BR112020023844A2 - Anticorpos, métodos de tratamento do câncer e de produção de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, células hospedeiras e composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpos, métodos de tratamento do câncer e de produção de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, células hospedeiras e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

“anticorpos, métodos de tratamento do câncer e de produção de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, células hospedeiras e composição farmacêutica”. a presente divulgação é, de modo geral, direcionada a composições que incluem anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, etc., que ligam-se especificamente a um polipeptídeo sirpa, por exemplo, sirpa de mamíferos ou sirpa humana, e ao uso dessas composições na prevenção, redução do risco, ou tratamento de um indivíduo com tal necessidade.

Description

“ANTICORPOS, MÉTODOS DE TRATAMENTO DO CÂNCER E DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos EUA nº US 62/676.813, depositado em 25 de maio de 2018, que é incorporado ao presente por referência para qualquer finalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é, por este meio, integralmente incorporada pela referência. A referida cópia ASCII, criada em 14 de maio de 2019, é denominada 40004-PCT_SL.txt e possui 99.798 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação refere-se a anticorpos anti-SIRPA e usos terapêuticos de tais anticorpos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] As células fagocíticas, como macrófagos (MΦ) e células dendríticas (DCs), distinguem células saudáveis de células anormais por uma intrincada matriz de receptores de superfície celular que modulam o estado de ativação celular, proliferação e/ou funções efetoras. Muitos destes receptores reconhecem diversos ligantes que ou marcam células indesejadas para remoção (os chamados sinais “comam-me”) ou protegem células normais da destruição (os chamados sinais “não me comam”). Nos últimos anos, o eixo SIRPα-CD47 emergiu como um determinante crítico na remoção programada de células por macrófagos em vários ambientes clínicos que vão desde a sobrevida de células cancerosas até o enxerto de transplante de células hematopoiéticas bem-sucedido. Os agentes terapêuticos que impactam esta via podem atender a uma necessidade médica relevante para melhorar a doença com particular relevância em muitos tipos de cânceres humanos.
[0005] A SIRPα (proteína reguladora de sinal α) pertence à família de receptores transmembrana SIRP, que são expressos principalmente dentro da linhagem de células mieloides (incluindo MΦ, DCs, granulócitos, etc.) e caracterizados por uma região extracelular contendo 2 domínios IgC proximais à membrana e um domínio IgV distal. Única nesta família, a SIRPα contém um motivo de imunorreceptor inibitório baseado em tirosina citoplasmático (ITIMs), intracelular. Após a reticulação do receptor, os sítios ITIM fosforilados com tirosina recrutam e ativam as fosfatases SHP para regular negativamente as funções celulares, como a fagocitose ou liberação de citocinas inflamatórias. O CD47 serve como o ligante principal para SIRPα, e sua ampla expressão na maioria dos tipos de células, incluindo células endoteliais/epiteliais, leucócitos e eritrócitos, sugere que ele medeia um sinal de “não me coma” para proteger as células saudáveis da depuração dependente de fagócito. Em apoio a este ponto de vista, vários estudos mostram que a transferência adotiva de glóbulos vermelhos ou leucócitos de camundongos com nocaute para CD47 em receptores tipo selvagem resulta na eliminação rápida de células deficientes em CD47. Por outro lado, a análise genética posicional de múltiplas cepas de camundongos imunocomprometidos que receberam células hematopoiéticas humanas identificou o alelo Sirpα em camundongos NOD como o fator causal para o enxerto bem-sucedido em modelos de xenotransplante. Estudos subsequentes demonstraram que a variante alélica de SIRPα expressa apenas em camundongos NOD reteve a capacidade de se ligar ao CD47 humano expresso em células-tronco hematopoiéticas e, assim, suprimir a rejeição de enxerto dependente de macrófago.
[0006] A expressão regulada de SIRPα e CD47 estabelece um mecanismo de controle homeostático para modular a atividade das células fagocíticas. Por exemplo, as células apoptóticas regulam negativamente a expressão de CD47 para facilitar o engolfamento por macrófagos residentes, enquanto as células vivas permanecem ilesas. Da mesma forma, estímulos inflamatórios, como LPS, diminuem a expressão de SIRPα em macrófagos e células dendríticas (DCs) para potencializar sua ativação durante a inflamação.
No entanto, a desregulação da expressão de SIRPα e CD47 contribui para doenças associadas ao sistema imunológico, conforme observado no câncer.
Diversos tumores aumentam significativamente a expressão de CD47 em relação às células não cancerosas, a fim de escapar dos mecanismos de vigilância imunológica que normalmente eliminam as células malignas. Estudos pré-clínicos revelam que o silenciamento gênico (knockdown) de CD47 em modelos de tumor singênico, como o melanoma B16F10, é suficiente para inibir o crescimento do tumor em camundongos imunocompetentes. Resultados semelhantes foram observados com linhagens de células de câncer humano com CD47 transplantadas em camundongos imunocomprometidos.
Alternativamente, os agentes biológicos que interrompem a interação SIRPα- CD47, como os anticorpos anti-CD47, também aumentam a eliminação do tumor em modelos de camundongo. Quando combinados com anticorpos antígenos antitumorais comerciais, como trastuzumabe ou rituximabe, os anticorpos anti-CD47 facilitam um aumento sinérgico na resposta antitumoral em comparação com a monoterapia padrão. Ainda, dada a expressão onipresente de CD47, os anticorpos anti-CD47 correm o risco de graves cargas de toxicidade devido aos efeitos fora do alvo que limitam sua eficácia terapêutica. No entanto, esses estudos estabelecem um papel crucial para a via SIRPα-CD47 na regulação das células mieloides com potenciais aplicações na imunoterapia do câncer.
[0007] Os anticorpos anti-SIRPA foram anteriormente descritos, por exemplo, nas Publicações do Pedido Internacional de Patente:
WO2018/057669, WO 2018/026600, WO 2017/178653, WO2017/068164, WO2016/063233, WO2016/205042, WO2015/138600, WO2013/0956352, WO2009/091547, WO2009/131453 e WO2009/046541.
[0008] Consequentemente, existe uma necessidade por anticorpos anti-SIRPA terapêuticos para tratar doenças, distúrbios e condições associadas à atividade indesejada de SIRPA.
[0009] Todas as referências citadas na presente divulgação, incluindo patentes e publicações, são integralmente incorporadas ao presente pela referência.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0010] A presente divulgação é, de modo geral, direcionada a composições que incluem anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, quiméricos, humanizados, fragmentos de anticorpos, etc., que se ligam especificamente à SIRPA humana e aos métodos de uso de tais composições.
[0011] Certos aspectos da presente divulgação são baseados, pelo menos em parte, na identificação de anticorpos anti-SIRPA com características funcionais melhoradas e/ou aumentadas (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA com uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, incluindo, por exemplo, capacidades aprimoradas e/ou melhoradas de diminuir os níveis de SIRPA na superfície celular de células, e/ou ter cinética de ligação aprimorada e/ou melhorada, e/ou ter K D aprimorada e/ou melhorada, e/ou ter valores de EC50 aprimorados e/ou melhorados. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação têm um valor KD para a SIRPA humana que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes menor do que um anticorpo anti-SIRPA com uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação tem um valor KD para SIRPA humana inferior a 6 nM, inferior a 5 nM, inferior a 4 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,9 nM, inferior a 0,8 nM, inferior a 0,7 nM, inferior a 0,6 nm ou inferior a 0,5 nM.
[0012] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação reduzem os níveis de expressão de SIRPA na superfície celular de maneira in vitro com uma EC50 que é pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% inferior a um anticorpo anti-SIRPA que possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. De um modo vantajoso, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação diminui os níveis celulares de SIRPA in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC50) que varia de cerca de 0,4 nM a cerca de 0,5 nM. Vantajosamente, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação tem uma constante de dissociação (K D) para SIRPA humana que varia de cerca de 0,6 nM a 0,7 nM.
[0013] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana.
Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização apresentados, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização apresentados, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga- se à SIRPB (SIRPbeta) v3 humana. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação não se liga à SIRPB v1 humana. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação não se liga à SIRPA murina.
Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação não se liga à SIRPγ humana. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à cynoSIRPA (SIRPA de macacos cinomolgos). Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação não se liga à cynoSIRPB1. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA de sagui.
[0014] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização da presente invenção, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo liga-se à SIRPA humana, SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana, SIRPA de cinomolgo, SIRPA de sagui, e SIRP β3 humana.
[0015] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização da presente invenção, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à
SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende: uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24.
[0016] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização da presente invenção, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende: uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19.
[0017] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende: uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24; uma HVR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19.
[0018] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35.
[0019] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
[0020] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais/de arcabouço (FR do inglês framework region) selecionadas a partir de VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[0021] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0022] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir da VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir da VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0023] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35.
[0024] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
[0025] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
[0026] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9- 9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (conforme mostrado na Tabela 8).
[0027] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9- 9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (conforme mostrado na Tabela 7).
[0028] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9- 9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (como mostrado na Tabela 8); e em que a região variável de cadeia leve compreende a HVR- L1, HVR- L2 e HVR- L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9 -2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9- 10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9 -20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (como mostrado na Tabela 7).
[0029] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presentepedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, em que o anticorpo compreende a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR -L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9- 18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25 (como mostrado nas Tabelas 7 e 8).
[0030] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VH FR1, VH FR2, VH, Fr3 e VH FR4, em que: a VH FR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; a VH FR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; a VH FR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e a VH FR4 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4, em que a VL FR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; a VL FR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; a VL FR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e a VL FR4 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0031] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0032] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo isolado anti-SIRPA que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0033] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0034] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0035] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0036] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0037] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0038] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0039] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0040] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0041] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um anticorpo anti-SIRPA isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0042] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0043] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
[0044] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é um Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv ou fragmento scFv.
[0045] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é um anticorpo multivalente.
[0046] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é da classe IgG, classe IgM ou classe IgA.
[0047] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo é da classe IgG como um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0048] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo se liga a um receptor Fc inibidor. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o receptor Fc inibidor é o receptor Fc gama IIB inibidor (FcγRIIB).
[0049] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo diminui os níveis celulares de FcγRIIB.
[0050] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é do isotipo IgG1 humana ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: N297A, D265A, D270A, L234A, L235A, G237A, P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V,
L234F, L235E, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou compreende uma deleção de aminoácido na região Fc em uma posição correspondente à glicina 236.
[0051] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste nas: C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos de aminoácidos está de acordo com a numeração EU.
[0052] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA diminui os níveis de SIRPA na superfície celular, diminui os níveis intracelulares de SIRPA, diminui os níveis celular totais de SIRPA, ou qualquer combinação destes.
[0053] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA induz a degradação de SIRPA, induz a clivagem de SIRPA, induz a internalização de SIRPA, induz a liberação de SIRPA, induz a regulação negativa da expressão de SIRPA ou qualquer combinação das mesmas.
[0054] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de superfície celular de SIRPA in vitro.
[0055] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de superfície celular de SIRPA in vivo.
[0056] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA regula negativamente a expressão de SIRPA em monócitos humanos.
[0057] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA regula negativamente a expressão de SIRPA em macrófagos humanos.
[0058] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA regula negativamente a expressão de SIRPA em macrófagos humanos em cerca de 70-95%.
[0059] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo tem uma afinidade (KD) para a SIRPA humana menor do que 6 nM, menor do que 5 nM, menor do que 4 nM, menor do que 3 nM, menor do que 2 nM ou menor do que 1 nM.
[0060] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo tem uma afinidade (KD) para a SIRPA humana de cerca de 0,1 nM a 2 nM.
[0061] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo tem uma afinidade para a SIRPA humana com uma KD que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes ou pelo menos 10 vezes menor do que a afinidade para a SIRPA humana de um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0062] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de SIRPA v1 na superfície celular de maneira in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC50) de cerca de 0,05 nM a 2 nM ou cerca de 0,4 nM, cerca de 0,5 nM, conforme medido por citometria de fluxo.
[0063] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de SIRPA v1 na superfície celular de maneira in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC50) de cerca de 0,05 a 0,20 nM para SIRPA v1 humana, de cerca de 0,05 a 0,10 nM para SIRPA v2 humana e/ou de cerca de 0,05 a 1 nM para SIRPA de cinomolgos conforme medido por citometria de fluxo.
[0064] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo se liga ao domínio D3 da SIRPA v1 humana de SEQ ID NO: 1.
[0065] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo se liga aos resíduos de aminoácidos R282, Q284 e G337 da SIRPA v1 humana de SEQ ID NO: 1.
[0066] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA aumenta a fagocitose de células tumorais em macrófagos, aumenta a fagocitose de células tumorais em macrófagos M1, aumenta fagocitose de células tumorais em macrófagos M2, regula negativamente a expressão de CD14 em macrófagos e/ou qualquer combinação dos mesmos.
[0067] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA aumenta a proliferação de células T.
[0068] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA bloqueia a interação ou ligação de SIRPA com a proteína surfactante tipo D (SP-D).
[0069] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA não bloqueia a interação ou ligação de SIRPA ao CD47.
[0070] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA regula negativamente a expressão da superfície celular de CD32A/B.
[0071] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA regula negativamente a expressão da superfície celular de CD14.
[0072] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA aumenta a proliferação de células T sem bloquear a interação de SIRPγ e CD47.
[0073] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA estimula a produção de ROS em monócitos e/ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos.
[0074] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA inibe o crescimento do tumor in vivo.
[0075] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA reduz o número de células mieloides CD14+ no sangue periférico e/ou aumenta o número de células mieloides CD14+ em um tumor.
[0076] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo liga-se à SIRPA humana, mas não bloqueia substancialmente a ligação de CD47 à SIRPA.
[0077] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reconhece um primeiro e um segundo antígeno, em que o primeiro antígeno é SIRPA e o segundo antígeno é: (a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica; (b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionado a partir de receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR -1 e 2), e receptor da toxina da difteria;
(c) um agente causador de doenças selecionado a partir de peptídeos ou proteínas causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição de GGCCCC (G2C4) antissenso, proteínas causadoras de doenças são selecionadas a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 no cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, Huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amiloide sérica A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG (RAN) associados à repetição, peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição prolina- alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR); e (d) ligantes e/ou proteínas expressas em células imunes, em que os ligantes e/ou proteínas são selecionados a partir de PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73 e fosfatidilserina; e uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais.
[0078] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é conjugado a um peptídeo que facilita o transporte através da barreira hemato-encefálica. Em alguns exemplos de realização, o peptídeo é selecionado a partir de CRM197, um domínio de transdução de proteína, TAT, Syn-B, penetratina, um peptídeo de poliarginina, um peptídeo angiopep e ANG1005.
[0079] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é um anticorpo opsonizante.
[0080] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é um anticorpo conjugado.
[0081] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é conjugado a um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico.
[0082] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é conjugado a uma toxina selecionada a partir de ricina, cadeia A de ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, um maitansinoide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposídeo, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracina diona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, cadeia abrina A, cadeia abrina A, cadeia modecina A, sarcina alfa, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidor da Saponaria officinalis, glicocorticoide, auristatina, auromicina, ítrio, bismuto, combrestatina, duocarmicina, dolastatina, cc1065 e uma cisplatina.
[0083] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinadas com qualquer um dos exemplos de realização aqui presentes, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo anti-SIRPA é usado em combinação com um ou mais anticorpos que ligam especificamente uma proteína causadora de doença selecionada a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou seus fragmentos, Tau, IAPP, alfa- sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpos de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amilóide sérica A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, Produtos de tradução não associados ao ATG (RAN), peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), peptídeos de repetição de ubiquitina, e prolina-arginina (PR), e qualquer combinação dos mesmos; ou com um ou mais anticorpos que se ligam uma proteína imunomoduladora selecionada a partir do grupo constituído por: PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR- 5, CD2, CD5, CD39, CD73, TREM1, TREM2, CD33, Siglec-5, Siglec-7, Siglec- 9, Siglec-11, fosfatidilserina, ácidos nucleicos causadores de doenças, RNA de repetição de expansão GGCCCC (G2C4) antissenso, e qualquer combinação dos mesmos.
[0084] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente descrição proporciona um método de prevenir, reduzir o risco ou tratar o câncer, em que o método contempla a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, tratando assim o câncer. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente invenção fornece um método de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com uma doença, distúrbio ou lesão, em que a doença, distúrbio ou lesão é o câncer, cujo método compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação e, desse modo, prevenindo, reduzindo o risco ou tratando o indivíduo.
[0085] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, em que o câncer é selecionado a partir de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma, glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga, linfoma difuso de grandes células B, adenocarcinoma de pulmão; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma indolente de células
B, linfoma de células B agressivo, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas, carcinoma invasivo de mama, carcinoma de células escamosas cervicais, adenocarcinoma endocervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma de cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma de cabeça e pescoço, carcinoma renal cromofóbico, carcinoma renal de células papilares, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas pulmonares, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso ovariano, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma retal, melanoma cutâneo, adenocarcinoma de estômago, tumores de células germinais testiculares, carcinoma da tiroide, timoma, carcinoma endometrial do corpo uterino, carcinossarcoma uterino, e melanoma uveal.
[0086] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, cujo método compreende ainda a administração de um agente terapêutico que inibe PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4- 1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 ou CD73. Em alguns exemplos de realização que podem ser combinadas com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o agente terapêutico é um anticorpo que inibe PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM,
LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 ou CD73.
[0087] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, cujo método compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é selecionado a partir de um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor das células killer semelhante à imunoglobulina (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti- CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFα, um anticorpo anti- CD33, um anticorpo anti-Siglec- 5, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, e qualquer combinação dos mesmos.
[0088] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais são selecionadas a partir de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercept, transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.
[0089] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, em que o método compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.
[0090] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido,
a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, em que o método compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, o pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo agonista anti-GITR proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide, um anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.
[0091] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um método de tratamento do câncer, em que o método compreende a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, em que o método compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos uma citocina estimuladora. Em alguns exemplos de realização, a pelo menos uma citocina estimuladora é selecionada a partir de IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM- CSF, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação das mesmas.
[0092] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece uma célula hospedeira isolada compreendendo um vetor que compreende um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação.
[0093] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo que se liga à SIRPA humana, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende um vetor que compreende um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, de modo que o anticorpo seja produzido. A presente invenção provê ainda a recuperação do anticorpo produzido pela célula.
[0094] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação e um veículo farmaceuticamente aceitável.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0095] A FIG. 1 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos dos domínios extracelulares da SIRPA humana variante 1 e proteínas SIRPA de várias espécies. A porcentagem de identidade registrada demonstra alta homologia dentro da região extracelular. Os números de acesso são P78324 (variante 1 da
SIRPA humana), XP015313153 (cinomolgo), JAB51896 (sagui), G1U0I5 (coelho) e XP005634938 (cão). A FIG. 1 divulga as SEQ ID NOs: 59-63, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0096] A FIG. 2A lista potenciais sequências humanizadas do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti-SIRPA 3F9. A sequência humanizada é baseada na estrutura aceptora IGHV3-23*01 e na região de junção IGHJ4*01. A FIG. 2A descreve as SEQ ID NOs: 64-65, 2, 64, e 3-4, respectivamente, por ordem de aparecimento. A FIG. 2B lista as sequências humanizadas potenciais do domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti- SIRPA 3F9. A FIG. 2B descreve as SEQ ID NOs: 66-67, 5, 66, e 68-70, respectivamente, por ordem de aparecimento.
[0097] A FIG. 3 apresenta dados que mostram a regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos em macrófagos humanos primários por anticorpos anti-SIRPA 3F9 murinos e humanizados.
[0098] A FIG. 4A apresenta dados que mostram que a regulação negativa do receptor mediada por anticorpos depende do glicano Fc N-ligado.
FIG. 4B apresenta dados que mostram o aumento da fagocitose de células tumorais mediado por anticorpo depende de glicano Fc N-ligado.
[0099] A FIG. 5A apresenta dados mostrando que anticorpos IgG4 anti-SIRPA humanizados 3F9 falharam em induzir a fagocitose de células tumorais. A FIG. 5B apresenta dados mostrando que anticorpos IgG4 anti- SIRPA humanizados 3F9 falharam em regular negativamente a expressão de CD14 em macrófagos.
[0100] A FIG. 6A mostra que o tratamento com anticorpo anti- SIRPA 3F9 mIgG1 regula negativamente a expressão de CD32A/B em macrófagos humanos primários. A FIG. 6B mostra que o tratamento com anticorpo anti-SIRPA 3F9 regula negativamente a expressão de CD32A e CD32B em macrófagos humanos primários.
[0101] A FIG. 7A apresenta dados mostrando que o bloqueio de CD32A/B inibe a regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpo anti- SIRPA 3F9 em macrófagos humanos primários. A FIG. 7B apresenta dados mostrando que o bloqueio de CD32A/B inibe o aumento da fagocitose de células tumorais mediado pelo anticorpo anti-SIRPA 3F9.
[0102] A FIG. 8 estabelece dados que mostram que o alotipo CD32A afeta a regulação negativa de SIRPA mediada pelo anticorpo 3F9 anti- SIRPA. FIG. 8A mostra que os doadores 507 e 508 eram heterozigotos para CD32A-R/H131; a FIG. 8B mostra que os doadores 516 e 517 eram homozigotos para CD32A-H/H131.
[0103] As FIGs. 9A-9B apresentam dados que mostram que a regulação negativa do receptor mediada por anticorpos leva à degradação de SIRPA. Na FIG. 9 A, 5 μg, 10 μg e 20 μg de lisado de célula inteira foram carregados em SDS-PAGE e submetidos ao immunoblotting para o domínio citoplasmático anti-SIRPA (a-SIRPAct). Na FIG. 9B, 20 μg de lisado de células inteiras foi carregado em um SDS-PAGE e sondados para a-SIRPAct e anti- SHP2.
[0104] As FIGs. 10A-10B apresentam dados comparando o aumento da atividade fagocítica de diferentes variantes Fc de anticorpo anti- SIRPA 3F9-22. Na FIG. 10A, macrófagos humanos primários foram tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 em uma cadeia central de IgG1 humana tipo selvagem ou uma IgG1 humana carregando as mutações S267E/L328F no Fc ou um anticorpo de controle isotípico. Na FIG. 10B, macrófagos humanos primários foram tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 em uma cadeia central de IgG1 humana carregando as mutações S267E/L328F ou A330/P331S em Fc ou um anticorpo isotípico de controle.
[0105] As FIGs. 11A-11B apresentam dados comparando a atividade fagocítica de diferentes anticorpos anti-SIRPA 3F9-22 ‘Fc variantes’
de em relação ao anti-CD47 em macrófagos M1 (FIG. 11B) e M2 (FIG. 11A).
[0106] As FIGs. 12A e 12B apresentam dados mostrando que macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 reduzem a viabilidade celular do tumor sólido in vitro.
[0107] A FIG. 13A apresenta dados comparando o aumento da proliferação de células T por diferentes variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) de 2 vias. A FIG.
13B apresenta dados comparando o aumento da proliferação de células T por diferentes variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 e anticorpo anti-SIRPA 3F9-14 em relação à IgG4 anti-CD47 em um ensaio MLR de 2 vias.
[0108] A FIG. 14A apresenta dados comparando o aumento da proliferação de células T por diferentes variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 em relação à IgG4 anti-CD47 em um ensaio MLR de 1 via. A FIG. 14B mostra o gráfico FACS representativo do ensaio de MLR de 1 via.
[0109] As FIGs. 15A e 15B exibem dados comparando o aumento na liberação de TNF por diferentes anticorpos anti-SIRPA 3F9-22 Fc variantes por macrófagos ativados com LPS.
[0110] A FIG. 16 apresenta os dados que mostram a identificação e a visualização de resíduos “críticos” para os anticorpos anti-SIRPA em um modelo de SIRPA humano.
[0111] As FIGs. 17A-17C apresentam dados que mostram o efeito do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 na inibição do crescimento tumoral em combinação com o anticorpo anti-PD-L1 em um modelo de carcinoma do cólon de camundongo singênico. A FIG. 17A apresenta histogramas FACS mostrando a expressão de CD47 de camundongo (painel superior) e CD47 humano (painel inferior) em linhagens de células MC38 tipo selvagem e modificadas. A FIG. 17B apresenta dados que mostram as curvas médias de crescimento tumoral de camundongos transgênicos huSIRPA/huCD47 BAC implantados subcutaneamente com células MC38 manipuladas para expressarem CD47 de camundongo e que superexpressam CD47 humano (MC38-mCD47KO/huCD47+). A FIG. 17C apresenta diagrama de espaguete de cada animal individual em cada grupo de tratamento da FIG. 17B.
[0112] As FIGs. 18A-18B apresentam dados que mostram a cinética da regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos em células mieloides de camundongos transgênicos BAC portadores de tumor tratados com doses crescentes de anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. A FIG.
18A apresenta dados que mostram a mudança relativa na expressão de SIRPA ao longo do tempo em células mieloides infiltrantes de tumor. A FIG. 18B apresenta dados que mostram a mudança relativa na expressão de SIRPA ao longo do tempo em células mieloides infiltrantes de tumor.
[0113] A FIG. 19A mostra condições de tratamento do estudo de regulação negativa mediada por anticorpo anti-SIRPA em camundongos NOG- EXL humanizados com tumores A375. A FIG. 19B apresenta dados que mostram o nível de expressão de SIRPA em macrófagos tumorais humanos como valores MFI (painel esquerdo) ou valores normalizados (painel direito) associados ao tratamento com anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação.
[0114] As FIGs. 20A-20B mostram os níveis de expressão de marcadores de macrófagos M1 HLA-DR/MHC classe 2 (FIG. 20A) e CD86 (FIG. 20B) em macrófagos de tumores humanos isolados de camundongos NOG-EXL humanizados com tumores A375 após tratamento com anticorpos anti-SIRPA da presente invenção. A FIG. 20A e FIG. 20B apresentam dados que mostram a expressão de HLA-DR/MHC classe 2 e CD86, respectivamente, como valores MFI (painéis à esquerda) ou como valores normalizados (painéis da direita).
[0115] As FIGs. 21A-21B exibem a regulação negativa de SIRPA humana em monócitos esplênicos (FIG. 21A) e monócitos do sangue periférico
(FIG. 21B) isolados de camundongos NOG-EXL humanizados com tumores A375 associados à administração de anticorpos anti-SIRPA da presente invenção. A FIG. 21A e FIG. 21B apresentam dados que mostram a expressão de SIRPA humana respectivamente, como valores MFI (painéis à esquerda) ou como valores normalizados (painéis da direita).
[0116] A FIG. 22 apresenta dados que mostram a regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos em macrófagos humanos primários por diferentes anticorpos anti-SIRPA 3F9 Fc variantes.
[0117] A FIG. 23 apresenta dados comparando o aumento da atividade fagocítica de diferentes variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 em comparação com anticorpos anti-CD47 bloqueadores.
[0118] A FIG. 24 estabelece dados que mostram as contagens de células vermelhas (hemácias) e plaquetas em macacos cinomolgos que receberam IgG controle, anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 PS, anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 IgG4, anticorpo anti-SIRPA 3F9-IgG2, e anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 NSLF.
[0119] Deve ser compreendido que uma, algumas ou todas as propriedades dos diversos exemplos de realização aqui descritos podem ser combinadas para formar outros exemplos de realização da presente invenção.
Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes para os técnicos hábeis no assunto. Estes e outros exemplos de realização da invenção são adicionalmente descritos pela descrição detalhada a seguir.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0120] A presente divulgação refere-se a anticorpos anti-SIRPA (por exemplo, anticorpos monoclonais); métodos de produção e uso de tais anticorpos; composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos; ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos; e células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos.
[0121] As técnicas e procedimentos descritos ou mencionados na presente invenção são, em geral, bem compreendidos e comumente empregados pelo uso da metodologia convencional pelos técnicos hábeis no assunto como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3º edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds.
(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I.
Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I.
Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A.
Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D.
Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company,
1993).
I. DEFINIÇÕES
[0122] Os termos “SIRPα” ou “polipeptídeo SIRPα” ou “ SIRPA “ ou “ polipeptídeo SIRPA” são usados de maneira indistinta no presente documento e referem-se a qualquer SIRPA nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos e cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. Em alguns exemplos de realização, o termo abrange sequências tipo selvagem e sequências variantes de ocorrência natural, por exemplo, variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em alguns exemplos de realização, o termo engloba SIRPA “completa” ou “de comprimento total” não processada, bem como qualquer forma de SIRPA que resulta do processamento na célula. Em alguns exemplos de realização, a SIRPA é SIRPA humana. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma SIRPA exemplar é a com o Nº de Acesso Uniprot: P78324 de 25 de abril de 2018. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma SIRPA v1 humana exemplar é a de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma SIRPA v2 humana exemplar é a do GenBank: CAA71403.
[0123] As expressões “anticorpo anti-SIRPA” e “um anticorpo que se liga à SIRPA” e “anticorpo que se liga especificamente à SIRPA” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente à SIRPA com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico direcionado contra SIRPA. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo anti-SIRPA a um polipeptídeo não SIRPA não relacionado, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo à SIRPA mensurada, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certos exemplos de realização, um anticorpo que se liga à SIRPA tem uma constante de dissociação (KD) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas realizações, um anticorpo anti-SIRPA liga-se a um epítopo de SIRPA que é conservado entre SIRPAs de diferentes espécies.
[0124] Com respeito à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “se liga especificamente à” ou é “específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo em um polipeptídeo alvo específico significa que a ligação é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, pela determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado à sonda é competitivamente inibida pelo excesso de alvo não marcado. O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular, tal como utilizado na presente invenção, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um K D para o alvo de cerca de 10-4 M ou menos, 10-5 M ou menos, 10-6 M ou menos, 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos ou um KD no intervalo de 10-4 M a 10-6 M ou 10-6 M a 10-10 M ou 10-7 M a 10-9 M. Como será reconhecido pelo versado na técnica, os valores de afinidade e KD estão inversamente relacionados. Uma alta afinidade para um antígeno é medida por um baixo valor de K D. Em uma realização, o termo “ligação específica” refere-se a ligação quando uma molécula se liga a um polipeptídeo específico ou epítopo de um polipeptídeo específico, substancialmente sem qualquer ligação a outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[0125] O termo “imunoglobulina” (Ig) é utilizado indistintamente com “anticorpo” no presente documento. O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) incluindo aqueles formado por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que estes exibam a atividade biológica desejada.
[0126] “Anticorpos nativos” são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (“L”) idênticas e duas cadeias pesadas (“H”) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (V H), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido específicos formam uma relação entre os domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada.
[0127] Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpo, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel. P. Stites, Abba I. Terr e Tristam G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 Capítulo 6.
[0128] A cadeia leve de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, denominados capa (kappa - “κ”) e lambda (“λ”), baseados nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas alfa (“α”), delta (“δ”), épsilon (“ε”), gama (“γ”) e mu (“μ”), respectivamente. As classes γ e α são divididas ainda em subclasses (isotipos) com base em diferenças relativamente pequenas na função e sequência de CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4a ed. (WB Saunders, Co., 2000).
[0129] A “região variável” ou “ domínio variável” de um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, refere-se aos domínios amino-terminais de cadeia pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser referidos como “VH” e “VL”, respectivamente. Esses domínios geralmente são as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação a antígenos.
[0130] O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos, como os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação. O domínio variável medeia a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em toda a extensão dos domínios variáveis.
Em vez disso, está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais ou de arcabouço (FR - frameworks). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem 4 regiões FR cada, adotando em grande parte uma configuração de folha beta, conectadas por três HVRs, que formam alças (loops) que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As HVRs de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Quinta Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
[0131] A expressão “anticorpo monoclonal”, usada no presente documento, refere-se a um anticorpo como um anticorpo anti-SIRPA monoclonal da presente descrição, obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural e/ou alterações pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações, etc.) que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos de modo que eles podem ser sintetizados por cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas.
O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante e tecnologias para produzir anticorpos humanos ou semelhantes aos de humanos em animais que possuem partes ou todos os loci ou genes de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina humana.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente divulgação, podem ser produzidos por uma série de técnicas, incluindo, por exemplo, as tecnologias de exibição em fagos (vide, por exemplo, Clackson et al., Nature,
352:624-628 (1991); Marks et al., J.
Mol.
Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al.,
J.
Mol.
Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J.
Mol.
Biol. 340(5):1073-1093
(2004); Fellouse, Proc.
Nat’l Acad.
Sci.
USA 101(34):12467-472 (2004); e Lee et al., J.
Immunol.
Methods 284(1-2):119-132 (2004), o método de hibridoma
(por exemplo, Kohler e Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongoet al.,
Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory
Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.,
1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente US
4,816,567), tecnologia de apresentação em levedura (vide, por exemplo, os documentos WO2009/036379A2; WO2010105256; WO2012009568, e Xu et al., Protein Eng.
Des.
Sel., 26(10): 663-70 (2013), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou similares a de humanos em animais que possuem partes ou todos os locus ou genes de imunoglobulina humana que codificam as sequências de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.633.425; e US 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.
14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).
[0132] Os termos “anticorpo completo”, “anticorpo intacto” ou “anticorpo inteiro” são usados indistintamente para se referir a um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo.
Especificamente, os anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes da sequência nativa humana) ou a sequência de aminoácidos variante desta. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.
[0133] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno para o qual o anticorpo intacto se liga.
Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’) 2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; (vide a Patente US 5.641.870, Exemplo 2; Zapata, et al, Protein Ens.. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0134] A digestão de anticorpos por papaína, como os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição, produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab” e um fragmento “Fc” residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste de uma cadeia leve inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia pesada (VH) e o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente com relação a ligação ao antígeno, ou seja, ele tem um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento de um anticorpo com pepsina gera um fragmento F(ab’) 2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por pontes de dissulfeto possuindo a atividade de ligação ao antígeno diferente, e ainda é capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos Fab’ se diferem dos fragmentos Fab por possuírem alguns resíduos adicionais na extremidade carbóxi-terminal do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas a partir da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH é a designação da presente invenção para o Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes sustenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ que possuem dobradiças de cisteínas entre si. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[0135] O fragmento Fc compreende as porções carboxi-terminal de ambas as cadeias pesadas unidas por ligações (pontes) de dissulfeto. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região de Fc, regiões as quais também são reconhecidas pelos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos celulares.
[0136] “Fragmentos funcionais” de anticorpos, como anticorpos anti-SIRPA da presente descrição, compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intacto ou a região F de um anticorpo que retém ou modificou a capacidade de ligação ao FcR. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (ou simples); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0137] O termo “diacorpos” (diabodies) refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos preparados pela construção de fragmentos sfv (consulte o parágrafo anterior), com ligantes curtos (cerca de resíduos 5-10) entre os domínios VH e VL, de modo que é obtido o pareamento intercadeia, mas não o pareamento intracadeia dos domínios variáveis, resultando em um fragmento bivalente, ou seja, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno.
Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv ‘cruzados’ (sFv crossover) em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas.
[0138] Como utilizado neste documento, “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo (imunoglobulina), como um anticorpo quimérico anti- SIRPA da presente descrição, no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é (são) idêntico(s) ou homólogo(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos quiméricos de interesse neste documento incluem anticorpos PRIMATIZED® nos quais a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, pela imunização de macacos Macaca com um antígeno de interesse. Como usado no presente documento, “anticorpo humanizado”; é usado como um subconjunto de “anticorpos quiméricos”.
[0139] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), como formas humanizadas de anticorpos anti-SIRPA da presente descrição, são anticorpos quiméricos que compreendem resíduos de aminoácidos de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àquelas de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[0140] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, produzido por um humano e/ou que foi produzido usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos divulgadas neste documento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição por fagos e bibliotecas de exibição em leveduras. Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos locos endógenos foram desativados, por exemplo, camundongos transgênicos imunizados e gerados por tecnologia de hibridoma de célula B humana. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição por fagos. Hoogenboom e
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Veja também van Dijk e van de Winkel, Curr.
Opin. Pharmacol, 5:368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos locus endógenos foram desativados, por exemplo, o xenocamundongo (xenomice) imunizado (vide, por exemplo, Patente US
6.075.181 e US 6.150.584 com relação à tecnologia XENOMOUSE®). Vide também, por exemplo, Li et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) sobre anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas. Alternativamente, os anticorpos humanos também podem ser preparados empregando bibliotecas de leveduras e métodos como divulgado em, por exemplo, nos documentos WO2009/036379A2; WO2010105256; WO2012009568; e Xu et al., Protein Eng. Des. Sel. 26 (10): 663-70 (2013).
[0141] O termo “região hipervariável”, “HVR”; ou “HV”, quando utilizado neste documento, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo, como o de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação, que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas.
Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular, desempenha um papel único na conferencia da especificidade fina aos anticorpos. Anticorpos de camelídeos de ocorrência natural e que consistem em uma cadeia pesada somente são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve.
[0142] Diversos delineamentos da HVR são utilizados e englobados no presente documento. Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de Kabat com base na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., supra). Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser CDRs de Chothia. Chothia por sua vez refere-se à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser CDRs de Chothia. As HVRs do AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular AbM antibody modeling software”. Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser HVRs de “contato”. O “contato” das HVRs é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritas a seguir.
Alça(Loop) Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0143] As HVRs podem compreender “HVRs estendidas” como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2,) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL, e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (a modalidade preferida) (H2) e 93- 102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al, supra para cada uma dessas definições de HVRs estendidas.
[0144] Os resíduos da “região estrutural” ou “região de arcabouço” ou “FR” (do inglês framework region) são aqueles resíduos do domínio variável que não são resíduos da HVR conforme definido no presente.
[0145] As expressões “numeração do resíduo de domínio variável como em EU ou Kabat” ou “numeração da posição do aminoácido como em EU ou Kabat” e variações destas referem-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em EU ou Kabat et al. supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, o que corresponde a redução ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc., de acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração EU ou de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.
[0146] O sistema de numeração EU ou de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, os resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al. Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). O “sistema de numeração EU ou de Kabat” ou “índice EU” é geralmente usado quando se faz referencia a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al. Supra (1991). O “índice EU como em Kabat” refere-se a numeração do resíduo do anticorpo humano IgG1 EU. Salvo quando disposto de outra maneira no presente documento, referência aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos significa a numeração de resíduos utilizando o sistema de numeração de Kabat. Salvo quando expresso de outra maneira na presente invenção, as referências aos números de resíduos no domínio constante de anticorpos referem-se a numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU ou de Kabat (vide, por exemplo, a publicação de Patente US 2010-280227).
[0147] A expressão “região estrutural humana aceptora” conforme usada na presente invenção é uma região estrutural (framework) contendo a sequência de aminoácidos de uma região estrutural V L ou VH derivada de uma região estrutural da imunoglobulina humana, ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural humana aceptora “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido desta ou pode compreender uma alteração na sequência de aminoácidos pré-existente. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos pré-existentes são de 10 ou menos, nove ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Quando as alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes em um VH, essas alterações ocorrem preferencialmente em apenas três, dois, ou uma das posições 71H, 73H e 78h, por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora V L é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana VL ou sequência da região estrutural de consenso humano.
[0148] Uma “região estrutural de consenso humano” é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de sequências da região estrutural VH ou VL da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências V H ou VL da imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Exemplos incluem para o VL, o subgrupo pode ser o subgrupo kappa (capa) I, kappa II, kappa III ou kappa IV, como em Kabat et al., supra. Além disso, para VH, o subgrupo pode ser o subgrupo I, subgrupo II ou subgrupo III, como em Kabat et al., supra.
[0149] Uma “modificação/alteração de aminoácidos” na posição especificada, por exemplo, de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, refere-se à substituição ou deleção do resíduo especificado, ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. A inserção “adjacente” a um resíduo especificado significa a inserção em um a dois dos resíduos dos mesmos. A inserção pode ser N-terminal ou C-terminal ao resíduo especificado. A alteração de aminoácido preferida neste documento é uma substituição.
[0150] Um anticorpo “maturado por afinidade”, tal como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, é um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas HVRs, que resultam em melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo de origem que não possua esta(s) alteração(ões). Em um exemplo de realização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuir afinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos no estado da técnica.
Marks, et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) descrevem, por exemplo, a maturação por afinidade por embaralhamento (shuffling) dos domínio VH e VL. A mutagênese aleatória da HVR e/ou resíduos da região estrutural é descrita em, por exemplo, Barbas, et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Shier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J.
Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
[0151] “Fv” é o menor fragmento de anticorpo, que compreende um sítio completo de reconhecimento e de ligação de antígenos. Este fragmento consiste em um dímero de uma região variável de cadeia pesada e uma de cadeia leve em estreita associação não covalente. A partir do enovelamento destes dois domínios, surgem 6 alças (loops) hipervariáveis (3 alças da cadeia H e 3 alças da cadeia L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antígeno e conferem especificidade de ligação ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer e ligar ao antígeno, embora em menor afinidade do que o site de ligação inteiro.
[0152] “Fv de cadeia única”, também abreviado como “sFv” ou “scFv” são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios V H e VL de anticorpo conectados em uma única cadeia de polipeptídica.
Preferencialmente, o polipeptídeo sFv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, permitindo que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno.
[0153] Um anticorpo com “funções efetoras” refere-se as atividades biológicas atribuídas a região Fc (uma sequência nativa da região Fc ou uma sequência de aminoácido variante da região Fc) de um anticorpo, e variam de acordo com o isotipo do anticorpo.
[0154] O termo “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência nativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos na posição Cys226, ou a partir da Pro230, até a região carboxi-terminal desta. A lisina C-terminal (resíduo 477 de acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou pela construção de um ácido nucleico recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo.
Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos podem incluir populações de anticorpos com todos resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem a remoção dos resíduos K447, e populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. As regiões Fc de sequência nativa adequadas para uso nos anticorpos da presente descrição incluem a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
[0155] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Região Fc humana de sequência nativa inclui uma região Fc de IgG1 humano de sequência nativa (alótipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG 3 humana de sequência nativa, região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como as variantes de ocorrência natural destas.
[0156] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere da região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência, uma ou mais substituição(ões) de aminoácido(s). Preferivelmente, a região Fc variante possui pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um polipeptídeo parental,
por exemplo, cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante da presente invenção irá possuir preferencialmente cerca de pelo menos 80% de homologia com uma sequência da região Fc nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.
[0157] Os termos “receptor de Fc” ou “FcR” descrevem um receptor que se liga a uma região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR de sequência nativa humana. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e formas oriundas de splicing alternativo destes receptores, os receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um “receptor ativador”) e FcγRIIB (um “receptor inibidor”), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcγRIIA possui um Motivo de Ativação do Imunorreceptor Baseado em Tirosina (“ITAM”), no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcγRIIB possui um Motivo de Inibição do Imunorreceptor Baseado em Tirosina (“ITIM”) no seu domínio citoplasmático.
Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro são abrangidos pelo termo “FcR” na presente invenção. Os FcRs também podem aumentar a meia-vida sérica dos anticorpos.
[0158] A ligação ao FcRn in vivo e a meia-vida sérica dos polipeptídeos que se ligam ao FcRn humano com alta afinidade de ligação podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou transfectados com linhagens de células humanas expressando FcRn humano, ou administrado em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. O documento WO 2004/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação aos FcRs melhorada ou diminuída. Vide também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[0159] Conforme usado neste documento, “porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” e “homologia” com relação a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo referem-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica de peptídeo ou polipeptídeo, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas (gaps), se necessário, para atingir a identidade percentual máxima da sequência e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign™ (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas.
[0160] O termo “competir” quando usado no contexto de anticorpos (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que competem pelo mesmo epítopo significa a competição entre o anticorpo, conforme determinado por um ensaio em que o anticorpo sendo testado previne ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma molécula de referência (por exemplo, um ligante ou um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, SIRPA ou um fragmento deste). Diversos tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se o anticorpo compete com outro, por exemplo: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio imunoenzimático direto ou indireto (EIA), (vide, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology. 2:242-253); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide, por exemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) ensaio de marcação direto em fase sólida, ensaio sanduíche marcado em fase sólida (vide, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA com marcação direta em fase sólida utilizando o marcador 125I (vide, por exemplo, Morel et al., 1988, Molec.
Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide, por exemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); e RIA com marcação direta (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes, um anticorpo de teste não marcado e um anticorpo de referência marcado. A inibição competitiva é mediada pela determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença do anticorpo teste. Normalmente, o anticorpo de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estérico. Detalhes adicionais relativos a métodos para determinar a ligação competitiva são fornecidos na presente invenção.
Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele irá inibir (por exemplo, reduzir) a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5% e/ou perto de 100%.
[0161] Como utilizado neste documento, uma “interação” entre uma polipeptídeo SIRPA e um segundo polipeptídeo abrange, sem limitação, interação proteína-proteína, interação física, interação química, ligação, ligação covalente e ligação iônica. Como utilizado neste documento, um anticorpo “inibe a interação” entre dois polipeptídeos quando o anticorpo interrompe, reduz ou elimina completamente uma interação entre os dois polipeptídeos. Um anticorpo da presente descrição, ou fragmento do mesmo, “inibe a interação” entre dois polipeptídeos quando o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a um dos dois polipeptídeos. Em alguns exemplos de realização, a interação pode ser inibida por pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5% e/ou perto de 100%.
[0162] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante capaz de ser ligado por um anticorpo. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo que tem como alvo esse antígeno e, quando o antígeno é um polipeptídeo, inclui aminoácidos específicos que contatam diretamente o anticorpo. Na maioria das vezes, os epítopos residem em polipeptídeos, mas, em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, como ácidos nucleicos. Determinantes epitópicos podem incluir agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativos, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou sulfonila e podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Geralmente, os anticorpos específicos para um determinado antígeno alvo reconhecerão preferencialmente um epítopo no antígeno alvo em uma mistura complexa de polipeptídeos e/ou macromoléculas.
[0163] Um anticorpo “agonista” ou um anticorpo “ativador” (ou ainda ‘de ativação’) é um anticorpo que induz (por exemplo, aumenta) uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno.
[0164] Um anticorpo “antagonista” ou anticorpo “bloqueador” ou anticorpo “inibidor” (inibitório) é um anticorpo que reduz, inibe e/ou elimina (por exemplo, diminui) a ligação ao antígeno de um ou mais ligantes após o anticorpo se ligar ao antígeno, e/ou que inibe e/ou abole (por exemplo, diminui)
uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno. Em alguns exemplos de realização, anticorpos antagonistas, ou anticorpos de bloqueio, ou anticorpos inibidores inibem substancialmente ou completamente a ligação do antígeno a um ou mais ligantes e/ou a uma ou mais atividades ou funções do antígeno.
[0165] Um anticorpo “isolado”, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, é aquele que foi identificado, separado e/ou recuperado de um componente de seu meio de produção (por exemplo, naturalmente ou de forma recombinante). De preferência, o polipeptídeo isolado está livre de associação a todos os outros componentes contaminantes do seu meio de produção. Os componentes contaminantes do seu meio de produção, como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interferem nas utilizações diagnósticas, terapêuticas ou de pesquisa para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em exemplos de realização preferenciais, o polipeptídeo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo, tal como determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e, em alguns exemplos de realização, até mais de 99% em peso; (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N- terminal através da utilização de, por exemplo, um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células T recombinantes, desde que, pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, contudo, um polipeptídeo ou anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0166] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” que codifica um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada no meio em que foi produzida. De preferência, o ácido nucleico isolado está livre de associação a todos os componentes associados ao meio de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos deste documento estão em uma forma diferente da forma ou configuração na qual são encontradas na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são, portanto, distinguidas do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos deste documento existentes naturalmente nas células.
[0167] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um DNA de fita dupla circular ao qual, segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar replicação autônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicado junto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são denominados na presente invenção como “vetores de expressão recombinantes” ou simplesmente, “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente presentes na forma de plasmídeos. De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada.
[0168] “Polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, utilizada na apresente invenção de forma alternada, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou análogos destes, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero pela DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética.
[0169] Uma “célula hospedeira” inclui uma célula de cultura ou uma célula individual que pode ser ou ter sido um receptor para vetor(es) para a incorporação de inserções de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira e a descendência pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do DNA genômico) à célula de origem devido a uma mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo(s) da presente invenção.
[0170] “Veículos” conforme utilizado no presente incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes e/ou estabilizantes, que são atóxicos para as células ou para os mamíferos que são expostos nas mesmas dosagens e concentrações utilizadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é de uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como o fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo manose, glicose, ou amidos; agentes quelantes, como o EDTA; alcoóis de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal como sódio; tensoativos e/ou tensoativos não iônicos, como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.
[0171] Conforme usado neste documento, o termo “prevenção”; inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença, distúrbio ou condição específica em um indivíduo. Um indivíduo pode estar predisposto a, suscetível a, uma doença, distúrbio ou condição específica, ou correr o risco de desenvolver tal doença, distúrbio ou condição, mas ainda não foi diagnosticado com a doença, distúrbio ou condição.
[0172] Conforme usado neste documento, um indivíduo “em risco” de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica pode ou não ter uma doença ou sintomas da doença detectáveis, e pode ou não ter exibido uma doença ou sintomas detectáveis antes dos métodos de tratamento descritos neste documento. “Em risco” denota que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição específica, como é conhecido na técnica. Um indivíduo com um ou mais desses fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica do que um indivíduo sem um ou mais desses fatores de risco.
[0173] Como utilizado neste documento, o termo “tratamento” refere-se à intervenção clínica projetada para modificar o curso natural do indivíduo sendo tratado durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão, melhorar ou diminuir o estado patológico e remissão ou prognóstico aprimorado de uma doença, distúrbio ou condição específica. Um indivíduo é “tratado” com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma doença,
distúrbio ou condição específica são mitigados ou eliminados.
[0174] Uma “quantidade eficaz” refere-se a pelo menos uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações. Uma quantidade eficaz no presente documento pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do tratamento de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do tratamento são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como a eliminação ou redução do risco, diminuição da gravidade, ou atraso do aparecimento da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos tais como a diminuição de um ou mais sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, potencialização do efeito de outro medicamento, tal como visando o retardo da progressão da doença, e/ou prolongando a sobrevida. Uma quantidade eficaz de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico direta ou indiretamente. Como é compreendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma “quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado como dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for atingido.
[0175] Um “indivíduo” para fins de tratamento, prevenção ou redução de risco refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda e zoológico, de esporte ou animais de estimação, como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbil, camundongos, furões, ratos, gatos e similares. Em alguns exemplos de realização, o indivíduo é humano.
[0176] Conforme usado neste documento, a administração “em conjunto” com outro composto ou composição inclui administração simultânea e/ou administração em diferentes momentos. A administração em conjunto também abrange a administração como uma coformulação ou administração como composições separadas, incluindo em diferentes frequências ou intervalos de dosagem, e usando a mesma via de administração ou diferentes vias de administração. Em alguns exemplos de realização, a administração em conjunto é a administração como parte do mesmo regime de tratamento.
[0177] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, como utilizado no presente documento, refere-se ao intervalo (faixa) de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. Em referência a “cerca de” um valor ou parâmetro no presente documento inclui (e descreve) exemplos de realização que são dirigidos a esse valor ou parâmetro per se.
[0178] Como utilizado no presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um” e “o, a” incluem a referência ao plural, a menos que o contexto indique claramente de outra maneira. Por exemplo, a referência a um “anticorpo” é uma referência a de um a muitos anticorpos, tais como quantidades molares, e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.
[0179] Entende-se que aspectos e exemplos de realização da presente descrição descritos no presente documento incluem “compreendendo”, “consistindo” e “consistindo essencialmente de” aspectos e exemplos de realização.
ANTICORPOS ANTI-SIRPA REGIÕES DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPA
[0180] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição podem se ligar a um epítopo conformacional. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição podem se ligar a um epítopo SIRPA descontínuo. Em alguns exemplos de realização, o epítopo descontínuo de SIRPA compreende dois ou mais peptídeos, três ou mais peptídeos, quatro ou mais peptídeos, cinco ou mais peptídeos, seis ou mais peptídeos, sete ou mais peptídeos, oito ou mais peptídeos, nove ou mais peptídeos, ou 10 ou mais peptídeos. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição podem se ligar a um epítopo SIRPA compreendendo um ou mais peptídeos.
Como divulgado neste documento, os epítopos de SIRPA podem compreender um ou mais peptídeos compreendendo cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, ou 20 ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, ou 20 ou mais resíduos de aminoácidos em uma proteína SIRPA de mamífero correspondendo à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0181] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação ligam-se a um epítopo da SIRPA humana que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo da SIRPA ligado por um anticorpo anti-
SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 7, ou um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação ligam-se essencialmente ao mesmo epítopo de SIRPA que é ligado por um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e um região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0182] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação inibem competitivamente a ligação de um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e um região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação competem com um anticorpo anti-SIRPA que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e um região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um anticorpo anti-SIRPA compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0183] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição inibem competitivamente a ligação de pelo menos um anticorpo selecionado dentre qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 4, 5, 7, 8 e 10 Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição inibem competitivamente a ligação de pelo menos um anticorpo selecionado dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9- 11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição compete com um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8,
3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-
18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes, para ligação à SIRPA quando o anticorpo anti-SIRPA reduz a ligação de um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9
H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4),
h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7,
3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-
17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes à SIRPA em uma quantidade que varia de cerca de 50% a 100%, em comparação com a ligação à SIRPA na ausência do anticorpo anti-SIRPA.
Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-
SIRPA da presente descrição compete com um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9
H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3,
3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13,
3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22,
3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes, para ligação à SIRPA quando o anticorpo anti-SIRPA reduz a ligação de um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9
H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3,
3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13,
3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22,
3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes à SIRPA em pelo menos 50%, pelo menos 55%, por pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos
90%, pelo menos 95% ou 100%, em comparação com a ligação à SIRPA na ausência do anticorpo anti-SIRPA.
Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição que reduz a ligação de um ou mais anticorpos selecionados de m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2),
h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2,
3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-
13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22,
3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes à SIRPA em 100%
indica que o anticorpo anti-SIRPA essencialmente bloqueia completamente a ligação de um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1
(14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9
H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8,
3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-
18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes à SIRPA.
Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti- SIRPA e o um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1
(14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9
H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8,
3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-
18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes estão presentes em uma quantidade que corresponde a uma razão de 10:1, razão de 9:1, razão de 8:1, razão de 7:1, razão de 6:1,
razão de 5:1, razão de 4:1, razão de 3:1, razão de 2:1, razão de 1:1, razão de
0,75:1, razão de 0,5:1, razão de 0,25:1, razão de 0,1:1, razão de 0,075:1, razão de 0,050:1, razão de 0,025:1, razão de 0,01:1, razão de 0,0075:1, razão de
0,0050:1, razão de 0,0025:1, razão de 0,001:1, razão de 0,00075:1, razão de
0,00050:1, razão de 0,00025:1, razão de 0,0001:, razão de 1:10, razão de 1:9,
razão de 1:8, razão de 1:7, razão de 1:6, razão de 1:5, razão de 1:4, razão de
1:3, razão de 1:2, razão de 1:0,75, razão de 1:0,5, razão de 1:0,25, razão de 1:0,1, razão de 1:0,075, razão de 1:0,050, razão de 1:0,025, razão de 1:0,01,
razão de 1:0,0075, razão de 1:0,0050, razão de 1:0,0025, razão de 1:0,001,
razão de 1:0,00075, razão de 1:0,00050, razão de 1:0,00025 ou razão de 1:0,0001 de anticorpo anti-SIRPA para um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA está presente em excesso em uma quantidade que varia de cerca de 1,5 a 100 vezes, ou superior a 100 vezes em comparação com a quantidade de um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9- 18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA está presente em uma quantidade que é cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 45 vezes, 50 vezes, 55 vezes, 60 vezes, 65 vezes, 70 vezes, 75 vezes, 80 vezes, 85 vezes, 90 vezes, 95 vezes ou 100 vezes em comparação com a quantidade de um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes.
[0184] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição ligam-se a um epítopo da SIRPA humana que é igual ou se sobrepõe ao epítopo da SIRPA que é ligado por pelo menos um anticorpo selecionado a partir de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 4, 5, 7, 8 e 10. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição ligam-se a um epítopo da SIRPA humana que é igual ou se sobrepõe ao epítopo de SIRPA ligado por pelo menos um anticorpo selecionado a partir de m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9- 13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25.
[0185] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição ligam-se essencialmente ao mesmo epítopo de SIRPA ligado por pelo menos um anticorpo selecionado dentre qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 4, 5, 7, 8 e 10. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição ligam-se essencialmente o mesmo epítopo de SIRPA ligado por pelo menos um anticorpo selecionado dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25. Os métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0186] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição competem com um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13,
3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes pela ligação à SIRPA.
[0187] Qualquer ensaio de competição adequado ou ensaio de ligação à SIRPA conhecido na técnica, como análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo, pode ser utilizado para determinar se um anticorpo anti- SIRPA compete com um ou mais anticorpos selecionados dentre m3F9, h3F9 H1/L1 (14.70.1), h3F9 H1/L2 (14.70.2), h3F9 H1/L3, h3F9 H2/L1 (14.70.4), h3F9 H2/L2, h3F9 H2/L3, 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9- 17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, 3F9-25, e qualquer combinação destes pela ligação à SIRPA. Em um ensaio de competição exemplificativo, a SIRPA imobilizada ou células que expressam SIRPA na superfície celular são incubadas em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à SIRPA (por exemplo, de primata humano ou não humano) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado pela sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação à SIRPA. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante do hibridoma. Como um controle, a SIRPA imobilizada ou células que expressam SIRPA são incubadas em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo à SIRPA, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado à SIRPA imobilizada ou às células que expressam SIRPA é medida.
Se a quantidade de marcação associada à SIRPA imobilizada ou células que expressam SIRPA for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, isso indica então que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para a ligação à SIRPA. Vide, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Cap. 14 (Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[0188] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos anticorpos anti-SIRPA que compreendem, pelo menos, uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis HVRs selecionadas a partir da (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.
[0189] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo pelo menos uma duas, três.
quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
[0190] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24.
[0191] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.
[0192] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24, e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.
[0193] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24, e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.
[0194] Em outro aspecto, um anticorpo anti-SIRPA compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade na sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35. Em alguns exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34, e 35 contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-SIRPA compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se à SIRPA. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos, e/ou deletados na SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 5 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO:
35. Em alguns exemplos de realização, substituições, inserções, ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-SIRPA compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35, incluindo modificações pós-traducionais de tais sequências. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e
24.
[0195] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (V L) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, e 44. Em alguns exemplos de realização, uma sequência V L possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, e 44 contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-SIRPA compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se à SIRPA. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:
40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 44. Em determinados exemplos de realização, um total de 1 a 5 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 44. Em determinados exemplos de realização, as substituições, inserções, ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-SIRPA compreende a sequência VL de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 44, incluindo modificações pós-traducionais de tais sequências. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.
[0196] Em alguns exemplos de realização, é fornecido o anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL nas SEQ ID NOs: 33, 34, ou 35 e SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ou 44, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais de tais sequências.
[0197] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê anticorpos anti-SIRPA compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL), em que as VH e VL são selecionadas a partir do grupo que consiste em: VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e V L compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0198] A presente invenção provê ainda anticorpos anti-SIRPA que inibem a ligação de maneira competitiva e/ou compete pela ligação com um anticorpo anti-SIRPA compreendendo (a) um domínio VH compreendendo
(i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24, e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL nas SEQ ID NOs: 33, 34, ou 35, e SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ou 44, respectivamente.
[0199] Na presente invenção são fornecidos anticorpos anti- SIRPA que ligam-se a um epítopo da SIRPA humana que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPA compreendendo (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24, e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL nas SEQ ID NOs: 33, 34, ou 35, e SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, e 44, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, o epítopo da SIRPA humana é o mesmo epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPA.
[0200] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo humanizado e/ou humano. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo (diabody), ou F(ab’)2.
Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA é um anticorpo substancialmente completo (de comprimento total), por exemplo, um anticorpo IgG1, anticorpo IgG2a ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido.
[0201] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA, de acordo com qualquer uma dos exemplos de realização acima, pode incorporar qualquer uma das características isoladamente ou em combinação, conforme descrito no presente.
[0202] São fornecidos aqui os anticorpos anti-SIRPA. Os anticorpos fornecidos são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de doenças mediadas por SIRPA.
[0203] A presente descrição se refere, em parte, a anticorpos anti- SIRPA que exibem uma ou mais características funcionais aprimoradas e/ou melhoradas (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA que possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5), incluindo, por exemplo, anticorpos anti-SIRPA capazes de diminuir os níveis da superfície celular de SIRPA e/ou anticorpos anti-SIRPA capazes de degradar SIRPA, anticorpos anti-SIRPA capazes de diminuir os níveis celulares de CD32A/B, anticorpos anti-SIRPA capazes de aumentar ou melhorar a fagocitose, anticorpos anti-SIRPA capazes de aumentar ou melhorar a fagocitose de células tumorais por macrófagos, anticorpos anti- SIRPA capazes de aumentar ou intensificar a atividade antitumoral de terapias anticâncer, anticorpos anti-SIRPA capazes de aumentar ou melhorar a proliferação de células T, anticorpos anti-SIRPA capazes de aumentar ou intensificar a liberação de citocinas pró-inflamatórias a partir de macrófagos e/ou anticorpos anti-SIRPA capazes de ligar à SIRPA humana com cinética melhorada/aumentada; métodos para preparar e o uso de tais anticorpos anti- SIRPA; composições farmacêuticas contendo tais anticorpos anti-SIRPA; ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos anti-SIRPA; e células hospedeiras contendo ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos anti- SIRPA.
[0204] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação podem ter uma ou mais atividades que são devidas, pelo menos em parte, à capacidade dos anticorpos em reduzir a expressão celular (por exemplo, expressão na superfície celular) de SIRPA pela indução da degradação, regulação negativa, clivagem, dessensibilização do receptor e/ou direcionamento lisossomal da SIRPA. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação que diminui os níveis celulares de SIRPA é um anticorpo que exibe uma ou mais das seguintes características: (1) inibe ou reduz uma ou mais atividades de SIRPA; (2) a capacidade de reduzir a expressão de SIRPA (tal como no nível de mRNA e/ou no nível de proteína) em células que expressam SIRPA; (3) a capacidade de interagir, ligar ou reconhecer uma proteína SIRPA; (4) a capacidade de interagir especificamente ou se ligar a uma proteína SIRPA; e (5) a capacidade de tratar, melhorar ou prevenir qualquer aspecto de uma doença ou distúrbio aqui descrito ou contemplado.
[0205] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA exibem uma ou mais das seguintes propriedades: a) têm uma constante de dissociação (KD) para SIRPA humana que é inferior à de um anticorpo anti- SIRPA com uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; b) liga-se a células humanas, como monócitos e macrófagos humanos; c) diminuir os níveis de superfície celular de SIRPA (por exemplo, diminui os níveis de SIRPA na superfície celular de macrófagos humanos in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) que é inferior à de um anticorpo anti-SIRPA com uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; d) têm uma constante de dissociação (KD) para SIRPA humana que pode variar de cerca de 0,6 nM a cerca de 0,7 nM; e/ou e) diminui os níveis de SIRPA na superfície celular (por exemplo, diminui os níveis de SIRPA na superfície celular de macrófagos humanos in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) que pode variar entre cerca de 0,4 nM a cerca de 0,5 nM. Conforme divulgado neste documento a metade da concentração máxima eficaz (EC50) refere-se à concentração na qual um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação reduz os níveis celulares de SIRPA em uma célula ou em uma célula para a metade das células não tratadas, ou a concentração na qual o anticorpo atinge metade da ligação máxima à SIRPA em uma célula.
[0206] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de SIRPA v1 na superfície celular de maneira in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC 50) para a SIRPA v1 humana de cerca de 0,40 nM a 0,5 nM, conforme medido por citometria de fluxo. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de superfície celular de SIRPA in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) para SIRPA v1 humana de cerca de 5 nM, de cerca de 4 nM, de cerca de 3 nM, de cerca de 2 nM, de cerca de 1 nM, de cerca de 0,9 nM, de cerca de 0,8 nM, de cerca de 0,7 nM, de cerca de 0,6 nM, de cerca de 0,5 nM, de cerca de 0,4 nM, de cerca de 0,3 nM, de cerca de 0,2 nM, ou de cerca de 0,1 nM, conforme medido por citometria de fluxo. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de superfície celular de SIRPA in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) para SIRPA v1 humana na faixa de cerca de 5 nM a 1 nM, de cerca de 1 nM a 0,9 nM, de cerca de 1 nM a 0,8 nM, de cerca de 1 nM a 0,7 nM, de cerca de 1 nM a 0,6 nM, de cerca de 1 nM a 0,5 nM, de cerca de 1 nM a 0,4 nM, de cerca de 1 nM a 0,3 nM, de cerca de 1 nM a 0,2 nM, de cerca de 1 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,8 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,7 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,6 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,5 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,4 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,3 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,6 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,5 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,4 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,3 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,5 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,4 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,3 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,6 nM a 0,4 nM, de cerca de 0,6 nM a 0,3 nM, de cerca de 0,6 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,6 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,5 nM a 0,3 nM, de cerca de 0,5 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,5 nM a 0,1 nM, de cerca de 0,4 nM a 0,2 nM, de cerca de 0,4 nM a 0,1 nM, ou de cerca de 0,3 nM a 0,1 nM, conforme medido por citometria de fluxo.
[0207] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido,
a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de SIRPA v1 na superfície celular de maneira in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC 50) para a SIRPA v1 humana de cerca de 0,093 nM, para a SIRPA v2 humana de cerca de 0,080 nM e/ou para a cynoSIRPA de cerca de 0,879 nM, conforme medido por citometria de fluxo. Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de superfície celular de SIRPA in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) para SIRPA v1 humana ou para SIRPA v2 humana na faixa de cerca de 2 nM a 0,05 nM, de cerca de 1 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,9 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,8 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,7 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,6 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,5 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,4 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,3 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,20 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,15 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,10 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,09 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,08 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,07 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,06 nM a 0,05 nM, de cerca de 0,20 nM a 0,06 nM, de cerca de 0,15 nM a 0,06 nM, de cerca de 0,10 nM a 0,06 nM, de cerca de 0,09 nM a 0,06 nM, de cerca de 0,08 nM a cerca de 0,06 nM, de cerca de 0,07 nM a 0,06 nM, de cerca de 0,20 nM a 0,07 nM, de cerca de 0,15 nM a 0,07 nM, de cerca de 0,10 nM a cerca de 0,07 nM, de cerca de 0,09 nM a 0,07 nM, de cerca de 0,08 nM a 0,7nM, de cerca de 0,20 nM a 0,08 nM, de cerca de 0,15 nM a 0,08 nM, de cerca de 0,10 nM a 0,08 nM, de cerca de 0,09 nM a 0,08 nM, de cerca de 0,20 nM a 0,09 nM, de cerca de 0,15 nM a 0,09 nM, ou de cerca de 0,10 nM a 0,9 nM, conforme medido por citometria de fluxo.
[0208] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido,
a presente divulgação fornece um anticorpo isolado que se liga à SIRPA humana, em que o anticorpo reduz os níveis de SIRPA v1 na superfície celular de maneira in vitro com uma metade da concentração máxima eficaz (EC 50) para a SIRPA v1 humana de cerca de 0,107 nM, para a SIRPA v2 humana de cerca de 0,082 nM e/ou para a cynoSIRPA de cerca de 0,107 nM, conforme medido por citometria de fluxo.
[0209] Vantajosamente, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação reduzem a expressão da superfície celular de SIRPA de forma mais potente (por exemplo, com uma EC50 mais baixa) em comparação com um anticorpo anti-SIRPA de controle (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA de controle com uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5). Além disso, vantajosamente, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação têm uma afinidade mais alta (por exemplo, afinidade até aproximadamente 100 vezes maior) para SIRPA (por exemplo, um valor KD mais baixo medido por ressonância plasmônica de superfície) em comparação com um anticorpo anti- SIRPA de controle (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA de controle possuindo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0210] Certos aspectos da presente divulgação são baseados, pelo menos em parte, na identificação de anticorpos anti-SIRPA que exibem uma ou mais características funcionais melhoradas e/ou aumentadas (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA que possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5), incluindo, uma capacidade melhorada/aumentada para diminuir os níveis de superfície celular de SIRPA nas células, resultando na redução, neutralização, prevenção ou restrição de uma ou mais atividades de SIRPA, incluindo, sem limitação, a redução do crescimento celular de monócitos, macrófagos, células T, células dendríticas e/ou da micróglia; redução da proliferação de células T induzida por células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada, micróglia M2, macrófagos,
macrófagos M1, macrófagos M1 ativados e/ou macrófagos M2; diminuição da sobrevida de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, macrófagos M1, macrófagos M1 ativados,
macrófagos M2, monócitos, osteoclastos, células T, células T auxiliares, células
T citotóxicas, granulócitos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 e/ou micróglia
M2 ativada; diminuição da proliferação de neutrófilos, células dendríticas,
células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, macrófagos M1,
macrófagos M1 ativados, macrófagos M2, monócitos, osteoclastos, células T,
células T auxiliares, células T citotóxicas, granulócitos, micróglia, micróglia M1 micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada; inibindo a migração de neutrófilos,
células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
macrófagos, macrófagos M1, macrófagos M1 ativados, macrófagos M2,
monócitos, osteoclastos, células T, células T auxiliares, células T citotóxicas,
granulócitos, micróglia, micróglia M1 micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada;
diminuição de uma ou mais funções de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, macrófagos M1,
macrófagos M1 ativados, macrófagos M2, monócitos, osteoclastos, células T,
células T auxiliares, células T citotóxicas, granulócitos, micróglia, micróglia M1,
micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada; redução da proliferação de monócitos, macrófagos, células T, células dendríticas, neutrófilos e/ou micróglia; redução da funcionalidade geral de monócitos, macrófagos, células T, células dendríticas, neutrófilos e/ou micróglia; inibição da resposta imune benéfica a diferentes tipos de câncer selecionados a partir do câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial,
câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia,
câncer de pulmão, melanoma, Linfoma de Hodgkin, leucemia mieloide aguda,
câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer da tireoide; inibição da resposta imune benéfica a diferentes tipos de distúrbios neurológicos selecionados dentre demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista,
doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença de tauopatia, doença de Nasu-
Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, tremor essencial, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de
Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical,
encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomatosos, Sarcoidose,
doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma,
retinite pigmentosa, degeneração retinal e esclerose múltipla; ligação ao ligante de SIRPA em células tumorais; ligação ao ligante de SIRPA em células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
micróglia, células T, neutrófilos e/ou macrófagos; inibição da morte de células tumorais por uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células
T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; inibição da atividade de proliferação de células antitumorais de uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas;
inibição da atividade de metástase de células antitumorais por uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; expressão modulada de um ou mais receptores inflamatórios, como CD86, expresso em uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; aumento da infiltração de uma ou mais células dentre células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos imunossupressores e células T reguladoras em tumores; aumento do número de células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor em um tumor, no sangue periférico ou em outro órgão linfoide; aumento da atividade de promoção de tumor de células supressoras de origem mieloide; diminuição da ativação de linfócitos T tumor-específicos com potencial para matar tumor; diminuição da infiltração de linfócitos T tumor-específicos com potencial para matar o tumor; aumento da taxa de crescimento do tumor; aumento da taxa de recorrência do tumor; diminuição da eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que têm como alvo uma ou mais proteínas selecionadas dentre CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27 , GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7- H4, HVEM, LIGHT, BTLA, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD39, CD70, TREM1, TREM2, Siglec-5, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-11, SirpA, CD447, receptor CSF-1 e qualquer combinação dos mesmos, ou de um ou mais agentes quimioterápicos e/ou vacinas contra o câncer.
[0211] Em alguns exemplos de realização, o tratamento do câncer com anticorpos anti-SIRPA, conforme descrito no presente documento, pode:
(i) aumentar o número de células T CD3+ que se infiltram no tumor; (ii) diminuir os níveis celulares de SIRPA em células mieloides CD14 + não tumorigênicas,
opcionalmente em que as células mieloides CD14+ não tumorigênicas são células infiltrantes de tumor ou opcionalmente em que as células mieloides
CD14+ não tumorigênicas estão presentes no sangue; (iii) reduzir o número de células mieloides CD14+ não tumorigênicas, opcionalmente em que as células mieloides CD14+ não tumorigênicas são células infiltrantes de tumor ou,
opcionalmente, em que as células mieloides CD14+ não tumorigênicas estão presentes no sangue; (iv) reduzir os níveis de PD-L1, PD-L2, B7-H7, B7-H3,
CD200R, CD163 e/ou CD206 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras não tumorigênicas de origem mieloide (MDSC); (v) diminuir a taxa de crescimento tumoral de tumores sólidos; (vi) reduzir o volume tumoral; (vii) aumentar a eficácia de um ou mais inibidores de PD-1; (viii) aumentar a eficácia de uma ou mais terapias de inibidores de ponto de verificação (checkpoint) e/ou terapias de modulação imunológica, opcionalmente em que uma ou mais terapias de inibidores de ponto de verificação e/ou modulação imunológica têm como alvo um ou mais dentre CTL4, via de adenosina, PD-L1, PD-L2, OX40, TIM3, LAG3 ou qualquer combinação dos mesmos; (ix) aumentar a eficácia de um ou mais agentes quimioterápicos, opcionalmente em que um ou mais dos agentes quimioterápicos são gencitabina, capecitabina, antraciclinas, doxorrubicina
(Adriamycin®), epirrubicina (Ellence®), taxanos, paclitaxel (Taxol®), docetaxel
(Taxotere®), 5-fluorouracila (5-FU), ciclofosfamida (Cytoxan®), carboplatina
(Paraplatin®) e qualquer combinação dos mesmos; (x) aumentar a proliferação de células T na presença de células supressoras de origem mieloide não tumorigênicas (MDSC); (xi) inibir a diferenciação, sobrevivência e/ou uma ou mais funções de células supressoras de origem mieloide não tumorigênicas
(MDSC); e (xii) matar células imunossupressoras não tumorigênicas mieloides que expressam CD33 e/ou células não tumorigênicas que expressam CD14 em tumores sólidos e vasos sanguíneos associados quando conjugados a uma toxina química ou radioativa.
[0212] Em alguns exemplos de realização, as células mieloides da presente divulgação incluem, sem limitação, células mieloides CD45 + CD14+, células mieloides CD14+ e células supressoras de origem mieloide (MDSC).
Em alguns exemplos de realização, as células mieloides da presente divulgação são células mieloides não tumorigênicas. As células imunossupressoras por vezes também são chamadas de células supressoras de origem mieloide (MDSC). Em humanos, as MDSCs podem ser definidas pelas seguintes combinações de marcadores: (1) CD14+ HLA-DRlow/−, (2) CD14+ IL4Rα+, (3) CD14+ HLA-DR− IL4Rα+, (4) CD34+ CD14+ CD11b+ CD33+, (5) CD11b+ CD14+ CD33+, (6) CD33+ HLA-DR−, (7) Lin− HLA-DR−, (8) Lin− HLA- DR− CD33+, (9) Lin− HLA-DR− CD33+ CD11b+, (10) Lin− CD33+ CD11b+ CD15+, (11) Lin− HLA-DR− CD33+ CD11b+ CD14− CD15+, (12) CD11b+ CD14− CD33+, (13) CD11b+ CD14− HLA-DR− CD33+ CD15+, (14) CD33+ HLA-DR− CD15+, (15) CD15+ IL4Rα+, (16) CD11b+ CD15+ CD66b+, (17) CD15+ FSClow SSChigh, (18) CD15high CD33+, (19) CD11b+ CD14− CD15+, (20) CD66b+ SSChigh, e (21) CD11b+ CD15+ (consulte também Solito S et al. Annals of the NY Academy of Sciences, 2014). Em camundongos, as MDSCs podem ser definidas pela expressão dos marcadores de superfície CD45+, CD11b+, Gr1+ e/ou Il4Ra+.
Linhagens monocíticas imunossupressoras exemplares adicionais são CD45+, CD11b+, Gr1low; e CD45+, CD11c+.
[0213] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação diminui os níveis de superfície celular de SIRPA, diminui os níveis intracelulares de SIRPA, diminui os níveis celulares totais de SIRPA, ou qualquer combinação dos mesmos, apenas na presença de ligantes naturais de SIRPA ou parceiros de ligação.
[0214] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação previne, reduz ou inibe a atividade mediada por SIRPA de um ligante ou parceiro de ligação de SIRPA, incluindo, por exemplo, o ligante de SIRPA ou parceiro de ligação CD47, proteína surfactante A e/ou proteína surfactante D.
[0215] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação liga-se seletivamente à SIRPA humana, incluindo variantes alélicas humanas, também referidas no presente documento como variantes “polimórficas” , incluindo a SIRPA v1 humana e SIRPA v2 humana , liga-se à SIRPβ3 humana, SIRPA de cinomolgos (cynoSIRPA) e SIRPA de sagui. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação não se liga à SIRPA de camundongo/murino, não se liga à SIRPB v1 (SIRPβ1), não se liga à SIRPA de coelho e não se liga à SIRPA de rato.
[0216] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação liga-se seletivamente à SIRPA humana. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se seletivamente à SIRPA humana e cynoSIRPA. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga- se à SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana e cynoSIRPA. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana e cynoSIRPA, mas não liga-se à SIRPA murina. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana e cynoSIRPA, mas não liga-se à SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana e cynoSIRPA, mas não liga-se à SIRPA murina e não liga- se à SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se à SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana, cynoSIRPA e SIRPAβ3 humana, mas não liga-se à SIRPA murina e não liga-se à SIRPβ1. Em qualquer combinação dos exemplos de realização acima, um anticorpo anti-SIRPA da presente invenção não bloqueia a ligação ou interação de SIRPA e CD47.
[0217] Certos aspectos da presente divulgação referem-se a anticorpos anti-SIRPA que regulam negativamente, ou seja, diminuem os níveis celulares de SIRPA. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti- SIRPA diminui os níveis celulares de SIRPA sem inibir, bloquear ou reduzir a interação (por exemplo, ligação) entre SIRPA e um ou mais ligantes de SIRPA, por exemplo, CD47.
[0218] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação podem ter uma ou mais atividades que são devidas, pelo menos em parte, à capacidade dos anticorpos em reduzir os níveis celulares (por exemplo, expressão na superfície celular) de SIRPA pela indução da degradação, regulação negativa, clivagem, dessensibilização do receptor e/ou direcionamento lisossomal da SIRPA.
[0219] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de SIRPA nas células. Em alguns exemplos de realização, a regulação negativa da expressão de SIRPA em células é a expressão na superfície celular SIRPA reduzida. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de SIRPA em monócitos (por exemplo, monócitos humanos). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de SIRPA em macrófagos (por exemplo, macrófagos humanos). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente invenção regula negativamente a expressão de SIRPA na superfície celular de macrófagos em mais de 70%, em mais de 75%, em mais de 80%, em mais de 85% ou em mais de 95% em comparação com o nível de expressão de SIRPA na superfície celular em macrófagos não tratados com um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de SIRPA na superfície celular de macrófagos em cerca de 70-90%, em cerca de 70-85%, em cerca de 70-80%, mas cerca de 70- 75%, em cerca de 75-90%, em cerca de 75-85%, em cerca de 75-80% em cerca de 80-90%, em cerca de 80-85% ou em cerca de 85-95% em comparação com o nível de expressão de SIRPA na superfície celular de macrófagos não tratados com um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação.
Em alguns exemplos de realização, os macrófagos são macrófagos humanos, incluindo, mas não se limitando a macrófagos M1 humanos e macrófagos M2 humanos.
[0220] Os níveis celulares de SIRPA podem referir-se a, sem limitação, a níveis de SIRPA na superfície celular, níveis de SIRPA intracelulares e níveis totais de SIRPA. Em alguns exemplos de realização, uma diminuição nos níveis celulares de SIRPA compreende uma diminuição nos níveis de SIRPA na superfície celular. Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo anti-SIRPA diminui os níveis de SIRPA na superfície celular se induzir uma diminuição de 25% ou mais nos níveis de SIRPA na superfície celular conforme medido por quaisquer ensaios baseados em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito na presente invenção ou conhecido no estado da técnica, por exemplo, utilizando citometria de fluxo, tal como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), para medir os níveis de superfície celular de SIRPA. Em alguns exemplos de realização, uma diminuição nos níveis celulares de SIRPA compreende uma diminuição nos níveis intracelulares de SIRPA. Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo anti-SIRPA diminui os níveis intracelulares de Siglec-9 se induzir uma diminuição de 25% ou mais nos níveis intracelulares de SIRPA conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito na presente invenção ou conhecido no estado da técnica, por exemplo, imunocoloração, análise de Western blot, coimunoprecipitação e citometria celular. Em alguns exemplos de realização, uma diminuição nos níveis celulares de SIRPA compreende uma diminuição nos níveis totais de SIRPA. Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo anti-SIRPA diminui os níveis totais de SIRPA se induzir uma diminuição de 25% ou mais nos níveis totais de SIRPA conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito na presente invenção ou conhecido no estado da técnica, por exemplo, imunocoloração, análise de Western blot, coimunoprecipitação e citometria celular. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA induzem a degradação de SIRPA, clivagem de SIRPA, internalização de SIRPA, derramamento de SIRPA, regulação negativa da expressão de SIRPA ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, os níveis celulares de SIRPA são medidos em células primárias (por exemplo, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia e macrófagos) ou em linhagens celulares utilizando um ensaio celular de SIRPA.
[0221] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA de regulação negativa tem uma IC50 de 200 nM ou menos, normalmente 100 nM ou menos (50% da SIRPA expressa na superfície celular é regulado negativamente), após 4 horas de exposição de macrófagos humanos ao anticorpo a 37ºC. Em alguns exemplos de realização, a SIRPA permanece regulado negativamente por pelo menos 24 horas da exposição a um anticorpo da presente invenção. As células podem ser analisadas quanto à expressão de SIRPA na superfície usando qualquer tecnologia, por exemplo, citometria de fluxo.
[0222] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação diminuem os níveis celulares de SIRPA em pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 34%, pelo menos 35%, pelo menos 36%, pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, pelo menos 40%, pelo menos 41%, pelo menos 42%, pelo menos 43%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49%, pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com os níveis celulares de SIRPA na ausência do anticorpo anti-SIRPA.
[0223] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer uma das atividades de regulação negativa resumidas nos parágrafos anteriores, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação inibe o agrupamento de SIRPA na superfície celular.
[0224] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação desregula a SIRPA, mas não bloqueia, inibe ou reduz a ligação de um ligante SIRPA, por exemplo, CD47, ao SIRPA. No contexto da presente invenção, um anticorpo direcionado contra SIRPA que não bloqueia a ligação de CD47 à SIRPA refere-se a um anticorpo que não resulta em uma diminuição significativa na ligação de CD47 à SIRPA quando o anticorpo é incubado com CD47 e células que expressam SIRPA. Uma “diminuição significativa” no contexto da ligação de CD47 à SIRPA refere-se a uma diminuição na ligação de 30% ou menos, normalmente pelo menos 25%, pelo menos 20%, pelo menos 15% ou pelo menos 10% ou menos em comparação com CD47 que liga-se à SIRPA na presença de um anticorpo de controle isotípico compatível que não se liga a SIRPA. Um ensaio ilustrativo para avaliar a atividade de bloqueio é apresentado nos exemplos do presente documento. Por exemplo, as células que expressam SIRPA humana, por exemplo, macrófagos humanos ou células como células CHO que são modificadas para expressar SIRPA humana de forma recombinante, são semeadas a 105 células/poço em uma placa de 96 poços, lavadas e incubadas em 100 μL tampão para FACS contendo 1,0 μg/mL de anticorpo monoclonal ou controle isotípico. As células são então lavadas e incubadas com CD47 humano solúvel durante 30 minutos em gelo. As células são então analisadas para CD47 ligado à superfície.
[0225] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente invenção regula negativamente a expressão de CD32A/B nas células (ou seja, FcγRIIA/FcγRIIB). Em alguns exemplos de realização, a regulação negativa da expressão de CD32A/B (ou seja, FcγRIIA/FcγRIIB) em células é a expressão reduzida de CD32A/B (ou seja, FcγRIIA/FcγRIIB) na superfície celular. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de CD32A/B em macrófagos (por exemplo, macrófagos humanos). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRP da presente divulgação regula negativamente a expressão de CD32A (ou seja, FcγRIIA) em macrófagos (por exemplo, macrófagos humanos). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente invenção regula negativamente a expressão de CD32B (ou seja, FcγRIIB) em macrófagos (por exemplo, macrófagos humanos). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de CD32A (isto é, FcγRIIA) na superfície celular em macrófagos humanos em cerca de 75%, em cerca de 80% ou em cerca de 85% em comparação com o nível de expressão de CD32A na superfície celular de macrófagos humanos não tratados com um anticorpo anti-SIRPA da presente invenção. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão de CD32A na superfície celular em macrófagos humanos em cerca de 70-85% em comparação com o nível de expressão de CD32A na superfície celular de macrófagos humanos não tratados com um anticorpo anti-SIRPA da presente invenção. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação regula negativamente a expressão na superfície celular de CD32B (ou seja, Fc γRIIB) em macrófagos humanos para níveis indetectáveis.
[0226] Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos, tais como anticorpos isolados (por exemplo, monoclonais), que interagem com ou de outra forma ligam-se a uma região, como um epítopo, dentro de uma proteína SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos interagem ou ligam-se a uma região, tal como um epítopo, dentro de uma proteína SIRPA da presente divulgação com cinética melhorada/aprimorada (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA que possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos interagem com ou ligam-se a uma região, como um epítopo, dentro de uma proteína SIRPA em células humanas, como células dendríticas, células mieloides, monócitos, macrófagos, etc. com metade da concentração máxima eficaz (EC50) que é inferior ao de um anticorpo de controle (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA possuindo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo o aminoácido sequência da SEQ ID NO: 5). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação ligam-se a uma proteína SIRPA e modulam uma ou mais atividades de SIRPA após a ligação à proteína SIRPA, por exemplo, uma atividade associada à expressão de SIRPA em uma célula. As proteínas SIRPA da presente divulgação incluem, sem limitação, uma proteína SIRPA de mamífero, proteína SIRPA humana, proteína SIRPA de camundongo, proteína SIRPA de cinomolgos e proteína SIRPA de rato.
[0227] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente divulgação podem ligar-se à SIRPA de uma maneira dependente do pH. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente descrição podem ligar-se à SIRPA em um pH neutro e serem internalizados sem se dissociarem da proteína SIRPA. Alternativamente, em um pH ácido, os anticorpos da presente descrição podem se dissociar de SIRPA uma vez internalizados e depois degradados pela via do endossoma/lisossomo. Em certos exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA liga-se à SIRPA em um pH que varia de 5,5 a 8,0, de 5,5 a 7,5, de 5,5 a 7,0, de 5,5 a 6,5, de 5,5 a 6,0, de 6,0 a 8,0, de 6,5 a 8,0, de 7,0 a 8,0, de 7,5 a 8,0, de 6,0 a 7,5, de 6,0 a 7,0, de 6,5 a 7,5. Em certos exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA se dissocia da SIRPA em um pH inferior a 6,0, inferior a 5,5, inferior a 5,0, inferior a 4,5, inferior a 4,0, inferior a 3,5, inferior a 3,0, inferior a 2,5 ou inferior a 2,0.
[0228] A SIRPA é uma proteína de membrana tipo I de passagem única. Dentro da sequência de aminoácidos da SIRPA humana (SEQ ID NO: 1), um domínio extracelular está localizado nos resíduos de aminoácidos 31- 373; um domínio transmembranar está localizado nos resíduos de aminoácidos 374-394; e um domínio intracelular está localizado nos resíduos de aminoácidos 395-504. A SIRPA humana compreende um único conjunto V e dois conjuntos C1 de domínios da superfamília Ig (IgSF), referidos como domínio D1, domínio D2 e domínio D3, respectivamente. O domínio D1 compreende os resíduos de aminoácidos 32-137 da SIRPA humana; o domínio D2 compreende os resíduos de aminoácidos 148-247 da SIRPA humana; e o domínio D3 compreende os resíduos de aminoácidos 254-348 da SIRPA humana. Como um versado na técnica apreciará, os resíduos de início e término dos domínios da presente divulgação podem variar dependendo do programa de modelagem de computador usado ou do método usado para determinar o domínio.
[0229] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação se liga ao domínio D3 da SIRPA. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga- se ao domínio D3 da SIRPA humana compreendendo os resíduos de aminoácidos 254-348 da sequência de aminoácidos da SIRPA humana de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se a um epítopo dentro do domínio D3 da SIRPA humana. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se a um epítopo dentro do domínio D3 da SIRPA humana, em que o epítopo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de resíduos de aminoácidos 254-348, resíduos de aminoácidos 254-274, resíduos de aminoácidos 264-279, resíduos de aminoácidos 274-289, resíduos de aminoácidos 273-331, resíduos de aminoácidos 281-315, resíduos de aminoácidos 281-337, resíduos de aminoácidos 284-299, resíduos de aminoácidos 294-309, aminoácidos resíduos 304-319, resíduos de aminoácidos 314-329, resíduos de aminoácidos 324-339 e resíduos de aminoácidos 334-348 da sequência de aminoácidos da SIRPA humana de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se a um epítopo dentro do domínio D3 da SIRPA humana, em que o epítopo inclui os resíduos de aminoácidos R282, Q284 e G337 da sequência de aminoácidos da SIRPA v1 humana (SEQ ID NO: 1). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se a um epítopo dentro do domínio D3 da SIRPA humana, em que o epítopo inclui resíduos de aminoácidos Q281, R282, Q284, L285, W287, R295, E297, V302 e W315 da sequência de aminoácidos da SIRPA v1 humana (SEQ ID NO: 1).
[0230] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se ao domínio D3 da SIRPA, por exemplo, SIRPA humana. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação liga-se ao mesmo epítopo da SIRPA ou parte do epítopo da SIRPA ligado por um anticorpo possuindo as CDRs do anticorpo designado como m3F9, conforme descrito neste documento. Consequentemente, em alguns exemplos de realização, um anticorpo da presente divulgação liga-se ao mesmo epítopo da SIRPA ou parte do epítopo da SIRPA ligado por um anticorpo possuindo as CDRs do anticorpo designados como m3F9, conforme descrito neste documento.
[0231] Certos aspectos da presente divulgação são baseados, pelo menos em parte, na identificação de anticorpos anti-SIRPA que exibem uma ou mais características funcionais melhoradas e/ou aumentadas (por exemplo, em relação a um anticorpo anti-SIRPA que possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5), incluindo, uma capacidade melhorada/aumentada para diminuir os níveis de superfície celular de SIRPA nas células, resultando na redução, neutralização, prevenção ou restrição de uma ou mais atividades de SIRPA, incluindo, sem limitação, a redução do crescimento celular de monócitos, macrófagos, células T, células dendríticas e/ou da micróglia; a redução da proliferação de células T induzida por células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada, micróglia M2, macrófagos,
macrófagos M1, macrófagos M1 ativados e/ou macrófagos M2; a diminuição da sobrevida de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, células NK, macrófagos M1, neutrófilos M1, células
NK M1, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células NK M1 ativadas, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T auxiliares, células T citotóxicas, granulócitos,
micróglia, micróglia M1, micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada(s); a diminuição ou redução da proliferação de neutrófilos, células dendríticas,
células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, células NK,
macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos M1 ativados,
neutrófilos M1 ativados, células NK M1 ativadas, macrófagos M2, neutrófilos
M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos, células T, células T auxiliares,
células T citotóxicas, granulócitos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada(s); a inibição da migração de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos,
células NK, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células NK M1 ativadas, macrófagos M2,
neutrófilos M2, Células NK M2, monócitos, osteoclastos, células T, células T auxiliares, células T citotóxicas, granulócitos, micróglia, micróglia M1, micróglia
M1 e/ou micróglia M2 ativada(s); a diminuição ou inibição de uma ou mais funções de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, células NK, macrófagos M1, neutrófilos M1, células
NK M1, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células NK M1 ativadas, macrófagos M2, Neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T auxiliares, células T citotóxicas, granulócitos,
micróglia, micróglia M1, micróglia M1 e/ou micróglia M2 ativada(s); a redução da proliferação de monócitos, macrófagos, células T, células dendríticas,
neutrófilos e/ou micróglia; a redução da funcionalidade geral de monócitos,
macrófagos, células T, células dendríticas, neutrófilos e/ou micróglia; a inibição da resposta imune benéfica a diferentes tipos de câncer selecionados de câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, Linfoma de Hodgkin,
leucemia mieloide aguda, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide; a inibição da resposta imune benéfica a diferentes tipos de distúrbios neurológicos selecionados de demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular,
demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal,
esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença de tauopatia,
doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, tremor essencial, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager,
paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical,
encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomatosos, sarcoidose,
doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração retinal e esclerose múltipla; a ligação do ligante de SIRPA em células tumorais; a ligação do ligante de SIRPA em células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
micróglia, células T, neutrófilos e/ou macrófagos; a inibição da morte de células tumorais por um ou mais de micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; a inibição da atividade de proliferação de células antitumorais de uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos,
células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos,
células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; a inibição da atividade de metástase de células antitumorais por uma ou mais células dentre micróglia,
macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; a modulação da expressão de um ou mais receptores inflamatórios, como CD86,
expresso em uma ou mais células dentre micróglia, macrófagos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células
T, células T auxiliares ou células T citotóxicas; o aumento da infiltração de uma ou mais células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos imunossupressores e células T reguladoras em tumores; a promoção ou resgate da funcionalidade de uma ou mais células dentre células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores,
neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor e células T reguladoras; o aumento da infiltração de uma ou mais células dentre células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressoras, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células mieloides não tumorigênicas
CD45+ CD14+ e células T reguladoras em tumores; o aumento do número de células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor em um tumor, no sangue periférico ou em outro órgão linfoide; o aumento da atividade de promoção de tumor de células supressoras derivadas de mieloide; a diminuição da ativação de linfócitos T tumores-específicos com potencial para matar o tumor; o aumento da sobrevida de células supressoras não tumorigênicas de origem mieloide e/ou células mieloides não tumorigênicas CD45+ CD14+; a diminuição da infiltração e/ou ativação de linfócitos T tumor- específicos com potencial de matar tumores; o aumento da taxa de crescimento do tumor; o aumento da taxa de recorrência do tumor; a diminuição da eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que têm como alvo uma ou mais proteínas selecionadas a partir de CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4 -1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD39, CD70, TREM1, TREM2, Siglec-5, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-11, receptor SIRPA, CD447, CSF-1 e qualquer combinação dos mesmos, ou de um ou mais agentes quimioterápicos e/ou vacinas contra o câncer.
[0232] Em alguns exemplos de realização, que podem ser combinados com qualquer uma das outros exemplos de realização acima, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação induz, aumenta ou aumenta uma ou mais atividades, incluindo: (i) aumentar o número de infiltração no tumor de células T CD3+; (ii) diminuir os níveis celulares de SIRPA em células mieloides não tumorigênicas CD14+, opcionalmente, em que as células mieloides não tumorigênicas CD14+ são células tumorais que se infiltram, ou, facultativamente, em que as células mieloides não tumorigênicas CD14 + estão presentes no sangue; (iii) reduzir o número de células mieloides não tumorigênicas CD14+, opcionalmente, em que as células mieloides não tumorigênicas CD14+ são células tumorais que se infiltram, ou, facultativamente, em que as células mieloides não tumorigênicas CD14 + estão presentes no sangue; (iv) reduzir os níveis de PD-L1, PD-L2, B7-H2, B7-H3, CD200R, CD163 e/ou CD206 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras de origem mieloide (MDSC) não tumorigênicas; (v) diminuir a taxa de crescimento tumoral de tumores sólidos; (vi) reduzir o volume tumoral; (vii) aumentar a eficácia de um ou mais inibidores de PD-1; (viii) aumentar a eficácia de uma ou mais terapias com inibidor de ponto de verificação imunológico e/ou de modulação imunológica, opcionalmente em que a uma ou mais terapias com inibidor de ponto de verificação imunológico e/ou de modulação imunológica têm como alvo um ou mais dentre CTL4, via da adenosina, PD-L1, PD-L2, OX40, TIM3, LAG3 ou qualquer combinação dos mesmos; (ix) aumentar a eficácia de um ou mais agentes quimioterápicos, opcionalmente em que o um ou mais dos agentes quimioterápicos são gemcitabina, capecitabina, antraciclinas, doxorrubicina (Adriamicina®), epirubicina (Ellence®), taxanos, o paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), 5-fluorouracila (5-FU), ciclofosfamida (Cytoxan®), carboplatina (Paraplatin®), e qualquer combinação dos mesmos; (x) aumento da proliferação de células T na presença de células supressoras de origem mieloide (MDSC) não tumorigênicas; (xi) inibir a diferenciação, sobrevivência e/ou uma ou mais funções de células supressoras de origem mieloide (MDSC) não tumorigênicas; e (xii) matar células mieloides não tumorigênicas imunossupressoras que expressam CD33 e/ou células não tumorigênicas que expressam CD14 em tumores sólidos e vasos sanguíneos associados quando conjugados a uma toxina química ou radioativa.
[0233] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição diminuem a funcionalidade ou sobrevida de células T reguladoras, células dendríticas imunossupressoras inseridas em tumores, macrófagos imunossupressores inseridos em tumores, células supressoras de origem mieloide, macrófagos associados aos tumores, células de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e/ou de leucemia mieloide crônica (CML).
[0234] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação induz ou promove a sobrevida, maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de uma ou mais células imunes, por exemplo, uma ou mais células imunes selecionadas a partir de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células NK, micróglia, células T, células T auxiliares, células T citotóxicas e qualquer combinação das mesmas em um indivíduo.
AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPA
[0235] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem uma constante de dissociação (Kd) <1 μM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM ou <0,001 nM (por exemplo,10-8 M ou menos, por exemplo, de10-8 M a10-13 M, por exemplo, de10-9 M a10-13 M). As constantes de dissociação podem ser determinadas por qualquer técnica analítica, incluindo qualquer técnica bioquímica ou biofísica, tal como ELISA, ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria BioLayer (consultar, por exemplo, Octet System por ForteBio), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), calorimetria de varredura diferencial (DSC), dicroísmo circular (CD), análise de fluxo interrompido e análise colorimétrica ou análises de fusão com proteína fluorescente. Em um exemplo de realização, a Kd é medida por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA). Em alguns exemplos de realização, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, por exemplo, conforme descrito em Chen et al. J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Em alguns exemplos de realização, o valor de Kd é medido usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE, por exemplo, um ensaio usando um instrumento BIACORE-2000 ou um instrumento BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25ºC com antígeno imobilizado chips CM5 em ~ 10 unidades de resposta (RU). Em alguns exemplos de realização, o KD é determinado usando um anticorpo monovalente (por exemplo, um Fab) ou um anticorpo de comprimento total (completo). Em alguns exemplos de realização, o valor de KD é determinado usando um anticorpo de comprimento total em uma forma monovalente.
FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
[0236] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão dos fragmentos scFv, consulte, por exemplo, o documento WO 93/16185; e as Patentes US
5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão de fragmentos Fab e F(ab') 2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação do receptor de recuperação e tendo meia-vida in vivo aprimorada, vide a Patente US 5.869.046.
[0237] Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos.
Consulte, por exemplo, EP404097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med.
9:129- 134 (2003). Os triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (consulte, por exemplo, a Patente US 6248516).
[0238] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando à digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito neste documento.
ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[0239] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo quimérico.
Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US.
4.816.567. Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em ainda outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe trocada”, em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo de origem. Anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno destes.
[0240] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade em seres humanos, enquanto mantém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano precursor. Em certos exemplos de realização, um anticorpo humanizado é substancialmente não imunogênico em humanos. Em certos exemplos de realização, um anticorpo humanizado tem substancialmente a mesma afinidade para um alvo que um anticorpo de outra espécie da qual o anticorpo humanizado é derivado.
Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.530.101, US 5.693.761; US
5.693.762; e US 5.585.089. Em certos exemplos de realização, os aminoácidos de um domínio variável de anticorpo que podem ser modificados sem diminuir a afinidade nativa do domínio de ligação ao antígeno enquanto reduzem sua imunogenicidade são identificados. Vide, por exemplo, as Patentes US
5.766.886 e US 5.869.619. De modo geral, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, nos quais as HVRs (ou porções destas), são derivadas de um anticorpo não humano e as FRs (ou porções destas) são derivadas das sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá adicionalmente pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[0241] Anticorpos humanizados e métodos de fazê-los são revistos, por exemplo, em Almagro et al. Front. Biosci. 13:161 9-1633 (2008), e são descritos ainda, por exemplo, nas Patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409. As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); e Presta et al., J.
Immunol. 151:2623 (1993)); regiões estruturais (mutadas somaticamente) maduras humanas ou regiões estruturais de linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro e Fransson Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al. J. Biol. Chem.
271:22611-22618 (1996)).
ANTICORPOS HUMANOS
[0242] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humano.
Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
[0243] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. É possível manipular cepas de camundongo deficientes na produção de anticorpos de camundongos com grandes fragmentos dos loci de Ig humanas na expectativa de que tais camundongos produzam anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camundongo. Grandes fragmentos de Ig humanas podem preservar uma grande diversidade de gene variável, bem como a regulação adequada de produção e de expressão de anticorpos. Através da exploração da maquinaria de camundongo para diversificação de anticorpo e seleção e a falta de tolerância imunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpo humano reproduzido nestas cepas de camundongo podem produzir anticorpos de afinidade elevada completamente humanos contra qualquer antígeno de interesse, incluindo antígenos humanos. Usando a tecnologia de hibridomas, mAbs humanos antígeno-específicos com a especificidade desejada podem ser prontamente produzidos e selecionados. Alguns métodos exemplificativos são descritos na Patente US 5.545.807, EP 546073 e EP 546073. Consulte também, por exemplo, as Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 descrevendo a tecnologia XENOMOUSE®; Patente US 5.770.429 descrevendo a tecnologia HUMAB®; a Patente US 7.041.870 descrevendo a tecnologia K-M MOUSE® e a Publicação do Pedido de Patente US 2007/0061900, descrevendo a tecnologia VELOCIMOUSE®. As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser modificadas ainda, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.
[0244] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos baseados em hibridoma. As linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol.
133:3001 (1984) e Boerner et al. J. Immunol. 147:86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados através da tecnologia do hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 03:3557-3562 (2006). Os métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente US 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens de células de hibridoma). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers et al.
Histology and Histopathology 20(3) :927-937 (2005) e Vollmers et al. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91 (2005).
Os anticorpos humanos também podem ser gerados por meio do isolamento das sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.
[0245] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humano isolado por métodos in vitro e/ou triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas.
Exemplos adequados incluem, mas não se limitam a, exibição de fagos (CAT, Morphosys, Dyax,
Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon),
Affimed) exibição de ribossomo (CAT), plataformas baseadas em leveduras
(Adimab) e similares.
Em certos métodos de exibição de fago, repertórios de genes de VH e VL são separadamente clonados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e aleatoriamente recombinados em bibliotecas de fagos, que podem então ser triadas por fagos de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al.
Ann.
Rev.
Immunol. 12: 433-455 (1994). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida no estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas.
Consulte também Sidhu et al.
J.
Mol.
Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al.
J.
Mol.
Biol. 340(5): 1073-
1093, 2004; Fellouse Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 101(34):12467-12472 (2004);
e Lee et al.
J.
Immunol.
Methods 284( - 2):1 19-132 (2004). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) quanto como fragmentos Fab.
As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas.
Alternativamente, o repertório inicial
(naive) pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos, para uma ampla faixa de antígenos não próprios (non-self) e também próprios (self), sem qualquer imunização,
conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente,
bibliotecas iniciais (naïves) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem de segmentos de gene V não rearranjados a partir de células tronco, e utilizando primers de PCR que compreendem sequências aleatórias para codificar as regiões HVR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom et al., J.
Mol.
Biol., 227:
381-388 (1992). As publicações de patentes descrevendo bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente US 5.750.373, e Publicações de Patentes US 2007/0292936 e US 2009/0002360. Os anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos neste documento.
REGIÕES CONSTANTES INCLUINDO REGIÕES FC
[0246] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos anti-SIRPA fornecidos no presente, o anticorpo compreende um Fc.
Em alguns exemplos de realização, o Fc é um isotipo de IgG1, IgG2, IgG3 e/ou IgG4 humana. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA.
[0247] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG2 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA induz uma ou mais atividades de SIRPA ou independentemente da ligação a um receptor Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB).
[0248] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG1 de camundongo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG1 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante da IgG1 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB).
[0249] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG4 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB).
[0250] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG2/4 híbrido. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo inclui uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 118 a 260 de acordo com a numeração EU da IgG2 humana e os aminoácidos 261-447 de acordo com a numeração EU da IgG4 humana (WO 1997/11971; WO 2007/106585).
[0251] Em alguns exemplos de realização, a região Fc aprimora o agrupamento sem ativar o complemento em comparação com um anticorpo correspondente compreendendo uma região Fc que não compreende as substituições de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo induz uma ou mais atividades de um alvo especificamente ligado pelo anticorpo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se à SIRPA.
[0252] Também pode ser desejável modificar um anticorpo anti- SIRPA da presente descrição para modificar a função efetora e/ou aprimorar a meia-vida sérica do anticorpo. Por exemplo, o sítio de ligação ao receptor Fc na região constante pode ser modificado ou mutado para remover ou reduzir a afinidade de ligação a certos receptores Fc, como FcγRI, FcγRII, e/ou FcγRIII para reduzir a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo.
Em alguns exemplos de realização, a função efetora é prejudicada pela remoção da N-glicosilação da região Fc (por exemplo, no domínio CH2 da IgG) do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, a função efetora é prejudicada pela modificação de regiões como 233-236, 297 e/ou 327-331 da IgG humana, conforme descrito no documento WO 99/58572 e Armor et al.
Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al. J. Immunology 164:1925- 1933 (2000). Em outros exemplos de realização, também pode ser desejável modificar um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição para modificar a função efetora para melhorar a seletividade de busca contra o FcγRIIb contendo ITIM (CD32b) para aprimorar o agrupamento de anticorpos SIRPA em células adjacentes sem ativar respostas humorais, incluindo citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos e fagocitose celular dependente de anticorpos.
[0253] Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação tipo receptor de recuperação nos anticorpos (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito na Patente US
5.739.277, por exemplo. Da forma como utilizada no presente, a expressão “epítopo de ligação do receptor de recuperação” designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida da molécula de IgG in vivo no soro.
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[0254] Os multiespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, incluindo aqueles no mesmo ou em outro polipeptídeo (por exemplo, um ou mais polipeptídeos SIRPA da presente descrição). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo biespecífico. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo triespecífico. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo tetraespecífico. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’)2). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico compreende uma primeira região de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro sítio na SIRPA e compreende uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga ao segundo sítio na SIRPA.
Em alguns exemplos de realização, os anticorpos multiespecíficos compreendem uma primeira região de ligação ao antígeno que se liga à SIRPA e uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga a um segundo polipeptídeo.
[0255] São fornecidos neste documento anticorpos multiespecíficos que compreendem uma primeira região de ligação ao antígeno, em que a primeira região de ligação ao antígeno compreende as seis HVRs de um anticorpo descrito neste documento, que se liga à SIRPA e uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga a um segundo polipeptídeo.
Em alguns exemplos de realização, a primeira região de ligação ao antígeno compreende a VH ou VL de um anticorpo descrito neste documento.
[0256] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica. Inúmeros antígenos são conhecidos na técnica que facilitam o transporte através da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Gabathuler R. Neurobiol. Dis. 37:48-57 (2010)). Esses segundos antígenos incluem, sem limitação, receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas 1 e 2 relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LPR-1 e 2), receptor da toxina da difteria, incluindo CRM197 (um mutante não tóxico da toxina da difteria), TMEM 30(A) (Flippase), domínios de transdução de proteínas, tais como TAT, Syn-B ou penetratina, poli-arginina ou peptídeos geralmente positivamente carregados, peptídeos Angiopep como ANG1005 (consulte, por exemplo, Gabathuler, 2010) e outras proteínas da superfície celular que são enriquecidas em células endoteliais da barreira hematoencefálica (consulte, por exemplo, Daneman et al. PLoS One 5(10):e13741 (2010)).
[0257] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é uma proteína causadora de doença selecionada a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, Proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpos de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo de ilhota amiloide, insulina, apolipoproteína A1, amiloide A sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina A1, proteína S-IBM, associada à repetição produtos de tradução não ATG (RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina- alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição prolina-alanina (PA), ubiquitina, peptídeos de repetição prolina-arginina (PR); (d) ligantes e/ou proteínas expressas em células imunes, em que os ligantes e/ou proteínas selecionadas a partir de CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA-4, PD- L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 e fosfatidilserina; e/ou (e) uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais e qualquer combinação dos mesmos.
[0258] Os anticorpos multivalentes podem reconhecer o antígeno
SIRPA, bem como, sem limitação, antígenos adicionais, como um antígeno peptídico Aβ, antígeno de proteína α-sinucleína, antígeno de proteína Tau, antígeno de proteína TDP-43, antígeno de proteína de príon, antígeno de proteína de huntingtina, antígenos de produtos de tradução RAN (incluindo as repetições de DiPeptídeos, (peptídeos DPRs) compostos de glicina-alanina (GA), glicina-prolina (GP), glicina-arginina (GR), prolina-alanina (PA) ou prolina- arginina (PR)), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina ou receptor de transferrina ou qualquer outro antígeno que facilite a transferência de anticorpos através da barreira hematoencefálica.
Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é transferrina. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é Tau. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é Aβ. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é TREM2. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é α- sinucleína.
[0259] O anticorpo multivalente contém pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em que a cadeia polipeptídica compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender VD1-(X1)n- VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Da mesma forma, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender cadeia da região VH- CH1-ligante flexível-VH-CH1-Fc; ou cadeia da região VH-CH1-VH-CH1-Fc. O anticorpo multivalente na presente invenção, preferencialmente compreende ainda de pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender entre cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve contemplados na presente invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e compreendem, opcionalmente, um domínio CL.
[0260] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina com especificidades diferentes (ver Milstein e Cuello Nature 305: 537 (1983), documento WO 93/08829 e Traunecker et al.
EMBO J. 10: 3655 (1991)) e manipulação “knob-in-hole” (consulte, por exemplo, a Patente US 5.731.168). Vide também o documento WO 2013/026833 (CrossMab).
Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de manipulação para a produção de moléculas Fc- heterodiméricas de anticorpos (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos (consulte, por exemplo, Patente US 4.676.980); usando leucina; usando a tecnologia “diacorpo” (diabody) para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993); e usando dímeros de cadeia única Fv (scFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al. J. Immunol. 152: 5368 (1994)); e preparar anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, in Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0261] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos octopus”, são também incluídos neste documento (consulte, por exemplo, US 2006/0025576). O anticorpo neste documento também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga a múltiplas SIRPAs (consulte, US 2008/0069820, por exemplo).
VARIANTES DE ANTICORPOS
[0262] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, são contempladas variantes de sequência de aminoácidos dos anticorpos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo.
VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO
[0263] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, são fornecidas variantes de anticorpo com uma ou mais substituições de aminoácidos. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo, ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo.
TABELA 1
SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[0264] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas por meio da seleção de substituições que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0265] Por exemplo, as substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima por um membro de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos, por exemplo, em regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos não humanos, ou nas regiões não homólogas da molécula.
[0266] Ao fazer alterações no polipeptídeo ou anticorpo descrito neste documento, de acordo com certos exemplos de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. São eles: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (−0,4); treonina (−0,7); serina (−0,8); triptofano (−0,9); tirosina (−1,3); prolina (−1,6); histidina (−3,2); glutamato (−3,5); glutamina (−3,5); aspartato (−3,5); asparagina (-3,5); lisina (−3,9); e arginina (−4,5).
[0267] A importância do índice de aminoácido hidropático para conferir função biológica interativa numa proteína é compreendida na técnica.
Kyte et al. J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Sabe-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos com um índice ou pontuação hidropática semelhante e ainda manter uma atividade biológica semelhante. Ao fazer alterações com base no índice hidropático, em certos exemplos de realização, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está inclusa. Em certos exemplos de realização, aquelas que estão dentro de ± 1 são incluídas e, em certos exemplos de realização, aquelas dentro de ± 0,5 são incluídas.
[0268] Também compreende-se a partir do estado da técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade, particularmente quando se pretende que a proteína ou peptídeo biologicamente funcional assim criado seja usado em exemplos de realização imunológicas, como no presente caso. Em determinados exemplos de realização, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona- se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.
[0269] Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a esses resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0 ± 1); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (−0,5±1); alanina (−0,5); histidina (−0,5); cisteína (−1,0); metionina (−1,3); valina (−1,5); leucina (−1,8); isoleucina (−1,8); tirosina (−2,3); fenilalanina (−2,5) e triptofano (−3,4). Ao fazer alterações com base nos valores de hidrofilicidade semelhantes, em certos exemplos de realização, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está inclusa, em certos exemplos de realização, aqueles que estão dentro de ± 1 estão inclusos, e em certos exemplos de realização, aqueles dentro de ± 0,5 estão inclusos. Também é possível identificar epítopos de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Essas regiões também são referidas como “regiões de núcleo epitópico”.
[0270] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno. Por exemplo, alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas nas HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas HVRs. Em determinados exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[0271] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxi-terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos compreendendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intra- sequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo à uma enzima (por exemplo, ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo no soro.
[0272] Qualquer resíduo da cisteína não envolvida na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para impedir ligações cruzadas aberrantes. De forma inversa, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (em especial quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).
VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0273] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é alterado para aprimorar ou reduzir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.
[0274] A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O- ligada. N-ligada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença de qualquer destas sequências de tripeptídeos no polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizados.
[0275] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada, de forma conveniente, pela alteração da sequência de aminoácido de modo que esta sequência contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N- ligados). A alteração pode também ser feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de glicosilação O-ligados).
[0276] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 de acordo com a numeração Kabat do domínio CH2 da região Fc.. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco/haste” da estrutura do oligossacarídeo bianternário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.
[0277] Em um exemplo de realização, as variantes de anticorpos são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Vide, por exemplo, as publicações dos Pedidos de Patente US 2003/0157108; US 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo “defucosilado” ou “deficiente em fucose” incluem: US 2003/0157108; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Os exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO Led 3 deficientes na fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108) e linhas celulares nocautes, tais como para o gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células CHO nocautes (vide, por exemplo, Yamane- Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) e Kanda et al. Biotechnol. Bioeng.
94(4):680-688 (2006)).
REGIÕES CONSTANTES MODIFICADAS
[0278] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo Fc é um isotipo e/ou modificações de anticorpo Fc. Em alguns exemplos de realização, o isotipo de anticorpo Fc e/ou modificação é capaz de se ligar ao receptor Fc gama.
[0279] Isotipos de anticorpo Fc exemplares e modificações são fornecidos na Tabela 2 abaixo. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação é capaz de se ligar a um receptor Fc gama e tem um isotipo Fc listado na Tabela 2 abaixo.
[0280] Tabela 2: Isotipos Fc de anticorpo anti-SIRPA exemplificativos que são capazes de ligar ao receptor Fc gama. Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) IgG1 N297A IgG1 D265A e N297A IgG1 D270A L234A e L235A IgG1 L234A e G237A L234A e L235A e G237A D270A, e/ou P238D, e/ou L328E, e/ou E233D, e/ou G237D e/ou IgG1 H268D, e/ou P271G, e/ou A330R IgG1 P238D e L328E e E233D e G237D e H268D e P271G e A330R IgG1 P238D e L328E e G237D e H268D e P271G e A330R P238D e S267E e L328F e E233D e G237D e H268D e P271G e IgG1 A330R IgG1 P238D e S267E e L328F e G237D e H268D e P271G e A330R IgG2 V234A e G237A IgG4 L235A e G237A e E318A IgG4 S228P e L236E IgG2/4 híbrido IgG2 aa 118 to 260 e IgG4 aa 261 to 447 H268Q e V309L; e A330S e P331S IgG1 C226S e C229S e E233P e L234V e L235A IgG1 L234F e L235E e P331S IgG2 C232S ou C233S IgG2 A330S e P331S S267E e L328F IgG1 S267E sozinho IgG2 S267E e L328F IgG4 S267E e L328F WT HC com Kappa (cadeia leve) LC HC C127S com Kappa LC Kappa LC C214S IgG2 Kappa LC C214S e HC C233S Kappa LC C214S e HC C232S Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com as mutações A330S e P331S
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) Fragmento F(ab')2 de WT IgG1 e qualquer uma das mutações listadas acima Substituição da constante pesada 1 (CH1) e região de dobradiça de IgG1 por CH1 e região de dobradiça de IGg2
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS IgG1
WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP (SEQ ID NO: 58) Com um Kappa LC Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com IgG1 A330L/A330S e/ou L234F e/ou L235E e/ou P331S Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com IgG1, IgG2, ou IgG4 M252Y e/ou S254T e/ou T256E IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, Para modelos de doenças de camundongos IgG2b de camundongo IgG4 WT Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com IgG1 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y, S440W e/ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, IgG2 S440Y, S440W e/ou qualquer combinação dos mesmos.
[0281] Além dos isotipos descritos na Tabela 2, e sem desejar se vincular à teoria, acredita-se que os anticorpos com isotipos IgG1 ou IgG3 humanos e mutantes dos mesmos (por exemplo, Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:685–691) que ligam os receptores Fcγ de ativação I, IIA, IIC, IIIA, IIIB em humanos e/ou receptores Fcγ I, III e IV em camundongos, também podem atuar como anticorpos agonistas transitórios.Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama tem um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, ou todas as treze) substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R,
E430G, S440Y em qualquer combinação (posição do resíduo de acordo com a numeração EU ou Kabat). Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição E430G. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições L243A, L235A e P331A. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições L243A, L235A, P331A. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições K322A e E430G.
Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições P331S e E430G. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições A330S, P331S e E430G. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições K322A, A330S e P331S. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições K322A, P331S e E430G. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições A330S, P331S e E430G. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição C127S. Em alguns exemplos de realização, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y.
[0282] Em certos exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama tem um isotipo IgG2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG2 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB). Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, as uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre V234A (Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-
1543. 31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Cole et al. (1999) Transplantation, 68:563-571), H268Q, V309L, A330S, P331S (US 2007/0148167; Armour et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2613- 2624; Armour et al.
(2000) The Haematology Journal 1(Suppl.1):27; Armour et al. (2000) The Haematology Journal 1(Suppl.1): 27), C232S e/ou C233S (White et al. (2015) Cancer Cell 27, 138–148), S267E, L328F (Chu et al., (2008) Mol Immunol, 45:3926-3933), M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat.
[0283] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc tem um isotipo lgG2 com um domínio constante de cadeia pesada que contém uma substituição de aminoácidos C127S, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al., (2010) PROTEIN SCIENCE 19:753-762; e WO2008079246).
[0284] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc tem um isotipo IgG2 com um domínio constante de cadeia leve Kappa que contém uma substituição de aminoácidos C214S, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (White et al.,(2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al., (2010) PROTEIN SCIENCE 19:753-762; e WO2008079246).
[0285] Em certos exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama tem um isotipo IgG1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG1 de camundongo.Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG1 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante da IgG1 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB).
Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre N297A (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403- 411), D265A (Shields et al.
(2001) R. J. Biol. Chem. 276, 6591-6604), D270A, L234A, L235A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al. (2000) Cell Immunol, 200:16-26), P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172), S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, e/ou T394D, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou de Kabat.
[0286] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo inclui um domínio constante de cadeia pesada do isotipo IgG2 1(CH1) e uma região de dobradiça (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138–148). Em certos exemplos de realização, o isotipo IgG2 CH1 e a região dobradiça contêm a sequência de aminoácidos de
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT
FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCP (SEQ ID NO: 58). Em alguns exemplos de realização, a região Fc do anticorpo contém uma substituição de aminoácidos S267E, uma substituição de aminoácidos L328F, ou ambas, e/ou uma substituição de aminoácidos N297A ou N297Q, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat.
[0287] Em certos exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama tem um isotipo IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG4 humano. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc gama IIB inibitório (FcγIIB). Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre L235A, G237A, S228P, L236E (Reddy et al., (2000) J Immunol, 164:1925-1933), S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat.
[0288] Em certos exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama tem um isotipo IgG2/4 híbrido. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama inclui uma sequência de aminoácidos contendo os aminoácidos 118 a 260 de acordo com a numeração EU ou Kabat de IgG2 humano e os aminoácidos 261-447 de acordo com a numeração EU ou Kabat de IgG4 humano (WO 1997/11971; WO 2007/106585).
[0289] Em certos exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG4 de camundongo (Bartholomaeus, et al. (2014). J.
Immunol. 192, 2091–2098).
[0290] Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas dentre A330L, L234F; L235E ou P331S, de acordo com a numeração EU ou Kabat; e qualquer combinação destas.
[0291] Em certos exemplos de realização, o anticorpo contém uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir de: C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destas, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S, em que a numeração da posição de resíduo é de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S, em que a numeração da posição de resíduo é de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, A330S e P331S, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, A330S e P331S, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A e A330S, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A e P331S, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos na posição C127S, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y, em que a numeração da posição de resíduo está de acordo com a numeração EU.
[0292] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos que ligam-se a uma proteína SIRPA podem incluir anticorpos que reduzem os níveis celulares de SIRPA (por exemplo, níveis de superfície celular de SIRPA), inibem a interação (por exemplo, ligação) entre SIRPA e/ou um ou mais ligantes SIRPA e inibem um ou mais atividades de uma proteína SIRPA. Tais anticorpos inibem uma ou mais atividades de uma proteína SIRPA, impedindo a interação (por exemplo, ligação) entre SIRPA e um ou mais ligantes SIRPA ou evitando a transdução de sinal do domínio extracelular de SIRPA no citoplasma celular na presença de um ou mais ligantes de SIRPA. Os anticorpos também podem inibir uma ou mais atividades de uma proteína SIRPA pela diminuição dos níveis de superfície celular de SIRPA por indução SIRPA degradação, SIRPA dessensibilização, SIRPA clivagem, SIRPA internalização, SIRPA derramamento, regulação negativa da expressão de
SIRPA, e/ou a degradação lisossômica de SIRPA. Em alguns exemplos de realização, tais anticorpos anti-SIRPA podem não ativar transitoriamente a SIRPA.
[0293] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação podem ter a especificidade do epítopo de um anticorpo anti-SIRPA agonista transitório da presente divulgação, mas têm um domínio Fc que não é capaz de se ligar aos receptores Fcγ e, portanto, incapaz, por exemplo, de agrupar e ativar temporariamente a SIRPA.
[0294] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição têm, sem limitação, uma ou mais das seguintes atividades: a capacidade de diminuir a ligação de uma proteína SIRPA com um ou mais ligantes de SIRPA, como glicolipídeos contendo ácido siálico ou glicoproteínas contendo ácido siálico, a capacidade de diminuir a ligação de um supressor de proteína de sinalização de citocina (SOCS) (por exemplo, proteína SOCS3) com uma proteína SIRPA, a capacidade de aumentar a degradação proteossomal de uma proteína SIRPA, a capacidade de reduzir a expressão funcional de SIRPA na superfície de macrófagos, monócitos, células T, micróglia e/ou células dendríticas circulantes, a capacidade de diminuir a fosforilação de Tyr-340 e Tyr-358 por uma tirosina quinase da família Src, como LCK e FYN, a capacidade para diminuir o recrutamento e a ligação com proteínas tirosina fosfatases específicas SHP1 e SHP2, a capacidade de diminuir o recrutamento e a ligação com PLC-g1, que atua como nucleotídeo de guanina, fator de troca para Dynami n-1, a capacidade de diminuir o recrutamento e a ligação com Crkl, a capacidade de diminuir o recrutamento e a ligação com a tirosina quinase de baço Syk, a capacidade de diminuir o recrutamento e a ligação com a proteína-2 ligada ao receptor do fator de crescimento (Grb2) SH3-SH2-SH3, a capacidade de diminuir o recrutamento e a ligação a várias proteínas contendo SH2, a capacidade de aumentar a mobilização intracelular de cálcio, a capacidade de modular a produção de citocinas pró- inflamatórias IL-1β, IL-8 e TNF-α, a capacidade de diminuir a ativação da fosfoinositida 3-quinase, a capacidade de aumentar o crescimento de monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T e/ou micróglia, a capacidade de aumentar a sobrevida de monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T, e/ou micróglia, a capacidade de aumentar a fosforilação da tirosina em várias proteínas celulares, a capacidade de aumentar a atividade fagocítica de monócitos, macrófagos, células dendríticas e/ou micróglia, a capacidade d e aumentar o proliferação de células de monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T e/ou micróglia, a capacidade de aumentar a fosforilação das moléculas de sinalização que medeia a sinalização ITAM, a capacidade de aumentar a função dos receptores de reconhecimento de padrão, a capacidade de aumentar a função de receptores tipo Toll, a capacidade de aumentar a função dos receptores de padrão molecular associado a danos (DAMP), a capacidade de modular a expressão do receptor de quimiocina CC 7 (CCR7) e a capacidade de aumentar a depuração de resíduos celulares e de proteínas.
[0295] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição têm uma região Fc que exibe ligação reduzida com um ou mais receptores Fcγ. Exemplos de tais regiões Fc e modificações são fornecidas na Tabela 3 abaixo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo tem um isotipo Fc listado na Tabela 3 abaixo.
[0296] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA com ligação reduzida aos receptores Fc gama têm um isótipo Fc listado na Tabela 3 abaixo.
TABELA 3 ISOTIPOS FC DE ANTICORPO ANTI-SIRPA EXEMPLIFICATIVOS COM LIGAÇÃO REDUZIDA
AO RECEPTOR FC GAMA Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) IgG1 N297A ou N297Q e/ou D270A IgG1 D265A, D270A, e/ou N297A IgG1 L234A e L235A IgG2 V234A e G237A IgG4 F235A e G237A e E318A E233P e/ou F234V N297Aou N297Q IgG4 S228P e L236E S241P S241P e L248E S228P e F234A e L235A IgG2 H268Q e V309L e A330S e P331S IgG1 C220S e C226S e C229S e P238S IgG1 C226S e C229S e E233P e L234V, e L235A IgG1 E233P e L234V e L235A e G236-deleted P238A D265A N297A A327Q ou A327G P329A IgG1 K322A e L234A e L235A IgG1 L234Fe L235E e P331S IgG1 ou IgG4 T394D IgG2 C232S ou C233S N297Aou N297Q IgG2 V234A e G237A e P238S e H268A e V309L e A330S e P331S IgG1, IgG2, ou modificações delta a, b, c, ab, ac, g IgG4 IgG1 Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com A330L ou L234F e/ou L235E e/ou P331S IgG1, IgG2, ou Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com M252Y e/ou IgG4 S254T e/ou T256E
[0297] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA tem um isotipo IgG1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 de camundongo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante da IgG1 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo).
[0298] Em alguns exemplos de realização, as substituições de um ou mais aminoácidos são selecionadas a partir de N297A, N297Q (Bolt S et al.
(1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A, D270A, L234A, L235A (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), C226S, C229S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2204- 2210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238A, A327Q, A327G, P329A (Shields RL, et al., (2001) J Biol Chem.
276(9):6591-604), K322A, L234F, L235E (Hezareh, et al., (2001) J Virol 75, 12161–12168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica 64, 700–704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica 64, 700–704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406–417), A330L, M252Y, S254T, e/ou T256E, onde a posição do aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat. Em certos exemplos de realização, a região Fc inclui ainda uma supressão de aminoácidos em uma posição correspondente à glicina 236, de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat.
[0299] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA tem um isotipo IgG1 com uma região constante de cadeia pesada que contém uma substituição de aminoácidos C220S de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas dentre A330L, L234F; L235E ou P331S, de acordo com a numeração EU ou Kabat. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA tem um isotipo IgG2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG2 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, V309L, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (Vafa O. et al., (2014) Methods 65: 114–126).
[0300] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo anti- SIRPA tem um isotipo IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPA contém uma região constante de IgG4 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre E233P, F234V, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92: 11980-11984), S228P, L234A/ F234A, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol, 164: 1925-1933; Angal et al., (1993) Mol Immunol. 30 (1): 105-8; US 8614299 B2; Vafa O. et al., (2014) Methods 65: 114–126), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A e/ou N297Q, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo tem um isotipo IgG4, e compreende uma substituição de aminoácido S228P na posição do resíduo 228, uma substituição de aminoácido F234A na posição do resíduo 234, e uma substituição de aminoácido L235A na posição do resíduo 235 (posição dos resíduos está de acordo com a numeração EU).
[0301] Em alguns exemplos de realização, a região Fc adicionalmente contém uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas dentre um M252Y, S254T e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat.
[0302] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG1. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de N297A (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A (Shields et al. (2001) R. J. Biol.
Chem. 276, 6591–6604), L234A, L235A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543.
31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al. (2000) Cell Immunol, 200:16-26), C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172), S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU.
[0303] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende a mutação N297A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações D265A e N297A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos
Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações D270A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende mutações L234A e L235A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234A e G237A de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234A e G237A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma ou mais (incluindo todas) das mutações P238D, L328E, E233, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma ou mais das mutações S267E/L328F de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, L328E, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, S267E, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, S267E, L328E, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações C226S, C229S, E233P, L234V, e L235A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234F, L235E, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações S267E e L328F de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende a mutação S267E de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende um substituto da cadeia constante pesada 1 (CH1) e região de dobradiça da IgG1 com CH1 e região de dobradiça da IgG2 (aminoácidos 118-230 de IgG2 de acordo com a numeração EU) com uma cadeia leve kappa (capa).
[0304] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc inclui duas ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram o agrupamento de anticorpos sem ativar o complemento em comparação com um anticorpo correspondente com uma região Fc que não inclui as duas ou mais substituições de aminoácidos. Consequentemente, em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 é um anticorpo compreendendo uma região Fc, em que o anticorpo compreende uma substituição de aminoácidos na posição E430G e uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir de: L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S e qualquer combinação destes de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em algumas exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em algumas exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e A330S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e P331S de acordo com a numeração EU.
[0305] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda neste documento pode ser combinado com uma mutação A330L (Lazar et al. Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010 (2006)), ou uma ou mais das mutações L234F, L235E e/ou P331S (Sazinsky et al. Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167- 20172 (2008)), de acordo com a convenção de numeração EU, para eliminar a ativação do complemento. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode ainda compreender um ou mais de A330L, A330S, L234F, L235E e/ou P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia- vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) das mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda um ou mais de E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e/ou S440W, de acordo com a numeração EU.
[0306] Outros aspectos da presente descrição referem-se a anticorpos com regiões constantes modificadas (ou seja, regiões Fc). Um anticorpo dependente da ligação ao receptor FcgR para ativar os receptores alvo pode perder sua atividade agonista se for manipulado para eliminar a ligação ao FcγR (consulte, por exemplo, Wilson et al. Cancer Cell 19:101-113 (2011); Armour et al. Immunology 40:585-593 (2003); e White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)). Como tal, é pensado que um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição com a especificidade correta do epítopo pode ativar o antígeno alvo, com efeitos adversos mínimos, quando o anticorpo tem um domínio Fc de um isotipo IgG2 humano (CH1 e região de dobradiça) ou outro tipo de domínio Fc que é capaz de ligar preferencialmente os receptores inibitórios de FcγRIIB r, ou uma variação destes.
[0307] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG2. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG2 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG2 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, as uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de V234A (Alegre et al. Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al. Cell Immunol, 200:16-26 (2000)); G237A (Cole et al. Transplantation, 68:563-571 (1999)); H268Q, V309L, A330S, P331S (US 2007/0148167; Armour et al. Eur J Immunol 29: 2613-2624 (1999); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000)), C219S, e/ou C220S (White et al.
Cancer Cell 27, 138-148 (2015)); S267E, L328F (Chu et al. Mol Immunol, 45:3926-3933 (2008)); e M252Y, S254T, e/ou T256E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições V234A e G237A de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições C219S ou C220S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições A330S e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.
[0308] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos C127S de acordo com a convenção de numeração EU (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762 (2010); e WO 2008/079246). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU (White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015); Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762 (2010); e WO 2008/079246).
[0309] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos C220S de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU.
[0310] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos
C219S de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU.
[0311] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc inclui um domínio constante 1 da cadeia pesada do isotipo IgG2 (CH1) e a região de dobradiça (White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)). Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o CH1 do isotipo IgG2 e a região de dobradiça compreendem a sequência de aminoácidos de 118-230 de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer dos Fc modificados de IgG2, a região Fc do anticorpo compreende uma substituição de aminoácidos S267E, uma substituição de aminoácidos L328F, ou ambos, e/ou uma substituição de aminoácidos N297A ou N297Q de acordo com a convenção de numeração EU.
[0312] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia-vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) das mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU ). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc pode ainda compreender A330S e P331S.
[0313] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc é um Fc híbrido IgG2/4. Em alguns exemplos de realização, o Fc híbrido IgG2/4 compreende os aa 118 a 260 da IgG2 e aa 261 a
447 da IgG4. Em alguns exemplos de realização de qualquer Fc modificado de IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições H268Q, V309L, A330S e P331S de acordo com a numeração EU.
[0314] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas a partir de A330L, L234F; L235E ou P331S de acordo com a numeração EU; e qualquer combinação destes.
[0315] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de resíduo selecionada a partir de C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destes, de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados por IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e A330S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição C127S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y de acordo com a numeração EU.
[0316] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG4. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG4 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG4 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, as uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de L235A, G237A, S229P, L236E (Reddy et al. J Immunol 164: 1925-1933(2000)), S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T e/ou T256E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc pode ainda compreender L235A, G237A e E318A de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc pode ainda compreender S228P e L235E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 pode ainda compreender S267E e L328F de acordo com a convenção de numeração EU.
[0317] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 compreende pode ser combinado com uma mutação S228P de acordo com a convenção de numeração EU (Angal et al. Mol Immunol. 30:105-108 (1993)) e/ou com uma ou mais mutações descritas em (Peters et al. J Biol Chem. 287(29):24525-33 (2012)) para potencializar a estabilização de anticorpos.
[0318] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia- vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) das mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU).
[0319] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende L235E de acordo com a numeração EU. Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de resíduo selecionada a partir de C127S, F234A, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destes, de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição E430 de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.
Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição C127S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y de acordo com a numeração EU.
OUTRAS MODIFICAÇÕES DE ANTICORPO
[0320] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos, o anticorpo é um derivado. O termo “derivado” refere-se a uma molécula que inclui uma modificação química diferente de uma inserção, deleção ou substituição de aminoácidos (ou ácidos nucleicos). Em certos exemplos de realização, os derivados compreendem modificações covalentes, incluindo, mas não se limitando a, uma ligação química com polímeros, lipídios ou outras porções orgânicas ou inorgânicas. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno quimicamente modificada pode ter uma meia-vida circulante maior do que uma proteína de ligação ao antígeno que não seja quimicamente modificada. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno quimicamente modificada pode ter capacidade de direcionamento melhorada para células, tecidos e/ou órgãos desejados. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno é modificada covalentemente para incluir uma ou mais ligações de polímeros solúveis em água, incluindo, sem limitação, polietilenoglicol, polioxietilenoglicol ou polipropilenoglicol. Consulte, por exemplo, as Patentes US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 US e US
4179337. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno derivada compreende um ou mais polímeros, incluindo, mas não se limitando a, monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas de tais polímeros.
[0321] Em certos exemplos de realização, um derivado é modificado covalentemente com subunidades de polietileno glicol (PEG). Em certos exemplos de realização, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados em uma ou mais posições específicas, por exemplo, no terminal amino, de um derivado. Em certos exemplos de realização, um ou mais polímeros solúveis em água são aleatoriamente ligados a uma ou mais cadeias laterais de um derivado. Em certos exemplos de realização, o PEG é usado para melhorar a capacidade terapêutica de uma proteína de ligação ao antígeno. Em certos exemplos de realização, o PEG é usado para melhorar a capacidade terapêutica de um anticorpo humanizado. Certos métodos são discutidos, por exemplo, na Patente US 6.133.426, que é incorporada no presente documento por referência para qualquer finalidade.
[0322] Análogos de peptídeo geralmente são usados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de compostos não peptídicos são denominados “miméticos peptídicos” ou “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv.
Drug Res., 15:29 (1986); e Evans et al. J. Med. Chem., 30:1229 (1987), os quais são incorporados neste documento por referência para qualquer finalidade. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos peptídicos que são estruturalmente semelhantes a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático semelhante.
Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo de paradigma (ou seja, um polipeptídeo que possui uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada a partir de: - CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, - CH═CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada em certos exemplos de realização para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, os peptídeos restritos compreendendo uma sequência consenso ou uma variação de sequência consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), incorporados neste documento por referência); por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.
[0323] A conjugação de fármaco envolve o acoplamento de uma carga ou fármaco citotóxico (anticâncer) ativa e biológica a um anticorpo que direciona especificamente um determinado marcador tumoral (por exemplo, um polipeptídeo que, idealmente, é encontrada apenas nas células tumorais ou sobre as células tumorais). Os anticorpos rastreiam essas proteínas no corpo e ligam-se à superfície das células cancerígenas. A reação bioquímica entre o anticorpo e a proteína alvo (antígeno) dispara um sinal na célula tumoral, que absorve ou internaliza o anticorpo juntamente com a citotoxina. Após o ADC ser internalizado, o fármaco citotóxico é liberado e mata o câncer. Devido a esse direcionamento, o ideal é que o fármaco tenha efeitos colaterais menores e proporcione uma janela terapêutica mais ampla do que outros agentes quimioterapêuticos. As técnicas para conjugar anticorpos são divulgadas e conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Jane de Lartigue, Onc Live, 5 de Julho de 2012; ADC Review on antibody-drug conjugates; e Ducry et al.
Bioconjugate Chemistry 21 (1):5-13 (2010).
REGIÕES ESTRUTURAIS (FRAMEWORKS) DE ANTICORPO
[0324] Qualquer um dos anticorpos anti-SIRPA descritos neste documento inclui ainda uma região estrutural (FR - framework). Em alguns exemplos de realização, a região estrutural (framework) é uma região estrutural de imunoglobulina humana. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA) compreende HVRs como em qualquer uma dos exemplos de realização acima e compreende adicionalmente uma região estrutural (framework) aceptora humana, por exemplo, uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humano. As regiões estruturais de imunoglobulina humana podem ser parte do anticorpo humano, ou um anticorpo não humano pode ser humanizado pela substituição de uma ou mais regiões estruturais endógenas por região(ões) estrutural(ais) humana(s). As regiões estruturais (frameworks) humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); e Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)); regiões estruturais (mutadas somaticamente) maduras humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro e Fransson Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al. J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
[0325] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPA da presente descrição compreendem uma região variável de cadeia pesada que compreende uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou todas as quatro) regiões estruturais selecionadas dentre VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 (conforme mostrado na Tabela 9). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR1, em que a VH FR1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Em alguns exemplos de realização, e anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR2, em que a VH FR2 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR3, em que a VH FR3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendp uma VH FR4, em que a VH FR4 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, uma VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e uma VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[0326] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR1, uma VH FR2, uma VH FR3, e VH FR4 do anticorpo anti-SIRPA 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9- 8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25.
[0327] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, ou todas as quatro) regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VL FR1, VL FR2, VL FR3, e VL FR4 (conforme exibido na Tabela 9).
Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR1, em que a VL FR1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR2, em que a VL FR2 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR3, em que a VL FR3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR4, em que a VL FR4 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e uma VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[0328] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR1, uma VL FR2, a VL FR3, e VL FR4 do anticorpo anti-SIRPA 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25.
[0329] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, uma VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e uma VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, uma VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, uma VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e uma VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma VH FR1, uma VH FR2, uma VH FR3, e uma VH FR4 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-
9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25, e a região variável de cadeia leve compreendendo uma VL FR1, uma VL FR2, uma VL FR3, e uma VL FR4 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25.
[0330] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0331] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0332] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0333] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[0334] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê um anticorpo anti-SIRPA, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[0335] Os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição podem ser produzidos pelo uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.816.567. Em alguns exemplos de realização, ácidos nucleicos isolados com uma sequência nucleotídica que codifica qualquer um dos anticorpos anti-SIRPA da presente descrição são fornecidos. Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL e/ ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo anti-SIRPA (por exemplo, as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em alguns exemplos de realização, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo esses ácidos nucleicos são fornecidos. Em alguns exemplos de realização, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é também fornecida. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transduzida com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster chinês (CHO) ou células linfoides (por exemplo, células Y0, NS0, Sp20). As células hospedeiras da presente descrição também incluem, sem limitação, células isoladas, células cultivadas in vitro e células cultivadas ex vivo.
[0336] Métodos de produção de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição são fornecidos. Em alguns exemplos de realização, o método inclui cultivar uma célula hospedeira da presente descrição compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-SIRPA, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é subsequentemente recuperado da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).
[0337] Para produção recombinante de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-SIRPA é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado por meio da utilização de procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[0338] Vetores adequados compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-SIRPA da presente descrição ou fragmentos expressos de superfície celular ou polipeptídeos destes polipeptídeos (incluindo anticorpos) descritos neste documento incluem, sem limitação, vetores de clonagem e vetores de expressão. Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende utilizar, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular, e/ou podem carrear genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones compreendendo o vetor. Os exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transferência, tais como PSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais tais como BioRad, Stratagene e Invitrogen.
[0339] As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem as células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias (por exemplo, Patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[0340] Além de procariontes, microrganismos eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores que codificam anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano (por exemplo, Gerngross Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); e Li et al. Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)).
[0341] As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado também podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas diversas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas juntamente com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras (por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US
6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429, descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[0342] Células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são: linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de células de rim embrionárias humana (células HEK 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), células de rim de filhote de hamster (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HeLa), células de rim canino (células MDCK) células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., et al, Annals NY Acad.
Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpos, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
COMPOSIÇÕES/FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0343] São fornecidas neste documento composições farmacêuticas e/ou formulações farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0344] Em alguns exemplos de realização, o veículo farmaceuticamente aceitável é preferencialmente não tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Os anticorpos descritos neste documento podem ser formulados em preparações nas formas sólida, semissólida, líquida ou gasosa. Exemplos de tais formulações incluem, sem limitação, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. Os veículos farmacêuticos aceitáveis podem incluir, dependendo da formulação desejada, veículos de diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. Em certos exemplos de realização, a composição farmacêutica pode compreender materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou de liberação, adsorção ou penetração da composição.
[0345] Em certos exemplos de realização, veículos farmaceuticamente adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogeno- sulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamino tetra- acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como glicose,
manose ou dextrina); proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, flavorizantes e diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (por exemplo, glicerina, propileno glicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ou agentes umectantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potencializadores de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes potencializadores de tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou de potássio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Outros exemplos de formulações adequadas para vários tipos de administração podem ser encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press 22ª ed. (2013). Para uma breve revisão dos métodos para distribuição de fármaco, consulte, Langer, Science 249:1527- 1533 (1990).
[0346] As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéril isotônicas aquosas e não aquosas, que podem compreender antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes.
[0347] As formulações podem ser otimizadas para retenção e estabilização no cérebro ou sistema nervoso central. Quando o agente é administrado no compartimento craniano, é desejável que o agente seja retido no compartimento e não difundir ou atravessar a barreira hematoencefálica. As técnicas de estabilização incluem reticulação, multimerização ou ligação a grupos como polietilenoglicol, poliacrilamida, veículos neutros de proteínas etc., de modo a obter um aprimoramento no peso molecular.
[0348] Outras estratégias para aprimorar a retenção incluem o aprisionamento do anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição, em um implante biodegradável ou bioerodível. A taxa de liberação do agente terapeuticamente ativo é controlada pela taxa de transporte através da matriz polimérica e pela biodegradação do implante. Os implantes podem ser partículas, folhas, adesivos, placas, fibras, microcápsulas e similares e podem ter qualquer tamanho ou forma compatível com o sítio de inserção selecionado. As composições poliméricas biodegradáveis que podem ser empregadas podem ser ésteres ou éteres orgânicos que, quando degradados, resultam em produtos de degradação fisiologicamente aceitáveis, incluindo os monômeros. Anidridos, amidas, orto ésteres ou outros semelhantes, sozinhos ou em combinação com outros monômeros, podem ser usados. Os polímeros serão polímeros de condensação. Os polímeros podem ser reticulados ou não reticulados. De particular interesse são os polímeros de ácidos carboxílicos hidroxialifáticos quer homo- ou copolímeros e polissacarídeos. Entre os poliésteres de interesse estão incluídos polímeros de ácido D-lático, ácido L- lático, ácido lático racêmico, ácido glicólico, policaprolactona e combinações destes. Entre os polissacarídeos de interesse estão o alginato de cálcio e celuloses funcionalizadas, particularmente ésteres de carboximetilcelulose caracterizados por serem insolúveis em água, um peso molecular de cerca de 5 kD a 500 kD, etc. Os hidrogéis biodegradáveis também podem ser utilizados nos implantes da presente invenção. Os hidrogéis são tipicamente um material de copolímero, caracterizado pela capacidade de absorver um líquido.
USOS TERAPÊUTICOS
[0349] Tal como divulgado na presente invenção, os anticorpos anti-SIRPA da presente descrição podem ser utilizados para prevenir, reduzir o risco ou tratar doenças ou distúrbios.
[0350] Em um aspecto da invenção, um agente que regula negativamente SIRPA, por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA, é usado como um agente terapêutico. Esses agentes são administrados para tratar, aliviar e/ou prevenir uma doença ou patologia associada à expressão, atividade e/ou sinalização de SIRPA em um sujeito. Um regime terapêutico é realizado identificando um sujeito, por exemplo, um paciente humano que sofre de (ou em risco de desenvolver) uma doença ou distúrbio associado à expressão, atividade e/ou sinalização de SIRPA, por exemplo, um câncer ou outro distúrbio neoplásico, usando métodos padrão. Em alguns exemplos de realização, as células com a patologia associada à expressão, atividade e/ou sinalização de SIRPA expressam um ligante de SIRPA, por exemplo, CD47. Em alguns exemplos de realização, as células com a patologia associada à expressão, atividade e/ou sinalização de SIRPA expressam SIRPA.
[0351] Conforme detalhado abaixo, um agente que infrarregula SIRPA, por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA pode ser usado em combinação com um agente terapêutico adicional que é usado para tratar a doença ou patologia associada à expressão, atividade ou sinalização de SIRPA. Os termos “em combinação” e “em conjunto” são usados indistintamente na presente divulgação. O agente terapêutico adicional sendo administrado em combinação com um anticorpo anti-SIRPA pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com o agente que regula negativamente a SIRPA, por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA.
[0352] Em um aspecto da presente divulgação, uma preparação de anticorpo anti-SIRPA, por exemplo, compreendendo um anticorpo anti-
SIRPA que diminui a expressão de SIRPA na superfície celular, mas não bloqueia substancialmente a ligação do ligante, por exemplo, CD47, à SIRPA, é administrado a um sujeito humano. A administração do anticorpo pode anular ou inibir ou interferir com a expressão, atividade e/ou função de sinalização de SIRPA que é mediada pela ligação do ligante, por exemplo, ligação de CD47.
[0353] Em um exemplo de realização, a doença ou distúrbio associado à expressão de SIRPA é o câncer. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPA é administrado a um paciente que tem um câncer, como um distúrbio proliferativo hematológico de células mieloides, que expressa SIRPA. Em exemplos de realização típicos, um anticorpo anti-SIRPA é administrado a um paciente que tem um câncer que expressa CD47.
[0354] Em determinados exemplos de realização, um câncer a ser prevenido ou tratado pelos métodos da presente divulgação inclui, sem limitação, carcinoma de células escamosas (por exemplo, carcinoma epitelial de células escamosas), câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células escamosas não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, NSCLC não escamoso, glioma, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal e câncer estromal gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de ovário, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de endométrio, câncer de rim (por exemplo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), câncer de tireoide, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer (ou carcinoma) de cabeça e pescoço, câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátrico, linfoma de linfocitos T citolíticos (NK) de seios paranasais, melanoma (por exemplo,
melanoma maligno metastático, como melanoma maligno cutâneo ou intraocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da região anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de colo uterino, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal,
sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, síndromes mielodisplásicas,
neoplasias colorretais, tumores sólidos, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi,
câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T,
cânceres induzidos ambientalmente, incluindo aqueles induzidos por amianto,
cânceres relacionados a vírus (por exemplo, tumor relacionado ao vírus do papiloma humano (HPV)) e malignidades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de células sanguíneas, ou seja, a linhagem celular mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos e mastócitos) ou linhagem celular linfoide (que produz células B, T, NK e plasmáticas), como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo, agudo, crônico, linfocítico e/ou leucemias mielogênicas, como leucemia aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML), LMA indiferenciada (M0),
leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou M3 variante [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 ou variante M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7),
sarcoma e cloroma; linfomas, como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-
Hodgkin (NHL), linfoma indolente, linfoma difuso de grandes células B,
malignidade hematológica de células B, por exemplo, linfomas de células B,
linfomas de células T, linfoma linfoplasmocitoides, linfoma de células B monocitóides, tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma anaplásico
(por exemplo, Ki1+) linfoma de células grandes, linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de células do manto, linfoma angioimunoblástico de células T,
linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinais primário, linfoma linfoblástico T precursor, linfoma/leucemia linfoblástica T (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma de efusão primária, linfoma linfoblástico (LBL), hematopoiético tumores de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de grandes células B
(DLBCL) (incluindo pacientes DLBCL que são refratários primários, refratários ao Rituximabe, refratários ao Rituximabe/CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina,
vincristina e prednisona), DLBCL (R/R) recidivante ou refratário e/ou pacientes
DLBCL inelegíveis para CAR-T), linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma cutâneo de células T (CTLC) (também chamado de micose fungoide ou síndrome de Sezary) e linfoma linfoplasmocitário (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas,
como mieloma IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado de mieloma indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células pilosas; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo, células T e tumores de células B, incluindo, mas não se limitando a distúrbios de células T, como T- leucemia prolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo de células pequenas e células cerebriformes; leucemia de linfócitos granulares grandes (LGL) de preferência do tipo de células T; linfoma heptassilábico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/pós- tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma angiocêntrico (nasal) de células T; câncer de cabeça ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quaisquer combinações dos referidos cânceres. Um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação também pode ser usado para tratar câncer metastático.
[0355] Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma. Em alguns exemplos de realização, o câncer é carcinoma da mama triplo-negativo. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um câncer em estágio inicial ou um câncer em estágio avançado. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um tumor primário. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um tumor metastático em um segundo local derivado de qualquer um dos tipos de câncer acima.
[0356] Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado de glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga; linfoma difuso de grandes células B; adenocarcinoma pulmonar; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, carcinoma invasivo de mama, carcinoma cervical de células escamosas, adenocarcinoma cervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma de cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma esofágico, cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço, cromófobo rim, carcinoma renal papilar, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de pulmão de células escamosas, mesotelioma, ovário cistadenocarcinoma seroso, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma de próstata, adenocarcinoma retal, melanoma cutâneo, adenocarcinoma estomacal, tumores de células germinativas testiculares, carcinoma da tireoide, timoma, corpo uterino e carcinoma endcomaterial uterino, carcinoma uterino corpusarocárico, carcinoma uterino- endometrial.
[0357] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com câncer, em que o indivíduo é refratário à terapia com inibidor do ponto de verificação, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação.
[0358] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com câncer, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação.
[0359] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação pode ser administrado em conjunto com um agente terapêutico que atua como um inibidor de ponto de verificação imunológico. Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imune inibitória e/ou outra terapia anticâncer padrão ou investigacional. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ponto de verificação inibitória é selecionada a partir de PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 e CD73.
Em exemplos de realização típicos, o agente terapêutico é um anticorpo para um inibidor de ponto de verificação selecionado a partir de D1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7- H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 ou CD73. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, uma combinação de anticorpos direcionados contra inibidores de ponto de verificação é administrada em conjunto com um anticorpo anti-SIRPA da presente invenção.
[0360] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação pode ser administrado em conjunto com pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 agonista, um anticorpo anti-OX40 agonista, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo anti- proteína GITR relacionada com TNFR induzida por glicocorticoide agonista, um anticorpo agonista anti- CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.
[0361] Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imune inibitória e/ou outra terapia anticâncer padrão ou investigacional. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é selecionado a partir de um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor das células killer semelhante à imunoglobulina (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti- A2AR, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27 e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, a terapia anticâncer padrão ou experimental é uma ou mais terapias selecionadas de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, imatinibe (Gleevec®), trastuzumabe (Herceptin®), transferência de células adotivas (ACT), transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.. Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.
[0362] Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação imune estimuladora.
Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-proteína GITR relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide e qualquer combinação dos mesmos.
[0363] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente invenção é administrado em combinação com radioterapia e/ou um agente quimioterápico. Os agentes quimioterápicos incluem, por exemplo, os seguintes grupos: antimetabolitos/agentes anticâncer, tais como análogos de pirimidina (5-fluorouracil, floxuridina, capecitabina, gencitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (metotrexato, pemetrexed, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluindo produtos naturais, tais como alcaloides da vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), desreguladores de microtúbulos, tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas, eribulina e navelbina; epidipodofilotoxinas (etoposide, teniposide);
agentes prejudiciais ao DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclinas,
bleomicina, bussulfano, camptotecina, carboplatina, clorambucilo, cisplatina,
ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina,
epirubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalano,
mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamicina,
procarbazina, taxol, taxotere, temozolamida, teniposide, trietilenotiofosforamida e etoposide (VP 16)); Inibidores de DNA metiltransferase (azacitidina);
antibióticos, como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina,
doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona,
bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistemicamente L-asparagina e priva células que não têm a capacidade de sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetários;
agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalan, clorambucila),
etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquilsulfonatos
(busulfan), nitrosoureias (carmustina (BCNU), triazsazina (carmustina (BCNU),
triazsazina, estrepbiazina (DTIC)); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos do ácido fólico
(metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina),
procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônios (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores da trombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase e uroquinase),
aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes anti-
migratórios; agentes anti-secretores (breveldina); imunossupressores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina,
micofenolato de mofetil); compostos anti-angiogênicos (TNP470, genisteína,
pomalidomida) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tais como ziv-aflibercept; inibidores do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)); inibidores de antagonistas da proteína de apoptose (IAP) (birinapant); inibidores da histona desacetilase
(HDAC) (vorinostat, romidepsina, xidamida, panobinostate, mocetinostate,
abexinostate, belinostate, entinostate, resminostate, givinostate, quisinostate,
SB939); inibidores de proteassoma (ixazomibe); bloqueador do receptor da angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos antissenso;
anticorpos (trastuzumabe, panitumumabe, pertuzumabe, cetuximabe,
adalimumabe, golimumabe, infliximabe, rituximabe, ocrelizumabe,
ofatumumabe, obinutuzumabe, alemtuzumabe, abciximabe, atlizumabebe,
daclizumabe, denosumabe, efalizumabe, elotuzumabe, rovelizumabe,
ruplizumabe, ustekinumabe, visilizumabe, gemtuzumabe ozogamicina,
brentuximb vedotin); receptores de antígenos quiméricos; inibidores do ciclo celular (flavopiridol, roscovitina, briostatina-1) e indutores de diferenciação
(tretinoína); Inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorrubicina
(adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina,
enipósido, epirrubicina, etoposídeo, idarrubicina, irinotecano (CPT-11) e mitoxantrona, topotecolesterona, cortisteroxantrona, topotecolesterona,
cortisortisortona, metil-desidrisortisortona, cortisortisortisortona,
cortisortisortisortona, prednisona e prenisolona); Inibidores de PARP
(niraparibe, olaparibe); inibidores da quinase de adesão focal (FAK)
(defactinibe (VS-6063), VS-4718, VS-6062, GSK2256098); inibidores da quinase de transdução de sinal do fator de crescimento (cediranibe,
galunisertibe, rociletinibe, vandetanibe, afatinibe, EGF816, AZD4547);
inibidores de c-Met (capmatinibe, INC280); Inibidores de ALK (ceritinibe, crizotinibe); indutores de disfunção mitocondrial, toxinas tais como toxina da cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclase de
Bordetella pertussis ou toxina da difteria e ativadores de caspase; e desreguladores da cromatina. Em alguns exemplos de realização, um agente quimioterápico é um inibidor de B-Raf, um inibidor de MEK, um inibidor de VEGF, um inibidor de VEGFR, um inibidor de tirosina quinase, um agente antimitótico ou qualquer combinação dos mesmos.
[0364] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação é administrado em combinação com terapia de transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.
[0365] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação é administrado em combinação com pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora, por exemplo, uma citocina inibidora, como um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, ou um anticorpo anti-IL-2.
[0366] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPA da presente divulgação é administrado em combinação com pelo menos uma citocina estimuladora. Em alguns exemplos de realização que podem ser combinadas com qualquer um dos exemplos de realização do presente pedido, a pelo menos uma citocina estimuladora é selecionada a partir de IFN-α4, IFN- β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação das mesmas.
[0367] Em alguns exemplos de realização, um agente que infrarregula SIRPA, por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA, é administrado a um paciente que tem um distúrbio neurológico ou é administrado para reduzir o risco, início lento ou prevenir um distúrbio neurológico. Em alguns exemplos de realização, o distúrbio neurológico é demência, incluindo demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, comprometimento cognitivo leve, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Huntington, doença de taupatia ou esclerose múltipla.
[0368] Em alguns exemplos de realização, um agente que regula negativamente SIRPA, por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA, é administrado a um paciente que tem doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doenças taupáticas ou esclerose múltipla. Em alguns exemplos de realização, o agente é administrado a um paciente que tem doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, doença de Nasu- Hakola, acidente vascular cerebral, uma infecção, lesão cerebral traumática, paralisia supranuclear progressiva, demência pugilística (encefalopatia traumática crônica), Parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig (complexo de Parkinson-demência de Guam), demência com predomínio de emaranhados, ganglioglioma e gangliocitoma, meningioangiomatose, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, doença de Hallervorden-espinocitoma, doença cortical, lipofusceneração de Pickalervorden, lipofusceneração, Doença de grãos argirofílicos (AGD), degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva ou degeneração ganglionar basal cortical.
DEMÊNCIA
[0369] A demência é uma síndrome inespecífica (ou seja, um conjunto de sinais e sintomas) que se apresenta como uma séria perda da capacidade cognitiva global em uma pessoa anteriormente não prejudicada, além do que se pode esperar do envelhecimento normal. A demência pode ser estática como resultado de uma lesão cerebral global única. Alternativamente, a demência pode ser progressiva, resultando em declínio a longo prazo devido a danos ou doenças no corpo. Embora a demência seja muito mais comum na população geriátrica, também pode ocorrer antes dos 65 anos. As áreas cognitivas afetadas pela demência incluem, sem limitação, memória, atenção, linguagem e solução de problemas. Em geral, os sintomas devem estar presentes por pelo menos seis meses antes de um indivíduo ser diagnosticado com demência.
[0370] Formas exemplificativas de demência incluem, sem limitação, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência semântica e demência com corpos de Lewy.
[0371] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a demência. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com demência.
DEMÊNCIA FRONTOTEMPORAL
[0372] A demência frontotemporal (FTD) é uma condição resultante da deterioração progressiva do lobo frontal do cérebro. Com o tempo, a degeneração pode avançar para o lobo temporal. Perdendo apenas para a doença de Alzheimer (AD) na prevalência, a FTD responde por 20% dos casos de demência pré-senil. As características clínicas da FTD incluem déficits de memória, anormalidades comportamentais, alterações de personalidade e comprometimentos de linguagem (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet. 24:186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51:1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002)).
[0373] Uma porção substancial dos casos da FTD é herdada de maneira autossômica dominante, mas mesmo em uma família, os sintomas podem abranger um espectro, desde FTD com distúrbios comportamentais, até Afasia Progressiva Primária, até Degeneração Ganglionar Corticobasal. A FTD,
como a maioria das doenças neurodegenerativas, pode ser caracterizada pela presença patológica de agregados de proteína específicos no cérebro doente.
Historicamente, as primeiras descrições da FTD reconheceram a presença de acúmulos intraneuronais da proteína Tau hiperfosforilada em emaranhados neurofibrilares ou corpos de Pick. Uma função causal para a proteína Tau associada ao microtúbulo foi respaldada pela identificação de mutações no gene que codifica a proteína Tau em várias famílias (Hutton, M., et al., Nature 393:702-705 (1998). No entanto, a maioria dos cérebros com FTD não mostra acúmulo de Tau hiperfosforilada, mas exibe imunorreatividade à ubiquitina (Ub) e à proteína TAR de ligação ao DNA (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch.
Neurol. 64:1388-1394 (2007)). Foi demonstrado que a maioria dos casos de FTD com inclusões de Ub (FTD-U) carrega mutações no gene da Progranulina.
[0374] Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a FTD. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com FTD.
DOENÇA DE ALZHEIMER
[0375] A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência. Não há cura para a doença, que piora à medida que progride e, eventualmente, leva à morte. Na maioria das vezes, a AD é diagnosticada em pessoas com mais de 65 anos. No entanto, o Alzheimer de início precoce menos prevalente pode ocorrer muito mais cedo. Os sintomas comuns da doença de Alzheimer incluem sintomas comportamentais, como dificuldade em lembrar eventos recentes; sintomas cognitivos, confusão, irritabilidade e agressão, alterações de humor, problemas de linguagem e perda de memória de longo prazo. À medida que a doença progride, as funções corporais são perdidas, levando à morte. A doença de Alzheimer se desenvolve por um período desconhecido e variável antes de se tornar totalmente aparente, e pode progredir sem diagnóstico por anos.
[0376] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Alzheimer. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com doença de Alzheimer.
DOENÇA DE PARKINSON
[0377] A doença de Parkinson, que pode ser chamada de parkinsonismo idiopático ou primário, síndrome rígida hipocinética (HRS) ou paralisia agitante, é um distúrbio cerebral neurodegenerativo que afeta o controle do sistema motor. A morte progressiva das células produtoras de dopamina no cérebro leva aos principais sintomas de Parkinson. Na maioria das vezes, a doença de Parkinson é diagnosticada em pessoas com mais de 50 anos. A doença de Parkinson é idiopática (sem causa conhecida) na maioria das pessoas. No entanto, fatores genéticos também desempenham um papel na doença.
[0378] Os sintomas da doença de Parkinson incluem, sem limitação, tremores nas mãos, braços, pernas, mandíbula e face, rigidez muscular nos membros e tronco, lentidão de movimento (bradicinesia), instabilidade postural, dificuldade para caminhar, problemas neuropsiquiátricos, alterações na fala ou comportamento, depressão, ansiedade, dor, psicose, demência, alucinações e problemas de sono.
[0379] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Parkinson. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com doença de Parkinson.
ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA (ALS)
[0380] Conforme usado neste documento, esclerose lateral amiotrófica (ALS) ou doença do neurônio motor ou doença de Lou Gehrig são usadas de forma intercambiável e referem-se a uma doença debilitante com etiologia variada caracterizada por fraqueza rapidamente progressiva, atrofia e fasciculações musculares, espasticidade muscular, dificuldade na fala (disartria), dificuldade em engolir (disfagia) e dificuldade em respirar (dispneia).
[0381] Foi demonstrado que a progranulina desempenha um papel na ALS (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg Psychiatry.; 78: 754-6) e protege novamente os danos causados por proteínas que causam ALS como TDP-43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). Também foi demonstrado que o pro-NGF induz a morte de oligodendrócitos e neurônios corticospinais mediada por p75 após lesão medular (Beatty et al., Neuron (2002), 36, pp. 375-386; Giehl et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA (2004), 101, pp 6226- 30).
[0382] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a ALS. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com esclerose lateral amiotrófica.
DOENÇA DE HUNTINGTON
[0383] A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene da Huntingtina (HTT). A expansão de uma repetição de tripleto de citocina-adenina-guanina (CAG) no gene Huntingtina resulta na produção de uma forma mutante da proteína Huntingtina (Htt) codificada pelo gene. Essa proteína Huntingtina mutante (mHtt) é tóxica e contribui para a morte neuronal. Os sintomas da doença de Huntington costumam aparecer entre 35 e 44 anos, embora possam aparecer em qualquer idade.
[0384] Os sintomas da doença de Huntington incluem, sem limitação, problemas de controle motor, movimentos aleatórios e espasmódicos (coreia), movimentos oculares anormais, equilíbrio comprometido, convulsões, dificuldade em mastigar, dificuldade em engolir, problemas cognitivos, fala alterada, déficits de memória, dificuldades de pensamento, insônia, fadiga, demência, alterações na personalidade, depressão, ansiedade e comportamento compulsivo.
[0385] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Huntington (HD). Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com doença de Huntington.
TAUPATIA
[0386] As taupatias, ou tauopatias, são uma classe de doença neurodegenerativa causada pela agregação da proteína tau associada ao microtúbulo no cérebro. A doença de Alzheimer (AD) é a taupatia mais conhecida e envolve um acúmulo de proteína tau dentro dos neurônios na forma de emaranhados neurofibrilares insolúveis (NFTs). Outras taupatias e distúrbios incluem paralisia supranuclear progressiva, demência pugilística (encefalopatia traumática crônica), demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig (complexo parkinsonismo- demência de Guam), demência com predomínio de emaranhados, ganglioglioma e gangliocitoma, meningioangiomatose, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, doença de Hallervorden-Spatz, lipofuscinose, doença de Pick, degeneração corticobasal, doença por grãos argirofílicos (AGD), doença de Huntington, demência frontotemporal e degeneração lobar frontotemporal.
[0387] Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a taupatia. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com tautopatia.
ESCLEROSE MÚLTIPLA
[0388] A esclerose múltipla (MS) também pode ser referida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminada. A MS é uma doença inflamatória na qual as bainhas de mielina ao redor dos axônios do cérebro e da medula espinhal são danificadas, levando à desmielinização e cicatrização, bem como a um amplo espectro de sinais e sintomas. A MS afeta a capacidade das células nervosas do cérebro e da medula espinhal de se comunicarem efetivamente. As células nervosas se comunicam enviando sinais elétricos chamados potenciais de ação por fibras longas chamadas axônios, que estão contidos em uma substância isolante chamada mielina. Na MS, o próprio sistema imunológico do corpo ataca e danifica a mielina. Quando a mielina é perdida, os axônios não podem mais conduzir sinais de maneira efetiva. O início da MS geralmente ocorre em jovens adultos e é mais comum em mulheres.
[0389] Os sintomas da MS incluem, sem limitação, alterações na sensação, como perda de sensibilidade ou formigamento; ardência ou dormência, como hipoestesia e parestesia; fraqueza muscular; clônus; espasmos musculares; dificuldade em se mover; dificuldades com coordenação e equilíbrio, como ataxia; problemas na fala, como disartria, ou na deglutição, como disfagia; problemas visuais, como nistagmo, neurite óptica incluindo fosfenos e diplopia; fadiga; dor aguda ou crônica; e dificuldades na bexiga e intestino; comprometimento cognitivo em vários graus; sintomas emocionais de depressão ou humor instável; fenômeno de Uhthoff, que é uma exacerbação dos sintomas existentes devido a uma exposição a temperaturas ambientes mais altas do que as normais; e sinal de Lhermitte, que é uma sensação elétrica que desce pelas costas ao dobrar o pescoço.
[0390] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPA da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a esclerose múltipla. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPA pode modular uma ou mais atividades de SIRPA em um indivíduo com esclerose múltipla.
[0391] Em determinados exemplos de realização, o sujeito ou indivíduo é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos tal como macacos), e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em alguns exemplos de realização, o sujeito ou indivíduo é um ser humano.
[0392] Um anticorpo fornecido neste documento (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo a via parenteral, intrapulmonar, intranasal, administração intralesional, intracerobrospinal, intracraniana, intraespinal, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa em bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, administração intra-arterial, intra-articular, intraperitoneal ou subcutânea. Em alguns exemplos de realização, a administração é administração intravenosa. Em alguns exemplos de realização, a administração é subcutânea. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas,
dependendo, em parte se a administração é breve ou crônica. Os esquemas de dosagem, incluindo mas não se limitando a, administração simples ou múltiplas administrações ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão pulsada, são contemplados na presente invenção.
[0393] Os anticorpos fornecidos neste documento seriam formulados, dosados e administrados de forma consistente com as boas práticas médicas. Fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente o local de entrega do agente, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.
[0394] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, se houve e qual foi a terapia anterior, o histórico clínico do paciente, a reação ao anticorpo, e o critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.
[0395] Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg – 20 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dose inicial candidata para a administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar em cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Em certos exemplos de realização, a frequência de dosagem é três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas ou uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou mais Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas.
Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.
USOS DIAGNÓSTICOS
[0396] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos, qualquer um dos anticorpos anti-SIRPA fornecidos neste documento é útil para detectar a presença de SIRPA em uma amostra ou indivíduo. O termo “detecção”, conforme usado neste documento, abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. São fornecidos métodos de uso dos anticorpos da presente divulgação para fins de diagnóstico, como a detecção de SIRPA em um indivíduo ou em amostras de tecido derivadas de um indivíduo. Em alguns exemplos de realização, o indivíduo é um ser humano.
[0397] O método de detecção pode envolver a quantificação do anticorpo ligado ao antígeno. A detecção de anticorpos em amostras biológicas pode ocorrer com qualquer método conhecido na técnica, incluindo microscopia de imunofluorescência, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, ELISA, análise FACS, imunoprecipitação ou tomografia por emissão de micropósitrons. Em certos exemplos de realização, o anticorpo é radiomarcado, por exemplo, com 18F e, subsequentemente, detectado utilizando análise de tomografia por emissão de micropósitrons. A ligação de anticorpos também pode ser quantificada em um paciente por técnicas não invasivas, como tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por raios X, tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT) e tomografia axial computadorizada (CAT).
ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0398] São fornecidos neste documento artigos de fabricação/manufatura (por exemplo, kit) compreendendo um anticorpo anti- SIRPA descrito neste documento. O artigo de fabricação pode incluir um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo descrito neste documento.
Recipientes podem ser quaisquer embalagens adequadas incluindo, mas não está limitada às ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico), e semelhantes. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade.
[0399] Em alguns exemplos de realização, os kits podem incluir ainda um segundo agente. Em alguns exemplos de realização, o segundo agente é um tampão ou agente diluente farmaceuticamente aceitável, incluindo, mas não limitado a, tal como água para injeção bacteriostática (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Em alguns exemplos de realização, o segundo agente é um agente farmaceuticamente ativo conforme descrito acima.
[0400] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos artigos de fabricação, o artigo de fabricação inclui ainda instruções para uso de acordo com os métodos desta descrição. Geralmente, as instruções incluem informações sobre dosagem, cronograma de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Em alguns exemplos de realização, essas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo anti- SIRPA isolado da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPA aqui descrito) para a prevenção, redução do risco ou tratamento de um indivíduo com uma doença, distúrbio ou lesão selecionada a partir de demência, demência frontotemporal, mal de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença tipo taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica, artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behcet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar corticobasal, encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomatosos, sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão medular, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada ao envelhecimento, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração retiniana, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget, e câncer incluindo câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC), mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mieloesclerose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloides, tumores que expressam SIRPA, câncer de tireoide, infecções, herpes do CNS, infecções parasitárias, infecção por tripanossomas, infecção por T. cruzi, infecção por Pseudomonas aeruginosa, infecção por Leishmania donovani, infecção por Streptococcus do grupo B, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por Neisseria meningiditis, HIV tipo I, e Haemophilus influenza, de acordo com quaisquer métodos dessa descrição. Em alguns exemplos de realização, as instruções incluem instruções para o uso do anticorpo anti- SIRPA e o segundo agente (por exemplo, o segundo agente farmaceuticamente ativo).
[0401] A presente descrição será compreendida mais amplamente pela referência aos exemplos a seguir. Tais Exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente divulgação. Todas as citações ao longo da descrição são expressamente incorporadas a este documento por referência.
EXEMPLOS
[0402] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas com o objetivo de ilustrar e não como forma de limitação da presente invenção. Os versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.
EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA
[0403] A sequência de aminoácidos da proteína SIRPA humana é apresentada abaixo na SEQ ID NO: 1. A SIRPA humana contém um peptídeo sinal localizado nos resíduos de aminoácidos 1-30 da SEQ ID NO: 1. A SIRPA humana contém um domínio extracelular tipo variável semelhante à Imunoglobulina (IgV) localizado nos resíduos amino 32-137 da SEQ ID NO: 1; sequências de domínio extracelular tipo constante semelhante à Imunoglobulina (IgC) adicionais localizadas nos resíduos de aminoácidos 148- 247 e 254-348 da SEQ ID NO: 1; um domínio transmembranar localizado nos resíduos de aminoácidos 374-394 da SEQ ID NO: 1; e um domínio intracelular localizado nos resíduos de aminoácidos 395-504 da SEQ ID NO: 1.
[0404] Sequência de aminoácidos da SIRPA v1 humana (SEQ ID NO: 1): 10 20 30 40 50
MEPAGPAPGR LGPLLCLLLA ASCAWSGVAG EEELQVIQPD KSVLVAAGET 60 70 80 90 100
ATLRCTATSL IPVGPIQWFR GAGPGRELIY NQKEGHFPRV TTVSDLTKRN 110 120 130 140 150
NMDFSIRIGN ITPADAGTYY CVKFRKGSPD DVEFKSGAGT ELSVRAKPSA 160 170 180 190 200
PVVSGPAARA TPQHTVSFTC ESHGFSPRDI TLKWFKNGNE LSDFQTNVDP 210 220 230 240 250
VGESVSYSIH STAKVVLTRE DVHSQVICEV AHVTLQGDPL RGTANLSETI
RVPPTLEVTQ QPVRAENQVN VTCQVRKFYP QRLQLTWLEN GNVSRTETAS 310 320 330 340 350
TVTENKDGTY NWMSWLLVNV SAHRDDVKLT CQVEHDGQPA VSKSHDLKVS 360 370 380 390 400
AHPKEQGSNT AAENTGSNER NIYIVVGVVC TLLVALLMAA LYLVRIRQKK 410 420 430 440 450
AQGSTSSTRL HEPEKNAREI TQDTNDITYA DLNLPKGKKP APQAAEPNNH 460 470 480 490 500
TEYASIQTSP QPASEDTLTY ADLDMVHLNR TPKQPAPKPE PSFSEYASVQ VPRK
[0405] As análises da estrutura cristalina dos complexos SIRPA- CD47 resolvem o sítio de ligação do ligante para as alças (loops) variáveis que ligam as cadeias da folha β no domínio IgV da SIRPA. A interface de ligação de CD47 consiste nos resíduos de aminoácidos S59-P65, L96-F104 e K123-D130 da SIRPA.
[0406] Vários polimorfismos da SIRPA foram identificados em humanos. Uma vez que a maioria das variações na sequência está além do sítio de ligação do ligante CD47, a maioria das variantes SIRPA examinadas parecem ligar-se ao CD47 com afinidades semelhantes. Outro membro da família SIRP, SIRPB1, compartilha alta homologia de sequência com SIRPA, mas não consegue se ligar ao CD47. Uma única substituição A57M é suficiente para reorganizar a interface de ligação do ligante S59-P65 para evitar a ligação de SIRPB1 ao CD47. Além disso, a interação SIRPA-CD47 é altamente espécie-específica. A SIRPA humana não consegue ligar-se ao CD47 de camundongo, rato ou vaca (entre as espécies testadas) e o CD47 humano reconhece apenas uma única variante alélica de SIRPA de camundongo expressa pela cepa de camundongo NOD.
[0407] A análise de proteína BLAST das sequências SIRPA de várias espécies mostra um grau significativo de identidade com a SIRPA humana (FIG. 1). A alta homologia de sequência dentro da família SIRP apresenta um desafio significativo na geração de anticorpos SIRPA- específicos, enquanto ainda mantêm a reatividade cruzada para antígenos SIRPA não humanos.
EXEMPLO 2 CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPA HUMANIZADO
[0408] O anticorpo SIRPA de camundongo m3F9 aqui discutido, que contém uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0409] As Tabelas 4 e 5 abaixo listam sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve derivadas de hibridoma de anticorpo anti-SIRPA murino, m3F9, assim como as sequências humanizadas correspondentes (referidas como “h3F9”). A primeira sequência de anticorpo humanizada para o domínio variável de cadeia pesada 3F9 do anticorpo anti-SIRPA (h3F9-H1) é uma “troca de CDR” sem alterações na sequência da região estrutural (framework) humana.
[0410] A subsequente sequência da região variável de cadeia pesada humanizada (h3F9-H2) tem resíduos da região estrutural alterados em determinadas junções de CDR. (Consulte a Figura 2A). A FIG. 2A lista potenciais sequências humanizadas do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti- SIRPA 3F9. A sequência humanizada é baseada na estrutura aceptora IGHV3- 23*01 e na região de junção IGHJ4*01.
[0411] A primeira sequência humanizada para o domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-SIRPA (h3F9-H1) é uma “troca de CDR” do domínio variável de cadeia leve sem alterações na sequência da região estrutural (framework) humana. As sequências subsequentes da região variável de cadeia leve humanizada alteram alguns resíduos de aminoácidos estruturais (h3F9-L2 e h3F9 -L3). (Consulte a Figura 2B). A FIG. 2B lista as sequências humanizadas potenciais do domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-SIRPA 3F9.
[0412] A sequência humanizada é baseada na estrutura aceptora IGKV3-11*01 e na região de junção IGKJ2*01. Sequências de CDR estão anotadas em negrito. As definições de CDR são de AbM do site www.bioinf.org.uk/abs/.”b” indica cadeias laterais encobertas; “p” parcialmente encobertas; “i” indica cadeia lateral na interface entre os domínios VH e VL. Diferenças de sequência entre linhagens germinativas humanas e murinas estão marcadas com asterisco (*). As potenciais mutações adicionais nas regiões estruturais são indicadas na sequência abaixo. Alterações potenciais nas sequências de CDR estão anotadas abaixo de cada sequência CDR. Isso pode prevenir a desamidação da asparagina (N). Todos as seis versões humanizadas diferentes de anticorpo anti-SIRPA 3F9 (baseado nas seguintes combinações de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve: h3F9-H1/L1; h3F9-H1/L2; h3F9-H1/L3; h3F9-H2/L1; h3F9-H2/L2; e h3F9-H2/L3) foram enxertadas em uma região estrutural de IgG4 humana, produzida de forma recombinante em células CHO-K1, e os anticorpos foram adicionalmente caracterizados como descrito abaixo.
TABELA 4 Anticorpo Sequências da região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: m3F9 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMS 2
WVRQTPEKRLEWVATISDYGGSYTYYPDSVKGRFTI SRDNAKYTLYLQMSSLRSEDTALYYCARPPYDDYYG
GFAYWGQGTLVTVSA h3F9-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS 3
WVRQAPGKGLEWVSTISDYGGSYTYYADSVKGRFTI
Anticorpo Sequências da região variável de cadeia pesada SEQ ID NO:
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPPYDDYY
GGFAYWGQGTLVTVSS h3F9-H2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS 4
WVRQAPGKGLEWVATISDYGGSYTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYY
GGFAYWGQGTLVTVSS TABELA 5 Anticorpo Sequências da região variável de cadeia leve SEQ ID NO: m3F9 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSY 5
MHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGS GTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHNRELPCTFGGGTK
LEIK h3F9-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSSSGYSY 6
MHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHNRELPCTFGQGTK
LEIK h3F9-L2 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSSSGYSY 7
MHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHNRELPCTFGQGTK
LEIK h3F9-L3 DIQLTQSPSSLSVSVGDRATITCRASKSVSSSGYSY 8
MHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHNRELPCTFGQGTK LEIK
[0413] As medições de finidade para os anticorpos anti-SIRPA foram realizadas da seguinte forma. Os dados de interferometria de biocamada (BLI) foram coletados em um instrumento Pall ForteBio Octet RED96. A análise dos dados foi realizada com o software ForteBio Data Analysis, versão 9.0. O tampão cinético padrão (PBS, 0,1 BSA, 0,02 Tween-20, pH 7,2) foi usado para o ensaio e para a preparação de reagentes. Após o equilíbrio do sensor em tampão, cada um dos anticorpos anti-SIRPA humanizados 3F9 (2,5 µg/mL, tempo de carregamento de 300 s) foi capturado em biossensores anti-Fc de IgG Humana Capture Dip and Read (Pall ForteBio, Menlo Park, CA).
Concentrações variáveis (0 - 200 nM) de SIRPA humana marcada com histidina (Sino Biological, Pequim, China) foram então ligadas à superfície anti- SIRPA capturada (tempo de associação de 300 s, tempo de dissociação de 600 s). O sinal BLI resultante foi obtido como a diferença na resposta do sensor de referência (2,5 µg/mL IgG + 0 nM SIRPA). Um controle de ligante zero (0 µg/mL de IgG + 200 nM SIRPA) não mostrou ligação mensurável não específica de SIRPA à superfície da ponta do sensor. As medições da afinidade para o anticorpo m3F9 parental foram realizadas usando um método semelhante, exceto que foi utilizado o anticorpo capturado em biossensores anti-Fc de IgG de camundongo. A análise cinética de multiconcentração foi realizada usando um modelo de interação 1:1 extrair constantes de taxa de associação e de dissociação (ka e kd, respectivamente) para cada anticorpo.
As constantes de afinidade (KD) foram calculadas a partir da razão kd/ka.
[0414] Os anticorpos anti-Fc de IgG de camundongo imobilizados ou os anticorpos anti-Fc de IgG humana capturaram o anticorpo anti-SIRPA 3F9 murino e o anticorpo anti-SIRPA 3F9 humanizado em biossensores, respectivamente. Concentrações crescentes da isoforma 1 de huSIRPA marcada com histidina (10-500 nM) fluíram sobre o anticorpo anti-SIRPA 3F9 capturado para registrar os traços. Os traços melhores a partir dos sensorgramas resultantes foram analisados para calcular a taxa de associação, taxa de dissociação, e valores de afinidade. As três variantes do anticorpo anti- SIRPA humanizado 3F9 testadas foram mAb 14.70.1 (sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e sequência variável de cadeia leve de SEQ
ID NO: 6), mAb 14.70.2 (sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7) e mAb 14.70.4 (sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4 e sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6). As cinéticas de ligação mensuradas de anticorpos anti-SIRPA humanizados 3F9 estão resumidas na Tabela 6 abaixo, como valores de ka, kd, e KD extraídos. Das seis variantes de h3F9 produzidas, 3 anticorpos anti-SIRPA (mAb 14.70.1: H1/L1; mAb 14.70.2: H1/L2; mAb
14.70.4: H2/L1) exibiram afinidades para o antígeno SIRPA solúvel semelhantes ao do anticorpo parental anti-SIRPA m3F9 (sequência variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2 e sequência variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5).
TABELA 6 -1 -1 Anticorpo clone 3F9 Kon (M s ) Koff (s-1) KD (nM) IgG1 m3F9 parental 5,08E+04 1,00E-03 18 mAb 14,70,1 1,10E+05 2,00E-03 19 mAb 14,70,2 1,10E+05 2,20E-03 20 mAb 14,70,4 8,60E+04 9,40E-04 11
[0415] Além disso, a ligação ao antígeno solúvel, também foram realizadas medições de afinidade à base de células para determinar as afinidades aparentes de anticorpos anti-SIRPA h3F9 em relação ao anticorpo anti-SIRPA m3F9 ao antígeno SIRPA v1 ligado à membrana. Os valores de EC50 atribuem afinidade relativa ao adicionar concentrações crescentes de anticorpos anti-SIRPA 3F9 a células BWZ com superexpressão de SIRPA humana. Os anticorpos ligados ao receptor foram detectados por coloração de células com anti-Fc de IgG APC de camundongo ou anticorpo secundário anti- IgG humana PE. Diluições em série dos anticorpos monoclonais foram adicionados a 105 células que superexpressam BWZ huSIRPA (BWZ- huSIRPA) e deixou-se atingir o equilíbrio de ligação a 4ºC. Após a adição de anticorpo secundário marcado com fluorescência e breves etapas de lavagem, os valores de intensidade fluorescente média (MFI) como uma função da concentração de anticorpo titulada foram registrados por análise FACS. As curvas foram ajustadas usando análise de regressão não linear com software Graphpad Prism 6. Experimentos de titulação baseados em células com anticorpos h3F9 anti-SIRPA mAb 14.70.1, mAb 14.70.2 e mAb 14.70.4 produziram valores de EC50 de 1,065 nM, 0,9682 nM e 1,607 nM, respectivamente. Os anticorpos anti-SIRPA 3F9 humanizados produziram valores de EC50 mais baixos do que o anticorpo anti-SIRPA m3F9 (EC50 = 2,1 nM), mostrando afinidade de ligação melhorada dos anticorpos humanizados em relação àquela determinada para o anticorpo anti-SIRPA 3F9 murino.
[0416] Um ensaio baseado em competição também foi realizado para calcular os valores de IC50 dos anticorpos anti-SIRPA, onde concentrações crescentes de anticorpos anti-SIRPA 3F9 humanizados e murinos foram adicionados às células BWZ-huSIRPA v1 para deslocar um anticorpo de referência marcado com fluoróforo. Os valores de IC50 fornecem outra comparação de afinidade relativa. Em um ensaio baseado em competição, concentrações crescentes de anticorpos anti-SIRPA 3F9 foram adicionadas às células que expressam huSIRPA para deslocar um anticorpo de referência marcado com fluoróforo. Os valores de IC50 foram determinados assim: m3F9 = 11,54 nM; mAb 14.70.1 = 3,303 nM; mAb 14.70.2 = 2,185 nM; mAb 14.70.4 = 4,606 nM). Estes resultados demonstram que os anticorpos humanizados anti-SIRPA da presente divulgação foram competidores mais eficazes contra o anticorpo anti-SIRPA de referência m3F9 pela ligação à SIRPA.
[0417] A capacidade dos anticorpos anti-SIRPA h3F9 em reduzir a expressão da superfície celular de SIRPA foi avaliada em macrófagos humanos primários (huMacs). Monócitos humanos foram isolados do sangue periférico de doadores saudáveis e diferenciados em macrófagos in vitro por suplementação de meio de crescimento com M-CSF humano. Após a diferenciação, os huMacs foram coletados e semeados em placas de cultura de tecidos de 96 poços com concentração crescente de controle de isotipo ou anticorpos anti-SIRPA solúveis e incubados durante a noite a 37ºC. As células foram analisadas por citometria de fluxo para expressão de SIRPA na superfície usando um anticorpo anti-SIRPA humana conjugado DyLight650 (clone SA56) pertencente a um compartimento de epítopo separado do anticorpo anti-SIRPA 3F9. Como mostrado na FIG. 3, as variantes do anticorpo anti-SIRPA h3F9 (mAb 14.70.1 (70.1), mAb 14.70.2 (70.2) e mAb 14.70.4 (70.4)) regularam negativamente os níveis de expressão do receptor SIRPA em macrófagos de uma maneira dose-dependente. Entretanto, o anticorpo parental m3F9 anti-SIRPA exibiu maior regulação negativa máxima do receptor do que os anticorpos humanizados, apesar das propriedades de ligação ao antígeno semelhantes discutidas acima. Estes resultados sugerem que as propriedades do anticorpo anti-SIRPA além do acoplamento do receptor determinam a atividade funcional do anticorpo anti-SIRPA 3F9 em macrófagos.
EXEMPLO 3 ANTICORPOS ANTI-SIRPA REQUEREM RECEPTORES FC GAMA (FCΓRS) PARA
ATIVIDADE FUNCIONAL
[0418] A principal diferença entre os anticorpos anti-SIRPA 3F9 humano e murino é a capacidade de envolver os receptores Fc gama (FcγRs).
Os anticorpos anti-SIRPA humanizados foram enxertados em uma estrutural central Fc de IgG4 humana conhecida por possuir fracas propriedades de ligação ao FcγR. O hibridoma do anticorpo anti-SIRPA 3F9, apesar de ser um anticorpo IgG1 murino, ainda mantém a atividade de ligação em relação a certos FcγRs humanos. Para verificar se os FcγRs modulam a atividade funcional dos anticorpos anti-SIRPA, o anticorpo m3F9 anti-SIRPA foi tratado enzimaticamente com EndoS para remover o glicano Fc na Asn297, um determinante chave que medeia a interação IgG-FcγR. Macrófagos humanos primários de 2 doadores saudáveis foram tratados durante a noite com concentrações crescentes de anticorpo m3F9 anti-SIRPA glicosilado ou desglicosilado. As células foram subsequentemente coradas com um anticorpo de referência anti-SIRPA conjugado com DyLight65 0 (SA56-DyL650) que se liga a um compartimento epitópico distinto e foram analisadas então quanto a expressão de SIRPA na superfície por análise FACS.
[0419] Como mostrado na FIG. 4A, ambas as glicoformas de anticorpo anti-SIRPA m3F9 regularam negativamente de maneira significativa as expressão de SIRPA na superfície celular. No entanto, em ambos os doadores, a variante desglicosilada do anticorpo anti-SIRPA m3F9 exibiu atividade máxima reduzida em comparação com a observada para a forma glicosilada do anticorpo. Em particular, o anticorpo m3F9 anti-SIRPA glicosilado regulou negativamente a expressão de SIRPA em até 90% e 85% no Doador (Dnr) 413 e Doador 414, respectivamente; ao passo que o anticorpo m3F9 anti- SIRPA desglicosilado atingiu apenas 70% e 75% da regulação negativa do receptor SIRPA nos macrófagos dos mesmos doadores, respectivamente. Esta constatação sugere que os anticorpos anti-SIRPA, especificamente o anticorpo m3F9, requer acoplamento ao FcγR para a regulação negativa reforçada da expressão de SIRPA na superfície celular. Os resultados na FIG. 4A são apresentados como porcentagem da ligação do anticorpo de referência dividindo o valor MFI de amostras tratadas com anticorpos anti-SIRPA pelo valor MFI de amostras tratadas com o controle isotípico.
[0420] Além da regulação negativa do receptor mediada por anticorpos, conforme divulgado acima, o papel dos FcγRs foi avaliado no aumento da fagocitose de células tumorais mediada por anticorpo 3F9 anti- SIRPA. Um ensaio de fagocitose de células tumorais foi desenvolvido com base na fluorescência pHrodo. Macrófagos humanos primários foram tratados durante a noite com anticorpo de controle isotípico (MOPC) ou variantes de anticorpo anti-SIRPA 3F9 indicadas. Células Raji marcadas com corante pHrodo foram adicionadas aos macrófagos e incubadas a 37ºC por 2 horas. A Red Avidin (Invitrogen) é uma molécula de estreptavidina conjugada com o corante pHrodo Red, um marcador fluorogênico que adquire fluorescência em ambientes ácidos, como o fagossoma. Para marcação de células tumorais alvo, 500 nM Red Avidin foi misturado com 15 nM de Lens Culinaris Agglutinin biotinilado (LCA; Vector Labs). Os complexos Avidin Red-LCA foram então misturados em uma proporção volumétrica de 1:1 com 400.000 células Raji em meio RPMI sem soro em gelo. As propriedades de ligação de açúcar do LCA ligam a avidina Red Avidin às estruturas de carboidratos na superfície da célula tumoral. Após breves etapas de lavagem, células Raji marcadas com Red Avidin-LCA foram misturadas com macrófagos humanos derivados de monócitos em meio RPMI sem soro e incubadas a 37ºC por 2 horas. Os macrófagos foram então coletados e corados em gelo com anti-CD14 APC em tampão FACS contendo anticorpos bloqueadores de FcγR. A atividade fagocítica foi medida contando a porcentagem de macrófagos duplos positivos para CD14/pHrodo. Como controle, células Raji não marcadas foram misturadas com macrófagos para estabelecer os níveis de fluorescência de fundo. Os resultados na FIG. 4B são apresentados como o aumento da porcentagem na população de macrófagos duplo-positivos pHrodo/CD14.
[0421] Como mostrado na FIG. 4B, macrófagos tratados durante a noite com anticorpo anti-SIRPA m3F9 glicosilado exibiram um aumento de ~ 2 vezes na fagocitose de células tumorais em relação ao observado usando macrófagos tratados com anticorpo de controle isotípico. Os macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA m3F9 desglicosilado exibiram aumento de ~ 1,5 vezes na fagocitose de células tumorais em relação aos macrófagos tratados como controle isotípico. Esse aumento de ~ 1,5 vezes na fagocitose de células tumorais representa uma diminuição estatisticamente significativa ~
50% da atividade em relação ao observado com o anticorpo anti-SIRPA m3F9 glicosilado. Além disso, os macrófagos tratados com h3F9 IgG4 (mAb 14.70.1 ou mAb 14.70.2) não exibiram qualquer capacidade para aumentar a fagocitose de células tumorais acima dos níveis basais.
[0422] Estudos anteriores estabeleceram uma correlação entre o aumento da atividade fagocítica e a regulação negativa de CD14 após a estimulação de macrófagos com o anticorpo anti-SIRPA 3F9. Para determinar se esta correlação também depende, pelo menos em parte, de FcγRs, macrófagos humanos primários foram tratados durante a noite com variantes de anticorpos m3F9 glicosilados ou h3F9 IgG4 anti-SIRPA (mAb 14.70.1, mAb 14.70.2 e m Ab
14.70.4) e testado para fagocitose de células tumorais e expressão de CD14. Como mostrado na FIG. 5 A, apenas macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA m3F9 mostraram fagocitose aumentada de células Raji em relação ao observado com macrófagos tratados com anticorpo de controle isotípico. Os resultados são apresentados como o aumento da porcentagem da população de macrófagos duplo-positivos pHrodo/CD14. Os anticorpos humanizados anti-SIRPA IgG4 não aumentaram a fagocitose das células Raji. Da mesma forma, apenas a estimulação do anticorpo m3F9 anti-SIRPA regulou negativamente a expressão de CD14 em macrófagos, enquanto as variantes do anticorpo anti-SIRPA h3F9 IgG4 não alteraram a expressão de CD14 (FIG. 5B). Em adição ao suporte de uma correlação entre o nível de expressão de CD14 e a atividade fagocítica em macrófagos, estes resultados confirmaram que a atividade funcional do anticorpo anti-SIRPA 3F9 é dependente, pelo menos em parte, de FcγRs.
EXEMPLO 4 REGULAÇÃO NEGATIVA DE CD32 POR ANTICORPOS ANTI-SIRPA
[0423] Além do antígeno alvo de interesse, as células da linhagem mieloide também expressam múltiplos receptores Fc capazes de se ligar ao domínio Fc de anticorpos terapêuticos. Os receptores Fc gama (FcγR) constituem a classe de receptor mais bem caracterizada e mais potente para mediar funções efetoras dependentes de Fc. Os FcγRs consistem em receptores de ativação associados a ITAM (CD64/FcγRI, CD32A/FcγRIIA e CD16A/FcγRIIIA) e um receptor inibidor possuindo ITIM (CD32B/FcγRIIB) e a coexpressão de receptores de ativação/inibição na mesma célula estabelece um limiar para ativação celular.
Em geral, a ligação de FcγRs ativadores por complexos imunes inicia várias cascatas de sinalização que levam à ativação celular e subsequente indução de funções efetoras. Essas atividades variam entre os tipos de células mieloides, mas podem incluir citotoxicidade celular dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpos e regulação positiva de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, etc. Em contraste, a ligação do receptor inibitório, FcγRIIB, por complexos imunes neutraliza os sinais imunoestimuladores das FcγRs de ativação e apoiam a manutenção da homeostase do tecido. Por exemplo, vários estudos estabelecem que o nocaute genético de FcγRIIB resulta em aumento da atividade macrofágica pró-inflamatória em modelos murinos de inflamação mediada por imunocomplexos. Uma vez que FcγRIIB é o único FcγR com atividade inibitória, ele desempenha um papel central na regulação da inflamação mediada por FcγR por células mieloides. No contexto do microambiente tumoral, os níveis de expressão de FcγRIIB podem determinar o estado de polarização de macrófagos associados ao tumor e a regulação da função efetora de macrófagos in vivo.
[0424] Para determinar qual FcγR contribui para a atividade in vitro do anticorpo anti-SIRPA 3F9, macrófagos derivados de monócitos obtidos de dois doadores saudáveis foram tratados durante a noite com o anticorpo de controle isotípico ou anticorpo anti-SIRPA m3F9 e então avaliados quanto aos níveis de expressão na superfície de FcγRIIIA (CD16), FcγRI (CD64) e FcγRIIA/B (CD32A/B). Como mostrado na FIG. 6A, o tratamento com o anticorpo anti-SIRPA m3F9 reduziu substancialmente a expressão de CD32A/B na superfície em relação à expressão observada nos macrófagos tratados com o controle isotípico. Uma vez que o anticorpo de detecção usado para medir os níveis de superfície de FcγRII (clone FUN-2; Biolegend) não distingue entre o receptor de ativação FcγRIIA e o receptor inibitório FcγRIIB, este ensaio foi repetido com anticorpos específicos para o receptor. Conforme descrito anteriormente, macrófagos derivados de monócitos obtidos de dois doadores saudáveis foram tratados durante a noite com o anticorpo de controle de isotipo ou o anticorpo variante anti-SIRPA 3F9 indicado. A FIG. 6B mostra que o anticorpo anti-SIRPA m3F9 regulou negativamente FcγRIIA de maneira significativa em macrófagos por ~ 70-85% em relação ao observado nas células tratadas com o anticorpo isotípico de controle. Este efeito era dependente do domínio Fc uma vez que tanto a variante h3F9 IgG4 (mAb
14.70.2) e a forma desglicosilada do anticorpo murino anulou a regulação negativa de FcγRIIA.
[0425] Ao avaliar a expressão de FcγRIIB na superfície, o tratamento com anticorpo anti-SIRPA m3F9 reduziu a expressão do receptor inibitório para níveis quase indetectáveis em relação ao observado em macrófagos tratados com anticorpo de controle isotípico (FIG. 6B). Em contraste, nenhuma regulação negativa significativa de FcγRI/CD64 ou FcγRIIIA/CD16A foi evidente em macrófagos tratados com anticorpo anti- SIRPA 3F9 em relação a células tratadas com controle isotípico, indicando que o tratamento com anticorpo anti-SIRPA 3F9 não altera a expressão de CD16 e CD64 em macrófagos humanos primários (dados não mostrados).
[0426] Para confirmar que o CD32A/B é necessário para a atividade funcional do anticorpo anti-SIRPA m3F9, experimentos de bloqueio seletivo de FcγR foram realizados para avaliar o papel de FcγRs individuais na regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos e fagocitose de células tumorais. Em experimentos de bloqueio, macrófagos humanos primários de dois doadores saudáveis foram pré-incubados com anticorpos bloqueadores anti-CD16 ou anti-CD32A/B por 15 minutos em gelo. Em seguida, as células foram incubadas durante a noite com o controle isotípico (MOPC21) ou anticorpos anti-SIRPA m3F9. A expressão de SIRPA foi detectada com anticorpo anti-SIRPA de referência conjugado com DyLight650 (SA56-DyL650). Os resultados são apresentados como porcentagem da ligação do anticorpo de referência dividindo o valor MFI de amostras tratadas com anticorpos anti-SIRPA pelo valor MFI de amostras tratadas com o controle isotípico. Como mostrado na FIG. 7A, o bloqueio de CD16 não interrompeu a regulação negativa de SIRPA após o tratamento com anticorpo anti-SIRPA m3F9 em relação ao observado em macrófagos não tratados com anticorpos bloqueadores de FcγR. Em contrapartida, a regulação negativa de SIRPA mediada por m3F9 foi significativamente prejudicada em macrófagos pré-incubados com anticorpos bloqueadores anti-CD32A/B.
[0427] Para determinar se o bloqueio CD32A/B também impede a fagocitose, macrófagos humanos primários foram pré-incubados com anticorpo de bloqueio anti-CD32A/B e tratados durante a noite com o anticorpo de controle isotípico ou anticorpo anti-SIRPA m3F9. Células Raji marcadas com corante pHrodo foram misturadas aos macrófagos e incubadas a 37ºC por 2 horas. Os resultados são apresentados como o aumento da porcentagem da população de macrófagos duplo-positivos pHrodo/CD14. Como mostrado na FIG. 7B, os macrófagos tratados com m3F9 de ambos os doadores aumentaram a fagocitose de células Raji ~ 2 vezes em relação ao observado em macrófagos tratados com anticorpo de controle isotípico. No entanto, o bloqueio de CD32A/B bloqueou parcial ou completamente o aumento da fagocitose de células tumorais mediado por m3F9. Analisados em conjunto, estes resultados estabelecem que o envolvimento CD32A/B é funcionalmente necessário para a atividade do anticorpo anti-SIRPA m3F9.
EXEMPLO 5 MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA H3F9
[0428] A maturação de afinidade do anticorpo anti-SIRPA h3F9 humanizado foi realizada. Resumidamente, certos resíduos de aminoácidos na cadeia pesada ou leve foram seletivamente mutagenizados e os mutantes que melhoraram a ligação foram selecionados por meio de rodadas adicionais de triagem. Esse processo melhora simultaneamente a especificidade, a reatividade cruzada das espécies e os perfis de desenvolvibilidade, permitindo o ajuste preciso das propriedades envolvidas no mecanismo de ação desejado, potência em ensaios biológicos e modelagem pré-clínica. As caracterizações incluíram medições de afinidade Forte Bio e MSD, ligação celular e vários ensaios de capacidade de desenvolvimento. Após a primeira rodada de maturação por afinidade, os anticorpos com afinidade aprimorada também exibiram reatividade poliespecífica (PSR) aprimorada, que é usada para determinar a ligação inespecífica do anticorpo. Assim, uma segunda rodada de maturação de afinidade foi realizada para melhorar a afinidade sem elevar a PSR.
SEQUÊNCIAS DE DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPO
[0429] Usando técnicas padrão, as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada dos anticorpos maturados por afinidade aqui descritos foram determinadas. As sequências da HVR de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas na Tabela 7 - 8. As sequências da HVR de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas na Tabela 7 . As sequências da HVR de cadeia pesada dos anticorpos são apresentadas na Tabela 8 . As sequências da região estrutural (FR) da cadeia leve e da cadeia pesada dos anticorpos são apresentadas na Tabela 9. As sequências da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas abaixo na Tabela 10.
TABELA 7 SEQUÊNCIAS HVR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR
AFINIDADE SEQ ID mAb ID (3F9-#) NO: HVR-L1 RASKSVSSGGYSYMH 9 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25 HVR-L2 LASNLES 10 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25 HVR-L3 QHNRELPST 11 1, 10, e 18 QHNRELPCT 12 2 QHNRELPIT 13 3, 11, e 19 QHNRELPPT 14 4, 12, e 20 QHNRELPTT 15 5, 13, e 21 QHNRELPVT 16 6, 14, e 22 QHNRELPAT 17 7, 15, e 23 QHNRELPGT 18 8, 16, e 24 QHNRELPWT 19 9, 17, e 25 TABELA 8 SEQUÊNCIAS HVR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS
POR AFINIDADE SEQ ID NO: mAb ID (3F9-#) HVR-H1 GFTFSSYAMS 20 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25 HVR-H2 TISEYGGSYTYYAESVKG 21 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25 HVR-H3 PPYDDYYGGFAY 22 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, e 9 PPYDDYYGGFRY 23 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, e 17 PPYDDYYGGFQY 24 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25
TABELA 9 SEQUÊNCIAS DA FR DE CADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA
MATURADOS POR AFINIDADE
FR VH SEQ ID VL SEQ ID NO: NO: FR 1 EVQLLESGGGLVQPGGSLR 25 DIQLTQSPSSLSASVGDR 29
LSCAAS VTITC FR 2 WVRQAPGKGLEWVA 26 WYQQKPGKAPKLLIY 30 FR 3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSL 27 GVPSRFSGSGSGTDFTL 31
RAEDTAVYYCAR TISSVQPEDFATYYC FR 4 WGQGTLVTVSS 28 FGQGTKLEIK 32 TABELA 10 Região Variável de Cadeia Pesada SEQ ID mAb ID (3F9-#) NO: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT 33 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, FSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYG e9
GSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFAYW
GQGTLVTVSS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT 34 10, 11, 12, 13, 14, FSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYG 15, 16, e 17
GSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFRY
WGQGTLVTVSS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT 35 18, 19, 20, 21, 22, FSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYG 23, 24, e 25
GSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFQY
WGQGTLVTVSS Região Variável de Cadeia Leve SEQ ID mAb ID (3F9-#) NO: DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 36 1, 10, e 18
Região Variável de Cadeia Pesada
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASN LESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPED
FATYYCQHNRELPSTFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 37 2
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPCTFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 38 3, 11, e 19
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPITFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 39 4, 12, e 20
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPPTFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 40 5, 13, e 21
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPTTFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 41 6, 14, e 22
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPVTFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 42 7, 15, e 23
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE
DFATYYCQHNRELPATFGQGTKLEIK DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 43 8, 16, e 24
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPE DFATYYCQHNRELPGTFGQGTKLEIK
Região Variável de Cadeia Pesada DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSV 44 9, 17, e 25
SSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASN LESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPED
FATYYCQHNRELPWTFGQGTKLEIK EXEMPLO 6 CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE
[0430] A caracterização inicial de anticorpos anti-SIRPA maturados por afinidade divulgados na presente invenção compreendeu a aquisição de medições de afinidade de antígeno usando interferometria de bio- camada (BLI) em um instrumento Pall ForteBio Octet RED96. Os anticorpos anti-Fc de IgG de camundongo imobilizados ou os anticorpos anti-Fc de IgG humana capturaram o anticorpo anti-SIRPA 3F9 murino e o anticorpo anti- SIRPA 3F9 humanizado em biossensores, respectivamente. A cinética de ciclo único foi realizada com 25 nM de huSIRPA [qual variante?] ou 50 nM de huSIRPB1 fluindo sobre o anticorpo capturado 3F9 para registrar traços. A análise dos dados foi realizada com o software ForteBio Data Analysis, versão
9.0. O tampão cinético padrão (PBS, 0,1 BSA, 0,02 Tween-20, pH 7,2) foi usado para o ensaio e para a preparação de reagentes. Após o equilíbrio do sensor em tampão, cada um dos anticorpos anti-SIRPA h3F9 (2 µg/mL, tempo de carregamento de 300 s) ou variantes amadurecidas por afinidade do anticorpo anti-SIRPA h3F9 foram capturados em biossensores anti-Fc de IgG Humana Capture Dip and Read (Pall ForteBio, Menlo Park, CA). 50 nM de SIRPA v1 humana marcado com histidina ou SIRPB1 humano (Novoprotein, Summit, NJ, EUA) foram ligados à superfície revestida com anticorpo anti- SIRPA capturado (tempo de associação de 200 s, tempo de dissociação de 900 s). O sinal BLI resultante foi obtido como a diferença na resposta do sensor de referência (2 µg/mL 3F9 + 0 nM SIRPA). Um controle de ligante zero (0 µg/mL de 3F9 + 200 nM SIRPA) não mostrou ligação mensurável não específica de SIRPA à superfície da ponta do sensor. A análise cinética de curba única foi realizada usando um modelo de interação 1:1 extrair constantes de taxa de associação e de dissociação (ka e kd, respectivamente) para cada anticorpo. As constantes de afinidade (KD) foram calculadas a partir da razão kd/ka. Sensorgramas de 25 anticorpos de progênie anti-SIRPA e um anticorpo parental que se liga à huSIRPA e huSIRPB1 solúvel foram obtidos, e os traços de melhor ajuste foram usados para calcular a taxa de associação, a taxa de dissociação e os valores de afinidade. As medições de afinidade (ka, kd e KD) derivadas da análise de ajuste de curva dos sensorgramas obtidos a partir desses experimentos estão resumidas na Tabela 11. Todos os anticorpos anti- SIRPA maturados por afinidade careciam de qualquer reatividade cruzada mensurável com huSIRPB1 (dados não mostrados) e seis anticorpos anti- SIRPA maturados por afinidade (3F9-18, 3F9 -12, 3F9 -23, 3F9 -14, 3F9 -22 e 3F9 -20) exibiram um aumento de ~ 10 vezes na afinidade para huSIRPA solúvel em relação ao observado com o anticorpo anti-SIRPA parental h3F9.
TABELA 11 CINÉTICA DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS H3F9 MATURADOS POR AFINIDADE Ab ID (3F9-#) KD (M) kon (Ms)-1 koff (s-1) 18 4,19E-10 1,37E+05 5,74E-05 12 4,29E-10 1,39E+05 5,96E-05 23 5,39E-10 1,69E+05 9,11E-05 14 6,18E-10 1,65E+05 1,02E-04 22 6,46E-10 1,74E+05 1,13E-04 20 8,50E-10 1,50E+05 1,28E-04 16 1,27E-09 1,19E+05 1,51E-04 21 1,03E-09 1,48E+05 1,52E-04 24 1,07E-09 1,44E+05 1,55E-04 25 1,06E-09 1,53E+05 1,62E-04 7 1,81E-09 9,92E+04 1,80E-04 19 1,29E-09 1,41E+05 1,81E-04 11 1,43E-09 1,34E+05 1,92E-04 6 1,65E-09 1,16E+05 1,92E-04
Ab ID (3F9-#) KD (M) kon (Ms)-1 koff (s-1) 13 1,38E-09 1,46E+05 2,01E-04 10 1,51E-09 1,34E+05 2,01E-04 4 1,79E-09 1,13E+05 2,03E-04 1 2,09E-09 1,06E+05 2,22E-04 2 2,06E-09 1,08E+05 2,22E-04 17 1,70E-09 1,40E+05 2,38E-04 5 2,95E-09 9,36E+04 2,76E-04 8 3,60E-09 7,66E+04 2,76E-04 9 3,38E-09 8,94E+04 3,02E-04 15 6,28E-09 5,76E+04 3,62E-04 3 4,43E-09 9,39E+04 4,16E-04 h3F9 6,48E-09 1,84E+05 1,19E-03
[0431] As medições de afinidade baseadas em células também foram realizadas para determinar as afinidades aparentes de anticorpos 3F9 anti-SIRPA maturados por afinidade para o antígeno expresso na superfície celular. As diluições em série de cada um dos anticorpos anti-SIRPA monoclonais foram adicionados a 105 células BWZ-huSIRPA e foi permitido atingir o equilíbrio de ligação a 4ºC. Os valores de EC50 (listados abaixo) atribuem afinidade relativa ao adicionar concentrações crescentes de anticorpo 3F9 variante às células BWZ com superexpressão de SIRPA humana. Os anticorpos ligados ao receptor foram detectados por coloração de células com anticorpo secundário anti-IgG humana PE. As curvas foram ajustadas usando análise de regressão não linear com software Graphpad Prism 6. Os experimentos de titulação baseados em células com 3F9 murino e anticorpos anti-SIRPA humanizados com afinidade maturada mostrou melhoria nos valores de EC50 dos anticorpos anti-SIRPA humanizados maturados por afinidade; dois anticorpos anti-SIRPA mostraram melhora significativa nos valores de EC50 (mAb 3F9-14 = 0,42 nM e mAb 3F9-22 = 0,49 n M) em comparação com o observado com o anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG1 (0,72 nM). Consulte a Tabela 12 abaixo.
TABELA 12 3F9 3F9-14 3F9-17 3F9-18 3F9-20 3F9-21 3F9-22 3F9-25 mIgG1 EC50 0,42 0,61 0,51 0,49 0,64 0,49 0,96 0,72 (nM) EXEMPLO 7 REATIVIDADE CRUZADA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE
PARA VARIANTES ANTIGÊNICAS SIRPA
[0432] O domínio de ligação de CD47 de SIRPA humana é altamente polimórfico, o que pode impedir o desenvolvimento de anticorpos anti-SIRPA bloqueadores de CD47, capazes de reconhecer todas as variantes alélicas de SIRPA expressas em populações humanas. Na verdade, os dois alelos mais comuns da SIRPA humana (v1 e v2) também são os mais divergentes na sequência, com 13 resíduos que diferem no domínio IgV. Uma vez que os estudos de competição de CD47 resolveram que o anticorpo anti- SIRPA m3F9 se liga a uma região distinta do local de ligação do ligante CD47, os ensaios de ligação foram realizados para verificar a reatividade cruzada entre SIRPA v1 e v2 humana, bem como a reatividade entre espécies para determinar modelos animais relevantes para estudos de toxicologia.
[0433] Em um ensaio ELISA, placas Immulon HBX de 96 poços foram revestidas com SIRPA marcado com His ou Fc de uma determinada espécie, como indicado, a 1 µg/mL em PBS durante a noite a 4ºC. As placas foram bloqueadas em albumina de soro bovino a 5% (p/v) em PBS durante 1 hora, após o que foram lavadas 3 vezes com PBS/Tween 20 a 0,05% (PBS/T).
Anticorpos anti-SIRPA foram adicionados à placa em diluições seriadas e foram incubados à temperatura ambiente por 2 horas, em seguida o anticorpo não ligado foi removido por lavagem com PBS/T. Anti-IgG de camundongo ou anti-cadeia leve kappa humana (Jackson Immunoresearch) conjugados com peroxidase de rábano foram então adicionados aos poços e incubados por 30 minutos. O anticorpo não ligado foi removido por lavagem com PBS/T, e em seguida o anticorpo ligado foi detectado usando tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi interrompida com 2N H2SO4, e em seguida as placas foram lidas a A450.
[0434] O anticorpo parental anti-SIRPA 3F9 murino se liga a ambas as versões de SIRPA-Fc humana, v1 e v2, com valores de EC50 semelhantes (0,695 e 0,789 nM, respectivamente). Uma diminuição parcial na afinidade aparente é observada com o antígeno humano marcado com His, sugerindo uma maior avidez de ligação ao SIRPA marcado com Fc. Além disso, o anticorpo parental anti-SIRPA murino 3F9 demonstra fraca reatividade cruzada com SIRPA de cinomolgos marcados com Fc e His (EC 50 = 1,09 nM).
Nenhuma ligação detectável foi observada ao SIRPA de rato.
[0435] Após a maturação de afinidade do anticorpo parental, tal como descrito acima, dois anticorpos anti-SIRPA descendentes, mAb 3F9-14 e mAb 3F9-22, foram rastreados contra o mesmo painel de antígenos SIRPA para avaliar a reatividade cruzada. Tal como acontece com o anticorpo anti- SIRPA m3F9, os anticorpos anti-SIRPA humanizados e maturados por afinidade retiveram a atividade de ligação contra SIRPA v1 e v2 humana, mas com valores de EC50 significativamente mais baixos, confirmando o aumento na afinidade observada em medições de biossensores e ensaios de ligação celular descritos acima. Apesar do aumento da afinidade para SIRPA v1 e v2 humana, o anticorpo anti-SIRPA 3F9-14 exibiu fraca reatividade cruzada com cynoSIRPA; as curvas de ligação produziram valores de EC50 (EC50 = 0,879 nM), semelhantes aos observados com o anticorpo anti-SIRPA m3F9. Em contraste, o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 demonstrou atividade de ligação equivalente para cynoSIRPA como com ambas as variantes de SIRPA humana (EC50 = 0,10 7 nM). Nem o anticorpo 3F9-14 nem o 3F9-22 liga-se ao SIRPA de rato (dados não mostrados). O valor de EC50 calculado a partir das curvas de ligação estão listados abaixo e estabelecem que todos os anticorpos anti- SIRPA ligam-se a ambas as variantes alélicas da SIRPA humana. Apenas o anticorpo anti-SIRPA hu3F9-22 ligou-se ao SIRPA de cinomolgos (cynoSIRPA) com afinidade de ligação semelhante à SIRPA humana. A Tabela 13 abaixo mostra os valores de EC50 de anticorpos anti-SIRPA para várias proteínas SIRPA (nM).
TABELA 13 ELISA huSIPRA v.1 huSIRPA v.2 cynoSIRPA CAA71403.1 NP542970.1 XPO15313153.1 3F9 mIgG1 0,789 0,695 1,089 3F9-14 0,093 0,080 0,879 3F9-22 0,108 0,082 0,107
[0436] Experimentos ELISA semelhantes foram realizados para determinar os valores de EC50 para o anticorpo anti-SIRPA 9C2 (consulte abaixo para sequências de aminoácidos do anticorpo anti-SIRPA 9C2) e 3F9 contra um painel de diferentes proteínas SIRPA e SIRPB. A Tabela 14 abaixo mostra os valores de EC50 destes anticorpos anti-SIRPA para várias proteínas SIRPA (nM).
TABELA 14 SIRPB1-His SIRPA v2 SIRPB1-Fc iso. 1 SIRPB1-Fc iso. 3 CynoSIRPA CynoSIRPB1 iso. 3 0,3578 n,b 0,3822 0,4251 7,439 s.l. mAb 9C2 mAb 3F9 0,3528 n,b, 0,3188 0,4353 0,6582 s.l.
Números de acesso: CAA71403.1 (SIRPA v2); O00241.5 (SIRPB1 iso. 1); Q5TFQ8.1 (SIRPB1 iso. 3); NP_001271679.1 (cyno SIRPA); XP_005568598 (cynoSIRPB1); s.l = sem ligação.
[0437] Devido a alta similaridade de sequência entre as proteínas SIRPA de várias espécies, como mostrado na FIG. 1, os clones da progênie do anticorpo anti-SIRPA também foram rastreados quanto a reatividade cruzada contra antígenos SIRPA adicionais de várias espécies de mamíferos. As proteínas SIRPA de sagui (número de acesso JAB51896) ou SIRPA de cão (número de acesso XP005634938) ou SIRPA de coelho (número de acesso G1U0I5) marcadas com Fc foram revestidas em placas e incubadas com concentrações crescentes de anticorpo anti-SIRPA hu3F9-14 e hu3F9-22.
Ambos os anticorpos anti-SIRPA, mAb 3F9-14 e mAb 3F9-22, reconheceram SIRPA de sagui e cão, embora com menor afinidade do que o observado com SIRPA humana. Por exemplo, os valores de EC50 para a ligação de 3F9-14 à SIRPA de sagui e cão foram de 1,2 nM e 0,64 nM, respectivamente. Da mesma forma, os valores de EC50 da ligação de 3F9-22 à SIRPA de sagui e SIRPA de cão foram de 4,3 nM e 0,83 nM, respectivamente. Nem o clone de anticorpo anti-SIRPA 3F9-14 nem o 3F9-22 se ligaram à SIRPA de coelho.
EXEMPLO 8 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE REGULAM NEGATIVAMENTE SIRPA E CD32A/B
[0438] Experimentos anteriores estabeleceram que o anticorpo anti-SIRPA m3F9 antagonizou de forma não competitiva a ligação de CD47 a SIRPA reduzindo a expressão de superfície de SIRPA, o que resultou no aumento da capacidade de estimular o envolvimento de células tumorais por macrófagos em comparação com anticorpos anti-SIRPA bloqueadores de CD47. Os anticorpos anti-SIRPA maturados por afinidade foram testados quanto à retenção de propriedades funcionais semelhantes ao anticorpo murino.
[0439] Uma vez que o anticorpo anti-SIRPA m3F9 (em uma cadeia principal de IgG1 de camundongo) regulam negativamente SIRPA e CD32A/B de uma forma dependente de Fc, os anticorpos quiméricos foram produzidos, em que a sequência de Fab do anticorpo anti-SIRPA m3F9 parental foi fundido ao domínio Fc de IgG1 humana de tipo selvagem (3F9 huIgG1) ou Fc de IgG1 humana com mutações S267E/L328F (3F9-SELF) na cadeia pesada. As mutações Fc SELF aumentam a ligação a Fc γR2B/CD32B humano > 100 vezes em relação ao Fc de IgG1 humano tipo selvagem.
Monócitos humanos foram isolados a partir do sangue periférico de doadores saudáveis e diferenciados in vitro em macrófagos com M-CSF humano. Após a diferenciação, os huMacs foram coletados e semeados em placas de cultura de tecidos de 96 poços com concentração crescente de controle de isotipo ou anticorpos anti-SIRPA solúveis e incubados durante a noite a 37ºC. As células foram analisadas por citometria de fluxo para SIRPA e expressão de superfície C32A/B usando um anticorpo SIRPA anti-humano conjugado com DyLight650 (clone SA56) e anti-CD32A/B marcado com FITC (FUN-2). De maneira consistente com observações anteriores, o anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG1 exibiu robusta regulação negativa dose-dependente de SIRPA e CD32A/B. No entanto, o anticorpo anti-SIRPA 3F9 huIgG1 quimérico exibiu potência diminuída na regulação negativa do receptor em comparação com o anticorpo murino (dados não mostrados). Estes resultados fornecem evidência adicional de que o domínio Fc do anticorpo desempenha um papel importante na atividade. A manipulação das AUTO mutações no domínio de Fc de 3F9 quimérico (3F9-SELF) restaura a capacidade de regular negativamente SIRPA e CD32A/B para níveis semelhantes aos observados com o anticorpo anti- SIRPA 3F9 mIgG1. Este resultado confirma que CD32A/B serve como um importante correceptor para a atividade m3F9 em macrófagos.
[0440] Experimentos anteriores revelaram que as variantes humanizadas de anticorpo anti-SIRPA 3F9 enxertadas em uma cadeia principal de IgG4 humana perdeu atividade funcional. Os anticorpos anti-SIRPA 3F9 variantes maturados por afinidade foram produzidos em uma cadeia principal de IgG1 humana e avaliados quanto a capacidade de regular negativamente SIRPA e CD32A/B, em comparação com o anticorpo anti-SIRPA m3F9 parental e anticorpo anti-SIRPA 3F9 huIgG1 quimérico. A expressão de SIRPA e
CD32A/B foi detectada com anti-SIRPA DyLight650 (clone SA56) e anti- CD32A/B FITC (clone FUN2). Os anticorpos maturados por afinidade 3F9-14, 3F9 -18, 3F9 -20 e 3F9 -22 regularam negativamente a SIRPA para níveis semelhantes aos observados com o anticorpo parental anti-SIRPA m3F9 (dados não mostrados). No entanto, os mesmos anticorpos anti-SIRPA maturados por afinidade melhoraram apenas minimamente a regulação negativa de CD32A/B em comparação com a observada com o anticorpo quimérico anti-SIRPA 3F9 huIgG1. Estes resultados indicam que o aumento de afinidade do anticorpo para o antígeno compensa a dependência de Fc na regulação negativa do receptor alvo (ou seja, SIRPA), mas não para as interações mediadas por Fc com FcγRs.
[0441] Para determinar se a manipulação de Fc melhora ainda mais a regulação negativa de SIRPA por anticorpos anti-SIRPA maturados por afinidade, as AUTO mutações pontuais foram introduzidas no domínio de Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 huIgG1. Macrófagos humanos primários de 4 doadores saudáveis foram tratados durante a noite com concentrações crescentes de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 humanizado contendo Fc de IgG1 humana tipo selvagem ou Fc de IgG1 S267E/L328F (SELF) humana. A expressão de SIRPA foi detectada com anti-SIRPA DyLight650 (clone SA56).
Os doadores de sangue foram genotipados para o polimorfismo CD32A- R/H131 por qPCR. As FIGS. 8A e 8B ilustram resultados típicos desses experimentos comparando a atividade de ambas as variantes Fc. Entre os indivíduos homozigóticos para o alelo CD32A-H131 (doadores 516 e 517 foram verificados por qPCR), ambas formas variantes de Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 regulam negativamente SIRPA para níveis semelhantes tal como observado em macrófagos humanos (FIG. 8 B). Este resultado indica que ligação aumentada para Fc γR2B falha em melhorar a regulação negativa de SIRPA mediada pelo anticorpo.
[0442] Dentre os indivíduos heterozigotos para alelos H131 e R131 de CD32A, o anti-SIRPA 3F9-22 hIgG1 Fc variante mostrou maior regulação negativa máxima de SIRPA do que àquela observada com a variante AUTO-Fc (FIG. 8A). Em vez de aumentar a regulação negativa de SIRPA, AUTO Fc pode limitar esta função. Deve-se observar que as mutações SELF aumentam a afinidade Fc para CD32B, bem como para o alelo CD32A-R131.
Dado que os macrófagos humanos expressam níveis maiores de CD32A do que CD32B, macrófagos de indivíduos que expressam CD32A-R131 podem sequestrar o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 para longe da SIRPA ou CD32B para limitar a atividade de regulação negativa máxima.
[0443] A Tabela 15 abaixo fornece um resumo dos resultados da regulação negativa mediada por anticorpos de SIRPA e CD32 na linhagem de macrófagos humanos U937. Nestes estudos, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação foram comparados com um anticorpo anti-SIRPA KWAR23 previamente descrito (divulgado na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO2015/138600). Como mostrado na Tabela 15, anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação regularam negativamente ou reduziram a expressão na superfície celular de SIRPA em células U937, com porcentagem máxima de regulação negativa entre 68% e 76%. Por comparação, o anticorpo anti-SIRPA KWAR23 só foi capaz de diminuir a expressão da superfície celular de SIRPA em 9%.
[0444] A Tabela 15 também mostra que os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação foram eficazes na regulação negativa ou redução da expressão de CD32 na superfície celular de células U937.
Como mostrado na Tabela, anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação regularam negativamente ou reduziram a expressão de CD32 na superfície celular nessa células, com porcentagem máxima da regulação negativa entre 49% e 73%.
TABELA 15 SIRPA CD32 Anticorpo IC50 (nM) % Max DR IC50 (nM) % Max DR 3F9 huIgG1 0,804 68% 0,9807 49% 3F9 mIgG1 0,105 75% 0,005609 73% 3F9-14 1,17 69% 2,028 50% 3F9-18 2,19 71% 4,861 52% 3F9-20 0,152 75% 0,2706 58% 3F9-22 0,187 76% 0,4305 60% KWAR23 15,52 9% 0,07118 63% EXEMPLO 9 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE DEGRADAM SIRPA EM
MACRÓFAGOS
[0445] A medição da regulação negativa do receptor mediada por anticorpos por FACS confirma que o envolvimento do alvo pelo anticorpo anti- SIRPA diminui a expressão na superfície celular. Para determinar se os receptores internalizados são degradados ou não e não subsequentemente reciclados para a superfície da célula, os macrófagos humanos foram analisados quanto aos níveis totais de proteína SIRPA por western blotting da seguinte forma. Macrófagos humanos primários derivados de monócitos foram tratados durante a noite com 5 μg/mL de anticorpo de controle isotípico ou anti- SIRPA 3F9-22 Fc variante A330S/P331S (ASPS). As células foram coletadas, lavadas com PBS frio e lisadas com tampão RIPA suplementado com inibidores de protease/fosfatase HALT em gelo por 15 minutos. As células lisadas foram centrifugadas para sedimentar a fração de membrana e a fração sobrenadante que abrange o lisado celular total foi coletada. Como mostrado na FIG. 9 A, quantidades crescentes de fração de lisado celular de anticorpo de controle isotípico ou anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 para tratamento dos macrófagos foram carregados em SDS-PAGE e submetidos ao immunoblotting para a proteína SIRPA com um anticorpo antígeno-específico. Na FIG. 9A, 5 μg, 10 μg e 20 μg de lisado de célula inteira foram carregados em SDS-PAGE e submetidos a immunoblotting com o domínio citoplasmático anti-SIRPA (a- SIRPAct). Uma banda que migra com o peso molecular previsto de SIRPA é detectada em macrófagos tratados com controle isotípico, mas não observada em macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22. Em um experimento semelhante, lisados celulares de macrófagos tratados com controle isotípico ou com anticorpo 3F9-22 ASPS foram carregados em SDS- PAGE e submetidos ao immunoblotting para SIRPA e SHP-2, uma tirosina fosfatase que pode se associar com SIRPA e outros receptores ITIM. Na FIG.
9B, 20 μg de lisado de células inteiras foram carregados em um SDS-PAGE e sondados para a-SIRPAct e anti-SHP2. Os blots demonstram que o nível de proteína SIRPA diminui com o tratamento com mAb 3F9-22. Conforme mostrado na FIG. 9B, a estimulação do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 leva a degradação de SIRPA, mas não de SHP2.
EXEMPLO 10 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE ESTIMULAM A FAGOCITOSE
DE CÉLULAS TUMORAIS EM MACRÓFAGOS
[0446] Experimentos anteriores verificaram que os anticorpos anti- SIRPA amadurecidos por afinidade retinham a capacidade de regular negativamente SIRPA e CD32A/B, levando à degradação de SIRPA em macrófagos humanos. Os anticorpos maturados por afinidade da presente invenção foram ensaiados para a capacidade de induzir a fagocitose de células tumorais. Macrófagos humanos primários foram tratados durante a noite com controle isotípico ou 3F9-22 IgG1 humano ou 3F9-22 AUTO para avaliar o efeito dependente de Fc na função do anticorpo. As células Raji marcadas com pHrodo foram misturadas com macrófagos e incubadas por 2 horas a 37ºC. A atividade fagocítica foi medida contando a porcentagem de macrófagos duplos positivos para CD14/pHrodo. Os resultados são apresentados como o aumento da porcentagem da população de macrófagos duplo-positivos pHrodo/CD14.
Além disso, os níveis de expressão de CD14 após a fagocitose são mostrados.
Conforme mostrado na FIG. 10A, ambos os anticorpos anti-SIRPA 3F9-22 Fc variantes exibiram fagocitose celular melhorada das células Raji em relação aos macrófagos tratados com o controle isotípico. Embora o anticorpo 3F9-22 AUTO pareça induzir maior fagocitose em comparação com o anticorpo 3F9-22 huIgG1, esta diferença não atingiu significância estatística. Além disso, ambas formas variantes de Fc do anti-SIRPA 3F9-22 regularam negativamente a expressão de CD14 para níveis semelhantes, indicando a indução semelhante de atividade fagocítica e estado de ativação dos macrófagos.
[0447] Uma característica da antagonização do eixo de sinalização SIRPA-CD47 é o aumento da fagocitose dependente de anticorpos de células tumorais opsonizadas. Na FIG. 10B, a fagocitose de células Raji com ou sem a adição de opsonizante anti-CD20 huIgG1 foi avaliada em macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22. Em macrófagos tratados com controle isotípico, a opsonização de células Raji com anti-CD20 huIgG1 aumenta a fagocitose de células tumorais ~ 50% em comparação com células Raji não opsonizadas. Os resultados são apresentados como a porcentagem da população de macrófagos duplo-positivos pHrodo/CD14.
Conforme mostrado anteriormente, os macrófagos estimulados com o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 AUTO ou 3F9-22 ASPS aumentaram a fagocitose de células Raji não opsonizadas em ~ 30-40% em relação aos macrófagos tratados com controle isotípico. De forma similar, macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 aumentaram a fagocitose ~ 30% em relação aos macrófagos tratados com controle misturados com células Raji opsonizadas com anti-CD20. A adição de células Raji opsonizadas com anti-CD20 aos macrófagos tratados com anticorpos anti-SIRPA 3F9-22 mostra um efeito aditivo sobre a fagocitose com um aumento de ~ 2 vezes em relação ao observado com os macrófagos tratados com controle misturados com células Raji não opsonizadas. Embora ambas as formas variantes de Fc do anticorpo 3F9-22 induziram a fagocitose de células tumorais, a variante Fc AUTO (Fc SELF) exibiu atividade fagocítica maior estatisticamente significativa quando comparada com a variante Fc ASPS. Estes resultados confirmaram que anticorpos anti-SIRPA maturados por afinidade da presente divulgação melhoram a fagocitose de células tumorais em macrófagos por antagonizar a via SIRPA-CD47.
[0448] A Tabela 16 abaixo fornece um resumo dos valores de IC 50 determinados para a regulação negativa mediada por anticorpos de SIRPA e CD32 em macrófagos primários humanos. Além disso, a Tabela 16 mostra o aumento da fagocitose associada a vários anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação em macrófagos primários humanos. Nestes estudos, os anticorpos anti-SIRPA da presente invenção foram comparados com um anticorpo anti- SIRPA HEFLB previamente descrito (divulgado na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO2017/178653). Como mostrado na Tabela 16, os anticorpos maturados por afinidade anti-SIRPA da presente divulgação têm valores de IC50 mais baixos em comparação com os valores observados com o anticorpo anti-SIRPA 3F9 huIgG1. Além disso, os anticorpos anti-SIRPA 3F9- 14, 3F9-18, 3F9-20 e 3F9-22 mostraram valores de IC50 mais baixos do que o anticorpo anti-SIRPA HEFLB. Da mesma forma, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação mostraram melhor atividade de fagocitose em comparação com o anticorpo anti-SIRPA HEFLB.
TABELA 16 SIRPA CD32 Fagocitose* Anticorpo IC50 (nM) Max % DR IC50 (nM) Max % DR 3F9 huIgG1 0,1722 90% 0,679 67% 1,77 3F9 mIgG1 0,00905 89 0,0623 82% 1,51
SIRPA CD32 Fagocitose* 3F9-14 0,0372 89% 0,135 62% 1,56 3F9-18 0,0174 90% 0,0915 65% 1,52 3F9-20 0,0283 90% 0,114 66% 1,62 3F9-22 0,0542 91% 0,133 66% 1,68 OSE HEFLB 0,0959 13% n.d. n.d. 1,05 n.d. = não determinado, * aumento em vezes sobre a atividade basal.
EXEMPLO 11 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE ESTIMULAM A FAGOCITOSE DE CÉLULAS TUMORAIS EM MACRÓFAGOS M1 E M2
[0449] Os macrófagos sofrem profunda transformação fenotípica em resposta a estímulos microambientais, adquirindo fenótipos pró- inflamatórios (M1) ou anti-inflamatórios (M2) distintos. Os anticorpos anti- SIRPA da presente divulgação foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir a fagocitose de células tumorais em macrófagos homeostáticos (tipo M2) e macrófagos inflamatórios (tipo M1). Os monócitos foram isolados a partir do sangue de voluntários saudáveis usando centrifugação em gradiente de densidade em Ficoll. Macrófagos tipo M1 e tipo M2 foram gerados por cultura de monócitos na presença de GM-CSF (800 U/mL; Peprotech) ou M-CSF (25 ng/mL; Peprotech) durante 6 dias. Os macrófagos polarizados foram tratados durante a noite com o anticorpo de controle isotípico ou variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22. Células Raji marcadas com fluorescência com ou sem opsonizante anti-CD20 huIgG1 foram misturadas com macrófagos por 2 horas a 37ºC. Alternativamente, as células Raji foram opsonizadas com anti- CD47 IgG4 (clone hu5F9) sozinho ou com anti-CD47 e anti- CD20 huIgG1 e adicionadas aos macrófagos não tratados. A atividade fagocítica foi medida contando a porcentagem de macrófagos duplos positivos para CD14/pHrodo.
[0450] Conforme mostrado na FIG. 11A, ambas as variantes Fc de macrófagos tipo M2 tratados com anticorpo 3F9-22 aumentam a fagocitose de células tumorais em relação a macrófagos tratados com controle. Consistente com as observações anteriores, o anticorpo variante AUTO Fc mostrou um aumento estatisticamente significativo na fagocitose de células Raji opsonizadas e não opsonizadas em comparação com o anticorpo 3F9-22 huIgG1. Além disso, o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 AUTO tratado com macrófagos tipo M2 aumentou a fagocitose de células Raji não opsonizadas e opsonizadas em uma extensão semelhante às células Raji tratadas com anti- CD47 IgG4.
[0451] Os macrófagos tipo M1 diferenciados de monócitos cultivados na presença de GM-CSF têm propriedades diferentes dos macrófagos tipo M2 derivados de MCSF. Por exemplo, macrófagos do tipo M1 derivados de GM-CSF diminuem a expressão de CD14, CD32A/B e SIRPA.
Além disso, macrófagos tipo M1 parecem fagocitar células Raji não opsonizadas a uma taxa mais alta do que macrófagos tipo M2 (FIG. 11 B) derivados do mesmo doador saudável. Após estimulação com variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22, macrófagos tipo M1 aumentam a fagocitose de células Raji não opsonizadas em ~ 50% em relação aos macrófagos tratados com controle. A opsonização de células Raji com anti-CD20 huIgG1 falha em mostrar um efeito aditivo na fagocitose por macrófagos tipo M1 tratados com anticorpo 3F9-22, o que contrasta com as observações feitas com macrófagos tipo M2. Da mesma forma, as células Raji opsonizadas com anticorpos anti- CD47 IgG4 com ou sem anti-CD20 huIgG1 também falham em aumentar a fagocitose acima dos níveis basais, quando adicionadas aos macrófagos tipo M1 (FIG. 11B). Uma vez que macrófagos derivados de GM-CSF regulam negativamente a expressão de FcγR, essas células podem possuir um potencial mais baixo de mediar a fagocitose dependente de anticorpos. Estes resultados também sugerem que o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 funciona antagonizando SIRPA para induzir a fagocitose em ambos tipos de macrófagos, M1 e M2, enquanto que os anticorpos anti-CD47 funciona principalmente como agentes opsonizantes que requerem acoplamento de FcγRs em macrófagos tipo M2 para induzir a fagocitose.
EXEMPLO 12
TERAPIAS COMBINADAS AUMENTAM A ATIVIDADE ANTITUMORAL DE ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE
[0452] Um pequeno subconjunto de células cancerosas, denominadas células iniciadoras de tumor (TICs) ou células-tronco cancerosas (CSCs), formam um reservatório de células cancerosas autossustentáveis que têm a capacidade de se autorrenovar e manter a massa tumoral. Evidências sugerem que as células tumorais sólidas humanas e CSCs aumentam a expressão de CD47 para evitar os mecanismos de vigilância imunológica que permitem a proliferação e metástase de células tumorais. Modelos de cultivo de tumoresfera, nos quais as células cancerosas crescem como aglomerados de células esferoides tridimensionais, são amplamente usados para analisar a capacidade de autorrenovação das CSCs e para simular melhor as condições de crescimento celular in vivo. A formação de tumoresfera é baseada na cultura de células cancerosas em placas de fixação ultrabaixa em meio sem soro suplementado com fatores de crescimento, como fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento de fibroblastos básico. A cocultura de tumoresferas com macrófagos humanos primários permite a avaliação de anticorpos anti-SIRPA na viabilidade das células tumorais como um único agente ou em combinação com outras terapias antitumorais.
[0453] A linhagem de células MDA-MB-231 é uma linhagem de células de câncer de mama humano triplo negativo bem caracterizada que anteriormente se mostrou formar tumoresferas. A fim de medir a viabilidade das células tumorais em ensaios de cocultura, as células MDA-MB-231 foram transduzidas com um lentivírus para a expressão constitutiva de luciferase e
GFP (MB231-Luc). Para a formação de tumoresfera, 10.000 células MB231- Luc por poço foram semeadas em placas de 96 poços em meio StemXVivo Serum-Free Tumorsphere Media (R&D Systems) suplementado com heparina e hidrocortisona. O meio da tumoresfera também foi suplementado com MCSF para suportar a viabilidade dos macrófagos. MB231-Luc foram cultivadas por 2- 3 dias, sozinhas ou na presença de 50.000 macrófagos/poço. A viabilidade das células tumorais foi quantificada medindo a atividade da luciferase com reagente OneGlo (Promega) adicionado a cada poço e incubando a amostra por 3 min em temperatura ambiente em um agitador de placa. O sinal de luminescência foi detectado com um leitor de microplacas BioTek Synergy™ Microplate Reader usando o software GEN5 ™ 2.04.
[0454] As células de câncer de mama MDA-MB-231 que expressam luciferase constitutivamente foram cultivadas sozinhas ou na presença de macrófagos humanos em meios de tumoresfera sem soro suplementadas com MCSF. As células foram tratadas por 2 dias a 37ºC com anti-EGFR (2 μg/mL), anti-PDL1 (2 μg/mL) ou paclitaxel (0,5 uM) com ou sem anticorpo anti-SIRPA 3F9-22. Como comparação, as células tumorais sozinhas ou na presença de macrófagos foram tratadas com IgG4 anti-CD47. A viabilidade das células tumorais foi quantificada medindo a atividade da luciferase com o reagente substrato OneGlo. Conforme mostrado na FIG. 12A, as células MB231-Luc proliferaram em cultura com ou sem macrófagos com base em valores de luminescência. O anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 sozinho inibiu a viabilidade das células tumorais quando as células MB231-Luc formaram tumoresferas na presença de macrófagos. Este resultado demonstrou que os macrófagos retêm potencial tumoricida sob condições de cultura otimizadas para a viabilidade do tumor. Sob condições semelhantes, a IgG4 anti-CD47 não inibiu de maneira significante a viabilidade de MB231-Luc.
[0455] Depois de verificar a eficácia do agente único do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 neste ensaio de viabilidade da tumoresfera, estudos adicionais foram realizados para mostrar o efeito do tratamento combinatório.
Uma vez que a viabilidade celular tumoral depende de EGF presente nos meios de comunicação, a adição de anticorpo anti-EGFR bloqueador mostra profunda inibição do crescimento tumoral quando células MB231-Luc são cultivadas isoladamente. A atividade antitumoral do anticorpo anti-EGFR não é aumentada na presença de macrófagos não tratados. No entanto, macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 potencializam a atividade antitumoral do anticorpo anti-EGFR de maneira estatisticamente significativa.
Em condições de cultura semelhantes, o anticorpo anti-PDL1 revelou um fenótipo inesperado ao induzir apoptose robusta de células tumorais, independentemente da presença de macrófagos. A viabilidade das células MB231-Luc também foi reduzida quando exposta a 500 nM de paclitaxel, um agente quimioterápico estabilizador de microtúbulos comumente usado para tratar diversos cânceres. A combinação de paclitaxel com macrófagos tratados com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 também mostra uma redução estatisticamente significativa na viabilidade das células tumorais. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação melhoram a atividade de terapias antitumorais que funcionam por diversos mecanismos de ação além da opsonização das células tumorais.
[0456] As células de câncer de mama MDA-MB-231 que expressam luciferase constitutivamente foram cultivadas sozinhas ou na presença de macrófagos humanos em meios de tumoresfera sem soro suplementados com MCSF ou MCSF + IL-4 + IL-10. Quando indicado, as células foram tratadas com o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 ou IgG4 anti-CD47 por 3 dias a 37ºC. A viabilidade das células tumorais foi quantificada por valores de luminescência após a adição do reagente OneGlo contendo substrato de luciferase. Na ocasião, macrófagos derivados de monócitos de voluntários saudáveis cocultivados com células MB231-Luc inibem a viabilidade das células tumorais sem tratamento (FIG. 12B). Para garantir que os macrófagos cocultivados com células MB231-Luc adotem um fenótipo imunossupressor mais semelhante a um tumor, o meio da tumoresfera foi suplementado com IL-4 e IL-10. Conforme mostrado na FIG. 12B, as células MB231-Luc cultivadas sozinhas proliferaram igualmente bem em meio suplementado com MCSF ou MCSF mais IL-4 e IL-10. Entretanto, em meios suplementados apenas com MCSF, os macrófagos do doador 570 reduziram a viabilidade das células tumorais em uma extensão estatisticamente significativa. Esta inibição é revertida pela adição de IL-4 e IL-10 demonstrando que diferentes estratégias de cultivo polarizam macrófagos para modular o crescimento de células tumorais. É importante notar que o tratamento de macrófagos com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 diminuiu significativamente a viabilidade das células tumorais em ambas as condições de crescimento.
EXEMPLO 13 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE AUMENTAM A
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T
[0457] As células T formam uma sinapse imunológica com células apresentadoras de antígeno (APC) para iniciar a ativação e proliferação de células T. A expressão de CD47 em células T pode contrariar a ativação pela transmissão de um sinal inibitório para APCs por meio de SIRPA. No entanto, as células T também expressam SIRPG, outro membro da família SIRP capaz de se ligar ao CD47 expresso em APCs. Foi demonstrado que a interação (células T)SIRPG- CD47 (APC) estabiliza a sinapse imunológica e promove a ativação de células T e a proliferação. Embora os anticorpos anti-CD47 bloqueiem o sinal inibitório entregue através de SIRPA, os anticorpos anti- CD47 também bloqueiam o efeito estimulador da ligação de SIRPG e, portanto, podem ser deletérios na montagem de uma resposta de células T antitumoral eficaz. Os anticorpos anti-SIRPA antagonistas, portanto, evitam esta desvantagem potencial ao inibir a sinalização de SIRPA sem interromper as interações críticas na sinapse imunológica. Para testar essa hipótese, os anticorpos anti-SIRPA foram avaliados em ensaios de MLR de uma via e de duas vias.
[0458] O princípio de um ensaio de MLR é que as APCs derivadas de um doador, geralmente DCs, apresentam peptídeos em moléculas MHC para células T isoladas de um doador separado. Uma pequena fração de células T expressará TCRs capazes de reconhecer o complexo MHC:peptídeo e proliferará após a coestimulação. Neste MLR unilateral, as células de um doador participam da apresentação do antígeno e as células de outro doador respondem proliferando. Em uma MLR bidirecional, ambos os doadores contribuem com APCs e células T para a reação; assim, duas populações separadas de células T respondem proliferando.
[0459] O efeito dos anticorpos anti-SIRPA na proliferação de células T foi inicialmente avaliado em ensaios MLR bidirecional. As PBMCs foram isoladas de doadores saudáveis e cocultivadas por 3 dias na presença de concentrações crescentes de variantes Fc 3F9-22 ou controle isotípico. A proliferação de células T foi estimada pela quantificação da presença de células metabolicamente ativas como um indicador do número de células. A atividade metabólica foi quantificada com o reagente CellTiter Glo (Promega), que gera um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente.
Conforme mostrado na FIG. 13A, PBMCs tratadas com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 mostraram aumento de ~ 1,5 vezes na luminescência relativa as PBMCs tratadas com isotipo, sugerindo um aumento na proliferação de células T. Em contraste com os ensaios de fagocitose descritos anteriormente, a variante Fc do anticorpo 3F9-22 huIgG1 tendeu a estimular a proliferação de células T de forma mais eficaz do que a variante AUTO Fc.
[0460] Para determinar se o aumento da luminescência observada com o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 é específico para anticorpos anti-SIRPA, o ensaio MLR bidirecional foi repetido com o anticorpo anti-CD47. PBMCs de dois doadores saudáveis foram isoladas e 100.000 células de cada doador foram misturadas com concentrações crescentes de anticorpo teste ou anticorpo de controle isotípico. A proliferação celular foi medida com o reagente CellTiter Glo após 3 dias de cocultura. Como mostrado na FIG. 13 B, os anticorpos anti-SIRPA 3F9-14 e 3F9-22 huIgG1 e variantes Fc ASPS aumentaram o sinal de luminescência ~ 70% em relação ao observado com PBMCs tratadas com anticorpo de controle isotípico. Os anticorpos anti-SIRPA em um AUTO Fc (3F9-14 AUTO e 3F9-22 AUTO) não conseguiram aumentar o sinal de luminescência em relação ao controle nas mesmas condições, estabelecendo outro efeito dependente de Fc na função do anticorpo. Em contraste com o anticorpo 3F9-22 huIgG1, o tratamento com anti-CD47 mostrou um aumento marginal de ~ 10% na luminescência. Em conjunto, os resultados do ensaio MLR bidirecional sugeriram que a antagonização de SIRPA com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 huIgG1 promove a proliferação de células T.
[0461] Uma vez que a quantificação da atividade metabólica na MLR bidirecional é uma medição indireta da proliferação de células T, mais ensaios de MLR unidirecional tradicionais foram realizados para confirmar o efeito estimulador observado com o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 huIgG1.
Células dendríticas (DCs) primárias foram derivadas de monócitos de doadores saudáveis e cocultivadas com células T alogênicas marcadas com corante CFSE em uma proporção de 1:5. As células dendríticas foram tratadas com variantes do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 Fc ou anti-CD47 (hu5F9) ou anticorpo controle isotípico e incubadas a 37ºC por 5 dias. A proliferação de células T foi medida pela coloração de células T com anti-CD3 APC e gating na população CFSElow. A FIG. 14A mostra que as DCs a partir de diferentes doadores tratados com anticorpo 3F9-22 huIgG1 ou ASPS aumentou a proliferação de células T em 50% ~ em relação a qualquer DCs tratadas com isotipo ou anti-CD47. Este aumento na proliferação de células T é proporcional ao aumento na luminescência observada com PBMCs tratadas com anticorpo 3F9-22 huIgG1 na MLR bidirecional. A FIG. 14B mostra um gráfico de FACS representativo para os dados apresentados na FIG. 14A. Os resultados da MLR unilateral e bidirecional sugeriram, assim, que antagonizar SIRPA com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 huIgG1 sem bloquear a interação SIRPG-CD47 pode promover a proliferação de células T.
EXEMPLO 14 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MATURADOS POR AFINIDADE AUMENTAM A LIBERAÇÃO DE CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS
[0462] Para diferenciar ainda mais a atividade das variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22, macrófagos humanos primários de dois voluntários saudáveis foram estimulados durante a noite com baixa dose de LPS em combinação com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 ou anticorpo de controle isotípico. Na FIG. 15A, macrófagos primários humanos a partir de 2 doadores saudáveis foram estimulados durante a noite a 37ºC com 0,5 ng/mL de LPS em combinação com anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 variante Fc ou controle isotípico. As frações do sobrenadante foram coletadas e analisadas quanto aos níveis de TNFα por ELISA. Na FIG. 15B, macrófagos primários humanos foram estimulados durante a noite a 37ºC com 0,5 ng/mL de LPS em combinação concentrações crescentes de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 variante Fc ou controle isotípico. A fração sobrenadante foi coletada e analisada por ELISA quanto à liberação de TNFα. Conforme mostrado nas FIGs. 15A e 15B, macrófagos coestimulados com anticorpo 3F9-22 ASPS exibiram um aumento significativo na secreção TNFα em relação às células coestimuladas tanto com o anticorpo de controle isotípico quanto anticorpos
3F9-22 AUTO. O anticorpo 3F9-22 AUTO Fc variante mostrou atividade coestimuladora mínima. A titulação dos anticorpos anti-SIRPA mostrou um padrão semelhante onde anticorpo 3F9-22 huIgG1 e ASPs variantes claramente aumentaram a liberação de TNFα em um modo dose-dependente por macrófagos ativados por LPS, enquanto que anticorpos 3F9-22 AUTO exibiram uma resposta diminuída de TNFα com alta variabilidade. Estes resultados demonstram que anticorpos anti-SIRPA não bloqueadores de CD47 antagonizam SIRPA de forma dependente de Fc para liberar a inibição da sinalização ITIM.
EXEMPLO 15 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE SÍTIOS DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPA
[0463] O mapeamento de epítopos de anticorpos anti-SIRPA foi realizado usando uma biblioteca de varredura de alanina criada por mutagênese shotgun da sequência de cDNA da SIRPA humana. Uma construção de expressão SIRPA que codifica um epítopo marcador C-terminal V5 foi submetido a mutagênese de varredura de alanina de alto rendimento (descrito em Davidson e Doranz, 2014 Immunology 143, 13-20) para gerar uma biblioteca de mutação abrangente. Cada um dos resíduos que representam o domínio extracelular SIRPA (aminoácidos 31-374 de SEQ ID NO: 1) foi mutado, a maioria para alanina, enquanto os códons de alanina foram mutados para serina.
[0464] Os clones da biblioteca mutante SIRPA, dispostos em uma microplaca de 384 poços, foram transfectados individualmente em células HEK-293T e foram expressos por 22 horas. Os anticorpos foram digeridos para gerar Fabs, em seguida as células foram incubadas com Fabs diluídos em soro de cabra normal a 10% (NGS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Antes da triagem da biblioteca, as concentrações de Fab primárias foram determinadas usando uma curva de titulação por imunofluorescência independente contra células que expressam SIRPA tipo selvagem para garantir que os sinais estivessem dentro da faixa linear de detecção. Os Fabs foram detectados usando 7,5 µg/mL de anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Westgrove, PA) em 10% de NGS. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em Cellstripper (Cellgro, Manassas, VA) com BSA a 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Em alguns casos, condições de maior estringência (rigor) foram usadas, incluindo aumento de pH, aumento da temperatura e aumento do tempo de dissociação. A fluorescência celular média foi detectada usando o citômetro de fluxo de alto rendimento Intellicyt (HTFC, Intellicyt, Albuquerque, NM). As reatividades de Fab contra cada clone mutante foram calculadas em relação à reatividade da proteína SIRPA tipo selvagem subtraindo o sinal dos controles transfectados simulados (mock) e normalizando para o sinal dos controles transfectados com SIRPA tipo selvagem.
[0465] Os resíduos mutados nos clones da biblioteca foram identificados como “críticos” para o epítopo de ligação do Fab se eles não suportassem a reatividade do Fab teste, mas suportassem a reatividade do anticorpo de referência comercialmente disponível, MAB4546 (R&D Systems) ou Fabs anti-SIRPA adicionais. Esta estratégia de contrasseleção facilitou a exclusão de mutantes SIRPA que estavam localmente mal enovelados/dobrados ou que tinham um defeito de expressão.
[0466] O anticorpo anti-SIRPA 9C2 é descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/US2017/65366.
[0467] mAb 9C2: sequência do domínio variável de cadeia pesada:
EFQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYSLTGYNMNWVKQSRGKSLEWIG
NINPHYGSSTYNQNFKDKATLTVDKSSSAAYMQFNSLTSEDSAVYYCAREGYDGVFDYW GQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 45).
[0468] mAb 9C2: sequência do domínio variável de cadeia leve:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYV
TSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 46).
[0469] A Tabela 17 abaixo descreve as reatividades de ligação médias e intervalos para todos os resíduos identificados como críticos nas triagens. Os resíduos críticos primários foram definidos como resíduos em que as mutações foram negativas para a ligação do anticorpo teste (<30% da ligação para WT), mas positivas para o anticorpo controle (> 80% WT).
FIG. 16 representa modelos de estrutura cristalina de SIRPA (PDB ID 2WNG; Hatherley et al., 2009, J Biol Chem, 284: 26613-9) destacando os resíduos críticos para a ligação de anticorpos anti-SIRPA 3F9 e 9C2 como esferas sombreadas.
[0470] Conforme indicado na Tabela 18, os resíduos críticos da SIRPA envolvidos na ligação do anticorpo anti-SIRPA 3F9 incluem os resíduos de aminoácidos R282, Q284 e G337 da sequência SIRPA v1 humana mostrada acima. Os resíduos críticos da SIRPA envolvidos na ligação pelo anticorpo 9C2 (conforme divulgado no Pedido de Patente Internacional PCT/US2017/65366) incluem resíduos de aminoácidos Q281, R282, Q284, L285, W287, R295, E297, V302 e W315 da Sequência da SIRPA v1 humana divulgada acima. Estes resíduos estão dentro do domínio Ig proximal à membrana da SIRPA, referido na literatura científica da SIRPA como domínio D3, que corresponde aos aminoácidos 254 -348 da sequência da SIRPA v1 humana. Vários relatórios publicados demonstram que o domínio D3 da SIRPA humana se liga a moléculas de reconhecimento de padrões na família coletina, nomeadamente proteínas surfactantes D e A (Sp-D e Sp-A, respectivamente).
TABELA 17 RESÍDUOS CRÍTICOS PARA LIGAÇÃO DE 3F9 E 9C2 Reatividade de ligação (% WT) Mutação 3F9 Fab 9C2 Fab Q281A 151,1 (14) 14,1 (11) R282A 3,8 (2) 4,7 (2) Q284A 3,3 (1) 6,5 (5) L285A 107,0 (12) 17,9 (1) W287A 124,8 (12) 2,4 (2) R295A 120,9 (10) 1,8 (2) E297A 116,9 (14) 5,3 (0) V302A 92,3 (29) 4,9 (0) W315A 117,3 (10) 19,0 (6) G337A 17,9 (9) 36,3 (68) TABELA 18 RESÍDUOS ENVOLVIDOS NA LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPA Anticorpo Resíduos críticos da SIRPA 3F9 R282, Q284, G337 9C2 Q281, R282, Q284, L285, W287, R295, E297, V302, W315 EXEMPLO 16 ANTICORPOS ANTI-SIRPA AUMENTAM A ATIVIDADE ANTITUMORAL DE INIBIDORES
DE PONTO DE VERIFICAÇÃO EM UM MODELO DE TUMOR SINGÊNICO
[0471] Os anticorpos terapêuticos direcionados à via SIRPA-CD47 podem se basear em modelos de xenoenxerto de tumores para estudos de prova de conceito nos quais camundongos NOD ou NOG imunodeficientes sustentam o crescimento de células cancerosas humanas implantadas. Uma vez que a variante alélica de SIRPA murina expressa por camundongos NOD se liga ao CD47 humano, essa interação permite o enxerto de células humanas em um hospedeiro murino. No entanto, esses camundongos também podem exagerar o papel da via porque SIRPA de NOD liga-se ao CD47 humano com maior afinidade do que a SIRPA humana. Além disso, as mutações Prkdc SCID e IL2RγNull em cepas imunodeficientes de camundongos eliminam células T,
células B e células NK, tornando assim as células mieloides e o sistema imunológico inato como únicas células efetoras disponíveis para inibir o crescimento tumoral. Modelos de xenoenxerto de tumores não permitem a interrogação de terapias que têm como alvo as células imunes inatas para preparar ou aumentar uma resposta imune antitumoral adaptativa. Assim, para avaliar os anticorpos anti-SIRPA humana da presente divulgação no contexto de hospedeiros animais imunocompetentes, os genes para SIRPA humana e CD47 humano foram introduzidos na cepa de camundongo C57BL6/J.
[0472] Resumidamente, cromossomos artificiais bacterianos (BACs) com sequências de ácidos nucleicos que codificam SIRPA humana ou CD47 humano com sequências de flanqueamento para incluir elementos reguladores de genes UCSC genome browser e CloneDB da NCBI. Um clone BAC (BACRP11-636L228) estava previsto por conter as sequências codificantes do gene da SIRPA humana. Um clone BAC (BACRP11-671F8) foi identificado previsto por conter as sequências codificantes do gene do CD47 humano. Os camundongos que abrigam clones BAC de interesse foram então gerados pela injeção do DNA BAC purificado em zigotos de camundongos C57BL6/J usando técnicas de injeção pronuclear padrão. Os zigotos foram devolvidos aos camundongos fêmeas e os filhotes murinos resultantes foram genotipados quanto à presença do transgene desejado. Os animais fundadores contendo o transgene foram então criados com animais não transgênicos e a progênie foi rastreada quanto à expressão do transgene por PCR usando técnicas padrão e adicionalmente por coloração FACS de células do sangue periférico dos animais. Os camundongos transgênicos BAC que abrigam cada gene individual de interesse foram intercruzados a fim de produzir camundongos “humanizados” que expressam SIRPA humana e CD47 humano.
[0473] Além de manipular camundongos para expressar SIRPA humana e CD47 humano, conforme descrito acima, linhagens de células tumorais singênicas também foram projetadas para substituir CD47 de camundongo por CD47 humano. Resumidamente, a tecnologia CRISPR-Cas9 foi utilizada para introduzir complexos Cas9/RNA guia (gRNA) nas células alvo MC38. A formação de indel mediada por Cas9/gRNA na região alvo (éxon 2 de CD47 de camundongo) resultou em uma mudança na fase de leitura (frameshift) e/ou parada prematura, eliminando assim a expressão do gene CD47 de camundongo endógeno. Após a transfecção de gRNA e Cas9, clones derivados de uma única célula foram selecionados por sequenciamento e os clones homozigotos contendo a mutação desejada foram expandidos. Como mostrado na FIG. 17A (painel superior), a análise FACS de células MC38 parentais e a linhagem de células nocaute de CD47 de camundongo (MC38- mCD47KO) corada com um anticorpo CD47 anticamundongo confirma a perda de expressão de CD47 de camundongo nessas células manipuladas.
Posteriormente, as células MC38-mCD47KO foram transduzidas com um lentivírus contendo a inserção do gene CD47 humano. Células MC38- mCD47KO-huCD47+ foram selecionadas com puromicina e expandidas. A FIG.
17A (painel inferior) mostra um histograma FACS que verifica a expressão de CD47 humano na população de células selecionada.
[0474] Os efeitos antitumorais de anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação foram avaliados in vivo usando um modelo de carcinoma de cólon de camundongo com camundongos huSIRPA/huCD47 BACtg enxertados com células MC38-mCD47KO-huCD47+ em combinação com um inibidor de ponto de verificação imune de células T. Estes camundongos receberam injeções por via subcutânea com 500.000 células MC38 no flanco direito. A terapia com anticorpos começou quando os camundongos foram randomizados em grupos aproximadamente dez dias após o transplante de células ou quando os tumores atingiram um volume médio de 80 mm3. Os camundongos receberam duas injeções intraperitoneais (IP) por semana durante 3 semanas de anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG1 ou anticorpo anti- SIRPA 3F9 mIgG2a a 10 mg/kg em combinação com uma dose subótima de anticorpo anti-PL1 de camundongo (clone 10F.9G2, Bioxcell) a 5 mg/kg. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume de ~ 2.000 mm3.
[0475] A FIG. 17B mostra as curvas médias de crescimento tumoral de camundongos transgênicos huSIRPA/huCD47 BAC implantados subcutaneamente com células MC38 manipuladas para expressarem CD47 de camundongo e que superexpressam CD47 humano (MC38- mCD47KO/huCD47+). Os camundongos foram tratados com anticorpo de controle isotípico, anticorpo anti-PDL1 de camundongo, anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG1 mais anticorpo anti-PDL1 de camundongo, ou anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG2a mais anticorpo anti-PDL1 de camundongo, conforme indicado. O tratamento foi iniciado quando os tumores tinham em média 80 mm 3. Tam como exibido na FIG. 17B, o tratamento com anticorpo anti-PDL1 inibiu o crescimento do tumor em 20% em relação aos animais tratados com anticorpo de controle isotípico, o que não atingiu significância estatística. No entanto, a terapia de combinação de anticorpo anti-PDL1 com anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG1 ou anticorpo anti-SIRPA 3F9 mIgG2a inibiu ainda mais o crescimento do tumor nestes animais em 40% e 47%, respectivamente. A FIG. 17C mostra diagrama de espaguete do volume tumoral de cada animal dentro dos grupos de tratamento. Exceto para alguns mal respondedores, os volumes tumorais não ultrapassaram 1000 mm3 na maioria dos animais nos grupos de tratamento com terapia combinada, enquanto que os tumores em vários animais no grupo tratado com anticorpo de controle isotípico ou grupo de monoterapia com anticorpo anti-PDL1 atingiram o limite de 2.000 mm3.
[0476] Estes resultados demonstram que os anticorpos anti- SIRPA 3F9 da presente divulgação são eficazes em melhorar a atividade antitumoral dos inibidores do ponto de verificação em um modelo animal imunocompetente que codifica a via CD47-SIRPA humana. Estes resultados indicaram que os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação são úteis para aumentar a atividade antitumoral de inibidores de ponto de verificação.
Consequentemente, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação são eficazes no tratamento do câncer quando usados em combinação com uma terapia com inibidor de ponto de verificação.
EXEMPLO 17 ANTICORPOS ANTI-SIRPA REGULAM NEGATIVAMENTE A EXPRESSÃO DE SIRPA EM
CÉLULAS MIELOIDES QUE SE INFILTRAM EM TUMORES SINGÊNICOS EM CAMUNDONGOS
[0477] O exemplo anterior demonstrou a atividade antitumoral de anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação em camundongos transgênicos BAC SIRPA/CD47 humanos. Para verificar se a atividade antitumoral correlacionada com a regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos em macrófagos tumorais, as células mieloides tumorais foram caracterizadas após a administração do medicamento.
[0478] Os camundongos transgênicos SIRPAhumana/huCD47 BAC foram submetidos ao implante subcutâneo no flanco direito de 500.000 células MC38-mCD47KO/huCD47+. Os tumores nos camundongos cresceram até um volume médio de ~ 400 mm3 antes da administração de anticorpos. Os camundongos receberam duas injeções IP de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 mIgG2A com três dias de intervalo a 3 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg. Os camundongos controle receberam 2 injeções IP de isotipo mIgG2a a 10 mg/kg.
O tecido tumoral e os baços foram coletados a partir de camundongos no dia 1, dia 4 e dia 8 após a administração da segunda dose de anticorpo. Os baços foram processados em suspensão de células individuais por dissociação mecânica através de um filtro de células de 70 µm. As células foram então lavadas com PBS e os glóbulos vermelhos lisados com tampão de lise ACK.
Subsequentemente, as células foram ressuspensas em tampão FACS consistindo em PBS/SBF 2% e preparadas para coloração. De forma similar, os tecidos tumorais foram processados em suspensões de células únicas com dissociação enzimática e mecânica com o dissociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotec). O homogenato de tecido foi filtrado através de um filtro de células de 70 µm e ressuspenso em tampão FACS consistindo em PBS/SBF 2% para coloração. As células foram coradas com o seguinte painel: TABELA 19 Fluorocromo Marcador Clone AmCyan (BV510) Vivas/Mortas PECγ7 mCD45 30-F11 Pacific Blue (BV421) mCD11b M1/70 PerCp/Cy5.5 mF4/80 BM8 APC/Cy7 mLy6G 1A8 AF488 (FITC) mLy6C HK1.4 APC hSIRPA SE5A5
[0479] A FIG. 18A mostra a mudança relativa na expressão de SIRPA ao longo do tempo em células mieloides que se infiltram em tumores (monócitos e macrófagos). Os macrófagos associados a tumores foram definidos como células CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C- Ly6G-, enquanto os monócitos infiltrantes de tumores foram definidos como células CD45+ CD11b+ F4/80- Ly6C+ Ly6G-. Em comparação com os animais administrados com anticorpo de controle isotípico, os animais administrados com anticorpo anti- SIRPA mostraram quase 80% de redução da expressão de SIRPA na superfície celular 1 dia após a administração do anticorpo em monócitos tumorais e macrófagos tumorais. A expressão de SIRPA retornou aos níveis basais após 4 dias ou 8 dias em camundongos administrados com 3 mg/kg ou 10 mg/kg de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 mIgG2A, respectivamente. O nível de expressão de SIRPA estabilizou em cerca de 50% abaixo da linha basal em camundongos administrados com 30 mg/kg de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 mIgG2A.
[0480] O compartimento esplênico também foi perfilado para determinar se poderia ser determinada qualquer correlação com o microambiente tumoral. Monócitos esplênicos parecem mais resistentes à regulação negativa do receptor mediada por anticorpo em relação ao que foi observado em monócitos de tumores (FIG. 18B). Monócitos esplênicos foram definidos como células CD45+ CD11b+ F4/80- Ly6C+ Ly6G-. Macrófagos da polpa vermelha esplênica foram definidos como células CD45+ CD11b- F4/80+ Ly6C-. Os monócitos esplênicos demonstram uma regulação negativa máxima de SIRPA de ~ 40% um dia de administração de anticorpo e recuperaram rapidamente a expressão do receptor em pontos de tempo posteriores. Os macrófagos da polpa vermelha, por outro lado, seguiram um padrão semelhante da expressão do receptor, como observado com os macrófagos de tumores.
[0481] Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação são eficazes na redução (regulação negativa) dos níveis de SIRPA em macrófagos, particularmente macrófagos associados a tumores, e a redução ou regulação negativa dos níveis de SIRPA em macrófagos se correlacionam com atividade antitumoral dos anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação.
EXEMPLO 18 ANTICORPOS ANTI-SIRPA REGULAM NEGATIVAMENTE A EXPRESSÃO DE SIRPA EM
CÉLULAS MIELOIDES QUE SE INFILTRAM EM TUMORES EM CAMUNDONGOS COM SISTEMA IMUNE HUMANO (HIS)
[0482] Uma vez que o domínio Fc de anticorpos anti-SIRPA desempenha um papel na regulação negativa do receptor e na função do anticorpo, camundongos reconstituídos com um sistema imunológico humano foram empregados para comparar a atividade de diferentes variantes Fc com anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação. Os modelos de camundongos HIS precisam do enxerto de células-tronco hematopoiéticas humanas (hHSCs) CD34+ obtidas do sangue do cordão umbilical em camundongos imunodeficientes (ou seja, cepa NOG) após seu pré-condicionamento com irradiação subletal. HSCs desenvolvem estavelmente linhagens celulares extensas, em particular, populações de linfócitos no sangue periférico, medula óssea, timo, e baço (bem como outros tecidos). Camundongos NOG manipulados para expressarem GM-CSF humano e IL-3 humana (NOG-EXL; Taconic) fornecem a vantagem adicional de suportar uma maior diferenciação de células mieloides em comparação com outras cepas de camundongos. Os camundongos HIS oferecem a oportunidade de estudar as interações tumorais humanas com o sistema imunológico in vivo em camundongos implantados com linhagens de células cancerosas humanas. Além disso, os camundongos HIS ajudam a avaliar os mecanismos de ação dos anticorpos terapêuticos candidatos em um ambiente in vivo.
[0483] Os camundongos foram inoculados com células de melanoma humano A375 por via subcutânea na região do flanco a uma densidade celular de 3x106 células por camundongo com Matrigel a 50% (Cat.354234; Corning). Os tumores cresceram até um volume médio de 400 mm3 antes dos camundongos receberem 2 injeções de IP de 3F9-22 huIgG1 P331S (PS), 3F9-22 huIgG1 N325S/L328F (NSLF) ou controle isotípico huIgG1 a 10 mg/kg com três dias de intervalo. O sangue, baços e tecidos tumorais foram coletados 1 dia após a segunda injeção de anticorpo. Os baços foram processados em suspensão de células individuais por dissociação mecânica através de um filtro de células de 70 µm. As células foram lavadas com PBS e os glóbulos vermelhos lisados com tampão de lise ACK. Subsequentemente, as células foram ressuspensas em tampão FACS consistindo em PBS/SBF 2% e preparadas para coloração. De forma similar, os tecidos tumorais foram processados em suspensões de células únicas com dissociação enzimática e mecânica com o dissociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotec). O homogenato de tecido foi filtrado através de um filtro de células de 70 µm e ressuspenso em tampão FACS consistindo em PBS/SBF 2% para coloração. As células do sangue periférico foram tratadas com tampão de lise ACK para lisar glóbulos vermelhos (RBCs) e ressuspensas em tampão FACS consistindo em PBS/SBF a 2%. As células foram coradas com o seguinte painel: TABELA 20 Fluorocromo Marcador Clone PERCPCY5 CD3 SK7 PERCPCY5 CD19 HIB19 FITC CD14 M5E2 PE-Cy7 CD11b ICRF44 Alexa700 CD45 humana 2D1 AmCyan Vivas/Mortas APC/DyL650 SIRPA interno BV421 CD16 3G8 BUV395 HLA-DR L243 PE-CF594 CD163 GHI/61 PE CD86 IT2.2 APC-Cy7 CD45 camund. 30-F11
[0484] Os camundongos NOG-EXL foram enxertados com células- tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas de sangue de cordão umbilical humano (HSC) de dois doadores diferentes (doadores A e B). Todos os camundongos foram implantados por via subcutânea com 3 milhões de células A375, uma linhagem de células de melanoma humano. Os tumores cresceram até um volume médio de ~ 400 mm 3 antes da administração do anticorpo. Os camundongos receberam duas injeções IP de anticorpos anti-SIRPA com três dias de intervalo a 10 mg/kg. Os camundongos controle receberam 2 injeções IP do isotipo huIgG1 a 10 mg/kg. O tecido tumoral foi coletado a partir de camundongos 1 dia após a administração da segunda dose de anticorpo.
[0485] FIG. 19 mostra o desenho do estudo e os resultados da regulação negativa mediada por anticorpos de SIRPA em camundongos NOG- EXL humanizados com tumores A375 nestes estudos. FIG. 19A mostra que 8 camundongos foram enxertados com HSCs CD34+ do doador A e 29 camundongos foram enxertados com HSCs CD34 + do doador B.
Resumidamente, 40 camundongos enxertados com HSCs CD34 + de 2 doadores diferentes foram adquiridas da Taconic, NY. Em 10 semanas após o enxerto, os camundongos foram verificados quanto a qualidade antes do envio para reconstituição de leucócitos humanos por citometria de fluxo. A maioria dos camundongos (36/40) continha > 50% de células huCD45 + no sangue periférico.
[0486] Macrófagos associados a tumor em camundongos NOG- EXL foram definidos como células CD45+ CD11b+ CD14+ CD16+ CD3- CD19-.
FIG. 19B mostra o nível de expressão de SIRPA em macrófagos tumorais humanos representados como valores MFI (painel esquerdo) ou valores normalizados (painel direito). Um tratamento com anticorpo anti-SIRPA resultou em regulação negativa significativa de SIRPA em macrófagos tumorais humanos de ambos os doadores em comparação com o grupo com controle isotípico. A normalização dos valores MFI para cada doador revela redução de ~ 70% da expressão de SIRPA, que se aproxima da extensão da regulação negativa observada em macrófagos derivados de monócitos in vitro e em macrófagos tumorais em camundongos transgênicos BAC. Não foi observada diferença significativa na atividade entre anti-SIRPA 3F9-22 variante Fc PS variante NSLF Fc do anticorpo anti-SIRPA nestes experimentos.
[0487] Além da expressão de SIRPA, os macrófagos tumorais desses experimentos também foram traçados para examinar a expressão de marcadores M1. Os macrófagos tumorais foram definidos como células huCD45+ huCD11b+ CD14+ huCD16+. Como mostrado na FIG. 20A anticorpos, anti-SIRPA da presente divulgação regular positivamente a expressão de HLA- DR. A normalização de valores MFI para cada doador demonstrou que o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 PS Fc variante aumentou a expressão de HLA-
DR em ~ 3 vezes em ambos os doadores, mais do que o observado pelo tratamento com o anticorpo de controle isotípico. Em contraste, o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 NSLF Fc variante aumentou a expressão de HLA-DR em ~ 1,5-2 vezes em relação ao observado com o tratamento com anticorpo de controle isotípico. Apenas o aumento medido nos macrófagos do doador B atingiu significância estatística com o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 NSLF variante Fc. Do mesmo modo, os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação aumentaram a expressão de CD86 em macrófagos tumorais apenas do doador B (FIG. 20B). Embora ambas as formas variantes de Fc, PS e NSLF, aumentassem a expressão de CD86 em ~ 40% em relação ao grupo de anticorpos de controle isotípico, apenas a forma Fc variante ‘PS’ alcançou significância estatística para expressão aumentada de CD86. Estes resultados demonstram que ambas variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 (PS e NSLF) regulam negativamente SIRPA e aumentam marcadores de macrófagos M1 em tumores humanos; no entanto, a variante PS parece parcialmente mais potente do que a variante NSLF nestes experimentos.
[0488] A regulação negativa de SIRPA mediada por anticorpos também foi avaliada em monócitos do sangue periférico e monócitos do baço a fim de comparar a atividade de anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação no tumor e compartimentos imune periféricos. As populações de monócitos humanos foram definidas como células CD45+ CD11b+ CD14+ CD16- CD3- CD19-. Os camundongos receberam duas injeções IP de anticorpos anti-SIRPA com três dias de intervalo a 10 mg/kg. Os camundongos controle receberam 2 injeções IP do anticorpo de controle huIgG1 a 10 mg/kg. Os baços e sangue foram coletados a partir de camundongos 1 dia após a administração da segunda dose de anticorpo. Como mostrado na FIG. 21A, o anticorpo anti- SIRPA 3F9-22 variante Fc NSLF exibiu regulação negativa de SIRPA superior em comparação com a regulação negativa observada com o anticorpo anti-
SIRPA 3F9-22 variante Fc PS em monócitos do baço. No entanto, em monócitos do sangue periférico, ambas as formas variantes de Fc exibem atividade semelhante (FIG. 21B). Os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação mostram maior regulação negativa do receptor em monócitos derivados do doador B do que do doador A, que pode estar correlacionado com uma maior expressão basal de SIRPA em monócitos do doador B do que do doador A.
[0489] Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação são eficazes na regulação negativa dos níveis de SIRPA em monócitos do sangue periférico, bem como em monócitos esplênicos.
EXEMPLO 19 ANTICORPOS ANTI-SIRPA PROJETADOS PARA ENGAJAMENTO DE FCR SELETIVO
RETÊM ATIVIDADE DE REGULAÇÃO NEGATIVA DO RECEPTOR MEDIADA POR ANTICORPO
[0490] Para avaliar melhor o papel de FcR na atividade de anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação, o domínio variável de anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 foi expresso com diferentes domínios Fc com perfis de ligação ao FcR distintos. As medições de afinidade ao FcR para anticorpos anti-SIRPA Fc variantes foram obtidas usando interferometria de biocamada (BLI) em um instrumento Pall ForteBio Octet RED96. O anticorpo Fab-CH1 anti-humano imobilizado capturou as formas variantes de Fc do anticorpo anti- SIRPA humanizado 3F9-22 em biossensores (10 µg/mL, tempo de carregamento de 300 s). A cinética de ciclo único foi realizada com 100 nM de FcRs humanos solúveis que fluíram sobre o anticorpo capturado para registrar os traços (tempo de associação de 300 s, tempo de dissociação de 300 s). A análise dos dados foi realizada com o software ForteBio Data Analysis, versão
9.0. O tampão cinético padrão (PBS, 0,1 BSA, 0,02 Tween-20, pH 7,2) foi usado para o ensaio e para a preparação de reagentes.
[0491] As medições de afinidade relativas derivadas da análise de ajuste de curva dos sensorgramas obtidos a partir desses experimentos estão resumidas abaixo na Tabela 19. As formas variantes de Fc previam padrões de ligação de FcR. Por exemplo, as mutações LALAPS em Fc anulam a ligação a todos FcRs, exceto o receptor de alta afinidade, FcγR1. As mutações em Fc N325S/L328F (NSLF) eliminam especificamente a ligação ao FcγR3A humano.
Da mesma forma, os isotipos IgG2 e IgG4 não conseguem se ligar ao FcγR3A e a IgG4 retêm ligação apenas ao FcγR1.
TABELA 19 Variante de Fc FcgR1 FcgR2A H131 FcgR2A R131 FcgR2B FcgR3A F158 FcgR3A V158 IgG1 LALAPS + - - - - - IgG1 NSLF ++ + ++ ++ - - IgG2 - + + - - - IgG 4 SP ++ + ++ ++ - -
[0492] As variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 foram subsequentemente avaliadas quanto à capacidade de regular negativamente a expressão ou níveis de SIRPA em macrófagos derivados de monócitos humanos. Conforme descrito anteriormente, monócitos humanos foram isolados do sangue periférico de doadores saudáveis e diferenciados em macrófagos in vitro por suplementação de meio de crescimento com M-CSF humano. Após a diferenciação, os macrófagos humanos foram coletados e semeados em placas de cultura de tecidos de 96 poços com concentração crescente de anticorpo controle ou anticorpos anti-SIRPA solúveis e incubados durante a noite a 37ºC. As células foram analisadas por citometria de fluxo para expressão de SIRPA na superfície celular usando um anticorpo anti-SIRPA humana conjugado DyLight650 pertencente a um compartimento epitópico separado do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22.
[0493] Como mostrado na FIG. 22 e resumido na Tabela 20, a maioria das variantes Fc do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 suprimiu ao máximo os níveis de superfície celular de SIRPA em macrófagos com valores de IC 50 semelhantes. No entanto, o anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 LALAPS regulou negativamente de maneira apenas parcial os níveis de superfície celular de SIRPA, confirmando que o envolvimento de FcR está envolvido na potenciação dessa atividade dos anticorpos anti-SIRPA. Além disso, uma vez que os anticorpo Fc variantes que não se ligam FcγR3A demonstram regulação negativa ao receptor similar ao do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 PS, que se liga a todos os FcR, isso sugere que o envolvimento de FcγR3A é dispensável para a internalização do receptor mediada por anticorpos.
TABELA 20 Variante de Fc IC50 (nM) %Max DR 3F9-22 PS 0,04701 73,825 3F9-22 LALAPS 0,04468 41,575 3F9-22 NSLF 0,045125 74,61 3F9-22 IgG2 0,02185 67,955 3F9-22 IgG4 0,032415 70,455 EXEMPLO 20 ANTICORPOS ANTI-SIRPA MANIPULADOS PARA ENGAJAMENTO DE FCR SELETIVO
AUMENTAM A FAGOCITOSE DE CÉLULAS TUMORAIS POR MACRÓFAGOS
[0494] Além da regulação negativa do receptor mediada por anticorpos, conforme divulgado acima, o papel dos FcRs foi avaliado no aumento da fagocitose de células tumorais mediada por diferentes anticorpos anti-SIRPA 3F9-22 Fc variantes. Além disso, a atividade fagocítica de outros anticorpos que visam essa via foram avaliadas em paralelo.
[0495] Macrófagos humanos primários foram tratados durante a noite com anticorpo controle ou anticorpo de teste indicado. As células tumorais foram marcadas com corante CFSE e adicionadas aos macrófagos a 37ºC durante a noite. No dia seguinte, os macrófagos foram coletados e corados em gelo com APC anti-CD14 em tampão FACS contendo anticorpos bloqueadores de FcR. A atividade fagocítica foi medida contando a porcentagem de macrófagos duplos positivos para CD14/CFSE.
[0496] Os resultados desses experimentos são mostrados na FIG.
23 e são apresentados como o aumento da porcentagem na população de macrófagos duplo-positivos CD14/CFSE. Como mostrado na FIG. 23 e resumido abaixo na Tabela 21, os anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 nas formas Fc variantes ‘PS e NSLF’ aumentaram significativamente a fagocitose de células de melanoma A375 em relação àquela observada em macrófagos tratados com anticorpo controle. O aumento observado da fagocitose pareceu comparável ao anticorpo anti-CD47 testado nesses estudos (aCD47), que funciona principalmente por opsonização de células tumorais que expressam CD47 para ADCP. Em contraste, dois diferentes de anticorpo anti-SIRPA bloqueadores de CD47 KWAR23 (consulte o documento WO2015/138600) e 18D5 (consulte o documento WO2017/178653) não mostraram qualquer aumento de fagocitose das células de tumor. Estes resultados demonstram que ambas as variantes de Fc, PS e NSLF, do anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 retêm propriedades de reforço da fagocitose de células tumorais na ausência de anticorpos antiantígeno tumorais opsonizantes. Como os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação não são bloqueadores em relação à interação SIRPA/CD47, esses resultados também mostraram que os anticorpos anti-SIRPA não bloqueadores da presente divulgação foram eficazes em aumentar ou potencializar a fagocitose de células tumorais em comparação com o observado com anticorpos anti- SIRPA não bloqueadores KWAR 23 e 18D5.
TABELA 21 Anticorpo EC50 (nM) Máx* 3F9-22PS 0,1144575 2,06925 3F9-22NSLF 0,457625 1,774 KWAR23 0,3631 1,126
Anticorpo EC50 (nM) Máx* 18D5 2,148 1,06446667 aCD47 0,777775 2,6235 * Aumento da fagocitose em relação à atividade basal.
EXEMPLO 21 ANTICORPO ANTI-SIRPA 3F9-22 VARIANTE NÃO INDUZ ALTERAÇÕES EM CÉLULAS
VERMELHAS DO SANGUE E NA CONTAGEM DE PLAQUETAS
[0497] Relatórios indicaram que o anticorpo anti-CD47 5F9 administrado a primatas não humanos resultou em anemia (Liu et al, 2015, PLOS ONE, DOI: 10.1371/journal.pone.0137345) e que a administração de anti-SIRPAFc TTI-621 a humanos resultou em diminuições dose-dependentes nas contagens de plaquetas (Ansell et al, 2016, Blood 128: 1812). Para examinar se os anticorpos anti-SIRPA da presente divulgação têm qualquer efeito na contagem de glóbulos vermelhos ou contagem de plaquetas in vivo, os seguintes estudos foram realizados. Macacos cinomolgos fêmeas foram atribuídos a cinco grupos e foram administrados com anticorpo controle, anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 PS, anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 IgG4, anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 IgG2 ou anticorpo anti-SIRPA 3F9-22 NSLF, conforme indicado na Tabela 22 abaixo. Os anticorpos receberam os tratamentos por infusão intravenosa pela veia safena.
TABELA 22 Nível da dose Nº de Via de Conc. da dose Vol. da dose Grupo Artigo teste alvo fêmeas adm alvo (mg/mL) alvo (mL/kg) (mg/kg) 1 3 IgG IV 10 2,5 4 2 3 3F9-22 PS IV 10 2,5 4 3 3 3F9-22 IgG4 IV 10 2,5 4 4 3 3F9-22 IgG2 IV 10 2,5 4 5 3 3F9-22 NSLF IV 10 2,5 4 IV = intravenoso; administrado como uma injeção em bolus. Notas: Os animais dos grupos 1 e 2 foram administrados uma vez nos dias 1, 8, 15, 22 e 29 (total de 5 doses). Os animais nos grupos 3, 4 e 5 foram administrados uma vez nos dias 1 e 29 (total de 2 doses)
[0498] Os animais nos grupos 3, 4 e 5 foram administrados uma vez nos dias 1 e 29 (total de 2 doses)O sangue foi coletado dos animais pela veia femoral para contagens de glóbulos vermelhos (RBC) e de plaquetas uma vez durante a fase de pré - dosagem e, em seguida, aproximadamente 72, 168, 240, 408, 576, 672 e 744 horas após a administração do anticorpo.
[0499] Como mostrado na FIG. 24, as contagens de células sanguíneas e plaquetas não foram alterados por nenhum dos anticorpos anti- SIRPA 3F9-22 PS, 3F9-22 IgG4, IgG2 3F9-22, e 3F9-22 NSLF durante o curso dos experimentos.
[0500] Certas sequências de anticorpo anti-SIRPA adicionais da presente divulgação são mostradas abaixo. Os aminoácidos sublinhados indicam certas diferenças nas sequências de aminoácidos dos seguintes anticorpos anti-SIRPA.
[0501] 3F9-22-IgG1 Cadeia Pesada WT (SEQ ID NO: 47):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVA TISEYGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGG FQYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0502] 3F9-22 huIgG1 PS Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 48):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISE YGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFQYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK.
[0503] 3F9-22 SELF Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 49):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISE YGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFQYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK.
[0504] 3F9-22 hIgG1 NSLF Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 53):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVA TISEYGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGG FQYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0505] 3F9-22 hIgG1 LALAPS Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 54):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVA TISEYGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGG FQYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0506] 3F9-22 huIgG1 Cadeia Leve (SEQ ID NO: 50):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIY LASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHNRELPVTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
[0507] 3F9-14 huIgG1 Cadeia Pesada WT (SEQ ID NO: 51):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISE YGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFRYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK.
[0508] 3F9-14 PS Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 57):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVA TISEYGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGG FRYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0509] 3F9-14 SELF Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 52):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISE YGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFRYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK.
[0510] 3F9-14 NSLF Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 55):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYGGSYT YYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFRYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0511] 3F9-14 LALAPS Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 56):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYGGSYT YYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFRYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0512] 3F9-14 huIgG1 Cadeia Leve (SEQ ID NO: 50):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHNRELPVTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC.

Claims (78)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende: uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24; e a região variável de cadeia leve compreende: uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região variável de cadeia pesada compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (framework) selecionadas a partir de VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região variável de cadeia leve compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pela região variável de cadeia pesada compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VH FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, VH FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, VH FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e VH FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e a região variável de cadeia leve compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VL FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, VL FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, VL FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e VL FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região variável de cadeia pesada compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34, e 35.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pela região variável de cadeia leve compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
7. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35.
8. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana,
caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
9. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
10. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24 ou 3F9-25 (conforme mostrado na Tabela 8).
11. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24 ou 3F9-25 (conforme mostrado na Tabela 7).
12. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9- 9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (como mostrado na Tabela 8); e em que a região variável de cadeia leve compreende a HVR- L1, HVR- L2 e HVR- L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9 -2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9- 10, 3F9-11, 3F9-12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9 -20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-2 4 ou 3F9-25 (como mostrado na Tabela 7).
13. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, em que o anticorpo compreende a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR - L3 do anticorpo 3F9-1, 3F9-2, 3F9-3, 3F9-4, 3F9-5, 3F9-6, 3F9-7, 3F9-8, 3F9-9, 3F9-10, 3F9-11, 3F9- 12, 3F9-13, 3F9-14, 3F9-15, 3F9-16, 3F9-17, 3F9-18, 3F9-19, 3F9-20, 3F9-21, 3F9-22, 3F9-23, 3F9-24, ou 3F9-25 (como mostrado nas Tabelas 7 e 8).
14. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4, em que a VH FR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; a VH FR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; a VH FR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e a VH FR4 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais selecionadas a partir de VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4, em que a VL FR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; a VL FR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; a VL FR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e a VL FR4 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
15. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo humanizado.
17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv ou scFv.
18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multivalente.
19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo anticorpo ser da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA.
20. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo anticorpo ser da classe IgG e ter um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
21. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado por ligar-se a um receptor de Fc inibidor.
22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo receptor Fc inibidor ser o receptor Fc gama IIB inibidor
(FcγRIIB).
23. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo anticorpo diminuir os níveis celulares de FcγRIIB.
24. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, caracterizado por ter um isotipo de IgG1 humana ou de camundongo e compreender uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: N297A, D265A, D270A, L234A, L235A, G237A, P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU ou compreende uma deleção de aminoácido na região Fc em uma posição correspondente à glicina 236.
25. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado por ter uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste em: C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destas substituições, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU ou de Kabat.
26. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
27. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
28. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
29. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
30. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
31. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
32. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
33. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
34. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
35. ANTICORPO isolado que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
36. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA diminuir os níveis de SIRPA na superfície celular, diminuir os níveis intracelulares de SIRPA, diminuir os níveis celulares totais de SIRPA ou qualquer combinação dos mesmos.
37. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 36, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA induzir a degradação de SIRPA, induzir a clivagem de SIRPA, induzir a internalização de SIRPA, induzir a liberação de SIRPA, regular negativamente a expressão de SIRPA ou qualquer combinação dos mesmos.
38. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37, caracterizado pelo anticorpo reduzir os níveis de SIRPA na superfície celular de maneira in vitro.
39. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 38, caracterizado pelo anticorpo reduzir os níveis de SIRPA na superfície celular de maneira in vivo.
40. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, caracterizado pelo anticorpo regular negativamente a expressão de SIRPA em monócitos humanos.
41. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 40, caracterizado pelo anticorpo regular negativamente a expressão de SIRPA em macrófagos humanos.
42. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41,
caracterizado pelo anticorpo regular negativamente a expressão de SIRPA em macrófagos humanos em cerca de 70-95%.
43. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 42, caracterizado pelo anticorpo ter uma afinidade (K D) para SIRPA v1 humana inferior a 6 nM, inferior a 5 nM, inferior a 4 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM ou inferior a 1 nM.
44. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, caracterizado pelo anticorpo possuir uma afinidade (KD) para SIRPA v1 humana de cerca de 0,1 nM a 2 nM.
45. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pelo anticorpo ter uma afinidade para SIRPA humana com uma KD que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes menor do que a KD de um anticorpo anti-SIRPA que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
46. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 45, caracterizado pelo anticorpo reduzir os níveis de SIRPA na superfície celular in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) de cerca de 0,05 nM a 2 nM, conforme medido por citometria de fluxo.
47. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 45, caracterizado pelo anticorpo reduzir os níveis de SIRPA na superfície celular in vitro com metade da concentração máxima eficaz (EC50) de cerca de 0,05 a 0,20 nM para SIRPA v2 humana e/ou de cerca de 0,05 a 1 nM para SIRPA de cinomolgos (cynoSIRPA), conforme medido por citometria de fluxo.
48. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 47, caracterizado pelo anticorpo liga-se à SIRPA humana, SIRPA v1 humana, SIRPA v2 humana, cynoSIRPA, SIRPA de sagui e SIRPβ3 humana.
49. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 48, caracterizado pelo anticorpo ligar-se ao domínio D3 da SIRPA v1 humana de SEQ ID NO: 1.
50. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 49, caracterizado pelo anticorpo ligar-se aos resíduos de aminoácidos R282, Q284 e G337 da SIRPA v1 humana de SEQ ID NO: 1.
51. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 50, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA aumentar a fagocitose de células tumorais em macrófagos, aumentar a fagocitose de células tumorais em macrófagos M1, aumentar a fagocitose de células tumorais em macrófagos M2, diminuir a expressão de CD14 em macrófagos, e/ou qualquer combinação dos mesmos.
52. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 51, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA aumentar a proliferação de células T.
53. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA aumentar a proliferação de células T sem bloquear a interação de SIRPγ e CD47.
54. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA estimular a produção de ROS em monócitos e/ou aumentar a expressão de IL-8 em monócitos.
55. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 54, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA inibir o crescimento tumoral in vivo.
56. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 55, caracterizado pelo anticorpo anti-SIRPA reduzir o número de células mieloides CD14+ no sangue periférico e/ou aumentar o número de células mieloides CD14+ em um tumor.
57. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 56, caracterizado pelo anticorpo ligar-se à SIRPA humana, mas não bloquear substancialmente a ligação de CD47 à SIRPA.
58. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 57, caracterizado pelo anticorpo reconhecer um primeiro e um segundo antígeno, em que o primeiro antígeno é SIRPA e o segundo antígeno é: (a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica; (b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionado a partir de receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR -1 e 2), e receptor da toxina da difteria; (c) um agente causador de doenças selecionado a partir de peptídeos ou proteínas causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição de GGCCCC (G2C4) antissenso, proteínas causadoras de doenças são selecionadas a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 no cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, Huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amiloide sérica A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG (RAN) associados à repetição, peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição prolina- alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR); e (d) ligantes e/ou proteínas expressas em células imunes, em que os ligantes e/ou proteínas são selecionados a partir de PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73 e fosfatidilserina; e uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais.
59. MÉTODO DE TRATAMENTO DO CÂNCER, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 58, tratando assim o câncer.
60. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma, glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga, linfoma difuso de grandes células B, adenocarcinoma de pulmão; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma indolente de células B, linfoma de células B agressivo, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas, carcinoma invasivo de mama, carcinoma de células escamosas cervicais, adenocarcinoma endocervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma de cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma de cabeça e pescoço, carcinoma renal cromofóbico, carcinoma renal de células papilares, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas pulmonares, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso ovariano, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma retal, melanoma cutâneo, adenocarcinoma de estômago, tumores de células germinais testiculares, carcinoma da tiroide, timoma, carcinoma endometrial do corpo uterino, carcinossarcoma uterino, e melanoma uveal.
61. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado por compreender ainda a administração de um agente terapêutico que inibe ou agoniza PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR- 5, CD2, CD5, CD39 ou CD73.
62. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 61, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de ponto de verificação, e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais.
63. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por compreender ainda a administração de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória em combinação com o anticorpo anti-SIRPA.
64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória ser selecionado a partir de um anticorpo anti-PD- L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor das células killer semelhante à imunoglobulina (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti- CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFα, um anticorpo anti- CD33, um anticorpo anti-Siglec- 5, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, e qualquer combinação dos mesmos.
65. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais serem selecionadas a partir de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercept, transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.
66. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 65, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora.
67. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora ser selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.
68. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 67, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora.
69. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora ser selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo agonista anti-GITR proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide, um anticorpo agonista anti- CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.
70. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 69, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo pelo menos uma citocina estimuladora.
71. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela citocina estimuladora ser selecionada a partir de IFN-α4, IFN-β, IL-1β,
TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1- beta e qualquer combinação das mesmas.
72. ÁCIDO NUCLEICO isolado, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 58.
73. VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 72.
74. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada, caracterizada por compreender o ácido nucleico da reivindicação 72 ou o vetor da reivindicação
73.
75. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada, caracterizada por expressar o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a
58.
76. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO que se liga à SIRPA humana, caracterizado por compreender o cultivo da célula de acordo com a reivindicação 74 ou 75, para que o anticorpo seja produzido.
77. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por compreender ainda a recuperação do anticorpo produzido pela célula.
78. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 58, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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