revelação será obtida por referência à descrição detalhada seguintes que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da revelação são utilizados, e nos desenhos em anexo, nos quais:

[016] As Fig. 1A-Fig. 1B ilustram fluxos de trabalho exemplares para construção dos modelos diagnósticos (Fig. 1A) e prognósticos (Fig. 1B).

[017] As Fig. 2A-Fig. 2D ilustram análise de metilação de cfDNA para o diagnóstico de LUNC e HCC.

[018] A Fig. 2A mostra curvas de características operacionais do receptor (ROC) e a Área Sob as Curvas (AUCs) associadas do modelo de predição diagnóstica (pontuação-cd) usando análise de metilação de cfÍDNA no coorte de validação.

[019] A Fig. 2B ilustra um diagrama de caixas de pontuações compostas usadas para classificar pacientes normais, com LUNC ou com HCC. A figura representa dados do coorte de validação com pontuações derivadas do classificador multiclasses.

[020] As Figs. 2C-Fig. 2D mostram agrupamento hierárquico não supervisionado de marcadores de metilação metilados diferencialmente entre câncer (HCC e LUNC) e normal (Fig. 2C) e entre HCC e LUNC (Fig. 2D). Cada fileira representa um paciente individual e cada coluna representa um marcador CpG6.

[021] A Fig. 3A-Fig. 3C mostra definição de perfil de metilação em pacientes de controle saudáveis, pacientes de alto risco e com câncer. A Fig. 3A mostra que a definição de perfil de metilação diferencia HCC de pacientes com doença do fígado de alto risco ou controles normais. Doenças do fígado de alto risco foram definidas como hepatite, cirrose hepática e doença gordurosa do fígado. A Fig. 3B mostra que AFP sérica diferencia HCC de pacientes com doença do fígado de alto risco ou controles normais. A Fig. 3C mostra que a definição de perfil de metilação diferencia LUNC de pacientes que fumam e controles normais.

[022] As Fig. 4A-Fig. 4L mostram que a análise de metilação de cfDNA poderia prever a carga tumoral estadiamento e resposta ao tratamento usando uma pontuação diagnóstica composta em pacientes com LUNC e HCC. (Figs. 4A, 4E) pontuação composta da análise de metilação de cfDNA (pontuação-cd) em pacientes com e sem carga tumoral detectável; (Figs. 4B, 4F) pontuação-cd de pacientes com doença em estágio I/II e estágio III/IV; (Figs. 4C, 4G) pontuação-cd em pacientes antes da cirurgia, depois da cirurgia e com recorrência; (Figs. 4D, 4H) pontuação-cd em pacientes antes do tratamento, com resposta ao tratamento e com progressão para piora; (Fig. 41) A curva ROC e a AUC de pontuação-cd e AFP para diagnóstico de HCC no coorte de HCC inteiro; (Fig. 457) AFP em pacientes com HCC em estágio I/II e estágio III/IV; (Fig. 4K) AFP em pacientes com HCC antes da cirurgia, depois da cirurgia e com recorrência; (Fig. 4L) AFP em pacientes com HCC antes do tratamento, com resposta ao tratamento e com progressão para piora. Recorrência foi definida como tumor inicialmente desapareceu após tratamento/cirurgia, mas recidivou após um período definido. Progressão foi definida como piora da doença apesar de tratamento/cirurgia.

[023] As Fig. 5A-Fig. 5F mostram predição prognóstica na sobrevida de HCC e LUNC com base na definição de perfil da metilação de cfDNA. (Fig. 5A) Curvas de sobrevida global de pacientes com LUNC com risco baixo ou alto de morte, de acordo com a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) no coorte de validação. (Fig. 5B) Curvas de sobrevida global de pacientes com HCC com risco baixo ou alto de morte, de acordo com a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) no conjunto de dados de validação. (Fig. 5C) Curvas de sobrevida de pacientes com LUNC com estágio I/II e estágio III/IV no coorte de validação. (Fig. 5D) Curvas de sobrevida de pacientes com HCC em estágio I/II e estágio III/IV no coorte de validação. (Figs. 5E, 5F) A ROC para sobrevida de 12 meses prevista por pontuação-cp, estágio e pontuação-cp combinados com estágio de LUNC (Fig. 5E) e HCC (Fig. 5E) no coorte de validação.

[024] A Fig. 6A mostra agrupamento hierárquico não supervisionado de 1.000 marcadores de metilação principais metilados diferencialmente em DNA em tecidos de HCC e LUNC versus sangue normal.

[025] A Fig. 6B mostra agrupamento hierárquico não supervisionado dos 1.000 marcadores de metilação principais metilados diferencialmente entre DNA de tecido de HCC e LUNC. Cada coluna representa um paciente individual e cada fileira representa um marcador CpG.

[026] As Fig. 7A-Fig. 7B mostram uma região ilustrativa que engloba dois Blocos de Metilação Correlacionada (BCM) em amostras de cfDNA de pacientes com LUNC e HCC e controles normais. A Fig. 7A mostra a vizinhança genômica dos BCM exibida dentro do navegador de genoma UCSC (genoma.ucsc.edu. O rastreamento de correlação de Pearson mostrou dados de correlação por soma de valores r para um marcador dentro de um BCM. Nomes do marcador Cg abaixo do gráfico de correlação de Pearson (cg14999168, cgl4088196, cg25574765) eram marcadores de metilação de TCGA. O nome do gene e SNPs comuns também foram listados. A Fig. 7B mostra uma representação fora de escala de um conjunto de marcadores cg analisados que pertencem a dois BCMs nessa região. Os limites entre blocos são indicados por um retângulo preto, enquanto quadrados vermelhos indicam metilação correlacionada (r>0,5) entre dois marcadores próximos. A correlação entre quaisquer dois marcadores é representada por um quadrado na interseção de linhas perpendiculares (virtuais) que se originam desses dois marcadores. A cor branca indica nenhuma correlação significante. Dez marcadores de metilação recém- identificados no MCB da esquerda ancorados por marcador cgl4999168 ou 11 marcadores de metilação recém-identificados no MCB da direita ancorados por cgl4088196/cg 25574765 eram altamente consistentes e correlacionados entre ctDNA de HCC, CfDNA normal e DNA de tecido de HCC. A utilização de marcadores dentro do mesmo MCB pode aumentar significantemente a precisão da chamada de alelo. Linhas verticais na parte de baixo do painel b eram coordenadas genômicas de limites de dois MCBs.

[027] A Fig. 8A mostra agrupamento hierárquico não supervisionado de 100 marcadores de metilação selecionados para uso no modelo de predição diagnóstica (pontuação-cd) no coorte de validação.

[028] A Fig. 8B mostra uma visão global de agrupamento hierárquico supervisionado de todos os MCBs no conjunto de dados de cfDNA inteiro.

[029] A Fig. 9 mostra diagramas de caixa que mostram o comportamento de 100 MCBs nos coortes de validação. Diagrama superior: valores médios e desvios de MCB nos pacientes saudáveis versus pacientes com HCC ou LUNC; diagrama inferior: valores médios e desvios de MCB em pacientes com LUNC versus HCC.

[030] As Fig. 10A-Fig. 10B mostram valores de metilação correlacionados com resultados finais do tratamento em pacientes com HCC e LUNC com amostras de plasma seriais. A Fig. 10A mostra gráficos sumários de alteração no valor de metilação que comparam pacientes depois da cirurgia, com resposta clínica (Remissão Parcial (PR) ou Doença Estável (SD), ou com progressão/doença recorrente (PD). A Fig. 10B mostra tendências do valor de metilação em pacientes individuais após ressecção cirúrgica completa, com resposta ao tratamento e com progressão da doença. Taxa de metilação delta representa o valor da diferença de metilação antes do tratamento e após tratamento. PRÉ: pré-tratamento; PÓS: após tratamento.

[031] À Fig. 11A mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento usando os números de cópia de metilação total de um MCB em pacientes com LUNC.

[032] A Fig. 11B mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento com o valor de metilação de um MCB em pacientes com LUNC. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; quimio, quimioterapia.

[033] A Fig. 12A mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento usando os números de cópia de metilação total de um MCB e AFP em pacientes com HCC.

[034] À Fig. 12B mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento com a taxa de metilação de um MCB em pacientes com HCC. Datas de tratamentos são indicadas na figura. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; quimio, quimioterapia, TACE, quimioembolização arterial transcateter.

[035] À Fig. 13 ilustra um fluxo de trabalho para construção dos modelos diagnósticos e prognósticos. Dados de metilação do genoma completo em HCC, LUNC e sangue normal foram usados para identificar marcadores candidatos para o design de sondas. Painel da esquerda: seleção de marcador diagnóstico: análise LASSO foi aplicada a um coorte de treinamento de 444 pacientes com HCC, 299 pacientes com LUNC e 1.123 pacientes normais para identificar uma seleção final de 77 marcadores. Esses 77 marcadores foram aplicados a um coorte de validação de 445 pacientes com HCC, 300 pacientes com LUNC e 1.124 pacientes normais. Painel da direita: marcador prognóstico seleção: LASSO-Cox foram aplicados a um coorte de treinamento de 433 pacientes com HCC e 299 pacientes com LUNC com dados de sobrevida para identificar uma seleção final de 20 marcadores. Esses 20 marcadores foram aplicados a um coorte de validação de 434 HCC e 300 LUNC com dados de sobrevida

[036] A Fig. 14A-Fig. 14D ilustra análise de metilação de cfDNA para o diagnóstico de LUNC e HCC. (Fig. 14A) Curvas de características operacionais do receptor (ROC) e a Área Sob as Curvas (AUCsS) associadas do modelo de predição diagnóstica (pontuação-cd) usando análise de metilação de CÍDNA no coorte de validação. (Fig. 14B) Diagrama de caixas de pontuações compostas usadas para classificar pacientes normais e com câncer (esquerda), e pacientes com LUNC e HCC (direita). (Fig. 14C-Fig. 14D) Agrupamento hierárquico não supervisionado de marcadores de metilação metilados diferencialmente entre câncer (HCC e LUNC) e normal (Fig. 14C) e entre HCC e LUNC (Fig. 14D). Cada fileira representa um paciente individual e cada coluna representa um marcador de MCB.

[037] A Fig. 15A-Fig. 15D ilustra a definição de perfil de metilação em pacientes de controle saudáveis, pacientes de alto risco e com câncer. (Fig. 15A) definição de perfil de metilação diferencia HCC de pacientes com doença do fígado de alto risco ou controles normais. Doenças do fígado de alto risco foram definidas como hepatite, cirrose hepática e doença gordurosa do fígado. (Fig. 15B) AFP sérica diferencia HCC de pacientes com doença do fígado de alto risco ou controles normais. (Fig. 15C) definição de perfil de metilação diferencia LUNC de pacientes que fumam e controles normais. (Fig. 15D) CEA sérica diferencia pacientes com LUNC de pacientes de alto risco (tabagismo).

[038] A Fig. 16A-Fig. 16R ilustra que a análise de metilação de CfDNA poderia prever carga tumoral, estadiamento e resposta ao tratamento usando uma pontuação diagnóstica composta em pacientes com LUNC e HCC. A pontuação-cd em pacientes com e sem carga tumoral detectável em pacientes com LUNC (Fig. 16A), quando comparada em pacientes com CEA (Fig. 161) e em pacientes com HCC (Fig. 16E), quando comparada com AFP (Fig. 16M); pontuação-cd de pacientes com doença em estágio I/II e estágio III/IV em pacientes com LUNC (Fig. 16B), quando comparada com CEA (Fig. 16JI) e em pacientes com HCC (Fig. 16F), quando comparada com AFP (Fig. 16N); pontuação-cd em pacientes antes de intervenção, depois da cirurgia e com recorrência em pacientes com LUNC (Fig. 16C), quando comparada com CEA (Fig. 16K) e em pacientes com HCC (Fig. 16G), quando comparada com AFP (Fig. 160); pontuação-cd em pacientes antes de intervenção, com resposta ao tratamento e com progressão para piora em pacientes com LUNC (Fig. 16D), quando comparada com CEA (Fig. 16L) e em pacientes com HCC (Fig. 16H), quando comparada com AFP (Fig. 16P); (Fig. 16Q) A curva ROC e a AUC de pontuação-cd e AFP para diagnóstico de LUNC em todo o coorte de LUNC. (Fig. 16R) A curva ROC e a AUC de pontuação- cd e AFP para diagnóstico de HCC no coorte de HCC inteiro.

[039] A Fig. 17A-Fig. 17F ilustra a predição prognóstica na sobrevida de HCC e LUNC com base na definição de perfil da metilação de cÍDNA. Curvas de sobrevida global de pacientes com HCC com risco baixo ou alto de morte, de acordo com a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) no coorte de validação (Fig. 17A). Curvas de sobrevida global de pacientes com LUNC com risco baixo ou alto de morte, de acordo com a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) no conjunto de dados de validação (Fig. 17B). Curvas de sobrevida de pacientes com HCC com estágio I/II e estágio

III/IV no coorte de validação (Fig. 17C). Curvas de sobrevida de pacientes com estágio I/II e estágio III/IV LUNC no coorte de validação (Fig. 17D). As Fig. 17E e Fig. 17F ilustram a ROC para sobrevida de 12 meses prevista por pontuação-cp, CEA, AFP, estágio e pontuação-cp combinados com estágio de HCC (Fig. 17E) e LUNC (Fig. 17F) no coorte de validação.

[040] À Fig. 18A-Fig. 18B ilustra detecção de LUNC precoce usando um painel de metilação de cfDNA. Duzentos e oito pacientes fumantes foram arrolados com nódulos no pulmão entre 10 mm e 30 mm de tamanho em um experimento prospectivo e medido um painel de metilação de cfDNA LUNC. Os pacientes foram divididos em um coorte de treinamento e um coorte de teste (Fig. 18A); curvas de características operacionais do receptor (ROC) e a Área Sob as Curvas (AUCs) associadas da predição de LUNC Estágio I versus nódulos benignos no pulmão no coorte de validação com 91,4% de precisão (Fig. 18B); tabela que mostra resultados de predição entre LUNC Estágio I versus nódulos benignos no pulmão mostrando sensibilidade e especificidade elevadas no coorte de validação (Fig. 18C).

[041] À Fig. 19A-Fig. 19D ilustra que marcadores de metilação podem diferenciar entre HCC e cirrose hepática e detectar a progressão de cirrose hepática para HCC. Um modelo de predição foi construído usando 217 pacientes com HCC e 241 pacientes com cirrose e os pacientes divididos em um coorte de treinamento e um coorte de teste (Fig. 19A); Curvas de características operacionais do receptor (ROC) e a Área Sob as Curvas (AUCs) associadas da predição de HCC em Estágio I versus cirrose hepática no coorte de validação com 89,9% de precisão (Fig. 19B); tabela que mostra resultados de predição entre HCC em Estágio I e cirrose hepática em um coorte de validação (Fig. 19C); tabela que mostra resultados de predição na progressão de cirrose hepática para HCC em Estágio I com sensibilidade (89,5%) e especificidade (98% elevadas (Fig. 19D).

[042] À Fig. 20A ilustra o agrupamento hierárquico não supervisionado de 1.000 marcadores de metilação principais metilados diferencialmente em DNA em tecidos primários de HCC e LUNC versus sangue normal.

[043] À Fig. 20B mostra o agrupamento hierárquico não supervisionado dos 1.000 marcadores de metilação principais metilados diferencialmente entre DNA de tecido de HCC e LUNC. Cada coluna representa um paciente individual e cada fileira representa um marcador CpG.

[044] À Fig. 20C ilustra uma visão global do agrupamento hierárquico supervisionado de todos os 888 MCBs no conjunto de dados de cfDNA inteiro.

[045] A Fig. 21 ilustra diagramas de caixas que mostram as características de MCBs em coortes. Diagrama superior: Valores médios e desvios de MCBs de Lasso em cada um versus comparação de repouso.

[046] À Fig. 22 ilustra valores de metilação correlacionados com resultados finais do tratamento em pacientes com HCC e LUNC com amostras de plasma seriais Gráficos sumários de alteração no valor de metilação que comparam pacientes depois da cirurgia, com resposta clínica (Remissão Parcial (PR) ou Doença Estável (SD), ou com progressão/doença recorrente (PD).

[047] À Fig. 23A mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento usando os números de cópia de metilação total de um MCB em pacientes com LUNC.

[048] À Fig. 23B mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento com o valor de metilação de um MCB em pacientes com LUNC. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; quimio, quimioterapia.

[049] A Fig. 24 ilustra monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento usando os números de cópia de metilação total de um MCB e CEA em pacientes com HCC.

[050] A Fig. 25 mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento com a taxa de metilação de um MCB em pacientes com HCC. Datas de tratamentos são indicadas na figura. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; quimio, quimioterapia, TACE, quimioembolização arterial transcateter.

[051] A Fig. 26 ilustra um gráfico de fluxo de trabalho exemplar da geração e análise de dados descritas nesse relatório descritivo.

[052] A Fig. 27A-Fig. 27H ilustra a análise de metilação de cfDNA para o diagnóstico de HCC. A Fig. 27A mostra um mapa de calor da metilação de 28 pares de DNA tumoral e cfDNA no plasma de HCC compatíveis, com um limiar do valor de metilação médio de 0,1 como um valor de corte. A Fig. 27B mostra os valores de metilação e desvios-padrões de dez marcadores diagnósticos em sangue normal, DNA tumoral de HCC e cfDNA de paciente com HCC. A Fig. 27C mostra a tabela de confusão de resultados binários do modelo de predição diagnóstica no conjunto de dados de treinamento e a Fig. 27D mostra a tabela de confusão de resultados binários do modelo de predição diagnóstica no conjunto de dados de validação. As Fig. 27E e Fig. 27F mostram ROC do modelo de predição diagnóstica com marcadores de metilação nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 27E) e de validação (Fig. 27F) As Fig. 27G e Fig. 27H mostram o agrupamento hierárquico não supervisionado de dez marcadores de metilação selecionados para uso no modelo de predição diagnóstica nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 27G) e de validação (Fig. 27H).

[053] A Fig. 28A-Fig. 28K mostra análise de metilação de CÍDNA e carga tumoral, resposta ao tratamento e estadiamento. As Fig. 28A e Fig. 28B mostram a pontuação diagnóstica combinada (pontuação-cd) (Fig. 28A) e AFP (Fig. 28B) em controles saudáveis, indivíduos com doenças do fígado (infecção por HBV/HCV, cirrose e fígado gorduroso) e pacientes com HCC. A Fig. 28C mostra a pontuação-cd em controles normais e pacientes com HCC com e sem carga tumoral detectável. A Fig. 28D mostra a pontuação-cd em controles normais, pacientes com HCC antes do tratamento, com resposta ao tratamento e com progressão. A Fig. 28E mostra a pontuação-cd em controles normais e pacientes com HCC antes da cirurgia, depois da cirurgia e com recorrência. A Fig. 28F mostra a pontuação-cd em controles normais e pacientes com HCC de estágio I-IV. A Fig. 28G ilustra a ROC de pontuação-cd e AFP para diagnóstico de HCC no coorte de HCC inteiro. As Fig. 28H e Fig. 28I mostram a pontuação-cd (Fig. 28H) e AFP (Fig. 281) em pacientes com HCC com diagnóstico inicial (antes da cirurgia ou outro tratamento), com resposta ao tratamento, com progressão e com recorrência. As Fig. 28J e Fig. 28K mostram a pontuação-cd (Fig. 28I) e AFP (Fig. 28K) em pacientes com HCC de estágios I-IV.

[054] As Fig. 29A-Fig. 29G mostram a análise de metilação de cfDNA para predição prognóstica da sobrevida de HCC. As Fig. 29A e Fig. 29B mostram as curvas de sobrevida global de pacientes com HCC com risco baixo ou alto de morte em 6 meses, de acordo com a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 29A) e de validação (Fig. 29B). As Fig. 29C e Fig. 29D mostram as curvas de sobrevida de pacientes com HCC com estágio I/II e estágio III/IV nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 29C) e de validação (Fig. 29D). A Fig. 29E e a Fig. 29F mostram a ROC para a pontuação-cp, estágio e pontuação-cp combinados com estágio nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 29E) e de validação (Fig. 29F). A Fig. 29G mostra as curvas de sobrevida de pacientes com HCC com combinações de risco e estágio da pontuação-cp no coorte de HCC inteiro.

[055] A Fig. 30 ilustra um agrupamento hierárquico não supervisionado de 1.000 marcadores de metilação principais metilados diferencialmente entre DNA tumoral de HCC e sangue normal. Cada coluna representa um paciente individual e cada fileira representa um marcador CpG.

[056] As Fig. 31A-Fig. 31B ilustram uma região exemplar que engloba dois Blocos de Metilação Correlacionada (BCM) em amostras de cfDNA de HCC e controles normais. A Fig. 31A mostra uma vizinhança genômica dos BCM exibida dentro do navegador de genoma UCSC (O rastreamento de correlação de Pearson mostrou dados de correlação por soma de valores r para um marcador dentro de um BCM. Nomes do marcador Cg abaixo do gráfico de correlação de Pearson (cgl4999168, cgl4088196, cg25574765) eram marcadores de metilação de TCGA. O nome do gene e SNPs comuns também foram listados. A Fig. 31B mostra uma representação fora de escala de um conjunto de marcadores cg analisados que pertencem a dois

BCMs nessa região. Os limites entre blocos são indicados por um retângulo preto, enquanto quadrados vermelhos indicam metilação correlacionada (r>0,5) entre dois marcadores próximos. A correlação entre quaisquer dois marcadores é representada por um quadrado na interseção de linhas perpendiculares (virtuais) que se originam desses dois marcadores. A cor branca indica nenhuma correlação significante. Dez marcadores de metilação recém- identificados no MCB da esquerda ancorados por marcador cgl4999168 ou 11 marcadores de metilação recém-identificados no MCB da direita ancorados por cgl4088196/cg 25574765 eram altamente consistentes e correlacionados entre ctDNA de HCC, CfDNA normal e DNA de tecido de HCC. A utilização de marcadores dentro do mesmo MCB pode aumentar significantemente a precisão da chamada de alelo. Linhas verticais na parte de baixo do painel b eram coordenadas genômicas de limites de dois MCBs.

[057] As Fig. 32A-Fig. 32B mostram valores de metilação correlacionados com resultados finais do tratamento em pacientes com HCC com amostras de plasma seriais. A Fig. 32A mostra a alteração na pontuação-cd que compara pacientes depois da cirurgia, com resposta clínica, e com progressão da doença (*** p<0,001). A Fig. 32B mostra tendências da pontuação-cd em pacientes individuais após ressecção cirúrgica completa com resposta ao tratamento e com progressão da doença. PRÉ: pré-tratamento; PÓS: após tratamento.

[058] À Fig. 33 ilustra um monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento em pacientes individuais com pontuação-cd e AFP. Datas de tratamentos são indicadas por setas azuis verticais. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; TACE, quimioembolização arterial transcateter.

[059] As Fig. 34A-Fig. 34B ilustram a análise de metilação de cfDNA de diagnóstico de HCC. A Fig. 34A mostra mapa de calor de metilação de 28 pares de DNA tumoral e cfDNA no plasma de HCC compatíveis, com um limiar do valor de metilação médio de 0,1 como um valor de corte. A Fig. 34B mostra os valores de metilação e desvios-padrões de dez marcadores diagnósticos em plasma normal, DNA tumoral de HCC e cfDNA de paciente com HCC.

[060] A Fig. 35 ilustra o agrupamento hierárquico de 10 marcadores diagnósticos em DNA em tecido de HCC de TCGA, DNA em tecido de HCC de Chinês, ctDNA de HCC e cfDNA no plasma normal. Cada coluna representa um paciente individual e cada fileira representa um marcador CpG. O agrupamento dentro de grupos mostra que os valores-beta seguem um gradiente entre tecido de HCC primário e cfDNA normal, com cfDNA tumoral exibindo valores-beta intermediários. cfDNA de amostras com tumores em estágio superior possuem valores-beta que se aproximam de amostras de tecido de HCC primário.

[061] A Fig. 36 mostra o monitoramento dinâmico de resultados finais do tratamento em pacientes individuais com valores compostos de metilação e AFP. Datas de tratamentos são indicadas por setas azuis verticais. PD, doença progressiva; PR, resposta parcial; SD, doença estável; TACE, quimioembolização arterial transcateter.

[062] As Fig. 37A-Fig. 37B mostram o estágio de TNM para sobrevida de HCC por predição prognóstica, Curvas de sobrevida de pacientes com HCC com estágio I/II e estágio

III/IV nos conjuntos de dados de treinamento (Fig. 37A) e de validação (Fig. 37B).

[063] As Fig. 38A-Fig. 38C mostram um experimento de misturação para medir frações de cfDNA de DNA genômico de tecido tumoral (gDNA). A Fig. 38A mostra resultados de PCR digital (ddPCR). Painel superior, cada ponto azul representa uma única reação de PCR e uma molécula de DNA metilada. Painel inferior, cada ponto verde representa uma única reação de PCR e uma molécula de DNA não metilada. AO0l a AO8 representavam um experimento de misturação (AO0l, 100% de CfDNA normal, 0% de gDNA de HCC; A02, 90% de cfDNA normal, 10% de gDNA de HCC; AO04, 70% de cfDNA normal, 30% de gDNA de HCC; AO07, 40% de cfDNA normal, 60% de gDNA de HCC; AO08, 0% de cfDNA normal, 100% de gDNA de HCC. Veja b e c para um resumo dos resultados. A Fig. 38B mostra resultados do experimento de misturação com fração diferente de cfDNA normal e HCC (gDNA). A Fig. 38C mostra uma ilustração de valores de metilação finais de cfDNA de HCC como um produto da misturação cfDNA normal e gDNA de HCC puro (ca gDNA). Cada linha vertical representa um experimento de misturação (da esquerda para a direita, A0l1, AO02, AO4, AO07, AO08). Pontos e barras verdes que correspondem ao eixo Y da esquerda (Chl) representam valores médios e erro-padrão (S.E.) de valores não metilados; Pontos e barras azuis que correspondem ao eixo Y da direita (Ch2) representam valores médios e S.E. de valores metilados. O eixo X representa concentrações variáveis de cfDNA normal e gDNA de HCC (veja a Fig. 38A para detalhes).

[064] As Fig. 39A-Fig. 39C mostram medições de concentrações de cfDNA em amostras de plasma normal e de

HCC. A Fig. 39A mostra 11 t+ 4,7 ng de cfDNA por 1 ml de plasma normal e 22 t 7,7 ng de cfDNA por 1 ml de plasma de HCC. Os foram exibidos como média + desvio-padrão (X t SD). P<0,001 (teste-t de Student). A Fig. 39B ilustra um gráfico que demonstra um relacionamento linear entre a quantidade de DNA e os números de cópia totais por PCR digital de gotícula (metilado mais não metilado) (P<0,001). A Fig. 39C mostra uma comparação de rendimentos de cfDNA por diferentes kits de extração comerciais. Os kits de Elitehealth e Qiagen geraram rendimentos superiores e comparáveis (Nenhuma diferença significante no rendimento entre Elitehealth e Qiagen, P>0,05; houve uma diferença significante no rendimento entre EliteHealth versus Thermo Fisher, P<0,05, ou entre Qiagen versus Thermo Fisher, P<0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[065] O câncer é caracterizado por um crescimento anormal de uma célula causado por uma ou mais mutações Ou modificações de um gene que levam a um equilíbrio desregulado da proliferação celular e morte celular. A metilação de DNA silencia a expressão de genes de supressão tumoral, e se apresenta, ela própria, como uma das primeiras alterações neoplásicas. Os padrões de metilação encontrados em tecido e plasma neoplásicos demonstram homogeneidade e, em alguns casos, são utilizados como um marcador diagnóstico sensível. Por exemplo, o ensaio cMethDNA demonstrou, em um estudo, ser cerca de 91% sensível e cerca de 96% específico quando usado para diagnosticar câncer de mama metastático. Em outro estudo, o DNA tumoral circulante (ctDNA) foi cerca de 87,2% sensível e cerca de 99,2% específico quando era usado para identificar mutação do gene KRAS em um grande coorte de pacientes com câncer do cólon metastático (Bettegowda e cols., “Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies”. Sci. Transl. Med., 6 (224): ra24. 2014). O mesmo estudo ainda demonstrou que ctDNA é detectável em > 75% de pacientes com cânceres pancreáticos, ovarianos, cólon-retais, da bexiga, gastroesofágicos, de mama, melanoma, hepatocelulares e de cabeça e pescoço avançados (Bettegowda e cols.).

[066] Estudos adicionais demonstraram que o padrão de metilação de CpG se correlaciona com progressão neoplásica. Por exemplo, em um estudo de padrões de metilação no câncer de mama, foi verificado que a hipermetilação de Pl6 se correlaciona com câncer de mama em estágio inicial, enquanto a hipermetilação do promotor de TIMP3 foi correlacionada com câncer de mama em estágio tardio. Além disso, foi demonstrado que a hipermetilação do promotor de BMP6, CST6 e TIMP3 se associa com metástase em linfonodos no câncer de mama.

[067] Em algumas modalidades, a definição de perfil de metilação de DNA fornece sensibilidade clínica e faixa dinâmica maiores, comparada com análise de mutação somática para detecção do câncer. Em outros casos, foi demonstrado que a assinatura de metilação de DNA alterada se correlaciona com o prognóstico de resposta ao tratamento para certos cânceres. Por exemplo, um estudo ilustrou que, em um grupo de pacientes com câncer retal avançado, dez regiões diferencialmente metiladas foram usadas para prever o prognóstico de pacientes. Da mesma forma, a medição da metilação de DNA de RASSFI1A no soro foi usada para prever um resultado final pobre em pacientes submetidos à terapia adjuvante nos pacientes com câncer de mama em um estudo diferente. Além disso, a hipermetilação do gene SRBC foi associada com resultado final pobre em pacientes com câncer cólon-retal tratados com oxaliplatina em um estudo diferente. Outro estudo demonstrou que a metilação do gene ESR1l se correlaciona com a resposta clínica nos pacientes com câncer de mama que recebem tamoxifeno. Adicionalmente, foi demonstrado que a hipermetilação do promotor do gene ARHI é um previsor de sobrevida de longo prazo nos pacientes com câncer de mama não tratados com tamoxifeno.

[068] Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos e kits de diagnóstico de câncer de pulmão e carcinoma hepatocelular (HCC) com base na definição do perfil de metilação de DNA. Em alguns casos, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos e kits para a distinção entre câncer de pulmão e HCC com base na definição do perfil de metilação de DNA. Em outros casos, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos e kits de identificação de um indivíduo como tendo câncer de pulmão ou HCC com base na definição do perfil de metilação de DNA. Em casos adicionais, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos e kits de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui câncer de pulmão ou HCC e determinação da progressão de câncer de pulmão ou HCC em um indivíduo com base na definição do perfil de metilação de DNAs.

Métodos de uso Métodos de diagnóstico de um indivíduo

[069] São revelados nesse relatório descritivo, em certas modalidades, métodos de diagnóstico de carcinoma hepatocelular (HCC) e seleção de indivíduos suspeitos de terem câncer hepático para tratamento. Em alguns casos, os métodos compreendem a utilização de um ou mais biomarcadores descritos nesse relatório descritivo. Em alguns casos, um biomarcador compreende um sítio de metilação de citosina. Em alguns casos, a metilação de citosina compreende 5- metilcitosina (5-mCyt) e 5-hidroximetilcitosina. Em alguns casos, um sítio de metilação de citosina ocorre em um motivo de dinucleotídeo CpG. Em outros casos, um sítio de metilação de citosina ocorre em um motivo CHG ou CHH, no qual H é adenina, citosina ou timina. Em alguns casos, um ou mais motivos de sítio de dinucleotídeo CpG ou CpG forma uma ilha CpG, uma sequência de DNA curta rica em dinucleotídeo CpG. Em alguns casos, ilhas CpG têm tipicamente, mas nem sempre, entre cerca de 0,2 até cerca de 1 kb de comprimento. Em alguns casos, um biomarcador compreende uma ilha CpG.

[070] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) ou câncer de pulmão para tratamento, que compreende (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado das Tabelas 2, 6, 7, 9 ou 10 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC ou câncer de pulmão; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC ou câncer de pulmão; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC ou câncer de pulmão.

[071] Em algumas modalidades, um ou mais genes em um painel de genes descrito nesse relatório descritivo ainda compreendem um bloco de metilação correlacionada (MCB). Em alguns casos, um MCB compreende cerca de 2 até cerca de 30, cerca de 2 até cerca de 25, cerca de 2 até cerca de 20, cerca de 2 até cerca de 15, cerca de 2 até cerca de 10, cerca de 2 até cerca de 8 ou cerca de 2 até cerca de 5 genes. Em alguns casos, um MCB compreende cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, ou mais genes.

[072] Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados das Tabelas 2, 3, 6, 7, 9 ou 10. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela

2. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela 3. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela 6. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela 7. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela 9. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados da Tabela 10.

[073] Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados de SOCS2, EPSTII1, TIAl, Cromossomo 4, Cromossomo 6, ZNF323, FOXP4, GRHL2, NPBWR1l, Cromossomo 2, AAK1I, SIMI, ClOorf46, Cl7orfl0l, DEPDC5, ZNF323, GABRAZ, PLAC8 e ADRAZB. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados de SOCS2, EPSTIl, TIAl, Cromossomo 4, Cromossomo 6, ZNF323, FOXP4 e GRHL2. Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados de NPBWRI1, Cromossomo 2, AAKI, SIMI, Cl0orf46, Cl7orflO0l, DEPDCS5,

ZNF323, GABRA2Z, PLAC8 e ADRAZB. Em alguns casos, MCB compreende SOCS2. Em alguns casos, MCB compreende EPSTI1. Em alguns casos, MCB compreende TIAl. Em alguns casos, MCB compreende Cromossomo 4. Em alguns casos, MCB compreende Cromossomo 6. Em alguns casos, MCB compreende ZNF323. Em alguns casos, MCB compreende FOXP4. Em alguns casos, MCB compreende NPBWR1. Em alguns casos, MCB compreende GRHL2. Em alguns casos, MCB compreende Cromossomo 2. Em alguns casos, MCB compreende AAKl. Em alguns casos, MCB compreende SIMI1. Em alguns casos, MCB compreende ClO0orf46. Em alguns casos, MCB compreende Cl7o0rfl01. Em alguns casos, MCB compreende DEPDC5. Em alguns casos, MCB compreende ZNF323. Em alguns casos, MCB compreende GABRA2. Em alguns casos, MCB compreende PLAC8. Em alguns casos, MCB compreende ADRAZB.

[074] En alguns casos, o método ainda compreende o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e a análise do produto amplificado adicional para gerar um perfil de metilação do gene adicional determinando, dessa forma, a presença de HCC ou câncer de pulmão no indivíduo.

[075] Em alguns casos, a amostra biológica é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[076] Em alguns casos, o modelo compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra HCC-positiva ou uma amostra positiva para câncer de pulmão. Em alguns casos, a amostra HCC-positiva compreende células de um HCC metastático. Em alguns casos, a amostra positiva para câncer de pulmão compreende células de câncer de pulmão metastático.

[077] Em alguns casos, o modelo ainda compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra normal.

[078] Em alguns casos, o modelo é desenvolvido com base nos perfis de metilação de biomarcadores das Tabelas 3, 6 ou

7.

[079] Em alguns casos, o modelo é desenvolvido com base nos perfis de metilação de biomarcadores das Tabelas 9 ou

10.

[080] Em alguns casos, o modelo é desenvolvido usando um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[081] En alguns casos, o método ainda compreende a distinção entre HCC e câncer de pulmão.

[082] O carcinoma hepatocelular (HC ou hepatoma maligno), em alguns casos, é o tipo mais comum de câncer hepático. Em alguns casos, HCC é o resultado de uma infecção por hepatite viral (por exemplo, por Hepatite B ou C), toxinas metabólicas (por exemplo, álcool ou aflatoxina), doença gordurosa não alcoólica do fígado (NASH), hemocromatose ou deficiência de alfa-l-antitripsina.

[083] Em algumas modalidades, o HCC é ainda classificado por estadiamento. Em alguns casos, o estadiamento leva em conta o tamanho do tumor, o número de tumores, a presença de invasão vascular e disseminação extra-hepática, função hepática (níveis de bilirrubina e albumina séricas, presença de ascite e hipertensão portal) e a saúde do paciente. Em alguns casos, o estadiamento é a Classificação de Estadiamento Clínico de Câncer hepático de Barcelona (BCLC). Em alguns casos, o estadiamento de HCC compreende Estágio 1, Estágio II, Estágio III e Estágio IV.

[084] Em alguns casos, um ou mais marcadores descritos nesse relatório descritivo são utilizados para diagnosticar um indivíduo como tendo HCC. Em alguns casos, HCC é um HCC metastizado. Em alguns casos, um ou mais marcadores descritos nesse relatório descritivo são utilizados para distinguir entre HCC e câncer de pulmão em um indivíduo.

[085] Em algumas modalidades, um câncer de pulmão é qualquer tipo de câncer de pulmão. Em alguns casos, um câncer de pulmão compreende câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer de pulmão de pequena célula (SCLC) carcinóides brônquicos ou mesotelioma. Em alguns casos, câncer de pulmão de célula não pequena compreende adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula grande ou tumores neuroendócrinos de célula grande. Em alguns casos, o câncer de pulmão é um câncer de pulmão metastizado. Em outros casos, o câncer de pulmão é um câncer de pulmão recidivado ou refratário.

[086] Em algumas modalidades, uma sonda compreende uma sonda de DNA, sonda de RNA, ou uma combinação destas. Em alguns casos, uma sonda compreende moléculas de ácido nucleico naturais e moléculas de ácido nucleico não naturais. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda marcada como, por exemplo, sonda marcada de forma fluorescente ou sonda marcada radioativamente. Em alguns casos, uma sonda se correlaciona com um sítio CpG. Em alguns casos, uma sonda é utilizada em uma reação de sequenciamento de próxima geração para gerar dados de metilação de um CpG. Em casos adicionais, uma sonda é usada em uma reação de sequenciamento de próxima geração à base de solução para gerar dados de metilação de um CpG. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda de farol molecular, uma sonda TaqgMan, sonda de ácido nucleico bloqueado, uma sonda-cadeado ou sonda Scorpion. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda-cadeado.

[087] Em alguns casos, o tratamento compreende quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia.

[088] Em alguns casos, o tratamento compreende um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada. Em alguns casos, o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes. Em alguns casos, o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib, um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

[089] Em algumas modalidades, o tratamento compreende cirurgia. Em alguns casos, cirurgia compreende ressecção curativa. Em outros casos, cirurgia compreende transplante de fígado.

[090] Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende uma amostra de sangue.

[091] Em alguns casos, a amostra biológica compreende uma amostra de biópsia de tecido.

[092] Em alguns casos, a amostra biológica compreende células tumorais circulantes.

[093] Em alguns casos, o indivíduo é um humano.

Painel de genes de HCC

[094] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) para tratamento, que compreende: (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em gene selecionado de um painel de genes que consiste em receptor de proteína morfogenética óssea tipo 1A (BMPRIA), Homologia de Plecstrina e proteína contendo domínio SEC7 1 (PSD), proteína de ativação de Rho GTPase 25 (ARHGAP25), fator Kruppel-like 3 (KLF3), específicos da placenta 8 (PLAC8), ataxina 1 (ATXN1), Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, proteína contendo domínio AAA 2 (ATAD2) da família de ATPase e Cromossomo 8:20 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC.

[095] Em algumas modalidades, também é revelado nesse relatório descritivo um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) para tratamento, que compreende: (a) contato do DNA tratado com diversas sondas para gerar produtos amplificados, em que cada sonda hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20, e cada sonda é diferente, e em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise dos produtos amplificados para gerar um perfil de metilação dos genes do painel de genes; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC.

[096] Em “modalidades adicionais, é revelado nesse relatório “descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIl, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMS8B do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[097] En modalidades adicionais, é revelado nesse relatório descritivo um método de detecção do estado de metilação de um ou mais genes de um painel de genes em um indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; e (b) detecção do estado de metilação em um gene selecionado do painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXNI1, Cromossomo .6:170 Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 por contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo do gene para gerar um produto amplificado; e análise do produto amplificado para determinar o estado de metilação do gene.

[098] Em algumas modalidades, um ou mais genes no painel de genes ainda compreende um bloco de metilação correlacionada (MCB). Em alguns casos, um MCB compreende cerca de 2 até cerca de 30, cerca de 2 até cerca de 25, cerca de 2 até cerca de 20, cerca de 2 até cerca de 15, cerca de 2 até cerca de 10, cerca de 2 até cerca de 8 ou cerca de 2 até cerca de 5 genes. Em alguns casos, um MCB compreende cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, ou mais genes.

[099] Em alguns casos, MCB compreende um ou mais genes selecionados de BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXNI, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2, Cromossomo 8:20, SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIl, Cromossomo 17:78, SERPINB5

NOTCH3, GRHL2 e TMEM8B. Em alguns casos, um MCB compreende um ou mais genes selecionados de BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1l, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20. Em alguns casos, um MCB compreende um ou mais genes selecionados de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIl, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMS8B. Em alguns casos, um MCB compreende BMPRIA. Em alguns casos, um MCB compreende PSD. Em alguns casos, um MCB compreende KLF3. Em alguns casos, um MCB compreende PLAC8. Em alguns casos, um MCB compreende ATXNl. Em alguns casos, um MCB compreende Cromossomo 6:170. Em alguns casos, um MCB compreende Cromossomo 6:3. Em alguns casos, um MCB compreende ATAD2. Em alguns casos, um MCB compreende Cromossomo 8:20. Em alguns casos, um MCB compreende SH3PXD2A. Em alguns casos, um MCB compreende Cllorf9. Em alguns casos, um MCB compreende PPFIAI. Em alguns casos, um MCB compreende Cromossomo 17:78. Em alguns casos, um MCB compreende ARHGAP25. Em alguns casos um MCB compreende SERPINBS. Em alguns casos, um MCB compreende NOTCH3. Em alguns casos, um MCB compreende GRHL2. Em alguns casos, um MCB compreende TMEMSB.

[100] En alguns casos, o método ainda compreende o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e uma análise do produto amplificado adicional para gerar um perfil de metilação do gene adicional determinando, dessa forma, a presença de HCC no indivíduo.

[101] Em alguns casos, a amostra biológica é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[102] En alguns casos, o modelo compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra HCC-positiva. Em alguns casos, a amostra HCC-positiva compreende células de um HCC metastático.

[103] Em alguns casos, o modelo ainda compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra normal.

[104] Em alguns casos, o modelo é desenvolvido com base nos perfis de metilação de biomarcadores da Tabela 15 ou da Tabela 16.

[105] Em alguns casos, o modelo é desenvolvido usando um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[106] O carcinoma hepatocelular (HCC ou hepatoma maligno), em alguns casos, é o tipo mais comum de câncer hepático. Em alguns casos, HCC é o resultado de uma infecção por hepatite viral (por exemplo, por Hepatite B ou C), toxinas metabólicas (por exemplo, álcool ou aflatoxina), doença gordurosa não alcoólica do fígado (NASH), hemocromatose ou deficiência de alfa-l-antitripsina.

[107] Em algumas modalidades, o HCC é ainda classificado por estadiamento. Em alguns casos, o estadiamento leva em conta o tamanho do tumor, o número de tumores, a presença de invasão vascular e disseminação extra-hepática, função hepática (níveis de bilirrubina e albumina séricas, presença de ascite e hipertensão portal) e a saúde do paciente. Em alguns casos, o estadiamento é a Classificação de Estadiamento Clínico de Câncer hepático de Barcelona (BCLC).

Em alguns casos, o estadiamento de HCC compreende Estágio 1, Estágio II, Estágio III e Estágio IV.

[108] Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores descritos nesse relatório descritivo distinguem HCC de outro tipo de câncer hepático. Em alguns casos, outro tipo de câncer hepático compreende cirrose hepática ou esteatose hepática (ou doença gordurosa do fígado).

[109] Em algumas modalidades, uma sonda compreende uma sonda de DNA, sonda de RNA, ou uma combinação destas. Em alguns casos, uma sonda compreende moléculas de ácido nucleico naturais e moléculas de ácido nucleico não naturais. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda marcada como, por exemplo, sonda marcada de forma fluorescente ou sonda marcada radioativamente. Em alguns casos, uma sonda se correlaciona com um sítio CpG. Em alguns casos, uma sonda é utilizada em uma reação de sequenciamento de próxima geração para gerar dados de metilação de um CpG. Em casos adicionais, uma sonda é usada em uma reação de sequenciamento de próxima geração à base de solução para gerar dados de metilação de um CpG. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda de farol molecular, uma sonda TaqgMan, sonda de ácido nucleico bloqueado, uma sonda-cadeado, ou sonda Scorpion. Em alguns casos, uma sonda compreende uma sonda-cadeado. Em alguns casos, a sonda é uma sonda-cadeado.

[110] Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-18. Em alguns casos,

a sonda compreende cerca de 90% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 91% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 92% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 93% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 94% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 95% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 96% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 97% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 98% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-18.

[111] Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 90% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 91% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 92% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 93% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 94% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 95% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºsº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 96% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 97% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 98% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 1-10. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10.

[112] Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 90% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 91% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS.

DE SEQ. Nºº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 92% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 93% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 94% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 95% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 96% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 97% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 98% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18. Em alguns casos, a sonda compreende cerca de 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18.

[113] Em alguns casos, o tratamento compreende quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia.

[114] Em alguns casos, o tratamento compreende um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada. Em alguns casos, o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes. Em alguns casos, o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib, um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

[115] En algumas modalidades, o tratamento compreende cirurgia. Em alguns casos, cirurgia compreende ressecção curativa. Em outros casos, cirurgia compreende transplante de fígado.

[116] En algumas modalidades, a amostra biológica compreende uma amostra de sangue.

[117] Em alguns casos, a amostra biológica compreende uma amostra de biópsia de tecido.

[118] En alguns casos, a amostra biológica compreende células tumorais circulantes.

[119] Em alguns casos, o indivíduo é um humano. Determinação do prognóstico de um indivíduo ou de monitoramento da progressão de HCC ou câncer de pulmão em um indivíduo

[120] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui HCC ou câncer de pulmão ou de monitoramento da progressão de HCC ou câncer de pulmão em um indivíduo. Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de supressor da sinalização de citocina 2 (SOCS2), proteína de interação estromal epitelial 1 (EPSTI1), proteína de ligação ao RNA associada ao grânulo citotóxico TIAl (TIAl) Cromossomo 4, Cromossomo 6, contendo domínio de dedo de zinco e SCAN 31 (ZNF323), forkhead box P4 (FOXP4) e fator de transcrição grainyhead-like 2 (GRHL2) do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[121] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui câncer de pulmão ou de monitoramento da progressão de câncer de pulmão no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de receptor de neuropeptídeos B/W 1 (NPBWR1), Cromossomo 2, quinase associada a AP2 1 (AAK1I), fator de transcrição BHLH da família single-minded 1 (SIM1), Ccl0oorf46, Cl7orflo1l, contendo domínio DEP 5 (DEPDCS5) contendo domínio de dedo de zinco e SCAN 31 (ZNF323) subunidade alfa-2 do receptor de ácido gama-aminobutírico tipo A (GABRA2), específicos da placenta 8 (PLAC8) e adrenoceptor alfa 2B (ADRAZB) do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[122] En — modalidades adicionais, é revelado nesse relatório descritivo um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SH3 e PX domínios 2A (SH3PXD2A), Cllorf9, proteína de interação com PTPRF alfa 1 (PPFIAI), Cromossomo 17:78, membro B da família da Serpina 5 (SERPINBS5S), proteína homóloga Notch do lócus neurogênico 3 (NOTCH3), fator de transcrição grainyhead-like 2 (GRHL2) e proteína transmembrana 8B (TMEM8B) do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[123] En alguns casos, uma pontuação de metilação é utilizada para determinar o prognóstico de um indivíduo. Em alguns casos, a pontuação de metilação ainda se refere nesse relatório descritivo a uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp). Em alguns casos, prognóstico se refere à predição da probabilidade de morte atribuível ao câncer ou progressão, incluindo recorrência, disseminação metastática e resistência farmacológica, de câncer hepático. O termo “predição” é usado nesse relatório descritivo para se referir à probabilidade de que um indivíduo responderá favoravelmente ou desfavoravelmente a um fármaco ou conjunto de fármacos, e também à extensão daquelas respostas, ou de que um indivíduo sobreviverá, após quimioterapia por certo período de tempo sem recorrência do câncer e/ou após cirurgia (por exemplo, remoção do baço). Em alguns casos, uma pontuação de metilação é utilizada para determinar o prognóstico de um indivíduo que possui câncer hepático.

[124] Em algumas modalidades, uma pontuação de metilação (ou pontuação-cp) se correlaciona com um prognóstico “bom”. Em alguns casos, um prognóstico “bom” se refere à probabilidade de que um indivíduo provavelmente responderá favoravelmente a um fármaco ou conjunto de fármacos, levando a uma remissão completa ou parcial de câncer hepático ou a uma diminuição e/ou uma interrupção na progressão de câncer hepático. Em alguns casos, um prognóstico “bom” se refere à sobrevida de um indivíduo desde pelo menos 1 mês até pelo menos 90 anos. Em alguns casos, um prognóstico “bom” se refere à sobrevida de um indivíduo na qual a sobrevida do indivíduo mediante tratamento é de pelo menos 1 mês até pelo menos 90 anos. Em alguns casos, a sobrevida de um indivíduo ainda se refere a uma taxa de sobrevida estendida de um indivíduo que recebe um esquema de tratamento em relação a um indivíduo que não recebe o mesmo esquema de tratamento. Em alguns casos, um prognóstico “bom” se refere a um tempo de sobrevida estendido de um indivíduo que recebe um esquema de tratamento em relação a um indivíduo que não recebe o mesmo esquema de tratamento.

[125] Em alguns casos, uma pontuação de metilação (ou pontuação-cp) se correlaciona com uma sobrevida de pelo menos 1 mês até pelo menos 90 anos. Em alguns casos, uma pontuação de metilação de cerca de 1,5 até cerca de 4 é indicativa de uma sobrevida de pelo menos 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 10 anos, 15 anos, 20 anos, 30 anos, 50 anos, ou mais.

[126] Em algumas modalidades, uma pontuação de metilação (ou pontuação-cp) se correlaciona com um prognóstico “ruim”. Em alguns casos, um prognóstico “ruim” se refere à probabilidade de que um indivíduo provavelmente responderá desfavoravelmente a um fármaco ou conjunto de fármacos, levando a uma progressão de leucemia (por exemplo, progressão para leucemia metastática) e/ou a ser refratário a um ou mais agentes terapêuticos. Em alguns casos, um prognóstico “ruim” se refere à probabilidade de que um indivíduo não responderá a um fármaco ou conjunto de fármacos, levando a uma progressão de leucemia. Em alguns casos, um prognóstico “ruim” se refere à sobrevida de um indivíduo de menos do que anos até menos do que 1 mês. Em alguns casos, um prognóstico “ruim” se refere à sobrevida de um indivíduo na qual a sobrevida do indivíduo mediante tratamento é de menos do que 5 anos até menos do que 1 mês. Em alguns casos, um prognóstico “ruim” ainda se refere à probabilidade de que um indivíduo desenvolverá uma leucemia refratária a um ou mais fármacos.

[127] En alguns casos, uma pontuação de metilação (ou pontuação-cp) se correlaciona com uma sobrevida de menos do que 5 anos até menos do que 1 mês. Em alguns casos, uma pontuação de metilação de menos do que 1,5 é indicativa de uma sobrevida de menos do que 5 anos, 4 anos, 3 anos, 2 anos 1,5 ano, 1 ano, 10 meses, 8 meses, 6 meses, 4 meses ou 2 meses.

[128] Em algumas modalidades, a pontuação de metilação é calculada, por exemplo, com base no modelo para uma análise de sobrevida. Em alguns casos, uma análise de sobrevida é uma análise estatística para análise da duração de tempo esperada até que um ou mais eventos de interesse aconteçam. Em alguns casos, análise de sobrevida compreende análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox, teste do log- rank ou um estimador de limite do produto. Em alguns casos, a pontuação de metilação é calculada com base na análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox, teste do log- rank ou estimador de limite do produto. Em alguns casos, a pontuação de metilação é calculada com base na análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox. Em algumas modalidades, a pontuação de metilação é ainda calculada com base em um teste do log-rank. Em alguns casos, o teste do log-rank é um teste de hipótese para comparar a distribuição de sobrevida de duas amostras (por exemplo, um conjunto de treinamento e um conjunto de validação). Em alguns casos, o teste do log-rank também é denominado um teste de Mantel-Cox ou um teste de Cochran-Mantel-Haenszel tempo-estratificado. Em alguns casos, a pontuação de metilação é adicionalmente calculada com base em um estimador de limite do produto. Um estimador de limite do produto (também conhecido como estimador de Kaplan-Meier) é uma estatística não paramétrica usada para estimar a função de sobrevida a partir de dados de toda a vida. Em algumas modalidades, a pontuação de metilação é inicialmente calculada com base na análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox e depois reprocessada com um teste do log-rank.

Métodos de detecção

[129] En algumas modalidades, diversos métodos são utilizados para medir, detectar, determinar, identificar e caracterizar o estado/nível de metilação de um biomarcador (ou seja, uma região/fragmento de DNA ou uma região/fragmento de DNA do genoma (por exemplo, região/fragmento contendo uma ilha CpG)) na identificação de um indivíduo como tendo câncer hepático, na determinação do subtipo de câncer hepático, no prognóstico de um indivíduo que possui câncer hepático, e na progressão ou regressão de câncer hepático em um indivíduo na presença de um agente terapêutico.

[130] Em alguns casos, o perfil de metilação é gerado a partir de uma amostra biológica isolada de um indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma biópsia. Em alguns casos, a amostra biológica é uma amostra de tecido. Em alguns casos, a amostra biológica é uma amostra de biópsia de tecido. Em alguns casos, a amostra biológica é uma amostra de sangue. Em outros casos, a amostra biológica é a amostra biológica livre de células. Em outros casos, a amostra biológica é uma amostra de DNA tumoral circulante. Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra biológica livre de células que contém DNA tumoral circulante.

[131] En algumas modalidades, um biomarcador (ou um marcador epigenético) é obtido de uma amostra líquida. Em algumas modalidades, a amostra líquida compreende sangue e outras amostras líquidas de origem biológica (incluindo, sem limitação, sangue periférico, soros, plasma, ascite, urina, líquido cerebrospinal (CSF), escarro, saliva, medula óssea, líquido sinovial, humor aquoso, líquido amniótico, cerume, leite do peito, líquido de lavagem broncoalveolar, sêmen, líquido prostático, fluido de Cowper ou líquido pré- ejaculatório, ejaculado feminino, suor, lágrimas, líquido de cistos, líquido pleural e peritoneal, líquido pericárdico, ascite, linfa, quimo, quilo, bile, líquido intersticial, menstruações, pus, sebo, vômito, secreções/descargas vaginais, líquido sinovial, secreção mucosa, fezes aquosas, suco pancreático, líquidos de lavagem de cavidades sinusais, aspirados broncopulmonares, líquido de cavidade de blastocisto ou sangue do cordão umbilical. Em algumas modalidades, o líquido biológico é sangue, um derivado do sangue ou uma fração do sangue, por exemplo, soro ou plasma. Em uma modalidade específica, uma amostra compreende uma amostra de sangue. Em outra modalidade, é usada uma amostra de soro. Em outra modalidade, uma amostra compreende urina. Em algumas modalidades, a amostra líquida também engloba uma amostra que foi manipulada de alguma forma após sua aquisição, por exemplo, por centrifugação, filtração, precipitação, diálise, cromatografia, tratamento com reagentes, lavada ou enriquecida para certas populações de células.

[132] En algumas modalidades, um biomarcador (ou um marcador epigenético) é obtido de uma amostra de tecido. Em alguns casos, um tecido corresponde a qualquer célula (ou células). Diferentes tipos de tecido correspondem a diferentes tipos de células (por exemplo, fígado, pulmão, sangue, tecido conjuntivo e semelhantes), mas também células saudáveis vs. células tumorais ou a células tumorais em vários estágios de neoplasia, ou a células tumorais malignas deslocadas. Em algumas modalidades, uma amostra de tecido ainda engloba uma amostra clínica, e também inclui células em cultura, sobrenadantes de células, órgãos e semelhantes. Amostras também compreendem blocos de tecido recém- congelados e/ou fixados em formalina, embebidos em parafina, por exemplo, blocos preparados a partir de biópsias clínicas ou patológicas, preparados para análise patológica ou para estudo por imunoistoquímica.

[133] En algumas modalidades, um biomarcador (ou um marcador epigenético) está metilado ou não metilado em uma amostra normal (por exemplo, tecido normal ou de controle sem doença, ou fluido corporal normal ou de controle, fezes, sangue, soro, líquido amniótico), mais importante ainda em fezes, sangue, soro, líquido amniótico ou outro fluido corporal saudável. Em outras modalidades, um biomarcador (ou um marcador epigenético) está hipometilado ou hipermetilado em uma amostra de um paciente que possui ou em risco de uma doença (por exemplo, uma ou mais indicações descritas nesse relatório descritivo); por exemplo, em uma frequência de metilação diminuída ou aumentada (respectivamente) de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80% pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%, em comparação com uma amostra normal. Em uma modalidade, uma amostra também está hipometilada ou hipermetilada em comparação com uma análise de amostra obtida previamente do mesmo paciente que possui ou em risco de uma doença (por exemplo, uma ou mais indicações descritas nesse relatório descritivo), particularmente para comparar a progressão de uma doença.

[134] Em algumas modalidades, um metiloma compreende um conjunto de marcadores epigenéticos ou biomarcadores, por exemplo, um biomarcador descrito acima. Em alguns casos, um metiloma que corresponde ao metiloma de um tumor de um organismo (por exemplo, um humano) é classificado como um metiloma tumoral. Em alguns casos, um metiloma tumoral é determinado usando DNA tumoral de tecido tumoral ou livre de células (ou livre de proteínas) em uma amostra biológica. Outros exemplos de metilomas de interesse incluem os metilomas de órgãos que contribuem com DNA em um fluido corpóreo (por exemplo, metilomas de tecido como, por exemplo, cérebro, mama, pulmão, a próstata e os rins, plasma etc.).

[135] Em algumas modalidades, um metiloma plasmático é o metiloma determinado do plasma ou soro de um animal (por exemplo, um humano). Em alguns casos, o metiloma plasmático é um exemplo de um metiloma livre de células ou livre de proteínas, na medida em que plasma e soro incluem DNA livre de células. O metiloma plasmático também é um exemplo de um metiloma misto, na medida em que é uma mistura de metiloma tumoral e outros metilomas de interesse. Em alguns casos, o metiloma da urina é determinado da amostra de urina de um indivíduo. Em alguns casos, um metiloma celular corresponde ao metiloma determinado de células (por exemplo, células sanguíneas) do paciente. O metiloma das células sanguíneas é denominado o metiloma da célula sanguínea (ou metiloma sanguíneo).

[136] En algumas modalidades, DNA (por exemplo, DNA genômico como, por exemplo, DNA genômico extraído ou DNA genômico tratado) é isolado por qualquer meio padronizado na técnica, incluindo o uso de kits disponíveis comercialmente. Resumidamente, quando o DNA de interesse está encapsulado por uma membrana celular, a amostra biológica é rompida e lisada por meios enzimáticos, químicos ou mecânicos. Em alguns casos, a solução de DNA é então depurada de proteínas e de outros contaminantes, por exemplo, por digestão com proteinase K. O DNA é então recuperado da solução. Nesses casos, isso é realizado por meio de diversos métodos, incluindo dessalinização, extração orgânica ou ligação do DNA a um suporte de fase sólida. Em alguns casos, a escolha do método é afetada por vários fatores, incluindo tempo, custos e quantidade de DNA necessária.

[137] Quando a amostra DNA não está encapsulada em uma membrana (por exemplo, DNA circulante de uma amostra livre de células como, por exemplo, sangue ou urina), são opcionalmente empregados métodos padronizados na técnica para o isolamento e/ou purificação de DNA (veja, por exemplo, Bettegowda e cols. “Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies”. Sci. Transl. Med., 6 (224): ra24. 2014). Esses métodos incluem o uso de um reagente de degeneração de proteína, por exemplo, sal caotrópico, por exemplo, cloridrato de guanidina ou uréia; ou um detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), brometo de cianogênio. Métodos alternativos incluem, sem limitação, precipitação de etanol ou precipitação de propanol, concentração a vácuo, entre outros, por meio de uma centrífuga. Em alguns casos, aqueles habilitados na técnica também se utilizam de dispositivos como, por exemplo, dispositivos de filtro, por exemplo, ultrafiltração, superfícies ou membranas de sílica, partículas magnéticas, partículas de poliestirol, superfícies de poliestirol, superfícies carregadas positivamente e membranas carregadas positivamente, membranas carregadas, superfícies carregadas, membranas de troca carregadas, superfícies de troca carregadas.

[138] Em alguns casos, após os ácidos nucleicos terem sido extraídos, a análise da metilação é realizada por qualquer meio conhecido na técnica. Diversos procedimentos de análise da metilação são conhecidos na técnica e podem ser usados para a prática métodos revelados nesse relatório descritivo. Esses ensaios permitem a determinação do estado de metilação de um ou de vários sítios CpG dentro de uma amostra de tecido. Além disso, esses métodos podem ser usados para quantificação absoluta ou relativa de ácidos nucleicos metilados. Esses ensaios de metilação envolvem, entre outras técnicas, duas etapas principais. A primeira etapa é uma reação ou separação metilação-específica como, por exemplo, (1) tratamento com bissulfífito, (ii) ligação metilação- específica, ou (iii) enzimas de restrição metilação- específicas. A segunda etapa importante envolve (1) amplificação e detecção, ou (ii) detecção direta, por diversos métodos como, por exemplo, (a) PCR (amplificação sequência-específica), por exemplo, Taqmano, (b) sequenciamento de DNA de DNA não tratado e tratado com bissulfito, (c) sequenciamento por ligação de sondas modificadas com corante (incluindo ligação cíclica e clivagem), (d) pirossequenciamento, (e) sequenciamento de molécula única, (f) espectroscopia de massa ou (g) análise Southern blot.

[139] Adicionalmente, a digestão com enzima de restrição de produtos de PCR amplificados de DNA convertido com bissulfito pode ser usada, por exemplo, o método descrito por Sadri e Hornsby (1996, Nucl. Acids Res. 24: 5.058- 5059), ou COBRA (Análise Combinada de Restrição de Bissulfito) (Xiong e Laird, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 2.532-2.534). A análise COBRA é um ensaio quantitativo de metilação útil para a determinação de níveis de metilação de DNA em loci gênicos específicos em pequenas quantidades de DNA genômico. Resumidamente, a digestão com enzima de restrição é usada para revelar diferenças de sequência metilação-dependentes em produtos de PCR de DNA tratado com bissulfito de sódio. As diferenças de sequência metilação-dependentes primeiro são introduzidas no DNA genômico por tratamento-padrão com bissulfito de acordo com o procedimento descrito por Frommer e cols. (Frommer e cols., 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 1.827-1.831). A amplificação por PCR do DNA convertido com bissulfito é então realizada com o uso de iniciadores específicos para os sítios CpG de interesse, seguida por digestão com endonuclease de restrição, eletroforese em gel, e detecção com o uso de sondas de hibridização específicas, marcadas. Os níveis de metilação na amostra de DNA original são representados pelas quantidades relativas de produto de PCR digerido e não digerido de uma forma linearmente quantitativa através de um amplo espectro de níveis de metilação de DNA. Além disso, essa técnica pode ser confiavelmente aplicada ao DNA obtido de amostras de tecido embebidas em parafina microdissecadas. Reagentes típicos

(por exemplo, como podem ser encontrados em um kit baseado em COBRA típico) para análise COBRA podem incluir, sem limitação: iniciadores de PCR para um gene específico (ou sequência de DNA ou ilha CpG com metilação alterada); enzima de restrição e tampão apropriado; óligo de hibridização de gene; óligo de hibridização de controle; kit de marcação de quinase para sonda de óligo; e nucleotídeos radioativos. Adicionalmente, reagentes de conversão de bissulfito podem incluir: tampão de desnaturação de DNA; tampão de sulfonação; reagentes ou kits de recuperação de DNA (por exemplo, precipitação, ultrafiltração, coluna de afinidade); tampão de dessulfonação; e componentes de recuperação de DNA.

[140] Em uma modalidade, o perfil de metilação de sítios CpG selecionados é determinado com o uso de PCR metilação- específica (MSP). MSP permite a avaliação do estado de metilação de praticamente qualquer grupo de sítios CpG dentro de uma ilha CpG, independente do uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação (Herman e cols., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93, 9.821-9.826; Patentes U.S. Nºs 5.786.146,

6.017.704, 6.200.756, 6.265.171 (Herman e Baylin); Publicação de Patente U.S. Nº 2010/0144836 (Van Engeland e cols.); que são incorporadas nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Resumidamente, DNA é modificado por um agente de desaminação como, por exemplo, bissulfito de sódio, para converter citosinas não metiladas em uracil e, subsequentemente, amplificado com iniciadores específicos para DNA metilado versus não metilado. Reagentes típicos (por exemplo, como podem ser encontrados em um kit baseado em MSP típico) para análise por MSP, podem incluir, sem limitação: iniciadores de PCR metilados e não metilados para um gene específico (ou sequência de DNA ou ilha CpG com metilação alterada), tampões de PCR e desoxinucleotídeos otimizados, e sondas específicas. Pode-se usar PCR metilação-específica quantitativa multiplexada (QM-PCR), como descrito por Fackler e cols. Fackler e cols., 2004, Cancer Res. 64 (13) 4.442-4.452; ou Fackler e cols., 2006, Clin. Cancer Res. 12 (11 Pt 1) 3.306-3.310.

[141] Em uma modalidade, o perfil de metilação de sítios CpG selecionados é determinado com o uso dos métodos MethyLight e/ou “Heavy Methyl”. Os ensaios MethyLight e “Heavy Methyl” são ensaios quantitativos de metilação de alto rendimento que utilizam tecnologia de PCR em tempo real à base de fluorescência (Taq ManO) que não necessita de manipulações adicionais após a etapa de PCR (Eads, C.A. e cols., 2000, Nucleic Acid Res. 28, e 32; Cottrell e cols., 2007, J. Urology 177, 1.753, Patentes U.S. Nºs 6.331.393 (Laird e cols.), cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Resumidamente, o processo de MethyLight começa com uma amostra mista de DNA genômico que é convertido, em uma reação de bissulfito de sódio, em um pool misto de diferenças de sequência metilação-dependentes de acordo com procedimentos- padrão (o processo de bissulfito converte resíduos de citosina não metilada em uracil). PCR à base de fluorescência é então realizada em uma reação de PCR “não viesada” (com iniciadores que não se sobrepõem a sítios de metilação de CpG conhecidos), ou em uma reação “viesada” (com iniciadores de PCR que se sobrepõem a dinucleotídeos CpG conhecidos). Em alguns casos, a discriminação de sequência ocorre no nível do processo de amplificação ou no nível do processo de detecção de fluorescência, ou em ambos. Em alguns casos, o ensaio MethyLight é usado como um teste quantitativo para padrões de metilação na amostra de DNA genômico, em que a discriminação de sequência ocorre no nível de hibridização de sonda. Nessa versão quantitativa, a reação de PCR fornece amplificação não viesada na presença de uma sonda fluorescente que se sobrepõe a um suposto sítio de metilação particular. Um controle não viesado para a quantidade de DNA inserido é fornecido por uma reação na qual nem os iniciadores, nem a sonda se sobrepõem a quaisquer dinucleotídeos CpG. Alternativamente, um teste qualitativo para metilação genômica é obtido por sondagem do pool de PCR viesada com oligonucleotídeos de controle que não “cobrem” sítios de metilação conhecidos (uma versão à base de fluorescência da técnica “MSP”), ou com oligonucleotídeos que cobrem sítios de metilação potenciais. Reagentes típicos (por exemplo, como podem ser encontrados em um kit baseado em MethyLight típico) para análise MethyLight podem incluir, sem limitação: iniciadores de PCR para um gene específico (ou sequência de DNA ou ilha CpG com metilação alterada); sondas TaqManG6; tampões de PCR e desoxinucleotídeos; e Taq polimerase otimizados.

[142] MethyLight quantitativo usa bissulfito para converter DNA genômico, e os sítios metilados são amplificados com o uso de PCR com iniciadores independentes de metilação. Sondas de detecção específicas para os sítios metilados e não metilados com dois fluoróforos diferentes fornecem medição quantitativa simultânea da metilação. A técnica “Heavy Methyl” começa com conversão com bissulfato de DNA. A seguir, bloqueadores específicos evitam a amplificação de DNA não metilado. DNA genômico metilado não se liga aos bloqueadores e suas sequências serão amplificadas. A sequências amplificadas são detectadas com uma sonda de metilação específica (Cottrell e cols., 2004, Nuc. Acids Res. 32: elO0O, cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade).

[143] A técnica Ms-SNuPE é um método quantitativo para avaliação de diferenças de metilação em sítios CpG específicos com base no tratamento com bissulfito de DNA, seguido por extensão com iniciador de nucleotídeo único (Gonzalgo e Jones, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 2.529-2.531). Resumidamente, DNA genômico é reagido com bissulfito de sódio para converter citosina não metilada em uracil deixando, ao mesmo tempo, 5-metilcitosina inalterada. A amplificação da sequência-alvo desejada é então realizada com o uso de iniciadores de PCR específicos para DNA convertido com bissulfito, e o produto resultante é isolado e usado como um modelo para análise da metilação nos sítios CpG de interesse. Em alguns casos, pequenas quantidades de DNA são analisadas (por exemplo, cortes de patologia microdissecados), e o método evita a utilização de enzimas de restrição para a determinação do estado de metilação em sítios CpG. Reagentes típicos (por exemplo, como encontrados em um kit baseado em Ms-SNuPE típico) para análise Ms-SNuPE incluem, sem limitação: iniciadores de PCR para um gene específico (ou sequência de DNA ou ilha CpG com metilação alterada); tampões de PCR e desoxinucleotídeos otimizados; kit de extração de gel; iniciadores de controle positivo; iniciadores de Ms- SNuPE para um gene específico; tampão de reação (para a reação de Ms-SNuPE); e nucleotídeos radioativos.

Adicionalmente, reagentes de conversão de bissulfito podem incluir: tampão de desnaturação de DNA; tampão de sulfonação; reagentes ou kit de recuperação de DNA (por exemplo, precipitação, ultrafiltração, coluna de afinidade); tampão de dessulfonação; e componentes de recuperação de DNA.

[144] En outra modalidade, o estado de metilação de sítios CpG selecionados é determinado com o uso de métodos de detecção de metilação baseados em ligação diferencial. Para identificação de regiões diferencialmente metiladas, uma abordagem é a captura de DNA metilado. Essa abordagem usa uma proteína, na qual o domínio de ligação de metil MBD2 está fundido ao fragmento Fc de um anticorpo (MBD-FC) (Gebhard e cols., 2006, Cancer Res. 66: 6.118-6.128; e Publicação PCT Nº WO 2006/056480 A2 (Relhi), cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Essa proteína de fusão possui várias vantagens em relação aos anticorpos metilação-específicos convencionais. A MBD-FC possui uma afinidade maior para DNA metilado e se liga ao DNA de fita dupla. Mais importante ainda, as duas proteínas diferem na forma que se ligam ao DNA. Anticorpos metilação-específicos se ligam ao DNA estocasticamente, o que significa que apenas uma resposta binária pode ser obtida. O domínio de ligação de metil de MBD-FC, por outro lado, se liga às moléculas de DNA independentemente de seu estado de metilação. A potência dessa interação proteína-DNA é definida pelo nível de metilação de DNA. Após ligação do DNA genômico, soluções de eluato de concentrações de sal crescentes podem ser usadas para fracionar DNA não metilado e metilado, o que permite uma separação mais controlada (Gebhard e cols., 2006, Nucleic

Acids Res. 34: e82). Consequentemente, esse método, denominado imunoprecipitação de Metil-CpG (MCIP), não apenas enriquece, mas também fraciona DNA genômico de acordo com o nível de metilação, o que é particularmente útil quando a fração de DNA não metilado também deve ser investigada.

[145] En uma modalidade alternativa, um anticorpo para 5-metil citidina se liga e precipita DNA metilado. Anticorpos estão disponíveis por Abeam (Cambridge, MA), Diagenode (Sparta, NJ) ou Eurogentec (c/o AnaSpec, Fremont, CA). Após os fragmentos metilados terem sido separados, eles podem ser sequenciados usando técnicas à base de microarranjos como, por exemplo, ensaio de recuperação de ilha CpG metilada (MIRA) ou imunoprecipitação de DNA mnmetilado (MeDIP (Pelizzola e cols., 2008, Genome Res. 18, 1.652-1.659; O' Geen e cols., 2006, BioTechniques 41 (5), 577-580, Weber e cols., 2005, Nat. Genet. 37, 853-862; Horak e Snyder, 2002, Methods Enzymol., 350, 469-83; Lieb, 2003, Methods Mol. Biol., 224, 99-109). Outra técnica é a coluna/segregação de domínio de ligação de metil-CpG de moléculas parcialmente fundidas (MBD/SPM, Shiraishi e cols., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (6): 2.913-2.918).

[146] Em algumas modalidades, métodos para a detecção de metilação incluem cisalhamento aleatório ou fragmentação aleatória do DNA genômico, corte do DNA com uma enzima de restrição metilação-dependente ou sensível à metilação e subsequentemente identificação e/ou análise seletiva do DNA cortado ou não cortado. A identificação seletiva pode incluir, por exemplo, a separação de DNA cortado ou não cortado (por exemplo, por tamanho) e quantificação de uma sequência de interesse que foi cortada ou, alternativamente,

que não foi cortada. Veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº

7.186.512. Alternativamente, o método pode englobar a amplificação de DNA intacto após digestão com uma enzima de restrição e, dessa forma, amplificação apenas do DNA que não foi clivado pela enzima de restrição na área amplificada. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nº 7.910.296; Nº

7.901.880; e Nº 7.459.274. Em algumas modalidades, a amplificação pode ser realizada com o uso de iniciadores que são gene-específicos.

[147] Por exemplo, há enzimas metil-sensíveis que preferencialmente ou substancialmente clivam ou digerem em sua sequência de reconhecimento de DNA se ele é não metilado. Dessa forma, uma amostra de DNA não metilado é cortada em fragmentos menores do que uma amostra de DNA metilado. Similarmente, uma amostra de DNA hipermetilado não é clivada. Em contraste, há enzimas metil-sensíveis que clivam em sua sequência de reconhecimento de DNA apenas se ele é metilado. Enzimas metil-sensíveis que digerem DNA não metilado adequadas para uso em métodos da tecnologia incluem, sem limitação, Hpall, Hhal, Maell, BstUI e Acil. Em alguns casos, uma enzima que é usada é Hpall que corta apenas a sequência CCGG não metilada. Em outros casos, outra enzima que é usada é Hhal que corta apenas a sequência GCGC não metilada. Ambas as enzimas estão disponíveis por New England BioLabsO, Inc. Combinações de duas ou mais enzimas metil-sensíveis que digerem apenas DNA não metilado também são usadas. Enzimas adequadas que digerem apenas DNA metilado incluem, sem limitação, Dpnl, que apenas corta em sequências 5”'-GATC totalmente metiladas, e McrBC, uma endonuclease, que corta DNA que contém citosinas modificadas (5-metilcitosina ou 5-

hidroximetilcitosina ou N4-metilcitosina) e corta no sítio de reconhecimento 5" ... PumC (N40-3000) PumC... 3" (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA). Métodos e procedimentos de clivagem para enzimas de restrição selecionadas para o corte de DNA em sítios específicos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, muitos fornecedores de enzimas de restrição fornecem informação sobre condições e tipos de corte de sequências de DNA por enzimas de restrição específicas, incluindo New England BioLabs, Pro-Mega Biochems, Boehringer-Mannheim e semelhantes. Sambrook e cols. (veja Sambrook e cols. “Molecular Biology: A Laboratory Approach”, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) fornecem uma descrição geral de métodos para a utilização de enzimas de restrição e outras enzimas.

[148] Em alguns casos, uma enzima de restrição metilação- dependente é uma enzima de restrição que cliva ou digere DNA em uma sequência de reconhecimento metilada ou próximo dela, mas não cliva DNA na mesma sequência ou perto dela quando a sequência de reconhecimento não é metilada. Enzimas de restrição metilação-dependentes incluem aquelas que cortam em uma sequência de reconhecimento metilada (por exemplo, Dpnl) e enzimas que cortam em uma sequência perto, mas não na sequência de reconhecimento (por exemplo, McrBC). Por exemplo, a sequência de reconhecimento de McrBC s está 5' RmC (N40-3000) RMC 3', em que “R” é uma purina e “mC” é uma citosina metilada e “N40-3000” indica a distância entre as dois meios-sítios RMC para os quais um evento de restrição foi observado. McrBC geralmente corta perto de um meio-sítio ou do outro, mas as posições de clivagem estão tipicamente distribuídas ao longo de vários pares de bases aproximadamente 30 pares de bases da base metilada. McrBC algumas vezes corta 3' de ambos os meios-sítios, algumas vezes 5” de ambos os meios-sítios, e algumas vezes entre os dois sítios. Enzimas de restrição metilação-dependentes exemplares incluem, por exemplo, McrBC, McrA, MrrA, Bisl Glal e Dpnl. Aqueles habilitados na técnica observarão que qualquer enzima de restrição metilação-dependente, incluindo homólogos e ortólogos das enzimas de restrição descritas nesse relatório descritivo, também é adequada para uso com um ou mais métodos descritos nesse relatório descritivo.

[149] Em alguns casos, uma enzima de restrição sensível à metilação é uma enzima de restrição que cliva DNA em uma sequência de reconhecimento não metilada ou perto dela, mas não cliva na mesma sequência ou perto dela quando a sequência de reconhecimento está metilada. Enzimas de restrição sensíveis à metilação exemplares são descritas, por exemplo, em McClelland e cols., 22 (17) NUCLEIC ACIDS RES. 3.640-59 (1994). Enzimas de restrição sensíveis à metilação adequadas que não clivam DNA em sua sequência de reconhecimento ou perto dela quando uma citosina dentro da sequência de reconhecimento está metilada na posição C5 incluem, por exemplo, Aat II, Aci I, Acd I, Age I, Alu LI, Asc I, Ase [, ASsiS I, Bbe I, BsaA I, BsaH I, BsiE I, BsiW I, BsrF I, BssH II, BssK I, BstB I, BstN I, BstU I, Cla I, Eae I, Eag I, Fau I, Fse I, Hha I, HinPl I, HinC II, Hpa II, Hpy99 I, HpyCH4 IV, Kas I, Mbo I, Mlu I, MapAl I, Msp I, Nae I, Nar LI, Not IT, Pml I, Pst I, Pvu I, Rsr II, Sac II, Sap I, Sau3A I, Sfl IT, Sfo I, SgrA I, Sma I, SnaB I, Tsc I, Xma I, e Zra [. Enzimas de restrição sensíveis à metilação adequadas que não clivam DNA em sua sequência de reconhecimento ou perto dela quando uma adenosina dentro da sequência de reconhecimento está metilada na posição N6 incluem, por exemplo, Mbo 1. Aqueles habilitados na técnica observarão que qualquer enzima de restrição sensível à metilação, incluindo homólogos e ortólogos das enzimas de restrição descritas nesse relatório descritivo, também é adequada para uso com um ou mais dos métodos descritos nesse relatório descritivo. Aqueles habilitados na técnica observarão ainda que uma enzima de restrição sensível à metilação que não corta na presença de metilação de uma citosina em sua sequência de reconhecimento ou perto dela pode ser insensível à presença de metilação de uma adenosina em sua sequência de reconhecimento ou perto dela. Da mesma forma, uma enzima de restrição metilação-sensível que não corta na presença de metilação de uma adenosina em sua sequência de reconhecimento ou perto dela pode ser insensível à presença de metilação de uma citosina em sua sequência de reconhecimento ou perto dela. Por exemplo, Sau3AI é sensível (ou seja, não corta) à presença de uma citosina metilada em sua sequência de reconhecimento ou perto dela, mas é insensível (ou seja, corta) à presença de uma adenosina metilada em sua sequência de reconhecimento ou perto dela. Aqueles habilitados na técnica também observarão que algumas enzimas de restrição sensíveis à metilação são bloqueadas por metilação de bases em uma ou ambas as fitas de DNA que englobam sua sequência de reconhecimento, enquanto outras enzimas de restrição sensíveis à metilação são bloqueadas somente por metilação em ambas as fitas, mas podem cortar se um sítio de reconhecimento está hemimetilado.

[150] En — modalidades alternativas, adaptadores são opcionalmente adicionados às extremidades do DNA fragmentado aleatoriamente, e o DNA é então digerido com uma enzima de restrição metilação-dependente ou metilação-sensível, e o DNA intacto é subsequentemente amplificado com o uso de iniciadores que hibridizam para as sequências adaptadoras. Nesse caso, uma segunda etapa é realizada para determinar a presença, ausência ou a quantidade de um gene particular em um pool de DNA amplificado. Em algumas modalidades, o DNA é amplificado usando PCR em tempo real, quantitativa.

[151] En outras modalidades, os métodos compreendem a quantificação da densidade de metilação média em uma sequência-alvo dentro de uma população de DNA genômico. Em algumas modalidades, o método compreende o contato de DNA genômico com uma enzima de restrição metilação-dependente ou uma enzima de restrição sensível à metilação sob condições que permitem que pelo menos algumas cópias de sítios de clivagem de enzima de restrição potenciais no lócus permaneçam não clivadas; a quantificação de cópias intactas do lócus; e uma comparação da quantidade de produto amplificado com um valor de controle que representa a quantidade de metilação de DNA de controle quantificando, dessa forma, a densidade de metilação média no lócus comparada com a densidade de metilação do DNA de controle.

[152] Em alguns casos, a quantidade de metilação de um lócus de DNA é determinada por fornecimento de uma amostra de DNA genômico que compreende o lócus, clivagem do DNA com uma enzima de restrição que é metilação-sensível ou metilação-dependente, e depois quantificação da quantidade de DNA intacto ou quantificação da quantidade de DNA cortado no lócus de DNA de interesse. A quantidade de DNA intacto ou cortado dependerá da quantidade inicial de DNA genômico que contém o lócus, da quantidade de metilação no lócus e do número (ou seja, da fração) de nucleotídeos no lócus que estão metilados no DNA genômico. A quantidade de metilação em um lócus de DNA pode ser determinada por uma comparação da quantidade de DNA intacto ou DNA cortado com um valor de controle que representa a quantidade de DNA intacto ou DNA cortado em uma amostra de DNA tratada similarmente. O valor de controle pode representar um número conhecido ou previsto de nucleotídeos metilados. Alternativamente, o valor de controle pode representar a quantidade de DNA intacto ou cortado do mesmo lócus em outra célula (por exemplo, normal, não doente) ou um segundo lócus.

[153] Pela utilização de pelo menos uma enzima de restrição metilação-sensível ou metilação-dependente sob condições que permitem que pelo menos algumas cópias de sítios de clivagem de enzima de restrição potenciais no lócus permaneçam não clivadas e subsequentemente quantificação das cópias intactas restantes e comparação da quantidade com um controle, a densidade de metilação média de um lócus pode ser determinada. Se a enzima de restrição sensível à metilação é colocada em contato com cópias de um lócus de DNA sob condições que permitem que pelo menos algumas cópias de sítios de clivagem de enzima de restrição potenciais no lócus permaneçam não clivadas, então o DNA intacto restante será diretamente proporcional à densidade de metilação e, dessa forma, pode ser comparado com um controle para determinar a densidade de metilação relativa do lócus na amostra. Similarmente, se uma enzima de restrição metilação- dependente é colocada em contato com cópias de um lócus de

DNA sob condições que permitem que pelo menos algumas cópias de sítios de clivagem de enzima de restrição potenciais no lócus permaneçam não clivadas, então o DNA intacto restante será inversamente proporcional à densidade de metilação e, dessa forma, pode ser comparado com um controle para determinar a densidade de metilação relativa do lócus na amostra. Esses ensaios são revelados, por exemplo, na Patente U.S. Nº 7.910.296.

[154] À técnica de amplificação de ilha CpG metilada (MCA) é um método que pode ser usado para pesquisar padrões de metilação alterados no DNA genômico e para isolar sequências específicas associadas a essas alterações (Toyota e cols., 1999, Cancer Res. 59, 2.307-2.312, Patente U.S. Nº

7.700.324 (Issa e cols.), cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Resumidamente, enzimas de restrição com sensibilidades diferentes à metilação de citosina em seus sítios de reconhecimento são usadas para digerir DNAs genômicos de tumores primários, linhagens de células e tecidos normais antes da amplificação por PCR com iniciadores arbitrários. Fragmentos que exibem metilação diferencial são clonados e sequenciados após resolução dos produtos de PCR em géis de poliacrilamida de alta resolução. Os fragmentos clonados são então usados como sondas para análise Southern para confirmar a metilação diferencial dessas regiões. Reagentes típicos (por exemplo, como podem ser encontrados em um kit baseado em MCA típico) para análise por MCA podem incluir, sem limitação: iniciadores de PCR para sensibilização arbitrária de DNA genômico; tampões e nucleotídeos de PCR, enzimas de restrição e tampões apropriados; óligos ou sondas de hibridização de genes; óligos ou sondas de hibridização de controle.

[155] Métodos de detecção de metilação adicionais incluem aqueles métodos descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nº

7.553.627; Nº 6.331.393; Patente U.S. Nº de Série 12/476.981; Publicação de Patente U.S. Nº 2005/0069879; Rein, e cols., 26(10) NUCLEIC ACIDS RES. 2.255-64 (1998); e Olek e cols., 17 (3) NAT. GENET. 275-6 (1997).

[156] En outra modalidade, o estado de metilação de sítios CpG selecionados é determinado com o uso de Fusão de Alta Resolução Metilação-Sensível (HRM) . Recentemente, Wojdacz e cols. relataram fusão de alta resolução metilação- sensível como uma técnica para avaliar metilação (Wojdacz e Dobrovic, 2007, Nuc. Acids Res. 35 (6) e41; Wojdacz e cols. 2008, Nat. Prot. 3 (12) 1.903-1.908; Balic e cols., 2009 JU. Mol. Diagn. 11, 102-108; e Publicação de Patente U.S. Nº 2009/0155791 (Wojdacz e cols.), cujos conteúdos são incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Diversas máquinas de PCR em tempo real disponíveis comercialmente possuem sistemas HRM, incluindo o Light Cycler 480 de Roche, Rotor Gene 6000 de Corbett Research e o Applied Biosystems 7500. HRM também pode ser combinada com outras técnicas de amplificação como, por exemplo, pirossequenciamento como descrito por Candiloro e cols. (Candiloro e cols., 2011, Epigenetics 6 (4) 500-507).

[157] En outra modalidade, o estado de metilação de um lócus de CpG selecionado é determinado com o uso de um ensaio de extensão de iniciador, incluindo uma amplificação otimizada por reação de PCR que produz alvos amplificados para análise com o uso de espectrometria de massa. O ensaio também pode ser feito em multiplex. A espectrometria de massa é um método particularmente eficaz para a detecção de polinucleotídeos associados com os elementos regulatórios diferencialmente metilados. A presença da sequência de polinucleotídeos é verificada por uma comparação da massa do sinal detectado com à massa esperada do polinucleotídeo de interesse. A potência de sinal relativa, por exemplo, pico de massa em um espectro, para uma sequência de polinucleotídeos particular indica a população relativa de um alelo específico permitindo, dessa forma, o cálculo da proporção do alelo diretamente pelos dados. Esse método é descrito em detalhe na Publicação PCT Nº WO 2005/012578 Al (Beaulieu e cols.), que é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Para análise da metilação, o ensaio pode ser adotado para detectar alterações de sequência de C para T dependente de metilação introduzida por bissulfito. Esses métodos são particularmente úteis para a realização de reações de amplificação multiplexadas e reações de extensão de iniciador multiplexadas (por exemplo, ensaios de extensão de massa homogênea de iniciador multiplexada (hME)) em um único poço para aumentar ainda mais o rendimento e reduzir o custo por reação para reações de extensão de iniciador.

[158] Outros métodos para análise de metilação de DNA incluem varredura genômica de restrição landmark (RLGS, Costello e cols., 2002, Meth. Mol. Biol., 200, 53-70), análise de diferença representativa metilação-sensível (MS- RDA, Ushijima e Yamashita, 2009, Methods Mol. Biol. 507, 117-130). Arranjos abrangentes de alto rendimento para técnicas de metilação relativa (CHARM) são descritos em WO

2009/021141 (Feinberg e Irizarry). Os microarranjos RocheO NimbleGen& incluindo o “Chromatin Immunoprecipitation-on- Chip” (ChIP-chip) ou “Methylated DNA Immunoprecipitation-on- Chip” (MeDIP-chip). Essas ferramentas têm sido usadas para diversas aplicações no câncer, incluindo melanoma, câncer hepático e câncer de pulmão (Koga e cols., 2009, Genome Res., 19, 1.462-1.470; Acevedo e cols., 2008, Cancer Res., 68,

2.641-2.651; Rauch e cols., 2008, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 105, 252-257). Outros relataram a conversão com bissulfato, hibridização de sonda-cadeado, circularização, amplificação e geração próxima ou sequenciamento multiplexado para detecção de metilação de alto rendimento (Deng e cols., 2009, Nat. Biotechnol. 27, 353-360; Ball e cols., 2009, Nat. Biotechnol. 27, 361-368; Patente U.S. Nº 7.611.869 (Fan)). Como uma alternativa à oxidação com bissulfato, Bayeyt e cols. relataram oxidantes seletivos que oxidam 5- metilcitosina, sem reação com timidina, que são seguidos por PCR ou pirossequenciamento (WO 2009/049916 (Bayeyt e cols.). Essas referências para essas técnicas são incorporadas nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[159] Em alguns casos, métodos de amplificação quantitativa (por exemplo, PCR quantitativa ou amplificação linear quantitativa) são usados para quantificar a quantidade de DNA intacto dentro de um lócus flanqueado por iniciadores de amplificação após digestão por restrição. Métodos de amplificação quantitativa são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nº 6.180.349; Nº 6.033.854; e Nº

5.972.602, bem como em, por exemplo, DeGraves, e cols., 34 (1) BIOTECHNIQUES 106-15 (2003); Deiman B, e cols., 20 (2 MOL. BIOTECHNOL. 163-79 (2002); e Gibson e cols., 6 GENOME

RESEARCH 995-1.001 (1996).

[160] Após reação ou separação de ácido nucleico de uma forma metilação-específica, os ácidos nucleicos são, em alguns casos, submetidos à análise baseada em sequência. Por exemplo, após ser determinado que uma sequência genômica de uma amostra está hipermetilada ou hipometilada comparada com sua contraparte, a quantidade dessa sequência genômica pode ser determinada. Subsequentemente, essa quantidade pode ser comparada com um valor de controle-padrão e usada para determinar a presença de câncer hepático na amostra. Em muitos casos, é desejável amplificar uma sequência de ácidos nucleicos usando qualquer um de diversos procedimentos de amplificação de ácido nucleico que são bem conhecidos na técnica. Especificamente, a amplificação de ácido nucleico é a síntese química ou enzimática de cópias de ácido nucleico que contêm uma sequência que é complementar a uma sequência de ácidos nucleicos que está sendo amplificada (modelo). Os métodos e kits podem usar quaisquer métodos de amplificação ou detecção de ácido nucleico conhecidos por aqueles habilitados na técnica, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nºs 5.525.462 (Takarada e cols.); 6.114.117 (Hepp e cols.); 6.127.120 (Graham e cols.); 6.344.317 (Urnovitz); 6.448.001 (O0ku) ; 6.528.632 (Catanzariti e cols.); e Publicação PCT Nº WO 2005/111209 (Nakajima e cols.); todos incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[161] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são amplificados por amplificação por PCR com o uso de metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, no entanto, que a amplificação pode ser obtida por qualquer método conhecido, por exemplo, reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação Q-Replicas, amplificação por círculo rolante, amplificação por transcrição, replicação de sequência auto-sustentada, amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), cada uma delas fornecendo amplificação suficiente. A tecnologia de DNA ramificado também é opcionalmente usada para demonstrar qualitativamente a presença de uma sequência da tecnologia, que representa um padrão de metilação particular, ou para determinar quantitativamente a quantidade dessa sequência genômica particular em uma amostra. Nolte revisa amplificação de sinal de DNA ramificado para a quantificação direta de sequências de ácidos nucleicos em amostras clínicas (Nolte, 1998, Adv. Clin. Chem. 33: 201- 235).

[162] O processo de PCR é bem conhecido na técnica e inclui, por exemplo, PCR por transcrição reversa, PCR mediada por ligação, PCR digital (dPCR) ou PCR digital de gotícula (ddPCR). Para uma revisão de métodos e protocolos de PCR, veja, por exemplo, Innis e cols., eds., “PCR Protocols, A Guide to Methods and Application”, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1990; Patente U.S. Nº 4.683.202 (Mullis). Reagentes e protocolos de PCR também estão disponíveis por vendedores comerciais como, por exemplo, Roche Molecular Systems. Em alguns casos, PCR é realizada como um processo automatizado com uma enzima termoestável. Nesse processo, a temperatura da mistura de reação é ciclada através de uma região de desnaturação, uma região de anelamento de iniciador e uma região de reação de extensão automaticamente. Máquinas especificamente adaptadas para essa finalidade estão disponíveis comercialmente.

[163] Em algumas modalidades, as sequências amplificadas também são medidas com o uso de reações de clivagem invasivas como, por exemplo, a tecnologia InvaderO (Zou e cols., 2010, “Association of Clinical Chemistry” (AACC), apresentação de pôster em 28 de julho de 2010, “Sensitive Quantification of Metilated Markers with a Novel Metilation Specific Technology”; e Patente U.S. Nº 7.011.944 (Prudent e cols.)).

[164] Tecnologias de sequenciamento de próxima geração adequadas estão amplamente disponíveis. Exemplos incluem a plataforma 454 Life Sciences (Roche, Branford, CT) (Margulies e cols. 2005 Nature, 437, 376-380); “Genome Analyzer” de Illumina, Ensaio de Metilação GoldenGate ou Ensaios de Metilação Infinium, ou seja, “Infinium HumanMetilation 27K BeadArray” ou arranjo de metilação “VeraCode GoldenGate” (Illumina, San Diego, CA; Bibkova e cols., 2006, Genome Res. 16, 383-393; Patentes U.S. Nº

6.306.597 e 7.598.035 (Macevicz); 7.232.656 (Balasubramanian e cols.)); “QX200""º Droplet Digital” PCR System” de Bio-Rad; ou Sequenciamento de DNA por Ligação, “SOLiD System” (Applied Biosystems/Life Technologies; Patentes U.S. Nº* 6.797.470,

7.083.917, 7.166.434, 7.320.865, 7.332.285, 7.364.858 e

7.429.453 (Barany e cols.); a tecnologia de sequenciamento de DNA “Helicos True Single Molecule” (Harris e cols., 2008 Science, 320, 106-109; Patentes U.S. Nº 7.037.687 e

7.645.596 (Williams e cols.); 7.169.560 (Lapidus e cols.);

7.769.400 (Harris)), a tecnologia de molécula única, em tempo real (SMRT”) de Pacific Biosciences, e sequenciamento (Soni e Meller, 2007, Clin. Chem. 53, 1996-2001); sequenciamento por semicondutor (Ion Torrent; “Personal Genome Machine”);

sequenciamento de nanobola de DNA; sequenciamento com o uso de tecnologia de Dover Systems (Polonator), e tecnologias que não necessitam de amplificação ou que de algum outro modo transformam DNA nativo antes do sequenciamento (por exemplo, Pacific Biosciences e Helicos), por exemplo, as estratégias baseadas em nanoporo (por exemplo, “Oxford Nanopore”, Genia Technologies, e Nabsys). Esses sistemas permitem o sequenciamento de muitas moléculas de ácido nucleico isoladas de uma amostra em altas ordens de multiplexação de forma paralela. Cada uma dessas plataformas permite o sequenciamento de moléculas únicas clonalmente expandidas ou não amplificadas de fragmentos de ácido nucleico. Certas plataformas envolvem, por exemplo, (1) sequenciamento por ligação de sondas modificadas por corante (incluindo ligação cíclica e clivagem), (11) pirossequenciamento, e (iii) sequenciamento de molécula única.

[165] O pirossequenciamento é um método de sequenciamento de ácido nucleico com base em sequenciamento por síntese, que se baseia na detecção de um pirofosfato liberado na incorporação de nucleotídeo. Geralmente, o sequenciamento por síntese envolve a síntese de um nucleotídeo de cada vez, uma fita de DNA complementar à fita cuja sequência está sendo buscada. Os ácidos nucleicos de estudo podem ser imobilizados a um suporte sólido, hibridizados com um iniciador de sequenciamento, incubados com DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfossulfato e luciferina. Soluções de nucleotídeo são sequencialmente adicionadas e removidas. A incorporação correta de um nucleotídeo libera um pirofosfato, que interage com ATP sulfurilase e produz ATP na presença de adenosina 5 fosfossulfato, abastecendo a reação de luciferina, que produz um sinal quimioluminescente que permite a determinação da sequência. Máquinas para reagentes de pirossequenciamento e metilação-específica estão disponíveis por Qiagen, Inc. (Valencia, CA). Veja também Tost e Gut, 2007, Nat. Prot. 2 2.265-2.275. Um exemplo de um sistema que pode ser usado por aqueles habilitados na técnica com base em pirossequenciamento geralmente envolve as seguintes etapas: ligação de um ácido nucleico adaptador a um ácido nucleico de estudo e hibridização do ácido nucleico de estudo a uma microesfera; amplificação de uma sequência de nucleotídeos no ácido nucleico de estudo em uma emulsão; separação das microesferas usando um suporte sólido multipoços de picolitro; e sequências de nucleotídeos amplificadas por sequenciamento “pela metodologia de pirossequenciamento (por exemplo, Nakano e cols., 2003, JU. Biotech. 102, 117-124). Um sistema desse tipo pode ser usado para amplificar exponencialmente produtos de amplificação gerados por um processo descrito nesse relatório descritivo, por exemplo, por ligação de um ácido nucleico heterólogo ao primeiro produto de amplificação gerado por um processo descrito nesse relatório descritivo. Métodos de análise de dados de metilação de CpG

[166] En certas modalidades, os valores de metilação medidos para biomarcadores de um painel de biomarcadores são matematicamente combinados e o valor combinado é correlacionado com a questão diagnóstica subjacente. Em alguns casos, os valores do biomarcador metilado são combinados por qualquer estado apropriado do método matemático da técnica.

Métodos matemáticos bem conhecidos para a correlação de uma combinação de biomarcadores com um estado de doença empregam métodos como análise discriminante (DA) (por exemplo, DA linear, quadrática, regularizada), Análise Funcional Discriminante (DFA), Métodos de Kernel (por exemplo, SVM), Escalonamento Multidimensional (MDS), Métodos Não Paramétricos (por exemplo, k-Classificadores do Vizinho Mais Próximo), PLS (Quadrados Mínimos Parciais), Métodos Baseados em Árvores (por exemplo, Regressão Lógica, CART, Métodos da Floresta Aleatória, Métodos de Boosting/Bagging), Modelos Lineares Generalizados (por exemplo, Regressão Logística), Métodos baseados em Componentes Principais (por exemplo, SIMCA), Modelos Aditivos Generalizados, Métodos baseados em Lógica Fuzzy, Redes Neurais e Métodos baseados em Algoritmos Genéticos.

Aqueles habilitados na técnica não terão problemas na seleção de um método apropriado para avaliar um marcador epigenético ou combinação de biomarcadores descritos nesse relatório descritivo.

Em uma modalidade, o método usado em uma correlação do estado de metilação de um marcador epigenético ou combinação de biomarcadores, por exemplo, para diagnosticar câncer hepático ou um subtipo de câncer hepático, é selecionado de DA (por exemplo, Análise Discriminante Linear, Quadrática, Regularizada), DFA, Métodos de Kernel (por exemplo, SVM), MDS, Métodos Não Paramétricos (por exemplo, k-Classificadores do Vizinho Mais Próximo), PLS (Quadrados Mínimos Parciais), Métodos Baseados em Árvores (por exemplo, Regressão Lógica, CART, Métodos da Floresta Aleatória, Métodos de Boosting) ou Modelos Lineares Generalizados (por exemplo, Regressão Logística) e Análise de Componentes Principais. Detalhes relacionados a esses métodos estatísticos são encontrados nas seguintes referências: Ruczinski e cols., 12 J. OF COMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475-511 (2003); Friedman, J.H., 84 O. OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165-75 (1989); Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, “The Elements of Statistical Learning”, Springer Série em “Statistics” (2001); Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., Stone, C.J. “Classification and Regression Trees”, Califórnia: Wadsworth (1984); Breiman, L., 45 MACHINE LEARNING 5-32 (2001); Pepe, M.S., “The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction”, Série “Oxford Statistical Science”, 28 (2003); e Duda, R.O., Hart, P.E., Stork, D.O., “Pattern Classification”, Wiley Interscience, 2º Edição (2001).

[167] En uma modalidade, os resultados correlacionados para cada painel de metilação são classificados por sua correlação com a doença ou estado positivo do tipo de tumor como, por exemplo, por teste do valor-p ou teste do valor-t ou teste-F. Os biomarcadores classificados (o primeiro melhor, ou seja, valor-p ou -t baixo) são então subsequentemente selecionados e adicionados ao painel de metilação até que certo valor diagnóstico seja alcançado. Esses métodos incluem a identificação de painéis de metilação ou, mais amplamente, genes que estavam metilados diferencialmente entre várias classes usando, por exemplo, um teste-t de variância aleatória (Wright G.W. e Simon R, Bioinformatics 19: 2.448-2.455, 2003). Outros “métodos incluem a etapa de especificação de um nível de significância para ser usado para a determinação dos marcadores epigenéticos que serão incluídos no painel de biomarcadores. São incluídos no painel marcadores epigenéticos que estão metilados diferencialmente entre as classes em um nível de significância paramétrico univariado menor do que o limiar especificado. Não importa se o nível de significância especificado é pequeno o bastante para excluir descobertas suficientemente falsas. Em alguns problemas, uma melhor predição é obtida sendo-se mais liberal sobre os painéis de biomarcadores usados como características. No entanto, em alguns casos, os painéis são biologicamente interpretáveis e clinicamente aplicáveis se menos marcadores são incluídos. Similar à validação cruzada, a seleção de biomarcadores é repetida para cada conjunto de treinamento criado no processo de validação cruzada. Isso tem o objetivo de fornecer uma estimativa não viesada do erro de predição. O painel de metilação para uso com dados de amostras de um novo paciente é aquele que resulta da aplicação da seleção de metilação e classificador da informação de metilação “conhecida”, ou painel de metilação de controle.

[168] Modelos para utilização de perfil de metilação para prever a classe de amostras futuras também podem ser usados. Esses modelos podem ter como base o Preditor Covariado Composto (Radmacher e cols. Journal of Computational Biology 9: 505-511, 2002), Análise Discriminante Linear Diagonal (Dudoit e cols. Journal of the American Statistical Association 97: 77-87, 2002), Classificação do Vizinho Mais Próximo (também Dudoit e cols.) e Máquinas de Vetor de Suporte com kernel linear (Ramaswamy e cols. PNAS USA 98:

15.149-54, 2001). Os modelos incorporaram marcadores que estavam diferencialmente metilados em certo nível de significância (por exemplo, 0,01, 0,05 ou 0,1) como avaliado pelo teste-t de variância aleatória (Wright G.W. e Simon R. Bioinformatics 19: 2.448-2.455, 2003). O erro de predição de cada modelo com o uso de validação cruzada, preferivelmente validação cruzada leave-one-out (Simon e cols. Journal of the National Cancer Institute 95: 14-18, 2003), pode ser estimado. Para cada conjunto de treinamento por validação cruzada leave-one-out, todo o processo de construção do modelo é repetido, incluindo o processo de seleção de marcador epigenético. Em alguns casos, também é avaliado se a estimativa da taxa de erro validada de forma cruzada para um modelo é significantemente menor do que seria esperado por predição aleatória. Em alguns casos, os rótulos da classe podem ser aleatoriamente permutados e todo o processo de validação cruzada leave-one-out é então repetido. O nível de significância é a proporção das permutações aleatórias que gera uma taxa de erro validada de forma cruzada que não é maior do que a taxa de erro validada de forma cruzada obtida com os dados de metilação reais.

[169] Outro método de classificação é o método de greedy- pairs descrito por Bo e Jonassen (Genome Biology 3 (4) pesquisa-0017.1-0017.11, 2002). A abordagem de greedy-pairs começa com a classificação de todos os marcadores com base em suas pontuações-t individuais no conjunto de treinamento. Esse método tenta selecionar pares de marcadores que funcionam bem juntos para discriminar as classes.

[170] Além disso, um classificador de árvore binário para utilização de perfil de metilação pode ser usado para prever a classe de amostras futuras. O primeiro nódulo da árvore incorporava um classificador binário que distinguia dois subconjuntos do conjunto total de classes. os classificadores binários individuais são feitos com base nas “Máquinas de Vetor de Suporte” que incorporam marcadores que eram expressos diferencialmente entre marcadores no nível de significância (por exemplo, 0,01, 0,05 ou 0,1), como avaliado pelo teste-t de variância aleatória (Wright G.W. e Simon R. Bioinformatics 19: 2.448-2.455, 2003). Classificadores para todas as partições binárias possíveis são avaliados e a partição selecionada é aquela para a qual o erro de predição validado de forma cruzada é mínimo. O processo é então repetido sucessivamente para os dois subconjuntos de classes determinados pela divisão binária prévia. O erro de predição do classificador de árvore binário pode ser estimado por validação cruzada de todo o processo de construção de árvores. Essa validação cruzada global inclui a resseleção das partições ótimas em cada nódulo e resseleção dos marcadores usados para cada conjunto de treinamento validado de forma cruzada como descrito por Simon e cols. (Simon e cols. Journal of the National Cancer Institute 95: 14-18 2003). É feita a validação cruzada várias vezes, em que uma fração das amostras é mantida, uma árvore binária desenvolvida nas amostras restantes, e depois o quadro de membros da classe é previsto para as amostras mantidas. Isso é repetido várias vezes, cada vez mantendo uma percentagem diferente das amostras. As amostras são particionadas aleatoriamente em conjuntos de teste fracionados (Simon R. e Lam A. “BRB-Array Tools User Guide”, versão 3.2. “Biometric Research Branch”, “National Cancer Institute”).

[171] Dessa forma, em uma modalidade, os resultados correlacionados para cada marcador b) são classificados por sua correlação correta com a doença, preferivelmente por teste do valor-p. Também é possível incluir uma etapa na qual os marcadores são selecionados d) na ordem de sua classificação.

[172] En modalidades adicionais, fatores como, por exemplo, o valor, nível, recurso, característica propriedade etc. de uma taxa de transcrição, nível de mRNA, taxa de tradução, nível de proteína, atividade biológica, característica ou propriedade celular, genótipo, fenótipo etc., podem ser adicionalmente utilizados antes, durante ou depois da administração de uma terapia a um paciente para permitir análise adicional do estado do câncer do paciente.

[173] Em algumas modalidades, um teste diagnóstico para prever corretamente o estado é comumente medido como a sensibilidade do ensaio, a especificidade do ensaio ou a área sob a curva de uma característica operada pelo receptor (“ROC”). Em alguns casos, a sensitividade é a percentagem de positivos verdadeiros que são previstos para que um teste seja positivo, enquanto a especificidade é a percentagem de negativos verdadeiros que são previstos para que um teste seja negativo. Em alguns casos, uma curva ROC fornece a sensibilidade de um teste como uma função de 1- especificidade. Quanto maior a área sob a curva ROC, por exemplo, mais preciso ou poderoso o valor preditivo do teste. Outras medições úteis da utilidade de um teste são valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. O valor preditivo positivo é a percentagem de pessoas que testam positivo que são realmente positivas. Valor preditivo negativo é a percentagem de pessoas que testam negativo que são realmente negativas.

[174] Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores revelados nesse relatório descritivo exibem uma diferença estatística em amostras diferentes de pelo menos p<0,05, p<102, p<l10-3, p<l0% ou p<l10º.

Testes diagnósticos que usam esses biomarcadores podem exibir uma ROC de pelo menos 0,6, pelo menos cerca de 0,7, pelo menos cerca de 0,8, ou pelo menos cerca de 0,9. Em alguns casos, os biomarcadores estão metilados diferencialmente em indivíduos diferentes com ou sem câncer hepático.

Em casos adicionais, os biomarcadores para diferentes subtipos de câncer hepático estão metilados diferencialmente.

Em certas modalidades, os biomarcadores são medidos em uma amostra do paciente usando os métodos descritos nesse relatório descritivo e comparados, por exemplo, com níveis predefinidos de biomarcador e são usados para determinar se o paciente possui câncer hepático, qual subtipo de câncer hepático o paciente tem, e/ou qual é o prognóstico do paciente que possui câncer hepático.

Em outras modalidades, a correlação de uma combinação de biomarcadores em uma amostra do paciente é comparada, por exemplo, com um conjunto predefinido de biomarcadores.

Em algumas modalidades, a medição (ou medições) é então comparada com uma quantidade (ou quantidades), valor (ou valores) de corte ou pontuações do modelo multivariado diagnósticas relevantes que distinguem entre a presença ou ausência de câncer hepático, entre subtipos de câncer hepático, e entre um prognóstico “bom” ou um prognóstico “ruim”. Como é bem compreendido na técnica, por ajuste do valor (ou valores) de corte diagnóstico particular usado em um ensaio, pode-se aumentar a sensibilidade ou especificidade do ensaio diagnóstico,

dependendo da preferência do profissional responsável pelo diagnóstico. Em algumas modalidades, o valor de corte diagnóstico particular é determinado, por exemplo, por medição da quantidade de hipermetilação ou hipometilação do biomarcador em um número estatisticamente significante de amostras de pacientes com ou sem câncer hepático e de pacientes com diferentes subtipos de câncer hepático, e ajustando-se o valor de corte para se adaptar aos níveis desejados de especificidade e sensibilidade. Kits/artigo manufaturado

[175] En algumas modalidades, são fornecidos nesse relatório descritivo include para detecção e/ou caracterização do perfil de metilação de um biomarcador descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, o kit compreende diversos iniciadores ou sondas para detectar ou medir o estado/níveis de metilação de uma ou mais amostras. Esses kits compreendem, em alguns casos, pelo menos um polinucleotídeo que hibridiza para pelo menos uma das sequências de marcador de metilação descritas nesse relatório descritivo e pelo menos um reagente para detecção de metilação gênica. Reagentes para detecção de metilação incluem, por exemplo, bissulfato de sódio, polinucleotídeos projetados para hibridizar para a sequência que é o produto de uma sequência de marcador caso a sequência de marcador não esteja metilada (por exemplo, contendo pelo menos uma conversão C-U), e/ou uma enzima de restrição metilação- sensível ou metilação-dependente. Em alguns casos, os kits fornecem suportes sólidos na forma de um aparelho de ensaio que está adaptado para ser usado no ensaio. Em alguns casos, os kits ainda compreendem marcadores detectáveis,

opcionalmente ligados a um polinucleotídeo, por exemplo, uma sonda, no kit.

[176] Em algumas modalidades, os kits compreendem um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou mais) polinucleotídeos diferentes (por exemplo, iniciadores e/ou sondas) capazes de amplificar especificamente pelo menos uma porção de uma região do DNA de um biomarcador descrito nesse relatório descritivo. Opcionalmente, um ou mais polipeptídeos marcados de forma detectável capazes de hibridização para a porção amplificada também são incluídos no kit. Em algumas modalidades, os kits compreendem suficiente iniciadores para amplificar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais regiões do DNA diferentes ou porções destas e, opcionalmente, incluem polinucleotídeos marcados de forma detectável capazes de hibridizar para cada região do DNA amplificada ou porção desta. Os kits podem ainda compreender uma enzima de restrição metilação-dependente ou metilação-sensível e/ou bissulfito de sódio.

[177] Em algumas modalidades, os kits compreendem bissulfito de sódio, iniciadores e adaptadores (por exemplo, oligonucleotídeos que podem ser ligados ou de algum outro modo unidos aos fragmentos genômicos) para amplificação do genoma completo, e polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos marcados de forma detectável) para quantificar a presença da sequência metilada convertida e/ou da sequência não metilada convertida de pelo menos uma citosina de uma região de DNA de um marcador epigenético descrito nesse relatório descritivo.

[178] Em algumas modalidades, os kits compreendem enzimas de restrição que percebam a metilação (por exemplo, uma enzima de restrição metilação-dependente e/ou uma enzima de restrição metilação-sensível), iniciadores e adaptadores para amplificação do genoma completo, e polinucleotídeos para quantificar o número de cópias de pelo menos uma porção de uma região do DNA de um marcador epigenético descrito nesse relatório descritivo.

[179] En algumas modalidades, os kits compreendem uma porção de ligação à metilação e um ou mais polinucleotídeos para quantificar o número de cópias de pelo menos uma porção de uma região de DNA de um de um marcador descrito nesse relatório descritivo. O termo “porção de ligação à metilação” se refere a uma molécula (por exemplo, um polipeptídeo) que se liga especificamente à metilcitosina.

[180] Exemplos incluem enzimas de restrição ou fragmentos destas que não possuem atividade de corte de DNA, mas retêm a habilidade para se ligar ao DNA metilado, anticorpos que se ligam especificamente ao DNA metilado etc.).

[181] Em algumas modalidades, o kit inclui um material de embalagem. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “material de embalagem” pode se referir a uma estrutura física que abriga os componentes do kit. Em alguns casos, o material de embalagem mantém a esterilidade dos componentes do kit, e é feito de material comumente usado para essas finalidades (por exemplo, papel, fibra ondulada, vidro, plástico, folha metálica, ampolas etc.). Outros materiais úteis no desempenho dos ensaios são incluídos nos kits, incluindo tubos de ensaio, pipetas de transferência e semelhantes. Em alguns casos, os kits também incluem instruções escritas para o uso de um ou mais desses reagentes em qualquer um dos ensaios descritos nesse relatório descritivo.

[182] Em algumas modalidades, os kits também incluem um agente de tamponamento, um conservante ou um agente estabilizante de proteína/ácido nucleico. Em alguns casos, os kits também incluem outros componentes de uma mistura de reação, como descrito nesse relatório descritivo. Por exemplo, os kits incluem uma ou mais alíquotas de DNA polimerase termoestável, como descrito nesse relatório descritivo, e/ou um ou mais alíquotas de dNTPs. Em alguns casos, os kits também incluem amostras de controle de quantidades conhecidas de moléculas de DNA de modelo que abrigam os alelos individuais de um lócus. Em algumas modalidades, o kit inclui uma amostra de controle negativo, por exemplo, uma amostra que não contém moléculas de DNA que abrigam os alelos individuais de um lócus. Em algumas modalidades, o kit inclui uma amostra de controle positivo, por exemplo, uma amostra que contém quantidades conhecidas de um ou mais dos alelos individuais de um lócus.

Certas terminologias

[183] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados como comumente compreendidos por aqueles habilitados na técnica à qual o tema reivindicado pertence. Deve ser subentendido que a descrição geral apresentada anteriormente e a descrição detalhada seguinte são apenas exemplares e explanatórias, e não são restritivas de qualquer tema reivindicado. Nesse pedido, o uso do singular inclui o plural, salvo quando especificamente declarado em contrário. Deve ser observado que, como usadas no relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes no plural, salvo quando o contexto determine claramente o contrário. Nesse pedido, o uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que estabelecido de forma diferente. Além disso, uso do termo “que inclui”, bem como outras formas, por exemplo, “incluem”, “inclui” e “incluído”, não é limitante.

[184] Como usadas nesse relatório descritivo, faixas e quantidades podem ser expressas como “cerca de” um valor ou faixa particular. “Cerca de” também inclui a quantidade exata. Dessa forma, “cerca de 5 ul”, significa “cerca de 5 ul”, e também “5 ul”. Geralmente, o termo “cerca de” inclui uma quantidade que seria esperada que estivesse dentro do erro experimental.

[185] Os cabeçalhos de seções usados nesse relatório descritivo são apenas para fins organizacionais, e não devem ser considerados como limitantes do tema descrito.

[186] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “indivíduo (indivíduos)”, “pessoa (pessoas)” e “paciente (pacientes)” significa qualquer mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um não humano. Nenhum dos termos exige ou está limitado às situações caracterizadas pela supervisão (por exemplo, constante ou intermitente) de um profissional de saúde (por exemplo, um médico, uma enfermeira formada, uma auxiliar de enfermagem, o assistente de um médico, um servidor ou um funcionário de um abrigo).

[187] Un “sítio” corresponde a um único sítio que, em alguns casos, é uma única posição de base ou um grupo de posições de bases correlacionadas, por exemplo, um sítio CcpG. Um “lócus” corresponde a uma região que inclui múltiplos sítios. Em alguns casos, um lócus inclui um sítio.

EXEMPLOS

[188] Esses exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos, e não para limitar o escopo das reivindicações fornecidas nesse relatório descritivo.

Exemplo 1

[189] O câncer de pulmão (LUNC) e o carcinoma hepatocelular (HCC) são causas de mortes por câncer importantes em todo o mundo. Como com muitos cânceres, LUNC e HCC descobertos em um estágio inicial implicam em um prognóstico bem melhor, comparados com doença em estágio avançado, em parte em função da eficácia relativa de tratamentos locais, comparados com a terapia sistêmica. Em alguns casos, a detecção precoce possui o potencial para redução da mortalidade.

[190] À metilação de DNA é um regulador epigenético da expressão gênica que normalmente resulta em silenciamento gênico. No câncer, a metilação de DNA está tipicamente aumentada em genes supressores de tumor e se apresenta como uma das primeiras alterações neoplásicas. O DNA tumoral circulante (ctDNA) compreende fragmentos de ácidos nucleicos extracelulares liberados no plasma por meio de necrose da célula tumoral, apoptose e liberação ativa de DNA. Em alguns casos, ctDNA que possui padrões de metilação câncer- específicos é usado como um biomarcador no diagnóstico de cânceres.

Dados de pacientes

[191] Dados de metilação de DNA tecidual foram obtidos do “The Cancer Genome Atlas” (TCGA). Conjuntos de dados clínicos, moleculares e histopatológicos completos estão disponíveis na página da Internet do TCGA. Instituições individuais que contribuíram com amostras coordenaram o processo de autorização e obtiveram autorização informada por escrito de cada paciente de acordo com seus respectivos conselhos de revisão institucionais.

[192] Un segundo coorte chinês independente consistiu em 654 pacientes com LUNC e 654 pacientes com HCC no “Sun Yat- sen University Cancer Center” em Guangzhou, no “Xijing Hospital” em Xi'an e no “West China Hospital” em Chengdu, China. Pacientes que se apresentaram com LUNC e HCC de estágio I-IV foram selecionados e incluídos nesse estudo. As características do paciente e as características do tumor estão resumidas na Tabela Sl. A classificação de estadiamento de TNM para LUNC e HCC está de acordo com a 7º Edição do manual de estadiamento de câncer do AJCC (Edge, S.B., e Compton, C.C. (2010). “The American Joint Committee on Cancer: the 7th Edition of the Cancer Staging Manual of the AJCC and the future of TNM”. Annals of Surgical Oncology 17,

1.471-1.474). Esse projeto foi aprovado pelos IRBs de “Sun Yat-sen University Cancer Center”, “Xijing Hospital” e “West China Hospital”. Autorização informada foi obtida de todos os pacientes. Tecidos do tumor e normais foram obtidos como clinicamente indicado para assistência ao paciente e foram retidos para esse estudo. Amostras de sangue humano foram coletadas por punção venosa e amostras de plasma foram obtidas por retirada do sobrenadante após centrifugação e armazenadas a -80ºC antes da extração de cfDNA. Fontes de dados

[193] Dados de metilação de DNA de 485.000 sítios gerados usando o “Infinium 450K Metilation Array” foram obtidos do

TCGA e um conjunto de dados gerados pelo estudo Hannum, G., e cols. (2013) “Genome-Wide Metilation Profiles Reveal Quantitative Views of Human Aging Rates”, Mol. Cell 49, 359- 367 (GSE40279), no qual perfis de metilação de DNA para HCC e sangue foram analisados. Foram gerados arquivos no formato IDAT dos dados de metilação contendo os valores de proporção de cada micropartícula escaneada. Usando a suíte de aplicativos Minfi de Bioconductor, esses arquivos de dados foram convertidos em uma pontuação, denominada um valor Beta. Os valores de metilação do coorte chinês foram obtidos por sequenciamento direcionado de bissulfato usando uma sonda de inversão molecular e analisados como descrito abaixo. Análise estatística Pré-seleção de marcador de metilação de DNA para análise diagnóstica e prognóstica

[194] Uma análise de metilação diferencial em dados do TCGA foi realizada usando uma abordagem de “contração moderada de estatística-t” e o valor-p para cada marcador foi então corrigido por testagem múltipla pelo procedimento de Benjamini-Hochberg para controlar FDR em um nível de significância de 0,05. A lista foi classificada por valor-p ajustado e selecionados os 1.000 marcadores principais para o design de sondas-cadeado para diferenciação de câncer (tanto LUNC quanto HCC) versus amostras normais e um grupo separado de 1.000 marcadores para diferenciação de LUNC versus HCC (Fig. 1). Foram obtidas cerca de 1.673 sondas- cadeado que geraram sinais de amplificação por PCR positivos e específicos e elas foram, portanto, usadas como sondas de captura nos experimentos subsequentes em amostras de cfDNA. Amostras de cfDNA com baixa qualidade ou menos do que 30.000 leituras por amostra também foram eliminadas. Cerca de 2.173 amostras de cfDNA foram incluídas em nosso estudo (654 amostras de sangue de LUNC e 654 amostras de sangue de HCC e 865 amostras de sangue normais). Leituras metiladas para cada marcador foram definidas como leituras metiladas únicas totais e valores de metilação para cada marcador foram definidos como a proporção de contagens de leitura com metilação dividida por contagens de leituras totais. Para marcadores de metilação particulares com menos do que 20 leituras únicas, foi usado um valor de metilação médio imputado de HCC ou controles saudáveis normais. Construção de um modelo diagnóstico Construção da característica de cfDNA e MCB

[195] Sondas-cadeado foram projetadas para englobar

2.000 sítios de metilação CpG que foram considerados como metilados diferencialmente em comparação entre tanto LUNC quanto HCC versus sangue, e entre LUNC e HCC. A captura e sequenciamento foram realizados em amostras de cfDNA convertido com bissulfato. O conceito de MCBs foi usado para unificar marcadores CpG proximais em um MCB, resultando em um total de 888 MCBs. Para cada MCB, o valor de metilação MCB-específico foi quantificado como loglOo (contagem de leitura metilada total +1), usando a transformada log para reduzir efeitos aberrantes. Construção de classificador diagnóstico baseado em cfDNA

[196] Dados das amostras de cfíDNA obtidos de pacientes diagnosticados com câncer hepático (HCC), câncer de pulmão (LUNC) e controles normais foram divididos em coortes de treinamento e de validação. As amostras foram excluídas caso tivessem menos do que 30.000 leituras únicas totais. Das amostras restantes com leituras suficientes para assegurar uma boa representação de MCBs, selecionamos 654 de cada uma das amostras de câncer de pulmão e do fígado, e 865 amostras saudáveis para assegurar um conjunto de dados equilibrado. O conjunto de dados inteiro foi dividido aleatoriamente com uma proporção de 2:1 para formar os coortes de treinamento e de validação.

[197] MCBs que exibiram boas faixas de metilação através das amostras de cfDNA foram selecionados. Além disso, um teste-t de duas amostras foi usado para identificar MCBs com a maior diferença absoluta média padronizada de leituras metiladas de um MCB entre amostras de câncer (LUNC ou HCC) versus amostras de controles normais. Os principais MCBs foram escolhidos de acordo com os valores-p ranqueados que ainda eram significantes após correção por testagem múltipla e construído um modelo de predição diagnóstica usando os 100 marcadores principais. O painel de MCBs foi agregado em uma pontuação composta (pontuação-cad) para realizar uma classificação binária pareada entre LUNC e normal, HCC e normal e LUNC e HCC. A pontuação composta foi gerada por um modelo de regressão logística polinômica usando os 50 MCBs principais por comparação.

[198] O nível de metilação pré-tratamento ou inicial foi obtido no diagnóstico inicial, e o nível pós-tratamento foi avaliado aproximadamente 2 meses após tratamento, em que o tratamento se refere a quimioterapia ou ressecção cirúrgica do tumor. O desfecho primário (incluindo resposta ao tratamento: doença progressiva (PD), resposta parcial (PR) e doença estável (SD)) foi definido de acordo com as diretrizes de RECIST (Eisenhauer e cols., 2009). Para pacientes tratados com remoção cirúrgica e nenhuma recorrência no momento de avaliação, pressupomos que tiveram resposta completa (CR). A diferença de distribuição da pontuação-cd entre categorias clínicas foi examinada por teste-t unilateral, já que a pontuação-cd demonstrou ser distribuída não normalmente usando um teste de Shapiro-Wilk. Construção de um modelo preditivo para prognóstico e sobrevida

[199] O potencial para usar um sistema de pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) foi investigado com base em leituras de metilação totais em ctDNA para predição de prognóstico em LUNC e HCC em combinação com características clínicas e demográficas que incluem idade, sexo e estágio de AJCC. Para cada tipo de câncer, dois terços das "observações foram selecionados aleatoriamente do conjunto de dados completo como o coorte de treinamento, e o resto tratado como o coorte de validação. A seleção de variáveis foi realizada no coorte de treinamento e construída a pontuação composta no coorte de validação. Dentro do coorte de treinamento, o esquema de “Lasso randomizado” foi adotado (Meinshausen, N., e Buhlmann, P. (2010) “Stability Selection. Journal of the Royal Statistical Society: Series B” (“Statistical Methodology”) 72, 417-473) para reduzir a dependência da amostragem para estabilizar a seleção de variáveis a fim de selecionar biomarcadores com uma confiança elevada. O coorte com uma proporção de 2:1 foi dividido aleatoriamente. O procedimento de seleção de variáveis foi realizado inicialmente nos dois terços do coorte de treinamento e depois usado no coorte de um terço restante para realizar um teste de validação interna dentro do mesmo coorte de treinamento.

O procedimento de seleção de variáveis foi realizado da seguinte forma, Primeiro, um modelo de regressão de Cox univariada foi usado para remover ruído excessivo e selecionado qualquer biomarcador com valor-p menor ou igual a 0,05 com base no teste de Wald.

Segundo, LASSO foi implementado com um parâmetro de ajuste ótimo determinado pelo erro de generalização esperado pela validação cruzada de 10 vezes ou pela informação baseada em critérios AIC/BIC, aquilo que gerasse o maior pº (a proporção de aleatoriedade explicada) com os biomarcadores selecionados.

O poder discriminatório na regressão de Cox dos biomarcadores selecionados foi ainda avaliado no coorte de validação interna usando a probabilidade de concordância (também conhecida como índice-C). Em HCC, tanto Pp? (Mediana 0,773; quartil: 0,722-0,838) e índice-C (Mediana: 0,768; quartil: 0,728-0,796) demonstraram o potencial de biomarcadores em um coorte de validação interna.

Similarmente em LUNC, tanto p? (Mediana: 0,737; quartil: 0,636-0,793) e índice-C (0,614; quartil: 0,585-0,650) demonstraram utilidade clínica potencial de biomarcadores

Os biomarcadores apresentados em pelo menos 30 das 100 rodadas foram agregados, o que resultou em 10 marcadores em HCC e 12 marcadores em LUNC (Tabela 3). Para avaliar a previsibilidade de cada painel externamente, foi obtida uma pontuação composta para cada paciente no coorte de validação por multiplicação das estimativas do coeficiente não enviesado da regressão de Cox e das leituras de metilação.

Uma curva de Kaplan-Meier e um teste do log-rank foram gerados usando a pontuação composta dicotomizada, que formou uma designação de afiliação a um grupo de alto risco e de baixo risco de acordo com sua mediana. Essa segmentação era compatível com aquela formada por estágio de AJCC. ROC tempo- dependente foi usada para resumir o potencial de discriminação da pontuação composta, estágio de AJCC e a combinação de dois, com curvas ROC variando em função do tempo e acomodando dados censurados. Finalmente, um modelo de regressão de Cox multivariada foi ajustado para avaliar a significância de fatores de risco potenciais. Toda a testagem de hipótese foi bilateral com valor-p < 0,05 considerado como estatisticamente significante. Toda a análise foi efetuada em R versão 3.2.3 com os seguintes pacotes usados: "glmnet', "*pROC', "*limma', 'sobrevida', *sobrevida-ROC', 'survcomp'. Extração de DNA tumoral

[200] A extração de DNA genômico de tecidos saudáveis ou de câncer recém congelados foi realizada com o “QIAamp DNA Mini Kit” (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Aproximadamente 0,5 mg de tecido foi usado para obter na média 5 ug de DNA genômico. DNA foi armazenado a - 20ºC e analisado dentro de uma semana de preparação. Extração de DNA de amostras de FFPE

[201] DNA genômico de amostras de FFPE congeladas foi extraído usando o “QIAamp DNA FFPE Tissue Kit” com várias modificações. As amostras de DNA foram armazenadas a -20ºC para análise posterior. Extração de DNA livre de células de amostras de plasma

[202] A extração de cfDNA de 1,5 ml de amostras de plasma foi realizada com o “QIAamp cfDNA Kit” (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Conversão com bissulfito de DNA genômico

[203] Cerca de 10 ng de cfDNA foram convertidos em bis- DNA usando o “EZ DNA Metilation-Lightning" Kit” (Zymo Research) de acordo com o protocolo do fabricante. O bis-DNA resultante tinha uma distribuição de tamanho de aproximadamente 200-3.000 pb, com um pico em torno de aproximadamente 500-1.000 pb. A eficiência da conversão com bissulfito foi de >99,8%, como verificado por sequenciamento profundo de bis-DNA e análise da proporção de conversão de C para T de dinucleotídeos CH (não-CG).

Determinação de níveis de metilação de DNA por sequenciamento profundo de Dbis-DNA capturado com sondas de inversão molecular (cadeado)

[204] Marcadores de CpG cujos níveis de metilação diferiam significantemente em qualquer uma das comparações entre qualquer tecido de câncer e sangue normal foram usados para o design de sondas-cadeado para captura e sequenciamento de cfDNA. A captura por cadeado de bis-DNA foi baseada na técnica em métodos publicados com modificações (Deng, J., Shoemaker, R., Xie, B., Gore, A., LeProust, E.M., Antosiewicz-Bourget, J., Egli, D., Maherali, N., Park, I.H., Yu, J., e cols. (2009). “Targeted Bisulfite Sequencing Reveals Changes in DNA Methylation Associated with Nuclear Reprogramming”. Nat. Biotechnol. 27, 353-360; Diep, D., Plongthongkum, N., Gore, A., Fung, H.L., Shoemaker, R., e Zhang, K. (2012). “Library-Free Methylation Sequencing with Bisulfite Padlock Probes”. Nat. Methods 9, 270-272; Porreca, G.J., Zhang, K., Li, J.B., Xie, B., Austin, D., Vassallo, S.L., LeProust, E.M., Peck, B.J., Emig, C.J., Dahl, F., e cols. (2007). “Multiplex Amplification of Large Sets of Human Exons”. Nat. Methods 4, 931-936).

Design e síntese de sondas

[205] Sondas-cadeado foram projetadas usando o software ppDesigner. O comprimento médio da região capturada foi de 100 pb, com o marcador CpG localizado na porção central da região capturada. A sequência vinculadora entre braços continha sequências de ligação para iniciadores de amplificação separadas por um trecho variável de Cs para produzir sondas de comprimento igual. Uma sequência de identificador molecular único de 6-pb (UMI) foi incorporada no design de sondas para permitir a identificação de eventos de captura molecular individual únicos e a pontuação precisa de níveis de metilação de DNA.

[206] As sondas foram sintetizadas como oligonucleotídeos separados usando métodos de síntese comerciais padronizados (ITD). Para experimentos de captura, as sondas foram misturadas, fosforiladas in vitro com T4 PNK (NEB) de acordo com as recomendações do fabricante e purificadas usando colunas P-30 Micro Bio-Spin (Bio-Rad). Captura de bis-DNA

[207] Cerca de 10 ng de DNA convertido com bissulfito foram misturados com sondas-cadeado em reações de 20 ul contendo 1X tampão Ampligase (Epicentre). Para anelar as sondas ao DNA, uma desnaturação de 30 segundos a 95ºC foi seguida por um resfriamento lento até 55ºC em uma taxa de 0,02ºC por segundo. A hibridização foi deixada para completar por 15 horas a 55ºC. Para preencher lacunas entre braços anelados, 5 ul da mistura seguinte foram adicionados a cada reação: 2 U de PfuTurboCx polimerase (Agilent), 0,5 U de Ampligase (Epicentre) e 250 pmol de cada dNTP em 1X tampão Ampligase. Após incubação de 5 horas a 55ºC, as reações foram desnaturadas por 2 minutos a 94ºC. 5 1ul de mistura de exonucleases (20 U de Exo I e 100 U de ExoIII, ambas de Epicentre) foram adicionados, e a degradação de DNA de fita simples foi realizada a 37ºC por 2 horas, seguida por inativação enzimática por 2 minutos a 94ºC.

[208] Produtos circulares de captura sítio-específica foram amplificados por PCR com codificação de barras concomitante de amostras separadas. A amplificação foi realizada usando iniciadores específicos para DNA vinculador dentro de sondas-cadeado, um das quais continha códigos de barras específicos de 6 pb. Ambos os iniciadores continham sequências adaptadoras de sequenciamento de geração próxima Illumina. PCR foi feita da seguinte forma: 1X Phusion Flash Master Mix, 3 ul de DNA capturado e 200 nM de iniciadores, usando o seguinte ciclo: 10 s a 98ºC, 8X de (1 s a 98ºC, 5 s a 58ºC, 10 s a 72ºC), 25X de (1 s a 98ºC, 15 s a 72ºC), 60 s a 72ºC. As reações de PCR foram misturadas e a biblioteca resultante foi selecionada por tamanho para incluir capturas eficazes (aproximadamente 230 pb) e excluir capturas “vazias” (aproximadamente 150 pb) usando micropartículas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter). A pureza das bibliotecas foi verificada por PCR usando iniciadores adaptadores de célula de fluxo de Illumina (P5 e P7) e as concentrações foram determinadas usando o ensaio “Qubit dsDNA HS” (Thermo Fisher). As bibliotecas foram sequenciadas usando sistemas MiSeq e HiSeg2500 (Illumina).

Otimização da uniformidade da cobertura de captura

[209] O sequenciamento profundo dos experimentos-pilotos de captura originais mostrou diferenças significantes entre número de leituras capturadas pela maioria das sondas eficientes e sondas não eficientes (60-65% de regiões capturadas com cobertura >0,2x da média). Para melhorar isso, as eficiências relativas foram calculadas a partir de dados de sequenciamento e as sondas foram misturadas em proporções molares ajustadas. Isso aumentou a uniformidade de captura para 85% de regiões em > 0,2x de cobertura média. Análise de dados de sequenciamento

[210] O mapeamento de leituras de sequenciamento foi feito usando a ferramenta de software bisReadMapper com algumas modificações. Primeiro, UMI foram extraídos de cada leitura de sequenciamento e anexados aos cabeçalhos de leitura dentro de arquivos FASTO usando um script customizado. As leituras foram convertidas on-the-fly como se todos os C fossem não metilados e mapeadas para fitas de DNA do genoma humano convertidas in silico, também como se todos os C fossem não metilados, usando Bowtie2. As leituras originais foram mescladas e filtradas para um UMI único, ou seja, leituras que carregam o mesmo UMI foram descartadas deixando uma leitura única, simples. As frequências de metilação foram calculadas para todos os dinucleotídeos CpG contidos dentro das regiões capturadas por sondas-cadeado por divisão dos números de leituras únicas que carregam um C na posição interrogada pelo número total de leituras que cobrem a posição interrogada. Identificação de Blocos de Metilação Correlacionada (BCM)

[211] Os coeficientes de correlação de Pearson entre as frequências de metilação de cada par de marcadores CpG separados por, no máximo, 200 pb foram calculados separadamente através de 50 amostras de cfDNA de cada uma das duas categorias diagnósticas, por exemplo, sangue normal e HCC. Um valor de r de Pearson < 0,5 foi usado para identificar limites entre marcadores adjacentes com metilação não correlacionada. Marcadores não separados por uma fronteira foram combinadas em Blocos de Metilação Correlacionada (MCBs). Esse procedimento identificou um total de aproximadamente 1.550 BCMs em cada categoria diagnóstica dentro dos dados de nosso cadeado, combinando entre 2 e 22 posições de CpG em cada bloco. As frequências de metilação para todos os BCMs foram calculadas por soma dos números de Cs em todas as posições de CpG interrogadas dentro de um BCM e dividindo-se pelo número total de C+Ts naquelas posições Isolamento e PCR digital quantitativa de DNA

[212] Amostras do tumor e de plasma correspondentes foram obtidas de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica do tumor; amostras foram congeladas e conservadas a -80ºC até o uso. O isolamento de DNA e RNA de amostras foi realizado usando o “AllPrep DNA/RNA Mini Kit” e um kit de extração de CÍDNA, respectivamente (Qiagen, Valencia, CA). Características do paciente e da amostra

[213] Características clínicas e perfis moleculares de metilação de DNA foram coletados para 827 amostras tumorais de LUNC e 377 amostras tumorais de HCC do “Cancer Genome Atlas” (TCGA) e 754 amostras normais de um conjunto de dados usado no estudo de metilação sobre o envelhecimento (GSE40279) (Hannum, G., e cols. (2013). “Genome-Wide Methylation Profiles Reveal Quantitative Views of Human Aging Rates”. Mol. Cell 49, 359-367). Dois coortes de pacientes foram estudados. O primeiro coorte era de tumores sólidos do TCGA e o segundo coorte era de amostras de cfDNA da China. Para estudar ctDNA em LUNC e HCC, amostras de plasma foram obtidas de 2.173 pacientes chineses com HCC ou LUNC e uma população selecionada aleatoriamente de controles saudáveis compatíveis submetidos a uma assistência médica de manutenção de rotina, resultando em um coorte de 654 pacientes com LUNC e 654 pacientes com HCC e 865 controles saudáveis “normais. Todos os participantes forneceram autorização informada por escrito. Características clínicas de todos os pacientes e controles estão listadas na Tabela

4. Identificação de marcadores de metilação que diferenciam LUNC e HCC e sangue

[214] Foi formulada a hipótese de que, na medida em que CÍDNA que se origina de células tumorais é detectado em um nível de fundo de cfDNA liberado predominantemente por leucócitos, marcadores CpG com uma diferença máxima em valores de metilação entre LUNC ou HCC versus leucócitos normais demonstram diferenças de metilação detectáveis no CÍDNA de pacientes com HCC ou LUNC, quando comparado com aquele de controles normais. Para identificar supostos marcadores, dados de metilação derivados de DNA de tecido de câncer do TCGA foram comparados com sangue normal, incluindo 827 amostras de sangue LUNC, 436 de HCC e 754 de controles saudáveis. A fim de identificar sítios de DNA com taxas de metilação significantemente diferentes entre LUNC ou HCC e sangue normal, uma estatística-t com Bayes Empírico para contração da variância foi usada e os 1.000 marcadores principais foram selecionados, usando o procedimento de Benjamini-Hochberg para controlar a FDR em um nível de significância de 0,05. O agrupamento hierárquico não supervisionado desses 1.000 marcadores principais foi capaz de distinguir entre LUNC, HCC e sangue normal (Fig. 6). Cerca de 2.000 sondas de inversão molecular (cadeado) que correspondem a esses 2.000 marcadores para captura- sequenciamento de cfDNA do plasma foram projetadas. Estrutura do bloco de metilação para precisão aumentada da chamada de alelo

[215] O conceito bem estabelecido de desequilíbrio de ligação genética (bloco LD) (Reich, D.E., e cols., (2001) “Linkage Disequilibrium in the Human Genoma. Nature 411, 199-204) foi empregado para estudar o grau de cometilação entre diferentes fitas de DNA, com o pressuposto subjacente de que sítios de DNA muito próximos têm maior probabilidade de ser cometilados do que sítios distantes. Leituras de sequenciamento com extremidades pareadas de Illumina foram usadas para identificar cada bloco de metilação individual (mBloco), e foi aplicado um método de correlação de Pearson para quantificar cometilação ou mBloco. Todos os mBlocos comuns de uma região foram compilados por cálculo de diferentes frações de mBloco. O genoma é dividido em blocos de sítios CpG firmemente cometilados que denominamos blocos de metilação correlacionada (MCBs), usando um valor de corte rº de 0,5, normalmente empregado em uma análise de desequilíbrio de ligação genética. MCBs foram pesquisados em CfDNA de 500 amostras normais e foi verificado que MCBs são altamente consistentes. Os níveis de metilação dentro de um MCB em cfDNA de 500 amostras de LUNC e 500 de HCC foram determinados, em adição a 500 amostras normais. Similar ao caso de um bloco LD, foi verificado que o padrão de metilação dentro de um MCB era consistente, quando se comparam amostras de cfDNA normais versus de HCC e LUNC, o que aumentava significantemente a precisão da chamada de alelo (Fig. 7). Portanto, os valores de MCB são usados para todas as análises subsequentes. Após filtragem dos MCBs com uma faixa de metilação dinâmica baixa para excluir MCBs não informativos (<5% em todas as amostras de cfDNA), 2.000 sítios de metilação CpG metilados diferencialmente foram mesclados em 888 MCBs (Fig. 7). Veja também o Anexo A. Modelo de predição diagnóstica de ctDNA para LUNC e HCC

[216] Os valores de metilação dos 888 MCBs selecionados que exibiram boas faixas de metilação em amostras de cfDNA (Fig. 7B) foram analisados por teste-t de duas amostras para identificar marcadores que geraram a diferença absoluta média padronizada máxima de leituras de metilação para cada marcador entre amostras de câncer (LUNC e HCC) versus amostras de controles normais. Os principais 100 MCBs mais significantes diferencialmente metilados classificados por valor-p ajustado após controle da taxa de erro de famílias foram escolhidos para construir um modelo de predição diagnóstica. O agrupamento hierárquico não supervisionado desses MCBs por amostra mostrado na Figura 8A e o valor metilado de cada MCB selecionado por tipo de tumor mostrado na Figura 9. Para comparação, o agrupamento hierárquico de todos os MCBs é mostrado na Figura 8B. Esse painel de 100 MCB é usado para gerar uma pontuação composta (pontuação-cd) a fim de realizar uma classificação binária pareada entre LUNC e normal, HCC e normal, e LUNC e HCC. A pontuação composta foi obtida de um modelo de regressão logística polinômica usando os 50 MCBs principais por comparação. O conjunto de dados completo foi dividido aleatoriamente com uma proporção de 2:1 para formar coortes de treinamento e de validação. O sistema de pontuação com o uso de 436 amostras de cfDNA LUNC, 436 de HCC e 576 amostras de cfDNA de controles normais foi treinado e depois validou o sistema de pontuação em 218 amostras de LUNC, 218 de HCC e 289 amostras normais. A aplicação do modelo gerou uma sensibilidade de 85,8% para HCC e 80,3% para LUNC, e uma especificidade de 88,2% para o conjunto de dados de validação (Tabela 1 A). Também foi verificado que esse modelo diferenciaria com sucesso amostras de LUNC e HCC de controles normais no coorte de validação (AUC normal = 0,957, AUC LUNC = 0,937, AUC HCC = 0,974) (Figura 2A, Tabela 1B, Tabela 1C). O agrupamento hierárquico não supervisionado desses 50 MCBs foi capaz de distinguir HCC e LUNC de controles normais com especificidade e sensibilidade elevadas (Figura 2C e 2D).

[217] À pontuação-cd do modelo para diferenciação entre doenças do fígado (infecção por HBV/HCV, cirrose e fígado gorduroso) e HCC foi avaliada, na medida em que essas doenças do fígado são reconhecidamente fatores de risco importantes para HCC. Foi verificado que a pontuação-cd foi capaz de diferenciar pacientes com HCC daqueles com doenças do fígado ou controles saudáveis (Figura 3A). Esses resultados eram consistentes e comparáveis com aqueles previstos por níveis de AFP em HCC (Figura 3B). A pontuação diagnóstica composta também poderia diferenciar entre pacientes com LUNC e pacientes sem LUNC com uma história de tabagismo (> 1 maço/dia por dez anos) que estavam em um risco aumentado de LUNC (Figura 3C).

Marcadores de metilação previram resposta ao tratamento e estadiamento da carga tumoral

[218] À utilidade da pontuação-cd na avaliação da resposta ao tratamento, da presença de tumor residual após tratamento, e estadiamento de LUNC e HCC foi estudada.

Em LUNC, as pontuações-cd de pacientes com tumor residual detectável após tratamento (n = 513) foram significantemente maiores do que aqueles sem tumor detectável (n = 126) (p= 0,002, Figs. 4A e 10B). Similarmente, houve uma boa correlação entre as pontuações-cd e estágio do tumor.

Pacientes com doença em estágio inicial (IL, II) tiveram pontuações-cd substancialmente menores, comparados — com aqueles com doença em estágio avançado (III, IV) (p=0,016, Fig. 4B). Além disso, as pontuações-cd foram significantemente menores em pacientes com ressecção completa do tumor depois da cirurgia (n = 124), comparadas com aquelas antes da cirurgia (n = 59), embora tenham ficado maiores em pacientes com recorrência (n = 48) (p< 0,01, Fig. 3C). Além disso, as pontuações-cd estavam significantemente maiores em pacientes antes do tratamento (n = 59) ou com progressão (n = 120), comparados com aqueles com uma resposta positiva ao tratamento (n = 277) (p< 0,001, Fig. 4D). Em HCC, as pontuações-cd de pacientes com tumor residual detectável após tratamento (n = 495) foram significantemente maiores do que aqueles sem tumor detectável (n = 156) (p<0,0001, Fig. 4E). Similarmente, houve uma correlação altamente positiva entre pontuações-cd e estágio do tumor.

Pacientes com doença em estágio inicial (II, II) tiveram pontuações-cd substancialmente menores, comparados — com aqueles com doença em estágio avançado (III, IV) (p<0,001, Fig. 3F). Além disso, as pontuações-cd foram significantemente menores em pacientes com ressecção completa do tumor depois da cirurgia (n = 146), comparadas com aquelas antes da cirurgia (n = 72), embora tenham ficado maiores em pacientes com recorrência (n = 72) (p= 0,036 Fig. 3G). Além disso, as pontuações-cd estavam significantemente maiores em pacientes antes do tratamento (n = 72) ou com progressão (n = 245), comparados com aqueles com resposta ao tratamento (n = 105) (p< 0,001, Fig. 4H) Fomos capazes de obter alterações dinâmicas longitudinais seriais de valores de metilação em vários indivíduos com LUNC ou pacientes com HCC a fim de monitorar a resposta ao tratamento e foi verificado que houve uma correlação elevada entre valores de metilação e resultados finais do tratamento (Figs. 10, 11 e 12). Coletivamente, esses resultados sugerem que a pontuação-cd (ou seja, a quantidade de ctDNA no plasma) está altamente correlacionada com a carga tumoral e pode ter utilidade para previsão da resposta do tumor e para vigilância para detectar recorrência. Utilidade de modelo de predição diagnóstica de ctDNA e AFP.

[219] En alguns casos, o biomarcador sanguíneo para avaliação de risco e vigilância de HCC consiste nos níveis de AFP sérica. No entanto, AFP possui baixa sensibilidade, o que a torna inadequada para detecção de todos os pacientes que desenvolverão HCC e limita acentuadamente sua utilidade clínica. Em alguns casos, muitos pacientes cirróticos desenvolvem HCC sem nenhum aumento nos níveis de AFP. Por exemplo, cerca de 40% pacientes do coorte de estudo de HCC possuem um valor de AFP normal (<25 ng/ml). Em pacientes com HCC comprovado por biópsia, a pontuação-cd demonstrou sensibilidade e especificidade superiores à AFP para diagnóstico de HCC (AUC 0,998 versus 0,855, Fig. 41). Tanto a pontuação-cd quanto os valores de AFP estavam altamente correlacionados com o estágio do tumor (Figs. 437 e 4K). Em pacientes com resposta ao tratamento, recorrência ou progressão do tumor, a pontuação-cd mostrou alterações mais significantes desde o diagnóstico inicial do que aquela de AFP (Figs. 4K e 4L). Em pacientes com amostras seriais, aqueles com uma resposta ao tratamento positiva tiveram uma diminuição concomitante e significante na pontuação-cd, comparada com aquela antes do tratamento, e houve uma redução ainda maior na pontuação-cd em pacientes depois da cirurgia. Em contraste, pacientes com doença progressiva ou recorrente tiveram um aumento na taxa de metilação (Fig. 10). Por comparação, AFP foi menos sensível para avaliação da eficácia do tratamento em pacientes individuais (Fig. 12). Modelo prognóstico de ctDNA para HCC e LUNC

[220] O potencial para usar a pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) com base na análise de metilação de CfÍDNA para predição do prognóstico em LUNC e HCC em combinação com características clínicas e demográficas que incluem idade, sexo, estágio de AJCC e valor de AFP, foi investigado. No coorte de HCC, o conjunto de dados de treinamento continha 764 observações com 69 eventos e o conjunto de dados de validação continha 382 observações com 31 eventos. Por utilização de métodos de aprendizagem estatística, um modelo preditivo que utiliza 10 marcadores CpG (Tabela 3) que podem separar o coorte de HCC em grupos de alto e baixo risco foi construído, com sobrevida mediana significantemente maior no grupo de baixo risco do que no grupo de alto risco (teste do log-rank = 4,884, df = 1, p=0,027) (Fig. 5A). No coorte de LUNC, o conjunto de dados de treinamento continha 437 observações com 69 eventos e o conjunto de dados de validação continha 220 observações com 33 eventos. Um painel de 12 marcadores CpG (Tabela 3) foi capaz de dividir o coorte de LUNC em grupos de alto e baixo risco, com sobrevida mediana significantemente maior no grupo de baixo risco do que no grupo de alto risco (teste do log-rank= 4,35, df = 1, p=0,037) (Fig. 5B).

[221] O modelo de regressão de Cox multivariado mostrou que a pontuação-cp estava significantemente correlacionada com a incidência de mortalidade tanto em HCC quanto em LUNC. A pontuação-cp era um fator de risco de sobrevida independente em coortes de validação tanto de HCC quanto de LUNC (Coeficiente de 0,37; p=0,03 em HCC; Coeficiente: 0,28; p=0,0017 em LUNC; Tabela S2). Curiosamente, AFP não era mais significante como um fator de risco quando a pontuação-cp e outras características clínicas eram consideradas em HCC (Tabela 5). Como esperado, o estágio de TNM (como definido pelas diretrizes de AJCC) previu o prognóstico de pacientes tanto em HCC quanto em LUNC (Figs. 5C e 5D). A combinação de pontuação-cp e estadiamento de TNM aumentaram significantemente nossa habilidade para prever o prognóstico tanto no coorte de HCC (AUC 0,762) quanto no coorte de LUNC (AUC 0,740) (Figs. SE e 5F).

[222] A Tabela 1A mostra uma tabela de confusão de diagnóstico previsto multiclassificações no coorte de validação.

(come DE VALIDAÇÃO | soe | mme [ame | | LL se [18 13 | 8 | | Poe TR Dm E | Normal | 9 | 30 | 255 | Totals| [emo “| 18 | 1 | 2 | é |

Especificidade (8) | — | | 862 | 81 |

[223] A Tabela 1B mostra uma tabela de confusão de diagnóstico previsto por classificação binária entre normal e HCC no coorte de validação.

Le e DB Sensibizidade (9) | aaa Especifíciaade (8) | — | 95 | 3

[224] A Tabela 1C mostra uma tabela de confusão de diagnóstico por classificação binária entre normal e LUNC no coorte de validação.

[oe as | 3 | [mar 2 | 263 | Totais | [tais — | 2 | 26 | 507 Sensibizidade (9) — | &6&7 | |“ Especificidade (8) —| — | 90 | 27

[225] A Tabela 1D mostra uma tabela de contingência do diagnóstico por classificação binária entre LUNC e HCC no coorte de validação.

Foge a o [oe ar | 2 | roteis | [emo — 6 | 2 | amo | Sensibilidade (8) — | 899 | |

[226] A Tabela 2 mostra características de 100 marcadores de metilação e seus coeficientes em diagnóstico. Seleção de Coeficiente | Coeficiente | Coeficiente Diagnós- | Marca- | caracteres- | de regressão de de tico dor tica: t- logística: regressão regressão estat, lihe logística: | logística:

EL IE E EA Ea Câncer " í ersus —-0,236675214 101027909 ,023841014 Verso 415285 | 17,61364538 6675 0r0202729029 [O o câncer Câncer | versus 1 1 —0,037590318 Z 7 e es | 39068 | 23,95893113| 2192? 0,576572433 | 0,855315385 câncer Câncer í sus | 8-287 1 475 93 | versus |8-28799 |, 5 95597716 | 0/216408897 | 0,192819267 | 0,366347583 câncer Câncer 3 versus O n —1,367721168 " S Ccrsus 759561 | 26,52474648 || 2129 0,956150328 | 0,054902768 câncer Câncer 1 í ersus , 008670 1123911407 | 0,0 versus | 565670 | 18,627055ag | 9-908670072 | 0,423911007 | 0,022632223 câncer Câncer 22 2- - - sus Oo, o, 7 88 | versus 222885 | 18,57400396 | 91 326246574 | 5 198542802 | 0193976473 câncer Câncer 3º í í í versus , ee , | -0,393347975 sons 2 1138223 18,55509702 1,396202888 1,807959073 câncer Câncer 1 í ersus 115297952 | -0,403114 , 5 versus | 935950 | 19,51737266 | 0/2125297952 | 0,4031146 | 0,0238655 câncer Câncer v sus o 4 o versus 159562 | 26,49964747 | Or 788704497 | 1 p699gsa36 | 0108324756 câncer Câncer 17º " : " " 1 | versus ' cana | =0,044811111 " , 2 802603 27,95631084 0,439876458 0,823216834 câncer Câncer 1 í í í ersus 1143266311 83 | versu 2130901 | 18, 64276869 | 9193266318 | n,629658794 | 0,417586625 câncer Câncer 16 sus —18,741526 | 0,4011601 versus 434054 18,741526 0,401160179 | À 515157305 | 0,804483279 câncer Câncer 6 versus | , —0,24712752 , 0,266218748 a 262504 18,22430745 0,169911531 câncer Câncer " í ersus , 356517591 —0,15981238 —-0,3504312 Verso 741531 | 17,86310499 | 913565175 oro 0,35043126 câncer Câncer 3 79 sus 5 —0,554783023 —0,2629371 versus 452092 | 18,90554153 | 2? ? 1,031814454 câncer Câncer 10- - - - 78 | versus a —0,01273024 , , , 2 1350729 18,91807833 0,355980173 0,178555972 câncer Câncer 22 2- - - 77 ersus 1,34 788 /266979058 Verso 455977 | 18,94775481 245069 0/266979058 | 2, 312805466 câncer Câncer " 76 | versus as6224 | 19,00487584 | 9/953035206 | 9 287082772 | 0,159022737 câncer Câncer R versus | - —0,296114847 0,200710002 a 2130902 17,85100263 0,674120091 câncer

Câncer " í í versus À 144, | -0,145333786 0,161187342 . 415284 17,82263372 0,004754725 câncer Câncer í 97 ersus | 6-30238 0,201307581 | -0,48399364 versu 17, 74738532 ? 0,419071695 câncer Câncer ; sus —-O 4 4 5 Versus | 186563 | 24,34195503 | 79r074199402 | 0,136565598 | 9, 309646468 câncer Câncer 21º í í í versus Do. , —0,169615641 5 ns , 2 456223 19,41711427 0,422104365 | 0,147740017 câncer Câncer o- í í ersus 116975442 045179717 verso 976919 |19,19924646 | 9116975992? | 9,149870129 | 0/9951797TA câncer Câncer "” sus , o 7 -1,2824 | versus | 11439 | 20,843850708 | 0-659900298 |1,179733872 | -1,28247216 câncer Câncer " í í í 36 versus " . . 0,111947525 ss " a a 329093 20,82914197 0,604232399 | 0,102113798 câncer Câncer 15. í í 67 | versus | 9/0404 | 19,20472322 | 1/998337579 |0,123021312 | 175357804 câncer Câncer 71 sus Ds 23,147 -o 54 - 209847484 14 | versus | 17,17,5 | -23,107695 | -0,349765433 |, 153506994 | 0720984748 câncer Câncer o 63 | versus 1, | -19,4484243 | -0,019813131 2 976918 0,338493813 0,042379462 câncer Câncer 21 í 1 ersus " O, 330151 102834384 ,177763167 6 | versu 364214 | 23,01536252 053301516 | 0,0 5 | 0,17776316 câncer Câncer " 61 | versus | 3/9139 | -29,2880008 | 0,308365313 | 0,170565161 | 0,122550653 câncer Câncer 17º - - - versus 2, | -0,292169228 Ao a 2 803588 19,49541887 0,024314234 0,368713245 câncer Câncer 5º - - 59 ersus —-19,53197 —0,249838093 verso 1715385 | 742/531275º 9938093 | 9,956471176 | 0,071441678 câncer Câncer "” sus o 4 18 | versus | 510167 | 22,97080946 | 79-388273429 | o 57701189 | 0936969628 câncer Câncer 22- - - - versus ' —0,284358361 dns 1 1650, Í 378131 | 19,72884156 0,110871059 | 0,131062087 câncer Câncer 19º 19 ersus —-22,960 2 —-0,566211213 0,1029850 , 9746482 versu 546460 60505. 566 0298505 | 0,6597 câncer Câncer ersus | 7-1093 007764 versu 1092? | 24,19828156 | 01 9077648618 | o sgag92994 | 0,760831017 câncer Câncer 6 53 | versus no | 0,378542639 o a 1704942 19,84874402 0,542555509 | 0,957150419 câncer

Câncer c c c 11 ersus 7-10938 r082561272 . . versu ? 23,95579676 | 09/08256 0,418722384 | 0,561011155 câncer Câncer " c ersus o, 7505 | 0,3025185 0,2056401 47 | versus | 21/5909 | 20,065867a7 | “9993577505 | 0,302518574 | 0,20564016 câncer Câncer 15 versus | 555695 | 20,15008607 | 791 90330229? | 9,382712364 | 701 20715912? câncer Câncer 3º c c 43 | versus 5. —0,514707374 | 0,371259532 ' 2 452091 20,27929394 0,466839863 câncer Câncer s- - ersus —1,050212 0,4923501 , 5538507 versu 1675324 | 21, 67048751 05021205 | -0,49235019 | 0,553850706 câncer Câncer 15 sus 23652 , 240962 2 1 27 | versus | 555694 |21,57393773 | 9023652533 | 0,240962939 | 0,23275336 câncer Câncer 10 c c versus À Tasca. | 0,029381721 Ds e2aes 0,033829985 N 1016060 | 20,46892585 0,426585276 câncer Câncer s- - - ersus o 7 1275781467 - 39 | versu 1675325 | 20, 59032645 | 9/1 980963067 | 0,275791467 | 9, 402068556 câncer Câncer sus 7787 | 21,5 1| o, , versus | 10-7787 | -21,5431691 | 0,00598852 |, 99509747 | 0,170189137 câncer Câncer versus | 10-7786 0,038463232 , - . 21,47479725 0,220956901 0,015378708 câncer Câncer e c c c versus 0,115741682 ' N 1704943 | 20,04539412 0,518054639 | 0,856636887 câncer Câncer sus = 7 0,16301047 7 7 Versus | 1222773 |17,72217416]| Í 1,858171112 | 1,216496148 câncer Normal versus 7 âncer —32,6798181 | 1, 3 | 0,1751537 , cânce 1017626 | 32679818 803275893 | 0,175153741 | 2,926283828 versus câncer Normal versus 7 âncer -0,11486827 267337677 | 0,0073977 cânce 382009 | 21,67679298 | Or 114868278 | 0,267337677 | 0,007397738 versus câncer Normal versus 14 câncer ” o , 02880255 , 2 17 73 | cânce 556474 | 19,09929792 | 1º 928802553 | 1,469882366 | 0,740193974 versus câncer Normal versus 13º : : : 72 | câncer ' | 0,539713717 4a , 988696 19,10886072 0,623018315 | 0,526201237 versus câncer 71 | Normal V 7 0,639678522 7 0,512492514 versus 2262968 |19,11861008 ' 0,087686268 | O câncer versus câncer Normal versus : :

70 | câncer |8-28798 |. 1921227 | Or 650234953 | n go ,553337 | 0250659271 versus câncer Normal versus 16- : o : : câncer ; ' —0,181424125 , a

724596 19,17897078 0,144884684 0,006709982 versus câncer Normal versus 11º : 6! câncer " 11375 127 17 45641 1,01 36575 | cânce 646123 | 19,02858974 | 2: 137556127 | 0,7690 09365 versus câncer Normal versus * âncer 7 —0,384110053 1 72 cênce 11026 |19,42859291 | 701 399110053? | 9, 360784146 | 0129999097? versus câncer Normal versus câncer 2 T —0,639960957 Z 7 Aeee | 222884 |19,47573625 | “> | 0,778683987 | 0,556777877 versus câncer Normal versus 10 câncer | 35238 |19,67767651 | 0-765056023 | 1,021326356 | 0,391045996 versus câncer Normal versus 2 : 57 | câncer . ' —o,558118495 | 0,714728365 | 1,200526621 546123 19,69433464 versus câncer Normal versus 7 : : câncer | * -0,125706754 | 0,507930814 - 2115267 19,73690799 0,305947675 versus câncer Normal versus 11º : :

54 câncer - —0,132624247 ,057514538 cênce 11025 |19,82113917 0,173316324 | 9/0975345 versus câncer Normal versus 17º : câncer À -0,001 7 , ' 1

52 | cânce ss5as6s | 19,87060257 | -9- 001212871 | 0,035726276 | 0,060919648 versus câncer Normal versus 16 câncer o, 2135525

51 | cânce 724595 | 19,87484907 | 79r69877162 | 9,122429a418 | 9124355250? versus câncer

Normal versus 10º - - 50 | câncer | 1188922 | 19,94415652 | 01526723185 | 0/917937922 | o, og6531139 versus câncer Normal versus câncer 1130921 -20,0927365 | -0,078902836 | 0,164631916 | À 397973458 versus câncer Normal versus > câncer | É. " 0,598962307 | 1,134520813 | 0,5877791 2402599 20,12830443 versus câncer Normal versus > câncer & —20,3243112 | -0,633540516 | 0,613485917 | 1,167536542 1139315 versus câncer Normal versus 10- : : 41 câncer 61622 20,42327924 0,005372067 0,196382224 0,085414271 versus câncer Normal versus À 38 | câncer |, 15266 | 20,69111164 | 79, 769131956 | 0,345916524 | 1,254836456 versus câncer Normal versus 3 37 | câncer | 918088 | 20,80693297 | 91 609398167 | 9, 0990557439 | 0,766058116 versus câncer Normal versus 16 TA | câncer | 995927 | 19,08800159 | 0-922529083 | 0,053859311 | 9 119151857 versus câncer Normal versus 13 câncer = 1 oe, | -1,031186323 Z 0,749708189 1141899 21,34469521 0,389204596 versus câncer Normal versus : : 75 câncer 2-34738 19,06924964 0,93625842 0,991715759 0,688867756 versus câncer Normal versus 2- : 81 câncer 1279336 18,75400747 0,26785859 0,679898396 | 1,980063473 versus câncer Normal 21 versus 37 & —-0,351581796 0,278320012 0,670590713 câncer | 1948265 | 22,40390002 versus o ame E j| Normal versus 3 câncer | 971914 | 269760943 | -1,096565994 |, 119434035 | 07 235950502 versus câncer Normal versus 23 | câncer |2-33179 21,87723261 —0,367084719 0,982935256 0,385724888 versus câncer Normal versus 1 - - câncer ae, —0,855883545 anna, | 0,371049084 579158 22,35886206 0,643500898 versus câncer Normal versus 7 - 12 câncer 1511292 23,69581782 —0,040188828 0,017871212 0,57857198 versus câncer Normal versus câncer o Z —0,344691441 | -0,52467607 " 1511060 | 22,42273418 0,001475964 versus câncer Normal versus 2 - : - câncer | ganas5o | 25,59587088 | 9/1 999759793 | 9,023595253 | 0,493610136 versus câncer Normal versus 17 | câncer |2-33180 |, p9797ç72 | 0,031485683 | 0,578377676 | 0,561864702 versus câncer Normal versus 2º - - câncer | 1971213 | 25,22834725 | 01259159596 | 9, 177874427 | 70091597? versus câncer Normal versus câncer 6 —23,0638498 | -0,765362602 Ae 0,371844191 1344914 0,056385391 versus câncer Normal versus 17 - 7 ane 579157 24,69417969 —1,836100826 —0,49945522 1,378041275 câncer Normal versus 5º - 32 câncer 1729823 21,10727499 0,49063763 0,442695007 0,228719149 versus câncer Normal TO" = = câncer versus câncer Normal versus 10º - - 31 | câncer | 311418 | 21,10588727 | 79, 360228601 | q 189755315 | 0322305225 versus câncer Normal versus câncer e as -0,913916851 | 0,004403469 | 0,352850662 versus 855515 | 19,97033653 câncer Normal versus 7º - 33 | câncer | 353917 | 21,10478683 | 9/560990981 | 1,26871861 | 0,300870717 versus câncer Normal versus 2- - 34 | câncer | 192598 | 209,95079767 | 9/560267322 | 0,568318096 | 0,352815469 versus câncer Normal versus 6 91 | câncer | 1574305 | 18,45922482 | 9/102685453 | 0,425266208 | 9 273613465 versus câncer Normal versus 2 87 | câncer | 99270 | 18,57780227 | 9174902599 | 9,209429644 | 0,359030027 versus câncer Normal versus câncer 6 ano, —0,095348947 | 0,333302114 | 0,04190651 1574304 | 18,58806884 versus câncer Normal versus câncer 167 2 5a 0,020279096 | 0,051846711 CNN 855514 | 18,62861605 0,155772388 versus câncer Normal versus 11º - câncer | 159173 |18,86145879 | 9/792965144 | 0,476433898 | 0,192061881 versus câncer Normal versus 2- - câncer | 2979,9 | 21732045 | -0,230367057 | 0,218145876 | À 071298246 versus câncer

[227] A Tabela 3 mostra Características de 10 MCBs em HCC e 12 MCBs em LUNC para predição do prognóstico. Marcadores, nomes do MCB; ID do Alvo, marcadores cg iniciais usados para realizar sequenciamento de captura direcionada; Gene de ref., genes se sobrepõem com um MCB. Tipo de câncer Marcadores ID do Alvo Gene de ref. Xx12.939663 cgl1225410 SOCs2 X13.435663 cgoo338116 EPSTI1 Xx2.704752 cgooss52226 TIAl X4.14001 cg24496475 CHA4: Hnce X6.262503 cgo5414338 CH6: X6.271255 cgl2041340 cH6: X6.283040 cgos343881 ZNF323 X6.415284 cgo3431741 FOXP4 X6.733300 cgl7126142 cH6: X8.1025045 cgl8004756 GRHL2 X8.538511 cg26205771 NPBWR1 X2.2355288 cgo8s436738 cH2: X2.698469 cgo1604601 AAK1 X6.1009129 cg27252696 SIM1 X10.1205149 cg24917945 cl0orf46 LUNC X17.803588 cgl1252953 Cl7orfl101 x22.321497 cgo3550506 DEPDC5 X6.283041 cgo6g903569 ZNF323 X6.1009115 cgl2865837 SIM1 X4.463914 cgl8440897 GABRA2 X4.840359 cgl9255783 PLAC8 Xx2.967814 cg20634573 ADRA2ZB

[228] A Tabela 4 mostra características clínicas do coorte de estudo. HCC de LUNC de | Normal HcC LUNC Normal

ENE RC RR RO RO ROO A () (53,2) (33,5) (46,8) (83,8) (63,4) E o een es ee Less PO TE Las IT

EXP (Sn Carcinoma de 229 ' élula Amosa o 369 (44,6) NA NA célula escamosa (35,0) Câncer de pulmão . A o NA 65(9,9) NA de pequena célula | ouros — [oem [o ma o [269 estágio A | 101 11 87(23,1) [115(13,9) NA - 42(6,4) NA (15,4) 342 126 111 86(22,8) |261(31,6) NA NA (52,3) (19,3) 394 TV 6(1,6) 25(3,0) NA 81(12,4) NA (60,2) ED o E 156 126 Livre de tumor |236(62,6) | 503(60,8) NA NA (23,9) (19,3) 495 513 Com tumor 114(30,2) [159(19,2) NA NA (75,7) (78,4) Ee o IL IT 006, TE 510 NA NA 327 (39,5) NA NA NA (78,0) Drs FEIO 623 Positivo 120(31,8) NA NA NA 346(40,0) (95,3) ELO 10 TD Less TO II

[229] A Tabela 5 mostra análise multivariada de sobrevida para pacientes com pacientes com HCC e LUNC com pontuação composta de marcadores de metilação e variáveis relevantes. e EXp Se Exp Se Coef Fator (coef | (coef z Coef.|(coef| (coef z : 2) a) a) a) Pontua- 0,001 2 0,37 | 1,45 [0,169 P 0,03 | 0,28 | 1,33 | 0,12 | 2,39 ção-cp 7

FFFFFEFEFFE e-6 -6

[230] A Tabela 6 mostra uma lista ilustrativa de 1.000 marcadores (mostrados com identificador cg) descritos nesse relatório descritivo. Em alguns casos, os marcadores são usados em análise de HCC vs. pulmão. cg204248 | cg239932 | cgo81287 | cg269547 | cgo20194 | cg162433 | cg190034 33 35 68 36 44 59 12 cgo293631 | cgo73665 | cgo01772 | cg184425 | cg066153 | cg140630 | cg095558 94 53 90 24 80 o8 18 cgo61057 | cg118184 | cÃg033887 | ca248644 | cgo71682 | cao61979 | cg121770 18 38 86 13 04 66 87 cg236932 | cg227006 | cg160387 | cgo76769 | cao63871 | cg274330 | cg267340 89 86 38 20 41 62 40 cg247874 | cg264533 | cg269440 | cgos8947 | cg150453 | cgo021490 | cg271838 70 60 11 34 56 69 18 cgo01774 | cg193404 | cgo63022 | cg162649 | cgo14287 | cg175162 | cg010536 96 20 95 66 50 47 21 cg203855 | cgo23953 | cg274999 | cg189010 | cgoons993 | cg250601 | cg222032 o8 63 25 45 93 72 19 cg223563 | cgo66051 | cg043595 | cgo36076 | cg120929 | cg233521 | cg169626 24 58 58 48 39 46 83 cgo27026 | cg248608 | cg105056 | cã214878 | cg257340 | cgos5900 | cg211039 14 86 10 56 35 53 92 cgo34222 | cg228093 | cg122690 | cg207011 | cg209867 | cgo88222 | cgo41132 04 15 o2 82 26 27 00 cgo71554 | cg137479 | cg201637 | cgos6738 | cgos2253 | cgo27343 | cg228625 78 67 96 82 88 26 26 cgo68151 | cgo73543 | cg019942 | cgo11442 | cgo33999 | cg101102 | cg188997 12 711 90 25 711 71 17 cgl124779 | cgl18284 | cgo64298 | cg145965 | cg137555 | 09123325 | cg248032 o3 46 87 89 46 26 o2 cgo30386 | cgo32287 | cg250967 | cg184406 | cg124334 | cg267036 | cg009839 85 60 45 92 86 61 o4 cgo73602 | cg269962 | cgo75717 | caoosa96 | cg164925 | cao8s1108 | cg181851 50 ol 34 59 97 61 89 cgl194189 | cg143138 | cgo66016 | cano4s98o | cg112253 | cgo22803 | cg188111 51 33 85 89 57 PE) 30 cgo417393 | cgo62353 | cgo29273 | cg196168 | cg208225 | cgo18550 | cg182814 o6 90 27 o7 79 7O 18 cgoo4560 | cgl161071 | cgos5838 | cg200111 | cg012898 | cgo00262 | cg185602 86 72 48 34 74 22 64 cgl182341 | cgo35508 | cg078235 | cg210589 | cgo26339 | cg003397 | cg110832 64 62 73 24 69 35 cg248691 | cgo55973 | cg023795 | cg263131 | cg126792 | cg276501 | cg041325 95 49 60 88 30 75 40 cgl42214 | cgos8033 | cgl37883 | cgo32385 | cgo70545 | cg138588 | cgL44802 60 61 81 16 o2 o3 49 cgo15184 | cgog5973 | cgl11227 | cg203658 | cgl30924 | cgo11455 | cgl18162 59 45 95 67 87 44 29 cg131975 | cgoos485 | cg244613 | cgl90261 | cg209267 | cg182039 | cg265361 51 94 37 24 20 65 64 cg239833 | cg186687 | cg275981 | cgos0206 | cg247877 | cg259627 | cgL93244 80 68 85 55 74 62 cg117438 | cgo17032 | cg261739 | cgo25714 | cgo12249 | cgo30100 | cgoss212 27 91 97 70 49 18 25 cgo37927 | cg236463 | cgl24557 | cgo94372 | cgoss3156 | cgo70003 | cg267970 68 15 62 83 13 34 73 cgl144638 | cgo79819 | cg263185 | cg265708 | cgl58828 | cgl45204 | cgoz8524 53 10 o2 44 78 23 21 cgo13129 | cgl66896 | cal56813 | cg159031 | cgo71755 | cgl19625 | cgoz0049 97 34 58 70 82 24 79 cg163264 | cg216418 | cgo39712 | cgl35279 | cgooZz113 | cg203786 | cgl54258 o2 34 27 22 37 28 27 cg194809 | cgoo3638 | cgl33116 | cgl40314 | cgoss7o5 | cg208522 | cgo1o544 65 13 o7 91 86 26 o2 cg263864 | cgo12049 | cg130390 | cg208143 | cgoo1502 | cg252963 | cg232419 72 11 82 12 45 14 14 cgo17493 | cg213037 | cg159835 | cgo28315 | cgl48552 | cg133241 | cgooz815 47 63 20 87 92 o3 51 cgo78191 | cgo79878 | cgl18570 | cgl16671 | cgl0o758 | cgoss794 | cgol5661 60 43 33 17 19 70 99 cg269754 | cg102010 | cgo49188 | cg100976 | cgo15000 | cg270751 | cg224136 59 84 31 51 55 04 o3 cgo64007 | cg259281 | cgoosses | cgo62151 | cgo27966 | cg249416 | cgo36612 45 99 51 o7 21 81 99 cg237363 | cg197867 | cg210925 | cg108817 | cgl18644 | cgoos907 | cgo39776 o7 33 51 45 90 61 57 cg152646 | cgo10165 | cg253027 | cg174302 | cgooso37 | cg262831 | cgo75605 81 92 o4 28 58 27 87 cg171674 | cgo49192 | cg260517 | cg165080 | cgl49782 | cg216635 | cgo72242 68 34 55 68 42 80 21 cgo37432 | cg171847 | cgos2835 | cg257574 | cgo27879 | cg143819 | cg1o5503 os o4 97 70 91 19 os cg211052 | cgo57728 | cgo6ss105 | cegli1545 | cg206619 | cgos8663 | cgL93587 27 50 91 52 85 o3 38 cgo24888 | cgl48640 | cgl38600 | cg265955 | cgl67828 | cgos2031 | cg200384 87 22 o6 20 85 99 93 cg210598 | cgos0046 | cgosz004 | cgl6B147 | cg261642 | cgos2990 | cg250212 34 91 19 86 69 48 47 cg256867 | cg204415 | cgl48040 | cgl56321 | cgl35832 | cgo29892 | cg234000 46 o2 oo 64 30 44 o2 cgos6344 | cg270793 | cgo21835 | cg213801 | cg231123 | cgos1435 | cg219103 69 41 64 81 60 30 90 cg200246 | cgos4676 | cgl66197 | cg209615 | cgl66740 | cg103217 | cgL66087 87 76 21 91 20 23 31 cg146721 | cg127975 | cgo31371 | cgoo7882 | cg270296 | cgoo5718 | cgos2223 28 94 17 04 23 o9 67 cg259347 | cg199255 | cgos1474 | cgoss5845 | cgl30816 | cg153118 | cgoz1797 oo 58 oo 97 oo 22 64 cgoosios | cg135023 | cgl17262 | cgo60982 | cga13365 | cgo73593 | cgos7537 95 46 88 15 94 o6 72 cg262591 | cgl16648 | cg270946 | cgoo04565 | cgo37107 | cg209671 | cgL64144 71 18 98 93 19 39 72 cgoss508 | cgo4s2133 | cg179526 | cgo4ss207 | cgoosa34 | cgo66257 | cg202667 39 84 61 oa 74 67 15 cgo29545 | cg105729 | cgl12331 | cgl97944 | cg270838 | cgl91114 | cgoZ6228 62 69 63 81 91 59 o3 cgo74677 | cgo7O542 | cgo37059 | cg225012 | cgo6sso10 | cg211951 | cg188300 16 26 26 43 28 85 83 cgo37811 | cg264324 | cg202278 | cgo75465 | cg230659 | cg073809 | cgl61292 23 59 60 o8 27 o7 13 cgl41264 | cg239538 | cgo66552 | cglos818 | cgl69731 | cg198986 | cgosss10 93 20 16 76 o7 68 19 cgo23632 | cg262491 | cg234049 | cgoB83731 | cgo6s730 | cgo27206 | cg255738 o2 oo 73 69 88 18 84 cg221980 | cg171983 | cgz01236 | cg214875 | cg173440 | cgos7182 | cg213698 44 os 37 09 48 53 90 cg254796 | cgos7584 | cgl93246 | cgo61438 | cgos1426 | cgo26753 | cgo6s2507 82 90 27 64 71 o8 20 cg236130 | cg257811 | cgl19046 | cgl70010 | cgo15959 | cgos1599 | cg106373 51 62 86 34 97 o9 70 cg195802 | cg271433 | cgo6s280 | cgl94242 | cgoz5800 | cg247385 | cg265300 63 26 15 65 os 92 45 cg262506 | cg179270 | cgo74354 | cgoos494 | cgooos19 | cg227473 | cgo4s1117 09 96 45 46 19 80 89 cgo72161 | cg216221 | cg274361 | cg192959 | cg272641 | cgl115662 | cgo19592 94 86 84 51 81 44 38 cg211862 | cgo43554 | cgo33260 | cg239822 | cgoss211 | cg242399 | cgo22584 96 35 59 12 86 61 44 cgoss768 | cgosa859 | cgz02054 | cgos8537 | cgl12545 | cgo37989 | cgl25446 64 40 717 72 27 86 78 cgo25861 | cg220563 | cg256770 | cgl04947 | cg147386 | cgo19798 | cgl13276 82 36 92 o3 70 88 59 cgos7478 | cgl42874 | cglos436 | cgo17335 | cgososs1 | cg183618 | cgoz2883 27 o3 34 99 58 15 41 cgl164233 | cgi69194 | cgo29191 | cgo78395 | cgos6s86 | cgo4s2218 | cgl86810 37 20 68 36 45 86 28 cgoo2644 | cg195716 | cgoss4a5s5s | cgo83287 | cgl40522 | cg247944 | cgoT6816 41 17 33 77 10 33 96 cg191018 | cgo64982 | cgoss268 | cgl65602 |cg276391 | cgo31232 | cgo36032 93 32 25 56 42 89 11 cgosa675 | cg130190 | cg182291 | cg261738 | cg253916 | cg138842 | cgl22965 96 92 34 47 92 95 32 cg159945 | cg177928 | cg268069 | cgos4507 | cgl40403 | cg244125 | cgosa377 19 49 24 o1 58 ol 43 cg120745 | cgo48010 | cg154853 | cg150582 | cgoss684 | cgos5052 | cgoso366 85 85 78 10 51 22 21 cg184951 | cg203588 | cgl78414 | cg168099 | cgl39055 | cgo02373 | cg221108 18 34 21 62 86 91 88 cg182635 | cg160788 | cg217980 | cgo81482 | cgo66716 | cgl75823 | cg199759 87 36 60 61 21 36 17 cgo19209 | cg265857 | cgl04260 | cg213616 | cgl85652 | cg213063 | cgo73954 51 24 84 46 68 29 39 cg107042 | cgoo2940 | cg119707 | cg100227 | cgl14932 | cg256583 | cgl69831 63 25 97 88 23 85 59 cgos1368 | cgos8918 | cgos7381 | cg260803 | cgl58068 | cga100643 | cg184957 23 99 56 os 80 39 10 cg203159 | cg115537 | cgos2187 | cgo25843 | cgoss141 | cgo70535 | cgo67038 95 55 57 717 42 46 44 cg201352 | cgo62302 | cg246722 | cgog90501 |cgl30167 | cg118567 | cgl92695 cgl21372 | cg218505 | cg276194 | cgl60464 | cgo78184 | cgo16874 | cgo21533 o6 78 75 44 22 o1 39 cgoo6s66 | cg109108 | cgooo719 | cg229723 | cgo4s280 | cgz05881 | cglo4838 94 48 50 18 38 62 25 cgos0386 | cgo38060 | cgoossa4 | cgl34002 |cgl/2973 | cgl49600 | cgl45825 76 87 93 49 os 43 50 cgos3536 | cgo37942 | cgo10615 | cgoos209 |cgl86594 | cg104182 | cgo71467 59 14 53 10 83 63 73 cgos1987 | cg187184 | cgo22431 | cgos5s021 |cg233159 | cg214513 | cg247824 87 10 57 49 32 o9 97 cg109934 | cgo33556 | cgos3502 | cgo4s4505 | cgoso6sss | cg273083 | cgz08961 60 90 74 99 48 19 13 cg252642 | cgo79481 | cg197776 | cgl84779 | cg235114 | cgo48091 | cgo75415 65 94 44 49 32 36 59 cg135106 | cg220769 | cg253930 | cg257464 | cgl28484 | cg139723 | cgo10043 51 12 os 89 57 66 82 cgo16147 | cg103878 | cg218612 | cgo4s6406 | cgl68654 | cg219125 | cg261925 59 90 33 84 42 56 20 cg195334 | cg103940 | cgo4s676 | cg239734 | cgo17540 | cgo46740 | cgl27160 43 47 34 29 o9 60 EX cgo79916 | cg159633 | cg132638 | cgo70645 | cg211013 | cgoo06723 | cg167384 21 26 30 44 86 33 53 cg161472 | cg163114 | cgos4692 | cgl74686 | cgos5997 | cgos6848 | cgl78759 21 62 55 16 40 91 35 cg107452 | cg213761 | cg123537 | cgo75321 | cgos3823 | cg100098 | cgl63629 72 20 88 83 13 o1 49 cgo39235 | cg163675 | cg209577 | cg220943 | cgo14195 | cg266617 | cgo30646 11 96 o6 82 18 42 cg217667 | cg125475 | cg164306 | cgl23299 | cg243908 | cg264570 | cgl68950 22 16 87 33 71 13 26 cg175915 | cg215617 | cgz24630 | cgo12509 | cg255888 | cg258655 | cg271731 14 12 97 60 44 53 51 cg184825 | cg180378 | cgoo3947 | cg243964 | cgz04821 | cg222349 | cg242207 93 os 18 oo 13 30 49 cgl72751 | cg183092 | cgo29009 | cg272978 | cgl30502 | cgo25791 | cg200184 62 86 95 51 40 36 69 cg215743 | cg201993 | cg120227 | cgl25280 | cgl92433 | cg135797 | cgoTO7T67 49 33 72 56 30 52 51 cg103564 | cg126996 | cg223107 | cg119909 | cg228853 | cgo65254 | cg243277 63 48 70 o2 32 53 23 cg122090 | cg102304 | cgl76438 | cgl51110 | cg130779 | cg167891 | cgLo3440 75 42 64 65 30 29 81 cg260993 | cgos8525 | cg240360 | cg275735 | cgooz999 | cg263016 | cgooooL7 16 37 39 91 43 89 91 cgo26075 | cg232786 | cg194651 | cgo70546 | cg230908 | cg030231 | cg250236 44 o4 65 68 70 52 84 cgo17108 | cg173306 | cgo44376 | cgl56576 | cgo78915 | cg224169 | cgoso6o3 86 52 48 41 o7 16 56 cgo25234 | cgosg582 | cgl28707 | cgl58513 | cgos5s901 | cg159785 | cg157838 oo 24 50 89 84 61 oo cg244419 | cg254882 | cgo63708 | cg266860 | cgl89649 | cgl26245 | cg202674 11 o6 55 o9 54 23 os cgossos8 | cgl00560 | cgl13644 | cgl21919 | cgl21493 | cg172528 | cgo18199 92 96 20 38 19 84 12 cgl16146 | cg133417 | cg101952 | cgoB83101 | cgos1322 | cg273219 | cgo5s7991 22 20 95 16 22 13 69 cg131536 | cgo45810 | cgl54808 | cgl58890 | cgl90861 | cg132555 | cg144305 61 o4 97 12 10 42 91 cg138633 | cg252475 | cg189668 | cgo22278 | cgl39841 | cgos7218 | cgoss942 96 96 19 67 73 58 67 cgos5087 | cg269401 | cg211071 | cg252109 | cgo72856 | cg249654 | cgo23008 63 22 97 36 75 79 25 cg123323 | cgo62853 | cgo49173 | cgo15190 | cgz02186 | cg194844 | cgo39309 16 37 91 63 14 81 70 cg242473 | cg105996 | cgo34642 | cgz03817 | cgooo610 | cgo6o767 | cgosass7 70 93 24 98 39 94 97 cg272551 | cgl06040 | cgl28171 | cgl87824 | cgoz4661 | cg198753 | cg172182 o2 o7 88 13 75 70 cgl41645 | cgo70469 | cgl43501 | cgosso8s2 | cgoo7os7 | cgo4s4315 | cgossa9a 96 69 20 16 75 96 o9 cgo62711 | cgI64085 | cgoz6479 | cgo25735 | cgo17704 | cg201349 | cg205943 28 65 29 51 oo 84 o4 cg264264 | cgo4sB498 | cgoos713 | cgl61787 | cgl72665 | cão37237 | cgz43541 88 78 69 43 15 16 ol cg185639 | cg226840 | cgl53101 | cgo29234 | cgo32846 | cgoo4871 | cgz03810 99 41 62 85 40 87 20 cgl120838 | cgo6s942 | cgl24204 | cgl31848 | cgol3472 | cg202507 | cegros26o 52 81 72 14 28 22 43 cgo79462 | cgl58343 | cg121805 | cgl91152 | cgo37714 | cgo26723 | cgl64526 77 95 51 72 56 97 51 cgos6964 | cg219879 | cgoos485 | cgl23019 | cgo37551 | cgos1462 | cgoosa7s o6 21 24 72 15 32 30 cg266198 | cg250337 | cg197848 | cglo6741 | cgz02535 | cg209767 | cg227092 94 67 16 os 51 87 o2 cg220325 | cgoso056 | cgo71827 | cgoo004o |cgl90249 | cgl63644 | cg268708 28 o9 53 82 80 95 o3 cg175573 | cgoo6301 | cgl30601 | cg256695 | cg249387 | cg143437 | cgo2z4654 40 64 54 oa 43 ol 27 cgoo3711 | cgo4s6s26 | cgl63100 | cg241056 | cgl16411 | cg236138 | cg247894 95 99 o3 85 o2 57 24 cgo72973 | cg137076 | cgl65818 | cg258627 | cgoz2063 | cg244320 | cgosa131 22 45 oo 68 23 73 47 cg105007 | cg261668 | cgz08171 | cg152021 | cgoo1619 | cg262882 | cgl69089 33 17 75 oa 55 49 48 cgo61200 | cegi69597 | cga12251 | cgl92916 | cg248778 | cg091300 | cgo7oO6L5 oo 47 70 96 42 35 oo cgoss475 | cg268596 | cg236254 | cgos9037 | cg236610 | cgoB6438 | cg210191 56 66 58 36 13 52 74 cgo62285 | cgo64317 | cgooz386 | cgl65781 | cgoosz285 | cg129852 | cg200593 42 o2 62 04 26 35 12 cg264188 | cgo42084 | cgz46776 | cgl54519 | cg177700 | cgos6883 | cgl11156 80 34 74 48 34 93 22 cg219802 | cg232951 | cgo41954 | cg265209 | cg159515 | cg252525 | cg186609 13 81 54 30 57 85 87 cg163483 | cgo25356 | cg208231 | cgl31878 | cgl56790 | cg237186 | cg237150 16 74 37 20 52 o6 29 cg108997 | cgo4s2571 | cgoss757 | cgo10124 |cgl57415 | cg191550 | cg153523 68 63 os 45 83 07 67 cg193009 | cgo23807 | cgos6sa4l | cg264741 | cgoo1o4s3 | cg249286 | cgos2434 37 15 97 24 48 87 54 cgos6676 | cgi69248 | cgo2s3742 | cgo76863 | cgo31689 | cgos5028 | cgo33154 40 22 o7 92 47 65 56 cg226470 | cgo20666 | cg180942 |cg270216 | cg241633 | cg243196 | cgl69430 18 38 61 66 60 51 19 cg259570 | cgoo6472 | cgo67435 | cg237431 | cgl75786 | cgo79687 | cgo6sa53 92 46 52 14 39 70 99 cg176556 | cgl54685 | cg253712 | cgo63914 | cgz203675 | cgo21199 | cgl29129 24 21 67 12 21 27 20 cg230414 | cgoos532 | cgo79600 | cgl32141 | cgl19723 | cg090703 | cgo6s2371 cg195540 | cgo22852 | cgo78715 | cglo04263 | cgl00853 | cg208341 | cgl96061 37 63 90 18 os 78 o3 cgo39467 | cgo19919 | cg131593 | cgo81739 | cg270618 | cg131758 | cgosa5s76 62 67 88 59 36 50 20 cgl12743 | cg100089 | cg223926 | cg032280 | cg180240 | cg140039 | cg230118 14 47 66 65 37 74 86 cgo33673 | cg171421 | cg209709 | cg208361 | cg218748 | cg108575 | cgo50093 87 34 04 56 62 58 89 cg272780 | cg203143 | cgo72945 | cg259385 | cg193477 | cg160326 17 31 41 30 90 21

[231] A Tabela 7 mostra uma lista ilustrativa de 1.000 marcadores (ilustrados com cg identificador) descritos nesse relatório descritivo. Em alguns casos, os marcadores são usados em análise de HCC-pulmão-sangue. cgl12529 | cg142472 | cgo36840 | cgo45172 | cg256714 | cg128350 | cg220084 53 87 62 63 38 12 90 cg259227 | cgo44112 | cg256860 | cgl151364 | cgl116012 | cg130178 | cgo36364 51 ol 87 10 97 13 88 cgos6143 | cgoo2064 | cgos4304 | cg163321 | cg183174 | cg156262 | cg263633 46 90 o7 59 39 85 63 cgo28749 | cg257397 | cg138282 | ca184408 | cgo17423 | cg208551 | cg000155 o8 15 27 39 70 60 30 cg267697 | cgo67885 | cgo72228 | cg228825 | cg250060 | cg254089 | cgo44668 00 14 61 23 77 50 98 cgo2s93661 | cgl44309 | cgl64603 | cÃg035932 | cg08BS5460 | cg116778 | cg232290 18 43 42 59 16 91 16 cg254901 | cgo64824 | cg241006 | cg225828 | cg092543 | cg093998 | cgo43149 45 98 71 75 18 78 78 cgl175189 | cg169276 | cgoos663 | ca184932 | cgos2340 | cg177456 | cg177424 65 o6 34 14 16 97 16 cg266686 | cgl176532 | cg009035 | cg265858 | cg143866 | cgo27560 | cg090976 o8 o3 84 99 24 56 32 cgoso981 | cgo60390 | cg240884 | cg269555 | cg155736 | cgos56934 | cgo55967 28 74 38 40 64 89 56 cgo20539 | cgl46420 | cg235454 | cg080556 | cg157286 | cg112140 | cg075798 64 45 58 63 92 ol 39 cgl13348 | cg247065 | cgo4sos13 | cg246053 | cg186373 | ca238075 | cg125048 70 os 65 25 83 70 17 cgl05429 | cg181138 | cg134158 | cg187818 | cg250230 | cg070970 | cg003024 75 26 31 35 95 98 79 cgooso72 | cgo28719 | cgo63854 | cg118849 | cgo74103 | cgo84335 | cg208731 72 85 49 33 39 04 36 cgl156987 | cg118037 | cg273091 | cg211224 | cgo062308 | cgo48486 | cg117915 95 71 42 74 47 82 26 cg186102 | cgos4149 | cgos1305 | cg273607 | cg103937 | cg190478 | cg141916 os 48 35 27 44 04 88 cgl66228 | cg189822 | cg181280 | cgoa3838 | cgo79240 | cg155700 | ceg117791 99 86 58 60 81 35 13 cgl183840 | cgo22865 | cg194001 | cgo30941 | cg162894 | cg146543 | cg275403 97 o6 79 34 49 85 67 cg231307 | cg271989 | cg141340 | cg131651 | cg129006 | cg083870 | cgo78609 31 31 o3 40 49 14 18 cg196757 | cg139254 | cgo38078 | cao26734 | cg211718 | cg090317 | cg193821 31 32 83 17 58 90 57 cg236122 | cgo73800 | cgo45238 | cg230130 | cg178095 | cg218300 | cgo78847 21 68 29 95 50 64 cgo74201 | cgo27982 | cg256664 | cg130855 | cgo37504 | cg225661 | cg263159 37 80 o3 53 78 42 85 cgo19033 | cg213767 | cgl66492 | cg194590 | cg266818 | cgo25566 | cgo44901 74 33 98 94 47 55 78 cgo14479 | cgos3357 | cg273889 | cglli2171 | cg254685 | cgo14409 | cgo32541 14 15 62 93 16 34 37 cgo76448 | cg205639 | cg236772 | cg268996 | cgz23311 | cg024817 | cglos118 o7 11 43 51 59 14 90 cgl115193 | cgoo2204 | cg227420 | cg275883 | cg185710 | cgo75844 | cgo17659 50 55 o1 21 45 94 30 cg196931 | cgo87151 | cgosos22 | cgl96195 | cgoss1l3 | cgoss595 | cgl71265 77 87 92 85 oo o8 55 cg201361 | cgo21852 | cg179849 | cgo16571 | cgol3142 | cgo78009 | cg274054 oo 48 56 86 52 o7 oo cg208475 | cgos3049 | cg212329 | cgl51283 | cgl37902 | cgl116853 | cgz05568 80 19 37 34 88 91 o3 cg271250 | cgo64881 | cg229353 | cg270165 | cgo39646 | cgo16459 | cg259536 93 50 17 79 96 55 92 cgl11052 | cg193003 | cgo14093 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cgl49986 79 73 37 o1 58 44 13 cg268364 | cg180817 | cg261333 | cg200667 | cgl42820 | cgl196456 | cgoos78l 79 60 o1 92 o4 16 63 cgo76820 | cgo37622 | cgo79215 | cglo04564 | cgl69865 | ca165907 | cgL63504 37 37 o3 59 78 94 46 cg224608 | cgo18169 | cgo48585 | cgos6678 | cga73071 | cg246914 | cgl20674 96 36 53 18 83 53 23 cg199826 | cgos9792 | cg222155 | cg235495 | cg265146 | cg032979 | cg134935 84 32 o8 34 23 o1 26 cgo33315 | cg234297 | cg134874 | cgo36998 | cg256620 | cgo26570 | cgr20422 14 94 45 43 41 12 64 cg238785 | cg189425 | cg201659 | cgo21457 | cgl43435 | cgooo4ssa | cgosz413 64 79 46 o1 13 36 18 cg165095 | cg265724 | cg120338 | cg276172 | cg214528 | cg235954 | cg190219 69 52 22 25 o8 13 85 cg120864 | cg162606 | cg211645 | cgo47260 | cgos9286 | cg143159 | cg246907 64 96 o9 13 75 12 o9 cgos1190 | cg197217 | cgos1770 | egl26786 | cgo6ssoss | cg241261 | cgo30896 os 87 60 86 67 80 51 cgo27826 | cgl45643 | cgos3992 | cg169589 | cgo14988 | cg240326 | cg245259 34 51 44 39 32 91 52 cgl21925 | cgos3315 | cg205102 | cgog7963 | cgoo3273 | cg194331 | cg138572 82 45 85 91 55 18 10 cgo19512 | cg191935 | cg1B1842 | cg201818 | cgo3s7734 | cg124365 | cgoz1167 74 95 18 87 13 68 68 cgl169115 | cg107832 | cgl14109 | cgl85814 | cgol7651 | cg152924 | cg249487 83 94 20 os 52 46 43 cg138210 | cg134642 | cgl55208 | cgo36496 | cg268428 | cgos9389 | cgo14481 o8 40 45 49 15 58 32 cg155690 | cgoso983 | cgos3574 | cgl18694 | cgoss921 | cg245459 | cgo32758 52 43 36 99 50 67 51 cg100552 | cgo31905 | cg203083 | cgl00017 | cgo31906 | cgo46909 | cgoo3ssss 31 13 51 15 61 98 71 cgos4418 | cgl21237 | cg260778 | cgo20374 | cga31842 | cg233526 | cgl47885 57 28 21 25 52 95 63 cg190558 | cg242342 | cg243972 | cg246680 | cg206410 | cgo79387 | cgoss5s25 28 70 41 61 26 43 55 cg172859 | cg228019 | cg118887 | cgo31062 | cgo49437 | cg173596 31 13 47 45 41 29

Exemplo 2 Dados de tecido primário do paciente

[232] Tanto tecidos sólidos primários de pacientes com câncer quanto tecidos sanguíneos de doador saudável foram medidos por chip de micropartícula Infinium 450k Illumina. Dados de metilação de DNA do tumor primário de 485.000 sítios foram obtidos do “Cancer Genome Atlas” (TCGA). Conjuntos de dados clínicos, moleculares e histopatológicos completos estão disponíveis na página da Internet do TCGA. Instituições individuais que contribuíram com amostras coordenaram o processo de autorização e obtiveram autorização informada por escrito de cada paciente de acordo com seus respectivos conselhos de revisão institucionais. Dados de metilação de DNA de tecido sanguíneo de doador saudável foram obtidos e gerados com base no estudo de Hannum e cols., 2013, Mol. Cell. 49, 359-367 (GSE40279), no qual os perfis de metilação de DNA para HCC e sangue foram analisados.

Dados da amostra de soro do paciente

[233] Um segundo coorte chinês independente consistiu em pacientes com LUNC e HCC no “Sun Yat-sen University Cancer Center” em Guangzhou, “Xijing Hospital” em Xi'an e no “West China Hospital” em Chengdu, China. Pacientes que se apresentaram com LUNC e HCC de estágio I-IV foram selecionados e incluídos nesse estudo. As características do paciente e as características do tumor estão resumidas na Tabela 11. A classificação de estadiamento de TNM para LUNC e HCC está de acordo com a 7º Edição do manual de estadiamento de câncer do AJCC. Esse projeto foi aprovado pelos IRBs de “Sun Yat-sen University Cancer Center”, “Xijing Hospital” e “West China Hospital”. Autorização informada foi obtida de todos os pacientes. Dois experimentos prospectivos sobre detecção precoce de pacientes com LUNC e HCC usando marcadores de metilação para previsão da ocorrência de câncer em populações de alto risco foram realizados. No primeiro estudo, pacientes foram recrutados de um grupo de fumantes que passaram por triagem de câncer de pulmão baseada em varredura por TC de dezembro de 2015 até dezembro de 2016. Pacientes que se apresentam com nódulos no pulmão (<10 mm, n = 232, Tabela 14) foram selecionados para serem submetidos à definição de perfil de metilação no momento da triagem e foram subsequentemente acompanhados por meio de testagem secundária para determinar se os nódulos eram causados por câncer ou por condições inflamatórias ou infecciosas por biópsia de tecido e verificação do diagnóstico por patologia. No segundo experimento, alto risco pacientes com cirrose hepática foram arrolados (n = 242).

[234] Tecidos do tumor e normais foram obtidos como clinicamente indicado para assistência ao paciente e foram retidos para esse estudo. Amostras de sangue humano foram coletadas por punção venosa, e amostras de plasma foram obtidas por retirada do sobrenadante após centrifugação e armazenadas a -80ºC antes da extração de cfDNA.

[235] As amostras de soro pré-tratamento foram obtidas no diagnóstico inicial, e as amostras de soro pós-tratamento foram avaliadas aproximadamente 2 meses após tratamento, em que o tratamento se refere a quimioterapia ou ressecção cirúrgica do tumor. O desfecho primário (incluindo resposta ao tratamento: doença progressiva (PD), resposta parcial (PR) e doença estável (SD)) foi definido de acordo com as diretrizes de RECIST. Para pacientes tratados com remoção cirúrgica e nenhuma recorrência no momento de avaliação, pressupomos que tiveram resposta completa (CR). Extração de cfDNA do plasma

[236] Foi determinado o volume mínimo de plasma necessário para obter quantidades consistentes de cfDNA para sequenciamento direcionado. Como uma diretriz grosseira, foi visada uma cobertura de aproximadamente 20X em 90% dos marcadores cobertos pelo painel de sonda-cadeado (veja abaixo). Foi observado que 20.000 ou mais leituras únicas totais por amostra atendiam a esse critério. Foi verificado que 1,5 ml ou mais de plasma geraria confiavelmente cfDNA suficiente para produzir >20.000 leituras únicas. o relacionamento entre quantidade de cfDNA em 1,5 ml de plasma e números de cópia detectados foi ainda investigado usando PCR digital de gotícula. Foi verificado que 1,5 ml de plasma gerava > 10 ng, que produziram pelo menos 140 cópias de amplicons detectados em cada ensaio de PCR digital de gotícula. Foi, portanto, estabelecida a utilização de 15 ng/1,5 ml como um valor de corte em todos os nossos experimentos para obter medições consistentes e confiáveis de metilação de DNA.

[237] cfDNA e 1,5 ml de plasma foi extraído usando o Kit de extração de cÍíDNA EliteHealth (EliteHealth, Guangzhou Youze, China) de acordo com as recomendações do fabricante. Conversão com bissulfito de DNA genômico ou cfDNA

[238] 10 ng de DNA foram convertidos em bis-DNA usando o “Ez DNA Metilation-Lightning"" Kit” (Zymo Research) de acordo com o protocolo do fabricante. O bis-DNA resultante tinha uma distribuição de tamanho de aproximadamente 200-3.000 pb, com um pico em torno de aproximadamente 500-1.000 pb. A eficiência da conversão com bissulfito foi de >99,8%, como verificado por sequenciamento profundo de bis-DNA e análise da proporção de conversão de C para T de dinucleotídeos CH (não-CG). Seleção de marcador para o design do painel de sonda-cadeado

[239] Para “identifica marcadores para diferenciar assinaturas de metilação de HCC, LUNC e sangue normal, foi empregada a abordagem de “contração moderada de estatística- t” em dados de metilação de 450 k com procedimento de Benjamini-Hochberg para controlar FDR em um nível de significância de 0,05 usando comparações pareadas de 377 amostras de HCC e 827 amostras de LUNC (TCGA) e 754 amostras de sangue normais (GSE40279, nosso estudo prévio (HANNUM REF)). As listas foram classificadas por valor-p ajustado e selecionados os 1.000 marcadores principais para o design de sondas-cadeado para diferenciação de câncer (tanto LUNC quanto HCC) versus amostras normais e um grupo separado de

1.000 marcadores para diferenciação de LUNC versus HCC (Fig. 20).

[240] Todos os 2.000 marcadores foram usados para o design de sondas-cadeado para captura e sequenciamento de CÍDNA. A captura por cadeado de bis-DNA foi baseada na técnica em métodos de Deng, e cols., 2009, Nature Biotechnology 27, 353-360; Diep, e cols., 2012, Nature Methods 9, 270-272; e Porreca, e cols., 2007, Nature Methods 4, 931-936; e com modificações adicionais. Por causa de um tamanho total relativamente modesto de regiões capturadas/marcadores cg, essa abordagem oferece um custo de sequenciamento bem menor do que o dos métodos atuais que incluem sequenciamento amplo do metiloma completo nos permitindo, dessa forma, avaliar um grande número de amostras. Além disso, a abordagem de sequenciamento direto direcionado oferece um resultado digital, e exige bem menos material de cfDNA de partida (10-15 ng) do que os métodos recentes mais tradicionais baseados na hibridização em um chip (por exemplo, Infinium, Illumina) ou enriquecimento do alvo por hibridização (por exemplo, SureSelect, Agilent) Essa abordagem também é menos sensível à amplificação desigual, na medida em que utiliza identificadores moleculares (UMIs). Design, síntese e validação de sondas-cadeado

[241] Todas as sondas foram projetadas usando o software ppDesigner. O comprimento médio da região capturada foi de 70 pb, com o marcador CpG localizado nos 80% centrais da região capturada. Um identificador molecular (UMI) único de 6 pb-6 pb flanqueava braços de captura para auxiliar na eliminação do viés de amplificação na determinação de frequências de metilação de DNA. A sequência vinculadora entre braços continha sequências de ligação para iniciadores de amplificação separadas por um trecho variável de Cs para produzir sondas de comprimento igual. As sondas foram sintetizadas como oligonucleotídeos separados (IDT). Para experimentos de captura, sondas foram misturadas em quantidades equimolares e purificadas em colunas Qiagen.

[242] O sequenciamento profundo dos experimentos-pilotos de captura originais mostrou diferenças significantes entre número de leituras capturadas pela maioria das sondas eficientes e sondas não eficientes (60-65% de regiões capturadas com cobertura >0,2x da média). Para melhorar isso, as eficiências relativas foram calculadas a partir de dados de sequenciamento e as sondas foram misturadas em proporções molares ajustadas. Isso aumentou a uniformidade de captura para 85% de regiões a > 0,5x de cobertura média. Sequenciamento de metilação direcionada usando captura por sonda-cadeado de bis-DNA

[243] 10 ng de DNA convertido com bissulfito foram misturados com sondas-cadeado em reações de 20 ul contendo 1X tampão Ampligase (Epicentre). Para anelar as sondas ao DNA, desnaturação de 30 segundos a 95ºC foi seguida por um resfriamento lento até 55ºC em uma taxa de 0,02ºC por segundo e incubação por 15 horas a 55ºC. Para preencher lacunas entre braços anelados, 5 ul da mistura seguinte foram adicionados a cada reação: 2 U de PfuTurboCx polimerase (Agilent), 0,5 U de Ampligase (Epicentre) e 250 pmol de cada dNTP em 1X tampão Ampligase. Após incubação de 5 horas a 55ºC, as reações foram desnaturadas por 2 minutos a 94ºC. Cinco pl de mistura de exonucleases (20 U de Exo I e 100 U ExoIII de Epicentre) foram adicionados, e a degradação de DNA de fita simples foi realizada a 37ºC por 2 horas, seguida por inativação enzimática por 2 minutos a 94ºC.

[244] Os produtos de captura circulares foram amplificados por PCR usando iniciadores específicos para DNA vinculador dentro de sondas-cadeado. Ambos os iniciadores continham códigos de barras de 10 pb para multiplexação única de índice duplo, e sequências adaptadoras de sequenciamento de geração próxima Illumina. PCR foi realizada da seguinte forma: 1X Phusion Flash Master Mix, 3 pl de DNA capturado e 200 nM de iniciadores, usando o seguinte ciclo: 10 s a 98ºC, 8X de (1 s a 98ºC, 5 s a 58ºC, 10 s a 72ºC), 25X de (1 s a 98ºC, 15 s a 72ºC), 60 s a 72ºC. As reações de PCR foram misturadas e a biblioteca resultante selecionada por tamanho em géis de agarose 2,5% para incluir capturas eficazes (aproximadamente 230 pb) e excluir capturas “vazias” (aproximadamente 150 pb). A pureza das bibliotecas foi verificada por TapeStation (Agilent) e PCR usando iniciadores adaptadores de célula de fluxo de Illumina (p5 e pl) e as concentrações foram determinadas usando o ensaio “Qubit dsDNA HS” (Thermo Fisher). As bibliotecas foram sequenciadas em sistemas MiSegq e HiSeg2500 (Illumina) usando leituras de PEl00. Leituras totais medianas para cada amostra foram de 500.000 e a capacidade de mapeamento no alvo de 25% (aproximadamente 125.000 leituras não únicas no alvo) Otimização da uniformidade da cobertura de captura

[245] O sequenciamento profundo dos experimentos-pilotos de captura originais mostrou diferenças significantes entre número de leituras capturadas pela maioria das sondas eficientes e sondas não eficientes (60-65% de regiões capturadas com cobertura >0,2x da média). Para melhorar isso, as eficiências relativas foram calculadas a partir de dados de sequenciamento e as sondas foram misturadas em proporções molares ajustadas. Isso aumentou a uniformidade de captura para 85% de regiões a > 0,5x de cobertura média. Análise de dados de sequenciamento

[246] O mapeamento de leituras de sequenciamento foi feito usando a ferramenta de software bisReadMapper com algumas modificações. Primeiro, UMI foram extraídos de cada leitura de sequenciamento e anexados aos cabeçalhos de leitura dentro de arquivos FASTQ usando um script customizado. As leituras foram convertidas on-the-fly como se todos os C fossem não metilados e mapeadas para fitas de

DNA do genoma humano convertidas in silico, também como se todos os C fossem não metilados, usando Bowtie2. As leituras originais foram mescladas e filtradas para um UMI único, ou seja, leituras que carregam o mesmo UMI foram descartadas deixando uma leitura única, simples. As frequências de metilação foram calculadas para todos os dinucleotídeos CpG contidos dentro das regiões capturadas por sondas-cadeado por divisão dos números de leituras únicas que carregam um C na posição interrogada pelo número total de leituras que cobrem a posição interrogada. Isolamento e PCR digital quantitativa de DNA

[247] Amostras do tumor e de plasma correspondentes foram obtidas de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica do tumor; amostras foram congeladas e conservadas a -80ºC até o uso. O isolamento de DNA e RNA de amostras foi realizado usando DNA/RNA MiniPrep kit e um kit de extração de cfDNA, respectivamente (EliteHealth, Guangzhou Youze, China). Para estimar as frações de cfDNA tumoral, realizamos experimentos de misturação com várias frações de cÍDNA normal e DNA genômico tumoral de HCC (gDNA) e testamos os valores de metilação e números de cópia por dPCR (veja seção seguinte para detalhes). PCR digital de gotícula (ddPCR) foi realizada de acordo com as especificações do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA). O seguinte ensaio de ddPCR foi usado nesse estudo: cgl0590292 - iniciador direto 5'- TGTTAGTTTTTATGGAAGTTT, iniciador reverso 5'- AAACIAACAAAATACTCAAA; sonda fluorescente para detecção de alelo metilado 5'/6-FAM/TGGGAGAGCGGGAGAT/BHQ1/-3'; sonda para detecção de alelo não metilado, 5' /HEX/TTTGGGAGAGTGGGAGATTT/BHQ1/-3'. ddPCR foi realizada de acordo com as especificações do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA). Usando as seguintes condições de ciclagem: 1X de 10 minutos a 98ºC, 40X de (30 s a 98ºC, 60 s a 53ºC), 1X de 10 minutos a 98ºC. Cálculo de fração de cfDNA tumoral

[248] Foi presumido que um valor de metilação particular observado para uma amostra de cfíDNA de HCC resulta da contribuição combinada de cfDNA normal e tumoral. A fração de cfDNA que se origina do tumor foi estimada usando a seguinte fórmula: fração contribuída por DNA tumoral na amostra i = [valor de metilação em cfDNA de HCC na amostra i - valor de metilação médio de cfíDNA normal]/[valor de metilação médio de DNA tumoral - valor de metilação médio de CfDNA normal]. Usando essa abordagem, foi estimado que, na média, a fração do tumor está em torno de 23% em amostras de CfDNA de HCC. As amostras foram então agrupadas de acordo com fatores que avaliam a carga tumoral, por exemplo, um estágio avançado e estado pré-tratamento, na medida em que se espera que esses fatores afetem a fração do tumor no CtDNA. Na verdade, foi observado que condições associadas com um estadiamento e severidade do tumor maiores também tendiam a ter uma fração do tumor maior. Para verificar ainda mais abordagem, um experimento de misturação com frações diferentes de cfDNA normal (0-100%) e DNA genômico tumoral (0-100%) foi realizado e os valores de metilação avaliados usando PCR digital. Foi demonstrado que a adição incremental de DNA genômico tumoral pode aumentar a percentagem de metilação da fração até os valores observados no paciente com amostras de HCC. Especificamente, a adição de 10%, 20%, 40%, 60% ou 100% da fração de DNA genômico tumoral pode ser prevista pela fórmula acima, quando se utilizam valores de metilação obtidos pelo experimento. Análise estatística Seleção de marcador de metilação de DNA para análise diagnóstica e prognóstica

[249] Das 2.000 sondas-cadeado inicialmente projetadas, somente 1.673 eram informativas, ou seja, capazes de gerar sinais de amplificação por PCR positivos e específicos e, dessa forma, foram usadas como sondas de captura nos experimentos subsequentes em amostras de CÍDNA. A profundidade do sequenciamento foi usada como um critério de inclusão de amostra. Amostras que tinham menos do que 100 MCB (veja abaixo) e mostravam cobertura de leitura de 10x foram excluídas de análise posterior. Como cada MCB incorporava na média aproximadamente 3 marcadores CG, a cobertura de 10x assegurou pelo menos 30 medições de metilação por MCB. Usando esses critérios, 73% de todas as amostras com uma mediana de 34 K mapearam leituras por amostra foram incluídos.

[250] Após a obtenção dos dados de metilação de DNA para

1.673 marcadores CG, o conceito de MCBs para unificar marcadores CpG proximais em um MCB foi usado, resultando em um total de 888 MCBs. Para cada MCB, o valor de metilação MCB-específico foi quantificado com dois números: logl0 (contagem de leitura metilada total +1) e logl0 (contagem de leitura não metilada total + 1), usando a transformada log para reduzir efeitos aberrantes.

[251] Foram “obtidas cerca de 1673 sondas-cadeado informativas que eram capazes de gerar sinais de amplificação por PCR positivos e específicos e foram usadas como sondas de captura nos experimentos subsequentes em amostras de CfDNA. Amostras de cfDNA com menos do que 100 MCB de cobertura de >30x também foram eliminadas. Leituras metiladas para cada marcador foram definidas como leituras metiladas únicas totais e os valores de metilação para cada marcador foram definidos como a proporção de contagens de leitura com metilação dividida por contagens de leituras totais.

Construção de classificador diagnóstico baseado em cfDNA usando MCBs (pontuação-cd)

[252] Dados das amostras de cfíDNA obtidos de pacientes diagnosticados com câncer hepático (HCC), câncer de pulmão (LUNC) e controles normais foram divididos em coortes de treinamento e de validação. O conjunto de dados completo foi divido aleatoriamente com uma proporção de 1:1 para formar os coortes de treinamento e de validação.

[253] Seleções de marcador: Dentro do coorte de treinamento, o esquema de “Lasso randomizado” foi adotado para reduzir a dependência da amostragem e estabilizar a seleção de variáveis a fim de selecionar biomarcadores com confiança elevada. O conjunto de treinamento primeiro foi dividido aleatoriamente com uma proporção de 1:1. O procedimento de seleção de variáveis em dois terços das amostras foi realizado e reteve um terço das amostras para avaliação do desempenho do processo de seleção de características. O processo de seleção de características consistiu em duas etapas repetidas 50 vezes. MCBs foram incluídos para treinamento do modelo final se fossem selecionados em 40 de 50 repetições de seleção de características. Um sistema de predição multiclasses baseados em Friedman e cols., 2010, J. Stat. Softw. 33, 1- 22 foi construído para prever a afiliação de grupo de amostras nos dados de teste usando o painel de MCBs selecionados. Uma matriz de confusão e curvas ROC também foram fornecidas para avaliar a sensibilidade e especificidade, em adição à precisão de predição com base na partição sustentada do conjunto de treinamento.

[254] Processo de classificação: um processo de classificação de duas etapas foi empregado: câncer versus normal, LUNC versus HCC, por construção de dois modelos binários de regressão logística polinômica. A regressão logística polinômica possui a vantagem de poder gerar uma pontuação de probabilidade intuitiva e permitir uma interpretação mais fácil. Por exemplo, se o modelo de câncer- versus-normal gera uma pontuação de probabilidade de 70% para certo perfil de metilação, ele sugere que o paciente possui uma probabilidade de 70% de ter câncer. A fim de minimizar o número de predições de câncer falsas, configuramos o limiar de confiança da predição de câncer em 80%. Para pacientes com pelo menos 80% de chance de câncer, aplicamos o modelo de regressão de câncer-versus-câncer para classificar entre LUNC e HCC, o modelo de classificação decidirá se a amostra classificada possui uma confiança acima de 55%.

Construção de um modelo preditivo para prognóstico e sobrevida

[255] O potencial para usar um sistema de pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) baseado tanto em leituras de metilação quanto em leituras não metiladas foi investigado para cada MCB em cfDNA para predição do prognóstico em LUNC e HCC em combinação com características clínicas e demográficas que incluem idade, sexo e estágio de AJCC.

Para cada tipo de câncer, foi construído um modelo de pontuação-cp e ele foi validado aleatoriamente por seleção de metade das observações do conjunto de dados completo como o coorte de treinamento, e o resto tratado como o coorte de validação.

A seleção de variáveis no coorte de treinamento foi realizada e foi construída a pontuação composta no coorte de validação.

Dentro do coorte de treinamento, o esquema de “Lasso randomizado” foi adotado para reduzir a dependência da amostragem para estabilizar a seleção de variáveis a fim de selecionar biomarcadores com uma confiança elevada.

Todo o coorte foi dividido aleatoriamente com uma proporção de 1:1. O procedimento de seleção de variáveis foi efetuado em dois terços do coorte de treinamento.

LASSO foi implementado com um parâmetro de ajuste ótimo determinado pelo erro de generalização esperado pela validação cruzada de 10 vezes ou pela informação baseada em critérios AIC / BIC, aquilo que gerasse o maior pº (a proporção de aleatoriedade explicada) com os biomarcadores selecionados.

As 10 características mais recorrentes de HCC e em LUNC (Tabela 10) foram então agregadas.

Para avaliar a previsibilidade de cada painel externamente, foi obtida uma pontuação composta para cada paciente no coorte de validação por multiplicação das estimativas do coeficiente não enviesado da regressão de Cox e das leituras de metilação.

Uma curva de Kaplan-Meier e um teste do log-rank foram gerados usando a pontuação composta dicotomizada, que formou uma designação de afiliação a um grupo de alto risco e de baixo risco de acordo com sua mediana.

Essa segmentação era compatível com aquela formada por estágio de AJCC. ROC tempo-dependente foi usada para resumir o potencial de discriminação da pontuação composta, estágio de AJCC e a combinação de dois, com curvas ROC variando em função do tempo e acomodando dados censurados. Finalmente, também ajustamos um modelo de regressão de Cox multivariada para avaliar a significância de fatores de risco potenciais.

[256] Toda a análise foi efetuada em R (versão 3.2.3) e Python (versão 2.7.13) com os seguintes pacotes usados: 'glmnet', "*limma', "sobrevida", *sklearn', "lifeline” , 'sobrevida ROC", 'survcomp'.

[257] Toda a testagem de hipótese foi feita por bilateral com valor-p < 0,05 considerado como estatisticamente significante, salvo quando especificamente declarado em contrário.

Características do paciente e da amostra

[258] Características clínicas e perfis moleculares de metilação de DNA foram coletados para 827 amostras tumorais de LUNC e 377 amostras tumorais de HCC do “Cancer Genome Atlas” (TCGA) e 754 amostras normais de um conjunto de dados usado em nosso estudo de metilação prévio sobre envelhecimento (GSE40279) (Hannum e cols., 2013). Dois coortes de pacientes foram estudados. O primeiro coorte era de amostras de tumores sólidos do TCGA e o segundo coorte era de amostras de plasma da China. Para estudar cfDNA em LUNC e HCC, amostras de plasma foram obtidas de 2.396 pacientes chineses com HCC ou LUNC, e de população selecionada aleatoriamente de controles saudáveis compatíveis submetidos a uma assistência médica de manutenção de rotina, resultando em um coorte de 892 pacientes com LUNC e 1.504 pacientes com HCC e 2.247 controles saudáveis normais. Autorização informada por escrito foi obtida de cada participante do estudo. Características clínicas de todos os pacientes e controles estão listadas na Tabela 11. Identificação de marcadores de metilação que diferenciam LUNC e HCC e sangue

[259] Relatos prévios indicam que o plasma contém DNA liberado por tecidos dentro do corpo. Foi formulada a hipótese de que, como o cÍDNA que se origina de células tumorais pode ser detectado em um fundo de cfíDNA liberado predominantemente por leucócitos, marcadores CpG com uma diferença máxima em valores de metilação entre LUNC ou HCC versus leucócitos normais teriam uma maior probabilidade de demonstrar diferenças de metilação detectáveis no cfDNA de pacientes com HCC ou LUNC, quando comparados com aqueles de controles normais. Para identificar supostos marcadores dados de metilação derivados de DNA de tecido de câncer do TCGA e sangue normal, incluindo 827 amostras de sangue de LUNC, 377 de HCC e 754 amostras de sangue de controles saudáveis foram comparados. A fim de identificar sítios de DNA com taxas de metilação significantemente diferentes entre LUNC ou HCC e sangue normal, uma estatística-t com Bayes Empírico foi usada para contração da variância e foram selecionados os 1.000 principais marcadores mais significantes, usando o procedimento de Benjamini-Hochberg para controlar a FDR em um nível de significância de 0,05. O agrupamento hierárquico não supervisionado desses 1.000 marcadores principais foi capaz de distinguir entre LUNC, HCC e sangue normal, e entre LUNC e HCC (Fig. 20). Cerca de

2.000 sondas de inversão molecular (cadeado) que correspondem a esses 2.000 marcadores para captura- sequenciamento cfíDNA do plasma (1.000 para câncer versus normal e 1.000 para LUNC versus HCC) foram então projetadas. Modelo de predição diagnóstica de cfDNA para LUNC e HCC

[260] Os dados de metilação dos 888 Blocos de Metilação Correlacionada (MCB) selecionados que mostraram boas faixas de metilação em amostras de cfDNA foram adicionalmente analisados para identificar MCBs que mostrassem metilação significantemente diferente entre amostras de câncer (LUNC e HCC) versus amostras normais de controle. O agrupamento hierárquico não supervisionado desses MCBs selecionados usando leituras metiladas através de amostras é mostrado na Fig. 20C, e as distribuições dos valores de leitura metilada de MCB para amostras normais, de LUNC e de HCC são mostradas na Fig. 21. Todo o conjunto de dados de metilação de 888 MCBs foi, portanto, analisado pelo método de “Operador de Seleção e Contração Menos Absoluta” (LASSO) e ainda reduziu o número de MCBs. A seleção de características baseada em LASSO identificou 28 MCBs para discriminação de LUNC versus HCC e normal, 27 MCBs para discriminação de HCC versus LUNC e normal, 22 MCBs para discriminação de normal versus HCC e LUNC, resultando em 77 marcadores únicos (5 MCBs superpostos entre modelos). Essa abordagem combinou a informação capturada pelos MCBs em uma pontuação composta baseada em CfDNA (pontuação diagnóstica composta: pontuação-cd). A utilidade dessa pontuação foi avaliada para previsão da presença de LUNC ou HCC usando uma estratégia de hold-out na qual amostras foram atribuídas aleatoriamente a um conjunto de treinamento e a um conjunto de validação com uma proporção de 1:1. O sistema de pontuação foi treinado usando 229 amostras de cfDNA de LUNC, 444 de HCC e 1123 amostras de CfDNA de controle normais e depois validado em 300 amostras de LUNC, 445 de HCC e 1.124 amostras normais. A aplicação do modelo ajustado às amostras do conjunto de validação gerou uma sensibilidade de 92,4% para HCC e 85,8% para LUNC, e uma especificidade de 99,0% para controles normais em um esquema multiclassificações (Tabela 8A). Foi verificado que esse modelo poderia diferenciar com sucesso amostras de LUNC e de HCC de controles normais no coorte de validação (AUC câncer versus normal = 0,979; AUC LUNC versus HCC = 0,924; Fig. 14A, Tabela 8B, Tabela 8C). O agrupamento hierárquico não supervisionado dos 77 MCBs foi capaz de distinguir HCC e LUNC de controles normais com especificidade e sensibilidade elevadas (Fig. 14C e Fig. 14D).

[261] Doenças hepáticas, por exemplo, cirrose e fígado gorduroso, são fatores de risco importantes para HCC. Dessa forma, a pontuação-cd do modelo foi avaliada para diferenciação entre doenças do fígado. Foi verificado que a pontuação-cd foi capaz de diferenciar pacientes com HCC daqueles com doenças do fígado ou controles saudáveis (Fig. 15A). Esses resultados eram consistentes e comparáveis com aqueles previstos por níveis de AFP em HCC (Fig. 15B). A pontuação-cd também podia diferenciar entre pacientes com LUNC e pacientes sem LUNC com uma história de tabagismo (> 1 maço/dia por dez anos) que estavam em um risco aumentado de LUNC (Fig. 15C). Esses resultados eram consistentes e comparáveis com aqueles previstos por níveis de AFP em HCC (Fig. 15D).

Perfis de metilação previram a carga tumoral, resposta ao tratamento e estadiamento

[262] A seguir, a utilidade da pontuação-cd foi estudada na avaliação da resposta ao tratamento, da presença de tumor residual após tratamento, e estadiamento de LUNC e HCC. Em LUNC, as pontuações-cd de pacientes com tumor residual detectável após tratamento (n = 559) foram significantemente maiores do que aqueles sem tumor detectável (n = 160) (p<0,001, Fig. 16A). Similarmente, houve uma boa correlação entre as pontuações-cd e estágio do tumor. Pacientes com doença em estágio inicial (I, II) tiveram pontuações-cd substancialmente menores, comparados com aqueles com doença em estágio avançado (III, IV) (p=<0,005, Fig. 16B). Além disso, as pontuações-cd foram significantemente menores em pacientes com ressecção completa do tumor depois da cirurgia (n = 158), comparadas com aquelas antes da cirurgia (n = 67), embora tenham ficado maiores em pacientes com recorrência (n = 56) (p< 0,01, Fig. 16C). Além disso, as pontuações-cd estavam significantemente maiores em pacientes antes do tratamento (n = 67) ou com progressão (n = 136), comparados com aqueles com uma resposta positiva ao tratamento (n = 328) (p< 0,001, Fig. 16D). Em HCC, as pontuações-cd de pacientes com tumor residual detectável após tratamento (n = 889) foram significantemente maiores do que aqueles sem tumor detectável (n = 314) (p<0,0001, Fig. 16E). Similarmente, houve uma correlação altamente positiva entre pontuações-cd e estágio do tumor. Pacientes com doença em estágio inicial (1, II) tiveram pontuações-cd substancialmente menores, comparados com aqueles com doença em estágio avançado (III, IV) (p<0,001, Fig. 16F). Além disso, as pontuações-cd foram significantemente menores em pacientes com ressecção completa do tumor depois da cirurgia (n = 293), comparadas com aquelas antes de intervenção (n = 109), embora tenham ficado maiores em pacientes com recorrência (n = 155) (p<0,01, Fig. 16G). Além disso, as pontuações-cd estavam significantemente maiores em pacientes antes do tratamento (n = 109) ou com progressão (n = 381), comparados com aqueles com resposta ao tratamento (n = 249 (p< 0,001, Fig. 16H). Alterações dinâmicas longitudinais seriais foram obtidas de valores de metilação de sítio CpG cgl0673833 em vários indivíduos com LUNC ou paciente com HCC a fim de monitorar a resposta ao tratamento e foi verificado que houve uma correlação elevada entre valores de metilação e resultados finais do tratamento (Fig. 23, Fig. 24 e Fig. 25). Coletivamente, os resultados mostraram a correlação significante entre a pontuação-cd (ou seja, a quantidade de CfDNA no plasma) e carga tumoral, demonstrando sua utilidade para a predição de resposta do tumor e para vigilância para detectar recorrência. Utilidade diagnóstica de cfDNA, comparado com AFP e CEA

[263] Apesar dos enormes esforços, um biomarcador sanguíneo não invasivo eficaz para vigilância e diagnóstico de LUNC e HCC ainda não existe. CEA (antígeno carcinoembrionário) e AFP preencheram esse papel para o câncer de pulmão e HCC por décadas, mas sua sensibilidade e especificidade são inadequadas. Além disso, alguns pacientes com carcinoma de célula escamosa ou câncer de pulmão de pequena célula não terão níveis sanguíneos de CEA aumentados. AFP possui baixa sensibilidade de 60%, o que a torna inadequada para detecção de todos os pacientes que desenvolverão HCC e, dessa forma, limita acentuadamente sua utilidade clínica.

Na verdade, é comum que pacientes cirróticos com HCC não exibam nenhum aumento no nos níveis de AFP.

Surpreendentemente, 30% dos pacientes do coorte de estudo de HCC possuem um valor de AFP normal (<25 ng/ml). Em pacientes com LUNC comprovado por biópsia do coorte inteiro, a pontuação-cd demonstrou sensibilidade e especificidade superiores ao CEA para diagnóstico de LUNC (AUC 0,977 (pontuação-cd) versus 0,856 (CEA), Fig. 160). Tanto a pontuação-cd quanto os valores de CEA estavam altamente correlacionados com o estágio do tumor (Fig. 16JI, Fig. 16B). Por outro lado, a pontuação-cd demonstrou sensibilidade e especificidade superiores à AFP para diagnóstico de HCC (AUC 0,993 versus 0,835, Figura 4R) em pacientes com HCC comprovado por biópsia.

Tanto a pontuação-cd quanto os valores de AFP estavam altamente correlacionados com o estágio do tumor (Fig. 16F e Fig. 16N). Em pacientes com resposta ao tratamento, recorrência ou progressão do tumor, a pontuação-cd mostrou mais alterações desde o diagnóstico inicial do que aquelas da AFP (Fig. 16G e Fig. 16H, Fig. 160 e Fig. 16P). Em pacientes com LUNC com resposta ao tratamento, recorrência ou progressão do tumor, a pontuação- cd mostrou alterações mais significantes desde o diagnóstico inicial do que aquelas de CEA (Fig. 16C e Fig. 16D, Fig. 16K e Fig. 16L). Em pacientes com LUNC e HCC com amostras seriais, houve uma diminuição concomitante e significante na pontuação-cd em pacientes com uma resposta positiva ao tratamento do que em pacientes antes do tratamento.

Havia uma redução ainda maior na pontuação-cd em pacientes depois da cirurgia.

Em contraste, houve um aumento na taxa de metilação em pacientes com doença progressiva ou recorrente

(Fig. 23). Por comparação, CEA e AFP foram menos sensíveis para avaliação da eficácia do tratamento em pacientes individuais (Fig. 24 e Fig. 25). Modelo prognóstico de cfDNA para HCC e LUNC

[264] O potencial da utilização de uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) com base na análise de metilação de cÍDNA para predição do prognóstico em LUNC e HCC em combinação com características clínicas e demográficas que incluem idade, sexo, estágio de AJCC e valor de AFP, foi investigado. No total 599 pacientes com LUNC e 867 pacientes com HCC foram arrolados na análise de prognóstico (pacientes sem carga tumoral são excluídos da análise). O tempo de acompanhamento mediano foi de 9,5 meses (variando de 0,6-26 meses) no coorte de LUNC e 6,7 meses (variando de 1,2-21,0 meses) no coorte de HCC. No coorte de HCC, o conjunto de dados de treinamento continha 433 observações com 41 eventos e o conjunto de dados de validação continha 434 observações com 58 eventos. Por utilização de métodos de aprendizagem estatística, foi construído um modelo preditivo usando 10 MCBs de CpG (Tabela 10) que podem separar o coorte de HCC em grupos de alto e baixo risco, com sobrevida mediana significantemente maior no grupo de baixo risco do que no grupo de alto risco (teste do log-rank = 24,323, df = 1, p<0,001) (Fig. 17A). No coorte de LUNC, o conjunto de dados de treinamento continha 299 observações com 61 eventos e o conjunto de dados de validação continha 434 observações com 58 eventos. Um painel de 10 marcadores CpG (Tabela 10) foi capaz de dividir o coorte de LUNC em grupos de alto e baixo risco, com sobrevida mediana significantemente maior no grupo de baixo risco do que no grupo de alto risco (teste do log-rank = 6,697, df = 1, PpP<0,001) (Fig. 17B).

[265] O modelo de regressão de Cox multivariado mostrou que a pontuação-cp estava significantemente correlacionada com a incidência de mortalidade tanto em HCC quanto em LUNC. A pontuação-cp era um fator de risco de sobrevida independente no coortes de validação tanto em HCC quanto, no limite, em LUNC (proporção de risco = 2,4881, p = 0,0000721 em HCC; proporção de risco = 1,74, p = 0,068 em LUNC; p = 0,0017 em LUNC; Tabela 12). Curiosamente, quando a pontuação- cp e outras características clínicas eram consideradas em HCC, AFP não era mais significante como um fator de risco (Tabela 13). Como esperado, o estágio de TNM (como definido pelas diretrizes de AJCC) previu o prognóstico de pacientes tanto em HCC (Fig. 17C) quanto em LUNC (Fig. 17D). A combinação de pontuação-cp e estadiamento de TNM aumentou nossa habilidade para prever o prognóstico tanto no coorte de HCC (AUC 0,867, Fig. 17E) quanto no de LUNC (AUC 0,825, Fig. 17F).

Marcadores de metilação no diagnóstico precoce de LUNC e HCC

[266] Como LUNC e HCC são cânceres muito agressivos com prognóstico e sobrevida ruins, e a remoção cirúrgica de câncer em estágio 1 carrega um prognóstico bem mais favorável, a detecção precoce se torna uma estratégia crucial na redução da morbidade e mortalidade. O método de utilização de marcadores de metilação para previsão da ocorrência de câncer em populações de alto risco foi investigado em dois estudos —prospectivos. No primeiro estudo, pacientes consecutivos foram recrutados de um grupo de pacientes com nódulos sólidos no pulmão >10 mm identificados em varreduras por TC do tórax. Esses pacientes foram arrolados em um estudo para detecção precoce do pulmão em fumantes e foram submetidos a uma triagem de câncer de pulmão baseada em varredura por TC. Pacientes que se apresentam com um nódulo sólido no pulmão (entre 10 mm e 30 mm de tamanho, n = 208, Tabela 13) foram selecionados para serem submetidos à definição de perfil de metilação no momento da triagem. Esses pacientes foram subsequentemente acompanhados por meio de testagem secundária para determinar se os nódulos eram causados por LUNC ou uma condição benigna causada por inflamação ou infecção por biópsia de tecido e verificação patológica. O perfil de metilação foi suficiente para diferenciar pacientes com lesões de LUNC em estágio 1 comprovado por biópsia, comparados com pacientes com nódulos benignos causados por condições inflamatórias ou infecciosas (Fig. 18, Tabela 14). Entre os pacientes com pelo menos 59% de confiança para diagnóstico, o valor preditivo positivo (PPV) de estágio I câncer foi de 95,9% e o valor preditivo negativo (NPV) foi de 97,4%. Similarmente, incluímos prospectivamente pacientes de alto risco com HCC com cirrose hepática (n = 236, Tabela 13). O perfil de metilação foi capaz de prever a progressão para HCC em estágio 1 com 89,5% de sensibilidade e 98,2% de especificidade (Fig. 19, Tabela 14) entre os pacientes com pelo menos 58% de confiança para diagnóstico. PPV foi de 80,9% e NPV foi de 99,1%.

[267] Nesse estudo, primeiro foram determinados sítios CpG metilados diferencialmente em amostras tumorais de LUNC e HCC versus sangue normal. A seguir, esses marcadores foram interrogados no cfDNA de um grande coorte de pacientes com LUNC e HCC, bem como de controles normais. Foi desenvolvido um modelo diagnóstico (pontuação-cd) usando a metilação de CÍDNA para prever a presença de câncer enquanto, ao mesmo tempo, diferenciar entre LUNC e HCC.

[268] À pontuação-cd discriminou pacientes com HCC de indivíduos com infecção por HBV/HCV, cirrose e doença gordurosa do fígado, bem como controles saudáveis. Em alguns casos, é importante que um teste no soro faça confiavelmente a distinção desses estados de doença de HCC. De acordo com os resultados, a sensibilidade da pontuação-cd para HCC é comparável ao ultra-som do fígado, o padrão atual para triagem de HCC. Além disso, em alguns casos, ela é superior à AFP, o único biomarcador usado clinicamente para HCC, o que torna a pontuação-cd uma abordagem mais econômica e com menor uso intensivo de recursos. Além disso, ao mostrar sua correlação elevada com a carga tumoral de HCC, resposta ao tratamento e estágio, a pontuação-cd do modelo demonstrou desempenho superior à AFP no presente coorte (os valores da AFP estavam dentro da faixa de normalidade para 40% de nossos pacientes com HCC durante toda a evolução de sua doença). Em alguns casos, a pontuação-cd pode ser particularmente útil para avaliação da resposta ao tratamento e da vigilância para recorrência em HCC. Como quase todos os pacientes com HCC tiveram hepatite (mais provavelmente hepatite B) no estudo, HCC decorrente de outras etiologias podem ter padrões de metilação de cfDNA diferentes. Similar ao HCC, a triagem para câncer de pulmão possui um custo elevado, que envolve imageamento por CT do tórax, que possui uma exposição à radiação associada e uma taxa elevada de falsos-positivos. Em alguns casos, a pontuação-cd distingue confiavelmente fumantes e pacientes com câncer de pulmão e também pode ter utilidade na melhora da triagem e vigilância.

[269] Modelos de predição prognóstica também foram construídos para HCC e LUNC pela pontuação-cp. A pontuação- cp distinguiu eficazmente pacientes com HCC e LUNC com prognóstico diferente e foi validada como um fator de risco prognóstico independente em uma análise de multivariáveis em nossos coortes. Vale ressaltar, para previsão do prognóstico em HCC, a análise de cfDNA foi novamente superior à AFP. Em alguns casos, esse tipo de análise é útil para identificação de pacientes para os quais são necessários um tratamento mais ou menos agressivo e vigilância.

[270] Tabela 8A. Tabela de contingência de diagnóstico por multiclassificações no coorte de validação. Le a as [| ão ascrardo | a a |

[271] Tabela 8B. Tabela de contingência de diagnóstico por classificação binária entre HCC e normal.

fspeciticiaade (1 [O as

[272] Tabela 8C. Tabela de contingência de diagnóstico por classificação binária entre LUNC e normal.

Não decidide Sensibilidade (O ME

[273] Tabela 9. Lista de MCBs selecionados por LASSO multiclasses e usados para geração de pontuação-cd. A, normal; B, LUNC; C, HCC. A, Normal Coeficientes de regressão Contagens logística As Gene de — Diagnóstico] MCBs de ID do Alvo e Câncer . Ireferêncial| LUNC versus leituras versus Hce normal 474165 cg13912307 | stca9a13 [-0,119495297 —0,097830945 11º cgoB794954 | opza |-0,502459754 —0,119001342 791245 cgo8794954 | opza |-0,050537881 —0,237868292 12- cgo0344358 0,013443025 |-0,152292508 561356 cgo0344358 0,210631385 | -0,24781796 cgos773599 | worso |-o, 220759943 /-0,438656833 16-7128 cgos773599 0,123092944 | -0,14690629 16- | me [egoizasez| - | 0,05314766 | 0,335012824 17º cg12054453 0,062499156 |-0,478242327 742484 cg24166450 NNE 0,443449771 | 0,566346654 1139315 cgos366118 0,039975437 |-0,005683265 cg21972382 | eira [-0,099097051 —0,61331161 2-293390 3- cgo6722069 | = |-0/427422216 —0,26910555 1138223 cgo6722069 NNE 0,089047399 |-0,071525276 cgo7748255 0,217866978 |-0,457591409 4-13248

5-429520 cg17757602 | = [-on133713163 —0,355503949 egl7757602 Foro 0,127773182 | 0,169659022 5-429521 cgo3161803 | = |-0r134554024 0,040255772 6-276491 cgo3161803 | = |-0r076945207 —0,517353281 cg0o1087382 0,132083258 |-0,263202543 6-912971 cgo1087382 0,023651284 | 0,314783378 cgis7aosas| = 0,028390415 | -0,269846773 9-885141 ca13740515] == — |-0,208939054 —0,193859618 cg13176022 0,511857283 | 0,042177783 X-27307 cg13176022 0,048888339 | -0,232292001 B: LUNC Coeficientes de regressão Contagens logística orósE: Gene de - Diagnóstico| MCBs de ID do Alvo e Câncer , Ireferência| LUNC versus leituras versus HcC normal 1º cgoo100121 | ciorf114 | 0,058289236 |-0,460201686 11- | nm Jegissssais| six | 0,374105093 |0,246746019 1169673] não me | cgl6858415 0,297361321 | 0,42281836 476248 cgoss85544 NNE 0,127193074 |-0,357434967 11º | me Jegosza23942| usess | 0,049737225 | 0,05832888 LUNC 45 191245 cgos794954 —0,050537884 |-0,237868292 687588 cg20323175 lo= —0,249738102 | 0, 397951832 12- cg16959747 0,09713964 |-0,079430598 13º | me Jegassssssz| - | 0,168798263 |-0,174946818 256210 cg25366582 NNE 0,031754087 | 0,303827389 16º | me Jcgosssosso| cenez | 0,235333764 | 0,168616245 571473 cgo6880930 —0,072680275 |-0,290080025 172 | me [egassa6tso| crIBA | —0,01244657 | 0,090902282

[16560 ra se aseneis orserns rr forces - - Ee fases] e rea 0 26955] [oito rece esse] rsss praia - se ema] = uvonsorTa [o oesezrea] [19520 re eim] oasis sus - c

EF - 7 - : - Cc: HCC piagnóstico MCBs de —|TD do AlVO o ferêncial LUNC versus |Câncer versus = see | Ee feed = [cessa [20 agree]

o e em [55 [7655 | [126% ste amei] o camas [oc cenmasas | - [26 st fear o oraeenses co 21056677] . . . . e

.

T

[274] Tabela 10. Características de 10 MCBs em predição de prognóstico de LUNC e 10 MCBs em predição de prognóstico de HCC. O ementas | nono | ENS, Características ID do Alvo . . referência [orem | creo | = | me 22355200 | cgoasetae | = e. [omedaennsse | camosatts | =

[275] Tabela 11. Características clínicas do coorte de estudo. HCC de | LUNC de GSE Característica| TCGA TCGA Normal HC TUNC Normal Tecido | Tecido |Sangue Sangue | Sangue Sangue ER | Nº de mulheres 122 340 401 146 263 (%) (67,6) | (58,9) | (46,8) | (65,9) | (54,6) 367 142 a: EEE

Idade (anos) [maia [e [| [6 [| Carcinoma 367 1504 hepatocelular (97,3) o NA (100) o NA (%) Adenocarcinoma 458 402

NA NA (%) (55,4) (45,1) Carcinoma de 369 138 célula NA NA (44,6) (15,5) escamosa (%) Câncer de pulmão de 79 o NA NA pequena célula (8,9) (%) Out: (%) o o NA 273 NA Yr meros (2,7) (30,6) 175 424 . 206 58 NA (46,4) | (51,3) (13,7) | (6,5) 87 115 202 52

NA NA (23,1) (13,9) (13,4) | (5,8) 86 261 612 148 I11I (%) NA NA (22,8) | (31,6) (40,7) | (16,6) 134 46 IV (%) 6 (1,6) 25 (3,0) NA 3 3 NA (8,9) | (51,9) 23 350 171 2 (0,2 NA NA | om [12% [aa] ss | (23,3) | (19,2) = | Livre de tumor| 236 503 314 160

NA NA (%) (62,6) | (60,8) (20,9) | (17,9) 114 159 889 599 C: t % NA NA (30,2) [esa | | (59,1) lena] > | 27 165 301 133

NA NA (7,2) (20,0) (20,0) | (14,9) Tipo amplo (%) NA 400 NA NA 102 NA PO amp (48,4) (11,4) Mutação (%) NA 100 NA NA oo NA (12,1) (7,7) 327 721

NA NA NA NA (39,5) (80,8) 120 623 Positi % NA NA NA 379 (16,9 Negativo (9) | 19 | mM | mM | Dn | mw 5165

FL EIE EITA 138 21 1297

NA NA NA (36,6) (3,2) (57,7) Tabagismo (%) Fumante atual NA 125 NA NA NA 192 (8,5) (%) (87,7) ' Não fumante | PO ft | om oo eo mo ao 1385 NA |22 (2,6) NA NA NA (61,6)

[276] Tabela 12. Análise multivariada de sobrevida para pacientes com pacientes com HCC e LUNC com pontuação composta de marcadores de metilação (pontuação-cp) e variáveis relevantes em coortes de validação. 0,95 0,95 Coef coef. se infe- | supe- ' (coef.) |(coef.) . P rior rior Pontua- o 7 7 1 7 ão-ep | 9 ENO) &s 0,21429/0, 6o690sº9t SIS? rs —lo,214291 gão-cPp 1458 543 458 Estágio |291605427 0,52471 21 /egl60542 0,524710| 9: 5 F5 0881 [0/648261| “os F5 381 504 egosssTa ATP2B4 | 0,19823 0, 368854299 SSTA ATP2B4 |0,198233 3007 771 007 Idade |c90663761 0,02377/0, 157886 /cg066376 0,023774 8 ATP2PA | 4113 336 18 | ATP | “13 egossoTas 0,29389 0,012727/2902597? 0,293894 4301 778 í 301 0,95 0,95 Coef Se infe- supe- ' (coef.) À P rior rior Pontua- = 0,5577 1,7467 | 0,3056 | 1,8249| 0,0680|-0,0414 | 1,1569 ção-cp Idade |-377 - 1 " - | ande | 322,08 9,000 3393 010007 506/6920 235, 2702 | Sexo | 0,0897 | 1,0936

[277] Tabela 13. Características clínicas e sensibilidade/especificidade para detecção de LUNC em estágio I e nódulos benignos no pulmão. Sensibilidade e Especificidade para a detecção de câncer Câncer de pulmão Nódulos Característica em Estágio I benignos N = 116 N = 116 [LL rasasaros O LL seo ATO [teres a ss [ia TO o Beam

NA escamosa een Sema | pequena célula [ouros a | | Famanho do nódulo Em | [aaa so a Estagio O EF E a | e CI) nu es CI) se ee — % (95% CI) '! o ae e — % (95% CI) '

[278] Tabela 14. Características clínicas e sensibilidade/especificidade para detecção da progressão para HCC em estágio I a partir de cirrose hepática.

Sensibilidade e Especificidade para a detecção de câncer

Câncer hepático . z : Ls Cirrose Característica em Estágio I N = 242 N = 204 [| saesaros TOO Lo TO a LF ATO A a < E 15/l Sensibilidade — % (95% 294,9 CI) Especificidade — % (95% 92,6 CI) Valor preditivo positivo — % (95% CI) Valor preditivo negativo 92,8 — % (95% CI) — Exemplo 3

[279] O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma causa importante de mortes por câncer em todo o mundo. Como ocorre com muitos cânceres, HCC detectado em um estágio inicial carrega um prognóstico bem melhor comparado com a doença em estágio avançado, em parte em função da eficácia relativa de tratamentos locais, comparados com terapia sistêmica. Em alguns casos, a detecção precoce possui um potencial para redução da mortalidade de HCC. Em alguns casos, a proteína fetal-alfa (AFP) é usada para detecção e vigilância de HCC. No entanto, em alguns casos, sua utilidade clínica é limitada por baixa sensibilidade.

[280] A metilação de DNA é um regulador epigenético da expressão gênica que normalmente resulta em silenciamento gênico. No câncer, a metilação de DNA está tipicamente aumentada em genes supressores de tumor e se apresenta como uma das primeiras alterações neoplásicas. O DNA tumoral circulante (ctDNA) compreende fragmentos de ácidos nucleicos extracelulares liberados no plasma por meio de necrose da célula tumoral, apoptose e liberação ativa de DNA. Em alguns casos, ctDNA que possui padrões de metilação câncer- específicos é usado como um biomarcador no diagnóstico de cânceres.

Dados de pacientes

[281] Dados de metilação de DNA de tecidos foram obtidos do “Cancer Genome Atlas” (TCGA). Conjuntos de dados clínicos, moleculares e histopatológicos completos estão disponíveis na página da Internet do TCGA. Instituições individuais que contribuíram com amostras coordenaram o processo de autorização e obtiveram autorização informada por escrito de cada paciente de acordo com seus respectivos conselhos de revisão institucionais.

[282] Um segundo coorte chinês independente consistiu em pacientes com HCC no “Sun Yat-sen University Cancer Center” em Guangzhou, no “Xijing Hospital” em Xi'an e no “West China Hospital” em Chengdu, China. Aqueles que se apresentaram com HCC de estágio I-IV foram selecionados e incluídos nesse estudo. As características do paciente e as características do tumor estão resumidas na Tabela 17. A classificação de estadiamento de TNM para HCC está de acordo com as “NCCN Hepatobiliary Cancers Clinical Practice Guidelines” (Benson III AB, Abrams TA, Ben-Josef E e cols. “Hepatobiliary Cancers: Clinical Practice Guidelines in Oncology”. Journal of the National Comprehensive Cancer Network: JNCCN 2009; 7: 350). Esse projeto foi aprovado pelos IRBs de “Sun Yat-sen University Cancer Center”, “Xijing Hospital” e “West China Hospital”. Autorização informada foi obtida de todos os pacientes. Tecidos do tumor e normais foram obtidos como clinicamente indicado para assistência ao paciente e foram retidos para esse estudo. Amostras de sangue humano foram coletadas por punção venosa e amostras de plasma foram obtidas por retirada do sobrenadante após centrifugação e armazenadas a -80ºC antes da extração de cfDNA. Fontes de dados

[283] Dados de metilação de DNA de 485.000 sítios gerados usando o “Infinium 450K Metilation Array” foram obtidos do TCGA e conjunto de dados gerados pelo estudo prévio (GSE40279), no qual perfis de metilação de DNA para HCC e sangue foram analisados. Foram gerados arquivos no formato IDAT dos dados de metilação contendo os valores de proporção de cada micropartícula escaneada. Usando a suíte de aplicativos Minfi de Bioconductor, esses arquivos de dados foram convertidos em uma pontuação, denominada um valor Beta. Os valores de metilação do coorte chinês foram obtidos por sequenciamento direcionado de bissulfato usando uma sonda de inversão molecular e analisados como descrito abaixo. Análise estatística - Pré-seleção de marcador de metilação de DNA para análise diagnóstica e prognóstica

[284] Primeiro foi realizada a análise de metilação diferencial em dados do TCGA usando uma abordagem de “contração moderada de estatística-t” e o valor-P para cada marcador foi então corrigido por testagem múltipla pelo procedimento de Benjamini-Hochberg para controlar FDR em um nível de significância de 0,05. A lista foi classificada por valor-P ajustada e selecionados os 1.000 marcadores principais para o design de sondas-cadeado (Fig. 26). Foram obtidas cerca de 682 sondas-cadeado que geraram sinais de amplificação por PCR positivos e específicos e foram usadas como sondas de captura nos experimentos subsequentes em amostras de cfDNA (Fig. 27A-Fig. 27H). Amostras de cfDNA com baixa qualidade ou menos do que 20.000 leituras por amostra também foram eliminadas. Cerca de 1.933 amostras de cfDNA foram incluídas no estudo (1.098 amostras de sangue de HCC e 835 amostras de sangue normais). Os valores de metilação para cada marcador foram definidos como a proporção de contagens de leitura com metilação dividida por contagens de leituras totais. Das 682 sondas-cadeado, cerca de 401 marcadores foram retidos para análise posterior após eliminação de marcadores de metilação com uma faixa de valores de metilação menores do que O0O,l em amostras compatíveis de tecido tumoral e amostras de sangue do tumor (Fig. 27A). Para marcadores de metilação particulares com menos do que 20 leituras únicas, um valor de metilação médio imputado de HCC ou controles saudáveis normais foi usado. Construção de um modelo diagnóstico

[285] O conjunto de dados completo de cfíDNA (1.098 amostras de sangue de HCC e 835 amostras de sangue normais foi dividido aleatoriamente em coortes de treinamento e de validação com uma proporção de 2:1, que corresponde a 1.275 e 658 amostras totais, respectivamente. Dois métodos de seleção de variáveis adequados para dimensionalidade elevada no conjunto de dados de treinamento pré-avaliado foram aplicados: “Operador de Seleção e Contração Menos Absoluta”

(LASSO) e método de seleção de variáveis baseado em “Random Forest” usando erro OOB. Como os resultados podem depender fortemente da escolha arbitrária de uma divisão de amostras aleatória para dados multidimensionais esparsos, uma análise do método “multidivisão” foi adotada, que aumenta a consistência da seleção de variáveis controlando, ao mesmo tempo, o erro finito de amostra. Para o operador de seleção de LASSO, 75 por cento do conjunto de dados foram subamostrados sem substituição 500 vezes e selecionados os marcadores com frequência de ocorrência repetida mais do que

450. Os parâmetros foram determinados de acordo com o erro de generalização esperado estimado a partir de validação cruzada 10 vezes e critérios AIC/BIC baseados em informação, e adotamos o maior valor de lambda, de modo que o erro estivesse dentro de um erro-padrão do mínimo, conhecido como lambda “l-se”. Para a análise “Random Forest”, usando o erro OOB como um critério de minimização, a eliminação de variáveis pelo “Random Forest” foi realizada configurando variável uma fração de retirada de cada iteração em 0,3. Des marcadores de metilação superpostos foram escolhidos pelos dois métodos para construção do modelo de uma predição binária. Um modelo de regressão logística foi adaptado usando esses 10 marcadores como as covariáveis e foi obtida uma pontuação diagnóstica combinada (designada pontuação-cd) por multiplicação das estimativas do coeficiente não enviesado e da matriz do valor de metilação do marcador nos conjuntos de dados tanto de treinamento quanto de validação. A previsibilidade do modelo foi avaliada por área sob ROC (AUC, também conhecida como índice-C), que calculava as proporções de pares concordantes entre todos os pares de observações com 1,0 indicando uma precisão de predição perfeita. Foram geradas tabelas de confusão usando um valor de corte otimizado da pontuação-cd com um índice de Youden máximo.

[286] O nível de metilação pré-tratamento ou inicial foi avaliado no nível de base, e o nível pós-metilação foi avaliado aproximadamente 2 meses após tratamento, em que o tratamento se refere a quimioterapia ou ressecção cirúrgica do tumor. O desfecho primário (incluindo resposta ao tratamento: doença progressiva (PD), resposta parcial (PR) e doença estável (SD)) foi definido de acordo com as diretrizes de RECIST. Para pacientes tratados com remoção cirúrgica e nenhuma recorrência no momento de avaliação, foi presumido que eles tiveram resposta completa (CR). A diferença de distribuição da pontuação-cd entre categorias clínicas foi examinada pelo teste “Wilcoxon Rank Sum”, na medida em que a pontuação-cd foi testada como sendo distribuída não normalmente usando um teste de Shapiro-Wilk. Construção de um modelo preditivo para prognóstico e sobrevida

[287] O coorte de HCC foi dividido em um conjunto de dados de treinamento e um conjunto de dados de validação e explorou a construção de um modelo preditivo para prognóstico e sobrevida. Cerca de 680 casos foram usados para treinamento e 369 casos para validação. A seguir, no conjunto de dados de treinamento, uma estratégia de seleção de variáveis sequencial baseada em modelo foi aplicada para avaliar os marcadores para previsão do resultado de sobrevida final Primeiro foi realizado um procedimento univariado pré- triagem para remover ruído excessivo para facilitar a análise computacional, que é geralmente recomendada antes da aplicação de qualquer método de seleção de variáveis. Para cada marcador de metilação, foi ajustado um modelo de riscos proporcionais de Cox univariado por utilização de cada marcador como a covariável. Um marcador com valor-p < 0,05 pela estatística de Wald foi retido no conjunto de dados. Segundo, uma estratégia de subamostragem similar foi usada em um processo de seleção de marcador diagnóstico com base no método de LASSO-Cox para contrair os números de marcadores para uma faixa razoável (menor do que eventos). Ligeiramente diferente do classificador binário, a subamostragem no conjunto de dados de treinamento com substituição caso a proporção de eventos fosse muito baixa para construção de um modelo. O valor de corte da frequência foi definido como 50 para reter aproximadamente 1/10º dos eventos totais. A análise acima gerou 8 marcadores finais para a construção de uma assinatura prognóstica. Por ajuste de um modelo de riscos proporcionais de Cox de multivariáveis nesses 8 marcadores, os coeficientes de cada marcador foram determinados e uma pontuação prognóstica combinada (designada pontuação-cp) foi obtida para cada indivíduo. Para validar o modelo preditivo, uma pontuação-cp foi calculada para cada paciente no conjunto de dados de validação usando estimativas de coeficiente do conjunto de dados de treinamento. Por divisão da pontuação- cp de acordo com sua mediana, foram formados grupos com pontuação-cp alta e baixa com um número aproximadamente igual de observações. Foi investigado se o tempo de sobrevida mediano era significantemente diferente entre esses dois grupos usando um estimador de Kaplan-Meier e teste do log- rank.

[288] Usando a pontuação-cp e informação clínica como covariáveis, modelos de riscos proporcionais de Cox de multivariáveis foram ajustados separadamente nos conjuntos de dados de treinamento e de validação para inferir se a pontuação-cp é um fator preditivo independente quando comparado com AFP, estágio, sexo e idade para prognóstico de HCC.

[289] Toda a testagem de hipótese é bilateral com valor- bp < 0,05 considerado como estatisticamente significante. Toda a análise foi efetuada em R versão 3.2.3 com os seguintes pacotes usados: 'glmnet'/, 'rms'”, 'pROC', 'limma” "ROCR', 'varSelRF' e "sobrevida! .

Extração de DNA tumoral

[290] A extração de DNA genômico de tecidos saudáveis ou de câncer recém congelados foi realizada com o “QIAamp DNA Mini Kit” (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Aproximadamente 0,5 mg de tecido foi usado para obter na média 5 yg de DNA genômico. DNA foi armazenado a - 20ºC e analisado dentro de uma semana de preparação. Extração de DNA de amostras de FFPE

[291] DNA genômico de amostras de FFPE congeladas foi extraído usando o “QIAamp DNA FFPE Tissue Kit” com várias modificações. DNA foi armazenado a -20ºC para análise posterior.

Extração de DNA livre de células de amostras de plasma

[292] A extração de cfDNA de 1,5 ml de amostras de plasma foi realizada com o “QIAamp cíDNA Kit” (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante.

[293] O volume mínimo de plasma que irá gerar uma recuperação de CcfDNA consistente e uma cobertura de sequenciamento confiável definida como mais de 20 leituras para um marcador cg-alvo, foi investigado. Foi demonstrado que uma exigência de pelo menos 20.000 leituras totais por amostra correspondia a 20 ou mais leituras por marcador cg para aproximadamente 90% de marcadores em uma amostra e era exato para produzir uma boa predição do valor beta do marcador cg correspondente. Foi verificado que 1,5 ml ou mais plasma pode gerar 20 ou mais leituras por marcador cg para aproximadamente 90% de marcadores em uma amostra. O relacionamento entre a quantidade de cfDNA em 1,5 ml de plasma e os números de cópia foi ainda investigado usando PCR digital de gotícula. Foi verificado que a quantidade de DNA de 15 ng gerava bons números de cópia, como definidos por > 140 cópias de amplicons totais detectadas em cada ensaio de PCR digital de gotícula (Fig. 39B) e um volume mínimo de 1,5 ml de plasma gerava um rendimento de cfDNA de ng. Cerca de 15 ng/1,5 ml foram usados como um valor de corte nos experimentos para obter medições consistentes e confiáveis de quantidade de DNA e boa recuperação. O rendimento de cfDNA também foi comparado por vários kits de extração de cfDNA comerciais (EliteHealth, Qiagen e Thermo Fisher). Foi verificado que os kits de extração de cfDNA EliteHealth ou Qiagen geravam as maiores quantidades de cfDNA de uma forma altamente consistente [aproximadamente 10 ng +/- 3 ng/por 1 ml de plasma, Fig. 39C]. Conversão com bissulfito de DNA genômico

[294] Cerca de 10-15 ng de cfDNA foram convertidos em bis-DNA usando o “EZ DNA Metilation-Lightning"" Kit” (Zymo Research) de acordo com o protocolo do fabricante. O bis-DNA resultante tinha uma distribuição de tamanho de aproximadamente 200-3.000 pb, com um pico em torno de aproximadamente 500-1.000 pb. A eficiência da conversão com bissulfito foi de >99,8%, como verificado por sequenciamento profundo de bis-DNA e análise da proporção de conversão de C para T de dinucleotídeos CH (não-CG).

Determinação de níveis de metilação de DNA por sequenciamento profundo de bis-DNA capturado com sondas de inversão molecular (cadeado)

[295] Marcadores de CpG cujos níveis de metilação diferiam significantemente em qualquer uma das comparações entre qualquer tecido de câncer e qualquer tecido normal foram usados para o design sondas-cadeado para captura e sequenciamento de cfÍDNA. A captura por cadeado de bis-DNA foi baseada na técnica em métodos publicados com modificações.

Design e síntese de sondas

[296] Sondas-cadeado foram projetadas usando o software ppDesigner. O comprimento médio da região capturada foi de 100 pb, com o marcador CpG localizado na porção central da região capturada. A sequência vinculadora entre braços continha sequências de ligação para iniciadores de amplificação separadas por um trecho variável de Cs para produzir sondas de comprimento igual. Uma sequência de identificador molecular único de 6-pb (UMI) foi incorporada no design de sondas para permitir a identificação de eventos de captura molecular individual únicos e a pontuação precisa de níveis de metilação de DNA. Veja a Tabela 19.

[297] As sondas foram sintetizadas como oligonucleotídeos separados usando métodos de síntese comerciais padronizados (ITD). Para experimentos de captura, as sondas foram misturadas, fosforiladas in vitro com T4 PNK

(NEB) de acordo com as recomendações do fabricante e purificadas usando colunas P-30 Micro Bio-Spin (Bio-Rad). Captura de bis-DNA

[298] Cerca de 10 ng de DNA convertido com bissulfito foram misturados com sondas-cadeado em reações de 20 ul contendo 1X tampão Ampligase (Epicentre). Para anelar as sondas ao DNA, desnaturação de 30 segundos a 95ºC foi seguida por um resfriamento lento até 55ºC em uma taxa de 0,02ºC por segundo. A hibridização foi deixada para completar por 15 horas a 55ºC. Para preencher lacunas entre braços anelados, nl da mistura seguinte foram adicionados a cada reação: 2 U de PfuTurboCx polimerase (Agilent), 0,5 U de Ampligase (Epicentre) e 250 pmol de cada dNTP em 1X tampão Ampligase. Após incubação de 5 horas a 55ºC, as reações foram desnaturadas por 2 minutos a 94ºC. 5 1ul de mistura de exonucleases (20 U de Exo I e 100 U de ExoIII, ambas de Epicentre) foram adicionados, e a degradação de DNA de fita simples foi realizada a 37ºC por 2 horas, seguida por inativação enzimática por 2 minutos a 94ºC.

[299] Produtos circulares de captura sítio-específica foram amplificados por PCR com codificação de barras concomitante de amostras separadas. A amplificação foi realizada usando iniciadores específicos para DNA vinculador dentro de sondas-cadeado, um das quais continha códigos de barras específicos de 6 pb. Ambos os iniciadores continham sequências adaptadoras de sequenciamento de geração próxima Illumina. PCR foi feita da seguinte forma: 1X Phusion Flash Master Mix, 3 pl de DNA capturado e 200 nM de iniciadores, usando o seguinte ciclo: 10 s a 98ºC, 8X de (1 s a 98ºC, 5 s a 58ºC, 10 s a 72ºC), 25X de (1 s a 98ºC, 15 s a 72ºC), 60 s a 72ºC. As reações de PCR foram misturadas e a biblioteca resultante foi selecionada por tamanho para incluir capturas eficazes (aproximadamente 230 pb) e excluir capturas “vazias” (aproximadamente 150 pb) usando micropartículas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter). A pureza das bibliotecas foi verificada por PCR usando iniciadores adaptadores de célula de fluxo de Illumina (P5 e P7) e às concentrações foram determinadas usando o ensaio “Qubit dsDNA HS” (Thermo Fisher). As bibliotecas foram sequenciadas usando sistemas MiSeq e HiSeg2500 (Illumina). Otimização da uniformidade da cobertura de captura

[300] O sequenciamento profundo dos experimentos-pilotos de captura originais mostrou diferenças significantes entre número de leituras capturadas pela maioria das sondas eficientes e sondas não eficientes (60-65% de regiões capturadas com cobertura > 0,2x da média). Para melhorar isso, as eficiências relativas foram calculadas a partir de dados de sequenciamento e as sondas foram misturadas em proporções molares ajustadas. Isso aumentou a uniformidade de captura para 85% de regiões em > 0,2x de cobertura média. Análise de dados de sequenciamento

[301] O mapeamento de leituras de sequenciamento foi feito usando a ferramenta de software bisReadMapper com algumas modificações. Primeiro, UMI foram extraídos de cada leitura de sequenciamento e anexados aos cabeçalhos de leitura dentro de arquivos FASTOQ usando um script customizado. As leituras foram convertidas on-the-fly como se todos os C fossem não metilados e mapeadas para fitas de DNA do genoma humano convertidas in silico, também como se todos os C fossem não metilados, usando Bowtie2. As leituras originais foram mescladas e filtradas para um UMI único, ou seja, leituras que carregam o mesmo UMI foram descartadas deixando uma leitura única, simples. As frequências de metilação foram calculadas para todos os dinucleotídeos CpG contidos dentro das regiões capturadas por sondas-cadeado por divisão dos números de leituras únicas que carregam um C na posição interrogada pelo número total de leituras que cobrem a posição interrogada. Identificação de Blocos de Metilação Correlacionada (BCM)

[302] Os coeficientes de correlação de Pearson entre as frequências de metilação de cada par de marcadores CpG separados por, no máximo, 200 pb foram calculados separadamente através de 50 amostras de cfDNA de cada uma das duas categorias diagnósticas, ou seja, sangue saudável normal e HCC. Um valor de r de Pearson' < 0,5 foi usado para identificar manchas de transição (limites) entre quaisquer dois marcadores adjacentes que indicam metilação não correlacionada. Marcadores não separados por uma fronteira foram combinadas em Blocos de Metilação Correlacionada (BCM) . Esse procedimento identificou um total de aproximadamente 1.550 BCM em cada categoria diagnóstica dentro dos dados de nosso cadeado, combinando entre 2 e 22 posições de CpG em cada bloco. As frequências de metilação para todos os BCMs foram calculadas por soma dos números de Cs em todas as posições de CpG interrogadas dentro de um BCM e dividindo-se pelo número total de C+Ts naquelas posições. Isolamento e PCR digital quantitativa de DNA

[303] Amostras do tumor e de plasma correspondentes foram obtidas de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica do tumor; amostras foram congeladas e conservadas a -80ºC até o uso. O isolamento de DNA e RNA de amostras foi realizado usando o “AllPrep DNA/RNA Mini Kit” e um kit de extração de CfDNA, respectivamente (Qiagen, Valencia, CA).

[304] Para estimar frações de cfDNA tumoral, experimentos de misturação com várias frações de cfDNA normal e DNA genômico tumoral de HCC (gDNA) foram realizados e os valores de metilação e números de cópia foram testados por PCR digital de gotícula (ddPCR, veja a seção seguinte para detalhes). ddPCR foi realizada de acordo com as especificações do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA). ddPCR foi configurada da seguinte forma: par de iniciadores de amplificação, cgl0590292-Direto 5'-TGTTAGTTTTTATGGAAGTTT, cgl0590292-Reverso 5'-AAACIAACAAAATACTCAAA; sonda fluorescente para detecção de alelo metilado, cgl0590292-M 5'/6-FAM/TGGGAGAGCGGGAGAT/BHQ1/-3'; sonda para detecção de alelo não metilado, cgl0590292-NM 5' /HEX/TTTGGGAGAGTGGGAGATTT/BHQ1/-3'. Condição de ciclagem: 1X de 10 minutos a 98ºC, 40X de (30 s a 98ºC, 60 s a 53ºC), 1X de 10 minutos a 98ºC.

Cálculo de fração de cfDNA tumoral

[305] Foi presumido que um valor de metilação particular observado para uma amostra de cíDNA de HCC resultava da contribuição combinada de cfDNA normal e tumoral. A fração de cÍDNA que se origina do tumor foi estimada usando a seguinte fórmula: fração contribuída por DNA tumoral na amostra i = [valor de metilação em cfDNA de HCC na amostra i - valor de metilação médio de cfíDNA normal]/[valor de metilação médio de DNA tumoral - valor de metilação médio de CfDNA normal]. Usando essa abordagem, foi estimado que, na média, a fração do tumor era cerca de 23% em amostras de

CfDNA de HCC. As amostras foram então agrupadas de acordo com fatores que avaliam a carga tumoral, por exemplo, um estágio avançado e estado pré-tratamento, na medida em que é esperado que esses fatores afetem a fração do tumor em ctDNA (Tabela 20). Na verdade, foi observado que condições associadas com um estadiamento e severidade do tumor maiores também tendiam a ter uma fração do tumor maior (Tabela 20). Para verificar ainda mais abordagem, um experimento de misturação foi realizado com frações diferentes de cfDNA normal (0-100%) e DNA genômico tumoral (0-100%) e os valores de metilação foram testados usando PCR digital. Foi demonstrado que a adição incremental de DNA genômico tumoral poderia aumentar a percentagem de metilação da fração até os valores observados no paciente com amostras de HCC (Fig. 38A-Fig. 38C). Especificamente, a adição de 10%, 20%, 40%, 60% ou 100% da fração de DNA genômico tumoral poderia ser prevista pela fórmula acima, quando se utilizam valores de metilação obtidos pelo experimento.

[306] A concentração de cfDNA foi medida em amostras de plasma normal e de HCC usando um método de corante fluorescente Qubite 10. 1 ul dos 20 ul de cfDNA extraídos de uma amostra de plasma de 1,5 ml foi diluído em 199 nl de solução de trabalho Qubito contendo Reagente de dsDNA HS QubitG. Foi verificado que, na média, há cerca de 11 ng de cCcfDNA em 1 ml de plasma normal e 22 ng de cfíDNA em 1 ml de plasma de HCC (Fig. 39A).

Características do paciente e da amostra

[307] Características clínicas e definição de perfil molecular, incluindo dados de metilação para comparação entre linfócitos de HCC e sangue, incluindo 377 amostras tumorais de HCC do “Cancer Genome Atlas” (TCGA) e 754 amostras normais de um conjunto de dados usado em um estudo de metilação sobre o envelhecimento (GSE40279). Para estudar CctDNA em HCC, amostras de plasma foram obtidas de pacientes chineses com HCC e controles saudáveis selecionados aleatoriamente submetidos a uma assistência médica de manutenção de rotina, resultando em um coorte de treinamento de 715 pacientes com HCC e 560 controles saudáveis normais e um coorte de validação de 383 pacientes com HCC e 275 controles saudáveis. Todos os participantes forneceram autorização informada por escrito. Características clínicas de todos os pacientes e controles estão listadas na Tabela

17. Identificação de marcadores de metilação que diferenciam HCC e sangue

[308] Foi formulada a hipótese de que marcadores CpG com uma diferença máxima na metilação entre HCC e sangue normal provavelmente demonstram diferenças de metilação detectáveis no cfDNA de pacientes com HCC, quando comparada com aquela de controles normais. O método de “estatística-t moderada” com Bayes Empírico para contração da variância foi usado, e o procedimento de Benjamini-Hochberg foi usado para controlar a FDR em um nível de significância de 0,05 para obter 1.000 marcadores principais com os menores valores P, identificando as taxas de metilação mais significantemente diferentes entre HCC e sangue (Fig. 26). O agrupamento hierárquico não supervisionado desses 1.000 marcadores principais foi capaz de distinguir entre HCC e sangue normal (Fig. 30). Sondas de inversão molecular (cadeado) que correspondem a esses 1.000 marcadores foram projetadas e testadas em 28 pares de DNA de tecido de HCC e ctDNA de plasma compatível dentro do mesmo paciente. Os perfis de metilação em ctDNA tumoral de HCC e de plasma combinado eram altamente consistentes, dando a elas o potencial como marcadores diagnósticos sensíveis (Fig. 27A, Fig. 27B, Fig. 34A e Fig. 34B). 401 marcadores demonstraram um bom perfil de amplificação e valor de metilação dinâmico e foram, portanto, selecionados como bons candidatos para análise posterior. Estrutura do bloco de metilação para precisão aumentada da chamada de alelo

[309] O conceito de desequilíbrio de ligação genética (bloco LD) foi usado para estudar o grau de cometilação entre fitas de DNA diferentes. Leituras de sequenciamento com extremidades —“pareadas de Illumina foram usadas para identificar cada bloco de metilação individual (mBloco). Um método de correlação de Pearson foi aplicado para quantificar cometilação ou mBloco. Todos os mBlocos comuns de uma região foram compilados por cálculo de diferentes frações de mBloco. A seguir, o genoma foi dividido em blocos de sítios CpG firmemente cometilados denominados blocos de metilação correlacionada (MCB), usando um valor de corte rº de 0,5. MCBs foram pesquisados em cfDNA de 500 amostras normais e foi verificado que MCBs são consistentes. Os níveis de metilação dentro de um MCB em cfDNA em 500 amostras de HCC foram então determinados. Foi verificado que um MCB possui um padrão de metilação consistente quando se comparam amostras de cfDNA normais versus de HCC (Fig. 31A-Fig. 31B). Modelo de predição diagnóstica de ctDNA para HCC

[310] Os valores de metilação dos 401 marcadores selecionados que mostraram boas faixas de metilação em amostras de cfDNA foram analisados pelos métodos “Random Forest” e “Operador de Seleção e Contração Menos Absoluta” (LASSO) para reduzir ainda mais o número de marcadores por sua modelagem em 715 amostras de ctDNA de HCC e 560 amostras de cfDNA normais (Fig. 26). Cerca de 24 marcadores foram obtidos usando a análise “Random Forest”. 30 marcadores foram obtidos usando uma análise LASSO na qual era necessário que os marcadores selecionados aparecessem mais de 450 vezes de um total de 500 repetições. Houve 10 marcadores superpostos entre esses dois métodos (Tabela 15). Com o uso de um método de regressão logística, um modelo de predição diagnóstica foi construído com esses 10 marcadores. A aplicação do modelo gerou uma sensibilidade de 85,7% e especificidade de 94,3% para HCC no conjunto de dados de treinamento de 715 amostras de HCC e 560 amostras normais (Fig. 27C) e uma sensibilidade de 83,2% e especificidade de 90,5% no conjunto de dados de validação de 383 amostras de HCC e 275 amostras normais (Fig. 27D). Em alguns casos, esse modelo ainda diferencia HCC de controles normais tanto no conjunto de dados de treinamento (AUC = 0,966) quanto o conjunto de dados de validação (AUC = 0,944) (Fig. 27E e Fig. 27F). O agrupamento hierárquico não supervisionado desses 10 marcadores foi capaz de distinguir HCC de controles normais com especificidade e sensibilidade elevadas (Fig. 27G, Fig. 27H e Fig. 35).

[311] Uma pontuação diagnóstica combinada (pontuação-cd) do modelo foi avaliada para diferenciação entre doenças do fígado (por exemplo, infecção por HBV/HCV, cirrose e fígado gorduroso) e HCC, na medida em que essas doenças do fígado reconhecidamente são fatores de risco para HCC. Foi verificado que a pontuação-cd foi capaz de diferenciar pacientes com HCC, quando comparados com aqueles com doenças do fígado ou controles saudáveis (Fig. 28A). Esses resultados eram consistentes e comparáveis com aqueles previstos por níveis de AFP (Fig. 28B). Marcadores de metilação previram carga tumoral, resposta ao tratamento e estadiamento

[312] A utilidade da pontuação-cd na avaliação da resposta ao tratamento, da presença de tumor residual após tratamento, e estadiamento de HCC foi ainda estudada. Características clínicas e demográficas, por exemplo, idade, sexo, raça e estágio de AJCC, foram incluídas na análise. As pontuações-cd de pacientes com tumor residual detectável após tratamento (n = 828) foram significantemente maiores do que aqueles sem tumor detectável (n = 270), e ambos eram significantemente maiores do que controles normais (n = 835) (p <0,0001, Fig. 28C). Similarmente, as pontuações-cd estavam significantemente maiores em pacientes antes do tratamento (n = 109) ou com progressão (n = 381), comparados com aqueles com resposta ao tratamento (n = 248) (p < 0,0001, Fig. 28D) . Além disso, as pontuações-cd foram significantemente menores em pacientes com ressecção completa do tumor depois da cirurgia (n = 170), comparadas com aquelas antes da cirurgia (n = 109), embora tenham ficado maiores em pacientes com recorrência (n = 155) (p < 0,0001, Fig. 28E). Além disso, há boa correlação entre as pontuações- cd e estágio do tumor. Pacientes com doença em estágio inicial (IT, II) tiveram pontuações-cd substancialmente menores, comparados com aqueles com doença em estágio avançado (III, IV) (p <0,05, Fig. 28F). Coletivamente, esses resultados sugerem que a pontuação-cd (ou seja, a quantidade de ctDNA no plasma) se correlaciona bem com carga tumoral e pode ter utilidade na predição da resposta do tumor e vigilância para recorrência. Utilidade de modelo de predição diagnóstica de ctDNA e AFP

[313] En alguns casos, o biomarcador sanguíneo para avaliação de risco e vigilância de HCC consiste nos níveis de AFP sérica. No entanto, sua baixa sensibilidade a torna inadequada para detectar todos os pacientes que desenvolverão HCC e limita severamente sua utilidade clínica. Em alguns casos, muitos pacientes cirróticos desenvolvem HCC sem nenhum aumento nos níveis de AFP. Em casos adicionais, 40% dos pacientes do coorte de estudo de HCC possuem um valor de AFP normal (<25 ng/ml).

[314] En pacientes com HCC comprovado por biópsia, a pontuação-cd demonstrou sensibilidade e especificidade superiores à AFP para o diagnóstico de HCC (AUC 0,969 versus 0,816, Fig. 28G). Em pacientes com resposta ao tratamento, recorrência ou progressão do tumor, a pontuação-cd mostrou alterações mais significantes, comparada com a testagem no diagnóstico inicial do que AFP (Fig. 28H e Fig. 281). Em pacientes com amostras seriais, aqueles com uma resposta ao tratamento positiva tiveram uma diminuição significante concomitante na pontuação-cd, comparada com aquela antes do tratamento, e houve uma redução ainda maior em pacientes depois da cirurgia. Em contraste, todos os pacientes com doença progressiva ou recorrente tiveram um aumento na pontuação-cd (Fig. 32A-Fig. 32B). Por comparação, AFP é menos sensível para avaliação da eficácia do tratamento em pacientes individuais (Fig. 33 e Fig. 36).

[315] Além disso, a pontuação-cd se correlacionou bem com o estágio do tumor (Fig. 28JI), particularmente entre pacientes com estágio I, II e III, enquanto não houve valores de AFP significantes diferentes em pacientes com diferentes estágios, exceto entre pacientes com estágio III e IV (Fig. 28K), indicando uma vantagem da pontuação-em relação à AFP na diferenciação de HCC em estágio inicial. Modelo de predição prognóstica de ctDNA para HCC

[316] O potencial para usar marcadores de metilação em CtDNA para predição do prognóstico em HCC em combinação com características clínicas e demográficas que incluem idade, sexo, raça e estágio de AJCC, foi investigado. Os 1.049 pacientes com HCC com informação de sobrevida completa foram divididos aleatoriamente em conjuntos de dados de treinamento e validação com alocação de 2:1. Os métodos Unicox e de LASSO-Cox foram implementados para reduzir a dimensionalidade e foi construído um modelo de Cox para prever o prognóstico com um painel de 8 marcadores (Tabela 16). Curvas de Kaplan-Meier foram geradas em conjuntos de dados de treinamento e validação usando uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) com esses marcadores. O grupo de alto risco (pontuação-cp > -0,24) possui 341 observações com 53 eventos no conjunto de dados de treinamento e 197 observações com 26 eventos no conjunto de dados de validação; e o grupo de baixo risco (pontuação-cp < -0,24) possui 339 observações com 7 eventos no conjunto de dados de treinamento e 172 observações com 9 eventos no conjunto de dados de validação. A sobrevida mediana foi significantemente diferente tanto no conjunto de treinamento (p <0,0001) quanto no conjunto de validação (p = 0,0014) por teste do log-rank (Fig. 29A e Fig. 29B).

[317] A análise de variáveis multivariada mostrou que a pontuação-cp se correlacionava significantemente com o risco de morte tanto nos conjuntos de dados de treinamento quanto nos de validação, e que a pontuação-cp era um fator de risco de sobrevida independente (proporção de risco [HR]: 2,512; intervalo de confiança de 95% [CI]: 1,966-3,210; p <0,001 no conjunto de treinamento; HR: 1,553, CI: 1,240-1,944; p <0,001 no conjunto de validação, Tabela 18). Curiosamente, AFP não era mais significante como um fator de risco quando a pontuação-cp e outras características clínicas eram levadas em conta (Tabela 18).

[318] O estágio de TNM previu o prognóstico de pacientes nos conjuntos de dados de treinamento e de validação (Fig. 29C, Fig. 29D, Fig. 37A e Fig. 37B). No entanto, a combinação de pontuação-cp e estadiamento de TNM aumentou a habilidade para prever o prognóstico nos conjuntos de dados tanto de treinamento (AUC 0,7935) quanto de validação (AUC 0,7586) Curvas de Kaplan-Meier também mostraram que pacientes separados tanto por pontuação-cp quanto por estadiamento possuem prognóstico significantemente diferente (p<0,0001 Fig. 29G).

[319] A Tabela 15 ilustra as características de dez marcadores de metilação e seus coeficientes no Diagnóstico de HCC. essas [ES [enem] 5 [PET] ref. z P Lo asas [2555] 6513 | <0,001| cgl1606215 6,865 1,095] 6,271 | <o0,001 cg24067911 ATXN1 —5,439 0,868 | -6,265 | <0,001 Chr cgl8196829 -9,078 1,355 | -6,698 | <0,001 6:170 cg23211949 | Chr 6:3 —5,209 1,081 | -4,819 | <0,001 cgl7213048 6,660 1,422 | 4,683 | <0,001 cg25459300 |Chr 8:20 1,994 1,029 | 1,938 <0,053 SE: erros-padrões de coeficientes; valor z: valor estático- z de Wald

[320] A Tabela 16 ilustra as características de oito marcadores de metilação e seus coeficientes na predição do prognóstico de HCC. Coefi Gene de . z P Marcadores cient cI ref. valor | valor es - SH3PXD2 - 0,28 | 0,024- | 1,2 - 23461741 ", ! n eq A 1,264 2 3,340 604 1,003 0,316 - 0,78 0,067- | 1,2 - 2,79 | 0,488- | 0,8 7 , , , Chr - 0,00 0,000- | 1,9 - <0,00 74 1 , , , , egoTAS 90? | 17:78 | 8,156] o 0,012 | 112 | 4,267 1 13,200 SERPINB 438 - 1,7 20490031 S , cg 5 6,082 000 14600, 885 3,400 0,001 000 - 0,00 0,000- 1,7 - 01643250 NOTCH3 n ! 1 | esa eazaso | morena | 5 560 [5 | Go [367 | 3,093 | 0002 | 4,47 1,030- 0,7 11397370 GRHL2 " já n |ostsenato | mma fan | SO 15700o | og | 11906 | 0.026 | 8,12 0,957- 1,0 HR: Proporção de Risco; CI: intervalo de confiança de 95%; SE: erros-padrões de coeficientes; z valor: valor estático- z de Wald

[321] A Tabela 17 mostra as características clínicas do coorte de estudo. Tecido Sangue Coorte do | Coorte do Característica de HCC normal estudo de estudo (TCGA) (GSE) HCC normal

[Los TT TEA Nº de mulheres (%) 123(32,6)| 401(53,2) 130(11,8) 407 (48,7) Nº de homens (%) 353(46,8) | 905(82,4) | 417 (49,9) ras tamos | [era | 1 1 7 mama (O) SOLO) <25 na/ml (%) |l163(43,0)] NA | 352(32,1) | 784(93,9) Lose TT s6I22,0) ST252,1) o 15202,0 | caras mamorar [o Oi" Com carga tumoral 114(30,2)|] “Ta — | 825075,9) Loma Sea e | e | [aátio O Ai" [| aegativo [nseno| mo | 10606, [165619 NA, não disponível; IA, não aplicável

[322] A Tabela 18 mostra a Análise multivariada de sobrevida para pacientes com HCC com pontuação-cp de marcadores de metilação e variáveis relevantes. FRT a a = er | ver cr Valor z Valor p tes ——————— e e E Fator Trei | Vali | Trei | Vali | Trei | Vali | Trei | Vali | Trei | Vali | Trei | Vali Pontu 1,96 | 1,24 a- |0,92|0,44|/2,51 /1,55]| 6 o- [0,12 /0,11|7,36 | 3,83 | <0o,0 | <o,0 ção- 1 o 2 3 [3,21 /1,94] 5 5 o 6 ol ol cp o 4 1,00 | 1,00 0,00 | 0,00 [1,00 [1,00 | o- o- [0,00 0,00 |0,93|2,22]|0,34 |0,02 o o o o [1,00 /1,00| o o 6 9 9 6 o o Está- | 0,49 | 0,83 | 1,64 | 2,29 | 1,15 | 1,36 | 0,18 | 0,26 | 2,77 | 3,13 | 0,00 | 0,00 gio 8 2 6 8 7- 5- o 6 2 o 6 2

CENSNBNNADNNBNBNE 1 8 [ee nl ee els Se ele repele 0,07 | 0,79 | 0,92 [2,22 | 7- 5- 0,39 [0,75 |, 9 |1,05 [0,84 [0,29 7 9 6 4 /2,08/|9,80] 5 7 7 6 5 1 8 1 ? 0,96 | 0,98 Idade nos Ma 25 uno Po doa no Ma nu 7” 2 nas 9 2 padrões de coeficientes; valor z: valor de estatística-z de Wald

[323] A Tabela 19 ilustra sequências de cadeado exemplares descritas nesse relatório descritivo. ID. DE Marcador Sequência SEQ. Nº:

ACAATATCCCAAACACATCATCATCTGTC

TCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC cgl0428836 BMPRIA CCCCCCCccccceeceotoGTcCGGCAGCGT 1

CAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAAA TTATTTTCTTCTAATTCAAAT ACAACCACATTCACTAAACACTGTCTCTT

ATACACATCTCCGAGCCCACGAGACCCCC cg26668608 PSD CCCCCCCcccccoeTteeaTt cCGGCAGCGTCAG 2

ATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAAATAT AAAATATTAAACAACTAAAAA ACCCTCTTCTCTCACTTCCACTGTCTCTT

ATACACATCTCCGAGCCCACGAGACCCCC cg25754195 ARHGAP25 | CCCCCCCCCececececteGTCGECAGCG 3

TCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAC ATCCTAAAAATATAAAACATA ACCCCTACTACCCACCCTATCTCCTGTCT

CTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACC cgo5205842 KLF3 CCCCCCCcccccceeTtcoeGTt CGGCAGCGTCA 4

GATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNACCAA CAATAAATACATAATAATAAT ACACAATTACCTCTCCCCTTCTGTCTCTT

ATACACATCTCCGAGCCCACGAGACCCCC cgl1606215 PLAC8 CCCCCCCcccceTtcGTCGEGCAGCGTCAGA 5

TGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAAAAATA TATTCATTCTCCAAATAAAAA TCTTTACTCTCTCAATCCAACCCTGTCTC

TTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACCC cg24067911 ATXN1 CCCCCCCccccececectoGTCGGCAGCGT

CAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAAA TCCCAAATACAATTTCAAAAT CCCTTAAACACCAATCTTCCAACCCTGTC

TCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACÇ cgl8196829 Chr 6:170 CCCCCCCcececeecceceTtTeGTtcGGCAGCE 7

GTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNA ATAAAACAAAAATAACCCCAA ATCTTCCCAACACTCAAAACAATACCCTG

TCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAG cg23211949 Chr 6:3 ACCCCCCCCCCCTCGTCGGCAGCGTCAGA

TGTGTATAAGAGACAGNNNNNNATCCCAT ACATTCCTAACTCCTTTAAAT TCTTAAACCACTTCTAACTACACCACAAT

CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCAC cgl7213048 ATAD2 GAGACCCCCCCCCCTCGTCGGCAGCGTCA

GATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAACCA TTATATCCTTCCCATCTTTTT CTCCTCCTCTTACCACACCCTTTTCCTAA

ACACTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCC cg25459300 Chr 8:20 CACGAGACCCCCCCCTCGTCGGCAGCGTC 10

AGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNTAAA TCCCCATATATCTTTTCTTCA ATAAAAACACTAAAACCCTAAAACACTGT

CTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGA cg23461741 SH3PXD2A | CCCCCCCCCCCCccececetTcGTcCGECAGE 11

GTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNA ATACCCTCTTTAATACAAAAA ATACAACCTAAATACAAACTTCCCACTGT

CTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGA cgo6482904 Cllorf9 CCCCCCCcceceTtcGTcCGECAGCGTCAGA 12

TGTGTATAAGAGACAGNNNNNNAAAAACC TAACCCTACCTCTAAACAAAT CACAACCTACACTCCTCCCAACCTGTCTC

TTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACCC cg25574765 PPFIAl CCCCCCcccccceeteGTcGGCAGCGTCA 13

GATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNTTCCC TTACCCTAAATATAATTAATA TCATTTCCCCCAACAAATTCTTTTTCTTC

TCCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCC cgo7459019 Chr 17:78 | ACGAGACCCCCCCCCCCCTCGTCGGCAGC 14

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[324] A Tabela 20 ilustra a fração de cfDNA de HCC derivada de tumor estratificada de acordo com o estadiamento do tumor e estado de tratamento. Pacientes com HCC com um estágio do tumor avançado e antes do tratamento tiveram frações maiores de cfDNA tumoral. [Lo Fração tumoral de cfDNA + STDEV Estado do estágio do tumor 0,098 E 0,020 0,389 E 0,178 Antes do tratamento * 0,389 + 0,148 Depois do tratamento* 0,109 + 0,085 * O coorte de antes do tratamento incluiu pacientes antes de qualquer tratamento (cirurgia ou quimioterapia). Depois de tratamento incluiu pacientes com uma resposta positiva à cirurgia ou quimioterapia e redução da carga tumoral.

[325] A Modalidade 1 relata um método de detecção do estado de metilação de um ou mais genes de um painel de genes em um indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; e (b) detecção do estado de metilação em um gene selecionado do painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXNI, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2, Cromossomo 8:20, SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIl, Cromossomo 17:78, SERPINBS5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMSB (i) pelo contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo do gene para gerar um produto amplificado; e (ii) análise do produto amplificado para determinar o estado de metilação do gene.

[326] Modalidade 2: o método de modalidade 1, em que a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-18.

[327] Modalidade 3: o método de modalidade 1, em que a sonda é uma sonda-cadeado selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº*: 1-18.

[328] Modalidade 4: o método de modalidade 1, em que o gene é selecionado de BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20.

[329] Modalidade 5: o método de modalidade 1, em que o gene é selecionado de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAI, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMSB.

[330] Modalidade 6: o método de modalidade 1, que compreende ainda a detecção do estado de metilação de dois ou mais genes do painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXNI1, Cromossomo .6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2, Cromossomo 8:20, SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAI, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMSE.

[331] Modalidade 7: o método de modalidade [329], em que a detecção compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até 18 e, no máximo, 18 genes do painel de genes.

[332] Modalidade 8: o método de modalidade 1, que compreende ainda a determinação de uma pontuação diagnóstica combinada (pontuação-cd) ou de uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp) com base no estado de metilação dos (um ou mais) genes, em que a pontuação-cd e a pontuação-cp, cada uma independentemente, se correlacionam com uma quantidade de DNA tumoral circulante (ctDNA) presente na amostra biológica.

[333] Modalidade 9: o método de modalidade [331], em que a pontuação-cd e a pontuação-cp, cada uma independentemente, são determinadas utilizando um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[334] Modalidade 10: o método de modalidade 1, em que a amostra biológica é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[335] Modalidade 11: o método de modalidade 1, em que o indivíduo é suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC).

[336] Modalidade 12: o método de modalidade 1, em que o indivíduo possui um HCC em estágio I, estágio II, estágio III ou estágio IV.

[337] Modalidade 13: o método de modalidade 1, em que o indivíduo é ainda tratado com uma quantidade eficaz de um agente terapêutico.

[338] Modalidade 14: o método de modalidade O, em que o tratamento compreende: (a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; (b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou (c) cirurgia.

[339] Modalidade 15: o método de modalidade O, em que o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes.

[340] Modalidade 16: o método de modalidade O, em que o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib, um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

[341] Modalidade 17: o método de modalidade 1, em que a amostra biológica compreende uma amostra de sangue, uma amostra de biópsia de tecido ou células tumorais circulantes.

[342] Modalidade 18 relata um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) para tratamento, que compreende: (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (b) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC; (c) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC; e (d) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC.

[343] Modalidade 19: o método de modalidade 18, em que àa sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10.

[344] Modalidade 20: o método de modalidade 18, que compreende ainda o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e uma análise do produto amplificado adicional para gerar um perfil de metilação do gene adicional determinando, dessa forma, a presença de HCC no indivíduo.

[345] Modalidade 21: o método de modalidade 18, em que o contato compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até dez e, no máximo, dez genes do painel de genes.

[346] Modalidade 22: o método de modalidade 18, em que a amostra biológica é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[347] Modalidade 23: o método de modalidade 18, em que o modelo compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra HCC-positiva.

[348] Modalidade 24: o método de modalidade 23, em que àa amostra HCC-positiva compreende células de um HCC metastático.

[349] Modalidade 25: o método de modalidade 18 ou 23, em que o modelo ainda compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra normal.

[350] Modalidade 26: o método de qualquer uma das modalidades 18 ou 23-25, em que o modelo é desenvolvido com base nos perfis de metilação de biomarcadores da Tabela 15 ou da Tabela 16.

[351] Modalidade 27: o método de qualquer uma das modalidades 18 ou 23-26, em que o modelo é desenvolvido usando um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[352] Modalidade 28: o método de modalidade 18, que compreende ainda a determinação do HCC como Estágio II, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.

[353] Modalidade 29 relata um método de seleção de um indivíduo suspeito de ter carcinoma hepatocelular (HCC) ou câncer de pulmão para tratamento, que compreende (a) contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado das Tabelas 2, 6, 7, 9 ou 10 para gerar um produto amplificado, em que o DNA tratado é processado de uma amostra biológica obtida do indivíduo; (b) análise do produto amplificado para gerar um perfil de metilação do gene; (c) aplicação do perfil de metilação a um modelo que relaciona perfis de metilação de genes do painel de genes quanto à presença com HCC ou câncer de pulmão; (d) avaliação de uma informação do modelo para determinar se o indivíduo possui HCC ou câncer de pulmão; e (e) administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao indivíduo se o indivíduo é determinado como tendo HCC ou câncer de pulmão.

[354] Modalidade 30: o método de modalidade 29, que compreende ainda o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e uma análise do produto amplificado adicional para gerar um perfil de metilação do gene adicional determinando, dessa forma, a presença de HCC ou câncer de pulmão no indivíduo.

[355] Modalidade 31: o método de modalidade 29, em que a sonda é uma sonda-cadeado.

[356] Modalidade 32: o método de modalidade 29, em que a amostra biológica é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[357] Modalidade 33: o método de modalidade 29, em que o modelo compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra HCC-positiva ou uma amostra positiva para câncer de pulmão.

[358] Modalidade 34: o método de modalidade 33, em que a amostra HCC-positiva compreende células de um HCC metastático.

[359] Modalidade 35: o método de modalidade 33, em que a amostra positiva para câncer de pulmão compreende células de câncer de pulmão metastático.

[360] Modalidade 36: o método de qualquer uma das modalidades 29 ou 33-35, em que o modelo ainda compreende perfis de metilação de genes do painel de genes gerados por uma amostra normal.

[361] Modalidade 37: o método de qualquer uma das modalidades 29 ou 33-36, em que o modelo é desenvolvido com base nos perfis de metilação de biomarcadores das Tabelas 3, 6, 7, 9 ou 10.

[362] Modalidade 38: o método de qualquer uma das modalidades 29 ou 33-37, em que o modelo é desenvolvido usando um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[363] Modalidade 39: o método de modalidade 29, que compreende ainda a distinção entre HCC e câncer de pulmão.

[364] Modalidade 40: o método de modalidade 18 ou 29, em que o tratamento compreende: (a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; (b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou (c) cirurgia.

[365] A Modalidade 41 relata um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIl, Cromossomo 17:78, SERPINB5 NOTCH3, GRHL2 e TMEMS8B do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[366] Modalidade 42: o método de modalidade 41, em que à pontuação de metilação se correlaciona com sobrevida por pelo menos 6 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 2,5 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, ou mais.

[367] Modalidade 43: o método de modalidade 41, em que a pontuação de metilação é calculada com base na análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox.

[368] Modalidade 44: o método de modalidade 41, em que a geração na etapa b) ainda compreende o contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAl, Cromossomo 17:78, SERPINB5S, NOTCH3, GRHL2 e TMEMSE.

[369] Modalidade 45: o método de modalidade 41, em que à sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18.

[370] Modalidade 46: o método de modalidade 41, em que a geração compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até oito e, no máximo, oito genes do painel de genes.

[371] A Modalidade 47 relata um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC) ou de monitoramento da progressão de HCC no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de SOCS2, EPSTIl, TIAl, Cromossomo 4, Cromossomo 6, ZNF323, FOXP4 e GRHL2 do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[372] A Modalidade 48 relata um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui câncer de pulmão ou de monitoramento da progressão de câncer de pulmão no indivíduo, que compreende: (a) processamento de uma amostra biológica obtida do indivíduo com um agente de desaminação para gerar DNA tratado que compreende nucleotídeos desaminados; (b) geração de um perfil de metilação que compreende um ou mais genes selecionados de NPBWRI1, Cromossomo 2, AAKI, SIMI, ClO0Oorf46, Cl7orfl0l, DEPDC5, ZNF323, GABRA2, PLAC8 e ADRAZB do DNA tratado; (c) obtenção de uma pontuação de metilação com base no perfil de metilação dos (um ou mais) genes; e (d) com base na pontuação de metilação, iniciar um primeiro tratamento, diminuir uma dosagem de um primeiro agente terapêutico se o indivíduo apresentou uma remissão, iniciar um segundo tratamento se o indivíduo apresentou uma recidiva, ou mudar para um segundo agente terapêutico se o indivíduo ficou refratário ao primeiro agente terapêutico.

[373] Modalidade 49: o método de modalidade 47 ou 48, em que a pontuação de metilação se correlaciona com sobrevida por pelo menos 6 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 2,5 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, ou mais.

[374] Modalidade 50: o método de modalidade 47 ou 48, em que a pontuação de metilação é calculada com base na análise de regressão de riscos proporcionais (PH) de Cox.

[375] Modalidade 51: o método de qualquer uma das modalidades 41, 47, ou 48, em que o primeiro tratamento compreende: (a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; (b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou (c) cirurgia.

[376] Modalidade 52: o método de qualquer uma das modalidades 41, 47, ou 48, em que o segundo tratamento compreende: (a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; (b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou (c) cirurgia.

[377] Modalidade 53: o método de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes.

[378] Modalidade 54: o método de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib,

um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

[379] Modalidade 55: o método de qualquer uma das modalidades “precedentes, em que a amostra biológica compreende uma amostra de sangue, uma amostra de biópsia de tecido ou células tumorais circulantes.

[380] Modalidade 56: o método de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo é um humano.

[381] Modalidade 57 relata um método de diagnóstico de carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo, que compreende: (a) obtenção de DNA tratado de uma amostra de sangue do indivíduo; (b) o contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 para gerar um produto amplificado; (c) análise do produto amplificado para determinar uma pontuação diagnóstica combinada (pontuação-cd), em que a pontuação-cd se correlaciona com uma quantidade de DNA tumoral circulante (CtDNA) presente na amostra de sangue; e (d) diagnóstico do indivíduo com HCC quando a pontuação-cd está elevada em relação a uma pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[382] Modalidade 58: o método de modalidade 57, em que a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10.

[383] Modalidade 59: o método de modalidade 57, em que à sonda compreende cerca de 100% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºsº: 1-10 ou consiste em uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-

10.

[384] Modalidade 60: o método de modalidade 57, que compreende ainda o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e a análise do produto amplificado adicional para gerar uma pontuação-cd adicional.

[385] Modalidade 61: o método de modalidade 57, em que o contato compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até dez e, no máximo, dez genes do painel de genes.

[386] Modalidade 62: o método de modalidade 57, em que à amostra de sangue é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

[387] Modalidade 63: o método de modalidade 57, que compreende ainda a determinação do HCC como Estágio 1, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.

[388] Modalidade 64: o método de modalidade 57, em que o indivíduo é ainda tratado com uma quantidade eficaz de um agente terapêutico.

[389] Modalidade 65: o método de modalidade 64, em que o tratamento compreende: (a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; (b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou (c) cirurgia.

[390] Modalidade 66: o método de qualquer uma das modalidades 57-65, em que o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes.

[391] Modalidade 67: o método de qualquer uma das modalidades 57-65, em que o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib, um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

[392] Modalidade 68: o método de modalidade 57, em que a pontuação-cd está elevada por cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[393] Modalidade 69: o método de modalidade 57, em que a pontuação-cd está elevada por cerca de 5%, 10%, 15%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[394] Modalidade 70: o método de modalidade 57, em que à pontuação-cd se baseia no estado de metilação dos (um ou mais) genes do painel de genes.

[395] Modalidade 71: o método de modalidade 57, em que a pontuação-cd é determinada por utilização de um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[396] A Modalidade 72 relata um método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC), que compreende: (a) obtenção de DNA tratado de uma amostra de sangue do indivíduo; (b) o contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAl, Cromossomo 17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2 e TMEMS8B para gerar um produto amplificado; (c) análise do produto amplificado para determinar uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp), em que a pontuação-cp se correlaciona com uma quantidade de DNA tumoral circulante (CtDNA) presente na amostra de sangue; e (d) determinação do prognóstico do indivíduo com HCC quando a pontuação-cp está elevada em relação a uma pontuação-cp obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[397] Modalidade 73: o método de modalidade 72, em que a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18.

[398] Modalidade 74: o método de modalidade 72, em que à sonda compreende cerca de 100% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18 ou consiste em uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-

18.

[399] Modalidade 75: o método de modalidade 72, em que a pontuação-cp se correlaciona com sobrevida por pelo menos 6 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 2,5 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, ou mais.

[400] Modalidade 76: o método de modalidade 72, que compreende ainda o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e a análise do produto amplificado adicional para gerar uma pontuação-cp adicional.

[401] Modalidade 77: o método de modalidade 72, em que à geração compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até oito e, no máximo, oito genes do painel de genes.

[402] Modalidade 78: o método de modalidade 72, em que a pontuação-cp está elevada por cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[403] Modalidade 79: o método de modalidade 72, em que a pontuação-cp está elevada por cerca de 5%, 10%, 15%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

[404] Modalidade 80: o método de modalidade 72, em que à pontuação-cp se baseia no estado de metilação dos (um ou mais) genes do painel de genes.

[405] Modalidade 81: o método de modalidade 72, em que a pontuação-cp é determinada por utilização de um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

[406] Modalidade 82: o método de modalidade 72, em que o indivíduo é tratado com um agente terapêutico para HCC antes da determinação do prognóstico do indivíduo.

[407] Modalidade 83: o método de modalidade 72, em que o indivíduo é um indivíduo virgem de tratamento ou um indivíduo que não foi tratado com um agente terapêutico para HCC.

[408] Modalidade 84: o método de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o indivíduo é um humano.

[409] Embora modalidades preferidas da presente revelação tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica, sem se afastar da revelação. Deve ser subentendido que diversas alternativas às modalidades da revelação descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática da revelação. Deseja-se que as reivindicações seguintes definam o escopo da revelação e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam por elas englobados.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de diagnóstico de carcinoma hepatocelular (HCC) em um indivíduo, caracterizado por compreender: a) obtenção de DNA tratado de uma amostra de sangue do indivíduo; b) o contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em BMPRIA, PSD, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, Cromossomo 6:170, Cromossomo 6:3, ATAD2 e Cromossomo 8:20 para gerar um produto amplificado; c) análise do produto amplificado para determinar uma pontuação diagnóstica combinada (pontuação-cd), em que a pontuação-cd se correlaciona com uma quantidade de DNA tumoral circulante (ctDNA) presente na amostra de sangue; e d) diagnóstico do indivíduo com HCC quando a pontuação- cd está elevada em relação a uma pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 1-10.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sonda compreende cerca de 100% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 1-10 ou consiste em uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-10.

4, Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o contato do DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e a análise do produto amplificado adicional para gerar uma pontuação-cd adicional.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até dez e, no máximo, dez genes do painel de genes.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é tratada com um agente de desaminação para gerar o DNA tratado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a determinação do HCC como Estágio 1, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é ainda tratado com uma quantidade eficaz de um agente terapêutico.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende: a) quimioembolização arterial transcateter, ablação por radiofrequência ou braquiterapia; b) um agente quimioterápico ou um agente para uma terapia direcionada; ou c) cirurgia.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico compreende cisplatina, doxorrubicina, fluorpirimidina, gencitabina, irinotecano, mitoxantrona, oxaliplatina, talidomida, ou uma combinação destes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente para a terapia direcionada compreende axitinib, bevacizumab, cetuximab, erlotinib, ramucirumab, regorafenib, sorafenib, sunitinib, um inibidor de timidina quinase (TK), ou uma combinação destes.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cd está elevada por cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cd está elevada por cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 100%, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cd se baseia no estado de metilação dos (um ou mais) genes do painel de genes.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cd é determinada por utilização de um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

16. Método de determinação do prognóstico de um indivíduo que possui carcinoma hepatocelular (HCC), caracterizado pelo fato de que compreende:

a) obtenção de DNA tratado de uma amostra de sangue do indivíduo; b) o contato do DNA tratado com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene selecionado de um painel de genes que consiste em SH3PXD2A, Cllorf9, PPFIAIL, Cromossomo 17:78, SERPINB5 NOTCH3, GRHL2 e TMEMS8B para gerar um produto amplificado; c) análise do produto amplificado para determinar uma pontuação prognóstica combinada (pontuação-cp), em que a pontuação-cp se correlaciona com uma quantidade de DNA tumoral circulante (ctDNA) presente na amostra de sangue; e d) determinação do prognóstico do indivíduo com HCC quando a pontuação-cp está elevada em relação a uma pontuação-cp obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sonda compreende cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºs: 11-18.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sonda compreende cerca de 100% de identidade de sequência para uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nº: 11-18 ou consiste em uma sonda selecionada dos IDS. DE SEQ. Nºº: 11-18.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cp se correlaciona com sobrevida por pelo menos 6 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 2,5 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, ou mais.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o contato do

DNA tratado com pelo menos uma sonda adicional que hibridiza sob condições de alta estringência para uma sequência-alvo de um gene adicional selecionado do painel de genes para gerar um produto amplificado adicional, e a análise do produto amplificado adicional para gerar uma pontuação-cp adicional.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a geração compreende a hibridização sob condições de alta estringência com um conjunto de sondas, em que o conjunto de sondas hibridiza para até oito e, no máximo, oito genes do painel de genes.

22. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cp está elevada por cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

23. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cp está elevada por cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais em relação à pontuação-cd obtida de uma amostra de sangue de um indivíduo saudável.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cp se baseia no estado de metilação dos (um ou mais) genes do painel de genes.

25. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pontuação-cp é determinada por utilização de um algoritmo selecionado de um ou mais dos seguintes: uma análise do componente principal, uma análise de regressão logística, uma análise do vizinho mais próximo, uma máquina de vetor de suporte e um modelo de rede neural.

26. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com um agente terapêutico para HCC antes da determinação do prognóstico do indivíduo.

27. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo virgem de tratamento ou um indivíduo que não foi tratado com um agente terapêutico para HCC.

28. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.