BR112016023904B1 - COMPOSITION, FOOD ADDITIVE FOR POULTRY, FOOD FOR POULTRY, ADDITIVE FOR DRINKING WATER FOR POULTRY, DRINKING WATER FOR POULTRY, DISINFECTANT AND DETERGENT - Google Patents

Abstract

NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção se refere a um novo bacteriófago denominado ()CJ24 (KCCM11462P) e a uma composição compreendendo o mesmo como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária em aves através do uso do bacteriófago ()CJ24 (KCCM11462P) ou da composição.NEW BACTERIOPHAGE AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME. The present invention relates to a new bacteriophage called ()CJ24 (KCCM11462P) and a composition comprising it as an active ingredient. Furthermore, the present invention provides a method of preventing and/or treating infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli in birds through the use of bacteriophage ()CJ24 (KCCM11462P) or the composition.

Description

[001] A presente invenção se refere a um novo bacteriófago com uma capacidade específica para matar Escherichia coli patogênica aviária (APEC), uma composição que inclui o mesmo, e um método para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas de aves utilizando o novo bacteriófago ou a composição.[001] The present invention relates to a new bacteriophage with a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli (APEC), a composition including the same, and a method for preventing or treating infectious diseases of birds using the new bacteriophage or the composition.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[002] A Escherichia coli (também denominada E.coli no presente relatório descritivo), é uma bactéria gram-negativa em forma de bastonete, pertencente ao gênero da Escherichia e à família da Enterobacteriaceae, sendo uma das floras normais existentes no intestino de diversos animais, inclusive de mamíferos. A maioria das estirpes de Escherichia coli são não patogênicas e podem causar infecções oportunistas, mas algumas estirpes altamente patogênicas causam diversas doenças intestinais e septicemia em animais, incluindo humanos.[002] Escherichia coli (also called E.coli in this descriptive report), is a gram-negative rod-shaped bacterium, belonging to the genus of Escherichia and the family of Enterobacteriaceae, being one of the normal flora existing in the intestine of several animals, including mammals. Most strains of Escherichia coli are nonpathogenic and can cause opportunistic infections, but some highly pathogenic strains cause various intestinal diseases and septicemia in animals, including humans.

[003] Dentre estas estirpes de Escherichia coli, particularmente a E.coli patogênica aviária (APEC), causa infecção através do trato respiratório das aves, tais como galinhas, gansos, perus, e similares, e sabe-se que ela se infiltra no corpo da ave através da membrana mucosa respiratória. A E.coli patogênica aviária causa doenças principalmente em aves de corte, particularmente doenças respiratórias, causando enormes prejuízos econômicos na indústria aviária.[003] Among these strains of Escherichia coli, particularly avian pathogenic E.coli (APEC), causes infection through the respiratory tract of birds, such as chickens, geese, turkeys, and the like, and is known to infiltrate the bird's body through the respiratory mucous membrane. Avian pathogenic E.coli causes diseases mainly in meat birds, particularly respiratory diseases, causing enormous economic losses in the poultry industry.

[004] Um bacteriófago é um tipo especializado de vírus que previne e inibe o crescimento de uma bactéria infectada com um bacteriófago específico. Como os bacteriófagos apresentam forte especificidade hospedeira se comparados aos antibióticos e, considerando o recente surgimento de bactérias resistentes a antibióticos, além da presença residual de antibióticos em animais, o interesse pelos bacteriófagos tem aumentado.[004] A bacteriophage is a specialized type of virus that prevents and inhibits the growth of bacteria infected with a specific bacteriophage. As bacteriophages have strong host specificity compared to antibiotics and, considering the recent emergence of antibiotic-resistant bacteria, in addition to the residual presence of antibiotics in animals, interest in bacteriophages has increased.

[005] Pesquisas com bacteriófagos têm sido ativamente conduzidas em vários países de todo mundo e, além de pedidos de patentes para bacteriófagos, houve um aumento gradual nos pedidos de aprovação encaminhados ao Food and Drug Administration (FDA) para composições contendo bacteriófagos.[005] Research with bacteriophages has been actively conducted in several countries around the world and, in addition to patent applications for bacteriophages, there has been a gradual increase in approval requests submitted to the Food and Drug Administration (FDA) for compositions containing bacteriophages.

[006] Entretanto, as tecnologias relacionadas com bacteriófagos para prevenir e/ou tratar doenças infecciosas, que são problemas importantes na indústria da avicultura devido à Escherichia coli patogênica aviária, ainda são insuficientes, o que torna necessário desenvolver novos bacteriófagos e tecnologias associadas.[006] However, technologies related to bacteriophages to prevent and/or treat infectious diseases, which are important problems in the poultry industry due to avian pathogenic Escherichia coli, are still insufficient, which makes it necessary to develop new bacteriophages and associated technologies.

DIVULGAÇÃODISCLOSURE PROBLEMA TÉCNICOTECHNICAL PROBLEM

[007] Como resultado da importante investigação destinada a superar o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos, a presença de antibióticos residuais em animais, e a necessidade de prevenir de forma eficaz e tratar doenças infecciosas em aves, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) que possui uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária presente na natureza, causadora de doenças respiratórias em aves de corte.[007] As a result of important research aimed at overcoming the emergence of antibiotic-resistant bacteria, the presence of residual antibiotics in animals, and the need to effectively prevent and treat infectious diseases in birds, the inventors of the present invention have isolated the new bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) which has a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli present in nature, which causes respiratory diseases in meat birds.

[008] Além disso, os inventores da presente invenção identificaram características morfológicas, bioquímicas e genéticas do novo bacteriófago e confirmaram que o bacteriófago tem uma excelente resistência ao ácido, ao calor e à secagem, e desenvolveram antibióticos, desinfetantes, aditivos alimentares, e outras composições usando o bacteriófago, além de uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas em aves, e um método para prevenir ou tratar doenças utilizando a mesma.[008] Furthermore, the inventors of the present invention identified morphological, biochemical and genetic characteristics of the new bacteriophage and confirmed that the bacteriophage has excellent resistance to acid, heat and drying, and developed antibiotics, disinfectants, food additives, and other compositions using the bacteriophage, in addition to a composition for preventing or treating infectious diseases in birds, and a method for preventing or treating diseases using the same.

[009] A presente invenção tem por objetivo proporcionar um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.[009] The present invention aims to provide a new bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) with a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli.

[010] Outro propósito da presente invenção é proporcionar uma composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[010] Another purpose of the present invention is to provide a composition for the prevention and/or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an active ingredient.

[011] Ademais, a presente invenção visa proporcionar antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[011] Furthermore, the present invention aims to provide antibiotics, food additives, additives for drinking water, food, drinking water, disinfectants or detergents containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an active ingredient.

[012] Além disso, a presente invenção visa ainda proporcionar um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, utilizando o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[012] Furthermore, the present invention further aims to provide a method of preventing and/or treating infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli, using the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an ingredient active.

SOLUÇÃO TÉCNICATECHNICAL SOLUTION

[013] De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.[013] According to one of its aspects, the present invention provides a new bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) with a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli.

[014] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[014] According to another aspect, the present invention provides a composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli, containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an active ingredient.

[015] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[015] According to yet another aspect, the present invention provides antibiotics, food additives, additives for drinking water, food, drinking water, disinfectants or detergents containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an active ingredient.

[016] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária, compreendendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo para aves.[016] According to another aspect, the present invention provides a method of preventing or treating infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli, comprising administering the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as a active ingredient for poultry.

EFEITOS VANTAJOSOSADVANTAGEOUS EFFECTS

[017] O bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) de acordo com a presente invenção tem uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.[017] The bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) according to the present invention has a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli.

[018] Além disso, o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) de acordo com a presente invenção apresenta excelente resistência ao ácido, ao calor e à secagem, de tal modo que pode ser usado não apenas como um agente para prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária em vários níveis de temperatura, de pH e de secagem, mas também como antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes, detergentes, e similares, contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.[018] Furthermore, the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) according to the present invention exhibits excellent resistance to acid, heat and drying, such that it can be used not only as an agent to prevent or treat infectious diseases caused by Avian pathogenic Escherichia coli at various temperature, pH and drying levels, but also as antibiotics, food additives, drinking water additives, food, drinking water, disinfectants, detergents, and the like, containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as a active ingredient.

[019] Ademais, a presente invenção proporciona o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou antibióticos incluindo o mesmo como um ingrediente ativo, sendo que estes antibióticos apresentam efeitos específicos contra a Escherichia coli patogênica aviária, quando comparados com os antibióticos disponíveis no estado da técnica, e assim, matam seletivamente as bactérias patogênicas específicas, sem matar as bactérias benéficas, de tal forma que estes antibióticos não induzem resistência aos mesmos, o que resulta na extensão do tempo de vida dos produtos tratados em comparação com os antibióticos disponíveis no estado da técnica.[019] Furthermore, the present invention provides the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) or antibiotics including it as an active ingredient, and these antibiotics have specific effects against avian pathogenic Escherichia coli, when compared to the antibiotics available in the prior art, and thus, they selectively kill specific pathogenic bacteria, without killing beneficial bacteria, in such a way that these antibiotics do not induce resistance to them, which results in extending the shelf life of the treated products compared to antibiotics available in the prior art .

[020] Ademais, a presente invenção permite prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária através da administração do bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo para aves.[020] Furthermore, the present invention makes it possible to prevent or treat infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli through the administration of the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P) as an active ingredient for birds.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF FIGURES

[021] A FIG. 1 é uma imagem obtida de um microscópio de elétrons do novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P), doravante denominado “ΦCJ24”.[021] FIG. 1 is an electron microscope image of the new bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P), hereinafter referred to as “ΦCJ24”.

[022] A FIG. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago ΦCJ24.[022] FIG. 2 shows the result of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) of the new bacteriophage ΦCJ24.

[023] A FIG. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida- dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do novo bacteriófago ΦCJ24.[023] FIG. 3 illustrates the result of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the new bacteriophage ΦCJ24.

[024] A FIG. 4 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago ΦCJ24.[024] FIG. 4 is a graph showing the result of an acid resistance test of the new bacteriophage ΦCJ24.

[025] A FIG. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦCJ24.[025] FIG. 5 is a graph showing the result of a heat resistance test of the new bacteriophage ΦCJ24.

[026] A FIG. 6 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência à secagem do novo bacteriófago ΦCJ24.[026] FIG. 6 is a graph showing the result of a drying resistance test of the new bacteriophage ΦCJ24.

CONFIGURAÇÃO IDEALIDEAL SETUP

[027] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.[027] Next, the present invention will be described in detail. Obvious and easily interpretable considerations by those skilled in the art will be omitted in the present specification.

[028] Uma configuração da presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P), com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária (APEC).[028] One embodiment of the present invention provides a new bacteriophage ΦCJ24 (KCCM11462P), with a specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli (APEC).

[029] A Escherichia coli patogênica aviária se refere à Escherichia coli transmitida pelo trato respiratório das aves, tais como galinhas, gansos, perus, e similares, e pode causar doenças infecciosas em aves, especificamente a colibacilose aviária. Especificamente, a Escherichia coli patogênica aviária se infiltra no corpo das aves através da membrana mucosa do trato respiratório, e causa diversas doenças tais como septicemia, granuloma, saculite aérea, salpingite, artrite, e similares. A Escherichia coli patogênica aviária é um bacilo gram-negativo similar à Escherichia coli comum, apresenta flagelos perítricos com motilidade, além de ser uma bactéria aeróbica ou facultativamente anaeróbica decompositora de lactose ou frutose para a produção de ácido e gás.[029] Avian pathogenic Escherichia coli refers to Escherichia coli transmitted through the respiratory tract of birds, such as chickens, geese, turkeys, and the like, and can cause infectious diseases in birds, specifically avian colibacillosis. Specifically, avian pathogenic Escherichia coli infiltrates the body of birds through the mucous membrane of the respiratory tract, and causes various diseases such as septicemia, granuloma, air sacculitis, salpingitis, arthritis, and the like. Avian pathogenic Escherichia coli is a gram-negative bacillus similar to common Escherichia coli, has peritrical flagella with motility, in addition to being an aerobic or facultatively anaerobic bacterium that decomposes lactose or fructose to produce acid and gas.

[030] A Escherichia coli patogênica aviária cresce bem em meio comum, e é capaz de crescer a uma temperatura situada entre cerca de 7°C e 48°C, sendo que a temperatura ideal de crescimento varia entre cerca de 35°C e 37°C. Especificamente, fatores patogênicos são expressos efetivamente a temperaturas de aproximadamente 42°C, que é uma temperatura próxima do corpo da ave. Além disso, a Escherichia coli patogênica aviária pode crescer em um nível de pH situado entre pH4,5 e pH9,0.[030] Avian pathogenic Escherichia coli grows well in common media, and is capable of growing at a temperature between about 7°C and 48°C, with the ideal growth temperature varying between about 35°C and 37°C. °C. Specifically, pathogenic factors are effectively expressed at temperatures of approximately 42°C, which is close to the bird's body temperature. Furthermore, avian pathogenic Escherichia coli can grow at a pH level between pH4.5 and pH9.0.

[031] Um bacteriófago é um vírus específico de bactéria capaz de infectar bactérias específicas para inibir o crescimento da bactéria, e é um vírus que possui ácido desoxirribonucleico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (RNA) como material genético.[031] A bacteriophage is a bacteria-specific virus capable of infecting specific bacteria to inhibit the growth of bacteria, and is a virus that has single- or double-stranded deoxyribonucleic acid (DNA), or ribonucleic acid (RNA) as genetic material.

[032] Especificamente, o bacteriófago ΦCJ24 de acordo com uma configuração da presente invenção, é um bacteriófago com especificidade para infectar seletivamente a Escherichia coli patogênica aviária, e pertence morfologicamente à Siphoviridae B1, e tem uma estrutura de cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil (ver FIG.1). A homologia entre a sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos é comparada e os resultados são mostrados na Tabela 1. O bacteriófago ΦCJ24 mostra uma resistência estável ao ácido em ambiente de pH 3,5 a pH 11,0 sem perder atividade (FIG. 4) e, em relação à resistência ao calor, o bacteriófago ΦCJ24 mostra declínio da atividade de cerca de 1 log ou menos quando exposto a 50° C ou mais durante 2 horas (FIG.5). Em relação à resistência à secagem, o bacteriófago ΦCJ24 mostra declínio da atividade de cerca de 1 log quando seco a 60° C durante 2 horas (FIG.6). As sequências parciais de nucleotídeos do DNA do bacteriófago ΦCJ24 são apresentadas em SEQ ID NOs: 1 e 2 da listagem de sequências.[032] Specifically, the bacteriophage ΦCJ24 according to an embodiment of the present invention, is a bacteriophage with specificity to selectively infect avian pathogenic Escherichia coli, and morphologically belongs to Siphoviridae B1, and has an icosahedral capsid structure with a long non- contractile (see FIG.1). The homology between the nucleotide sequence of bacteriophage ΦCJ24 and decoded nucleotide sequences of other bacteriophages is compared and the results are shown in Table 1. Bacteriophage ΦCJ24 shows stable acid resistance in pH 3.5 to pH 11.0 environment without losing activity (FIG. 4) and, regarding heat resistance, bacteriophage ΦCJ24 shows decline in activity of about 1 log or less when exposed to 50° C or more for 2 hours (FIG. 5). Regarding resistance to drying, the bacteriophage ΦCJ24 shows a decline in activity of around 1 log when dried at 60° C for 2 hours (FIG.6). The partial nucleotide sequences of the bacteriophage ΦCJ24 DNA are presented in SEQ ID NOs: 1 and 2 of the sequence listing.

[033] O bacteriófago ΦCJ24 é um novo bacteriófago isolado recentemente pelos inventores da presente invenção, e foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) sob o número de acesso KCCM11462P em 25 de outubro de 2013.[033] Bacteriophage ΦCJ24 is a new bacteriophage recently isolated by the inventors of the present invention, and has been deposited at the Korean Microorganism Culture Center (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Republic of Korea ) under accession number KCCM11462P on October 25, 2013.

[034] Em outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.[034] In another embodiment, the present invention provides a composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient.

[035] Como o bacteriófago ΦCJ24 apresenta uma atividade antibacteriana capaz de matar especificamente a Escherichia coli patogênica aviária, o bacteriófago ΦCJ24 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas pela infecção por Escherichia coli patogênica aviária. Como um exemplo de doença infecciosa causada pela Escherichia coli patogênica aviária, podemos citar a colibacilose aviária, mas não se limitando a ela.[035] As the bacteriophage ΦCJ24 has antibacterial activity capable of specifically killing avian pathogenic Escherichia coli, the bacteriophage ΦCJ24 can be used to prevent or treat diseases generated by infection by avian pathogenic Escherichia coli. As an example of an infectious disease caused by avian pathogenic Escherichia coli, we can mention avian colibacillosis, but not limited to it.

[036] O termo “colibacilose aviária” tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma doença que ocorre no trato respiratório das aves devido à infecção por Escherichia coli patogênica, e causa sintomas tais como saculite aérea, perihepatite, peritonite, pericardite, salpingite, onfalite, osteomielite ou septicemia, inibindo assim o crescimento e causando a morte das aves infectadas.[036] The term “avian colibacillosis” as used in this descriptive report, refers to a disease that occurs in the respiratory tract of birds due to infection by pathogenic Escherichia coli, and causes symptoms such as air sacculitis, perihepatitis, peritonitis, pericarditis , salpingitis, omphalitis, osteomyelitis or septicemia, thus inhibiting growth and causing death of infected birds.

[037] O termo "prevenir" ou "prevenção" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações envolvendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em um animal a fim de inibir ou retardar a ocorrência da doença.[037] The term "prevent" or "prevention" as used in this specification refers to all actions involving the administration of the bacteriophage ΦCJ24 and/or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient in an animal in order to inhibit or delay the occurrence of the disease.

[038] O termo "tratar" ou "tratamento" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações envolvendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em um animal, a fim de permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causados pela infecção.[038] The term "treat" or "treatment" as used in this specification, refers to all actions involving the administration of the bacteriophage ΦCJ24 and/or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient in an animal, in order to allow the improvement or relief of the symptoms of the disease caused by the infection.

[039] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração pode conter o bacteriófago ΦCJ24 em uma quantidade de 5x102 pfu/ml a 5x1012 pfu/ml, especificamente 1x106 pfu/ml a 1x1010 pfu/ml.[039] The composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli according to this configuration may contain the bacteriophage ΦCJ24 in an amount of 5x102 pfu/ml to 5x1012 pfu/ml, specifically 1x106 pfu/ml to 1x1010 pfu/ml.

[040] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, pode conter ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, e ser formulada em conjunto com o excipiente, para dessa forma ser fornecida como alimento, medicamento, aditivo alimentar, aditivo para água potável, e similares. O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável", tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a um veículo ou um diluente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica e as propriedades da composição administrada.[040] The composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli according to this configuration, may also contain a pharmaceutically acceptable excipient, and be formulated together with the excipient, so as to be provided as food, medicine, food additive, drinking water additive, and the like. The term "pharmaceutically acceptable excipient", as used in the present specification, refers to a vehicle or a diluent that does not stimulate the living organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered composition.

[041] Não há limitações específicas para o tipo de excipiente utilizável de acordo com esta configuração, de tal sorte que qualquer excipiente pode ser utilizado desde que seja geralmente utilizado na técnica e desde que seja farmaceuticamente aceitável. Exemplos de excipientes podem incluir solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina tamponada, uma solução injetável de albumina, uma solução de dextrose, uma solução de maltodextrina, glicerol, e etanol, sem se limitar a estes. Tais excipientes podem ser utilizados isoladamente ou combinados entre si.[041] There are no specific limitations to the type of excipient usable according to this configuration, such that any excipient can be used as long as it is generally used in the art and as long as it is pharmaceutically acceptable. Examples of excipients may include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, an albumin injectable solution, a dextrose solution, a maltodextrin solution, glycerol, and ethanol, without being limited to these. Such excipients can be used alone or combined with each other.

[042] Além disso, quando necessário, outros aditivos tais como antioxidantes, soluções tampão e/ou citostáticas, podem ser adicionados à composição de acordo com a presente invenção, e diluentes, dispersantes, surfactantes, aglutinantes e/ou lubrificantes também podem ser adicionados à composição de acordo com a presente invenção para produzir formulações injetáveis, tais como solução aquosa, suspensão e emulsão, pílulas, cápsulas, grânulos e comprimidos.[042] Furthermore, when necessary, other additives such as antioxidants, buffer and/or cytostatic solutions can be added to the composition according to the present invention, and diluents, dispersants, surfactants, binders and/or lubricants can also be added to the composition according to the present invention to produce injectable formulations, such as aqueous solution, suspension and emulsion, pills, capsules, granules and tablets.

[043] Não há limitações específicas para o método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças pela Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, de tal sorte que qualquer método geralmente aceito na arte pode ser empregado. Um exemplo do método de administração pode incluir a administração por via oral ou parentérica.[043] There are no specific limitations to the method of administering the composition for the prevention or treatment of diseases by avian pathogenic Escherichia coli according to this configuration, such that any method generally accepted in the art can be employed. An example of the method of administration may include oral or parenteral administration.

[044] Exemplos da formulação para a administração por via oral podem incluir drágeas, pastilhas, comprimidos, suspensões aquosas, suspensões oleosas, pó preparado, grânulos, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes, elixires, e similares.[044] Examples of the formulation for oral administration may include dragees, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups, elixirs, and the like.

[045] A fim de formular a composição de acordo com esta configuração na forma de comprimidos ou cápsulas, a formulação pode conter ainda aglutinantes tais como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina, excipientes tais como fosfato dicálcico, desintegrantes tais como amido de milho e amido de batata doce, e lubrificantes tais como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearil fumarato de sódio e cera de polietilenoglicol. No caso de formulação em cápsulas, a formulação pode conter ainda excipientes líquidos, tais como óleos gordurosos, além dos materiais acima mencionados.[045] In order to formulate the composition according to this configuration in the form of tablets or capsules, the formulation may further contain binders such as lactose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose and gelatin, excipients such as phosphate dicalcium, disintegrants such as corn starch and sweet potato starch, and lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate and polyethylene glycol wax. In the case of a capsule formulation, the formulation may also contain liquid excipients, such as fatty oils, in addition to the materials mentioned above.

[046] Métodos de administração parentérica da composição de acordo com esta configuração podem incluir, por exemplo, injeção intravenosa, administração intraperitoneal, administração intramuscular, administração subcutânea, administração tópica, e um método de aplicação ou pulverização da composição de acordo com a presente invenção sobre a região afetada, mas não se limitando a estes métodos.[046] Methods of parenteral administration of the composition according to this configuration may include, for example, intravenous injection, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, topical administration, and a method of applying or spraying the composition according to the present invention on the affected region, but not limited to these methods.

[047] A fim de formular uma dosagem para a administração parentérica, por exemplo, a composição de acordo com esta configuração pode ser formulada em doses para injeção subcutânea, injeção intravenosa e injeção intramuscular, formulações para supositórios, formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol a fim de permitir a inalação através do sistema respiratório, sem se limitar a estas formulações. A fim de formular a composição para injeção, a composição de acordo com esta configuração pode ser misturada com um estabilizador ou uma solução tampão em água para, dessa forma, preparar uma solução ou uma suspensão e, em seguida, a solução preparada ou a suspensão pode ser formulada em dose individual para ampola ou frasco. No caso de formulação da composição para pulverização, tal como a formulação para aerossol, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em pó seja dispersa.[047] In order to formulate a dosage for parenteral administration, for example, the composition according to this configuration can be formulated in doses for subcutaneous injection, intravenous injection and intramuscular injection, suppository formulations, spray formulations, such as of aerosol in order to allow inhalation through the respiratory system, without being limited to these formulations. In order to formulate the composition for injection, the composition according to this configuration may be mixed with a stabilizer or a buffer solution in water to thereby prepare a solution or a suspension and then the prepared solution or suspension can be formulated in an individual dose for ampoule or vial. In the case of formulating the composition for spraying, such as aerosol formulation, a propellant or the like can be mixed together with an additive so that the condensed composition in water or powder is dispersed.

[048] Quantidades adequadas para aplicar, pulverizar ou administrar a composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, podem ser diferentemente determinadas dependendo de fatores tais como a idade, peso, sexo, grau dos sintomas da doença, tipo de alimentos ingeridos, taxa de excreção, e similares, além de um método de formulação da composição, um método de administração, tempo de administração e/ou via de administração, e podem ser facilmente determinados e prescritos em doses eficazes para o tratamento por um veterinário perito na arte.[048] Amounts suitable for applying, spraying or administering the composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli according to this configuration, may be differently determined depending on factors such as age, weight, sex, degree of the symptoms of the disease, type of food ingested, excretion rate, and the like, in addition to a method of formulating the composition, a method of administration, time of administration and/or route of administration, and can be easily determined and prescribed in doses effective for treatment by a veterinarian skilled in the art.

[049] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.[049] In another embodiment, the present invention provides an antibiotic containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient.

[050] O termo "antibiótico", tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma preparação administrada em animais, incluindo seres humanos, em forma de medicamento, com eficácia para esterilizar bactérias, sendo utilizado como agente antisséptico, germicida e antibacteriano.[050] The term "antibiotic", as used in this specification, refers to a preparation administered to animals, including humans, in the form of a medicine, effective in sterilizing bacteria, being used as an antiseptic, germicidal and antibacterial agent. .

[051] Antibióticos contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, apresentam elevada especificidade para a Escherichia coli patogênica aviária se comparados com os antibióticos convencionais, e por isso matam bactérias patogênicas específicas, mas não as bactérias benéficas, não induzindo resistência ao medicamento e proporcionando um tempo de vida maior dos produtos tratados quando comparados aos antibióticos convencionais.[051] Antibiotics containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient according to this configuration, present high specificity for avian pathogenic Escherichia coli compared to conventional antibiotics, and therefore kill specific pathogenic bacteria, but not beneficial bacteria, not inducing resistance to the medicine and providing a longer shelf life of the treated products when compared to conventional antibiotics.

[052] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um aditivo alimentar para aves e um aditivo para água potável para aves contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.[052] In another embodiment, the present invention provides a feed additive for poultry and a drinking water additive for poultry containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient.

[053] Não há limitações para os tipos de aves que podem ser tratadas com os aditivos alimentares para aves ou com os aditivos para água potável para aves, mas as aves de acordo com esta configuração são particularmente aves de corte.[053] There are no limitations to the types of birds that can be treated with the poultry feed additives or the poultry drinking water additives, but the birds according to this configuration are particularly meat birds.

[054] O termo “aves de corte” tal como empregado no presente relatório descritivo é um nome genérico para os animais pertencentes ao grupo das aves. As aves de corte não estão particularmente limitadas, mas podem incluir pelo menos uma dentre o grupo compreendendo galinhas, gansos, perus, e similares.[054] The term “broiler birds” as used in this specification is a generic name for animals belonging to the group of birds. Meat birds are not particularly limited, but may include at least one of the group comprising chickens, geese, turkeys, and the like.

[055] Aditivos alimentares para aves e aditivos para água potável para aves podem ser utilizados preparando-se separadamente o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo como um aditivo alimentar para aves ou como um aditivo para água potável para aves, e em seguida misturado a um alimento ou água potável, ou de tal forma que o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo seja diretamente adicionada no processo de preparação do alimento ou da água potável.[055] Poultry feed additives and poultry drinking water additives can be used by separately preparing the bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing the same as a poultry feed additive or as a poultry drinking water additive, and then mixing to a food or drinking water, or in such a way that the bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing it is directly added in the process of preparing the food or drinking water.

[056] O bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo usado na forma de aditivos alimentares ou aditivos para água potável de acordo com esta configuração pode ser usada na forma líquida ou seca, por exemplo em forma de pó seco.[056] The bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient used in the form of food additives or drinking water additives according to this configuration can be used in liquid or dry form, for example in dry powder form.

[057] Para ilustrar um exemplo, o bacteriófago ΦCJ24 de acordo com a presente invenção pode ser misturado em forma de pó em quantidades variando de 0,05% por peso (wt%) a 10 wt%, especificamente 0,1 wt% a 2 wt%, com base no peso dos aditivos para alimentares.[057] To illustrate an example, the bacteriophage ΦCJ24 according to the present invention can be mixed in powder form in amounts ranging from 0.05% by weight (wt%) to 10 wt%, specifically 0.1 wt% to 2 wt%, based on the weight of the food additives.

[058] Métodos de secagem para a preparação dos aditivos alimentares ou dos aditivos para água potável sob a forma de pó seco de acordo com esta configuração não apresentam limitações, de maneira que quaisquer métodos comumente utilizados pelos peritos na arte podem ser empregados. Exemplos de métodos de secagem podem incluir secagem com ar, secagem natural, secagem por pulverização, e liofilização, sem se limitar a estes. Estes métodos podem ser utilizados isoladamente ou de forma combinada.[058] Drying methods for preparing food additives or drinking water additives in dry powder form according to this configuration do not present limitations, so that any methods commonly used by those skilled in the art can be employed. Examples of drying methods may include, but are not limited to, air drying, natural drying, spray drying, and freeze drying. These methods can be used alone or in combination.

[059] Os aditivos alimentares ou aditivos para água potável de acordo com esta configuração podem incluir ainda outros microrganismos não patogênicos. Os microrganismos podem ser selecionados dentre um grupo compreendendo Bacillus sp., tal como Bacillus Subtilis, capaz de produzir proteases, lipases e/ou enzimas de conversão de açúcar; uma bactéria de ácido lático tal como Lactobacillus sp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbicas, tal como o estômago bovino, bactérias filamentosas tais como Aspergillus oryzae com capacidade de aumentar o peso de um animal, produção de leite, e digestão de alimentos, e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, e similares. Estes microrganismos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.[059] Food additives or drinking water additives according to this configuration may also include other non-pathogenic microorganisms. The microorganisms can be selected from a group comprising Bacillus sp., such as Bacillus Subtilis, capable of producing proteases, lipases and/or sugar converting enzymes; a lactic acid bacteria such as Lactobacillus sp. with physiological activity and degradation activity for an organic material under anaerobic conditions, such as the bovine stomach, filamentous bacteria such as Aspergillus oryzae with the ability to increase an animal's weight, milk production, and food digestion, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, and the like. These microorganisms can be used alone or in combination.

[060] Os aditivos alimentares ou aditivos para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, podem ainda conter outros aditivos, conforme a necessidade. Exemplos de aditivos apropriados incluem aglutinantes, emulsificantes e conservantes, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nitrogenadas não proteicas, silicatos, soluções tampão, agentes corantes, agentes extratantes, ou oligossacarídeos, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável, e outros suplementos alimentares, e similares. Estes aditivos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.[060] Food additives or drinking water additives containing bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient according to this configuration may also contain other additives, as necessary. Examples of suitable additives include binders, emulsifiers and preservatives, which are added to prevent spoilage of food or water; amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, flavoring agents, non-protein nitrogenous compositions, silicates, buffer solutions, coloring agents, extracting agents, or oligosaccharides, which are added in order to increase the usefulness of food or drinking water, and other food supplements , and the like. These additives can be used alone or in combination.

[061] Os aditivos alimentares de acordo com a presente invenção podem ser adicionados em quantidades de 0,05 a 10 partes por peso, especificamente 0,1 a 2 partes por peso com base em 100 partes por peso dos alimentos. Os aditivos para água potável de acordo com a presente invenção podem ser adicionados em quantidades de 0,0001 a 0,01 partes por peso, especificamente de 0,001 a 0,005 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. Dentro destes parâmetros, os aditivos permitem que a atividade do bacteriófago ΦCJ24 contra a Escherichia coli patogênica aviária seja suficientemente exposta.[061] Food additives according to the present invention can be added in amounts of 0.05 to 10 parts by weight, specifically 0.1 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of the food. Drinking water additives according to the present invention can be added in amounts of 0.0001 to 0.01 parts by weight, specifically 0.001 to 0.005 parts by weight based on 100 parts by weight of drinking water. Within these parameters, the additives allow the activity of the bacteriophage ΦCJ24 against avian pathogenic Escherichia coli to be sufficiently exposed.

[062] Em outra configuração, a presente invenção proporciona alimentos ou água potável preparados através da adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ΦCJ24.[062] In another embodiment, the present invention provides food or drinking water prepared by adding a food or drinking water additive containing bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient, or by directly adding bacteriophage ΦCJ24.

[063] Não há limitação para os alimentos utilizados nesta configuração, de tal sorte que quaisquer alimentos comumente usados na arte podem ser utilizados. Exemplos destes alimentos podem incluir vegetais, grãos, raízes, subprodutos do processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, óleos e gorduras, amidos, resíduos ou subprodutos de grãos e similares, alimentos para animais tais como proteínas, materiais inorgânicos, óleos e gorduras, minerais, proteínas unicelulares, plânctons animais ou alimentos. Estes alimentos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.[063] There is no limitation on the foods used in this configuration, such that any foods commonly used in the art can be used. Examples of these foods may include vegetables, grains, roots, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, grain residues or by-products and the like, animal foods such as proteins, inorganic materials, oils and fats, minerals, single-celled proteins, animal plankton or food. These foods can be used alone or in combination.

[064] A água potável usada nesta configuração não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável comumente aceita na arte pode ser usada.[064] The drinking water used in this configuration has no limitations, such that any drinking water commonly accepted in the art can be used.

[065] De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo. A dosagem do desinfetante ou detergente não apresenta limitações específicas, de tal sorte que a dosagem do desinfetante ou do detergente pode obedecer quaisquer formulações conhecida na arte.[065] According to another embodiment, the present invention provides disinfectants or detergents containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient. The dosage of the disinfectant or detergent does not present specific limitations, such that the dosage of the disinfectant or detergent can comply with any formulations known in the art.

[066] A fim de eliminar a Escherichia coli patogênica aviária, o desinfetante pode ser pulverizado em áreas onde vivem as aves, em locais de abate, em áreas inabitadas, em cozinhas ou em equipamentos de cozinha, sem que sua aplicação seja limitada a estes exemplos.[066] In order to eliminate avian pathogenic Escherichia coli, the disinfectant can be sprayed in areas where birds live, in slaughter sites, in uninhabited areas, in kitchens or on cooking equipment, without its application being limited to these examples.

[067] Os detergentes podem ser utilizados para lavar uma superfície da derme ou partes do corpo das aves expostas ou que podem ser expostas à Escherichia coli patogênica aviária, sem se limitar a estes exemplos.[067] Detergents can be used to wash a surface of the dermis or parts of the body of birds exposed or that may be exposed to avian pathogenic Escherichia coli, without being limited to these examples.

[068] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, utilizando o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.[068] In another embodiment, the present invention provides a method of preventing and/or treating infectious diseases caused by avian pathogenic Escherichia coli, using the bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient.

[069] Especificamente, o método de prevenção ou tratamento de acordo com esta configuração inclui a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em aves expostas ou que podem ser expostas à Escherichia coli patogênica aviária. As quantidades diárias totais adequadas do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição incluindo o mesmo podem ser determinadas por um médico de acordo com sua avaliação, como seria de fácil compreensão aos peritos na arte.[069] Specifically, the method of prevention or treatment according to this embodiment includes administering a pharmaceutically effective amount of the bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient to birds exposed or that may be exposed to avian pathogenic Escherichia coli . Suitable total daily amounts of bacteriophage ΦCJ24 or the composition including the same can be determined by a physician in accordance with his assessment, as would be readily understood by those skilled in the art.

[070] Uma dose específica farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo para determinadas aves pode ser determinada considerando-se o tipo e o grau de resposta desejada, a idade, peso, estado geral de saúde, sexo ou dieta dos indivíduos, o tempo de administração e a via de administração do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o mesmo, e a taxa de secreção da composição, o período de duração do tratamento, ou fatores similares, de tal sorte que a dosagem farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores bem conhecidos no campo da medicina, incluindo os ingredientes dos medicamentos a serem usados simultaneamente ou em diferentes ocasiões.[070] A specific pharmaceutically effective dose of bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient for certain birds can be determined considering the type and degree of response desired, age, weight, general health, sex or diet of the subjects, the time of administration and route of administration of the ΦCJ24 bacteriophage or the composition containing the same, and the secretion rate of the composition, the period of duration of treatment, or similar factors, such that the pharmaceutical dosage effectiveness can be changed according to several factors well known in the field of medicine, including the ingredients of the medicines to be used simultaneously or on different occasions.

[071] O bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo pode ser administrado na forma de preparação farmacêutica aplicada como spray nasal em aves ou adicionada diretamente em um alimento das aves ou na água potável que será ingerida pelos animais, podendo ser misturada em um alimento ou na água potável sob a forma de aditivo alimentar ou aditivo para água potável, e então administrada aos animais.[071] The bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing the bacteriophage ΦCJ24 as an active ingredient can be administered in the form of a pharmaceutical preparation applied as a nasal spray to birds or added directly to bird food or drinking water that will be ingested by the animals, which can be mixed into food or drinking water in the form of a food additive or drinking water additive, and then administered to animals.

[072] A via de administração e o método de administração do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo não são especificamente limitadas, de tal forma que qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado. Isto é, o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo pode ser administrada através de várias vias, oral ou parentérica. Como exemplos não restritivos das vias de administração, é possível utilizar a via oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação.[072] The route of administration and the method of administration of the ΦCJ24 bacteriophage or the composition containing the ΦCJ24 bacteriophage as an active ingredient are not specifically limited, such that any route of administration and method of administration can be used, as long as the bacteriophage ΦCJ24 or the composition containing it can reach the desired tissue. That is, the ΦCJ24 bacteriophage or the composition containing the ΦCJ24 bacteriophage as an active ingredient can be administered via various routes, oral or parenteral. As non-restrictive examples of routes of administration, it is possible to use oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutaneous and nasal administration or inhalation.

[073] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. No entanto, os referidos exemplos visam apenas ilustrar a presente invenção sem o propósito de limitar o escopo da presente invenção aos exemplos apresentados.[073] Next, the present invention will be described in detail through examples. However, said examples only aim to illustrate the present invention without the purpose of limiting the scope of the present invention to the examples presented.

[074] [Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago que infecta a Escherichia coli patogênica aviária[074] [Example 1] Isolation of bacteriophage that infects avian pathogenic Escherichia coli

[075] <Exemplos 1-1>[075] <Examples 1-1>

[076] Seleção do bacteriófago e isolamento de um único bacteriófago[076] Bacteriophage selection and isolation of a single bacteriophage

[077] Foi obtida uma amostra de 50ml de fezes de galinha colhida próximo a uma granja em Chengwon-gun, na província de Chungcheong, República da Coréia, e a amostra foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45μm para preparar uma solução de amostra, e depois um método de sobreposição de ágar macio foi realizado utilizando a solução de amostra preparada. O método de sobreposição de ágar macio é um método de observação da ação de lise do bacteriófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre um meio sólido com 0,7% de ágar).[077] A 50ml sample of chicken feces collected near a poultry farm in Chengwon-gun, Chungcheong Province, Republic of Korea, was obtained and the sample was centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was filtered with a 0.45μm filter to prepare a sample solution, and then a soft agar overlay method was performed using the prepared sample solution. The soft agar overlay method is a method of observing the lysis action of bacteriophage using host cells growing on surface agar (on a solid medium with 0.7% agar).

[078] Especificamente, 150 μl de uma solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) obtida pelo Departamento de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk e 2ml de meio 10*LB “Luria Bertani” (10 g/l de triptofano; 5 g/l de extrato de levedura e 10 g/l de NaCl) foram misturados com 18ml de amostra filtrada e cultivada a 30°C por 18 horas. Em seguida a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45 μm. Em seguida, uma mistura de 3ml de ágar a 0,7% (w/v) e 150 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) foram vertidas e endurecidas numa placa com meio LB, à qual foram adicionados 10 μl da solução de amostra, seguida de cultura a 30C por 18 horas, resultando na formação de placas.[078] Specifically, 150 μl of a stirred culture solution (OD600 = 2) of avian pathogenic Escherichia coli (E10-4) obtained by the Department of Veterinary Medicine at Konkuk University and 2ml of 10*LB “Luria Bertani” medium ( 10 g/l of tryptophan; 5 g/l of yeast extract and 10 g/l of NaCl) were mixed with 18 ml of filtered sample and cultivated at 30°C for 18 hours. Then the culture solution was centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes and the supernatant was filtered with a 0.45 μm filter. Then, a mixture of 3 ml of 0.7% (w/v) agar and 150 μl of the stirred culture solution (OD600 = 2) of avian pathogenic Escherichia coli (E10-4) were poured and hardened on a plate with medium. LB, to which 10 μl of the sample solution was added, followed by culture at 30C for 18 hours, resulting in the formation of plaques.

[079] Considerando que um tipo de bacteriófago estava presente em cada placa, os inventores tentaram isolar bacteriófagos específicos a partir das placas formadas. Especificamente, 400 μl de solução SM [5,8 g/l de NaCl; 2 g/l de MgSO47H2O; 50 ml de 1M Tris-HCl (pH 7,5)] foi adicionada às placas e deixada em temperatura ambiente durante 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.[079] Considering that a type of bacteriophage was present in each plaque, the inventors attempted to isolate specific bacteriophages from the plaques formed. Specifically, 400 μl of SM solution [5.8 g/l NaCl; 2 g/l of MgSO47H2O; 50 ml of 1M Tris-HCl (pH 7.5)] was added to the plates and left at room temperature for 4 hours, thus obtaining the bacteriophage solution.

[080] Em seguida, 100 μl da solução do bacteriófago foi misturada com 12 ml de 0,7% (w/v) de ágar e 500 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4), que foi usada para executar o método de sobreposição em ágar macio usando um meio LB em placa com um diâmetro de 150 mm onde a cultura foi realizada até que o bacteriófago fosse completamente lisado. Após o término da cultura, 15ml da solução SM foram adicionados ao meio LB e deixados em temperatura ambiente por um período de 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.[080] Then, 100 μl of the bacteriophage solution was mixed with 12 ml of 0.7% (w/v) agar and 500 μl of the stirred culture solution (OD600 = 2) of avian pathogenic Escherichia coli (E10- 4), which was used to perform the soft agar overlay method using LB medium in a plate with a diameter of 150 mm where culture was carried out until the bacteriophage was completely lysed. After the end of the culture, 15ml of the SM solution was added to the LB medium and left at room temperature for a period of 4 hours, thus obtaining the bacteriophage solution.

[081] À solução obtida, foi adicionado 1% (v/v) de clorofórmio e a solução foi misturada durante 10 minutos, seguida por centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante obtido foi filtrado com um filtro de 0,45 μm, obtendo assim uma amostra final.[081] To the obtained solution, 1% (v/v) chloroform was added and the solution was mixed for 10 minutes, followed by centrifugation at 4,000 rpm for 10 minutes, thus obtaining the supernatant. The supernatant obtained was filtered with a 0.45 μm filter, thus obtaining a final sample.

[082] <Exemplos 1-2>[082] <Examples 1-2>

[083] Cultura em grande escala e purificação do bacteriófago[083] Large-scale culture and purification of bacteriophage

[084] O bacteriófago obtido no Exemplo 1-1 foi cultivado em grande escala utilizando Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) e, em seguida, o bacteriófago foi purificado.[084] The bacteriophage obtained in Example 1-1 was cultivated on a large scale using avian pathogenic Escherichia coli (E10-4) and then the bacteriophage was purified.

[085] Especificamente, a Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) foi agitada e inoculada a 1,0*1010 cfu, centrifugada a 4.000 rpm durante 10 minutos, e em seguida ressuspensa em 4ml de solução SM. A esta solução foi adicionado o bacteriófago a 1,0x106 pfu com multiplicidade de infecção (MOI) = 0,0001, e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos.[085] Specifically, avian pathogenic Escherichia coli (E10-4) was shaken and inoculated at 1.0*1010 cfu, centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes, and then resuspended in 4ml of SM solution. To this solution, bacteriophage was added at 1.0x106 pfu with multiplicity of infection (MOI) = 0.0001, and then left at room temperature for 20 minutes.

[086] Em seguida, 150ml de meio LB foi inoculado e a solução foi cultivada a 30°C durante 6 horas. Após a conclusão da cultura, foi adicionado clorofórmio a um volume de 1% (v/v) do volume final, e o material mexido durante 20 minutos, ao qual foram adicionadas enzimas de restrição DNase I e RNase A para obter uma concentração final de 1 μg/ml, respectivamente, e a solução foi deixada a 30°C durante 30 minutos. A seguir, foram adicionados cloreto de sódio e glicol polietileno a uma concentração final de 1M e 10% (w/v), respectivamente, e em seguida a solução foi deixada a 4°C durante 3 horas, seguida de centrifugação a 4°C e 12.000 rpm por um período de 20 minutos, obtendo assim um precipitado.[086] Then, 150ml of LB medium was inoculated and the solution was cultivated at 30°C for 6 hours. After completion of the culture, chloroform was added to a volume of 1% (v/v) of the final volume, and the material stirred for 20 minutes, to which restriction enzymes DNase I and RNase A were added to obtain a final concentration of 1 μg/ml, respectively, and the solution was left at 30°C for 30 minutes. Next, sodium chloride and polyethylene glycol were added to a final concentration of 1M and 10% (w/v), respectively, and then the solution was left at 4°C for 3 hours, followed by centrifugation at 4°C. and 12,000 rpm for a period of 20 minutes, thus obtaining a precipitate.

[087] O precipitado obtido foi suspenso em 5ml da solução SM e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos, sendo adicionado 4ml de clorofórmio e a solução mexida, seguida de centrifugação a 4°C e 4.000 rpm durante 20 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45 μm, e seguido de ultracentrifugação (35.000 rpm, 1 hora, 4 °C) através do método de gradiente de densidade em glicerol (densidade: 40%, 5% de glicerol), purificando assim o bacteriófago.[087] The precipitate obtained was suspended in 5ml of the SM solution and then left at room temperature for 20 minutes, 4ml of chloroform was added and the solution stirred, followed by centrifugation at 4°C and 4,000 rpm for 20 minutes, thus obtaining the supernatant. The supernatant was filtered with a 0.45 μm filter, and followed by ultracentrifugation (35,000 rpm, 1 hour, 4 °C) using the glycerol density gradient method (density: 40%, 5% glycerol), purifying thus the bacteriophage.

[088] Os inventores da presente invenção isolaram um bacteriófago obtido através da amostra de fezes de galinha colhidas em fazendas com capacidade específica para matar Escherichia coli patogênica aviária, que foi denominado "Bacteriófago ΦCJ24", e depositaram o bacteriófago no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) como o número de acesso KCCM11462P em 25 de outubro de 2013.[088] The inventors of the present invention isolated a bacteriophage obtained from the sample of chicken feces collected from farms with specific ability to kill avian pathogenic Escherichia coli, which was named "Bacteriophage ΦCJ24", and deposited the bacteriophage at the Korean Food Culture Center Microorganisms (KCCM) (361221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Republic of Korea) as accession number KCCM11462P on October 25, 2013.

[089] <Exemplo 2>[089] <Example 2>

[090] Exame morfológico do ΦCJ24[090] Morphological examination of ΦCJ24

[091] O bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1 foi diluído em 0,01% de solução de gelatina e em seguida fixado com 2,5% de solução de glutaraldeído. O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm), aclimatado por 10 minutos e em seguida lavado com água destilada estéril.[091] The ΦCJ24 bacteriophage purified in Example 1 was diluted in 0.01% gelatin solution and then fixed with 2.5% glutaraldehyde solution. The fixed bacteriophage was poured onto a carbon-coated mica plate (about 2.5 mm × 2.5 mm), acclimated for 10 minutes, and then washed with sterile distilled water.

[092] Em seguida, uma película de carbono foi disposta sobre uma grelha de cobre, tingida com 4% de acetato de uranilo por 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-1011, 80 kV, ampliação: x200.000) (FIG.1).[092] Next, a carbon film was placed on a copper grid, dyed with 4% uranyl acetate for 60 seconds, dried, and observed through an electron transmission microscope (JEM-1011, 80 kV, magnification: x200,000) (FIG.1).

[093] A FIG. 1 mostra uma imagem do bacteriófago ΦCJ24 feita pelo microscópio de elétrons, onde o bacteriófago ΦCJ24 apresenta características morfológicas de uma cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil, indicando que o bacteriófago ΦCJ24 pertence ao morfotipo Siphoviridae B1.[093] FIG. 1 shows an image of the bacteriophage ΦCJ24 made by electron microscope, where the bacteriophage ΦCJ24 presents morphological characteristics of an icosahedral capsid with a long non-contractile tail, indicating that the bacteriophage ΦCJ24 belongs to the Siphoviridae B1 morphotype.

[094] <Exemplo 3>[094] <Example 3>

[095] A análise do tamanho total do DNA genômico do ΦCJ24[095] Analysis of the total size of ΦCJ24 genomic DNA

[096] O DNA genômico foi extraído do bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1.[096] Genomic DNA was extracted from the bacteriophage ΦCJ24 purified in Example 1.

[097] Especificamente, 20mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 μg/ml de proteinase K e 0,5% (w/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução da cultura do bacteriófago ΦCJ24 purificado e foi deixada a 50°C durante 1 hora, à qual foi adicionada e mexida uma quantidade de fenol (pH 8,0) seguida de centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante.[097] Specifically, 20mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 50 μg/ml proteinase K and 0.5% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) were added to a culture solution of the purified ΦCJ24 bacteriophage and was left at 50°C for 1 hour, to which a quantity of phenol (pH 8.0) was added and stirred, followed by centrifugation at room temperature and 12,000 rpm for 10 minutes, thus obtaining a supernatant.

[098] O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de PC (fenol: clorofórmio = 1: 1) e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de clorofórmio e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi misturado com 10% (v/v) de acetato de sódio 3M com base no volume total, seguido da adição de 2 volumes de etanol frio a 95%, mexido, e deixado a -20C durante 1 hora.[098] The supernatant was mixed with an equal amount of PC (phenol: chloroform = 1: 1) and centrifuged at room temperature and 12,000 rpm for 10 minutes, thus obtaining a supernatant. The supernatant was mixed with an equal amount of chloroform and centrifuged at room temperature and 12,000 rpm for 10 minutes, thus obtaining a supernatant. The obtained supernatant was mixed with 10% (v/v) 3M sodium acetate based on the total volume, followed by the addition of 2 volumes of cold 95% ethanol, stirred, and left at -20C for 1 hour.

[099] Em seguida, a substância resultante foi centrifugada a 0C e 12.000 rpm por 10 minutos, da qual o sobrenadante foi removido para a obtenção do precipitado, que foi dissolvido em 50 μl de Tris-EDTA (TE) solução tampão (pH 8,0). O DNA extraído foi diluído 10 vezes, e então a concentração de DNA foi determinada medindo-se a absorção em OD260.[099] Then, the resulting substance was centrifuged at 0C and 12,000 rpm for 10 minutes, from which the supernatant was removed to obtain the precipitate, which was dissolved in 50 μl of Tris-EDTA (TE) buffer solution (pH 8 ,0). The extracted DNA was diluted 10 times, and then the DNA concentration was determined by measuring the absorbance at OD260.

[100] Em seguida, 1 μg de DNA foi carregado em 1% de PFGE (eletroforese em gel de campo pulsado) em gel de agarose, e desenvolvido com o uso de BIORAD PFGE SYSTEM N° 7 (tamanho variando entre 25 kb a 100 kb; comutador tempo de rampa 0,4 segundos para 2,0 segundos, forma linear; tensão 180 V; tensão inversa 120 V) em temperatura ambiente durante 20 horas (FIG 2).[100] Next, 1 μg of DNA was loaded into 1% PFGE (pulsed field gel electrophoresis) agarose gel, and developed using BIORAD PFGE SYSTEM No. 7 (size ranging from 25 kb to 100 kb; ramp time switch 0.4 seconds to 2.0 seconds, linear form; voltage 180 V; inverse voltage 120 V) at room temperature for 20 hours (FIG 2).

[101] A FIG. 2 é uma fotografia da eletroforese em gel do DNA genômico do bacteriófago ΦCJ24, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do bacteriófago ΦCJ24 tem um tamanho de cerca de 53kbp.[101] FIG. 2 is a photograph of gel electrophoresis of the genomic DNA of bacteriophage ΦCJ24, where it can be confirmed that the genomic DNA of bacteriophage ΦCJ24 has a size of about 53kbp.

[102] <Exemplo 4>[102] <Example 4>

[103] Análise do padrão da proteína do ΦCJ24[103] ΦCJ24 protein pattern analysis

[104] 15 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 purificado (título 1011 pfu/ml) foi misturada com 3 μl de uma solução de amostra 5* SDS, e aquecida durante 5 minutos para obter 12% de SDS-PAGE (FIG. 3).[104] 15 μl of the purified ΦCJ24 bacteriophage solution (titer 1011 pfu/ml) was mixed with 3 μl of a 5* SDS sample solution, and heated for 5 minutes to obtain 12% SDS-PAGE (FIG. 3) .

[105] A FIG. 3 é uma fotografia da eletroforese mostrando o resultado da SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦCJ24, onde proteínas principais com tamanhos de cerca de 10,3kDa, cerca de 12,5kDa e cerca de 15,1kDa, cerca de 43kDa, cerca de 49,3kDa, cerca de 60,4kDa e cerca de 94,9kDa foram observadas.[105] FIG. 3 is a photograph of electrophoresis showing the result of SDS-PAGE performed on bacteriophage ΦCJ24, where major proteins with sizes of about 10.3kDa, about 12.5kDa and about 15.1kDa, about 43kDa, about 49, 3kDa, about 60.4kDa and about 94.9kDa were observed.

[106] <Exemplo 5>[106] <Example 5>

[107] Análise das propriedades genéticas do ΦCJ24[107] Analysis of the genetic properties of ΦCJ24

[108] A fim de confirmar as propriedades genéticas do bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1, o DNA do bacteriófago ΦCJ24 foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise de gene. Genes foram recombinados utilizando GS e o software (Roche) da Macrogen INC. A análise da sequência do quadro aberto de leitura foi feita com GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 e software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi feita com BLASTP e InterProScan.[108] In order to confirm the genetic properties of the ΦCJ24 bacteriophage purified in Example 1, the DNA of the ΦCJ24 bacteriophage was analyzed using a FLX titanium sequencer (Roche), which is a gene analysis device. Genes were recombined using GS and software (Roche) from Macrogen INC. Open reading frame sequence analysis was performed with GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02, and FGENESB software. Open reading frame identification was done with BLASTP and InterProScan.

[109] A sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 apresentou semelhanças com a sequência nucleotídica dos bacteriófagos previamente reportados (fago de Escherichia phiEB49, fago de Escherichia KBN21), mas foi confirmado que não há nenhum outro bacteriófago com 100% de coincidência dos fragmentos. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago de acordo com a presente invenção foi isolado.[109] The nucleotide sequence of bacteriophage ΦCJ24 showed similarities with the nucleotide sequence of previously reported bacteriophages (Escherichia phage phiEB49, Escherichia phage KBN21), but it was confirmed that there is no other bacteriophage with 100% fragment coincidence. In this way, it was confirmed that a new bacteriophage according to the present invention has been isolated.

[110] A Tabela 1 representada abaixo mostra os resultados obtidos pela comparação da sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos conhecidos no estado da técnica.[110] Table 1 represented below shows the results obtained by comparing the nucleotide sequence of bacteriophage ΦCJ24 and nucleotide sequences decoded from other bacteriophages known in the art.

[111] [Tabela 1] Pergunta Assunto Pontuação Identidades [111] [Table 1] Question Subject Score Identities

[112] O DNA do bacteriófago ΦCJ24 preparado foi analisado utilizando um sequenciador de DNA e a sequência total de nucleotídeos é apresentada na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO:2.[112] The prepared bacteriophage ΦCJ24 DNA was analyzed using a DNA sequencer and the total nucleotide sequence is presented in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

[113] <Exemplo 6>[113] <Example 6>

[114] Estabilidade do pH do ΦCJ24[114] pH stability of ΦCJ24

[115] A fim de confirmar a estabilidade do bacteriófago ΦCJ24 em um ambiente de baixo pH no estômago, foi realizado o teste de estabilidade do bacteriófago ΦCJ24 sobre uma larga gama de pH (pH 2,5 / 3,0 / 3,5 / 4,0 / 5,5/ 6,5 / 7,0 / 8,0 / 9,0 / 10,0 e 11,0).[115] In order to confirm the stability of bacteriophage ΦCJ24 in a low pH environment in the stomach, the stability test of bacteriophage ΦCJ24 was carried out over a wide range of pH (pH 2.5 / 3.0 / 3.5 / 4.0 / 5.5/ 6.5 / 7.0 / 8.0 / 9.0 / 10.0 and 11.0).

[116] Para o teste, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH 4,0, pH4,5, pH5,0 e pH5,5), solução tampão de citrato de sódio (pH 2,5, pH3,0 e pH3,5), solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,0 e pH 7,0), e uma solução de Tris-HCl (pH 8,0, pH 9,0, pH 10,0 e pH11,0)] foram preparadas numa concentração de 0,2 M.[116] For the test, various pH solutions [sodium acetate buffer solution (pH 4.0, pH4.5, pH5.0 and pH5.5), sodium citrate buffer solution (pH 2.5, pH3 .0 and pH3.5), sodium phosphate buffer solution (pH 6.0 and pH 7.0), and Tris-HCl solution (pH 8.0, pH 9.0, pH 10.0 and pH11 ,0)] were prepared at a concentration of 0.2 M.

[117] 180 μl de cada uma das soluções de pH foram misturados com 20 μl de solução do bacteriófago com um título de 2,0x1o11 pfu/ml de modo a permitir que cada solução de pH tivesse uma concentração de 0,2 M, e então a solução resultante foi deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Para um grupo de controle, 20 μl da solução do bacteriófago com um título de 2,0x1011 pfu/ml foi misturada com 180 μl da solução SM pelo mesmo método e deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, as soluções foram diluídas em série, e 10 μl de cada solução em cada etapa da diluição foram cultivadas a 30°C durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (FIG. 4).[117] 180 μl of each of the pH solutions was mixed with 20 μl of bacteriophage solution with a titer of 2.0x1011 pfu/ml to allow each pH solution to have a concentration of 0.2 M, and then the resulting solution was left at room temperature for 2 hours. For a control group, 20 μl of the bacteriophage solution with a titer of 2.0x1011 pfu/ml was mixed with 180 μl of the SM solution by the same method and left at room temperature for 2 hours. Then, the solutions were serially diluted, and 10 μl of each solution in each dilution step were cultivated at 30°C for 18 hours using the soft agar overlay method to determine the bacteriophage titer, when subjected or not to the lysis process (FIG. 4).

[118] A FIG. 4 mostra os resultados experimentais da resistência do bacteriófago ΦCJ24 a ácidos. Conforme ilustrado na FIG. 4, foi confirmado que o bacteriófago ΦCJ24 não perdeu sua atividade e permaneceu estável em um ambiente de pH de 3,5 a 11,0 quando comparado ao grupo de controle.[118] FIG. 4 shows the experimental results of the resistance of bacteriophage ΦCJ24 to acids. As illustrated in FIG. 4, it was confirmed that the bacteriophage ΦCJ24 did not lose its activity and remained stable in a pH environment of 3.5 to 11.0 when compared to the control group.

[119] <Exemplo 7>[119] <Example 7>

[120] Estabilidade e resistência do ΦCJ24 ao calor[120] Stability and heat resistance of ΦCJ24

[121] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade e resistência do bacteriófago ao calor durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de se usar o bacteriófago na formulação de aditivos alimentares, dentre outras formulações de bacteriófagos.[121] Tests were carried out to confirm the stability and resistance of the bacteriophage to heat during the bacteriophage formulation process in the case of using the bacteriophage in the formulation of food additives, among other bacteriophage formulations.

[122] Especificamente, 100 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com uma concentração de 1,65x1011 pfu/ml foi deixada a 37°C, 45°C, 53°C e 60°C durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, respectivamente. Então, as soluções acima foram diluídas em série, e 10 μl de cada uma das soluções foram diluídas em cada etapa e cultivadas a 30°C durante um período de 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (FIG. 5).[122] Specifically, 100 μl of bacteriophage ΦCJ24 solution with a concentration of 1.65x1011 pfu/ml was left at 37°C, 45°C, 53°C and 60°C for 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes respectively. Then, the above solutions were serially diluted, and 10 μl of each of the solutions were diluted at each step and cultured at 30°C for a period of 18 hours via the soft agar overlay method to determine the bacteriophage titer, when subjected or not to the lysis process (FIG. 5).

[123] A FIG. 5 mostra o resultado de um teste de resistência ao calor do bacteriófago ΦCJ24. Conforme ilustrado na FIG. 5, o bacteriófago ΦCJ24 teve sua atividade reduzida em cerca de 1 log ou menos quando exposto a 53°C por 120 minutos, e teve sua atividade reduzida com o passar do tempo quando exposto a 60°C.[123] FIG. 5 shows the result of a heat resistance test of bacteriophage ΦCJ24. As illustrated in FIG. 5, bacteriophage ΦCJ24 had its activity reduced by about 1 log or less when exposed to 53°C for 120 minutes, and its activity reduced over time when exposed to 60°C.

[124] <Exemplo 8>[124] <Example 8>

[125] Estabilidade do ΦCJ24 à secagem[125] Drying stability of ΦCJ24

[126] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade do bacteriófago sob condições de secagem durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de usar o bacteriófago como uma formulação de aditivo alimentar, dentre outras formulações do bacteriófago.[126] Tests were carried out to confirm the stability of the bacteriophage under drying conditions during the bacteriophage formulation process in the case of using the bacteriophage as a food additive formulation, among other bacteriophage formulations.

[127] Baseado nos resultados do teste de resistência ao calor, o teste de secagem foi realizado usando um concentrador SpeedVac. Assim, 200 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com um título de 2,5*1010 pfu/ml foi seca a 60°C em condições de vácuo durante um período de 2 horas, e os sedimentos resultantes foram introduzidos em 200 μl de solução SM que a seguir foi completamente ressuspensa a 4°C por um dia, e então os títulos foram medidos (FIG.6).[127] Based on the results of the heat resistance test, the drying test was performed using a SpeedVac concentrator. Thus, 200 μl of bacteriophage ΦCJ24 solution with a titer of 2.5*1010 pfu/ml was dried at 60°C under vacuum conditions for a period of 2 hours, and the resulting pellets were introduced into 200 μl of SM solution. which was then completely resuspended at 4°C for one day, and then the titers were measured (FIG.6).

[128] Conforme ilustrado na FIG. 6, o bacteriófago ΦCJ24 teve sua atividade reduzida em cerca de 1 log após ser seco a 60°C por 2 horas, quando comparado aos títulos iniciais e à estabilidade relativa.[128] As illustrated in FIG. 6, the bacteriophage ΦCJ24 had its activity reduced by approximately 1 log after being dried at 60°C for 2 hours, when compared to the initial titers and relative stability.

[129] <Exemplo 9>[129] <Example 9>

[130] Exame de espectro de infecção do bacteriófago ΦCJ24 em estirpe isolada do tipo selvagem de Escherichia coli patogênica aviária[130] Examination of infection spectrum of bacteriophage ΦCJ24 in isolated wild-type strain of avian pathogenic Escherichia coli

[131] A atividade lítica do bacteriófago ΦCJ24 foi testada para 46 estirpes selvagens de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Escola de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk (KU), 10 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Agência de Quarentena de Plantas e Animais da Coréia (KAPQA), 7 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Escola de Medicina Veterinária da Universidade Nacional de Chonbuk (CNU), e 26 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária com diagnóstico de doença isoladas pela Fazenda Komipharm (KF), além da Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) usada no presente experimento.[131] The lytic activity of bacteriophage ΦCJ24 was tested for 46 wild-type strains of avian pathogenic Escherichia coli isolated by the Konkuk University (KU) School of Veterinary Medicine, 10 strains of avian pathogenic Escherichia coli isolated by the Plant and Animal Quarantine Agency of Korea (KAPQA), 7 strains of avian pathogenic Escherichia coli isolated by Chonbuk National University (CNU) School of Veterinary Medicine, and 26 disease-diagnosed strains of avian pathogenic Escherichia coli isolated by Komipharm Farm (KF), in addition to Avian pathogenic Escherichia coli (E10-4) used in the present experiment.

[132] Especificamente, 150 μl de solução de cultura agitada de cada estirpe (OD600 = 2) foram misturadas, e 10 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com um título de 109 pfu/ml foram derramados e cultivados a 30°C durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio, e então a formação de placas foi examinada (Tabela 2).[132] Specifically, 150 μl of stirred culture solution of each strain (OD600 = 2) was mixed, and 10 μl of bacteriophage ΦCJ24 solution with a titer of 109 pfu/ml was poured and cultured at 30°C for 18 hours using the soft agar overlay method, and then plaque formation was examined (Table 2).

[133] Os resultados estão ilustrados na Tabela 2 a seguir.[133] The results are illustrated in Table 2 below.

[134] [Tabela 2] [134] [Table 2]

[135] Conforme ilustrado na Tabela 2, o bacteriófago ΦCJ24 demonstra capacidade de infectar a Escherichia coli patogênica aviária, incluindo os sorotipos O-1, O-78, que representam as principais bactérias causadoras de colibacilose aviária nas granjas de aves de corte.[135] As illustrated in Table 2, bacteriophage ΦCJ24 demonstrates the ability to infect avian pathogenic Escherichia coli, including serotypes O-1, O-78, which represent the main bacteria causing avian colibacillosis in poultry farms.

[136] Sabe-se que o sorotipo O-78 representa a estirpe mais dominante de Escherichia coli patogênica aviária dentre as estirpes isoladas nas granjas de aves de corte.[136] It is known that serotype O-78 represents the most dominant strain of avian pathogenic Escherichia coli among the strains isolated on poultry farms.

Claims (8)

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um bacteriófago ΦCJ24 depositado sob o número de acesso KCCM11462P como um ingrediente ativo, e um aglutinante selecionado do grupo que consiste em lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina.1. COMPOSITION, characterized by comprising a bacteriophage ΦCJ24 deposited under accession number KCCM11462P as an active ingredient, and a binder selected from the group consisting of lactose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose and gelatin. 2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso na prevenção da colibacilose aviária causada por Escherichia coli dos sorotipos O-1 ou O- 78.2. COMPOSITION, according to claim 1, characterized in that it is for use in the prevention of avian colibacillosis caused by Escherichia coli of serotypes O-1 or O-78. 3. ADITIVO ALIMENTAR PARA AVES, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.3. FOOD ADDITIVE FOR POULTRY, characterized in that it comprises the composition as defined in claim 1. 4. ALIMENTOS PARA AVES, caracterizados por compreender o aditivo alimentar para aves conforme definido na reivindicação 3.4. POULTRY FOOD, characterized in that it comprises the bird feed additive as defined in claim 3. 5. ADITIVO PARA ÁGUA POTÁVEL PARA AVES, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.5. ADDITIVE FOR DRINKING WATER FOR POULTRY, characterized in that it comprises the composition as defined in claim 1. 6. ÁGUA POTÁVEL PARA AVES, caracterizada por compreender o aditivo para água potável para aves conforme definido na reivindicação 5.6. DRINKING WATER FOR POULTRY, characterized in that it comprises the additive for drinking water for birds as defined in claim 5. 7. DESINFETANTE, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.7. DISINFECTANT, characterized by comprising the composition as defined in claim 1. 8. DETERGENTE, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.8. DETERGENT, characterized by comprising the composition as defined in claim 1.