BR112016023904B1 - Composição, aditivo alimentar para aves, alimentos para aves, aditivo para água potável para aves, água potável para aves, desinfetante e detergente - Google Patents

Abstract

NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção se refere a um novo bacteriófago denominado ()CJ24 (KCCM11462P) e a uma composição compreendendo o mesmo como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária em aves através do uso do bacteriófago ()CJ24 (KCCM11462P) ou da composição.

Description

[001] A presente invenção se refere a um novo bacteriófago com uma capacidade específica para matar Escherichia coli patogênica aviária (APEC), uma composição que inclui o mesmo, e um método para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas de aves utilizando o novo bacteriófago ou a composição.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A Escherichia coli (também denominada E.coli no presente relatório descritivo), é uma bactéria gram-negativa em forma de bastonete, pertencente ao gênero da Escherichia e à família da Enterobacteriaceae, sendo uma das floras normais existentes no intestino de diversos animais, inclusive de mamíferos. A maioria das estirpes de Escherichia coli são não patogênicas e podem causar infecções oportunistas, mas algumas estirpes altamente patogênicas causam diversas doenças intestinais e septicemia em animais, incluindo humanos.

[003] Dentre estas estirpes de Escherichia coli, particularmente a E.coli patogênica aviária (APEC), causa infecção através do trato respiratório das aves, tais como galinhas, gansos, perus, e similares, e sabe-se que ela se infiltra no corpo da ave através da membrana mucosa respiratória. A E.coli patogênica aviária causa doenças principalmente em aves de corte, particularmente doenças respiratórias, causando enormes prejuízos econômicos na indústria aviária.

[004] Um bacteriófago é um tipo especializado de vírus que previne e inibe o crescimento de uma bactéria infectada com um bacteriófago específico. Como os bacteriófagos apresentam forte especificidade hospedeira se comparados aos antibióticos e, considerando o recente surgimento de bactérias resistentes a antibióticos, além da presença residual de antibióticos em animais, o interesse pelos bacteriófagos tem aumentado.

[005] Pesquisas com bacteriófagos têm sido ativamente conduzidas em vários países de todo mundo e, além de pedidos de patentes para bacteriófagos, houve um aumento gradual nos pedidos de aprovação encaminhados ao Food and Drug Administration (FDA) para composições contendo bacteriófagos.

[006] Entretanto, as tecnologias relacionadas com bacteriófagos para prevenir e/ou tratar doenças infecciosas, que são problemas importantes na indústria da avicultura devido à Escherichia coli patogênica aviária, ainda são insuficientes, o que torna necessário desenvolver novos bacteriófagos e tecnologias associadas.

DIVULGAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[007] Como resultado da importante investigação destinada a superar o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos, a presença de antibióticos residuais em animais, e a necessidade de prevenir de forma eficaz e tratar doenças infecciosas em aves, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) que possui uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária presente na natureza, causadora de doenças respiratórias em aves de corte.

[008] Além disso, os inventores da presente invenção identificaram características morfológicas, bioquímicas e genéticas do novo bacteriófago e confirmaram que o bacteriófago tem uma excelente resistência ao ácido, ao calor e à secagem, e desenvolveram antibióticos, desinfetantes, aditivos alimentares, e outras composições usando o bacteriófago, além de uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas em aves, e um método para prevenir ou tratar doenças utilizando a mesma.

[009] A presente invenção tem por objetivo proporcionar um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.

[010] Outro propósito da presente invenção é proporcionar uma composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

[011] Ademais, a presente invenção visa proporcionar antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

[012] Além disso, a presente invenção visa ainda proporcionar um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, utilizando o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[013] De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.

[014] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

[015] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

[016] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária, compreendendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo para aves.

EFEITOS VANTAJOSOS

[017] O bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) de acordo com a presente invenção tem uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária.

[018] Além disso, o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) de acordo com a presente invenção apresenta excelente resistência ao ácido, ao calor e à secagem, de tal modo que pode ser usado não apenas como um agente para prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária em vários níveis de temperatura, de pH e de secagem, mas também como antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes, detergentes, e similares, contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo.

[019] Ademais, a presente invenção proporciona o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou antibióticos incluindo o mesmo como um ingrediente ativo, sendo que estes antibióticos apresentam efeitos específicos contra a Escherichia coli patogênica aviária, quando comparados com os antibióticos disponíveis no estado da técnica, e assim, matam seletivamente as bactérias patogênicas específicas, sem matar as bactérias benéficas, de tal forma que estes antibióticos não induzem resistência aos mesmos, o que resulta na extensão do tempo de vida dos produtos tratados em comparação com os antibióticos disponíveis no estado da técnica.

[020] Ademais, a presente invenção permite prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária através da administração do bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) como um ingrediente ativo para aves.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[021] A FIG. 1 é uma imagem obtida de um microscópio de elétrons do novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P), doravante denominado “ΦCJ24”.

[022] A FIG. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago ΦCJ24.

[023] A FIG. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida- dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do novo bacteriófago ΦCJ24.

[024] A FIG. 4 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago ΦCJ24.

[025] A FIG. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦCJ24.

[026] A FIG. 6 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência à secagem do novo bacteriófago ΦCJ24.

CONFIGURAÇÃO IDEAL

[027] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

[028] Uma configuração da presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P), com uma capacidade específica para matar a Escherichia coli patogênica aviária (APEC).

[029] A Escherichia coli patogênica aviária se refere à Escherichia coli transmitida pelo trato respiratório das aves, tais como galinhas, gansos, perus, e similares, e pode causar doenças infecciosas em aves, especificamente a colibacilose aviária. Especificamente, a Escherichia coli patogênica aviária se infiltra no corpo das aves através da membrana mucosa do trato respiratório, e causa diversas doenças tais como septicemia, granuloma, saculite aérea, salpingite, artrite, e similares. A Escherichia coli patogênica aviária é um bacilo gram-negativo similar à Escherichia coli comum, apresenta flagelos perítricos com motilidade, além de ser uma bactéria aeróbica ou facultativamente anaeróbica decompositora de lactose ou frutose para a produção de ácido e gás.

[030] A Escherichia coli patogênica aviária cresce bem em meio comum, e é capaz de crescer a uma temperatura situada entre cerca de 7°C e 48°C, sendo que a temperatura ideal de crescimento varia entre cerca de 35°C e 37°C. Especificamente, fatores patogênicos são expressos efetivamente a temperaturas de aproximadamente 42°C, que é uma temperatura próxima do corpo da ave. Além disso, a Escherichia coli patogênica aviária pode crescer em um nível de pH situado entre pH4,5 e pH9,0.

[031] Um bacteriófago é um vírus específico de bactéria capaz de infectar bactérias específicas para inibir o crescimento da bactéria, e é um vírus que possui ácido desoxirribonucleico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (RNA) como material genético.

[032] Especificamente, o bacteriófago ΦCJ24 de acordo com uma configuração da presente invenção, é um bacteriófago com especificidade para infectar seletivamente a Escherichia coli patogênica aviária, e pertence morfologicamente à Siphoviridae B1, e tem uma estrutura de cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil (ver FIG.1). A homologia entre a sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos é comparada e os resultados são mostrados na Tabela 1. O bacteriófago ΦCJ24 mostra uma resistência estável ao ácido em ambiente de pH 3,5 a pH 11,0 sem perder atividade (FIG. 4) e, em relação à resistência ao calor, o bacteriófago ΦCJ24 mostra declínio da atividade de cerca de 1 log ou menos quando exposto a 50° C ou mais durante 2 horas (FIG.5). Em relação à resistência à secagem, o bacteriófago ΦCJ24 mostra declínio da atividade de cerca de 1 log quando seco a 60° C durante 2 horas (FIG.6). As sequências parciais de nucleotídeos do DNA do bacteriófago ΦCJ24 são apresentadas em SEQ ID NOs: 1 e 2 da listagem de sequências.

[033] O bacteriófago ΦCJ24 é um novo bacteriófago isolado recentemente pelos inventores da presente invenção, e foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) sob o número de acesso KCCM11462P em 25 de outubro de 2013.

[034] Em outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Escherichia coli patogênica aviária contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.

[035] Como o bacteriófago ΦCJ24 apresenta uma atividade antibacteriana capaz de matar especificamente a Escherichia coli patogênica aviária, o bacteriófago ΦCJ24 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas pela infecção por Escherichia coli patogênica aviária. Como um exemplo de doença infecciosa causada pela Escherichia coli patogênica aviária, podemos citar a colibacilose aviária, mas não se limitando a ela.

[036] O termo “colibacilose aviária” tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma doença que ocorre no trato respiratório das aves devido à infecção por Escherichia coli patogênica, e causa sintomas tais como saculite aérea, perihepatite, peritonite, pericardite, salpingite, onfalite, osteomielite ou septicemia, inibindo assim o crescimento e causando a morte das aves infectadas.

[037] O termo "prevenir" ou "prevenção" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações envolvendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em um animal a fim de inibir ou retardar a ocorrência da doença.

[038] O termo "tratar" ou "tratamento" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações envolvendo a administração do bacteriófago ΦCJ24 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em um animal, a fim de permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causados pela infecção.

[039] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração pode conter o bacteriófago ΦCJ24 em uma quantidade de 5x102 pfu/ml a 5x1012 pfu/ml, especificamente 1x106 pfu/ml a 1x1010 pfu/ml.

[040] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, pode conter ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, e ser formulada em conjunto com o excipiente, para dessa forma ser fornecida como alimento, medicamento, aditivo alimentar, aditivo para água potável, e similares. O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável", tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a um veículo ou um diluente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica e as propriedades da composição administrada.

[041] Não há limitações específicas para o tipo de excipiente utilizável de acordo com esta configuração, de tal sorte que qualquer excipiente pode ser utilizado desde que seja geralmente utilizado na técnica e desde que seja farmaceuticamente aceitável. Exemplos de excipientes podem incluir solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina tamponada, uma solução injetável de albumina, uma solução de dextrose, uma solução de maltodextrina, glicerol, e etanol, sem se limitar a estes. Tais excipientes podem ser utilizados isoladamente ou combinados entre si.

[042] Além disso, quando necessário, outros aditivos tais como antioxidantes, soluções tampão e/ou citostáticas, podem ser adicionados à composição de acordo com a presente invenção, e diluentes, dispersantes, surfactantes, aglutinantes e/ou lubrificantes também podem ser adicionados à composição de acordo com a presente invenção para produzir formulações injetáveis, tais como solução aquosa, suspensão e emulsão, pílulas, cápsulas, grânulos e comprimidos.

[043] Não há limitações específicas para o método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças pela Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, de tal sorte que qualquer método geralmente aceito na arte pode ser empregado. Um exemplo do método de administração pode incluir a administração por via oral ou parentérica.

[044] Exemplos da formulação para a administração por via oral podem incluir drágeas, pastilhas, comprimidos, suspensões aquosas, suspensões oleosas, pó preparado, grânulos, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes, elixires, e similares.

[045] A fim de formular a composição de acordo com esta configuração na forma de comprimidos ou cápsulas, a formulação pode conter ainda aglutinantes tais como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina, excipientes tais como fosfato dicálcico, desintegrantes tais como amido de milho e amido de batata doce, e lubrificantes tais como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearil fumarato de sódio e cera de polietilenoglicol. No caso de formulação em cápsulas, a formulação pode conter ainda excipientes líquidos, tais como óleos gordurosos, além dos materiais acima mencionados.

[046] Métodos de administração parentérica da composição de acordo com esta configuração podem incluir, por exemplo, injeção intravenosa, administração intraperitoneal, administração intramuscular, administração subcutânea, administração tópica, e um método de aplicação ou pulverização da composição de acordo com a presente invenção sobre a região afetada, mas não se limitando a estes métodos.

[047] A fim de formular uma dosagem para a administração parentérica, por exemplo, a composição de acordo com esta configuração pode ser formulada em doses para injeção subcutânea, injeção intravenosa e injeção intramuscular, formulações para supositórios, formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol a fim de permitir a inalação através do sistema respiratório, sem se limitar a estas formulações. A fim de formular a composição para injeção, a composição de acordo com esta configuração pode ser misturada com um estabilizador ou uma solução tampão em água para, dessa forma, preparar uma solução ou uma suspensão e, em seguida, a solução preparada ou a suspensão pode ser formulada em dose individual para ampola ou frasco. No caso de formulação da composição para pulverização, tal como a formulação para aerossol, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em pó seja dispersa.

[048] Quantidades adequadas para aplicar, pulverizar ou administrar a composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária de acordo com esta configuração, podem ser diferentemente determinadas dependendo de fatores tais como a idade, peso, sexo, grau dos sintomas da doença, tipo de alimentos ingeridos, taxa de excreção, e similares, além de um método de formulação da composição, um método de administração, tempo de administração e/ou via de administração, e podem ser facilmente determinados e prescritos em doses eficazes para o tratamento por um veterinário perito na arte.

[049] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.

[050] O termo "antibiótico", tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma preparação administrada em animais, incluindo seres humanos, em forma de medicamento, com eficácia para esterilizar bactérias, sendo utilizado como agente antisséptico, germicida e antibacteriano.

[051] Antibióticos contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, apresentam elevada especificidade para a Escherichia coli patogênica aviária se comparados com os antibióticos convencionais, e por isso matam bactérias patogênicas específicas, mas não as bactérias benéficas, não induzindo resistência ao medicamento e proporcionando um tempo de vida maior dos produtos tratados quando comparados aos antibióticos convencionais.

[052] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um aditivo alimentar para aves e um aditivo para água potável para aves contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.

[053] Não há limitações para os tipos de aves que podem ser tratadas com os aditivos alimentares para aves ou com os aditivos para água potável para aves, mas as aves de acordo com esta configuração são particularmente aves de corte.

[054] O termo “aves de corte” tal como empregado no presente relatório descritivo é um nome genérico para os animais pertencentes ao grupo das aves. As aves de corte não estão particularmente limitadas, mas podem incluir pelo menos uma dentre o grupo compreendendo galinhas, gansos, perus, e similares.

[055] Aditivos alimentares para aves e aditivos para água potável para aves podem ser utilizados preparando-se separadamente o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo como um aditivo alimentar para aves ou como um aditivo para água potável para aves, e em seguida misturado a um alimento ou água potável, ou de tal forma que o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo seja diretamente adicionada no processo de preparação do alimento ou da água potável.

[056] O bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo usado na forma de aditivos alimentares ou aditivos para água potável de acordo com esta configuração pode ser usada na forma líquida ou seca, por exemplo em forma de pó seco.

[057] Para ilustrar um exemplo, o bacteriófago ΦCJ24 de acordo com a presente invenção pode ser misturado em forma de pó em quantidades variando de 0,05% por peso (wt%) a 10 wt%, especificamente 0,1 wt% a 2 wt%, com base no peso dos aditivos para alimentares.

[058] Métodos de secagem para a preparação dos aditivos alimentares ou dos aditivos para água potável sob a forma de pó seco de acordo com esta configuração não apresentam limitações, de maneira que quaisquer métodos comumente utilizados pelos peritos na arte podem ser empregados. Exemplos de métodos de secagem podem incluir secagem com ar, secagem natural, secagem por pulverização, e liofilização, sem se limitar a estes. Estes métodos podem ser utilizados isoladamente ou de forma combinada.

[059] Os aditivos alimentares ou aditivos para água potável de acordo com esta configuração podem incluir ainda outros microrganismos não patogênicos. Os microrganismos podem ser selecionados dentre um grupo compreendendo Bacillus sp., tal como Bacillus Subtilis, capaz de produzir proteases, lipases e/ou enzimas de conversão de açúcar; uma bactéria de ácido lático tal como Lactobacillus sp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbicas, tal como o estômago bovino, bactérias filamentosas tais como Aspergillus oryzae com capacidade de aumentar o peso de um animal, produção de leite, e digestão de alimentos, e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, e similares. Estes microrganismos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[060] Os aditivos alimentares ou aditivos para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, podem ainda conter outros aditivos, conforme a necessidade. Exemplos de aditivos apropriados incluem aglutinantes, emulsificantes e conservantes, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nitrogenadas não proteicas, silicatos, soluções tampão, agentes corantes, agentes extratantes, ou oligossacarídeos, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável, e outros suplementos alimentares, e similares. Estes aditivos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[061] Os aditivos alimentares de acordo com a presente invenção podem ser adicionados em quantidades de 0,05 a 10 partes por peso, especificamente 0,1 a 2 partes por peso com base em 100 partes por peso dos alimentos. Os aditivos para água potável de acordo com a presente invenção podem ser adicionados em quantidades de 0,0001 a 0,01 partes por peso, especificamente de 0,001 a 0,005 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. Dentro destes parâmetros, os aditivos permitem que a atividade do bacteriófago ΦCJ24 contra a Escherichia coli patogênica aviária seja suficientemente exposta.

[062] Em outra configuração, a presente invenção proporciona alimentos ou água potável preparados através da adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ΦCJ24.

[063] Não há limitação para os alimentos utilizados nesta configuração, de tal sorte que quaisquer alimentos comumente usados na arte podem ser utilizados. Exemplos destes alimentos podem incluir vegetais, grãos, raízes, subprodutos do processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, óleos e gorduras, amidos, resíduos ou subprodutos de grãos e similares, alimentos para animais tais como proteínas, materiais inorgânicos, óleos e gorduras, minerais, proteínas unicelulares, plânctons animais ou alimentos. Estes alimentos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[064] A água potável usada nesta configuração não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável comumente aceita na arte pode ser usada.

[065] De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo. A dosagem do desinfetante ou detergente não apresenta limitações específicas, de tal sorte que a dosagem do desinfetante ou do detergente pode obedecer quaisquer formulações conhecida na arte.

[066] A fim de eliminar a Escherichia coli patogênica aviária, o desinfetante pode ser pulverizado em áreas onde vivem as aves, em locais de abate, em áreas inabitadas, em cozinhas ou em equipamentos de cozinha, sem que sua aplicação seja limitada a estes exemplos.

[067] Os detergentes podem ser utilizados para lavar uma superfície da derme ou partes do corpo das aves expostas ou que podem ser expostas à Escherichia coli patogênica aviária, sem se limitar a estes exemplos.

[068] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli patogênica aviária, utilizando o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como um ingrediente ativo.

[069] Especificamente, o método de prevenção ou tratamento de acordo com esta configuração inclui a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo em aves expostas ou que podem ser expostas à Escherichia coli patogênica aviária. As quantidades diárias totais adequadas do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição incluindo o mesmo podem ser determinadas por um médico de acordo com sua avaliação, como seria de fácil compreensão aos peritos na arte.

[070] Uma dose específica farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo para determinadas aves pode ser determinada considerando-se o tipo e o grau de resposta desejada, a idade, peso, estado geral de saúde, sexo ou dieta dos indivíduos, o tempo de administração e a via de administração do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o mesmo, e a taxa de secreção da composição, o período de duração do tratamento, ou fatores similares, de tal sorte que a dosagem farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores bem conhecidos no campo da medicina, incluindo os ingredientes dos medicamentos a serem usados simultaneamente ou em diferentes ocasiões.

[071] O bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo pode ser administrado na forma de preparação farmacêutica aplicada como spray nasal em aves ou adicionada diretamente em um alimento das aves ou na água potável que será ingerida pelos animais, podendo ser misturada em um alimento ou na água potável sob a forma de aditivo alimentar ou aditivo para água potável, e então administrada aos animais.

[072] A via de administração e o método de administração do bacteriófago ΦCJ24 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo não são especificamente limitadas, de tal forma que qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado. Isto é, o bacteriófago ΦCJ24 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ24 como ingrediente ativo pode ser administrada através de várias vias, oral ou parentérica. Como exemplos não restritivos das vias de administração, é possível utilizar a via oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação.

[073] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. No entanto, os referidos exemplos visam apenas ilustrar a presente invenção sem o propósito de limitar o escopo da presente invenção aos exemplos apresentados.

[074] [Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago que infecta a Escherichia coli patogênica aviária

[075] <Exemplos 1-1>

[076] Seleção do bacteriófago e isolamento de um único bacteriófago

[077] Foi obtida uma amostra de 50ml de fezes de galinha colhida próximo a uma granja em Chengwon-gun, na província de Chungcheong, República da Coréia, e a amostra foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45μm para preparar uma solução de amostra, e depois um método de sobreposição de ágar macio foi realizado utilizando a solução de amostra preparada. O método de sobreposição de ágar macio é um método de observação da ação de lise do bacteriófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre um meio sólido com 0,7% de ágar).

[078] Especificamente, 150 μl de uma solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) obtida pelo Departamento de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk e 2ml de meio 10*LB “Luria Bertani” (10 g/l de triptofano; 5 g/l de extrato de levedura e 10 g/l de NaCl) foram misturados com 18ml de amostra filtrada e cultivada a 30°C por 18 horas. Em seguida a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45 μm. Em seguida, uma mistura de 3ml de ágar a 0,7% (w/v) e 150 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) foram vertidas e endurecidas numa placa com meio LB, à qual foram adicionados 10 μl da solução de amostra, seguida de cultura a 30C por 18 horas, resultando na formação de placas.

[079] Considerando que um tipo de bacteriófago estava presente em cada placa, os inventores tentaram isolar bacteriófagos específicos a partir das placas formadas. Especificamente, 400 μl de solução SM [5,8 g/l de NaCl; 2 g/l de MgSO47H2O; 50 ml de 1M Tris-HCl (pH 7,5)] foi adicionada às placas e deixada em temperatura ambiente durante 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.

[080] Em seguida, 100 μl da solução do bacteriófago foi misturada com 12 ml de 0,7% (w/v) de ágar e 500 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Escherichia coli patogênica aviária (E10-4), que foi usada para executar o método de sobreposição em ágar macio usando um meio LB em placa com um diâmetro de 150 mm onde a cultura foi realizada até que o bacteriófago fosse completamente lisado. Após o término da cultura, 15ml da solução SM foram adicionados ao meio LB e deixados em temperatura ambiente por um período de 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.

[081] À solução obtida, foi adicionado 1% (v/v) de clorofórmio e a solução foi misturada durante 10 minutos, seguida por centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante obtido foi filtrado com um filtro de 0,45 μm, obtendo assim uma amostra final.

[082] <Exemplos 1-2>

[083] Cultura em grande escala e purificação do bacteriófago

[084] O bacteriófago obtido no Exemplo 1-1 foi cultivado em grande escala utilizando Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) e, em seguida, o bacteriófago foi purificado.

[085] Especificamente, a Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) foi agitada e inoculada a 1,0*1010 cfu, centrifugada a 4.000 rpm durante 10 minutos, e em seguida ressuspensa em 4ml de solução SM. A esta solução foi adicionado o bacteriófago a 1,0x106 pfu com multiplicidade de infecção (MOI) = 0,0001, e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos.

[086] Em seguida, 150ml de meio LB foi inoculado e a solução foi cultivada a 30°C durante 6 horas. Após a conclusão da cultura, foi adicionado clorofórmio a um volume de 1% (v/v) do volume final, e o material mexido durante 20 minutos, ao qual foram adicionadas enzimas de restrição DNase I e RNase A para obter uma concentração final de 1 μg/ml, respectivamente, e a solução foi deixada a 30°C durante 30 minutos. A seguir, foram adicionados cloreto de sódio e glicol polietileno a uma concentração final de 1M e 10% (w/v), respectivamente, e em seguida a solução foi deixada a 4°C durante 3 horas, seguida de centrifugação a 4°C e 12.000 rpm por um período de 20 minutos, obtendo assim um precipitado.

[087] O precipitado obtido foi suspenso em 5ml da solução SM e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos, sendo adicionado 4ml de clorofórmio e a solução mexida, seguida de centrifugação a 4°C e 4.000 rpm durante 20 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45 μm, e seguido de ultracentrifugação (35.000 rpm, 1 hora, 4 °C) através do método de gradiente de densidade em glicerol (densidade: 40%, 5% de glicerol), purificando assim o bacteriófago.

[088] Os inventores da presente invenção isolaram um bacteriófago obtido através da amostra de fezes de galinha colhidas em fazendas com capacidade específica para matar Escherichia coli patogênica aviária, que foi denominado "Bacteriófago ΦCJ24", e depositaram o bacteriófago no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) como o número de acesso KCCM11462P em 25 de outubro de 2013.

[089] <Exemplo 2>

[090] Exame morfológico do ΦCJ24

[091] O bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1 foi diluído em 0,01% de solução de gelatina e em seguida fixado com 2,5% de solução de glutaraldeído. O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm), aclimatado por 10 minutos e em seguida lavado com água destilada estéril.

[092] Em seguida, uma película de carbono foi disposta sobre uma grelha de cobre, tingida com 4% de acetato de uranilo por 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-1011, 80 kV, ampliação: x200.000) (FIG.1).

[093] A FIG. 1 mostra uma imagem do bacteriófago ΦCJ24 feita pelo microscópio de elétrons, onde o bacteriófago ΦCJ24 apresenta características morfológicas de uma cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil, indicando que o bacteriófago ΦCJ24 pertence ao morfotipo Siphoviridae B1.

[094] <Exemplo 3>

[095] A análise do tamanho total do DNA genômico do ΦCJ24

[096] O DNA genômico foi extraído do bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1.

[097] Especificamente, 20mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 μg/ml de proteinase K e 0,5% (w/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução da cultura do bacteriófago ΦCJ24 purificado e foi deixada a 50°C durante 1 hora, à qual foi adicionada e mexida uma quantidade de fenol (pH 8,0) seguida de centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante.

[098] O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de PC (fenol: clorofórmio = 1: 1) e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de clorofórmio e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi misturado com 10% (v/v) de acetato de sódio 3M com base no volume total, seguido da adição de 2 volumes de etanol frio a 95%, mexido, e deixado a -20C durante 1 hora.

[099] Em seguida, a substância resultante foi centrifugada a 0C e 12.000 rpm por 10 minutos, da qual o sobrenadante foi removido para a obtenção do precipitado, que foi dissolvido em 50 μl de Tris-EDTA (TE) solução tampão (pH 8,0). O DNA extraído foi diluído 10 vezes, e então a concentração de DNA foi determinada medindo-se a absorção em OD260.

[100] Em seguida, 1 μg de DNA foi carregado em 1% de PFGE (eletroforese em gel de campo pulsado) em gel de agarose, e desenvolvido com o uso de BIORAD PFGE SYSTEM N° 7 (tamanho variando entre 25 kb a 100 kb; comutador tempo de rampa 0,4 segundos para 2,0 segundos, forma linear; tensão 180 V; tensão inversa 120 V) em temperatura ambiente durante 20 horas (FIG 2).

[101] A FIG. 2 é uma fotografia da eletroforese em gel do DNA genômico do bacteriófago ΦCJ24, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do bacteriófago ΦCJ24 tem um tamanho de cerca de 53kbp.

[102] <Exemplo 4>

[103] Análise do padrão da proteína do ΦCJ24

[104] 15 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 purificado (título 1011 pfu/ml) foi misturada com 3 μl de uma solução de amostra 5* SDS, e aquecida durante 5 minutos para obter 12% de SDS-PAGE (FIG. 3).

[105] A FIG. 3 é uma fotografia da eletroforese mostrando o resultado da SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦCJ24, onde proteínas principais com tamanhos de cerca de 10,3kDa, cerca de 12,5kDa e cerca de 15,1kDa, cerca de 43kDa, cerca de 49,3kDa, cerca de 60,4kDa e cerca de 94,9kDa foram observadas.

[106] <Exemplo 5>

[107] Análise das propriedades genéticas do ΦCJ24

[108] A fim de confirmar as propriedades genéticas do bacteriófago ΦCJ24 purificado no Exemplo 1, o DNA do bacteriófago ΦCJ24 foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise de gene. Genes foram recombinados utilizando GS e o software (Roche) da Macrogen INC. A análise da sequência do quadro aberto de leitura foi feita com GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 e software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi feita com BLASTP e InterProScan.

[109] A sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 apresentou semelhanças com a sequência nucleotídica dos bacteriófagos previamente reportados (fago de Escherichia phiEB49, fago de Escherichia KBN21), mas foi confirmado que não há nenhum outro bacteriófago com 100% de coincidência dos fragmentos. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago de acordo com a presente invenção foi isolado.

[110] A Tabela 1 representada abaixo mostra os resultados obtidos pela comparação da sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ24 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos conhecidos no estado da técnica.

[111] [Tabela 1] Pergunta Assunto Pontuação Identidades

[112] O DNA do bacteriófago ΦCJ24 preparado foi analisado utilizando um sequenciador de DNA e a sequência total de nucleotídeos é apresentada na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO:2.

[113] <Exemplo 6>

[114] Estabilidade do pH do ΦCJ24

[115] A fim de confirmar a estabilidade do bacteriófago ΦCJ24 em um ambiente de baixo pH no estômago, foi realizado o teste de estabilidade do bacteriófago ΦCJ24 sobre uma larga gama de pH (pH 2,5 / 3,0 / 3,5 / 4,0 / 5,5/ 6,5 / 7,0 / 8,0 / 9,0 / 10,0 e 11,0).

[116] Para o teste, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH 4,0, pH4,5, pH5,0 e pH5,5), solução tampão de citrato de sódio (pH 2,5, pH3,0 e pH3,5), solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,0 e pH 7,0), e uma solução de Tris-HCl (pH 8,0, pH 9,0, pH 10,0 e pH11,0)] foram preparadas numa concentração de 0,2 M.

[117] 180 μl de cada uma das soluções de pH foram misturados com 20 μl de solução do bacteriófago com um título de 2,0x1o11 pfu/ml de modo a permitir que cada solução de pH tivesse uma concentração de 0,2 M, e então a solução resultante foi deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Para um grupo de controle, 20 μl da solução do bacteriófago com um título de 2,0x1011 pfu/ml foi misturada com 180 μl da solução SM pelo mesmo método e deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, as soluções foram diluídas em série, e 10 μl de cada solução em cada etapa da diluição foram cultivadas a 30°C durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (FIG. 4).

[118] A FIG. 4 mostra os resultados experimentais da resistência do bacteriófago ΦCJ24 a ácidos. Conforme ilustrado na FIG. 4, foi confirmado que o bacteriófago ΦCJ24 não perdeu sua atividade e permaneceu estável em um ambiente de pH de 3,5 a 11,0 quando comparado ao grupo de controle.

[119] <Exemplo 7>

[120] Estabilidade e resistência do ΦCJ24 ao calor

[121] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade e resistência do bacteriófago ao calor durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de se usar o bacteriófago na formulação de aditivos alimentares, dentre outras formulações de bacteriófagos.

[122] Especificamente, 100 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com uma concentração de 1,65x1011 pfu/ml foi deixada a 37°C, 45°C, 53°C e 60°C durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, respectivamente. Então, as soluções acima foram diluídas em série, e 10 μl de cada uma das soluções foram diluídas em cada etapa e cultivadas a 30°C durante um período de 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (FIG. 5).

[123] A FIG. 5 mostra o resultado de um teste de resistência ao calor do bacteriófago ΦCJ24. Conforme ilustrado na FIG. 5, o bacteriófago ΦCJ24 teve sua atividade reduzida em cerca de 1 log ou menos quando exposto a 53°C por 120 minutos, e teve sua atividade reduzida com o passar do tempo quando exposto a 60°C.

[124] <Exemplo 8>

[125] Estabilidade do ΦCJ24 à secagem

[126] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade do bacteriófago sob condições de secagem durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de usar o bacteriófago como uma formulação de aditivo alimentar, dentre outras formulações do bacteriófago.

[127] Baseado nos resultados do teste de resistência ao calor, o teste de secagem foi realizado usando um concentrador SpeedVac. Assim, 200 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com um título de 2,5*1010 pfu/ml foi seca a 60°C em condições de vácuo durante um período de 2 horas, e os sedimentos resultantes foram introduzidos em 200 μl de solução SM que a seguir foi completamente ressuspensa a 4°C por um dia, e então os títulos foram medidos (FIG.6).

[128] Conforme ilustrado na FIG. 6, o bacteriófago ΦCJ24 teve sua atividade reduzida em cerca de 1 log após ser seco a 60°C por 2 horas, quando comparado aos títulos iniciais e à estabilidade relativa.

[129] <Exemplo 9>

[130] Exame de espectro de infecção do bacteriófago ΦCJ24 em estirpe isolada do tipo selvagem de Escherichia coli patogênica aviária

[131] A atividade lítica do bacteriófago ΦCJ24 foi testada para 46 estirpes selvagens de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Escola de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk (KU), 10 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Agência de Quarentena de Plantas e Animais da Coréia (KAPQA), 7 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária isoladas pela Escola de Medicina Veterinária da Universidade Nacional de Chonbuk (CNU), e 26 estirpes de Escherichia coli patogênica aviária com diagnóstico de doença isoladas pela Fazenda Komipharm (KF), além da Escherichia coli patogênica aviária (E10-4) usada no presente experimento.

[132] Especificamente, 150 μl de solução de cultura agitada de cada estirpe (OD600 = 2) foram misturadas, e 10 μl da solução do bacteriófago ΦCJ24 com um título de 109 pfu/ml foram derramados e cultivados a 30°C durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio, e então a formação de placas foi examinada (Tabela 2).

[133] Os resultados estão ilustrados na Tabela 2 a seguir.

[134] [Tabela 2]

[135] Conforme ilustrado na Tabela 2, o bacteriófago ΦCJ24 demonstra capacidade de infectar a Escherichia coli patogênica aviária, incluindo os sorotipos O-1, O-78, que representam as principais bactérias causadoras de colibacilose aviária nas granjas de aves de corte.

[136] Sabe-se que o sorotipo O-78 representa a estirpe mais dominante de Escherichia coli patogênica aviária dentre as estirpes isoladas nas granjas de aves de corte.

Claims (8)

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um bacteriófago ΦCJ24 depositado sob o número de acesso KCCM11462P como um ingrediente ativo, e um aglutinante selecionado do grupo que consiste em lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso na prevenção da colibacilose aviária causada por Escherichia coli dos sorotipos O-1 ou O- 78.

3. ADITIVO ALIMENTAR PARA AVES, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.

4. ALIMENTOS PARA AVES, caracterizados por compreender o aditivo alimentar para aves conforme definido na reivindicação 3.

5. ADITIVO PARA ÁGUA POTÁVEL PARA AVES, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.

6. ÁGUA POTÁVEL PARA AVES, caracterizada por compreender o aditivo para água potável para aves conforme definido na reivindicação 5.

7. DESINFETANTE, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.

8. DETERGENTE, caracterizado por compreender a composição conforme definida na reivindicação 1.