BR112019014689A2 - Inibidor da dor antissenso de scn9a - Google Patents
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Abstract
a presente invenção proporciona derivados de ácidos nucleicos peptídicos que visam o sítio de remoção em 3? do éxon 4 no pré-mrna de scn9a humano. os derivados de ácidos nucleicos peptídicos induzem, de um modo potente, a(s) variante(s) de remoção de mrna de scn9a não tendo o éxon 4 de scn9a nas células e são úteis para tratar com segurança as dores ou as condições que envolvam a ativi-dade de nav1.7.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para INIBIDOR DA DOR ANTISSENSO DE SCN9A.
[001] Esta invenção refere-se aos derivados de ácidos nucleicos peptídicos que visam complementarmente o pré-mRNA de SCN9A humano para o tratamento de dores e distúrbios mediados através do subtipo de canal de sódio regulado pela voltagem Nav1.7 e reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório U.S. No. 62/449.738, depositado em 24 de janeiro de 2017, que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Os canais de sódio regulados pela voltagem (VGSCs) são proteínas transmembranas compostas das subunidades α e β. Os VGSCs funcionam como um acesso para os íons de sódio atravessarem a membrana celular. A atividade do canal de sódio é produzida pela subunidade α. O subtipo de VGSC é definido de acordo com o subtipo da subunidade a. Até esta data, existem pelo menos 10 subtipos de VGSC, isto é, Nav1.1, Nav1.2, ..., Nav1.9, e Nax.
[003] Cada subtipo de VGSC tem uma subunidade α distinta e destina-se a mostrar papéis fisiológicos característicos dependendo do tecido de expressão. Por exemplo, o subtipo Nav1.2 é expresso nos neurônios centrais e parece estar ligado à epilepsia. [Human Mol. Genet, vol 24(5), 1459-1468 (2015)]] O subtipo Nav1.5 é abundantemente expresso em cardiomiócitos. A inibição do Nav1.5 pode causar a síndrome do QT longo e a morte súbita. [Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137-168 (2014)] O subtipo Nav1.7 é abundantemente expresso nos gânglios da raiz dorsal. A suprarregulação da atividade de Nav1.7 causa eritromelalgia. [J. Med. Genet vol 41, 171-174 (2004)] Entretanto, as pessoas geneticamente sem a atividade de Nav1.7 (isto é, canalopatia de SCN9A) não sentem dores fortes, embora esses indivíduos tenham sido considerados normais em outras funções sensoPetição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 10/168
2/81 riais.[Nature vol 444, 894-898 (2006)] [004] A tetrodotoxina (TTX) é uma neurotoxina encontrada no baiacu. A TTX é extremamente tóxica e a sua DL50 intraperitoneal é 10 pg/kg nos camundongos. [Toxins vol 6, 693-755 (2014)]. A ingestão oral de TTX pode causar paresia dos lábios e língua, hipersalivação, sudorese, dor de cabeça, tremor, paralisia, cianose, convulsões, incoordenação, diarréia, dor abdominal, hipotensão, desconforto respiratório, arritmias cardíacas, coma e assim por diante. Sabe-se que a TTX induz tais efeitos adversos ligando-se não especificamente aos locais ativos dos subtipos de VGSC. Assim, a inibição não específica dos subtipos de VGSC incorrería em sérios eventos adversos.
[005] A lidocaína é um inibidor não específico de VGSC e tem sido amplamente utilizada como um agente anestésico local. Com a administração intravenosa, a lidocaína pode induzir efeitos colaterais indesejáveis, como espasmo muscular, vômito, batimento cardíaco irregular, sonolência e assim por diante. Tais efeitos colaterais são considerados serem devidos à inibição não específica dos subtipos de VGSC. No entanto, a inibição de Nav1.5 com a lidocaína seria útil para tratar a taquicardia ventricular. Todavia, a administração sistêmica de lidocaína é considerada ser indesejável para tratar as dores crônicas devido aos eventos adversos decorrentes da inibição não específica dos subtipos de canais de sódio.
[006] Canalopatia de SCN9A: O gene SCN9A (subtipo do canal de sódio 9A) codifica a subunidade α do subtipo de VGSC Nav1.7. Há um número extremamente pequeno de indivíduos que não sentem dores fortes, porém são normais em outras funções sensoriais. Verificouse que esses indivíduos tinham 0 gene SCN9A mutado para codificar 0 subtipo não funcional Nav1.7. [Nature vol 444, 894-898 (2006)] Isto tem sido denominado como canalopatia de SCN9A. Os fenótipos comportamentais da canalopatia de SCN9A humana são reproduzidos
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3/81 bastante em camundongos nocautes de SCN9A. [PLoS One 9(9): e105895 (2014)] Portanto, a inibição seletiva do subtipo Nav1.7 seria útil para tratar com segurança as dores crônicas em pacientes humanos.
[007] Inibidores de Moléculas Pequenas Seletivos do Nav1.7: Refletindo a função fisiológica do VGSC, os sítios ativos dos subtipos de VGSC são similares em sua estrutura 3D. Ao direcionar diretamente o sítio ativo com inibidores de moléculas pequenas, a inibição seletiva do subtipo Nav1.7 seria altamente desafiadora. A lidocaína e a tetrodotoxina são bons exemplos para tais inibidores não seletivos dos subtipos de VGSC. (cf. a Figura 1 A) [008] Os inibidores do Nav1.7 com uma seletividade modesta em relação ao Nav1.5 (cerca de 8 vezes) foram identificados através de uma campanha de exame de alto rendimento com uma biblioteca de 200.000 compostos, para identificar os inibidores seletivos de Nav1.8. [J. Gen. Physiol, vol. 131(5), 399-405 (2008)] Verificou-se que um derivado de 1-benzazepin-2ona inibia seletivamente o Nav1.7 em relação ao Nav1.5 com uma seletividade modesta em relação ao Nav1.7 (cerca de 8 vezes) pelo ensaio de eletrofisiologia. (cf. a Figura 1B) [009] Até esta data, foram divulgados vários inibidores de moléculas pequenas seletivos do Nav1.7, e vários foram avaliados em pacientes humanos, (cf. a Figura 1C) Por exemplo, a funapida (XEN402/TV-45070) foi avaliada em um pequeno número de pacientes com eritromelalgia. [Pain vol. 153, 80-85 (2012)] Embora a funapida mostrasse atividade analgésica, a funapida mostrou eventos adversos relacionados ao tratamento e limitantes da dose, incluindo tontura e sonolência, em uma parcela relativamente grande dos pacientes inscritos. Os eventos adversos do SNC sugerem que a seletividade da funapida em relação ao Nav1.7 não seria alta o suficiente para tratar com segurança as dores crônicas.
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4/81 [0010] O raxatrigino (CNV1014802/GSK-1014802) inibe o Nav1.7, bem como outros subtipos de VGSC. No entanto, tem sido reivindicado que o raxatrigino inibe a atividade funcional do canal de sódio estabilizando seletivamente o estado inativo do canal de sódio. Embora o raxatrigino iniba os subtipos de canais de sódio no SNC, ele foi bem tolerado na dose terapêutica. [The Pharmaceutical J. 11 de mar. de 2016. Nav1.7: Nav1.7: a new channel for pain treatment] O raxatrigeno mostrou boa atividade analgésica em pacientes com neuralgia do trigêmeo, embora os pacientes fossem inscritos para avaliação clínica com base em critérios cardiológicos rigorosos devidos à cardiotoxicidade potencial da seletividade relativamente fraca em relação ao Nav1.7.
[0011] O PF-05089771 é um inibidor seletivo do Nav1.7 com uma IC50 de 11 nM. Foi reivindicado que 0 PF-05089771 estabiliza a forma inativa do Nav1.7. [Biophysical J. vol. 108(2) Suppl., 1573a-1574a (2015)] O PF-05089771 de potencial terapêutico foi avaliado em pacientes de eritromelalgia ou dor de dentes após uma extração do dente do siso. Uma análise farmacocinética do PF-05089771 sugeriu que a baixa concentração de fármaco no tecido-alvo responsável pela dor neuropática podería ser uma possível explicação para a sua fraca atividade analgésica em pacientes humanos. [Clin. Pharmacokinet. vol. 55(7), 875-87 (2016)] Embora se reivindicasse que 0 PF-05089771 possuía uma excelente seletividade para 0 Nav1.7 em relação ao Nav1.5, 0 seu tamanho molecular parece ser demasiado grande para mostrar uma boa distribuição nos tecidos do SNC de interesse terapêutico para as dores neuropáticas crônicas.
[0012] Os inibidores de moléculas pequenas seletivos do Nav1.7 foram revistos a partir de aspectos estruturais. [Bioorg. Med. Chem. Lett, vol 24, 3690-3699 (2014)] O tamanho molecular de tais inibidores seletivos do Nav1.7 tende a ser consideravelmente maior do que a li
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5/81 docaína, um inibidor não seletivo dos subtipos de VGSC. A seletividade para o Nav1.7 foi melhorada tornando o tamanho molecular grande. Considera-se que cada inibidor seletivo do Nav1.7 se liga a um domínio distinto dentro da proteína Nav1.7, e o domínio de ligação varia dependendo da estrutura química do inibidor. Ironicamente, a eficácia analgésica dos inibidores seletivos do Nav1.7 não foi forte e não conseguiu atingir a expectativa sugerida a partir das descobertas em pessoas com canalopatia de SCN9A. [Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975-983 (2016)] [0013] Outros Tipos de Inibidores Seletivos do Nav1.7: Verificou-se que o peptídeo do veneno de tarântula ProTx-ll inibe seletivamente o Nav1.7 em relação aos outros subtipos de VGSC. No entanto, o veneno mostrou fraca atividade analgésica em modelos animais de dor inflamatória aguda. [Mol. Pharmacol, vol 74, 1476-1484 (2008)] Considerando que a eletrofisiologia do peptídeo do veneno foi avaliada nas células HEK-293 engenheiradas para expressar abundantemente cada subtipo de VGSC, o ProTx-ll não podería se ligar ao sítio ativo do Nav1.7 nas células neuronais primárias. As células neuronais primárias expressam o Nav1.7 consistindo na cadeia α e β, enquanto as células HEK-293 são normalmente engenheiradas para expressar estavelmente apenas a cadeia α de cada subtipo de VGSC.
[0014] Verificou-se que o Ssm6a, um peptídeo de 46 meros isolado do veneno da centopeia, inibe seletivamente o Nav1.7 em relação aos outros subtipos de VGSC. A IC50 do Nav1.7 observada era 0,3 nM nas células HEK-293 engenheiradas para superexpressar 0 Nav1.7. O peptídeo do veneno da centopeia mostrou uma eficácia analgésica comparável à morfina pelo teste da formalina em camundongos, um modelo de dor inflamatória aguda. O peptídeo de 46 meros também suprimiu a corrente de sódio nas células de DRG de ratos. Embora 0 peptídeo do veneno mostrasse uma estabilidade grande no soro, a ati
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6/81 vidade analgésica durou apenas algumas horas. [Proc. Nat. Acad. Sei. USAvo\ 110(43), 17534-17539 (2013)] [0015] O SVmabl é um anticorpo monoclonal que visa seletivamente o Nav1.7 em relação aos outros subtipos de VGSC nas células HEK-293 superexpressando cada subtipo de VGSC. O SVmabl inibiu seletivamente a corrente de sódio provocada pelo Nav1.7 com uma IC50 de 30 nM nas células HEK-293. O anticorpo monoclonal mostrou uma atividade analgésica acentuada após administração intravenosa (a 50 mg/kg) ou intratecal (10 pg, isto é, cerca de 0,5 mg/kg) contra 0 teste da formalina em camundongos. Com base na diferença na potência analgésica das duas rotas de administração, a inibição do Nav1.7 na medula espinhal ou no SNC deve ser 0 principal contribuinte para a atividade analgésica contra 0 teste da formalina. [Cell vol 157(6), 1393-1404 (2014)].
[0016] Diferença das Espécies na Contribuição do Nav1.7 para a Sensação de Dor: Recentemente, os DRGs humanos de voluntários saudáveis foram avaliados por qPCR quanto aos níveis de expressão relativa dos subtipos de VGSC. Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264017-0132-3, publicado on-line em 19 de abril (2017)] Nos DRGs humanos, a expressão do subtipo Nav1.7 foi aproximadamente 50% da expressão total de VGSC. O Nav1.8 contribuiu para cerca de 12%. Uma incubação de 24 horas de células neuronais de DRG humanos com 0 paclitaxel suprarregulou 0 Nav1.7, porém não 0 Nav1.8, indicando que 0 Nav1.7 deve ser 0 subtipo dominante para a neuropatia em relação ao Nav1.8 em seres humanos. Estas descobertas suportam fortemente os fenótipos observados na canalopatia de SCN9A humana. [Nature vol 444, 894-898 (2006)].
[0017] Por outro lado, a contribuição do Nav1.8 foi primordial para ocupar 48% da expressão de VGSC inteira no DRG de camundongo. A contribuição do Nav1.7 foi 18% no DRG de camundongos CD sim
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7/81 pies (8 a 10 semanas de idade). Assim, prudência deve ser considerada na extrapolação de dados da dor animal para a dose terapêutica em pacientes humanos. Da mesma forma, os modelos de dor animal devem ser cuidadosamente avaliados com o nível de expressão do Nav1.7 no tecido-alvo.
[0018] Pré-mRNA: A informação genética é transportada no DNA (ácido 2-desoxirribose nucleico). O DNA é transcrito para produzir o pré-mRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. O prémRNA de mamíferos normalmente consiste em éxons e introns, e o éxon e o íntron estão interconectados entre si. Os éxons e os introns são numerados conforme ilustrado na Figura 1 D.
[0019] Remoção do Pré-mRNA: O pré-mRNA é processado em mRNA após a remoção dos introns por uma série de reações complexas, coletivamente chamadas remoção (“splicing”), como ilustrado esquematicamente na Figura 2A. [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].
[0020] A remoção é iniciada pela formação do complexo de spliceossoma E (isto é, complexo de spliceossoma inicial) entre o prémRNA e os fatores adaptadores de remoção. No complexo de spliceossoma E, o U1 liga-se à junção de éxon N e íntron N e a U2AF35 liga-se à junção de íntron N e éxon (N+1). Assim, as junções de éxon/íntron ou íntron/éxon são críticas para a formação do complexo de spliceossoma inicial. O complexo de spliceossoma E evolui para o complexo de spliceossoma A na formação de complexo adicional com U2. O complexo de spliceossoma A sofre uma série de reações complexas para excluir ou remover o íntron para unir os éxons vizinhos.
[0021] Síntese da Proteína Ribossômica: As proteínas são codificadas pelo mRNA (ácido ribonucleico mensageiro). Em resposta à es
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8/81 timulação celular ou espontaneamente, o DNA é transcrito para produzir o pré-mRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. Os introns do pré-mRNA são removidos enzimaticamente para produzir o mRNA, o qual é então translocado para o citoplasma. No citoplasma, um complexo de maquinaria translacional chamado ribossomo liga-se ao mRNA e realiza a síntese de proteínas à medida que varre a informação genética codificada ao longo do mRNA. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
[0022] Oliqonucleotídeo Antissenso (ASO): Um oligonucleotideo que se liga ao ácido nucleico, incluindo o DNA, o mRNA e o prémRNA, em uma forma específica da sequência (isto é, complementar), é chamado oligonucleotideo antissenso (ASO).
[0023] Se um ASO se liga a um mRNA no citoplasma, por exemplo, o ASO pode ser capaz de inibir a síntese da proteína ribossômica ao longo do mRNA. O ASO precisa estar presente no citoplasma para inibir a síntese de proteína ribossômica de sua proteína-alvo.
[0024] Se um ASO se ligar firmemente a um pré-mRNA no núcleo, o ASO pode ser capaz de inibir ou modular a remoção do pré-mRNA para mRNA. O ASO precisa estar presente no núcleo para inibir ou modular a remoção do pré-mRNA para mRNA. Tal inibição antissenso da remoção produz um mRNA ou mRNAs sem o éxon visado pela ASO. Tal(is) mRNA(s) é(são) chamado(s) variante(s) da remoção e codifica(m) proteína(s) menor(es) do que a proteína codificada pelo mRNA de tamanho total.
[0025] Em princípio, a remoção pode ser interrompida pela inibição da formação do complexo de spliceossoma E. Se um ASO se ligar firmemente a uma junção de (5’ —> 3') éxon-íntron, isto é, sítio de remoção em 5’, o ASO bloqueia a formação de complexo entre o prémRNA e o fator U1 e, portanto, a formação do complexo de spliceossoma E. Do mesmo modo, o complexo de spliceossoma E não pode
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9/81 ser formado se um ASO se ligar firmemente a uma junção de (5 3') íntron-éxon, isto é, o sítio de remoção em 3’. O sítio de remoção em 3’ e o sítio de remoção em 5’ são esquematicamente ilustrados na Figura 2B.
[0026] Oliqonucleotídeos Não Naturais: Os oligonucleotídeos de DNA ou RNA são suscetíveis à degradação por nucleases endógenas, limitando a sua utilidade terapêutica. Até esta data, muitos tipos de oligonucleotídeos não naturais (isto é, que não ocorrem naturalmente) foram desenvolvidos e estudados intensivamente. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)] Alguns deles mostram estabilidade metabólica prolongada em comparação com o DNA e o RNA. Estão proporcionadas na Figura 3A as estruturas químicas para alguns dos oligonucleotídeos não naturais representativos. Tais oligonucleotídeos previsivelmente ligam-se a um ácido nucleico complementar como o DNA ou o RNA se liga.
[0027] Oliqonucleotídeo de Fosforotioato: O oligonucleotídeo de fosforotioato (PTO) é um análogo de DNA com um dos átomos de oxigênio do fosfato da cadeia principal esqueleto substituído por um átomo de enxofre por monômero. Tal mudança estrutural pequena tornou o PTO comparativamente resistente à degradação por nucleases. [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)] [0028] Refletindo a similaridade estrutural na cadeia principal do PTO e do DNA, ambos penetram mal na membrana celular na maioria dos tipos de células de mamíferos. Para alguns tipos de células expressando abundantemente o(s) transportador(es) de DNA, no entanto, o DNA e o PTO mostram boa permeabilidade celular. Os PTOs administrados sistemicamente são conhecidos por distribuir prontamente para o fígado e o rim. [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)] [0029] A fim de facilitar a penetração celular do PTO in vitro, a lipo
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10/81 fecção tem sido aplicada popularmente. No entanto, a lipofecção altera fisicamente a membrana celular, causa citotoxicidade e, portanto, não seria ideal para uso terapêutico in vivo a longo prazo.
[0030] Nos últimos 30 anos, os PTOs antissenso e as variantes dos PTOs têm sido clinicamente avaliados para tratar cânceres, distúrbios imunológicos, doenças metabólicas e assim por diante. [Biochemistry vol 41,4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)] Muitos desses candidatos a fármacos antissenso não foram desenvolvidos com sucesso, em parte devido à fraca permeabilidade celular do PTO. Para superar a fraca permeabilidade celular, o PTO precisa ser administrado em alta dose para a atividade terapêutica. No entanto, sabe-se que os PTOs estão associados à toxicidade limitante da dose, incluindo o tempo de coagulação aumentado, a ativação do complemento, a nefropatia tubular, a ativação das células de Kupffer e a estimulação imunológica, incluindo a esplenomegalia, a hiperplasia linfoide, a infiltração de células mononucleares. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)].
[0031] Descobriu-se que muitos PTOs antissenso mostram atividade clínica adequada para doenças com uma contribuição significativa do fígado ou rim. O mipomersen é um análogo do PTO que inibe a síntese da apoB-100, uma proteína envolvida no transporte do colesterol LDL. O mipomersen manifestou atividade clínica adequada em uma população de pacientes com aterosclerose, mais provavelmente devida à sua distribuição preferencial para o fígado. [Circulation vol 11 (7), 743-753 (2008)] O ISIS-113715 é um análogo antissenso do PTO que inibe a síntese da proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) e verificou-se que mostra atividade terapêutica em pacientes com diabetes do tipo II. [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
[0032] Ácido Nucleico Bloqueado: No ácido nucleico bloqueado (LNA), o anel de ribose da cadeia principal do RNA é restrito estrutu
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11/81 ralmente para aumentar a afinidade de ligação pelo RNA ou DNA. Assim, o LNA pode ser considerado como um análogo de DNA ou RNA de alta afinidade. [Biochemistry vol. 45, 7347-7355 (2006)] O LNA também mostra uma permeabilidade celular fraca.
[0033] Oliqonucleotídeo de Fosforodiamidato Morfolino: No oligonucleotídeo de fosforodiamidato morfolino (PMO), o fosfato da cadeia principal e a 2-desoxirribose do DNA são substituídos por fosforamidato e morfolina, respectivamente. [Appl. Microbiol. BiotechnoL vol 71, 575-586 (2006)] Embora a cadeia principal do DNA esteja carregada negativamente, a cadeia principal do PMO não está carregada. Assim, a ligação entre o PMO e o mRNA está livre de repulsão eletrostática entre as cadeias principais e tende a ser mais forte do que a ligação entre o DNA e o mRNA. Como o PMO é marcadamente diferente do DNA na estrutura química, o PMO não seria reconhecido pelo(s) transportador(es) hepático(s) que reconhece(m) o DNA ou o RNA. No entanto, o PMO não penetra prontamente na membrana celular.
[0034] Ácido Nucleico Peptídico: O ácido nucleico peptídico (PNA) é um polipeptideo com a N-(2-aminoetil)glicina como a cadeia principal da unidade, e foi descoberto por Peter Nielsen e colaboradores. [Science vol 254, 1497-1500 (1991)] A estrutura química e a nomenclatura abreviada do PNA estão ilustradas na Figura 3B. Como o DNA e o RNA, o PNA também se liga seletivamente ao ácido nucleico complementar. [Nature (London) vol. 365, 566-568 (1992)] Na ligação ao ácido nucleico complementar, a extremidade de N do PNA é considerada como equivalente à “extremidade de 5”’ do DNA ou RNA, e a extremidade de C do PNA como equivalente à “extremidade de 3”’ do DNA ou RNA.
[0035] Como o PMO, a cadeia principal do PNA não está carregada. Assim, a ligação entre o PNA e o RNA tende a ser mais forte do que a ligação entre o DNA e o RNA. Como o PNA é marcadamente
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12/81 diferente do DNA na estrutura química, o PNA não seria reconhecido pelo(s) transportador(es) hepático(s) que reconhece(m) o DNA e mostraria um perfil de distribuição tecidual diferente do DNA ou do PTO. No entanto, o PNA também penetra fracamente na membrana celular dos mamíferos. (Adv. Drug Delivery Rev. vol. 55, 267-280, 2003). [0036] Nucleobases Modificadas para Melhorar a Permeabilidade na Membrana do PNA: O PNA foi tornado altamente permeável na membrana de células de mamífero introduzindo as nucleobases modificadas com um lipídio catiônico ou o seu equivalente ligado covalentemente a este. As estruturas químicas de tais nucleobases modificadas são proporcionadas na Figura 3C. Verificou-se que estas nucleobases modificadas de citosina, adenina e guanina hibridizam de forma previsível e complementar com a guanina, a timina e a citosina, respectivamente. [Peds. PCT Nos. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253] [0037] A incorporação de tais nucleobases modificadas no PNA simula situações de lipofecção. Pela lipofecção, as moléculas de oligonucleotídeos com a cadeia principal de fosfato são envolvidas com moléculas lipídicas catiônicas, tais como a lipofectamina, e tais complexos de lipofectamina/oligonucleotídeos tendem a penetrar na membrana celular com bastante facilidade em comparação com as moléculas de oligonucleotídeos nuas.
[0038] Além da boa permeabilidade na membrana, verificou-se que estes derivados de PNA modificados mostravam uma afinidade ultraforte para o ácido nucleico complementar. Por exemplo, a introdução de 4 a 5 nucleobases modificadas nos derivados de PNA de 11 meros a 13 meros produziu prontamente um ganho de Tm de 20QC ou superior na formação de duplex com o DNA complementar. Tais derivados de PNA são altamente sensíveis a um único mal emparelhamento de bases. Um único mal emparelhamento de bases resultou em
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13/81 uma perda de Tm de 11 a 22QC, dependendo do tipo de base modificada, bem como da sequência do PNA.
[0039] RNA Interferente Pequeno (siRNA): O RN A interferente pequeno (siRNA) refere-se a um RNA de fita dupla de 20-25 pares de bases. [Microbiol. Mol. Biol. Bev. vol. 67(4), 657-685 (2003)] A fita antissenso do siRNA de alguma forma interage com as proteínas para formar um Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC). Em seguida, o RISC liga-se a uma determinada parte do mRNA complementar à fita antissenso do siRNA. O mRNA que formou um complexo com o RISC sofre divagem. Assim, o siRNA induz cataiiticamente a divagem do seu mRNA-alvo e, consequentemente, inibe a expressão da proteína pelo mRNA. O RISC nem sempre se liga à sequência complementar completa dentro do seu mRNA-alvo, o que levanta preocupações relacionadas aos efeitos fora do alvo (“off-target”) de uma terapia de siRNA. Como as outras classes de oligonucleotídeo com cadeia principal de DNA ou RNA, o siRNAi possui uma permeabilidade celular fraca e, portanto, tende a mostrar fraca atividade terapêutica in vitro ou in vivo, a menos que adequadamente formulado ou quimicamente modificado para ter uma boa permeabilidade na membrana.
[0040] siRNA de SCN9A: Uma técnica anterior divulgou siRNAs que visam uma sequência de 19 meros [(5' 3') GAUUAUGGCUACACGAGCU] dentro do éxon 8 do mRNA de SCN9A humano. [Patente US 8183221] Com uma infusão intratecal, os siRNAs foram reivindicados mostrar atividade terapêutica em modelos animais de dor neuropática e dor inflamatória. Os siRNAs foram ditos suprarregular a expressão do Nav1.7 nas células de DRG de ratos.
[0041] ASO de SCN9A: Os 2'-O-metoxietil PTO ASOs visando complementarmente o mRNA de SCN9A de rato foram avaliados quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína Nav1.7 em DRG em ratos após uma única injeção subcutânea de 30 mg de ASO
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14/81 por paciente. Um ASO inibiu a expressão da proteína Nav1.7 em DRG em mais do que 80% na semana 4 após a dose. Estes ASOs de SCN9A inibiram a dor mecânica pelo teste de Randall-Selitto. A eficácia correlacionou-se amplamente com o nível de expressão da proteína Nav1.7 no DRG. [Pain, Mohan e Fitzsimmons et al. na imprensa] [0042] Inibição Antissenso da Remoção do pré-mRNA de SCN9A: Até o momento, não há casos relatados de ASOs de SCN9A induzindo a remoção alternativa do pré-mRNA de SCN9A.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0043] Figura 1 A. As estruturas químicas de lidocaína e tetrodotoxina, inibidores não seletivos de moléculas pequenas de canais de sódio regulados pela voltagem.
[0044] Figura 1B. Um inibidor de 1-benzazepin-2ona do Nav1.7 mostrando uma seletividade modesta para Nav1.7 em relação ao Nav1.5.
[0045] Figura 1C. As estruturas químicas de funapida, raxatrigene e PF-05089771, inibidores seletivos de moléculas pequenas dos canais de sódio regulados pela voltagem.
[0046] Figura 2A. Ilustração esquemática da numeração de éxons e introns dentro de um pré-mRNA.
[0047] Figura 2B. Ilustração esquemática do processo de remoção levando à remoção do intron N.
[0048] Figura 2C. Ilustração esquemática do sítio de remoção em 3’ e do sítio de remoção em 5’ em relação ao complexo de spliceossoma E.
[0049] Figura 3A. Estruturas químicas representativas para o DNA e os ácidos nucleicos não naturais.
[0050] Figura 3B. Ilustração para a estrutura química e a nomenclatura abreviada do PNA.
[0051] Figura 3C. Exemplos de nucleobases modificadas, empre
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15/81 gadas para melhorar a permeabilidade celular do ácido nucleico peptídico.
[0052] Figura 4. Exemplos de nucleobases naturais ou não naturais (modificadas), selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
[0053] Figura 5A. Exemplos para os radicais alquila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
[0054] Figura 5B. Exemplos para os radicais alquilacila substituída ou não substituída, e arilacila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula
I.
[0055] Figura 5C. Exemplos para os radicais alquilamino substituído, arilamino substituído, arila substituída ou não substituída, alquiIsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída e arilfosfonila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
[0056] Figura 5D. Exemplos para os radicais alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, e carbonila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
[0057] Figura 5E. Exemplos para os radicais alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, e alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, que são selecionáveis para o derivado de ácido nucleico peptídico de Fórmula I.
[0058] Figura 6. Estruturas químicas para os monômeros de PNA abreviados como A (adenina), G (guanina), T (timina), C (citosina),
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C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) e G(pOq).
[0059] Figura 7. Estruturas químicas para as abreviaturas utilizadas para descrever os substituintes para ο N terminal ou o C terminal no composto de Fórmula I.
[0060] Figura 8. Estrutura química para o derivado de PNA de 14 meros expresso como (N —> C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)AA(5)A-A(5)A-NH2 [0061] Figura 9. Estrutura química para o derivado de PNA de 16 meros abreviado como (N —> C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)CGC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2.
[0062] Figura 10. Estruturas químicas dos monômeros de FmocPNA utilizados para sintetizar os derivados de PNA desta invenção.
[0063] Figura 11. Ilustração esquemática de um ciclo de alongamento de monômero típico adotado na SPPS desta invenção.
[0064] Figura 12A. Cromatograma de Cw-HPLC de fase reversa para o ASO 2 antes da purificação por HPLC.
[0065] Figura 12B. Cromatograma de Cw-HPLC de fase reversa para o ASO 2 após a purificação por HPLC.
[0066] Figura 13. Dados espectrais de massa ES-TOF obtidos com o ASO 2 após a purificação por HPLC.
[0067] Figura 14A. Dados da eletroforese dos produtos de RTPCR aninhada de SCN9A nas células PC3 tratadas com o ASO 7 durante 5 horas, a 0 (controle negativo), 10 ou 100 zM.
[0068] Figura 14B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída ao salto dos éxons 4-5.
[0069] Figura 14C. Dados de eletroforese dos produtos de RTPCR aninhada de SCN9A nas células PC3 tratadas com o ASO 7 durante 24 horas, a 0 (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 aM.
[0070] Figura 15A. Dados de qPCR para o mRNA de SCN9A de tamanho natural em células PC3 tratadas com o ASO 7, a 0 (controle
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17/81 negativo), 0,1, 1 ou 10 aM, durante 24 horas. O cDNA foi sintetizado por PCR em uma etapa, (barra de erro por erro padrão; e * para p < 0,05) [0071] Figura 15B. Dados de qPCR para o mRNA de SCN9A de tamanho natural em células PC3 tratadas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 0,1, 1 ou 10 aM, durante 24 horas. O cDNA foi sintetizado usando hexâmeros aleatórios, (barra de erro por erro padrão; e ** para p < 0,05) [0072] Figura 16A. A reversão da alodinia induzida por ligação de L5/L6 em ratos SD administrados subcutaneamente com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 1, 3 ou 6 pmole/kg, uma vez por 2 dias. O limiar de von Frey para a pregabalina, 30 mpk, foi adicionado pela adoção da base histórica interna. (* para p <0 ,05 pelo teste t de Student) [0073] Figura 16B. Reversão da alodinia induzida por SNL (ligação de L5/L6) em ratos SD recebendo subcutaneamente o ASO 2, a 0 (controle negativo), 20 pmole/kg QD, 100 pmole/kg QD, 500 pmole/kg QD e 100 pmole/kg Q2D. O limiar de von Frey para a pregabalina, 30 mpk, foi adicionado pela adoção da base histórica interna. (* para p < 0,05 pelo teste t de Student) [0074] Figura 17A. Traços médios da intensidade de fluorescência celular (esquerda) em células neuronais de L5 de DRG de ratos com ligação de L5/L6 após uma incubação de 30 horas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM, juntamente com uma imagem de fluorescência da amostra de uma célula neuronal de DRG tratada com CoroNa Green (direita).
[0075] Figura 17B. Traços médios da intensidade de fluorescência celular em células neuronais de L5 de DRG de ratos sem ligação de L5/L6 após uma incubação de 30 horas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
[0076] Figura 18A. Reversão da alodinia induzida com DPNP em
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18/81 ratos administrados subcutaneamente com 100 pmole/kg de ASO 1. (barra de erro por erro padrão; * para p < 0,05 pelo teste t de student) [0077] Figura 18B. Reversão da alodinia induzida com DPNP em ratos administrados subcutaneamente com 60 pmole/kg de ASO 2 ou 30 pmole/kg de ASO 6 nos Dias 0, 2 e 4. O limiar de von Frey sem DPNP foi adicionado pela adoção da base histórica interna, (barra de erro por erro padrão; * e ** para p < 0,05 e p < 0,01 pelo teste t de student, respectivamente) [0078] Figura 19A. Inibição da dor induzida por uma injeção intraplantar de formalina a 5% em ratos administrados subcutaneamente com ASO 7, a 0 (controle negativo), 10, 30 ou 100 pmole/kg. (barra de erro por erro padrão; * p < 0,05 pelo teste t de student) [0079] Figura 19B. Inibição da dor induzida por uma injeção intraplantar de formalina a 5% em ratos administrados subcutaneamente com o ASO 10, a 0 (controle negativo), 15, 50 ou 150 pmole/kg. (barra de erro por erro padrão; * p < 0,05 pelo teste t de student) [0080] Figura 20A. Imagens de IHC representativas por grupo para a expressão de Nav1.7 em DRG L5 em ratos administrados subcutaneamente com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 1, 6 ou 30 pmole/kg.
[0081] Figura 20B. Nível de expressão relativa do Nav1.7 em DRG L5 em ratos administrados subcutaneamente com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 1, 6 ou 30 pmole/kg. (barra de erro por erro padrão; * para p < 0,05 e ** para p < 0,01 pelo teste t de student) [0082] Figura 21 A. Reversão da alodinia em ratos com ligação de L5/L6 por administração subcutânea de ASO 10, em 1 (escalonado para 30 pmole/kg nos Dias 3 e 7), 3 e 10 pmole/kg. (barra de erro por erro padrão; * para p < 0,05 pelo teste t de student).
[0083] Figura 21B. Reversão da alodinia em ratos com ligação de L5/L6 por administração subcutânea de ASO 10, a 100 pmole/kg,
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19/81 uma vez a cada 4 ou 5 dias, ou por administração oral de pregabalina, 30 mpk.
[0084] Figura 22. Imagens de IHC da expressão de Nav1.7 (vermelho), do corpo de célula neuronal (verde) e do núcleo (azul) com as amostras de medula espinhal obtidas do grupo de tratamento de ASO 10 dosado nos Dias 0 e 4 (imagens do painel superior) e do grupo de controle negativo (imagens do painel inferior). (N = 3 por grupo) [0085] Figura 23A. Dados de Western blot para a expressão do Nav1.7 em células neuronais de L5 de DRG tratadas com o ASO 10 durante 24 horas, a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
[0086] Figura 23B. Dados de qPCR para o mRNA de SCN9A de tamanho natural com a síntese de cDNA por PCR em uma etapa (figura à esquerda) e a síntese de cDNA usando hexâmeros aleatórios (figura à direita) em células neuronais de L5 de DRG tratadas com o ASO 10, em 0 (controle negativo), 10, 30, 100 ou 300 zM, durante 24 horas, (barra de erro por erro padrão; * para p < 0,05 e ** para p < 0,01 pelo teste t de student) [0087] Figura 23C. Média agrupada dos dados da corrente de sódio em células neuronais de L5 de DRG tratadas com o ASO 10, durante cerca de 6 horas, a 0 (controle negativo), 10, 30 ou 100 zM (figura do lado esquerdo); e os traços médios dos dados de corrente de sódio agrupados para as células de controle negativo e as células tratadas com 100 zM de ASO 10 durante cerca de 6 horas (figura do lado direito). Os dados da corrente de sódio foram agrupados como normalizados contra o tamanho da célula. (N refere-se ao número de células agrupadas para análise de dados por grupo; barra de erro por erro padrão; e * para p < 0,05 pelo teste t de student) [0088] Figura 24A. Reversão da alodinia induzida pela ligação de L5/L6 em ratos SD administrados subcutaneamente com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 5, 25, 125 ou 625 fmole/kg, nos Dias 0, 3 e 6. O
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20/81 grupo de tratamento de Pregabalina 30 mg/kg po foi incluído como o controle positivo. (N = 8 por grupo; e barra de erro por erro padrão) [0089] Figura 24B. Alterações no limiar de dor pelo teste de Randall-Selitto em ratos administrados subcutaneamente com o ASO 2, a 0 (controle negativo) ou 100 pmole/kg, nos Dias 0 e 1. (barra de erro por erro padrão; * para p < 0,05 por teste t de student)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0090] A presente invenção proporciona um derivado de ácido nucleico peptídico representado pela Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
B-ι B2
O Y o
X, A Ã N Η Ύ N Η V
Bn-1
O. J o
S!
Sn-1
Bn °γ O NFórmula I
Sn Tn em que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobrepo[0091] [0092] [0093] sição complementar de 10 meros com uma sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano;
[0094] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
[0095] Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn representam, independentemente, 0 radical deuterido [D], hidrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;
[0096] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila [NH2-C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não
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21/81 substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída ou o radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
[0097] Z representa o radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída;
[0098] Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais; e, [0099] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à parte de nucleobase.
[00100] O composto de Fórmula I induz 0 salto do éxon 4 no prémRNA de SCN9A humano, produz a(s) variante(s) de remoção do mRNA de SCN9A humano sem 0 éxon 4 e, portanto, é útil para tratar dores, ou condições que envolvam a atividade do Nav1.7.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [00101] A presente invenção proporciona um derivado de ácido nucleico peptídico representado pela Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
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[00102] em que, [00103] n é um número inteiro entre 10 e 25;
[00104] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com uma sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU]] dentro do prémRNA de SCN9A humano;
[00105] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
[00106] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn representam, independentemente, 0 radical deuterido [D], hidrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;
[00107] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila [NH2-C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída ou 0 radical arila substituída ou não substituída;
[00108] Z representa 0 radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substi
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23/81 tuído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída;
[00109] Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais; e, [00110] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à parte de nucleobase.
[00111] O composto de Fórmula I induz 0 salto do éxon 4 no prémRNA de SCN9A humano, produz a(s) variante(s) de remoção de mRNA de SCN9A humano sem 0 éxon 4 e, portanto, é útil para tratar dores, ou condições que envolvam a atividade do Nav1.7.
[00112] Em algumas modalidades do composto de Fórmula I, n é um número inteiro selecionado de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 e 24.
[00113] O composto de Fórmula I liga-se complementarmente ao sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do intron 3 e do éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, lido a partir do DNA genômico [Sequência de Referência do NCBI: NC_000002.12]. A sequência de 14 meros de [(5' —> 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano é uma sequência de sítio de remoção em 3’ consistindo em 7 meros a partir do íntron 3 e 7 meros a partir do éxon 4. Assim, a sequência de pré-mRNA de 14 meros pode ser convencionalmente expressa como [(5' —> 3') uguuuag | GUACACU],, em que as sequências de íntron e éxon são indicadas com letras pequenas e maiúsculas, respectivamente, e a junção entre 0 íntron 3 e 0 éxon 4 está marcada com | .
[00114] A indicação convencional para 0 pré-mRNA é ainda ilustrada por uma sequência de 30 meros [(5' —> 3') gaaucuugu
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24/81 guuuag | GUACACUUUUACUGG] estendendo-se sobre a junção de intron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano. A numeração dos éxons pode variar dependendo dos transcritos de mRNA de SCN9A relatados. A provisão da sequência de SCN9A de 30 meros é para identificar inequivocamente o sítio-alvo de remoção do composto de Fórmula I, independentemente da numeração do éxon relatada do mRNA de SCN9A.
[00115] As estruturas químicas das nucleobases naturais (isto é, que ocorrem naturalmente) ou não naturais (isto é, que não ocorrem naturalmente) no derivado de PNA da Fórmula I são exemplificadas na Figura 4. As nucleobases naturais ou não naturais desta invenção compreendem, porém não estão limitadas às, nucleobases proporcionadas na Figura 4. A provisão de tais nucleobases naturais e não naturais como exemplos é para ilustrar a diversidade de nucleobases permitidas e, portanto, não deve ser interpretada como limitando o escopo da presente invenção.
[00116] Os substituintes adotados para descrever o derivado de PNA de Fórmula I são exemplificados nas Figuras 5A a 5E. A Figura 5A proporciona exemplos para os radicais alquila substituída ou não substituída. Os radicais alquilacila substituída ou não substituída e arilacila substituída ou não substituída estão exemplificados na Figura 5B. A Figura 5C ilustra exemplos para os radicais alquilamino substituído, arilamino substituído, arila substituída ou não substituída, alquiIsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, e arilfosfonila substituída ou não substituída. A Figura 5D proporciona exemplos para os radicais alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, e arilaminocarbonila substituída ou não substituída. Na Figura 5E, são proporcionados exemplos para os radicais alquiloxiPetição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 33/168
25/81 tiocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, e alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída. A provisão de tais substituintes como exemplos é para ilustrar a diversidade de substituintes permitidos e, portanto, não deve ser interpretada como limitando o escopo da presente invenção. Uma pessoa perita no campo pode prontamente compreender que a sequência de oligonucleotídeos é o fator primordial para a ligação específica da sequência do oligonucleotídeo à sequência-alvo de pré-mRNA sobre os substituintes na extremidade de N ou na extremidade de C.
[00117] O composto de Fórmula I liga-se fortemente ao DNA complementar como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. O duplex entre o derivado de PNA de Fórmula I e o seu DNA ou RNA complementar de tamanho natural possui um valor de Tm demasiado elevado para ser determinado de forma confiável em tampão aquoso. O composto de PNA de Fórmula I produz altos valores de Tm com os DNAs complementares de comprimento mais curto.
[00118] O composto de Fórmula I liga-se fortemente ao sítio-alvo de remoção em 3’ do pré-mRNA de SCN9A humano transcrito a partir do gene SCN9A humano, e interfere com a formação do complexo de spliceossoma inicial que envolve o éxon-alvo do composto. Uma vez que o composto desta invenção inibe estericamente a formação do complexo de spliceossoma inicial, o éxon 4 do SCN9A é removido para produzir a(s) variante(s) de remoção do mRNA de SCN9A sem o éxon 4. Consequentemente, o composto desta invenção induz o salto do éxon 4 no mRNA de SCN9A.
[00119] Devido à forte afinidade do referido composto pela sequência de pré-mRNA complementar, o composto desta invenção pode também ligar-se fortemente a uma sequência de pré-mRNA parcial
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26/81 mente complementar com um ou dois mal emparelhamentos e induzir o salto do éxon-alvo dentro do pré-mRNA de SCN9A. Por exemplo, mesmo se um derivado de PNA de 14 meros de Fórmula I possuir um único mal emparelhamento com o pré-mRNA de SCN9A, o ASO de SCN9A de 14 meros ainda induz o salto do éxon 4 no mRNA de SCN9A.
[00120] O composto de Fórmula I possui uma boa permeabilidade celular e pode ser prontamente distribuído na célula como oligonucleotídeo “nu”, como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. Assim, o composto desta invenção induz o salto do éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A para produzir a(s) variante(s) de remoção do mRNA de SCN9A sem o éxon 4 de SCN9A nas células tratadas com o composto de Fórmula I como oligonucleotídeo nu. O referido composto não requer quaisquer meios ou formulações para distribuir na célula para induzir, de um modo potente, o salto do éxonalvo nas células. O composto de Fórmula I induz prontamente o salto do éxon 4 de SCN9A nas células tratadas com o composto desta invenção como oligonucleotídeo nu na concentração subfemtomolar.
[00121] As células tratadas com o composto de Fórmula I como oligonucleotídeo nu expressam um nível inferior do mRNA de SCN9A de tamanho natural e, portanto, mostram uma atividade funcional do Nav1.7 mais fraca do que as células sem o tratamento com o composto. O composto de Fórmula I inibe a expressão de Nav1.7 em células ou tecidos neuronais após administração sistêmica como oligonucleotídeo nu. Assim, o referido composto é útil para tratar dores, ou distúrbios que envolvam a expressão excessiva de Nav1.7.
[00122] O derivado de PNA de Fórmula I pode ser administrado sistemicamente como oligonucleotídeo nu para induzir o salto do éxon 4 deSCN9A em tecidos-alvo e, portanto, inibir a expressão do mRNA de SCN9A de tamanho natural. O composto de Fórmula I não
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27/81 requer uma formulação particular para aumentar a distribuição sistêmica aos tecidos-alvo para a atividade terapêutica ou biológica pretendida. Normalmente, o composto de Fórmula I é dissolvido em PBS ou solução salina, e administrado sistemicamente para induzir a atividade terapêutica desejada nos tecidos-alvo. O composto desta invenção não necessita ser formulado forte ou invasivamente para induzir a atividade terapêutica sistêmica.
[00123] O composto de Fórmula I pode ser utilizado como combinado com um ácido ou base farmaceuticamente aceitável, incluindo, porém não limitado ao, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ácido clorídrico, ácido metanossulfônico, ácido cítrico, ácido trifluoracético, e assim por diante.
[00124] O derivado de PNA de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado a um paciente em combinação com um adjuvante farmaceuticamente aceitável, incluindo, porém não limitado ao, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido tartárico, ácido esteárico, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etanol, isopropanol, bicarbonate de sódio, água destilada, conservante(s) e assim por diante.
[00125] O composto da presente invenção pode ser sistemicamente administrado a um paciente em uma dose terapêutica de 1 fmole/kg até mais do que 1 nmole/kg, o que variaria dependendo do programa de dosagem, condições ou situações do paciente, e assim por diante.
[00126] É preferido um derivado de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00127] em que, [00128] n é um número inteiro entre 10 e 25;
[00129] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
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SCN9A humano;
[00130] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
[00131] Si, S2, Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn representam, independentemente, 0 radical deuterido, hidrido, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;
[00132] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou 0 radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
[00133] Z representa 0 radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída;
[00134] Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais; e, [00135] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV:
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N-R.
Fórmula II nh2
N N NH wv I 1 L2-N'R4
I
R3 o
„n^nh vwv I ' L3-N'R6
I r5
Fórmula III
Fórmula IV [00136] em que, [00137] R1, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída;
[00138] Li, l_2 e L3 são um ligante covalente representado pela Fórmula V que liga covalentemente 0 grupo amino básico à parte da nucleobase:
Qm-1
Fórmula V em que,
Qi e Qm são um radical metileno (-CH2-) substituído ou não [00139] [00140] substituído, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
[00141] Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-) e amino substituído ou não substituído [-N(H)- ou N(substituinte)-]; e, [00142] [00143]
Tn-1, e Tn m é um número inteiro entre 1 e 15.
Em certas tais modalidades, Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., representam, independentemente, 0 radical deuterido ou hidrido e Z representa 0 radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, ou amino substituído ou não substituído. Em outras tais modalidades, pelo menos um de Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Τι, T2, ..., Tn-1, e Tn representa independentemente 0 radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída, e/ou Z representa 0 radical alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída.
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30/81 [00144] Em algumas modalidades, m na Fórmula V é um número inteiro selecionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14.
[00145] De interesse é um oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00146] em que, [00147] n é um número inteiro entre 11 e 21;
[00148] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
[00149] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
[00150] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn são 0 radical hidrido; [00151] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída;
[00152] Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído; [00153] Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
[00154] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
[00155] R1, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente seleciona
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31/81 dos a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída; [00156] Qi e Qm são um radical metileno substituído ou não substituído, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
[00157] Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno, oxigênio e amino substituído ou não substituído; e, [00158] m é um número inteiro entre 1 e 11.
[00159] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ou ariloxicarbonila substituída ou não substituída.
[00160] Em outra modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos um de X e Y representa independentemente 0 radical alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída ou arilsulfonila substituída ou não substituída.
[00161] De particular interesse é um derivado de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00162] em que, [00163] n é um número inteiro entre 11 e 19;
[00164] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
[00165] 0 composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
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32/81 [00166] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn são 0 radical hidrido; [00167] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída;
[00168] Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído; [00169] Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
[00170] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
[00171] R1, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída;
[00172] Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
[00173] Q2, Q3, ..., e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno, oxigênio e amino; e, [00174] m é um número inteiro entre 1 e 9.
[00175] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
[00176] Em outra modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos um de X e Y representa independentemente 0 radical alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substi
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33/81 tuída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída.
[00177] De grande interesse é um oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00178] em que, [00179] n é um número inteiro entre 11 e 19;
[00180] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
[00181] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
[00182] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn são 0 radical hidrido; [00183] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
[00184] Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído; [00185] Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
[00186] pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
[00187] R1, R3 e Rssão 0 radical hidrido e R2, R4 e Re representam, independentemente, 0 radical hidrido ou alquila substituída ou não substituída;
[00188] Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
[00189] Q2, Q3, ..., e Qm-ι são independentemente selecionados a
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34/81 partir de radical metileno, oxigênio; e, [00190] m é um número inteiro entre 1 e 8.
[00191] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, X e Y representam, independentemente, o radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
[00192] Em outra modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos um de X e Y representa independentemente alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída ou arilacila substituída ou não substituída.
[00193] De maior interesse é um derivado de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00194] em que, [00195] n é um número inteiro entre 11 e 19;
[00196] o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
[00197] o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
[00198] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn são 0 radical hidrido; [00199] X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
[00200] Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído; [00201] Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados a partir de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais;
[00202] pelo menos cinco de Bi, B2, ..., Bn-i, e Bn são independen
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35/81 temente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV;
[00203] Ri, R2, R3, R4, Rs, e Re são 0 radical hidrido;
[00204] Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
[00205] Q2, Q3, ..., e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno e oxigênio; e, [00206] m é um número inteiro entre 1 e 8.
[00207] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
[00208] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos um de X e Y representa, independentemente, 0 radical arilacila substituída ou não substituída.
[00209] De maior interesse é um derivado de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
[00210] em que, [00211] n é um número inteiro entre 11 e 19;
[00212] 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
[00213] 0 composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
[00214] Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι, e Tn são 0 radical hidrido; [00215] X é 0 radical hidrido;
[00216] Y representa 0 radical alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila
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36/81 substituída ou não substituída;
[00217] Z representa o radical amino substituído ou não substituído; [00218] Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais;
[00219] pelo menos cinco de Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV;
[00220] R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são 0 radical hidrido;
[00221] L1 representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, ou -CH2-O-(CH2)5-, com a extremidade direita diretamente ligada ao grupo amino básico; e, [00222] l_2 e L3 são independentemente selecionados a partir de (CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, e -(CH2)2-O-(CH2)3-, com a extremidade direita diretamente ligada ao grupo amino básico.
[00223] Em uma modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, Y representa 0 radical alquilacila substituída ou não substituída ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
[00224] Em outra modalidade do oligômero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, Y representa a arilacila substituída ou não substituída.
[00225] De interesse específico é um derivado de PNA de Fórmula I que é selecionado a partir do grupo de compostos proporcionados abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
(N C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)NH2;
(N C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-ANH2;
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37/81 (N -+ C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N -+ C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)NH2;
(N -+ C) Benzoil-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-LysNH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N -+ C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N -+ C) Benzenossulfonil-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-ANH2;
(N -+ C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N -+ C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N -+ C) Metil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N -+ C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N -+ C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2; (N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N -+ C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)AA(5)C-Lys-NH2;
(N -+ C) [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) N,N-Fenil-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)CNH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
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38/81 (N -+ C) p-Toluenossulfonil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)C-NH2;
(N -+ C) p-Toluenossulfonil-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)C-Lys-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Propil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzoil-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-LysNH2;
(N -+ C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Metilsulfonil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexanoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexanoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)AA(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CAC(1O5)AA-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AANH2;
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39/81 (N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTANH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-CNH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N -+ C) p-Toluenossulfonil-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CAC-Lys-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Benzoil-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2; (N -+ C) Propionil-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-ValNH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2; and, (N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2: [00226] em que, [00227] A, G, T e C são monômeros de PNA com uma nucleobase natural de adenina, guanina, timina e citosina, respectivamente;
[00228] C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq) são monômeros de PNA com uma nucleobase não natural representada pela Fórmula VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX e Fórmula X, respectivamente;
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40/81
Ο--(CH2)q—NH2
Fórmula VI Fórmula VII Fórmula
VIII
Fórmula IX Fórmula X [00229] em que, [00230] p e q são números inteiros; e, [00231] as abreviaturas para os substituintes dos terminais de N e C são especificamente definidas como se segue: Fmoc- é a abreviatura para [(9-fluorenil)metilóxi]carbonil-; Fethoc- para [2-(9fluorenil)etil-1-óxi]carbonila; Ac- para acetil-; n-Hexanoil- para 1(n-hexanoil)-; Benzoil- para benzenocabonil-; Piv- para pivalil-; n-Propil- para l-(n-propil)-; n-Hexil- para l-(n-hexil)-; H- para hidrido-; p-Toluenossulfonila” para (4-metilbenzeno)-1-sulfonil-; Benzenossulfonila” para benzeno-1-sulfonil-; Metilsulfonila” para metil-1-sulfonil-; -Lys- para o resíduo de aminoácido lisina; -Vai- para o resíduo de aminoácido valina; -Leu- para o resíduo de aminoácido leucina; -Arg- para o resíduo de aminoácido arginina;
Gly- para o resíduo de aminoácido glicina; [N-(2Feniletil)amino[carbonil- para [N-1-(2-feniletil)-amino[carbonil-; Benzil- para 1-(fenil)metil-; Fenil- para fenil-; Me- para metil-;
HEX- para 6-amino-1-hexanoil-, FAM- para 5, ou 6-fluoresceínacarbonil- (mistura isomérica) e -NH2 para grupo -amino” não substituído.
[00232] A Figura 6 proporciona coletivamente as estruturas quími
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41/81 cas para os monômeros de PNA abreviados como A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq). Como discutido na técnica anterior [PCT/KR2009/001256], C(pOq) é considerado como um monômero de PNA modificado correspondendo à citosina devido à sua hibridação preferida em guanina. A(p) e A(pOq) são considerados como monômeros de PNA modificados que atuam como adenina pela sua estreita afinidade pela timina. Da mesma forma, G(p) e G(pOq) são considerados serem monômeros de PNA modificados equivalentes à guanina devido ao seu emparelhamento complementar de bases com a citosina.
[00233] A Figura 7 proporciona inequivocamente as estruturas químicas para uma variedade de abreviaturas para os substituintes utilizados para introduzir diversidades na extremidade de N ou na extremidade de C do derivado de PNA de Fórmula I.
[00234] De modo a ilustrar as abreviaturas para os derivados de PNA, a estrutura química para um derivado de PNA de 14 meros indicado como (N C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)AA(5)A-NH2 é proporcionada na Figura 8. Como outra ilustração, a estrutura química para um derivado de PNA de 16 meros abreviado como (N C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)A-Lys-NH2 é proporcionada na Figura 9.
[00235] Uma sequência de PNA de 14 meros de (N —> C) FethocAA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 é equivalente à sequência de DNA (5' 3') AAG-TGT-ACC-TAA-AC, que tem uma sobreposição complementar de 14 meros com uma sequência de prémRNA de 20 meros, conforme marcado em negrito e sublinhado” em [(5' -> 3') uuguquuuaq | GUACACUUUU] estendendo-se sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano.
[00236] Uma sequência de PNA de 18 meros de (N —> C) FethocAA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2 é equiPetição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 50/168
42/81 valente à sequência de DNA de (5' 3') AAG-TGT-ACC-TAA-ACACAA, que tem uma sobreposição complementar de 18 meros com a sequência de pré-mRNA de SCN9A de 20 meros, conforme marcado em negrito e sublinhado” em [(5' -> 3) uuguguuuag | GUACACUUUU1.
[00237] Uma sequência de PNA de 18 meros de (N —> C) FethocAA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2 é equivalente à sequência de DNA de (5' —> 3') AAG-TCT-ACC-TAA-ACA-CTA, que tem uma sobreposição complementar de 16 meros com a sequência de pré-mRNA de SCN9A de 20 meros, conforme marcado em negrito e sublinhado” em [(5' 3') uuguauuuag | GUACACUUUU]·
Assim, o PNA de 18 meros tem dois únicos mal emparelhamentos com o sítio de remoção em 3’ do éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano. Os dois únicos mal emparelhamentos são encontrados no íntron 3 e no éxon 4, conforme marcados com aspas ().
[00238] Uma sequência de PNA de 14 meros de (N —> C) FethocAA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2 é equivalente à sequência de DNA de (5' 3') AAG-TGT-ACC-TAA-AG, que tem uma sobreposição complementar de 13 meros com a sequência de prémRNA de SCN9A de 20 meros, conforme marcado em negrito e sublinhado” em [(5' 3') uuguguuuaq | GUACACUUUU]· Assim, o PNA de 14 meros tem um único mal emparelhamento com o sítio de remoção em 3’ do éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano. O único mal emparelhamento é encontrado no íntron 3, conforme marcado com aspas ().
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Procedimentos Gerais para a Preparação dos Oligômeros de PNA [00239] Os oligômeros de PNA foram sintetizados por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) com base na química de Fmoc, de acordo com o método descrito na técnica anterior [US 6.133.444; WO
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43/81
96/40685], com pequenas modificações, se necessário. O suporte sólido empregado neste estudo foi a Η-Rink Amide-ChemMatrix, adquirida da PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canadá). Os monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada foram sintetizados como descrito na técnica anterior [PCT/KR 2009/001256] ou com pequenas modificações. Tais monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada e os monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase natural foram utilizados para sintetizar os derivados de PNA da presente invenção. Os monômeros de Fmoc-PNA com uma nucleobase modificada são proporcionados na Figura 10. Para um especialista no campo, no entanto, existem muitas pequenas variações obviamente possíveis para os grupos protetores nesses monômeros de PNA. Assim, os monômeros de Fmoc-PNA na Figura 10 devem ser considerados como exemplos e, por conseguinte, não devem ser considerados para limitar o escopo da presente invenção. Os oligômeros de PNA foram purificados por Cw-HPLC de fase reversa (água/acetonitrila ou água/metanol com 0,1% de TFA) e caracterizados por espectrometria de massa, incluindo ESI/TOF/MS.
[00240] A Figura 11 ilustra esquematicamente um ciclo de alongamento de monômero típico, adotado na SPPS deste estudo, e os detalhes sintéticos são proporcionados como abaixo mencionado. Para um especialista no campo, no entanto, existem muitas pequenas variações obviamente possíveis na execução eficaz de tais reações de SPPS em um sintetizador automático de peptídeos ou sintetizador manual de peptídeos. Cada etapa de reação é resumidamente proporcionada como se segue.
[00241] [Ativação da Resina H-Rink-ChemMatrix] 0,01 mmol (ca. 20 mg de resina) da resina ChemMatrix em 1,5 ml de piperidina a 20%/DMF foi submetido ao vórtice em um tubo libra durante 20 min, e a solução de DeFmoc foi removida por filtração. A resina foi lavada
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44/81 durante 30 segundos cada, em série, com 1,5 ml_ de cloreto de metileno (MC), 1,5 ml_ de dimetilformamida (DMF), 1,5 ml_ de MC, 1,5 ml_ de DMF e 1,5 mL de MC. As aminas livres resultantes sobre o suporte sólido foram submetidas ao acoplamento com um monômero de Fmoc-PNA ou com um derivado de aminoácido protegido com Fmoc.
[00242] [DeFmoc] A resina foi submetida ao vórtice em 1,5 mL de piperidina a 20%/DMF durante 7 min e a solução de DeFmoc foi removida por filtração. A resina foi lavada durante 30 segundos cada, em série, com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC. As aminas livres resultantes sobre o suporte sólido foram imediatamente submetidas ao acoplamento com um monômero de Fmoc-PNA.
[00243] [Acoplamento com Monômero de Fmoc-PNA] As aminas livres sobre o suporte sólido foram acopladas com um monômero de Fmoc-PNA como se segue. 0,04 mmol de um monômero de FmocPNA, 0,05 mmol de HBTU [hexafluorfosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-
1,1,3,3-tetrametilurônio] e 10 mmol de DIEA (Λ/,ΛΖ-di-isopropiletilamina) foram incubados, por 2 min, em 1 mL de DMF anidra e adicionados à resina com as aminas livres. A solução de resina foi submetida ao vórtice durante 1 hora e o meio de reação foi removido por filtração. Em seguida, a resina foi lavada durante 30 segundos cada, em série, com
1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC.
[00244] [Capeamento] Após a reação de acoplamento, as aminas livres não reagidas foram capeadas por agitação durante 5 min em 1,5 mL de solução de capeamento (5% de anidrido acético e 6% de 2,6leutidina em DMF). Em seguida, a solução de capeamento foi removida por filtração e lavada durante 30 s cada, em série, com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC.
[00245] [Introdução do Radical Fethoc- na Extremidade de N] O radical Fethoc- foi introduzido na extremidade de N reagindo as ami
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45/81 nas livres sobre a resina com Fethoc-OSu, sob as condições de acoplamento básicas comuns. A estrutura química do Fethoc-OSu [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, PM 351,36] é proporcionada como se segue.
Fethoc-OSu [00246] [Clivagem da Resina] Os oligômeros de PNA ligados à resina foram clivados da resina por agitação durante 3 horas, em 1,5 mL de solução de clivagem (2,5% de tri-isopropilsilano e 2,5% de água em ácido trifluoracético). A resina foi removida por filtração e 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi triturado com éter dietílico e 0 precipitado resultante foi coletado por filtração para purificação por HPLC de fase reversa.
[00247] [Análise e Purificação por HPLC] Após uma clivagem da resina, 0 produto bruto de cada derivado de PNA foi purificado por CwHPLC de fase reversa, eluindo com água/acetonitrila ou água/metanol (método de gradiente) contendo 0,1% de TFA. As Figuras 12A e 12B são cromatogramas de HPLC ilustrativos para 0 ASO 2 antes e depois da purificação por HPLC, respectivamente. A sequência de oligômeros de ASO 2 é como proporcionada na Tabela 1.
Exemplos sintéticos para o Derivado de PNA da Fórmula I [00248] De modo a visar complementarmente 0 sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, os derivados de PNA desta invenção foram preparados de acordo com os procedimentos sintéticos proporcionados acima ou com pequenas modificações. A provisão desses derivados de PNA visando 0 pré-mRNA de SCN9A humano é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser inter
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46/81 pretada como limitando o escopo da presente invenção.
[00249] A Tabela 1 proporciona os derivados de PNA que visam complementarmente o sítio de remoção em 3’ do éxon 4 no prémRNA de SCN9A humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. A provisão dos ASOs de SCN9A na Tabela 1 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretada como limitando o escopo da presente invenção.
Tabela 1. Derivados de PNA complementarmente visando o sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
| Exemplo de PNA | Sequência de PNA (N C) | Massa Exata, m/z | |
| teór.a | obs.b | ||
| ASO 1 | Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T- A(5)CC(102)-TA(5)A-A(5)-NH2 | 5398,60 | 5398,58 |
| ASO 2 | Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)- TAA(5)-A-NH2 | 4282,97 | 4284,99 |
| ASO 3 | Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(102)C- TAA(5)-A-NH2 | 4182,87 | 4182,89 |
| ASO 4 | Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)- TAA-A(5)-NH2 | 4282,97 | 4283,00 |
| ASO 5 | Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A-NH2 | 4281,98 | 4282,05 |
| ASO 6 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)-NH2 | 4369,06 | 4369,08 |
| ASO 7 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4620,16 | 4620,14 |
| ASO 8 | Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T- A(5)AA(5)-C-NH2 | 4345,04 | 4345,08 |
| ASO 9 | Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)- TA(6)A-A(6)C-NH2 | 4676,22 | 4676,25 |
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| Exemplo de PNA | Sequência de PNA (N —> C) | Massa Exata, m/z | |
| teór.a | obs.b | ||
| ASO 10 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)G-NH2 | 4660,16 | 4660,15 |
| ASO 11 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)CA-NH2 | 4895,27 | 4895,20 |
| ASO 12 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)GG-NH2 | 4951,27 | 4951,26 |
| ASO 13 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(102)- TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2 | 5146,37 | 5146,35 |
| ASO 14 | Benzoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4488,10 | 4488,06 |
| ASO 15 | Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(102)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4468,13 | 4468,04 |
| ASO 16 | Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)- TG(5)A-A(5)C-NH2 | 4620,16 | 4620,14 |
| ASO 17 | p-Toluenossulfonil-AA(5)G-TG(2O3)T- A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2 | 4682,17 | 4682,15 |
| ASO 18 | n-Hexanoil-AA(5)G-TG(5)T- A(5)CC(102)-TA(8)A-A(5)C-NH2 | 4524,19 | 4524,20 |
| ASO 19 | Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T- A(5)CC(102)-TA(2O2)A-A(5)C-Lysnh2 | 4991,41 | 4991,37 |
| ASO 20 | [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-AA(3)G- TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)Cnh2 | 4545,16 | 4545,15 |
| ASO 21 | H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(102)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4386,05 | 4386,03 |
| ASO 22 | n-Propil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4440,14 | 4440,06 |
| ASO 23 | N,N-Fenil-Me-AA(5)G-TG(5)T- A(5)CC(102)-TA(5)A-A(4)C-NH2 | 4460,10 | 4460,09 |
| ASO 24 | Benzoil-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)- TA(5)A-A(5)C-NH2 | 4474,08 | 4474,11 |
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| Exemplo de PNA | Sequência de PNA (N —> C) | Massa Exata, m/z | |
| teór.a | obs.b | ||
| ASO 25 | p-Toluenossulfonil-TG(2O3)TA(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lysnh2 | 4238,92 | 4238,95 |
| ASO 26 | Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)- TA(5)T-A(5)C-NH2 | 4635,16 | 4635,14 |
a)massa exata teórica,b) massa exata observada [00250] A Figura 12A é um cromatograma de HPLC obtido com um produto bruto de ASO 2. O produto bruto foi purificado por Cw-HPLC preparativa de fase reversa (RP). A Figura 12B é um cromatograma de HPLC para um produto purificado de ASO 2. A pureza de ASO 2 melhorou marcadamente pela purificação por HPLC preparativa. A Figura 13 proporciona um espectro de massa ESI-TOF obtido com o produto purificado de ASO 2. A provisão dos dados de análise para ASO 2 é para ilustrar como os derivados de PNA de Fórmula I foram purificados e identificados na presente invenção, e não deve ser interpretada como limitando o escopo desta invenção.
Afinidade de Ligação dos Derivados de PNA pelo PNA Complementar [00251] Os derivados de PNA na Tabela 1 foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação pelos DNAs de 10 meros visando complementarmente o N terminal ou o C terminal de PNA. A afinidade de ligação foi avaliada pelo valor de Tm para o duplex entre o PNA e o DNA complementar de 10 meros. O duplex entre os derivados de PNA na Tabela 1 e os DNAs totalmente complementares mostra valores de Tm muito altos para serem determinados com segurança em solução tampão aquosa, uma vez que a solução tampão tendia a ferver durante a medição de Tm.
[00252] Os valores de Tm foram determinados em um espectrômetro de UV/Vis como se segue. Uma solução mista de 4 μΜ de oligôme
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49/81 ro PNA e 4 μΜ de DNA complementar de 10 meros, em 4 ml_ de tampão aquoso (pH 7,16, 10 mM de fosfato de sódio, 100 mM de NaCI), em tubo falcon de polipropileno de 15 ml_, foi incubada a 90Ό por urn minuto e lentamente resfriada até a temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi transferida para uma cubeta de UV de quartzo de 3 ml_, equipada com uma tampa hermética, e submetida a uma medição de Tm em um espectrofotômetro de UV/Visível a 260 nm, como descrito na técnica anterior [PCT/KR2009/001256] ou com pequenas modificações. Os DNAs complementares de 10 meros para a medição de Tm foram adquiridos da Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Coréia do Sul) e usados sem purificação adicional.
[00253] Os valores de Tm observados dos derivados de PNA de Fórmula I foram muito elevados para uma ligação complementar ao DNA de 10 meros, e são proporcionados na Tabela 2 como não corrigidos. Por exemplo, o ASO 7 mostrou um valor de Tm de 77,0QC para o duplex com o DNA complementar de 10 meros [i.e., (5' 3') AGGTAC-ACT-T] visando os 10 meros N terminais no PNA, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” em [(N —> C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)TA(5)CC(1 O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2]· Por outro lado, o ASO 7 mostrou uma Tm de 69,0QC para o duplex com o DNA complementar de 10 meros [i.e., (5' 3') GTT-TAG-GTA-C] visando os 10 meros C terminais no PNA, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” em [(N C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(102)-TA(5) A-A(5)C-N H2].
Tabela 2. Valores de Tm entre os PNAs na Tabela 1 e o DNA complementar de 10 meros visando o N terminal ou o C terminal de PNA.
| PNA | Valor de Tm, QC | |
| DNA de 10 meros contra o N Terminal | DNA de 10 meros contra o C Terminal | |
| ASO 2 | 74,0 | 65,0 |
| ASO 4 | 77,0 | 66,0 |
| ASO 5 | 78,0 | 66,0 |
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| PNA | Valor de Tm, QC | |
| DNA de 10 meros contra o N Terminal | DNA de 10 meros contra o C Terminal | |
| ASO 6 | 75,0 | 72,0 |
| ASO 7 | 77,0 | 69,0 |
| ASO 8 | 78,1 | 70,0 |
| ASO 10 | 79,0 | 74,0 |
Exemplos para as Atividades Biológicas dos Derivados de PNA de Fórmula I [00254] Os derivados de PNA de Fórmula I foram avaliados quanto às atividades biológicas in vitro e in vivo. Os exemplos biológicos proporcionados abaixo são para ilustrar a atividade antissenso dos derivados de PNA de Fórmula I nas células, bem como nos animais e, portanto, não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção aos compostos listados na Tabela 1.
Exemplo 1· Salto do Éxon Induzido pelo ASO 7 nas Células PC3 (A)· [00255] O ASO 7 especificado na Tabela 1 é um ASO de 14 meros que se liga complementarmente a uma sequência de 14 meros do sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A humano. A sequência-alvo de 14 meros dentro do sítio de remoção em 3’ é como marcada em negrito e sublinhada” em [(5' -> 3') uuguauuuag | GUACACUUUU1· O ASO 7 possui uma sobreposição complementar de 6 meros com o íntron 3 e uma sobreposição complementar de 8 meros com o éxon 4. [00256] Uma vez que as células PC3 (Número do Cat. CRL1435, ATCC) são conhecidas por expressar abundantemente o mRNA de SCN9A humano [Br. J. Pharmacol, vol. 156, 420-431 (2009)], o ASO 7 foi avaliado pela sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 nas células PC3 como se segue.
[00257] [Cultura das Células e Tratamento com o ASO] As células
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PC3, desenvolvidas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio F-12K, foram tratadas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 1, 10 ou 100 zM.
[00258] [Extração do RNA e Síntese do cDNA por PCR em Uma Etapa] Após uma incubação com o ASO 7 por 5 horas, o RNA total foi extraído usando Universal RNA Extraction Kit (Número do Cat. 9767, Takara), de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de molde de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit Super Script® One-Step RT-PCR com a polimerase Platinum® Taq (No. do Cat. 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de primers específicos para éxons [exon 2_forward: (5' —> 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; e exon 9_reverse: (5' 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT], de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50QC por 30 min e 94QC por 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 s a 94QC, 30 s a 55QC e 2 min a 72QC.
[00259] [Amplificação por PCR Aninhada] 1 pL de cDNA foi então submetido a uma reação PCR aninhada de 20 pL (No. do Cat. K2612, Bioneer) contra um conjunto de primers específicos para éxons [exon 2n_forward: (5' —> 3') CCACCGGACTGGACCAAAAA; e exon 9n_reverse: (5' 3') GCTAAGAAGGC-CCAGCTGAA], de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95QC por 2 min seguido por 34 ciclos de 30 s a 95QC, 30 s a 55QC e 1 min a 72QC .
[00260] [Identificação dos Produtos para o Salto do Éxon] Os produtos da PCR foram submetidos à separação eletroforética sobre um gel de agarose a 2%. As bandas de tamanho-alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger.
[00261] A Figura 14A proporciona os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada, nos quais as células tratadas com o ASO 7 produziram uma forte banda de PCR atribuível ao salto dos éxons
4-5. No entanto, a banda de PCR para o mRNA de SCN9A de tama
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52/81 nho natural tendeu a ser mais forte nas amostras tratadas com 10 ou 100 zM de ASO do que na amostra de controle negativo. O estranho padrão de resposta à dose na PCR aninhadapode ser devido a uma suprarregulação da transcrição pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon com o ASO 7. [Nature Struc. Mol. Biol, vol 22(3), 256-264 (2015)] O produto de PCR para o salto do éxon foi confirmado por sequenciamento de Sanger ser o salto dos éxons 4-5, como mostrado na Figura 14B.
Exemplo 2. Salto do Éxon Induzido pelo ASO 7 nas Células PC3 (B)· [00262] O ASO 7 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 nas células PC3, como no Exemplo 1, a menos que indicado de outro modo. Nesta experiência, as células PC3 foram tratadas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 1, 10, 100 e 1.000 aM, durante 24 horas. A reação CR aninhada foi realizada contra um conjunto de primers de [exon 3/6_forward: (5' 3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT; e exon 9_reverse: (5' 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA], projetado para amplificar o produto que possui a sequência de junções do éxon 3 e éxon 6.
[00263] A sequência de primers de exon 3/6_forward reconhece a junção do éxon 3 e éxon 6 mais seletivamente do que a junção do éxon 3 e éxon 4 encontrada no mRNA de SCN9A de tamanho natural. A sequência de primers foi projetada para detectar a variante de remoção de SCN9A sem os éxons 4-5 mais sensivelmente do que o mRNA de SCN9A de tamanho natural. Tal primer de salto do éxon seria útil para detectar as variantes de remoção de mRNA com fraca estabilidade metabólica, uma vez que os mRNAs de tamanho natural tendem a mostrar boa estabilidade metabólica obtida através da evolução durante bilhões de anos.
[00264] A Figura 14C proporciona os dados de eletroforese dos produtos da PCR aninhada, nos quais as células tratadas com o ASO
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4-5. O produto da PCR para o salto do éxon foi confirmado por sequenciamento de Sanger ser o salto dos éxons 4-5.
Exemplo 3· gPCR para o mRNA de SCN9A nas Células PC3 Tratadas com o ASO 7 (A) [00265] O ASO 7 foi avaliado por qPCR aninhada de SCN9A quanto à sua capacidade de induzir alterações no nível de mRNA de SCN9A humano nas células PC3, como descrito abaixo.
[00266] [Tratamento com ASO] As células PC3 foram tratadas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 0,1, 1 ou 10 aM. (2 placas de cultura para cada concentração de ASO) [00267] [Extração do RNA e Síntese do cDNA por PCR de Uma Etapa] Após uma incubação com o ASO 7 durante 24 horas, o RNA total foi extraído e submetido à amplificação por PCR de uma etapa, como descrito no Exemplo 1.
[00268] [Amplificação por qPCR aninhada] As soluções de cDNA foram diluídas por 100 vezes e 1 pL de cada produto de PCR diluído foi submetido a uma reação PCR em Tempo Real de 20 μΙ_ contra um conjunto de primers específicos para éxons de [exon 3_forward: (5' 3') TGACCATGAATAACCCAC; and exon 4_reverse: (5' 3')
GCAAGGATTTTTACAAGT], de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95QC por 30 s, seguido por 40 ciclos de 5 s a 95QC e 30 s a 60QC. A reação qPCR foi seguida com uma sonda TaqMan de [(5' —> 3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ] visando a junção do éxon 3 e éxon 4 dentro do mRNA de SCN9A de tamanho natural.
[00269] A Figura 15A resume os dados da qPCR observados, nos quais o nível de mRNA de SCN9A de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de student) nas células tratadas com o ASO 7 em cerca de 35 ~ 45%.
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Exemplo 4. gPCR para o mRNA de SCN9A nas Células PC3 Tratadas com o ASO 7 (B) [00270] O ASO 7 foi avaliado por qPCR aninhada de SCN9A quanto à sua capacidade de induzir alterações no nível de mRNA de SCN9A humano nas células PC3, como no Exemplo 3, a menos que indicado de outro modo. O cDNA foi sintetizado utilizando hexâmeros aleatórios e submetido à reação qPCR de SCN9A contra a sonda TaqMan.
[00271] A Figura 15B proporciona os dados de qPCR observados, nos quais o nível de mRNA de SCN9A de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de student) nas células tratadas com o ASO 7 em cerca de 50 ~ 60%.
Exemplo 5· Indução da Neuropatia Espinhal em Ratos por Ligação de L5/L6 do Nervo Espinhal· [00272] A ligação do nervo espinhal (SNL) induz a neuropatia nos gânglios da raiz dorsal (DRG) e na medula espinhal, e tem sido amplamente utilizada como um modelo para dores neuropáticas. [Pain vol 50(3), 355-363 (1992)] Dependendo de como o(s) feixe(s) do nervo espinhal é(são) ligado(s), no entanto, existem diversas variações da SNL. O grau e a duração da neuropatia no GRD parecem variar dependendo de como o(s) feixe(s) do nervo espinhal é(são) ligado s). [Pain vol 43(2), 205-218 (1990)] De acordo com a experiência interna, a dupla ligação dos nervos espinhais L5 e L6 (isto é, ligação de L5/L6) induz a neuropatia mais grave e persistindo por mais tempo do que a ligação única do nervo espinhal L5 (isto é, ligação de L5).
[00273] [Cirurgia de SNL por Ligação de L5/L6] Os ratos SD machos foram anestesiados com zoletil/rompun. Em seguida, os feixes do nervo espinhal L5 e L6 (lado esquerdo) foram expostos e firmemente ligados. Em seguida, o músculo e a pele foram fechados e grampeados de acordo com os procedimentos assépticos devidos.
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55/81 [00274] [Indução da Dor Neuropática] 6 a 7 dias após a operação de SNL, a pata do lado ligado foi estimulada por pontuação de von Frey utilizando um anestesiômetro eletrônico de von Frey (Modelo Número 2390, IITC Inc. Life Science), como descrito abaixo. A pontuação de von Frey foi feita diariamente até o agrupamento para as avaliações farmacológicas.
[00275] [Pontuação de Von Frey Eletrônica] Após estabilização por menos do que 30 minutos de cada animal em uma gaiola de plástico, personalizada para a pontuação de von Frey, a pata traseira esquerda de cada animal foi submetida à pontuação de von Frey 6 vezes, com um intervalo de vários minutos entre as pontuações. A pontuação da primeira pontuação foi descartada, pois os animais não estavam estabilizados durante a primeira pontuação. Das cinco pontuações restantes, as pontuações mais alta e mais baixa foram excluídas. Então, a média das três pontuações restantes foi tomada como a pontuação de von Frey para o animal.
Exemplo 6· Reversão da alodinia pelo ASO 7 nos Ratos com Neuropatia Espinhal· (1) [00276] O ASO 7 é um ASO de SCN9A de 14 meros parcialmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A de rato lido a partir do DNA genômico de rato [Sequência de Referência do NCBI: NC_000002.12] com um único mal emparelhamento na extremidade 3’ da sequênciaalvo. A sequência-alvo de 13 meros de ASO 7 dentro do pré-mRNA de SCN9A de rato é especificada em negrito e sublinhada”, conforme marcado na sequência de pré-mRNA de SCN9A de 20 meros de [(5' —> 3') uuuccuuuag | GUACACUUUU1, em que o único mal emparelhamento encontrado no íntron 3 foi marcado com aspas ().
[00277] O ASO 7 foi avaliado pela sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com neuropatia espinhal induzida por ligação de L5/L6, como descrito abaixo.
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56/81 [00278] [Cirurgia de SNL e Agrupamento] No Dia -10, os ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à ligação de L5/L6. Os animais foram estimulados pela pontuação de von Frey desde o Dia -4, diariamente. No Dia 0, 30 animais foram selecionados com base nas pontuações de von Frey individuais no Dia 0, e especificados em 4 grupos do grupo de controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO), e os três grupos de tratamento de
1,3 e 6 pmole/kg de ASO 7. (6 ou 9 animais por grupo) [00279] [Tratamento com ASO e Pontuação de Von Frey] Os ratos receberam subcutaneamente o ASO 7 a 0 (controle negativo), 1,3 ou 6 pmole/kg, à tarde, nos Dias 0, 2, 4, 6, 8 e 10. A alodinia foi pontuada pelo método de pontuação de von Frey eletrônico descrito no Exemplo 5, de manhã. O ASO foi administrado como oligonucleotídeo nu, isto é, conforme dissolvido em PBS.
[00280] [Reversão da Alodinia] A Figura 16A resume os resultados observados das pontuações de von Frey. Os animais do grupo de controle negativo mostraram pontuações médias de von Frey (limiar de retirada) estabilizadas entre cerca de 6 e 7 g ao longo do período de 12 dias após o agrupamento. O ASO 7 reverteu significativamente (teste t de student) a alodinia a partir do Dia 4 e depois. Embora a atividade terapêutica fosse comparável em todos os grupos de tratamento, o grupo de 6 pmole/kg começou a mostrar a atividade terapêutica a partir do Dia 2 após a primeira dosagem.
[00281] Embora não houvesse comparador de controle positivo incluído nesta avaliação específica, as pontuações de von Frey de 10 a 12 g foram frequentemente observadas de acordo com as avaliações internas nos ratos (com a ligação de L5/L6) administrados oralmente com pregabalina, a 30 mg/kg. Assim, a eficácia do ASO 7 a 1 a 6 pmole/kg seria comparável à pregabalina, 30 mg/kg, neste modelo específico de dor neuropática.
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Exemplo 1. Reversão da Alodinia pelo ASO 2 nos Ratos com Neuropatia Espinhal· [00282] O ASO 2 especificado na Tabela 1 é um ASO de 13 meros totalmente complementar ao sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” em [(5' 3') uuauquuuaq | GUACACUUUU1· O ASO 2 possui uma sobreposição de 5 meros com o íntron 3, e uma sobreposição de 8 meros com o éxon 4. A sequência-alvo de ASO2 é conservada no pré-mRNA de SCN9A de rato.
[00283] O ASO 2 foi avaliado quanto à sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com neuropatia espinhal induzida por ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 6, a menos que indicado de outro modo.
[00284] [Agrupamento e Tratamento com ASO] Os ratos SD machos (5 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à operação de SNL no Dia -16. No Dia 0, 30 ratos foram selecionados e especificados em 5 grupos do grupo de controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO) e os quatro grupos de tratamento de 20 pmole/kg QD (ou seja, diariamente uma vez), 100 pmole/kg QD, 500 pmole/kg QD e 100 pmole/kg Q2D (ou seja, uma vez a cada dois dias) de ASO 2. (6 animais por grupo) Os animais foram administrados subcutaneamente com o ASO 2 durante os Dias 0 a 13, de acordo com os programas de dosagem de QD e Q2D. O ASO foi administrado como oligonucleotídeo nu, isto é, como dissolvido em PBS.
[00285] [Pontuação da Alodinia] A alodinia foi pontuada durante os Dias 0 a 14 de acordo com o método de von Frey descrito no Exemplo 5. No Dia 7, a pata direita (lado não ligado) foi submetida à pontuação de von Frey.
[00286] [Reversão da Alodinia] A Figura 16B resume os resultados
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58/81 observados das pontuações de von Frey. Os animais no grupo de controle negativo mostraram pontuações de limiares médioa de von Frey estabilizadas entre cerca de 6 e 8 g durante o período de 14 dias após o agrupamento.
[00287] No caso da pata do lado ligado, a alodinia foi significativamente revertida (teste t de student) noDdia 1 e depois nos animais administrados com o ASO a 20 pmole/kg QD, 100 pmole/kg Q2D e 500 pmole/kg QD, exceto para o grupo de 100 pmole/kg QD. No Dia 14, no entanto, a alodinia também foi significativamente revertida nos 100 pmole/kg QD.
[00288] No caso da pata do lado não ligado, as pontuações de von Frey dos grupos de tratamento com ASO no Dia 7 foram maiores do que a pontuação do grupo de controle negativo. As pontuações de von Frey observadas foram 15,3 g (controle negativo), 17,6 g (20 pmole/kg QD), 19,2 g (100 pmole/kg QD), 20,1 g (100 pmole/kg Q2D) e 19,5 g (500 pmole/kg QD). No entanto, não houve diferenças significativas entre os grupos de tratamento com ASO e o grupo de controle negativo.
Exemplo 8· Inibição da Corrente de Sódio pelo ASO 7 em Células de L5 de DRG de Rato Ativadas com a Ligação de L5/L6 do Nervo Espinhal· [00289] A corrente de sódio celular é normalmente medida por fixação de membranas. À medida que os íons de sódio são absorvidos nas células, o nível de íons de sódio intracelular aumenta. O nível de sódio intracelular pode ser avaliado usando um corante sensível ao íon de sódio. O CoroNa Green é um corante com um quelante específico para íons de sódio do tipo éter de coroa. Após a quelação de um íon de sódio, o CoroNa Green emite fluorescência verde. O CoroNa Green tem sido usado para medir indiretamente o nível de sódio celular. Verificou-se que o nível de sódio medido pelo CoroNa Green cor
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59/81 relaciona-se bem com a corrente de íons de sódio medida por fixação de membranas dos íons de sódio. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)] [00290] O ASO 7 foi avaliado quanto à sua capacidade de infrarregular a corrente de íon de sódio em células de DRG de rato utilizando o CoroNa Green como se segue.
[00291] [Extração de DRG] No Dia 0, os ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 5. Os ratos foram esporadicamente submetidos à ponutação de von Frey durante um período de 4 semanas. No Dia 31, um rato mostrando uma pontuação de von Frey baixa foi sacrificado para extrair o DRG de L5 tanto esquerdo (lado ligado) quanto direito (lado não ligado). Os DRGs foram imersos em 0,5 mL de PBS imediatamente após a extração.
[00292] [Preparação das Células Neuronais de L5 de DRG] As células de DRG foram preparadas de acordo com os procedimentos divulgados na literatura [Methods Mol Biol, vol 846, 179-187 (2012); PLoS One vol 8(4); e60558 (2013)], que é resumidamente descrito em série como se segue: (1) O DRG foi transferido para um tubo e de 1,5 mL contendo 0,2 mL de colagenase a 0,125% (Colagenase Tipo IV, No. do Cat. C5138-100MG, Sigma) em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank, Número do Cat. 14025-092, Life Technologies), cortada em pedaços o menor possível com tesouras e incubada durante 20 min em uma incubadora de CO2 a 37QC sob 5% de CO2 e 95% de UR; (2) 50 pL de 0,25% de tripsina/EDTA foram adicionados ao tubo e, que foi mantido na incubadora por mais 10 min; (3) 0 tubo e foi carregado com 1 mL de meio DMEM completo, e submetido à sedimentação centrífuga a 600g por 5 min; @ a pelota resultante foi suspensa em 4 mL de meio Neurobasal-A (Meio Neurobasal®, No. do Cat. 21103-049, Gibco) suplementado com 2X B-27 (Suplemento Sem Soro B-27®, No. do Cat.
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17504- 044, Gibco), 1X penicilina-estreptomicina, 1X L-glutamina e 1 mL da suspensão de células foi cuidadosamente semeado sobre um vidro de cobertura revestido com laminina (No. do Cat. GG-25-1,5laminina, Neuvitro) colocado em uma placa de cultura de 35 mm; (5) um dia após a semeadura, a placa foi cuidadosamente carregada com outro meio Neurobasal-A fresco de 1 mL; © dois dias após a sementeira, o meio foi substituído com 2 mL de meio Neurobasal-A fresco suplementado com 1 μΜ de Ara-C (citosina β-D-arabinofuranosídeo, No. do Cat. C1768-100MG, Sigma) de modo a suprimir seletivamente o crescimento de células que não fossem células neuronais de DRG; © quatro dias após a semeadura, o meio foi substituído novamente com 2 mL de meio Neurobasal-A suplementado com 1 μΜ de Ara-C; e (8) cinco ou seis dias após a semeadura, as células neuronais de DRG foram tratadas com o ASO.
[00293] [Tratamento com ASO e Ensaio com CoroNa] As células neuronais de DRG de L5 com a ligação de L5/L6 ou sem a ligação de L5/L6 foram tratadas com o ASO 7, a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM. 30 horas depois, as células foram lavadas com 2 mL de HBSS e, em seguida, carregadas com 2 mL de HBSS fresca. Em seguida, as células foram tratadas com 5 μΜ de CoroNa Green (No. do Cat. C36676, Life Technologies), a 37QC. 30 min depois, as células foram lavadas 2 vezes com 2 mL de HBSS e carregadas com 2 mL de HBSS fresca. A placa de cultura foi montada sobre um microscópio de fluorescência Olympus (Modelo BX53, Olympus) equipado com uma câmera CCD para capturar continuamente as imagens fluorescentes verdes das células. As células foram tratadas de forma aguda com NaCI a 10 mM e então as alterações na intensidade fluorescente celular foram registadas digitalmente durante um período de 300 s. Havia 4 a 5 células por quadro, isto é, por concentração de ASO. As intensidades de fluorescência de cada célula individual foram traçadas em uma
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61/81 resolução de segundo. Foi tirada a média dos traços das intensidades de fluorescência intracelular das células individuais utilizando o programa ImageJ (versão 1.50i, NIH), e os traços médios são proporcionados nas Figuras 13(A) e 13(B) para as células com a ligação de L5/L6 e sem a ligação de L5/L6, respectivamente. O traço de intensidade de fluorescência médio foi considerado como o traço da concentração de sódio intracelular individual para as células tratadas com o ASO 7 a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
[00294] [Resultados do Ensaio com CoroNa] Nas células neuronais de DRG estimuladas com a ligação de L5/L6 [cf. Figura 17A], o tratamento com o ASO 7 a 100 zM ou 1 aM inibiu marcadamente a intensidade média de fluorescência celular. No ponto de tempo de 150 s, por exemplo, a intensidade média de fluorescência celular (isto é, a corrente de sódio) diminuiu em 80 ~ 85% nas células tratadas com o ASO.
[00295] Nas células neuronais de DRG sem a ligação de L5/L6 [cf. Figura 17B], o tratamento com o ASO 7 a 1 aM induziu uma diminuição na intensidade média de fluorescência celular. No entanto, a diminuição observada foi cerca de 50% no ponto de tempo de 150 s, e não tão acentuada como nas células estimuladas com a ligação de L5/L6. Além disso, o tratamento com o ASO 7 a 100 zM não inibiu a corrente de sódio nas células neuronais sem a estimulação de L5/L6.
[00296] Sabe-se que as células neuronais de DRG sem estimulação neuropática expressam vários subtipos de VGSC, incluindo Nav1.7, Nav1.8, Nav1.2 e assim por diante. O subtipo Nav1.7 mostra uma contribuição limitada para toda a corrente de sódio nas células neuronais de DRG sem a estimulação. [Nat Comm, vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)] As células neuronais de DRG de rato sem a ligação de L5/L6 podem simular essas células neuronais de DRG sem neuropatia. A inibição observada da corrente
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62/81 de sódio nas células de DRG sem a ligação de L5/L6 pode refletir apenas a contribuição da corrente de sódio do subtipo Nav1.7.
[00297] Por outro lado, as células neuronais são conhecidas por suprarregularem a expressão de Nav1.7 em resposta à neuropatia persistente. [J Biol Chem. vol 279(28), 29341-29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)] As células neuronais de DRG de rato com a ligação de L5/L6 podem simular as células neuronais de DRG com neuropatia. O ASO 7 tanto a 100 zM quanto a 1 aM inibiu a corrente de sódio em 80 ~ 85% nas células neuronais estimuladas pela ligação de L5/L6. A maior inibição da corrente de sódio pelo ASO 7 nas células de DRG com a ligação de L5/L6 é consistente com a suprarregulação de Nav1.7 nas células neuronais por neuropatia crônica.
[00298] Consideradas em conjunto, as verificações observadas nas células neuronais de DRG de rato com e sem a ligação de L5/L6, conclui-se que o ASO 7 inibe seletivamente a expressão do subtipo Nav1.7. O ASO 7 parece inibir a expressão de Nav1.7 de modo mais potente em células neuronais com neuropatia do que naquelas células sem neuropatia.
Exemplo 9· Reversão da Alodinia pelo ASO 1 em Ratos com DPNP· [00299] O ASO 1 especificado na Tabela 1 é um ASO de 16 meros totalmente complementar ao sítio de “remoção” em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” na sequência de pré-mRNA de SCN9A de 25 meros de [(5' 3') uuguguuuag | GUACACUUUUACUGG]· O ASO 1 possui uma sobreposição de 5 meros com o íntron 3, e uma sobreposição de 11 meros com o éxon 4. O ASO 1 é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A de rato.
[00300] O ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de reverter a alodinia provocada pela dor neuropática periférica diabética (DPNP)
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63/81 em ratos.
[00301] [Indução da DPNP e Agrupamento] No Dia 0, a estreptozotocina dissolvida em tampão de citrato (pH 6) foi administrada de modo intraperitoneal, a 60 mg/kg, aos ratos SD machos pesando cerca de 200 g, para induzir o diabetes do tipo I. [J. Ethnopharmacol. vol 72(1-
2), 69-76 (2000)] No Dia 10, os ratos com a DPNP foram especificados aleatoriamente em 2 grupos do controle negativo (apenas veículo, PBS) e 100 pmole/kg de ASO 1 e com base nas pontuações de von Frey dos animais individuais, no Dia 10, usando os microfilamentos de von Frey, como descrito abaixo. (N = 8 por grupo) [00302] [Pontuação de Von Frey pelo Método Up & Down] A alodinia foi pontuada com um conjunto de microfilamentos de von Frey (Touch Test®) de acordo com o método Up & Down. [J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63 (1994)] [00303] [Administração do ASO e Pontuação da Alodinia] O ASO 1 foi dissolvido em PBS e administrado subcutaneamente aos ratos nos Dias 11, 13, 15, 17 e 19. A alodinia foi pontuada 2 horas após a dose nos Dias 11, 13, 15, 17 e 19 e, adicionalmente, nos Dias 21 e 23, a fim de avaliar a duração da atividade terapêutica após a dose final.
[00304] [Reversão da Alodinia] A Figura 18A resume os resultados observados das pontuações de von Frey. Os animais no grupo de controle negativo mostraram limiares de von Frey médios estabilizados entre 6 e 7 g durante o período dos Dias 10 a 23. Nos animais que receberam o ASO 1 a 100 pmole/kg, a alodinia foi significativa (teste t de student) revertida em cerca de 80%, 2 horas após a primeira dose, ou seja, no Dia 11. A atividade terapêutica aumentou ligeiramente, porém gradualmente, até cerca de 90%, à medida que o ASO era repetidamente administrado até o Dia 19. Dada a atividade terapêutica completamente removida 2 dias após a dose final, ou seja, noDdia 21, o ASO 1 pode não possuir uma meia-ida farmacodinâmica longa o su
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64/81 ficiente para suportar o programa de dosagem de uma vez por dois dias, ou seja, Q2D.
[00305] No entanto, o ASO 1 mostrou um tempo de início de algumas horas na reversão da alodinia se julgado pelas pontuações de von Frey no Dia 11.
Exemplo 10· Reversão da Alodinia pelo ASO 2 e pelo ASO 6 em Ratos com DPNP· [00306] O ASO 6 é um ASO de 13 meros que se liga complementarmente a uma sequência de 13 meros do sítio de “remoção” em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, conforme marcado em negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de SCN9A de 25 meros de [(5' —> 3') uuguguuuag | GUACACUUUUACUGG]· O ASO 6 possui uma sobreposição de 5 meros com o íntron 3, e uma sobreposição de 8 meros com o éxon 4. Embora o ASO 2 e o ASO 6 visem a mesma sequência no pré-mRNA de SCN9A humano, o ASO 6 é considerado possuir uma afinidade mais forte pelo RNA complementar do que o ASO 2.
[00307] O ASO 2 e o ASO 6 foram avaliados quanto à sua capacidade de reverter a alodinia provocada pela DPNP nos ratos, como descrito no Exemplo 9, salvo indicação em contrário.
[00308] O diabetes foi induzido nos ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) por uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina, a 60 mg/kg, no Dia -10. No Dia 0, 18 animais mostrando as menores pontuações de von Frey foram selecionados e especificados para três grupos de controle negativo (somente veículo, PBS), 60 pmole/kg de ASO 2 e 30 pmole/kg de ASO 6. (N = 6 por grupo) Os ratos foram administrados subcutaneamente com veículo ou ASO dissolvido em PBS nos Dias 0, 2 e 4. A alodinia foi pontuada pelo modo de von Frey eletrônico, como descrito no Exemplo 5.
[00309] [Reversão de Alodinia] A Figura 18B resume as pontuações
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65/81 de von Frey observadas. Os animais no grupo de controle negativo mostraram limiares de von Frey médios estabilizados em cerca de 10 a 12 g durante o periodo dos Dias 0 a 9.
[00310] Nos animais que receberam 60 pmole/kg de ASO 2, a alodinia foi gradualmente revertida para o nivel de base sem neuropatia diabética (isto é, o nível de recuperação total pelo limiar histórico interno) no Dia 4, após a primeira dose no Dia 0. A atividade terapêutica significativamente (teste t de student) persistiu por mais 3 dias após a dose final no Dia 4.
[00311] Nos animais que receberam 30 pmole/kg de ASO 6, a atividade terapêutica significativamente (teste t de student) melhorou no Ddia 2, e persistiu por mais 4 dias após a dose final no Dia 4. Assim, o ASO 6 reverteu a alodinia mais potentemente do que o ASO 2. Ao contrário do ASO 1 no Exemplo 9,o ASO 6 mostrou uma duração de atividade terapêutica suficientemente longa para suportar um programa de dosagem de 2 vezes por semana em ratos.
[00312] [Diversos] Como o diabetes persistiu, os animais no grupo de controle negativo mostraram sinais de colapso físico durante as pontuações de von Frey. Os animais nos grupos de tratamento estavam ativos e responsivos ao desafio de von Frey, o que estaria consistente com a atividade terapêutica dos ASOs.
Exemplo 11. Atividade Analgésica do ASO 7 no teste de Formalina em Ratos.
[00313] A dor induzida por uma injeção intraplantar de 20 μΙ_ de 2% de formalina diminuiu acentuadamente nos camundongos KO de SCN9A globais. A extensão inibitória foi 73% e 86% para a Fase I (0 a 10 minutos após a injeção de formalina) e a Fase II (15 a 45 minutos após a injeção de formalina), respectivamente. [PLoS One vol 9(9), e105895 (set. 2014)] [00314] O ASO 7 possui um único mal emparelhamento na extre
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66/81 midade 5’ do pré-mRNA de SCN9A de rato, e foi avaliado quanto à sua atividade analgésica no teste de formalina em ratos como se segue.
[00315] [Agrupamento e Tratamento com ASO] No Dia -6, 24 ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram aleatoriamente especificados para 4 grupos do controle negativo (sem tratamento com ASO) e três grupos de tratamento com ASO 7 de 10, 30 e 100 pmole/kg. (N = 6 por grupo) Cada grupo de animais recebeu subcutaneamente o ASO 7 a 0 (controle negativo), 10, 30 ou 100 pmole/kg nos Dias -6 e -2. O ASO 7 foi diluído em PBS para a injeção.
[00316] [Teste de Formalina] No Dia 0, a dor aguda foi induzida por uma injeção intraplantar de 50 pL de formalina a 5% na pata traseira esquerda. Imediatamente após a injeção de formalina, cada rato foi submetido a uma gravação de vídeo individual durante uma hora após a injeção de formalina. O vídeo foi repetido para pontuar visualmente as respostas de dor para cada animal infligido.
[00317] [Atividade Analgésica] A Figura 19A resume as pontuações observadas de dor pelo grupo em vários pontos de tempo após a injeção de formalina. As respostas de dor na Fase II (AUC entre 10 e 40 min) diminuíram significativamente (* p < 0,05 pelo teste t de student) em 33%, 36% e 32% nos grupos de tratamento de 10, 30 e 100 pmole/kg, respectivamente. Por outro lado, as respostas de dor na Fase I (AUC entre 0 e 10 min) diminuíram em 14%, 40% e 43% sem significância estatística nos grupos de tratamento de 10, 30 e 100 pmole/kg, respectivamente.
Exemplo 12· Atividade Analgésica do ASO 10 no Teste de Formalina em Ratos.
[00318] O ASO 10 especificado na Tabela 1 é um ASO de SCN9A de 14 meros parcialmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A
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67/81 humano com um único mal emparelhamento na extremidade 5’ da sequência-alvo de pré-mRNA, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” na sequência de pré-mRNA de SCN9A de 25 meros de [(5' —> 3') uuguquuuaq | GUACACUUUUACUGG1, em que o único mal emparelhamento no íntron 3 está marcado com aspas (). Por outro lado, o ASO 10 é totalmente complementar ao sítio de remoção em 3’ que se estende sobre a junção do íntron 3 e éxon 4 dentro do pré-mRNA de SCN9A de rato, conforme marcado “em negrito” e “sublinhado” na sequência de pré-mRNA de SCN9A de rato de 20 meros de [(5' —> 3') uuuccuuuaq | GUACACUUUU1· O ASO 10 possui uma sobreposição de 6 meros com o íntron 3 e uma sobreposição de 8 meros com o éxon 4.
[00319] O ASO 10 foi avaliado quanto à sua atividade analgésica no teste da formalina em ratos, como descrito no Exemplo 11, a menos que indicado de outro modo.
[00320] [Agrupamento e Tratamento com ASO] 36 ratos SD machos (7 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram especificados aleatoriamente para quatro grupos do controle negativo (sem tratamento com ASO) e três grupos de tratamento com ASO 10 de 15, 50 e 150 pmole /kg. (N = 9 por grupo) Cada grupo de animais foi administrado subcutaneamente com o ASO 10 a 0 (controle negativo), 15, 50 ou 150 pmole/kg nos Dias -6 e -2. O ASO foi administrado como dissolvido em PBS.
[00321] [Atividade Analgésica] A Figura 19B resume as pontuações observadas de dor por grupo em vários pontos de tempo. As respostas de dor na Fase II (AUC entre 10 e 40 min) diminuíram significativamente (teste t de student) em 17% e 41% nos grupos de tratamento de 15 e 50 pmole/kg, respectivamente. Por outro lado, as respostas de dor na Fase I (AUC entre 0 e 10 min) diminuíram significativamente em 38% e 50% nos grupos de tratamento de 15 e 50 pmole/kg, respecti
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68/81 vamente.
[00322] Curiosamente, o grupo de 150 pmole/kg falhou em mostrar atividade terapêutica tanto na Fase I quanto na Fase II. O ASO 10 a 150 pmole/kg seria uma overdose induzindo uma suprarregulação da transcrição pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon com o ASO 10. [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
Exemplo 13· Inibição da expressão de Nav1.7 no DRG de L5 pelo ASO 7 em Ratos Infligidos com uma Injeção de Formalina Intraplantar.
[00323] O ASO 7 foi avaliado por IHC (imuno-histoquímica) quanto à sua capacidade de inibir a expressão de Nav1.7 no DRG de L5 de ratos SD machos infligidos com uma injeção intraplantar de formalina, como se segue.
[00324] [Tratamento com ASO e Injeção de Formalina] No Dia -5, os ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram aleatoriamente especificados para 4 grupos do controle negativo (sem tratamento com ASO) e três grupos de tratamento com o ASO 7 de 1, 6 e 30 pmole/kg. Cada grupo de animais recebeu subcutaneamente o ASO 7 a 0 (controle negativo), 1,6 ou 30 pmole/kg nos Dias -5 e -1.0 ASO 7 foi diluído em PBS e usado para a injeção. No Dia 0, todos os animais receberam uma única injeção intraplantar de 50 pL de formalina a 5%.
[00325] [Extração do DRG de L5 e IHC do Nav1.7] No Dia 8, os ratos foram anestesiados com zoletil/rompun e submetidos a amostragem do DRG de L5 do lado injetado com formalina. (N = 2 por grupo) As amostras do DRG foram submetidas à IHC do Nav1.7, como descrito resumidamente abaixo.
[00326] As amostras do DRG foram criosseccionadas e submetidas à imunocoloração em série com um anticorpo anti-Nav1.7 primário (No.
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69/81 do Cat. ASC-008, Alomone) na diluição de 1: 500, com urn anti-IgG secundário (No. do Cat BA -1100, Vector) em uma diluição de 1: 200, e depois com Dylight 594-steptavidin (No. do Cat. SA-5594, Vector, CA, EUA) em uma diluição de 1: 200 para marcação com fluorescência vermelha. As imagens da IHC foram capturadas em um scanner de slides Zeiss para a expressão do Nav1.7 no DRG.
[00327] [Inibição da Expressão do Nav1.7 no DRG de L5] A Figura 20A proporciona um conjunto representativo de imagens da IHC do Nav1.7 por grupo. A expressão do Nav1.7 no DRG foi notavelmente alta no grupo de controle negativo em comparação com a expressão nos grupos de tratamento com ASO.
[00328] O nível de cor vermelha em cada imagem da IHC individual foi pontuado digitalmente usando o programa NIH ImageJ, e os níveis individuais foram submetidos à análise estatística por grupo. (N = 2 por grupo) A Figura 20B resume o nível de expressão do Nav1.7 digitalmente quantificado por grupo. O nível de expressão do Nav1.7 diminuiu significativamente (teste t de student) em cerca de 50 ~ 60% em todos os grupos de tratamento com ASO.
Exemplo 14. Reversão da Alodinia em Ratos com Neuropatia Espinhal pelo ASO 10 (1)· [00329] O ASO 10 foi avaliado quanto à sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com neuropatia espinhal induzida pela ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 6, salvo indicação em contrário.
[00330] [Agrupamento] No Dia -14, os ratos SD machos (5 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à ligação de L5/L6. No Dia 0, 36 animais foram selecionados com base em suas pontuações de von Frey individuais no Dia 0, e especificados para 4 grupos do grupo de controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO), três grupos de tratamento com ASO de 1,3 e 10 pmole/kg. (N =
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70/81 por grupo) [00331] [Tratamento com ASO e Pontuação de Von Frey] Os ratos receberam subcutaneamente, à tarde, o ASO 10 a 0 (controle negativo), 3 e 10 pmole/kg nos Dias 0, 3 e 7. No grupo de tratamento de 1 pmole/kg, a dose era inicialmente 1 pmole/kg no Dia 0, e depois aumentou para 30 pmole/kg nos Dias 3 e 7 devido à falta de atividade terapêutica a 1 pmole/kg nos Dias 2 e 3.
[00332] [Reversão da Alodinia] A Figura 21A resume as pontuações de von Frey observadas. Os animais do grupo de controle negativo mostraram pontuações de von Frey médias (limiar de retirada) estabilizadas entre cerca de 6 e 7 g durante o período de 9 dias após o agrupamento.
[00333] A alodinia foi revertida gradual e significativamente durante um período de uma semana por administrações com o ASO 10 a 3 até 30 pmole/kg. A atividade terapêutica atingiu um platô até a pontuação de von Frey de cerca de 13 g para todos os grupos de tratamento.
[00334] No grupo de 1 pmole/kg, no entanto, a atividade terapêutica começou a melhorar após a dose ser elevada de 1 pmole/kg para 30 pmole/kg no Dia 3. A alodinia foi significativamente revertida em cerca de 40%, no Dia 6, após a dose ser aumentada para 30 pmole/kg, se um limiar de base histórica de cerca de 18 g fosse considerado como a pontuação de von Frey sem a ligação de L5/L6. A eficácia analgésica aumentou para cerca de 60% no Dia 8.
[00335] No grupo de 3 pmole/kg, a alodinia foi significativamente revertida (teste t de student) no Dia 6 com uma modesta eficácia (cerca de 40 - 50%). A eficácia terapêutica aumentou para 6 +% no Dia 8.
[00336] No grupo de 10 pmole/kg, a alodinia foi significativamente revertida no Dia 4 com uma eficácia de cerca de 25 ~ 30%. A eficácia terapêutica aumentou para cerca de 60% no Dia 9. No entanto, a eficácia permaneceu estagnada desde o Dia 6.
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Exemplo 15· Reversão da Alodinia em Ratos com Neuropatia Espinhal pelo ASO 10 (2)· [00337] O ASO 10 foi avaliado quanto à sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com neuropatia espinhal induzida por ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 6, salvo indicação em contrário.
[00338] [Agrupamento] No Dia -10, os ratos SD machos (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à ligação de L5/L6. No Dia 0, 36 animais foram selecionados com base nas suas pontuações de von Frey individuais no Dia 0, e aleatoriamente especificados para 4 grupos do grupo de controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO), dois grupos de tratamento com ASO de 100 pmole/kg uma vez por cada 4 ou 5 dias e o grupo de controle positivo de pregabalina, 30 mg/kg. (N = 9 por grupo) [00339] [Tratamento com ASO e Pontuação de Von Frey] Os ratos receberam subcutaneamente, à tarde, o ASO 10 a 0 (controle negativo), 100 pmole/kg nos Dias 0 e 4, 100 pmole/kg nos Dias 0 e 5. A alodinia foi pontuada na manhã em uma base diária. Os ratos do grupo de controle positivo foram administrados oralmente com pregabalina, 30 mg/kg, uma hora antes da pontuação de von Frey. O ASO foi administrado como dissolvido em PBS.
[00340] [Reversão da Alodinia] A Figura 21B resume as pontuações de von Frey observadas. Os animais no grupo de controle negativo mostraram pontuações de von Frey médias (limiar de retirada) estabilizadas entre cerca de 6 e 7 g durante o período dos 7 dias após o primeiro tratamento com ASO. Os ratos no grupo de pregagarbina, 30 mg/kg, mostraram pontuações de von Frey médias de cerca de 10 ~ 11 g, embora a pontuação observada no Dia 7 fosse cerca de 13 g devida à sedação.
[00341] No grupo de tratamento com ASO de uma vez por cada 4
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72/81 dias, a alodinia foi significativamente revertida (teste t de student) em todas as ocasiões testadas nos Dias 3, 6 e 7, e significativamente superior à pregabalina, 30 mg/kg, nos Dias 3 e 6 Assim, a frequência de dosagem de uma vez por cada 4 dias nos ratos parece ser apropriada para manter a atividade terapêutica superior à pregabalina, 30 mpk. Observa-se que a alodinia foi revertida no Dia 8 para cerca de 90% do nível basal, sem neuropatia espinhal contra a base histórica interna. [00342] No grupo de tratamento com ASO de uma vez por cada 5 dias, a alodinia foi significativamente revertida (teste t de student) em todas as ocasiões testadas nos Dias 3, 6 e 7, e significativamente superior à pregabalina, 30 mg/kg, apenas no Dia 3. Assim, a frequência de dosagem de uma vez por cada 5 dias parece ser demasiada longa para assegurar uma atividade terapêutica significativamente superior à pregabalina, 30 mg/kg.
[00343] [Expressão do Nav1.7 na Medula Espinhal] No Dia 7, os animais foram anestesiados com zoletil/rompun, perfundidos com PBS suplementado com formalina, a fim de preservar a integridade estrutural da medula espinhal, e submetidos à amostragem da medula espinhal. (N = 3 por grupo) As amostras de medula espinhal foram processadas no bloco de parafina, e foram submetidas à IHC em série para a expressão do Nav1.7 (coloração vermelha) com um anticorpo para Nav1.7 (No. do Cat. ASC-008, Alomone) e para o corpo celular neuronal (coloração verde) com um anticorpo para Neu (No. do Cat. Ab104224, Abeam). O núcleo foi tingido com DAPI (azul).
[00344] A Figura 22 proporciona as imagens da IHC capturadas sobre um scanner de slides Zeiss. O nível de expressão do Nav1.7 diminuiu acentuadamente nas amostras de medula espinhal do grupo de tratamento com ASO com a dosagem nos Dias 0 e 4, em comparação com o nível de expressão nas amostras de medula espinhal do grupo de controle negativo. Assim, o ASO parece ter se distribuído facilmen
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73/81 te para a medula espinhal e inibiu a expressão do Nav1.7 na medula espinhal após administração subcutânea.
Exemplo 16· Inibição da Expressão do Nav1.7 nas Células Neuronais de DRG de Rato pelo ASO 10· [00345] O ASO 10 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão do Nav1.7 nas células neuronais de DRG de L5 do rato, como descrito abaixo.
[00346] [Preparação das Células Neuronais de DRG de L5] Os ratos SD machos (7 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foram submetidos à ligação de L5/L6 firme, como descrito no Exemplo 5. 7 dias depois, 4 ratos foram anestesiados com zoletil/rompun para a extração do DRG de L5 do lado ligado. Os DRGs foram reunidos e processados para preparar as células neuronais de DRG, como descrito no Exemplo 8.
[00347] [Tratamento com ASO] As células neuronais de DRG foram tratadas com o ASO 10 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM, por 24 horas, e então submetidas à lise para o western blot contra um anticorpo para Nav1.7 (No. do Cat.ab85015, Abeam) sondando o C terminal da proteína Nav1.7. A β-actina foi sondada para referência. As soluções de estoque de ASO 10 foram dissolvidas em DDW e divididas em alíquotas para o meio de cultura.
[00348] [Inibição da Expressão do Nav1.7] A Figura 23A proporciona os dados de western blot obtidos com as células neuronais de DRG tratadas com o ASO 10 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. Todos os lisados produziram uma banda forte a 170 ~ 200K, que seriam metabolites da proteína Nav1.7. A banda da proteína Nav1.7 de tamanho natural foi detectada a 220 ~ 240K apenas com os lisados do controle negativo e 10 zM de ASO 10. Assim, a expressão do Nav1.7 foi totalmente inibida nas células neuronais de DRG de rato após uma incubação de 24 horas com o ASO 10 a 100 até 1.000 zM.
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74/81 [00349] O ASO 10 é um ASO de 14 meros totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A de rato, enquanto o ASO 7 é um ASO de 14 meros totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano. Os perfis inibidores de SCN9A obtidos com o ASO 10 nas células neuronais de ratos podem ser previsivelmente extrapolados para os perfis inibidores de SCN9A de ASO 7 nas células neuronais humanas.
Exemplo 17· gPCR para o mRNA de SCN9A em Células Neuronais de DRG de Ratos Tratadas com o ASO 10 com o cDNA sintetizado por PCR em Uma Etapa.
[00350] O ASO 10 foi avaliado por qPCR aninhada de SCN9A quanto à sua capacidade de induzir alterações no nível de mRNA de SCN9A de rato nas células de DRG de ratos, como descrito abaixo.
[00351] [Preparação das Células Neuronais de DRG de L5] Um rato SD macho (6 semanas de idade, Harlan Laboratories, Itália) foi anestesiado com zoletil/rompun para extrair os DRGs de L5. As amostras de DRG de L5 foram processadas como descrito no Exemplo 8, de modo a preparar as células neuronais de DRG de L5.
[00352] [Tratamento com ASO] As células neuronais de DRG de L5 de rato foram tratadas com o ASO 10 a 0 (controle negativo), 10, 30, 100 ou 300 zM. (1 placa de cultura por cada concentração de ASO) As soluções de estoque de ASO 10 foram dissolvidas em DDW e divididas em alíquotas para o meio de cultura.
[00353] [Extração de RNA e Síntese de cDNA por PCR em Uma Etapa] Após uma incubação com o ASO 10 por 24 horas, o RNA total foi extraído das células usando o Universal RNA Extraction Kit (Número do Cat. 9767, Takara), de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de molde de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit One Step RT-PCR (Invitrogen, EUA) contra um conjunto de primers específicos para éxons de
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75/81 [exon 2_forward: (5' -+ 3') CAATCTTCCG-TTTCAACGCC, e exon 10_reverse: (5' —> 3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT], de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50QC por 30 min e 94QC por 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 s a 94QC, 30 s a 55QC, e 2 min a 72QC.
[00354] [Amplificação por qPCR Aninhada] As soluções de cDNA (duplicadas por concentração de ASO) foram diluídas em 100 vezes e 1 μΙ_ de cada solução de cDNA diluída foi submetido a uma reação PCR em Tempo Real de 20 μΙ_ com uma sonda TaqMan (No. do Cat. RnO1514993_mH, ThermoFisher) visando a junção do éxon 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A, de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95QC por 30 s, seguido por 40 ciclos de 5 s a 95QC e 30 s a 60QC. [00355] A figura do lado esquerdo na Figura 23B resume os dados de qPCR observados, nos quais o nível de mRNA de SCN9A de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de student) nas células tratadas com o ASO 10 em cerca de 50 ~ 60%.
Exemplo 18· qPCR para o mRNA de SCN9A em Células Neuronais de DRG de Ratos Tratadas com o ASO 10 com a Síntese de cDNA com Hexâmeros Aleatórios.
[00356] O ASO 10 foi avaliado por qPCR de SCN9A quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A em células neuronais de DRG de L5 de rato. O RNA total foi preparado como descrito no Exemplo 17, e submetido à síntese de cDNA utilizando hexâmeros aleatórios. As soluções de cDNA (duplicadas por concentração de ASO) foram diluídas em 100 vezes e 1 pL de cada produto da PCR diluído foi submetido a uma reação PCR em Tempo Real de 20 μΙ_ com a sonda TaqMan, visando a junção do éxon 3 e éxon 4 de SCN9A, de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95QC por 30 s, seguido por 40 ciclos de 5 s a 95QC e 30 s a 60QC.
[00357] As soluções de cDNA foram também submetidas à amplifi
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76/81 cação por qPCR para o mRNA de GAPDH. Os valores de Ct do mRNA de SCN9A foram normalizados contra os valores de Ct do mRNA de GAPDH.
[00358] A figura do lado direito na Figura 23B proporciona os dados de qPCR de SCN9A normalizados contra GAPDH. O nível de expressão de mRNA de SCN9A de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de student) nas células tratadas com o ASO 10 em cerca de 45 ~ 75%.
Exemplo 19· Inibição da Corrente de Sódio em Células Neuronais de DRG de L5 pelo ASO 10 (1)· [00359] O ASO 10 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de sódio em células neuronais de DRG de L5 de ratos, como se segue.
[00360] [Preparação das Células Neuronais de DRG] Os ratos SD machos (5 semanas de idade, Daehan Biolink, Coréia do Sul, www.dbl.co.kr) foram submetidos à ligação de L5/L6 firme, como descrito no Exemplo 5. 10 a 14 dias após a ligação, os ratos foram anestesiados com zoletil/rompun para a extração de DRG de L5 do lado ligado. As células neuronais de DRG de L5 foram preparadas como descrito abaixo.
[00361] (1) O DRG de L5 extraído de forma aguda do rato foi transferido para um tubo e de 1,5 mL contendo 0,2 mL de colagenase a 0,125% (Colagenase Tipo IV, No. do Cat. C5138-100MG, Sigma) em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank, Número do Cat. 14025092, Life Technologies), cortada em pedaços tão pequenos quanto possível com uma tesoura, e depois incubado durante 20 min em uma incubadora de CO2 a 37QC, sob 5% de CO2 e 95% de UR; (2) então 50 pL de 0,25% de tripsina/EDTA foram adicionados ao tubo e, que foi mantido na incubadora por mais 10 min; (3) 0 tubo e foi carregado com 1 mL de meio DMEM completo, e submetido à sedimentação centrífu
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77/81 ga a 600g por 5 min; © então a pelota resultante foi suspensa e transportada como vedada em um tubo falcon de 15 mL contendo cerca de 15 mL de meio Neurobasal-A; © após um transporte de cerca de uma hora, 0,5 mL da suspensão de células foi cuidadosamente semeado sobre um vidro de cobertura revestido com laminina, colocado em uma placa de cultura de placa de 24 poços; © a placa de cultura foi incubada em uma incubadora de CO2 a 37QC durante 2 horas para ligar as células ao vidro de cobertura.
[00362] [Tratamento com ASO] As células neuronais de DRG de L5 preparadas como acima foram tratadas com 0 ASO 10 a 0 (controle negativo), 10, 30 ou 100 zM e mantidas na incubadora durante 4 horas. As soluções de estoque de ASO foram preparadas em DDW suplementado com 0,1% (v/v) de Tween80. Cada solução de estoque (incluindo veículo apenas para 0 controle negativo) foi dividida em alíquotas para 0 meio de cultura, de modo a conter 0,0001% (v/v) de Tween80 para od ensaios de fixação de membranas.
[00363] [Ensaio de Fixação de Membranas Manual] Em seguida, as células neuronais de DRG foram submetidas aos ensaios de fixação de membranas manuais da corrente de sódio em um aparelho de fixação de membranas de sódio (Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments). Os ensaios de fixação de membranas normalmente levam 4 horas. Assim, considera-se que as células foram tratadas com 0 ASO durante 4 a 8 horas (isto é, cerca de 6 horas em média).
[00364] [Reunião de Dados e Análise] A experiência acima foi repetida durante várias ocasiões independentes, de modo a aumentar a potência estatística por dose de ASO. Apenas os dados de corrente de sódio das células sensíveis ao TTX foram incluídos na reunião para análise estatística.
[00365] A Figura 23C resume os dados reunidos de corrente de sódio normalizados contra 0 tamanho celular das células neuronais de
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DRG. A corrente de sódio diminuiu gradualmente à medida que a concentração de ASO era aumentada de 10 zM para 100 zM. A corrente de sódio diminuiu significativamente em cerca de 40% nas células tratadas com 100 zM de ASO 10 durante cerca de 6 horas, em média. Dado que as células neuronais de DRG expressam não apenas o Nav1.7, como também outros subtipos de canais de sódio regulados pela voltagem, a diminuição observada de cerca de 40% na corrente de sódio a 100 zM de ASO 10 deve ser considerada como marcante para a redução da expressão do Nav1.7 pelo ASO 10.
Exemplo 20. Inibição da Corrente de Sódio nas Células Neuronais de DRG de L5 pelo ASO 10 (2)· [00366] As avaliações internas de ratos a partir de vários fornecedores indicam que o nível de expressão do Nav1.7 no DRG de L5 variaria muito com a idade e o fornecedor. O ASO 10 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de sódio nas células neuronais de DRG de L5 de rato de uma fonte diferente, como descrito no Exemplo 19, a menos que indicado de outra forma.
[00367] [Preparação das Células Neuronais de DRG] Os ratos SD machos (5 semanas de idade, Harlan Laboratories/Envigo, Dinamarca) foram submetidos à ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 5. 10 a 14 dias após a ligação, os ratos foram anestesiados com zoletil/rompun para a extração do DRG de L5 do lado ligado. As células neuronais de DRG de L5 foram preparadas como descrito abaixo.
[00368] [Tratamento com ASO] As células neuronais de DRG de L5 preparadas como acima foram tratadas com o ASO 10 a 0 (controle negativo) ou 100 zM e mantidas na incubadora durante 4 horas. As soluções de estoque de ASO foram preparadas em DDW.
[00369] A corrente de sódio normalizada contra o tamanho da célula diminuiu significativamente (p < 0,05) em cerca de 55% nas células tratadas com 100 zM de ASO 10 durante cerca de 6 horas, em mé
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79/81 dia. (N = 14 para o controle negativo; e N = 15 para 100 zM de ASO 10) A corrente de sódio normalizada para o controle negativo foi mais elevada em 37% neste exemplo do que no Exemplo 19. Assim, a contribuição do Nav1.7 para a corrente de sódio nas células neuronais de DRG deve ser consideravelmente maior nos ratos do Harlan Laboratories deste exemplo do que nos ratos da Daehan Biolink do Exemplo 19.
Exemplo 21· Reversão da Alodinia pelo ASO 7 em Ratos com Neuropatia Espinhal· (2) [00370] O ASO 7 foi avaliado quanto à sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com neuropatia espinhal induzida por ligação de L5/L6, como descrito no Exemplo 6, a menos que indicado de outro modo.
[00371] [Cirurgia de SNL e Agrupamento] No Dia -10, os ratos SD machos (5 semanas de idade, Daehan Biolink, Coréia do Sul, www.dbl.co.kr) foram submetidos à ligação de L5/L6. No Dia 0, 48 animais foram selecionados com base nas menores pontuações de von Frey individuais no Dia 0, e especificados aleatoriamente eparam 6 grupos do grupo de controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO), pregabalina, 30 mg/kg, e os quatro grupos de tratamento de 5, 25, 125 e 625 fmole/kg de ASO 7. (8 animais por grupo) [00372] [Tratamento com ASO e Pontuação de Von Frey] Os ratos receberam subcutaneamente o ASO 7 a 0 (controle negativo), 1,3 ou 6 pmole/kg, à tarde, nos Dias 0, 3, 6 e 9. A alodinia foi pontuada pelo método de pontuação de Frey eletrônica descrito no Exemplo 5, de manhã. A pregabalina foi administrada oralmente uma hora antes de cada ocasião de pontuação de von Fret. O ASO foi administrado como dissolvido em PBS suplementada com 0,1% de Tween80.
[00373] [Reversão da Alodinia] A Figura 24A resume os resultados observados das pontuações de von Frey. Os animais no grupo de con
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80/81 trole negativo mostraram pontuações de von Frey médias (limiar de retirada) estabilizadas em cerca de 6 g durante os Dias 4 a 8. Por outro lado, o grupo de pregagargina, 30 mg/kg (grupo de controle positivo), mostrou pontuações de von Frey médias estabilizadas em cerca de 10 g. Dado que as pontuações de von Frey médias de cerca de 21 g foram observadas com os animais simples (i.e., sem ligação e tratamento), a alodinia foi significativamente revertida nos Dias 2, 4 e 6 em 20 a 30% no grupo de tratamento com pregabalina.
[00374] O ASO 7 reverteu significativamente (teste t de student) a alodinia nos Dias 2 a 8 a 5 fmole/kg, nos Dias 2, 4 e 6 a 25 e 125 fmole/kg, e nos Dias 4 e 6 a 625 fmole/kg. O grupo mais ativo foi o grupo de 5 fmole/kg, embora não houvesse diferenças significativas entre os grupos de tratamento com ASO. A pregabalina também reverteu significativamente a alodinia em 20 a 30% durante os Dias 2 a 8. O grupo mais ativo foi o grupo de 5 fmole/kg mostrando uma reversão de cerca de 40% da alodinia, embora não houvesse diferenças significativas entre os grupos de tratamento com ASO. No entanto, as eficácias dos grupos de tratamento não foram significativamente diferentes da eficácia do grupo de pregabalina.
Exemplo 22· Atividade Analgésica do ASO 2 contra a Dor Inflamatória SubCrônica em Ratos.
[00375] O ASO 2 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a dor inflamatória subcrônica em ratos infligidos com uma injeção intraplantar de adjuvante completo de Freund (FCA), como descrito abaixo. [00376] [Indução da Inflamação Subcrônica] No Dia -17, os ratos SD machos (7 semanas de idade) receberam uma injeção intraplantar de 100 μΙ_ de FCA (No. do Cat. F5881-6X10ML, Sigma) na pata traseira esquerda.
[00377] [Pontuação da Dor Inflamatória e Agrupamento] A dor inflamatória na pata traseira esquerda foi pontuada pelo teste de Ran
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81/81 dall-Selitto usando um aparelho eletrônico Randall-Selitto [Modelo 2390, IITC Life sciences]. Os ratos foram aclimatados sobre uma rede por 10 min, antes da pontuação da dor. (N = 5 por grupo) [00378] No Dia 0, 10 animais que mostraram estavelmente as menores pontuações de limiar de dor durante vários dias foram selecionados para o agrupamento. Os 10 animais foram especificados para dois grupos do grupo de controle negativo (sem tratamento com ASO) e o grupo de tratamento (ASO 2, 100 pmole/kg).
[00379] [Tratamento com ASO e Avaliação da Dor] Os animais do grupo de tratamento receberam o ASO 2 a 100 pmole/kg na tarde do Dia 0 e na manhã do Dia 1. O ASO foi dissolvido em PBS e administrado subcutaneamente. A dor foi avaliada 2 horas após a dose no Dia 1 e de manhã no Dia 4.
[00380] [Atividade Analgésica] A Figura 24B resume as pontuações de dor observadas. O limiar de dor do grupo de tratamento com ASO no Dia 1 aumentou para cerca de 27 g em comparação com o valor no Dia 0, enquanto o limiar do grupo de controle negativo diminuiu para cerca de 3 g. O limiar de dor antes da indução do edema da pata era cerca de 23 g. Assim, a administração de ASO reverteu completamente a dor inflamatória para o nível sem edema da pata. No entanto, a atividade analgésica do ASO 2 desapareceu completamente no Dia
4.
Claims (24)
1. Derivado de ácido nucleico peptídico representado pela
Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
B-i B2 Bn_.| Bn
V o v° v°
------Formulai
Sn Tn ®η-1 caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com uma sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano;
o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-1 e Tn representam, independentemente, 0 radical deuterido [D], hidrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;
X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, formila [H-C(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila [NH2-C(=S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída
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2/15 ou não substituída ou o radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa o radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída;
Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais; e, pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à parte de nucleobase.
2. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-ι e Tn representam, independentemente, o radical deuterido, hidrido, alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída;
X e Y representam, independentemente, o radical hidrido, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída
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3/15 ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou o radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa o radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída;
Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais; e, pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV:
i
Fórmula II Fórmula III Fórmula IV em que,
Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída;
L1, l_2 e l_3 são um ligante covalente representado pela Fórmula V que liga covalentemente 0 grupo amino básico à parte da
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4/15 nucleobase:
Fórmula V em que,
Qi e Qm são o radical metileno (-CH2-) substituído ou não substituído, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-) e amino substituído ou não substituído [-N(H)- ou N(substituinte)-]; e, m é um número inteiro entre 1 e 15.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-i e Tn representam, independentemente, 0 radical deuterido ou hidrido e Z representa 0 radical hidrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído ou amino substituído ou não substituído.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-i e Tn representa, independentemente, 0 radical alquila substituída ou não substituída, ou arila substituída ou não substituída, e/ou Z representa 0 radical alquila substituída ou não substituída ou arila substituída ou não substituída.
5. Derivado de ácido nucléico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 21;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
0 composto de Fórmula I é totalmente complementar ao
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5/15 pré-mRNA de SCN9A humano ou parcialmente complementar ao prémRNA de SCN9A humano com um ou dois mal emparelhamentos;
Si, S2, Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-ι e Tn são 0 radical hidrido;
X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-ι e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro de B1, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são 0 radical metileno substituído ou não substituído, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno, oxigênio e amino substituído ou não substituído; e, m é um número inteiro entre 1 e 11.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substitu
Petição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 95/168
6/15 ida ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ou ariloxicarbonila substituída ou não substituída.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X e Y representa independentemente o radical alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída.
8. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι e Tn são 0 radical hidrido;
X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, ou arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-ι e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais represen
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7/15 tadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir de radical hidrido e alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno, oxigênio e amino; e, m é um número inteiro entre 1 e 9.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X e Y representa independentemente 0 radical alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída ou arilsulfonila substituída ou não substituída.
11. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ -+ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano;
0 composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Ti, T2, ..., Tn-ι e Tn são 0 radical hidrido;
X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido,
Petição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 97/168
8/15 alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa o radical amino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases naturais, que incluem a adenina, a timina, a guanina, a citosina e a uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
R1, R3 e R5 são 0 radical hidrido e R2, R4 e Re representam, independentemente, 0 radical hidrido, ou alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno, oxigênio; e, m é um número inteiro entre 1 e 8.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X e Y representa, independentemente, 0 radical alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, ou arilacila substituída ou não substituída.
14. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
Petição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 98/168
9/15 o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano;
o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
Si, S2, Sn-i, Sn, Τι, T2, ..., Tn-ι e Tn são 0 radical hidrido;
X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa 0 radical amino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-ι e Bn são independentemente selecionados a partir de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, Rs e Re são 0 radical hidrido;
Q1 e Qm são 0 radical metileno, e Qm está diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, ... e Qm-ι são independentemente selecionados a partir de radical metileno e oxigênio; e, m é um número inteiro entre 1 e 8.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que X e Y representam, independentemente, 0 radical hidrido, alquilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X e Y representa independentemente arilacila substituída ou não substituída.
17. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a
Petição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 99/168
10/15 reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10 meros com a sequência de pré-mRNA de 14 meros de [(5’ -+ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano;
o composto de Fórmula I é totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano;
Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-ι e Tn são o radical hidrido;
X é o radical hidrido;
Y representa o radical alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa o radical amino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-ι e Bn são independentemente selecionados a partir de adenina, timina, guanina, citosina e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco de Bi, B2, ..., Bn-i e Bn são independentemente selecionados a partir de nucleobases não naturais representadas pela Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV;
Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são 0 radical hidrido;
L1 representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, ou -CH2-O-(CH2)5-, com a extremidade direita diretamente ligada ao grupo amino básico; e, l_2 e l_3 são independentemente selecionados a partir de (CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, e -(CH2)2-O-(CH2)3-, com a extremidade direita é diretamente ligada ao grupo amino básico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que Y representa 0 radical alquilacila substituída ou
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11/15 não substituída ou alquiloxicarbonila substituída ou não substituída.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que Y representa arilacila substituída ou não substituída.
20. Derivado de ácido nucleico peptídico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo de derivados de ácido nucleico peptídico proporcionados abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
(N C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)NH2;
(N C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-ANH2;
(N C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2; (N C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)-NH2;
(N C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)NH2;
(N C) Benzoil-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-LysNH2;
(N C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N C) Benzenossulfonil-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-ANH2;
(N C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N C) Metil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
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12/15 (N -+ C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2; (N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N -+ C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)AA(5)C-Lys-NH2;
(N -+ C) [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) N,N-Fenil-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)CNH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) p-Toluenossulfonil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)C-NH2;
(N -+ C) p-Toluenossulfonil-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)AA(5)C-Lys-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Propil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Benzoil-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-LysNH2;
(N -+ C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Metilsulfonil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexanoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) n-Hexanoil-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
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13/15 (N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N -+ C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)AA(5)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CAC(1O5)AA-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AANH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTANH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-CNH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N -+ C) p-Toluenossulfonil-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CAC-Lys-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Benzoil-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Propionil-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N -+ C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-ValNH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2; e,
Petição 870190067370, de 17/07/2019, pág. 103/168
14/15 (N -+ C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2:
em que,
A, G, T e C são monômeros de PNA com uma nucleobase natural de adenina, guanina, timina e citosina, respectivamente;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) e G(pOq) são monômeros de
PNA com uma nucleobase não natural representada pelas Fórmula
VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula
IX e Fórmula X, respectivamente;
I
Fórmula VI
Fórmula VII
Fórmula VIII o
Fórmula IX
Fórmula X em que, p e q são números inteiros; e, as abreviaturas para os substituintes dos terminais de N e C são especificamente definidas como se segue: Fmoc- é a abreviatura para [(9-fluorenil)metilóxi]carbonil-; Fethoc- para [2-(9fluorenil)etil-1 -óxi]carbonila; Ac- para acetil-; n-Hexanoil- para 1(n-hexanoil)-; Benzoil- para benzenocabonil-; Piv- para pivalil-; n-Propil- para l-(n-propil)-; n-Hexil- para l-(n-hexil)-; H- para hidrido-; p-Toluenossulfonila para (4-metilbenzeno)-1-sulfonil-; Benzenossulfonila para benzeno-1-sulfonil-; Metilsulfonila para metil-1-sulfonil-; -Lys- para o resíduo de aminoácido lisina; -Vai- para o resíduo de aminoácido valina; -Leu- para o resíduo de ami
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15/15 noácido leucina; -Arg- para o resíduo de aminoácido arginina; Gly- para o resíduo de aminoácido glicina; [N-(2Feniletil)amino[carbonil- para [N-1-(2-feniletil)-amino[carbonil-; Benzil- para 1-(fenil)metil-; Fenil- para fenil-; Me- para metil-; HEX- para 6-amino-1-hexanoil-, FAM- para 5, ou 6-fluoresceínacarbonil- (mistura isomérica) e -NH2 para grupo -amino” não substituído.
21. Método para tratar uma condição envolvendo a atividade de Nav1.7 ou a dor, caracterizado por administração do derivado de ácido nucleico peptídico como definido na reivindicação 1.
22. Método para tratar dor crônica, caracterizado por administração do derivado de ácido nucleico peptídico como definido na reivindicação 1.
23. Método para tratar a dor neuropática, caracterizado por administração do derivado de ácido nucleico peptídico como definido na reivindicação 1.
24. Método para tratar a dor envolvendo atividade de Nav1.7, caracterizado por administração do derivado de ácido nucleico peptídico como definido na reivindicação 1.
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