BR112017024854B1 - Uso de um composto - Google Patents

Abstract

composto. a presente invenção se refere aos compostos para a profilaxia ou o tratamento de dano em órgão através da restauração da função endotelial e/ou da inibição da produção das espécies de oxigênio reativas e especialmente aos compostos para a profilaxia ou o tratamento do dano renal diabético. especificamente, a presente invenção se refere ao 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona ou n,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida ou um sal ou base farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso na profilaxia ou no tratamento de dano em órgão através da restauração função endotelial e/ou da inibição da produção das espécies de oxigênio reativas e especialmente o dano ao órgão renal diabético.

Description

Descri^ao

[1] A presente invensao se refere aos compostos para a profilaxia ou o tratamento de danos em orgaos, atraves da restaura?ao da funsao endotelial e / ou da inib^ao da produ?ao de especies de oxigenio reativas e especialmente aos compostos para a profilaxia ou o tratamento de dano renal diabetico.

[2] A nefropatia diabetica (nefropatia diabetica), tambem conhecida como glomeruloesclerose diabetica nodular ou glomerulonefrite intercapilar e uma doen£a renal progressiva causada por angiopatia dos capilares nos glomerulos renais. Esta e caracterizada por sindrome neffotica e glomeruloesclerose difusa. A nefropatia diabetica e geralmente causada por diabetes mellitus de longa data, e e uma indica?ao principal para a dialise em muitos paises desenvolvidos.

[3] A insuficiencia renal provocada por glomeruloesclerose leva aos deficits na filtra?ao de fluidos e aos outros disturbios da fun?ao renal. Ha um aumento na pressao arterial sanguinea (hipertensao) e na retensao de liquidos no corpo, alem de uma pressao oncotica no plasma reduzida que causa edema. Outras complicasoes podem ser a arteriosclerose da arteria renal e a proteina na urina.

[4] A primeira anomalia laboratorial geralmente e um teste de microalbuminuria positivo. A nefropatia diabetica e suspeita de diagnostico quando uma rotina de analise de urina de uma pessoa com diabetes mostra muita proteina na urina (proteinuria). A analise de urina pode tambem mostrar glicose na urina, especialmente se a glicose no sangue e mal controlada. A creatinina no soro e BUN podem aumentar a medida que progridem os danos nos rins. Uma biopsia renal geralmente confirma o diagnostico, embora nem sempre seja necessario, se o caso e simples, com uma progressao documentada de proteinuria ao longo do tempo e a presen5a de retinopatia diabetica no exame da retina dos olhos.

[5] A hiperfiltra?ao glomerular e a fisiopatologia basica na nefropatia diabetica levando a hipertensao intraglomerular. Os farmacos inibidores da ACE ajudam a prevenir a nefropatia diabetica, impedindo esta etapa. A progressao da hiperfiltra?ao glomerular conduz ao estagio de espessamento da membrana basal. Esta e a primeira mudansa detectavel no curso da nefropatia diabetica. Isto e seguido pela expansao da mesangio e, finalmente, pela esclerose nodular. Nesta fase, o rim pode vazar mais albumina serica (proteina do plasma) do que o normal na urina (albuminuria), e isto pode ser detectado por exames medicos para albumina. Como a nefropatia diabica progride, um numero crescente de glomerulos e destruido por glomerulosclerose nodular progressiva. A biopsia renal mostra claramente geralmente nefropatia diabetica. A nefropatia diabetica e normalmente precedida pelo aparecimento de retinopatia diabetica; a evidencia de nefropatia sem retinopatia da a suspeita de que a insuficiencia renal nao e causada por diabetes em si, mas e o resultado de comorbidade (por exemplo, glomerulonefrite).

[6] Os objetivos do tratamento da nefropatia diabetica sao para retardar a progressao do dano nos rins e o controle das complica?oes. O tratamento principal, uma vez que a proteinuria e estabelecida, e o uso de farmacos inibidoras de ACE, o que geralmente reduz os niveis de proteinuria e retarda a progressao da nefropatia diabetica. Varios efeitos de ACEIs que podem contribuir para a prote?ao renal tern sido relacionados com a associa?ao de aumento nas Quininas que e tambem responsavel por alguns dos efeitos colaterais associados com a terapia de ACEIS, tais como tosse seca. O efeito de prote?ao renal esta relacionado com os efeitos anti- hipertensivos em pacientes normais e hipertensos, a vasodilata?ao renal resultando em um aumento do fluxo sanguineo renal e a dilata?ao das arteriolas eferentes. Muitos estudos tern demonstrado que os medicamentos relacionados, os bloqueadores do receptor da angiotensina (ARBs), tern um beneficio semelhante.

[7] Varios compostos estao em desenvolvimento da nefropatia diabetica. Estes compostos incluem bardoxolona metil, olmesartan medoxomil, sulodexida, NOX-E36 e avosentano.

[8] No entanto, apesar do exposto acima, continua existindo uma necessidade continua na tecnica para outros compostos para a profilaxia ou o tratamento da nefropatia diabetica ou a doenga renal diabetica.

[9] E um objeto da presente invengao, entre outros objetos, para satisfazer a necessidade acima na tecnica.

[10] De acordo com a presente invengao, o objetivo acima mencionado, entre outros objetos, e alcangado atraves de compostos como descrito nas reivindicagoes anexas.

[11] Especificamente, o objeto acima, entre outros objetos, e alcangado pela presente invengao por um composto de acordo com a formula (I), ou um sal ou base farmaceuticamente aceitavel do mesmo, para uso na profilaxia ou tratamento de dano em orgao atraves da restauragao da fungao endotelial e/ou da inibigao da produgao das especies de oxigenio reativas, de modo preferencial, em que o referido dano em orgao e dano em orgao diabetico e/ou o referido orgao e o rim,em que R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes, e representam um grupo a C1-C4 alquil linear ou ramificado; em que R3 representa um hidrogenio ou uma fragao pro- farmaco que pode ser removida em tecido vivo; de modo preferencial, R3 forma em conjunto com o oxigenio 6 de um grupo ester. R3 pode ter 1 a 12 atomos de carbono, de modo preferencial, 1 a 6 atomos de carbono, e pode compreender uma ou mais amina ou atomos de oxigenio; n pode ser 0 ou 1, e e, de modo preferencial, 1; R4 e um grupo que compreende em 1 a 20 atomos de carbono e pelo menos um atomo de nitrogenio; R4 pode compreender ainda atomos de nitrogenio, um ou mais atomos de oxigenio, halogenio, atomos de enxofre ou de fosforo e R4 pode compreender grupos aromaticos, em que o peso molecular de R4, de modo preferencial, e menos do que 300 Da.

[12] Como sera reconhecido, o composto de formula (I) e derivado de trolox, um analogo soluvel em agua da vitamina E. Em Trolox, R1 e R2 sao metil, R3 e hidrogenio, e R4 e o acido carboxilico.

[13] Especificamente, o objetivo acima mencionado, entre outros objetos, e alcansado pela presente invensao por um composto de acordo com a formula (II) (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-l- il)metanona (II) ou um sal ou base farmaceuticamente aceitavel do mesmo para uso na profilaxia ou o tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da fun5ao endotelial e/ou da inib^ao da produ?ao das especies de oxigenio reativa, de modo preferencial, em que o referido dano em orgao e dano em orgao diabetico e/ou o referido orgao e o rim.

[14] De acordo com a presente inven5ao, de acordo com um outro aspecto, o objeto acima mencionado, entre outros objetos, e alcan5ado por um composto de acordo com a formula N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida (III) ou um sal ou base farmaceuticamente aceitavel do mesmo para uso na profilaxia ou no tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da fun?ao endotelial e/ou da inibi?ao da produ?ao das especies de oxigenio reativas, de modo preferencial, em que o referido dano em orgao e dano em orgao diabetico e/ou o referido orgao e o rim.

[15] De acordo com a presente invensao, de acordo com outro aspecto, o objeto acima, entre outros objetos, e alcansado por um composto selecionado a partir do grupo, em conjunto com o “grupo A”, que consiste em 2.2.5.7.8- pentametilcroman-6-ol; acido (S)-6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxilico;acido (R)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman- 2-carboxilico; 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; N-butil-6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; 6-hidroxi-N-isopropil- 2.5.7.8- tetrametilcroman-2-carboxamida; (E)-N-(3,7-dimetilcta-2,6-dien-l-il)- 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-il)(morfolino)metanona; N-(4-fluorobenzil)-6-hidroxi- 2.5.7.8- tetrametilcroman-2-carboxamida; 6-hidroxi-N-((S)-2-hidroxi-l- feniletil)-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametil-N-(2-(metilamino)etil)croman-2-carboxamida; 6-hidroxi-N,2,5,7,8- pentametil-N-(2-(metilamino)etil)croman-2-carboxamida; 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametil-N-(3 -(piperidin-1 -il)propil)croman-2-carboxamida; 6-hidroxi- 2.5.7.8- tetrametil-N-(3-nitrofenil)croman-2-carboxamida; N-(4-fluorofenil)-6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; metil 4-(6-hidroxi-2,5,7,8- dimetilpiperazin-l-il)(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)metanona; N- ((R)-2-amino-2-oxo-1 -feniletil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxamida; (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)((S)-2- (hidroximetil)pirrolidin-l-il)metanona; N-(2-bromoetil)-6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxamida; N'-(2-cianoetil)-6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carbohydrazide; 2-(((4-fluorobenzil)amino)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol; 2-((butilamino)metil)-2,5,7,8-tetrametilcroman-6-ol; acido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxilico; 2- (hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-6-ol; 6-hidroxi-N-((R)-l- hidroxipropan-2-il)-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida; (6-hidroxi- 2.5.7.8- tetrametilcroman-2-il)(4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-l- il)metanona; N-(2-cianoetil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxamida; 6-hidroxi-N-(2-((2-hidroxietil)(metil)amino)etil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxamida; (R)-N,6-dihidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxamida; (S)-N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman- 2-carboxamida; 2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1 -il)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol; 2-((((S)-2-hidroxi-1 -feniletil)amino)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol; 2,5,7,8-tetrametil-2-(piperidin-l-ilmetil)croman-6-ol; N,6-dihidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxamida; (6-hidroxi- 2.5.7.8- tetrametilcroman-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-l-il)metanona; (6- hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-l- il)metanona; 2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-l-il)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol; 2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-l-il)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol; acido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)piperazin-l-il)acetico; (6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman- 2-il)(piperazin-l-il)metanona; (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(4-(2- hidroxietil)piperazin-l-il)metanona; acido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carbonil)piperazin-1 -il)acetico; etil 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carbonil)piperazin-1 -il)acetato; acido (S)-2-(4-(6-hidroxi- 2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carbonil)piperazin-1 -il)acetico; acido (R)-2-(4-(6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbonil)piperazin-1 -il)acetico; acido (2S)-l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbonil)pirrolidina-2- carboxilico; acido (2S)-l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)pirrolidina-2-carboxilico; acido (2S)-1 -(6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carbonil)pirrolidina-2-carboxilico e sais ou bases farmaceuticamente aceitaveis dos mesmos para uso na profilaxia ou no tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da funsao endotelial e/ou da inibisao da produ?ao das especies de oxigenio reativas, de modo preferencial, em que o referido dano em orgao e dano em orgao diabetico e/ou o referido orgao e o rim.

[16] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que os presentes compostos de acordo com a formula (I), e ainda mais, de modo preferencial, (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1 - il)metanona ou N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxamida tern um efeito significativo na restaura?ao da fun?ao endotelial e/ou na inib^ao das especies de oxigenio reativas em um modelo de camundongo de diabetes tomando os mesmos apropriados para na profilaxia ou no tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da funsao endotelial e/ou da inib^ao da produ?ao das especies de oxigenio reativas em orgaos e, especialmente, em neffopatia diabetica ou doen5a renal diabetica.

[17] De acordo com uma modalidade preferencial da presente inven5ao, a presente profilaxia ou o tratamento compreende a administra?ao dos presentes compostos, tais como os compostos de acordo com as formulas (I), (II) e (III), ou de acordo com o grupo A em uma dose terapeuticamente eficaz.

[18] O composto de acordo com a formula (I), de modo preferencial tem as seguintes caracteristicas:

[19] R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentes, e representam um grupo C1-C4 alquil linear ou ramificado. De modo preferencial, R1 e R2 sao metil, etil ou isopropil, e ainda, de modo preferencial, R1 e R3 sao os mesmos, e sao metil ou isopropil. Outros grupos apropriados sao n-butil e t- butil.

[20] R3 representa um hidrogenio ou uma fra?ao pro-farmaco que pode ser removida em tecido vivo. De modo preferencial, R3 forma em conjunto com o oxigenio 6 um grupo ester. R3 pode ter 1 a 12 atomos de carbono, de modo preferencial, 1 a 6 atomos de carbono, e pode compreender uma ou mais amina ou atomos de oxigenio. Grupos apropriados - em conjunto com o oxigenio 6 - incluem etil-ester, butil-ester, benzoil-ester, ou um ester de um aminoacido, ou aminoacidos no grupo amino e amidado com um acido alquil carboxilico tendo 1 a 4 atomos de carbono. Em uma modalidade preferencial, R3 e hidrogenio. n pode ser 0 ou 1, e e, de modo preferencial, 1; R4 e um grupo que compreende em 1 a 20 atomos de carbono e pelo menos um atomo de nitrogenio. R4 pode compreender ainda atomos de nitrogenio, um ou mais atomos de oxigenio, halogenio, atomos de enxofre ou de fosforo e R4 pode compreender grupos aromaticos.

[21] O peso molecular de R4, de modo preferencial, e menos do que 300 Da.

[22] De modo preferencial, o composto, de acordo com a formula (I) tem um peso molecular menor do que 500 Da.

[23] De modo preferencial, o composto, de acordo com a formula (I) nao compreende um anel heterociclico aromatico.

[24] De modo preferencial, R4 compreende um grupo carbonil, e mais ainda, de modo preferencial, um grupo carbonil ligado a fra?ao trolox.

[25] Em uma modalidade preferencial, R4 e -CO-N-R5, em que o C=0 e ligado a fra?ao trolox, e em que R5 e um grupo alquil, opcionalmente substituido com nitrogenio ou oxigenio, em que o grupo alquil compreende 1 a 12 atomos de carbono, e em que nitrogenio pode ser amina, amina quatemaria, guanidina ou imina, e oxigenio pode ser hidroxil, carbonil ou acido carboxilico. Oxigenio and nitrogenio em conjunto podem formar amida, ureia ou grupos carbamato.

[26] O grupo alquil em R5 pode ser linear, ramificado ou ciclico, e, de modo preferencial, compreende pelo menos uma estrutura ciclica.

[27] Os compostos, como apresentados pela formula (I) podem ser preparados de acordo com as sinteses quimicas conhecidas.

[28] Por exemplo, os compostos com um grupo guanidina, ou um grupo piperazina ligados a uma fra?ao de trolox atraves de um grupo alquil sao descritos em EP202580. A sintese de analogo pode ser utilizada, em que o oxigenio 6 esta protegido, e liberado apos a sintese, ou protegido com uma fra?ao de pro-farmaco.

[29] Por exemplo, os compostos com grupos nicotinato como substituintes, estao descritos em US461890. O nicotinato ligado ao oxigenio 6 da fra?ao trolox pode atuar como uma fra?ao pro-farmaco, que e hidrolisada in vivo para um grupo hidroxil livre.

[30] Por exemplo, os compostos adequados sao descritos em WO88/08424, exemplos 18 a 23 e 78 a 164.

[31] Por exemplo, os compostos adequados sao descritos em W097/41121, nas preparasoes 1, 6, 7, 12 a 15, 21, 24 e 27, em que o grupo benzoil pode ser removido, ou podem atuar como uma fra?ao de pro-farmaco.

[32] Outros compostos sao descritos, por exemplo, em WO03/024943, como os compostos 9 a 11, 25 a 28, 109 a 112, 119 a 122, etc.

[33] Por exemplo, os compostos tendo um grupo de amonio quatemario sao descritos em W02014/011047, incluindo uma descr^ao da sintese nos exemplos.

[34] A presente invensao sera ainda mais detalhada nos exemplos abaixo. Nos exemplos, e feita referenda as figuras em que:

[35] A Figura 1 mostra os dados metabolicos de camundongos diabeticos e nao diabeticos SUL121 tratados. A) O peso corporal, B) absorsao de agua, C) produ?ao de urina, D) os niveis de glicose no plasma de nao jejum. E) A pressao sanguinea. *p <0,05 de SUL121 diabeticos versus controle diabetico; A Figura 2 mostra os pesos de orgaos na termina?ao. *p <0,05 de diabetico versus controle de tipo selvagem; A Figura 3 mostra a excre?ao de albumina urinaria e proposes ACR para animais diabeticos. *,#p <0,05 SUL121 diabetico versus controle diabetico; A Figura 4 mostra escores FGS em animais diabeticos sao significativamente reduzidos pelo tratamento de SUL121; A Figura 5 mostra que o tratamento de SUL121 restaura relaxamento mediado por endotelio; A Figura 6 mostra que o tratamento de SUL121 normalizou os niveis plasmaticos de H2O2 em diabetes; A Figura 7 mostra que o tratamento de SUL121 normalizou a produ?ao de ROS intracelular induzida por glicose elevada; e A Figura 8 mostra as correla?oes entre os diferentes parametros.

Exemplos Exemplo 1: Sintese de varios compostos

[36] Os compostos, de acordo com a invensao, podem ser sintetizados de acordo com os metodos de slntese padroes que sao bem conhecidos por um tecnico especialista no assunto. SUL-0083, SUL-0084 e SUL-0085 sao comercialmente disponlveis. A Tabela 1 abaixo fomece um resumo dos compostos presentes como uma indica?ao arbitraria intercambiavel (codigo) dos presentes compostos usados aqui.Tabela 1: Varios compostos, de acordo com a presente invengao

Sintese de SUL 089-112, 114-117, 120-126, 128-130, 132, 134-135, 138, e 140

[37] Amidapao de trolox foi conseguida pela reapao com a amina apropriada na presenpa de reagentes de acoplamento padroes para a formapao de amida, por exemplo, HATU e CDI. As correspondentes aminas foram preparadas pela redupao das amidas formadas com BH3. Os derivados de acido hidroxamico foram preparados pela reapao com hidroxilamina/CDI. A sintese de analogos de carbohidrazida de trolox foi conseguida pela reapao com (substituidas) hidrazinas. Os compostos enantiomericos/diastereoisomericos foram preparados partindo a partir de Trolox enantiomericamente puro (R)- ou (S)- ou por meio de cromatografia quiral.

Sintese de SUL-118, SUL-119 e SUL-146

[38] A oxidapao de propofol comercialmente disponivel com salcomina, um complexo de coordenapao do ligante salen com cobalto, seguido pela redupao com NaBH4 gerou 2,6-diisopropilbenzene-l,4-diol. A metilapao subsequente com HCO/SnCVHCl e a reapao com metil metacrilato gerou SUL-146 (metil 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2- carboxilato). Hidrolise com LiOH gerou o acid carboxilico SUL-118 (acido 6- hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxilico). O alcool SUL-119 (2-(hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-6-ol) foi obtido por redu?ao de SUL-146 com LiAlH4.

Sintese de SUL-131, SUL-133, SUL 137 e SUL-146

[39] Partindo do acido carboxllico SUL-118 (acido 6-hidroxi-5,7- diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxllico), a hidroxilamina foi obtida pela rea?ao com hidroxilamina usando CDI como reagente de acoplamento. Os compostos SUL 133 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-il)(4-(2- hidroxietil)piperazin-l-il)metanona) e SUL 137 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil- 2,8-dimetilcroman-2-il)(piperazin-l-il)metanona) foram preparados pela rea?ao de SUL-118 com o derivado piperazina apropriado. Ambos os reagentes de acoplamento HATU e CDI resultaram em rendimentos satisfatorios. SUL 139 (acido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carbonil)piperazin-l-il)acetico) foi preparado por uma amina?ao reativa de SUL 137 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman- 2-il)(piperazin-l-il)metanona) com acido glioxalico.

Sintese de SUL-136, SUL-141 e SUL-142

[40] Hidrolise de SUL-140 (etil 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carbonil)piperazin-l-il)acetato) sob atmosfera de N2 gerou SUL-136 (acido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)piperazin-l-il)acetico) em rendimento elevado. Os enantiomeros SUL-141 e SUL-142 foram preparados de acordo com as cond^oes descritas acima.

Sintese de SUL 143,144 e 145

[41] Amida9ao de trolox com (S)-metil pirrolidina-2-carboxilato (ester metil L-prolina) gerou, apos a cromatografia em coluna, dois diastereoisomeros. A subsequente hidrolise dos diastereoisomeros individuais gerou SUL-144 (acido (2S)-l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)pirrolidina-2-carboxilico, diastereoisomero 1) e SUL-145 (acido (2S)-l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbonil)pirrolidina-2- carboxllico, diastereoisomero 2). O analogo racemico SUL-143 (acido (2S)-1- (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbonil)pirrolidina-2-carboxilico) foi obtido atraves da mistura dos esteres dos diastereoisomeros individuals seguido por hidrolise da fra?ao de ester usando LiOH.

Amidagao de Trolox (exemplo geral) S UL-108 ((4-butilpiperazin-l -il) (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- iljmetanona). HCl

[42] Trolox (11 g, 0,044 mol, 1 eq.) foi suspenso em acetonitrila (100-150 ml). CDI (8,6 g, 0,053 mol, 1,2 eq.) foi adicionado em porsoes. A mistura de rea?ao foi agitada por 0,5 a 1 hora em temperatura ambiente. Depois da adi?ao de 1-butilpiperazina (6,9 g, 0,048 mol, 1,1 eq.) a mistura de rea?ao foi agitada a 25 a 30°C ao longo do fim de semana. A mistura de rea?ao foi concentrada, H20 (200 ml) foi adicionada e a camada aquosa foi extraida com EtOAc (4X). As camadas organicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. O produto em bruto obtido foi purificado por cromatografia em coluna (DCM/10% MeOH) gerando o composto pretendido (9 g de produto, 82% puro). A cristaliza?ao a partir de EtOAc/heptanos gerou SUL-108 (6 g, 0,016 mol, 36 % de rendimento, 90% puro) como um solido branco. O material obtido foi dissolvido em DCM (50 a 100 ml). HCl (4 M em dioxano, 8,8 ml, 0,0035 mol, 2,2 eq.) foi adicionado e a mistura de rea?ao foi agitada em temperatura ambiente durante o fim de semana. A mistura foi filtrada, rinsada com DCM, e seca para gerar o sal HC1 de SUL-108 (6,3 g, 97-98% puro) como um solido branco.

[43] !H-NMR (CDC13, em ppm): 0,93 (t, 3H), 1,38 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 1,67 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,50-3,20 (m, 14H). M+ = 375,3

Redugao de amidas Trolox (exemplo geral) S UL-128. (2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-l -il)metil)-2,5,7,8- tetrametilcroman-6-ol). HCl

[44] BH3.THF em THF (16 ml, 0,0156 mol, 2 eq.) foi resfriado ate T = 0°C. Uma solu?ao de SUL-112 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- il)((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-l-il)metanona; 2,6 g, 0,0078 mol, 1 eq.) em THF (50 ml) foi adicionada sob gotejamento e a mistura de rea?ao foi refluxada por 1 hora e resfriada ate a temperatura ambiente durante a noite. A mistura de rea?ao foi resfriada em um banho de gelo e HCl (6 M, 25 ml) foi adicionado sob gotejamento. DCM (100 ml) foi adicionado e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraida com DCM (3X). As camadas organicas combinadas foram secas sobre K2CO3 ate nenhuma forma?ao de gas ser percebida novamente. A fase organica foi filtrada e concentrada. O produto em bruto foi resfriado em um banho de gelo, e NaOH (6M, 50 ml) foi adicionado sob gotejamento. Depois da adi?ao a mistura de rea?ao foi agitada por 1 hora e extraida com DCM (4X). As camadas DCM combinadas foram secas, filtradas e concentradas para gerar 1,6 g de produto em bruto (20 a 40% puro). O material foi purificado por cromatografia em coluna gerando SUL- 128 (300 mg, 0,94 mmol, 12 % de rendimento, 90 % puro). Este foi dissolvido em DCM (10 ml) e resfriado ate T =0°C (banho de gelo). HCl (4M em dioxano, 0,3 ml, 0,94 mmol, 1,2 eq.) foi adicionado e a mistura de rea?ao foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O solido formado foi filtrado, lavado com Et20 e seco para gerar o sal HCl de SUL-128 (300 mg, 90 % puro) como um solido branco (mistura de diastereoisomeros).

[45] !H-NMR (CDC13, em ppm): 1,20-1,90 (m, 7H), 2,12 (s, 6H), 2,17 (s, 3H), 2,20-2,90 (m, 9H), 3.4-3,65 (m, 2H). M+ = 320,1

Sintese de 2,6-Diisopropilciclohexa-2,5-dieno-l,4-diona

[46] Propofol 100 g, 561 mmol) foi dissolvido em DMF (250 mL). A solu?ao foi resfriada ate 0°C enquanto sob agita?ao. Salcomina (16,6 g, 51 mmol; 9 mol%) foi adicionada e a mistura de rea?ao resultante foi agitada 112 h durante a noite enquanto sob aquecimento ate a temperatura ambiente. A mistura de rea?ao foi vertida em agua (7 L). A suspensao resultante foi extraida com heptanos (5x1 L). Os extratos organicos combinados foram secos com Na2S04. A concentra?ao da solu?ao sob vacuo gerou o produto bruto de 2,6-diisopropilciclohexa-2,5-dieno-l,4-diona (62,5 g; 325 mmol; 58% de rendimento) como um oleo. O produto foi usado na etapa seguinte sem outra purifica?ao.

Sintese de 2,6-Diisopropilbenzene-l,4-dio

[47] O produto em bruto 2,6-diisopropilciclohexa-2,5-dieno-l,4- diona (62,5 g, 325 mmol) foi dissolvido em diclorometano (300 mL) e metanol (100 mL). A solu?ao foi resfriada ate 0°C com um banho de gelo. Boro-hidreto de sodio (4,5 g, 182 mmol) foi adicionado em porsoes. Depois de a adi?ao estar completa, a mistura de rea?ao foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Acetona (150 mL) foi adicionada para extinguir o excesso de boro-hidreto de sodio. Depois de 30 minutos, 2N aq. de HC1 em agita?ao (200 mL) foi adicionado. Depois de agita?ao durante 45 minutos a mistura foi extraida com acetato de etila (4 x 400 mL). As camadas organicas combinadas foram secas com Na2S04. Concentra?ao da solu?ao sob vacuo gerou o produto em bruto de 2,6-diisopropilbenzene-l,4-diol (64 g, 330 mmol) como um oleo vermelho em rendimento quantitative. O produto foi usado na etapa seguinte sem outra purifica?ao.

Sintese de 3,5-Diisopropil-2-metilbenzene-l,4-diol

[48] A mistura de 2,6-diisopropilbenzene-l,4-diol (64 g, 0,33 mol), paraformaldeido (9,8 g, 0,327 mol), S11CI2 (217,9 g, 1,15 mol), HC1 aquoso a 37% concentrado (0,6 L) e eter diisopropil (2,5 L) foi aquecido ate refluxo por 4 horas. Depois do resfriamento ate a temperatura ambiente durante a noite a mistura bifasica foi separada. A camada aquosa foi extraida com TBME (2000 mL). As fra?oes organicas foram lavadas com IN aq. HC1 (1000 mL), agua (1000 mL) e salmoura (1000 mL). As fra?oes organicas foram secas com NaaSCL e concentradas sob vacuo para gerar uma mistura 50 :35 de 3,5-diisopropil-2-metilbenzeno-l,4-diol e 2,6-diisopropil-3,5- dimetilbenzeno-l,4-diol (61 g de oleo) de acordo com a analise de GCMS. A purificasao por cromatografia em gel de silica (1200 mL) eluindo com acetato de etila/heptanos = 97,5:2,5 (4000 mL), 95:5 (4000 mL) gave 3,5-diisopropil- 2-metilbenzeno-l,4-diol 6 (16,6 g, 79,8 mmol; 24%: 83% puro) como um oleo.

Sintese de Metil 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxilato

[49] 3,5-diisopropil-2-metilbenzeno-l,4-diol (10,6 g, 50,9 mmol; 83% puro) foi dissolvido em metacrilato de metila (20 mL, 186 mmol). A solu?ao foi transferida a um tubo de Teflon tube em um reator Berghof. O formaldeido aquoso (10 mL; solu?ao a 37% em peso, estabilizado com 1015% MeOH) foi adicionado e a mistura de rea?ao foi aquecida ate 180°C (temperatura interna) no reator fechado por 5 horas enquanto sob agita?ao. Depois do resfriamento ate ca. 40°C a mistura de rea?ao foi vertida em MeOH (200 mL) e a mistura foi concentrada sob vacuo. A purificasao por cromatografia em gel de silica (600 mL) eluindo com acetato de etila/heptanos = 95:5 (5000 mL; TLC: Rf ~ 0,2; spot corado com vapor de iodo) gerou o produto puro desejado metil 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carboxilato (10,0 g, 31,3 mmol, 61%).

Sintese de dcido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxilico (SUL-118)

[50] Uma mistura de metil 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carboxilato purificado (8,3 g, 25,9 mmol) e hidroxido de litio mono-hidratado (4,3 g, 102,5 mmol; 4 eq.) em MeOH (100 mL), THF (100 mL) e agua (25 mL) foi aquecida por 30 minutos em pressao ambiente enquanto girando com um evaporador rotativo em um banho-maria momo a 60°C. Os solventes organicos foram evaporados sob vacuo. Agua (150 mL) foi adicionada ao residuo, seguido por acido acetico (10 mL). Uma mistura laranja clara foi obtida. A extra?ao com acetato de etila (3 x 100 mL), secagem das fra?oes organicas combinadas com Na2S04 e a concentra?ao sob vacuo geraram o produto em bruto como um solido laranja. Os solidos foram agitados com tBME (150 mL). Um solido bege precipitou e uma solu?ao laranja foi obtida. Heptano (250 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada por 15 minutos. A mistura foi filtrada por um filtro de vidro. Os solidos residuais foram lavados com heptanos (2 x 50 mL) no filtro sob suc?ao. A secagem dos solidos sob vacuo a 60°C gerou o acido 6-hidroxi-5,7- diisopropil-2,8-dimetilcroman-2-carboxilico puro (SUL-118) como um solido quase branco (3,1 g, 10,13 mmol; 39%, 100% puro).

[51] !H-NMR (CDC13, em ppm): 1,38 (t, 12 H), 1,52 (s, 3H), 1,87 (m, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 3,38 (m, 1H). M+ = 307,10 Sintese de SUL 119 (2-(hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-6-ol)

[52] Uma solu?ao de metil 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carboxilato (500 mg, 1,56 mmol) em THF (12 mL) foi adicionada durante 5 minutos com uma seringa via uma tampa de borracha ate LiAlFL (238 mg, 6,26 mmol; 4 eq.), pre-pesado em um frasco de fundo redondo de 3 gargalos seco de 100 mL sob atmosfera inerte de nitrogenio enquanto sob agita?ao em temperatura ambiente. A adi?ao exotermica do ester foi acompanhada com evolu?ao de gas. Depois da adi?ao ter sido completa, a suspensao cinza resultante foi aquecida ao refluxo. Depois de 3 horas, o aquecimento foi interrompido e a rea?ao foi extinta por adi?ao sob gotejamento de EtOAc (6 mL; exotermica). Agua (5 mL) foi adicionada em pequenas porsoes, seguido por 2N HC1 (2 mL) seguido pelo EtOAc (25 mL). A mistura foi vertida em Na2S04 (ca. 50 g) e a camada organica ligeiramente amarela foi separada a partir da mistura de duas fases. A fase aquosa foi lavada com EtOAc (50 mL) e as fra?oes organicas combinadas foram concentradas sob vacuo para gerar o alcool em bruto (530 mg) como um oleo claro. Heptano (100 mL) foi adicionado e depois concentra?ao sob vacuo o 2- (hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcroman-6-ol (248 mg, 0,85 mmol, 54%, LCMS: 95,5 % puro).

[53] M+ = 293,2

Sintese de SUL 139 (dcido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8- dimetilcroman-2-carbonil)piperazin-l-il)acetico

[54] SUL-137 (440 mg, 1,17 mmol, 1 eq.,) foi dissolvido em MeOH (50 ml) e acido glioxalico (216 mg, 2,35 mmol, 2 eq.) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente e, subsequentemente, NaBH3CN (183 mg, 2,94 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado. A mistura de rea?ao foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Acido acetico (alguns ml) foi adicionado e depois da agita?ao em temperatura ambiente por 0,5 a 1 hora, a mistura de rea?ao foi concentrada. O residuo obtido foi dissolvido em EtOAc, lavado com H20 (2X), seco, filtrado e concentrado para gerar SUL-139 (500 mg, 1,16 mmol, 98%, 91-92 % puro) como um solido amarelo claro.

[55] ^-NMR (CD3OD, em ppm): 1,33 (dd, 12H), 1,59 (s, 3H), 1,62 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 2-5-3,0 (m, 7H), 3,1-3,6 (m, 4H), 3,81 (bs, 2H), 4,28 (bs, 2H). M+ = 433,2.

Sintese de SUL 136 (dcido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil) piperazin-l-il)acetico)

[56] Um frasco de tres gargalos de 250 ml equipado com duas tampas (esquerda e direta) e uma tomeira de passagem foi carregado com SUL-136 (15,5 g, 38,4 mmol) e THF/agua (240 ml THF + 80 ml agua). A solu?ao clara foi agitada e desgaseificada por pelo menos 30 minutos por borbulhamento de argonio, usando um tubo de entrada equipado com uma agulha de seringa longa atraves da tampa esquerda; a tampa direita foi equipada com uma agulha curia e funcionou como saida. A solu?ao desgaseificada (que foi mantida sob argonio) foi resfriada ate 0°C em um banho de gelo e LiOH anidro solido (2,3 g, 96 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado em uma porsao. A mistura de rea?ao resultante foi agitada por 2 horas a 0°C depois do qual esta foi neutralizada por adi?ao de uma suspensao MeOH/agua (3/1, v/v) de resina de troca ionica Dowex-50WX8-200; o pH final foi de aproximadamente 6. A resina Dowex foi filtrada com suc?ao e rinsada com 3 por5oes de MeOH/agua (3/1, v/v). O filtrado foi reduzido em vacuo e o produto umido foi adicionado aproximadamente 100 ml de agua. A suspensao aquosa branca resultante foi liofilizada durante a noite para gerar SUL-136 (13,48 g, 93%. LCMS: 99,6%) como um solido branco.

[57] *H-NMR (CD30D, em ppm)): 1,60 (s, 3H), 1,65 (m, 1H), 2,05 (s, 3H), 2,10 (s, 6H), 2,55 (m, 2H), 2,62 (m, 1H), 3,0, (bs, 4H), 3,40 (bs, 2H), 3,65 (bs, 2H), 4,25 (bs, 2H). M+ = 377,1

Sintese de SUL 144 (dcido (2S)-l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)pirrolidina-2-carboxilico)

[58] (2S)-metil l-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carbonil)pirrolidina-2-carboxilato (diastereoisomero 1, 3,5 g, 9,7 mmol) foi dissolvido em THF/H20 (60/20 mL). N2 foi borbulhado por uma solu?ao por 1 h. A mistura foi resfriada em um banho de gelo e LiOH.H20 (1,01 g, 24,2 mmol, 2,5 eq.) foi adicionado. A mistura de rea?ao foi agitada sob N2 em RT durante a noite. Dowex-50WX8-200 (lavada 4x com MeOH/H20 3:1) foi adicionada como uma suspensao em MeOH/H20 (3:1) ate o pH=6. A mistura foi filtrada, lavada com MeOH/H20 (3:1) e concentrada em vacuo. Demi H20 (50 mL) foi adicionado ao concentrado e a solu?ao foi liofilizada gerando SUL-144 (3,4 g, 9,7 mmol, quant, 99,7% puro) como uma espuma quase branca.

[59] !H-NMR (CDC13): 1,60 (s, 3H), 1,65-2,30 (m, 14H), 2,60 (m, 2H), 2,81 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 4,01 (t, 1H), 4,50 (d, 1H). M+ = 348,1

Exemplo 2 Introdugao

[60] (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-l - il)metanona ou SUL121 demonstrou ser muito eficaz na redu?ao da isquemia e dano de reperfusao no rim do rato. Neste modelo, o fluxo sangulneo ao rim foi interrompido por um periodo estendido no qual, depois, o fluxo sangulneo foi restabelecido. Este modelo e conhecido por fortemente induzir a produ?ao de ROS renal. SUL121 parece ser um indutor de H2S, um composto com diversas a?oes incluindo a inib^ao da cadeia respiratoria, assim, reduzindo a forma?ao de ROS. Um dos mecanismos subjacentes pode ser a indu?ao da enzima CBS produzindo H2S e a expressao aumentada de GDF15.

[61] Dada a sua eficacia no modelo de isquemia e reperfusao renal, foi colocada a hipotese que o composto SUL121 tambem ira proteger o rim em um modelo experimental de diabetes Tipo 2 induzida por obesidade (T2DM). Portanto, foram estudados os efeitos de SUL121 sobre o desenvolvimento de albuminuria e dano renal no modelo de diabetes Tipo 2 do camundongo. Para o estudo, foi empregado o modelo de camundongo db/db. O camundongo db/db nao tern um receptor de leptina e funcional e, portanto, diabetes induzida por obesidade. O diabetes come?a na idade de 6 a 8 semanas de idade e niveis adequados de dano renal e albuminuria pode ser observada na idade de 18 semanas de idade.

[62] Para estudar os efeitos de SUL121 no desenvolvimento de diabetes, o tratamento com SUL121 iniciou a partir da idade de 10 semanas ate a idade 18 de semanas. Alem disso, para estudar os efeitos do SUL121 em animais saudaveis, camundongos de controle foram tratados de modo semelhante. Um grupo de controle nao tratado foi incluido no estudo para servir como controle nao tratado saudavel. A droga e o veiculo foram administrados pela implementa?ao de minibombas osmoticas na idade de 10 e 14 semanas.

Materials e metodos Substancias quimicas e formulagao

[63] DMSO de grau de cultura de celulas foi obtido a partir da Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, the Netherlands). 0,9 % de solu?oes salinas estereis foram de Baxter (Utrecht, Holanda). (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-il)(piperazin-l-il)metanona (SUL121) foi fomecido a partir de Sulfateq BV, Groningen, Holanda, fomecido em uma formula?ao de 500mM em 100% DMSO que corresponde a 177g/l. Minibombas osmoticas (Alzet, EUA) sao resistentes as concentrates de DMSO < 50%. Portanto, a solubilidade de SUL121 foi testada em 50% DMSO em solu?ao salina. SUL121 foi completamente soluvel em 50% DMSO ate uma concentra?ao de 12,6g/l. Bombas Alzet modelo 2004 foram carregadas com 200pi de solu?ao 12,6g/l de SUL121 ou com 200ul da solu?ao 50% DMSO (veiculo). De acordo com as especifica?oes da bomba, 6pi de SUL121 foram administrados por dia, resultando em uma dose diaria de 2,2mg/kg/dia para um camundongo de 35 gramas.

Animais de teste

[64] Camundongos machos db/db (n=16) e animais de controle heterozigotos magros (n=16) foram adquiridos de Harlan UK (cepa JAX000642). Todos os camundongos foram alojados individualmente. Agua e alimentos foram dados ad-libitum. Quatro gmpos de camundongos foram investigados: 1) db/db + veiculo (controle diabetico) 2) db/db + Sull21 (grupo diabetico tratado) 3) wt + veiculo (controle nao diabetico) 4) wt + Sull21 (para estudar apenas o efeito do farmaco)

[65] Farmaco e veiculo foram administrados por implanta?ao de minibombas osmoticas na idade de 10 (t=0) e 14 semanas (t=4). Gaiolas metabolicas e medi?oes de pressao arterial foram realizadas a cada duas semanas. As amostras de sangue nao puderam ser obtidas por perfura?ao no rosto, portanto, o sangue foi coletado a partir do plexo retro orbital na idade de 10 (t=0) e 12 semanas (t=2). Na idade de 18 semanas (t=8) todos os animais foram sacrificados e o sangue foi coletado por punsao cardiaca. Medigdes urindrias

[66] As concentrates da glicose na urina foram medidas pelo metodo da glicose oxidase com um eletrodo especifico a partir de coletas de urina de 24 horas depois de as amostras terem sido armazenadas em -20°C. A concentra?ao da creatinina urinaria foi medida por metodos de laboratorio padroes (metodo de Jaffe sem desproteiniza?ao, DiaSys Diagnostic Systems, Holzheim, Alemanha). Os valores medios das coletas de urina de 24 horas e da proporsao de albumina para a creatinina foram calculados. Alem disso, os niveis de albumina de camundongos em urina foram determinados manualmente usando um kit Elisa de albumina de camundongo (Abeam, Cambridge, Reino Unido). Os niveis de peroxido de hidrogenio urinario foram determinados usando um kit de ensaio Amplex Red H202 (Life technologies, Leusden, Holanda).

Medigao de pressao sanguinea

[67] A pressao sanguinea arterial foi medida em camundongos anestesiados (2% isoflurano) por meio de metodo de punho-cauda (PS-200A; Riken-Kaihatsu; Toquio, Japao). Para cada animal, os valores de pressao arterial representam a media de tres a dez registros obtidos em uma sessao unica.

Histologia

[68] Os rins fixados em paraformaldeido foram usados para colora?ao de a-actina de musculo liso (a-SMA). Se?oes de quatro micrometros foram cortadas, desparafinizadas, hidratadas, e processadas com 1 mmol/EDTA (pH 9,0) para a recupera?ao de antigeno. Todas as etapas foram de acordo com o protocolo do kit Vector MOM. Para avaliar a prefibrose depois da lesao diabetica, as se?oes foram coradas para a -SMA (monoclonal anti- a -actina de musculo liso de camundongo; Sigma Chemical, St. Louis, MO) em dilui?ao 1:100, com diluente MOM certificando colora?ao negativa.

[69] Atividade de peroxidase foi desenvolvida por incuba?ao com AEC (Dako). A expressao de -SMA foi medida usando morfometria assistida por computador. A colora?ao total foi avaliada em uma amplitude de x200. Glomerulos e arterias foram excluidos das medi?oes. A colora?ao a-SMA foi dividida pela area medida e expressa como um percentual. Pelo menos 10 campos corticais foram medidos para se obter um escore medio por animal.

[70] Para avaliar o dano renal depois da lesao diabetica, as se?oes foram coradas para KIM-1, um marcador de dano tubular (policlonal de coelho, Dr. H. van Goor, University Medical Center Groningen). Se?oes de parafina foram desparafinadas e submetidas a uma recupera?ao de antigeno em tampao 0,1 M Tris*HCl, pH 9, por incuba?ao durante a noite a 80°C. Uma tecnica de imunoperoxidase de duas etapas foi usada. Laminas de controle, em que o anticorpo primario foi substituido com PBS, foram consistentemente negativos. Avalia?ao das analises de colora?ao e morfometricas foram realizadas em uma maneira cega. Experimentos de banho de orgao com a aorta isolada Aneis aorticos toracicos recentemente isolados (1,5 a 2 mm em comprimento) foram montados em fios de a?o inoxidavel de 200 pm em banhos miografos individuals (Danish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca). Resumidamente, os banhos contendo 6 ml de solu?ao de Krebs foram aquecidos ate 37°C e previamente equilibrados e continuamente aerados com 95% de O2 a 5% de CO2 para manter o pH em 7,4. O comprimento das tiras aorticas foi avaliado por microscopia. Os aneis aorticos foram equilibrados por 40 min ate que estivessem em uma linha de base de equilibrio. Os aneis foram entao preparados e verificados para a viabilidade por duas estimula?oes consecutivas com KC1 (60 mM) seguido por lavagens e a estabiliza?ao renovada para obter as respostas contrateis reproduziveis.

Protocolo Vascular

[71] As respostas de contra?ao foram medidas como curvas de concentra?ao e resposta cumulativas para fenilefrina (PE; 10 nM a 100 pM) seguido por uma concentra?ao unica de KC1 (90 mM). O relaxamento dependente de endotelio foi avaliado pela obtensao das curvas de concentra?ao e resposta para ACh (10 nM a 300 pM) em aneis previamente contraidos com PE (1 pM) seguido pela estimula?ao com uma elevada concentra?ao do doador de NO nitroprussiato de sodio (SNP; 0,1 mM) para avaliar a dilata?ao maxima independente do endotelio.

[72] Para avaliar o papel do endotelio nos efeitos vasoconstritores, os aneis foram desnuados por remo?ao da camada da celula endotelial esfregando o lado luminal do vaso com um fio umedecido. Para avaliar a contribui?ao de diferentes EDRFs em modular as respostas vasoconstritoras e mediando o relaxamento dependente do endotelio, os inibidores de sintese de PG e NO foram usados. Para esta finalidade, os componentes PG foram avaliados atraves da incuba?ao previa dos aneis (20 minutos) com o inibidor de ciclo-oxigenas indometacina (10 pM). O componente NO foi avaliado por incuba?ao subsequente com ambos o inibidor da sintese de NO NG- monometil-L-arginina (L-NMMA; 1 pM) e indometacina. O relaxamento restante mediado por ACh foi atribuido ao EDHF nao identificado.

Analise morfologica

[73] Se?oes fixadas em formalina de quatro micrometros foram desparafinizadas e coradas para acido periodico de Schiff (PAS) para a quantidade de glomeruloesclerose focal (FGS) e lesao tubular. FGS foi ranqueado de modo semi-quantitativo em urn modo cego atraves da determina?ao do nlvel de expansao mesangial e adesao focal em cada quadrante em um glomerulo e expresso em uma escala de 0 a 4. Se 25% do glomerulo foi afetado, este foi ranqueado como 1, 50% como 2, 75% como 3, e 100% como 4. No total, 50 glomerulos por rim foram analisados, e o escore FGS total foi calculado atraves da multiplica?ao do escore pelo percentual dos glomerulos com o mesmo escore FGS. Assim, o escore FGS total variou de 0 a 200.

[74] As altera?oes histologicas da morfologia tubular foram avaliadas pela avalia?ao de quatro marcadores de dano: necrose tubular, perda da borda em escova, desnuda?ao da membrana basal, e moldes intraluminais. Cada parametro foi graduado em uma escala de 0 a 3, de acordo com a extensao da lesao (0: <5%; 1: 5-25%; 2: 25-75%; e 3: >75%). No total, 30 tubulos por rim foram analisados, e o escore histologico foi calculado. Assim, o escore histologico total variou de 0 a 90.

Processamento de dados

[75] As contra?oes para KC1 e PE sao apresentados em miliNewtons. As respostas de relaxamento ao ACh e SNP sao expressas como percentuais da pre-constrisao com PE. Alem disso, a area sob cada curva individual (AUC; em unidades arbitrarias) foi determinada para relaxamento induzido por ACh (SigmaPlot version 10.0, Software Systat, San Jose, CA). A AUC foi usada para apresentar relaxamento dependente do endotelio e para a analise subsequente das diferen£as em relaxamento mediado por ACh com e sem os inibidores presentes para estimar a contribui?ao dos diferentes EDRFs, ou seja, PGs para a parte sensivel a inib^ao da ciclo-oxigenase com indometacina, NO para a parte sensivel a inib^ao de NOS com L-NMMA, e EDHF por meio de exclusao de PG e NO (34).

Avaliagao estatistica

[76] Os dados sao apresentados como medias ± SE, e n se refere ao numero de animais em cada grupo. A analise estatistica foi feita com SPSS 16.0.2 para Windows (SPSS, Chicago, IL). As diferen£as entre as curvas de concentra?ao total e resposta foram testadas com ANOVA repetitiva; as diferen£as entre os pontos foram testadas com ANOVA de uma via. Os valores P de <0,05 (duas caudas) foram considerados como estatisticamente significativo.

Resultados Dados metabolicos

[77] Os dados metabolicos sao mostrados na figura 1. Como esperado, os camundongos diabeticos tiveram um peso corporal significativamente maior em compara?ao com seus controles magros (figura 1, painel A). Os camundongos diabeticos gradualmente perderam peso desde a semana 4 e posterior. O tratamento com SUL121 nao afetou o peso corporal em qualquer ponto de tempo.

[78] A ingestao de agua e produ?ao de urina (figura 1, painel B e C) estavam intimamente relacionadas e significativamente maiores nos camundongos diabeticos. Na semana 8, os camundongos diabeticos tratados com SUL121 tiveram significativamente menor produ?ao de urina e ingestao de agua do que os diabeticos de controle (urina 23,1 ±2,5 e 11,2 ± 3,8g, ingestao de agua 22,5 ± 2,5 e 10,9 ± 3,9g para o controle diabetico e SUL121 diabeticos, respectivamente). Em todos os outros pontos de tempo, SUL121 nao afetou significativamente a produ?ao de urina e absorsao de agua.

[79] Os niveis de glicose sanguineo sem jejum foram significativamente maiores em db/db diabeticos em compara?ao com os camundongos de controle de tipo selvagem (figura 1, painel D). Durantes o curso do experimento, niveis de glicose em nao jejum nos animais diabeticos aumentaram de 27,5 ± 2,5 e 27,2 ±1,3 (controle diabetico e diabetico tratado com SUL121, respectivamente) para 35,8 ± 2,4 e 35,3 ± l,lmM, indicando um estado diabetico grave e progressive. O tratamento com SUL121 nao afetou os niveis de glicose sanguinea.

[80] Nas semanas 0, 2 e 6, a pressao arterial foi medida (figura 1, painel E). Na semana 0, a pressao arterial media nos animais diabeticos foi maior do que em camundongos tipo selvagem nao diabeticos. O tratamento com SUL121 reduziu a pressao arterial na semana 2 em camundongos tipo selvagem nao diabeticos na semana 2. O tratamento com SUL121 nao afetou a pressao arterial na semana 6. Em camundongos diabeticos, o tratamento com SUL121 nao afetou a pressao arterial.

Efeitos de tratamento com SUL121 no peso do orgao

[81] Depois de 8 semanas de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os pesos dos orgaos foram medidos (figura 2). Nos camundongos diabeticos de controle, ambos os pesos dos rins esquerdo e direito foram significativamente aumentados, indicando hipertrofia renal. O tratamento com SUL121 normalizou os pesos para os valores de diabeticos nao controle.

Efeitos de SUL121 na fungao renal

[82] Para testar se o tratamento com SUL121 poderia reduzir o dano renal, o vazamento de albumina na urina foi medido em todos os pontos de tempo para os animais diabeticos. A excre?ao de albumina total por dia (AER) foi calculada atraves da multiplica?ao da concentra?ao de albumina na urina diariamente (figura 3A). O tratamento com SUL121 preveniu a progressao em AER nos animais diabeticos nas semanas 6 e 8.

[83] AER em diabeticos nao controle foi apenas medido na semana 8 e foi significativamente menor do que para os animais diabeticos (controle nao diabetico: 33,8 ± 5,1 mg/dia, nao diabeticos tratados com SUL121: 31,3 ± 4,6 mg/dia). O tratamento com SUL121 nao afetou AER em animais nao diabeticos.

[84] Alem disso, a proporsao de albumina /creatinina (ACR) foi determinada nas semanas 6 e 8 (figura 3B). Na semana 6, ACR em camundongos diabeticos tratados com SUL121 foi significativamente menor do que nos camundongos diabeticos de controle (1107 ± 130 e 534 ± 79 pg/mg para diabeticos de controle e diabeticos tratados com SUL121, respectivamente). Na semana 8, ACR em animais tratados com SUL121 foi ainda menor do que nos camundongos diabeticos de controle, mas isto nao atingiu significancia estatistica. (1084 ± 156 e 866 ±91 pg/mg para diabeticos de controle e diabeticos tratados com SUL121, respectivamente).

[85] ACR em animais do tipo selvagem na semana 8 foi significativamente menor do que para animais diabeticos e nao foi afetado por tratamento com SUL121 (71 ± 9 e 55 ± 6 pg/mg para controle de tipo selvagem e SUL121 de tipo selvagem tratado, respectivamente).

Efeitos de SUL121 na histologia renal

[86] Como SUL121 teve um efeito profundo na albuminuria, uma colora?ao PAS foi realizada para investigar os efeitos de SUL121 em esclerose glomerular focal (FGS) em todos os animais (figura 4). Como esperado, os escores de FGS foram aumentados em camundongos diabeticos db/db. O tratamento com SUL121 significativamente reduziu os escores FGS em camundongos diabeticos.

Fungao Vascular em diabetes

[87] A libera?ao comprometida de fatores a partir do endotelio (disfun?ao endotelial) e um fenomeno estabelecido no modelo db/db de diabetes. Para estabelecer os efeitos do tratamento de SUL121 na fun?ao endotelial, os aneis aorticos de camundongo foram previamente contraidos com fenileffina (PE) e subsequentemente relaxados com concentrates crescentes de acetilcolina (ACh). As curvas de dose e efeito foram construidas (figura 5A), demonstrando um relaxamento comprometido para ACh em camundongos db/db em compara?ao com os controles (relaxamento maximo de PE 39,2 ± 6,5 e 9,2 ± 1,6% para db/db e controle, respectivamente). No grupo diabetico tratado com SUL121, os relaxamentos foram restaurados para os niveis de controle (11,3 ± 2,3%). Nos nao diabeticos de controle, o tratamento com SUL121 nao afetou os relaxamentos vasculares (9,2 ± 1,6%). Tornados em conjunto, estes dados demonstram que o tratamento com SUL121 foi ainda capaz de prevenir o desenvolvimento da disfun?ao endotelial no modelo db/db de diabetes.

[88] Para ainda investigar os componentes endoteliais envolvidos no relaxamento vascular, as curvas de dose e resposta foram construidas usando inibidores especificos para eNOS (L-NMMA) e ciclo-oxigenase (indometacina) e a contribui?ao relativa de cada componente foi calculada (figura 5B). Nos animais diabeticos, SUL121 melhorou o relaxamento total ao significativamente aumentar EDHF. Alem disso, SUL121 causou um aumento nao significativo (p=0,06) nos componentes NO e prostaglandina.

Efeitos de SUL121 na produgao de ROS em diabetes

[89] A produ?ao aumentada de especies de oxigenio reativas (ROS) e um fenomeno bem estabelecido em diabetes. Para estudar os efeitos de tratamento com SUL121 na produ?ao de ROS, o peroxido de hidrogenio, um metabolito estavel de ROS, foi medido no plasma (figura 6). O tratamento com SUL121 normalizou os niveis de H202 no plasma.

Avaliagao in vitro de protegao mediada por SUL121 em diabetes

[90] Para ainda explorar os mecanismos atraves dos quais SUL121 medeia a prote?ao renal em diabetes, um modelo in vitro de diabetes foi empregado. Para isto, as celulas mesangiais renais de camundongos foram expostas as condi?oes que simulam o diabetes tipo 2 (elevada glicose e insulina). A exposi?ao a elevada glicose/ insulina aumentou os niveis de ROS intracelulares em aproximadamente 70% (figura 7). De modo interessante, este aumento poderia ser substancialmente inibido se as celulas fossem previamente tratadas com SUL121 (p<0,05). O SUL121 isolado nao afetou a produ?ao de ROS intracelular.

Correla?oes

[91] Para determinar se a hipertrofla renal foi relacionada as altera?oes funcionais no rim, uma analise de correla?ao foi realizada entre o peso do rim e a excre?ao de albumina em todos os animais diabeticos combinados (figura 8, painel A), uma correla?ao positiva significativa foi encontrada entre ambos os marcadores (p<0,05). Uma vez que SUL121 normalizou a funsao endotelial em animais diabeticos, os niveis de relaxamento maximos foram correlacionados ao peso do rim (figura 8, painel B) e a excre?ao de albumina (figura 8, painel C). ambas as correla?oes foram significativas (p<0,05).

[92] Uma vez que SUL121 inibiu os niveis H2O2 no plasma, H2O2 ainda estava correlacionado a excre?ao de albumina (figura 8, painel D) e ao peso do rim (figura 8, painel E). Ambas as correla?oes foram significativas (p<0,05). Os niveis de H2O2 no plasma nao se correlacionaram com os niveis maximos de relaxamento para acetilcolina (dados nao mostrados).

Claims (4)

1. Uso de um composto de acordo com a formula (II) ou um sal ou base farmaceuticamente aceitavel do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para a profllaxia ou o tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da fun$ao endotelial e/ou da inibisao da produ?ao das especies de oxigenio reativas, em que o dito dano em orgao e nefropatia diabetica ou doen£a renal diabetica.

2. Uso de 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-l- il)metanona de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizado pelo fato de que o referido orgao e o rim.

3. Uso de um composto de acordo com a formula (I) ou de um sal farmaceuticamente aceitavel do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para a profilaxia ou o tratamento de dano em orgao atraves da restaura?ao da fun?ao endotelial e/ou da inib^ao da produ?ao de especies reativas de oxigenio, em que o dito dano em orgao e nefropatia diabetica ou doen£a renal diabetica; em que R1 representa uma metila ou isopropila; em que R2 representa uma metila ou isopropila em que R3 representa um hidrogenio; n e 1; R4 e C0-N-R5, em que o C=0 esta ligado a fra?ao trolox, em que o peso molecular de R4 e preferencialmente menos que 300 Da, e em que R5 e um grupo alquil, opcionalmente substituldo com nitrogenio e/ou oxigenio, em que o grupo alquil compreende 1 a 12 atomos de carbono, e em que nitrogenio pode ser amina, amina quatemaria, guanidina ou imina, e oxigenio pode ser hidroxil, carbonil ou acido carboxilico, e em que oxigenio e nitrogenio em conjunto podem formar grupos carbamato, ureia, ou amida, em que R5 compreende pelo menos uma estrutura ciclica, em que o composto de acordo com a formula (I) tern um peso molecular inferior a 500 Da.

4. Uso de um composto de acordo com a reivindica?ao 3, caracterizado pelo fato de que o referido orgao e o rim.