BR112016008975B1 - Métodos para detectar, monitorar o desenvolvimento e avaliar a eficácia de um tratamento de uma doença autoimune - Google Patents

Métodos para detectar, monitorar o desenvolvimento e avaliar a eficácia de um tratamento de uma doença autoimune Download PDF

Info

Publication number
BR112016008975B1
BR112016008975B1 BR112016008975-8A BR112016008975A BR112016008975B1 BR 112016008975 B1 BR112016008975 B1 BR 112016008975B1 BR 112016008975 A BR112016008975 A BR 112016008975A BR 112016008975 B1 BR112016008975 B1 BR 112016008975B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
hmwk
human
protein
cleaved
antibody
Prior art date
Application number
BR112016008975-8A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112016008975A2 (pt
Inventor
Daniel J. Sexton
Burt Adelman
Andrew Nixon
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Publication of BR112016008975A2 publication Critical patent/BR112016008975A2/pt
Publication of BR112016008975B1 publication Critical patent/BR112016008975B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA AUTOIMUNE, MONITORAR SEU DESENVOLVIMENTO E AVALIAR A EFICÁCIA DE UM TRATAMENTO PARA TAL DOENÇA. Métodos, kits e composições para diagnosticar e tratar doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide, doença de Crohn e colite ulcerativa.

Description

Referência cruzada aos pedidos relacionados
[0001] Este pedido reivindica o benefício da data do depósito doPedido Provisório US N° 61/893.542, depositado em 21 de outubro de 2013, cujo conteúdo total é incorporado neste documento por referência.
Fundamentos
[0002] Calicreína plasmática (pKal) é a enzima primária geradora de bradicinina na circulação e é um componente do sistema calicreína-cinina plasmática (KKS). Colman, R. W., e Schmaier, A. H. (1997) Blood90, 3819-3843. A ativação da pKal ocorre por meio do sistema de contato, o qualtem demonstrado ser causadorda patologia da doença associada com angioedema hereditário (AEH).Zuraw, B. L., e Christiansen, S. C. (2008) Expert Opin Investig Drugs17, 697-706. A bradicinina é um mediador chave da dor, inflamação, edema e angiogênese. Maurer, M., et al. (2011) Allergy66, 1397-1406; Colman, R. W. (2006) Curr Pharm Des12, 2599-2607.
Resumo
[0003] A presente invenção é baseada nas observações de que os níveis de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) são elevados em pacientes que possuem uma doença autoimune, como a artrite reumatoide (AR), doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Assim, são aqui descritos métodos para diagnosticaruma doença autoimune, tal como AR, CD ou UC, monitorar o progresso da doença autoimune ou avaliar a eficácia de um tratamento para a doença autoimune com base no nível de HMWKclivado.
[0004] Em um aspecto, a presente invenção provê um método de diagnóstico de uma doença autoimune (por exemplo, AR, CD ou UC) em um indivíduo, o método compreende: (i) prover uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de soro ou uma amostra de plasma) de um indivíduo suspeito de ter a doença autoimune; (ii) medir um nível de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) na amostra biológica; e (iii) identificar o indivíduo como tendo ou com risco de desenvolver a doença autoimune, se o nível de HMWK clivado na amostra biológica estiver elevado quando comparado com uma amostra controle.
[0005] Em algumas modalidades, o nível de HMWK clivado é medido por um ensaio, o qual envolve um agente aglutinante (por exemplo, um anticorpo) específico ao HMWK clivado. O ensaio pode ser um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio immunoblotting, por exemplo, um ensaio Westernblottingque envolve a detecção de LiCor.
[0006] O método pode ainda compreender a sujeição do indivíduo a um tratamento para a doença autoimune. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com uma quantidade eficaz de um inibidor de calicreína plasmática (pKal), por exemplo, os aqui descritos.
[0007] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de desenvolvimento da monitoração de uma doença autoimune (por exemplo, AR, CD ou UC) em um indivíduo, o método compreende: (i) prover uma primeira amostra biológica de um indivíduo suspeito de ter a doença autoimune em primeiro momento; (ii) medir um primeiro nível de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) na primeira amostra biológica; (iii) prover uma segunda amostra biológica do indivíduo em um segundo momentosubsequente ao primeiro momento; (iv) medir um segundo nível de HMWK clivado na segunda amostra biológica; e (v)avaliar o desenvolvimento da doença autoimune no indivíduo com base na mudança dos níveis de HMWK clivado na primeira e na segunda amostras biológicas. Se o segundo nível de HMWK clivado é maior do que o primeiro nível de HMWK clivado, isso indica que a doença autoimune progride no indivíduo ou o indivíduo desenvolveu ou está em risco de desenvolver a doença autoimune. Se o segundo nível de HMWK clivado for maior do que o primeiro nível de HMWK clivado, indica que a doença autoimune progride no indivíduo ou que o indivíduo desenvolveu ou está em risco de desenvolver a doença autoimune.
[0008] Em algumas modalidades, a primeira amostra biológica, a segunda amostra biológica ou ambas são amostras de soro ou plasma. Em outras modalidades, o primeiro ou o segundo nível do HMWK clivado é medido por meio de um ensaio que envolve um agente aglutinante (por exemplo, um anticorpo) específico ao HMWK clivado. Em alguns exemplos, o ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio de immunoblotting, por exemplo, um ensaio Westernblottingque envolve a detecção de LiCor.
[0009] O método pode ainda compreender a sujeição do indivíduo a um tratamento para a doença autoimune. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com uma quantidade eficaz de um inibidor de calicreína plasmática (pKal), por exemplo, os aqui descritos.
[0010] Além disso, a presente invenção provê um método para avaliar a eficácia de um tratamento para uma doença autoimune (por exemplo, AR, CD ou UC) em um paciente, o método compreende: (i) provermúltiplas amostras biológicas (por exemplo, amostras de soro ou amostras de plasma) de um paciente submetido a um tratamento para uma doença autoimune durante o curso do tratamento; (ii) medir os níveis de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) nas múltiplas amostras biológicas; e (iii) avaliar a eficácia do tratamento no paciente com base na alteração dos níveis do HMWK clivado ao longo do curso do tratamento. Se o nível de HMWK clivado diminui durante o curso do tratamento, isso indica que o tratamento é eficaz no paciente.
[0011] Em algumas modalidades, o tratamento envolve pelo menos um inibidor de calicreína plasmática, por exemplo, os aqui descritos. Em outras modalidades, os níveis de HMWK clivado nas múltiplas amostras biológicas são medidos por meio de um ensaio que envolve um agente aglutinante (por exemplo, um anticorpo) específico ao HMWK clivado. Em alguns exemplos, o ensaio é um ensaio de imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio immunoblotting, por exemplo, um ensaio de detecção Westernblottingque envolve a detecção deLiCor. Em qualquer um dos métodos aqui descritos, a amostra biológica aqui utilizada pode compreender um inibidor de protease ou um coquetel inibidor de protease, o qual é adicionado à amostra biológica após a sua coleta.
[0012] O inibidor de calicreína útil nos métodos pode ser, por exemplo, um inibidor decalicreína plasmática (pKal). Em algumas modalidades, o inibidor é um inibidor de calicreína plasmática.
[0013] Os inibidores de calicreína úteis nos métodos podem ser qualquer um dos polipeptídeos de domínio de Kunitz conhecidos no estado da técnicaou aqui descritos, os polipeptídeos maiores compreendem qualquer um desses domínios de Kunitz, desde que os polipeptídeos inibidores de calicreína liguem e inibam a calicreína, tal como determinado em ensaios convencionais, as proteínas de ligação de calicreína (por exemplo, anticorpos, por exemplo, anticorpos de calicreína anti-plasma), ou outros inibidores de calicreína aqui descrito.
[0014] Polipeptídeos de domínios de Kunitzexemplificativo capazes de inibir as atividades da pKal incluem: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:2; DX-88), ou o fragmento deste como, por exemplo, de 3 a 60 aminoácidos da SEQ ID NO:2.
[0015] Em algumas modalidades, o inibidor de calicreína compreende ou consiste em uma região de estrutura de um domínio de Kunitz e primeira e segunda regiões de loopsde ligação dospolipeptídeos DX-88.
[0016] Em algumas modalidades, o inibidor de calicreína compreende ou consiste em cerca de sequência de 58aminoácidosde 3 a 60 aminoácidos comSEQ ID NO:2, ou consiste no polipeptídeoDX-88 com sequência de 60 aminoácidos daSEQ ID NO: 2.
[0017] Em algumas modalidades, o inibidor de calicreína compreende uma proteína de ligação de calicreína plasmática(por exemplo, anticorpo, por exemplo, um anticorpo de calicreína anti-plasma aqui descrito).
[0018] Em algumas modalidades, a proteína de ligação (por exemplo, anticorpo, por exemplo, anticorpo humano) se liga ao mesmo epítopo ou compete para a ligação com uma proteína aqui descrita.
[0019] Em algumas modalidades, a proteína aqui descrita é selecionada a partir do grupo que consiste em M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também referido como DX-2922), X81- B01, X67 -D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também referido como DX-2930), X115-G04, M29-D09, D11-M145, M06 e M35-D09-G04. Tais proteínas de ligação são descritas, por exemplo, na Publicação PCT WO 2012/094587 e na Publicação do Pedido de Patente US 20100183625, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[0020] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática compete com ou se liga ao mesmo epítopo que X81- B01, X67-D03, X101-A01, A04-M162, X-115 F02, X124-G01, ou X63-G06.
[0021] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática não se liga com a pré-calicreína (por exemplo, a pré- calicreína humana), mas se liga à forma ativa de calicreína plasmática (por exemplo, a calicreína plasmática humana).
[0022] Em certas modalidades, a proteína se liga no ou perto do local ativo do domínio catalítico da calicreína plasmática, ou de um fragmento deste, ou se liga a um epítopo, o qual se sobrepõe com o local ativo da calicreína plasmática.
[0023] Em algumas modalidades, a proteína se liga a um ou mais aminoácidos que formam a tríade catalítica da calicreína plasmática: His434, Asp483, e/ou Ser578 (numeração baseada na sequência humana). Em outras modalidades, a proteína se liga a um ou mais aminoácidos do Ser479, Tyr563, e/ou Asp585 (numeração baseada na sequência humana). Em ainda uma outra modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática se ligaa um ou mais aminoácidos do: Arg551, Gln553, Tyr555, e/ou Arg560 (numeração das posições de aminoácidos com base na sequência de calicreína humana). Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática se ligaaum ou mais aminoácidos do: Ser478, Asn481, Ser525 e/ou Lys526 (numeração da posição do aminoácido com base na sequência de calicreína humana).
[0024] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática diminui o Fator XIIIa e/ou a produção de bradicinina por maior que cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40 %, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95% em comparação com um padrão, por exemplo, o Fator XIIIa e/ou com a produção de bradicinina, sob as mesmas condições, mas na ausência de proteína.
[0025] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmáticapossui uma constante de inibição aparente (Ki,app) inferior a 1000, 500, 100, ou 10 nM.
[0026] Em uma modalidade, as sequências de domínio variáveisde HC e LC são componentes da mesma cadeia de polipeptídeo.
[0027] Em uma outra modalidade, as sequências de domínio variáveisde HC e LC são componentes de diferentes cadeias polipeptídicas. Por exemplo, a proteína de ligação de calicreína plasmática é uma IgG., Por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. A proteína de ligação de calicreína plasmática pode ser um Fab solúvel (sFab).
[0028] Em outras implementações, a proteína de ligação de calicreína plasmática inclui um Fab2', scFv, minicorpo, fusão scFv::Fc, fusão Fab::HSA, fusão HSA::Fab, fusão Fab::HSA::Fab, ou outra molécula que compreende o local de combinação de antígenode uma das proteínas de ligação da presente invenção. As regiões VH e VL desses Fab podem ser providos como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGuilado, scFvPEGuilado, Fab2PEGuilado, VH::CH1::HSA + LC, HSA::VH::CH1 + LC, LC::HSA + VH::CH1, HSA::LC + VH::CH1, ou outra construção adequada.
[0029] Em uma modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática é um anticorpo humano ou humanizado, ou é um não imunogênico em um humano. Por exemplo, a proteína inclui uma ou mais regiões de estrutura de anticorpo humano, por exemplo, todas as regiões de estrutura humana.
[0030] Em uma modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática inclui um domínio Fc humano, ou um domínio Fc, o qual é de pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntico a um domínio Fc humano.
[0031] Em uma modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática é um anticorpo de primata ou primatizado, ou é um não imunogênico em um humano. Por exemplo, a proteína inclui uma ou mais regiões de estrutura de anticorpo primata, por exemplo, todas as regiões de estrutura de primatas.
[0032] Em uma modalidade, a proteína de ligação de calicreína plasmática inclui um domínio Fc primata, ou um domínio Fc, o qual é pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntico a um domínio Fc primata. "Primata" inclui seres humanos (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes e Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibões, macacos, lêmures, aie- aies (Daubentonia madagascariensis), e társios.
[0033] Em uma modalidade, a proteína de ligação da calicreína plasmática inclui as regiões de estrutura humana, ou regiões de estrutura que são pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idênticas às regiões de estrutura humana.
[0034] Em certas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática não inclui sequências de ratos ou coelhos (por exemplo, não é um anticorpo de murino ou coelho).
[0035] Em algumas modalidades, a proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo tal como um anticorpo humano) compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma sequência de domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, em que a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três (por exemplo, três) regiões CDR de domínio variável de cadeia pesada de uma proteína aqui descrita, e/ou a sequência de domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três (por exemplo, três) regiões CDR de domínio variável de cadeia leve de uma proteína aqui descrita, em que a proteína se liga (por exemplo, e inibe) a calicreína plasmática.
[0036] Em algumas modalidades, a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três (por exemplo, três regiões) regiões CDR de domínio variável de cadeia pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referida como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referida como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04, e/ou a sequência de domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três (por exemplo, três) regiões CDR do domínio variável da cadeia leve doM162-A04, M160-G12, M142-H08, X63- G06, X101-A01 (também aqui referida como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35- G04 (respectivamente).
[0037] Em algumas modalidades, uma, duas ou três regiões CDR (por exemplo, três) de domínio variável de cadeia pesada são do X81- B01 e/ou uma, duas ou três regiões CDR (por exemplo, três) de domínio variável de cadeia leve são do X81-B01 ou do X67-D03.
[0038] Em algumas modalidades, a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende o domínio variável da cadeia pesada de uma proteína aqui descrita, e/ou a sequência do domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia leve de uma proteína aqui descrita.
[0039] Em algumas modalidades, a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia pesada doM162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, A01-X101 (também aqui referido como DX-2922), X81- B01, X67-D03, X67- G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referidos como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04, e/ou a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve compreende o domínio variável de cadeia leve de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124- G01 (também aqui referida como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04 (respectivamente).
[0040] Em algumas modalidades, a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia pesada de X81-B01, e/ou a sequência do domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia leve de X81-B01.
[0041] Em algumas modalidades, a sequência de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia pesada de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, ou X63-G06 e/ou a sequência do domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende o domínio variável de cadeia leve de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, ou X63-G06 (respectivamente).
[0042] Em algumas modalidades, a proteína compreende a cadeia pesada de uma proteína aqui descrita, e/ou a cadeia leve de uma proteína aqui descrita.
[0043] Em algumas modalidades, a proteína compreende a cadeia pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04 (respectivamente).
[0044] Em algumas modalidades, a proteína compreende a cadeia pesada de X81-B01, e/ou a cadeia leve de X81-B01.
[0045] Em algumas modalidades, a proteína compreende a cadeia pesada de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115-F02, X124-G01, ou X63-G06 e/ou da cadeia leve de X67-D03, X101-A01, M162-A04, X115- F02, X124-G01, ou X63-G06 (respectivamente).
[0046] Em algumas modalidades, a proteína inclui uma ou mais das seguintes características: (a) uma CDR humana ou região de estrutura humana; (b) a sequência de domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3), as quais são pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idênticas a uma CDR de um domínio variável de HC aqui descrito; (c) a sequência de domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma ou mais CDRs(por exemplo, 1, 2, ou 3), as quais são pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idênticas a uma CDR de um domínio variável de LC aqui descrita; (d) a sequência de domínio variável de LC de imunoglobulina é, pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idêntica a um domínio variável de LC aqui descrito (por exemplo, em geral, ou em regiões de estrutura ou CDRs); (e) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina é pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idêntica a um domínio variável de HC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDRs); (f) a proteína se liga a um epítopo ligado por uma proteína aqui descrita, ou compete para a ligação com uma proteína aqui descrita;(g) uma CDR primata ou região de estrutura primata; (h) a sequência de domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma CDR1 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais de 2 ou 3 aminoácidos da CDR1 de um domínio variável de HC aqui descrito; (i) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma CDR2 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 aminoácidos da CDR2 de um domínio variável de HC aqui descrito; (j) a sequência do domínio variável de HC deimunoglobulina compreende uma CDR3 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, ou 6 aminoácidos da CDR3 de um domínio variável de HC aqui descrito; (k) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR1 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais de 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos da CDR1 de um domínio variável de LC aqui descrito; (l) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR2 que difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3 ou 4 aminoácidos da CDR2 de um domínio variável de LC aqui descrito; (m) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR3 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos da CDR3 de um domínio variável de LC aqui descrito; (n) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de um domínio variável de LC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDRs); e (o) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de um domínio variável de HC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDR).
[0047] Em algumas modalidades, a proteína possui uma constante de inibição aparente (Ki, app) de menos do que 1000, 500, 100, ou 10 nM.
[0048] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano), o qual possui as cadeias leves e pesadas de anticorpos selecionados a partir do grupo que consiste em M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[0049] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano), o qual possui a cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[0050] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano) que possui a cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115-G04, M29D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[0051] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano), o qual possui regiões variáveis de um anticorpo pesado e/ou leve selecionado a partir do grupo que consiste em: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[0052] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática não se liga com a pré-calicreína (por exemplo, a pré- calicreína humana), mas se liga à forma ativa de calicreína plasmática (por exemplo, a calicreína plasmática humana).
[0053] Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática diminui o Fator XIIIa e/ou a produção de bradicinina por pelo menos superior a cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40 %, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95% em comparação com um padrão, por exemplo, o Fator XIIIa e/oucom a produção de bradicinina, sob as mesmas condições, mas na ausência da proteína.
[0054] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da calicreína plasmática tem uma constante de inibição aparente (Ki, app) de menos do que 1000, 500, 100, ou 10 nM.
[0055] Em uma modalidade, as sequências do domínio variável de HC e LC são componentes da mesma cadeia de polipeptídeo.
[0056] Os detalhes de uma ou mais modalidades da presente invenção são estabelecidos nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.
[0057] Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patentes pendentes e patentes publicadas, citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados por referência.
Breve descrição das figuras
[0058] A Figura 1 é um gráfico que mostra a associação do HMWK clivado com a artrite reumatoide, doença de Crohn e colite ulcerosa.
Descrição detalhada
[0059] A presente invenção é baseada na descoberta de que foram observados elevados níveis de HMWK clivado em pacientes com AR, CD ou UC. Particularmente, foi observado um grande nível de HMWK clivado em pacientes com AR e um nível moderado de HMWK clivado em ambos os pacientes de UC e CD. Portanto, aqui são proporcionados novos métodos de diagnóstico e de prognóstico para identificar indivíduos tendo ou em risco de desenvolver uma doença autoimune, tal como AR, UC ou CD, monitorando o progresso da doença autoimune e avaliando a eficácia de um tratamento para a doença autoimune em um indivíduo, com base no nível de HMWK clivado em uma amostra biológica do indivíduo. Também são aqui descritos, métodos para o tratamento de uma tal doença autoimune, bem como outras doenças associadas com o sistema calicreína plasmática (pKal) utilizando um inibidor de pKal, tais como aqueles aqui descritos.
Definições
[0060] Por conveniência, antes da descrição detalhada da presente invenção, certos termos empregados na especificação, nos exemplos e nas reivindicações anexas, são definidas aqui.
[0061] As formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[0062] O termo "anticorpo" se refere a uma proteína, a qual inclui pelo menos um domínio variável de imunoglobulina ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo pode incluir uma regiãovariável de cadeia pesada (H) (aqui abreviada como VH) e uma região variável de cadeia leve (L) (aqui abreviada como VL). Em outro exemplo, um anticorpo inclui duas regiões variáveis de cadeia pesada (H) e duas regiões variáveis de cadeia leve (L). O termo "anticorpo" engloba fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos (por exemplo, anticorpos de cadeia simples, Fab e fragmentos sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv, e fragmentos de anticorpos de domínio (dAb) (de Wildtet al., Eur. J. Immunol. 1996; 26(3):629-39)), bem como anticorpos completos. Um anticorpo pode ter as características estruturais de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (assim como os subtipos do mesmo). Os anticorpos podem ser de qualquer fonte, mas são preferidos de primata (primata humano ou não-humano) e primatizados.
[0063] As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas como “regiões determinantes de complementaridade” ("CDR"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões de estrutura" ("FR"). A extensão da região de estrutura e CDRs foi definida com precisão (ver, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH US Publicação No. 913242, e Chothia, C. et. al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, ver também www.hgmp.mrc.ac.uk). As definições de Kabat são usadas aqui. Cada VH e VL é tipicamente composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal para o carboxilo-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[0064] A cadeia VH ou VL do anticorpo pode ainda incluir a totalidade ou parte de uma região constante de cadeia pesada ou leve, para assim formar uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias pesadas de imunoglobulinas e duas cadeias leves de imunoglobulina, em que as cadeias pesadas e levesde imunoglobulina estão interconectadas por, por exemplo, ligações de dissulfureto. Em IgGs, a região constante da cadeia pesada inclui três domínios de imunoglobulina, CH1, CH2 e CH3. A região constante de cadeia leve inclui um domínio CL. A região variável das cadeias pesadas e leves contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos tipicamente mediam a ligação do anticorpo aos tecidos do hospedeiro ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico. As cadeias leves de imunoglobulina podem ser dos tipos kappa ou lambda.Em uma modalidade, o anticorpo é glicosilado. Um anticorpo pode ser funcional para a citotoxicidade dependente de anticorpos e/ou citotoxicidade mediada por complemento.
[0065] Uma ou mais regiões de um anticorpo pode ser humana ou eficazmente humana. Por exemplo, uma ou mais regiões variáveis podem ser humanas ou eficazmentehumanas. Por exemplo, um ou mais CDRs podem ser humanas, por exemplo, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 e LC CDR3. Cada CDR de cadeia leve pode ser humana. CDR3 de HC pode ser humana. Uma ou mais regiões de estrutura podem serhumanas, por exemplo, FR1, FR2, FR3, e FR4 da HC ou LC. Por exemplo, a região Fc pode ser humana. Em uma modalidade, todas as regiões de estrutura são humanas, por exemplo, possuem uma sequência de uma estrutura de um anticorpo produzido por uma célula somática humana, por exemplo, uma célula hematopoiética que produz imunoglobulinas ou uma célula não-hematopoiéticas. Em uma modalidade, as sequências humanas são sequências de linha germinal, por exemplo, codificado por um ácido nucleico de linha germinal. Em uma modalidade, os resíduos de estrutura (FR) de um fragmento Fab selecionado pode ser convertido para o tipo de aminoácido do resíduo correspondente no gene da linha germinal primata mais semelhante, especialmente o gene da linha germinal humana. Uma ou mais regiões constantes pode ser humana ou eficazmente humana. Por exemplo, pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, ou 100% de um domínio variável de imunoglobulina, a região constante, os domínios constantes (CH1, CH2, CH3, CL1), ou o anticorpo inteiro pode ser humano ou humano eficazmente.
[0066] Todo ou parte de um anticorpo pode ser codificado por um gene da imunoglobulina ou pelo segmento deste. Genes exemplificativos de imunoglobulina humana incluem genes da região constante dekappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon e mu, bem como os diversos genes da região variável de imunoglobulina. As "cadeias leves" de comprimento totalde imunoglobulina (cerca de 25 KDa ou cerca de 214 aminoácidos) são codificadas por um gene da região variável no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene da região constante de kappa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas” de comprimento total de imunoglobulina (cerca de 50 KDa ou cerca de 446 aminoácidos), são similarmente codificados por um gene da região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes da região constante acima mencionados, por exemplo, gama (que codifica cerca de 330 aminoácidos). O comprimento de HC humano varia consideravelmente, uma vez que a CDR3 deHC varia de cerca de 3 resíduos de aminoácidos para mais de 35 resíduos de aminoácidos.
[0067] O termo "fragmentos de ligação ao antígeno" de um anticorpo de comprimento total se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo de comprimento total, o qual retém a capacidade de se ligar especificamente a um alvo de interesse. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "fragmentos de ligação ao antígeno" de um anticorpo de comprimento total incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), a qual retém a funcionalidade. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitas como uma cadeia de proteína única, em que as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv). Ver, por exemplo, nos Pedidos de Patentes US N°s 5.260.203, 4.946.778, e 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
[0068] Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos usando qualquer técnica apropriada, incluindo técnicas convencionais conhecidas pelo versado na técnica. O termo "anticorpo monoespecífico" se refere a um anticorpo que exibe uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado alvo, por exemplo, epítopo. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou uma "composição de anticorpo monoclonal", emque, como aqui utilizado, se refere a uma preparação de anticorpos ou de seus fragmentos de composição molecular única, independentemente da forma como o anticorpo foi gerado.
[0069] A constante de inibição (Ki) proporciona uma medida dopotente inibidor; é a concentração do inibidor requerida para reduzir a atividade enzimática pela metade, e não é dependente das concentrações de enzima ou do substrato. A Ki aparente (Ki,app) é obtida em diferentes concentrações de substrato por meio da medição do efeito inibidor de diferentes concentrações do inibidor (por exemplo, proteína de ligação inibitória) na extensão da reação (por exemplo, na atividade da enzima); encaixando a alteração na taxa constante de pseudo-primeira ordem como uma função da concentração de inibidor à equação de Morrison (Equação 1) fornecendo uma estimativa do valor de Ki aparente. O valor de Ki é obtido a partir da intercepção-y extraída a partir de uma análise de regressão linear de um gráfico de Ki,appversus a concentração de substrato.
Figure img0001
[0070]
[0071] Equação 1
[0072] Onde v= velocidade medida; v0= velocidade na ausência de inibidor; Ki, app= constante de inibição aparente; I= concentração total de inibidor; e E= concentração total de enzima.
[0073] Como aqui utilizado, a "afinidade de ligação" se refere à constante de associação aparente ou Ka. A Ka é inversa a constante de dissociação (Kd). Uma proteína de ligação pode, por exemplo, ter uma afinidade de ligação de pelo menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 e 1011 M- 1em relação a uma molécula alvo particular. A ligação de afinidade superior de uma proteína de ligação a um primeiro alvo em relação a um segundo alvo pode ser indicada por uma Ka superior (ou uma Kdde valor numéricomenor) para a ligação do primeiro alvo e então a Ka (ou Kdde valor numérico) para a ligação do segundo alvo. Em tais casos, a proteína de ligação possui uma especificidade para o primeiro alvo (por exemplo, uma proteína em uma primeira conformação ou mímica da mesma) em relação ao segundo alvo (por exemplo, a mesma proteína em uma segunda conformação ou mímica da mesma; ou uma segunda proteína). Diferenças na afinidade de ligação (por exemplo, para a especificidade ou outras comparações) podem ser de pelo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, ou 105 vezes.
[0074] A afinidade de ligação pode ser determinada por uma variedade de métodos incluindo a diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração em gel, ELISA, ressonância de plasma de superfície, ou espectroscopia (por exemplo, utilizando um ensaio de fluorescência). Condições exemplificativas para avaliar a afinidade de ligação são em tampão Tris (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2 com pH 7,5). Estas técnicas podem ser usadas para medir a concentração de proteína de ligação ligada e livre em função da concentração da proteína de ligação (ou do alvo). A concentração da proteína de ligação ligada ([Ligada]) está relacionada com a concentração da proteína de ligação livre ([Livre]) e a concentração de locais de ligação para a proteína de ligação no alvo, onde (N) é o número de locais de ligação por molécula alvo por meio da seguinte equação: [Ligada] = N^Livre]/((1/Ka) + [Livre]).
[0075] Não é sempre necessário fazer uma determinação exata da Ka, embora, uma vez queas vezes é suficiente para se obter uma medida quantitativa da afinidade, por exemplo, determinar usando um método tal como ELISA ou análise de FACS, é proporcional à Ka, e, portanto, pode ser utilizada para comparações, como determinar se uma afinidade mais elevada é, por exemplo, duas vezes mais elevada, para obter uma medida qualitativa de afinidade, ou para obter uma inferência de afinidade, por exemplo, por atividade em um ensaio funcional, por exemplo, ensaio in vitro ou in vivo.
[0076] O termo "proteína de ligação" se refere a uma proteína, a qual pode interagir com uma molécula alvo. Este termo é usado de modo cambiável com "ligando." Uma "proteína de ligação de calicreína plasmática" se refere a uma proteína que pode interagir com (por exemplo, se ligar) a calicreína plasmática, e inclui, particularmente, proteínas que preferencialmente ou especificamente interagem com e/ou inibema calicreína plasmática. A proteína inibe a calicreína plasmática, se ela provocar uma diminuição na atividade de calicreína plasmática em comparação com a atividade de calicreína plasmática na ausência de proteína e sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmática é um anticorpo.
[0077] O termo "inibidor de calicreína" se refere a qualquer agente ou molécula que inibe a calicreína.
[0078] O termo "combinação" se refere ao uso de dois ou mais agentes ou terapias para tratar o mesmo paciente, ao passo que a utilização ou a ação dos agentes ou terapias se sobrepõem no tempo. Os agentes ou terapias podem ser administrados ao mesmo tempo (por exemplo, como uma única formulação que é administrada a um paciente ou em duas formulações separadas administradas simultaneamente) ou sequencialmente em qualquer ordem.
[0079] Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeiaslaterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[0080] É possível que uma ou mais estruturas e/ou resíduos de aminoácidos de CDR (ou resíduos de aminoácidos de loop de ligação) de uma proteína de ligação incluam uma ou mais mutações (por exemplo, substituições (por exemplo, substituições conservativas ou substituições de aminoácidos não essenciais), inserções ou deleções) em relação a uma proteína de ligação aqui descrita. Uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter mutações (por exemplo, substituições (por exemplo, substituições conservadoras ou substituições de aminoácidos não essenciais), inserções ou deleções) (por exemplo, pelo menos uma, duas, três, ou quatro, e/ou menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 mutações) em relação a uma proteína de ligação aqui descrita, por exemplo, mutações que não têm um efeito significativo sobre a função da proteína. As mutações podem estar presentes em regiões de estrutura, CDRs (ou em loops de ligação), e/ou em regiões constantes. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma região de estrutura. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma CDR. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma região constante. Seja ou não uma substituição particular tolerada, isto é, que não vai afetar negativamente as propriedades biológicas, tal como a atividade de ligação pode ser projetada, por exemplo, por meio da avaliação, se a mutação é conservadora ou pelo método de Bowie, et al. (1990) Science 247:13061310.
[0081] Uma região variável de imunoglobulina "eficazmente humana" é uma região variável de imunoglobulina que inclui um número suficiente de posições de aminoácidos de estrutura humana, de tal modo que a região variável da imunoglobulina não elicia uma resposta imunogênica em um humano normal. Um anticorpo "eficazmente humano" é um anticorpo que inclui um número suficiente de posições de aminoácidos humanos, de modo que o anticorpo não elicia uma resposta imunogênica em um humano normal.
[0082] Um "epítopo" se refere ao local de um composto alvo, o qual está ligado por uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo tal como um fragmento Fab ou um anticorpo de comprimento total). No caso em que o composto alvo é uma proteína, o local pode ser inteiramente composto de componentes de aminoácidos, compostos inteiramente por modificações químicas dos aminoácidos da proteína (por exemplo, frações de glicosil), ou compostos por combinações dos mesmos. Epítopos sobrepostos incluem pelo menos um resíduo aminoácido comum, grupo glicosil, grupo fosfato, grupo sulfato, ou qualquer outra função molecular.
[0083] Uma primeira proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) "se liga ao mesmo epítopo" como uma segunda proteína de ligação (por exemplo, anticorpo), se a primeira proteína de ligação se liga ao mesmo local em um composto alvo que a segunda proteína de ligação se liga, ou se liga a um local que se sobrepõe (por exemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de sobreposição, por exemplo, em termos de sequência de aminoácidos ou outra característica molecular (por exemplo, grupo glicosil, um grupo fosfato ou sulfato grupo)) com o local que a segunda proteína de ligação se liga.
[0084] Uma primeira proteína de ligação (por exemplo, anticorpo) "compete para a ligação" com uma segunda proteína de ligação (por exemplo, anticorpo), se a ligação da primeira proteína de ligação ao seuepítopo diminui (por exemplo, por 10%, 20%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais) a quantidade da segunda proteína de ligação que se liga ao seu epítopo. A competição pode ser direta (por exemplo, a primeira proteína de ligação se liga a um epítopo que é o mesmo que, ou se sobrepõe com, o epítopo ligado pela segundaproteína de ligação), ou indireta (por exemplo, a ligação da primeira proteína de ligação ao seu epítopo provoca uma alteração estérica no composto alvo que diminui a capacidade da segunda proteína de ligação de se ligar ao seu epítopo).
[0085] Os cálculos de "homologia" ou "identidade de sequência" entre duas sequências (os termos são aqui utilizados de modo intercambiável) são executados como se segue. As sequências estão alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácido nucleíco para um alinhamento ideal,e sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). O alinhamento ideal é determinado como a melhor pontuação utilizando o programa GAP no pacote de software GCG com uma matriz de pontuação Blosum62 com uma penalidade paralacunas de 12, uma penalidade estendida para lacunasde 4, e uma penalidade paralacunas de quadro de leitura de 5. Os resíduos de aminoácidos ou os nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou nas posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado,a "identidade" do aminoácido ou do ácido nucleico é equivalente à"homologia” doaminoácido ácido ou do ácido nucleico). A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências.
[0086] Em uma modalidade preferencial, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação é de pelo menos 30%, preferencialmente de pelo menos 40%, mais preferencialmente de pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente de pelo menos 60%, e particularmente preferencial depelo menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% ou 100% do comprimento da sequência de referência. Por exemplo, a sequência de referência pode ser o comprimento da sequência de domínio variável de imunoglobulina.
[0087] Uma região variável de imunoglobulina "humanizada" é uma região variável de imunoglobulina, a qual é modificada para incluir um número suficiente de posições de aminoácido de estrutura humana, de tal modo que a região variável de imunoglobulina não elicia uma resposta imunogênica em um humano normal. Descrições de imunoglobulinas "humanizadas" incluem, por exemplo, US 6.407.213 e US 5.693.762.
[0088] Como aqui utilizado, o termo "hibridar sob condições com estringência baixa, média, elevada, ou muito elevada" descreve as condições de hibridação e lavagem. Orientações para a execução de reações de hibridação podem ser encontradas em Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Métodos aquosos e não aquosos são descritos na referência e qualquer um deles pode ser utilizado. As condiçõesespecíficas de hibridação aqui referidas são as seguintes: (1) condições de hibridaçãocom baixa estringência em cloreto de sódio/citrato de sódio 6x(SSC) a cerca de 45 °C, seguida por duas lavagens em SSC0,2X, 0,1% de SDS a pelo menos 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser elevadaaté 55 °C para as condições de baixa estringência); (2) condições de hibridação com média estringênciaem SSC 6Xa cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC0,2X, 0,1%de SDS a 60 °C; (3) condições de hibridaçãocom elevada estringênciaem SSC 6Xa cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC0,2X, 0,1% de SDS a 65 °C; e (4) condições de hibridação com estringência muitoelevada são 0,5 Mde fosfato de sódio, 7% de SDSa 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens emSSC 0,2X, 1% de SDS a 65 °C. As condições com estringência muitoelevada (4) são as condições preferenciais e as que devem ser usadas,a menos que especificado ao contrário. A invenção inclui ácidos nucléicos que hibridam com estringênciabaixa, média, elevada ou muito elevadapara um ácido nucleíco descrito aqui ou para um complementoseu, por exemplo, ácidos nucléicos que codificam uma proteína de ligação aqui descrita. Os ácidos nucléicos podem ter o mesmo comprimento ou dentro de 30, 20 ou 10% do comprimento do ácido nucleico de referência. O ácido nucleíco pode corresponder a uma região que codifica uma sequência de domínio variável de imunoglobulina aqui descrita.
[0089] Uma "composição isolada" se refere a uma composição que é removida a partir de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra experimental, a partir do qual pode ser obtida a composição isolada. As composições produzidas artificialmente ou naturalmente podem ser "composições de pelo menos" um certo grau de pureza, se a espécie ou população de espécies de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou 99% pura em uma relação pesopeso.
[0090] Uma proteína "isolada" se refere a uma proteína que é removida a partir de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra experimental, a partir do qual pode ser obtida a proteína isolada. As proteínas podem ser "de pelo menos" um certo grau de pureza, se a espécie ou população de espécies de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou 99% pura em uma relação peso-peso.
[0091] Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo, o qual pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem do agente aglutinante, por exemplo, o anticorpo, sem abolir ou, preferencialmente, sem alterar substancialmente a atividade biológica, ao passo que a alteração de umresíduode aminoácido"essencial" resultaem uma perda substancial de atividade.
[0092] Um "paciente", "indivíduo" ou "hospedeiro" (estes termos são utilizados de modo intercambiável) para ser tratado pelo método pode significar um animal humano ou não-humano.
[0093] Um "indivíduo com essa necessidade" inclui, por exemplo, um indivíduo tendo uma doença ouum transtornoaqui descrito, ou um indivíduo em risco de desenvolver uma doença ou umtranstornoaqui descrito.
[0094] O termo "calicreína" (por exemplo, calicreína plasmática) se refere às peptidases (enzimas que clivam ligações peptídicas em proteínas), um subgrupo da família de protease deserina.Calicreína plasmática clivacininogênio para gerar cininas, peptídeos potentes pro- inflamatórios. DX-88 (também aqui referido como "PEP-1") é um inibidor específico potente (Ki <1 nM) de calicreína plasmática (NP_000883). (Ver também, por exemplo, WO 95/21601 ou WO 2003/103475).
[0095] A sequência de aminoácidos de KLKb1 (calicreína plasmática) é: KLKb1 >gi|78191798|ref|NP_000883.2| precursor B1 calicreína plasmática [Homo sapiens] MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYC QMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRT GAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQ KRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNV ESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICT YHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGY SLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMI RCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSL RLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRH LCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFS QIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIY TNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQR MVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCA RREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA (SEQUÊNCIA ID NO:3)
[0096] Como aqui utilizado, o termo "DX-2922", tal como utilizado de modo intercambiável com o termo "X101-A01". Outras variantes deste anticorpo são descritas abaixo.
Figure img0002
[0097]
[0098] Tal como aqui utilizado, o termo "DX-2930", tal como utilizado de modo intercambiável com o termo "X124-G01". Outras variantes deste anticorpo são descritas abaixo.
Figure img0003
KLK1 >gi|13529059|gb|AAH05313.1| calicreína 1 [Homo sapiens] MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHF STFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFV HVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDA VKVVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPND ECKKVHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGV TSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS (SEQ ID NO: 4).
[0099] As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica" tal como se utiliza aqui, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóidea, intra-espinal, epidural e intra-esternal.
[00100] O termo "prevenção" de uma doença em um indivíduose refere a submeter o indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de um fármaco, de tal forma que pelo menos um sintoma da doença é prevenido, isto é, administrado antes da manifestação clínica da condição indesejada (por exemplo, doença ou outro estado indesejado do animal hospedeiro), de modo que protege o hospedeiro contra o desenvolvimento da condição indesejada. "Prevenção" de uma doença, também pode ser referida como "profilaxia" ou "tratamento profilático".
[00101] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, porque uma dose profilática é utilizada em indivíduos antes ou em uma fase precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz é provavelmente, mas não necessariamente, menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00102] Como aqui utilizado, o termo "substancialmente idêntico" (ou "substancialmente homólogo") é aqui usado para se referir a uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico que contém um número suficiente de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral semelhante, por exemplo, substituições de aminoácidos conservados) em relação a uma segunda sequência deaminoácido ou de ácido nucleico, de tal modo que a primeira e a segunda sequência de aminoácido ou de ácidos nucléicos possuem (ou codificam proteínas tendo) atividades semelhantes, por exemplo, uma atividade de ligação, uma preferência de ligação, ou uma atividade biológica. No caso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelo menos 50%, pelo menos 25% ou pelo menos 10% da afinidade relativa ao mesmo antigênico.
[00103] As sequências similares ou homólogas (por exemplo, pelo menos a cerca de 85% da identidade de sequência) às sequências aqui descritas também são parte deste pedido. Em algumas modalidades, a identidade de sequência pode ser de cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maisdeidentidade de sequência em relação à uma proteína de ligação aqui descrita. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência nas regiões de estrutura de HC e/ou LC (por exemplo, HC e/ou LC FR 1, 2, 3, e/ou 4) em relação à uma proteína de ligação aqui descrita. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência nas CDRs de HC e/ou LC (por exemplo, CDR1 de HC e/ou LC, 2 e/ou 3) em relação à uma proteína de ligação aqui descrita. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência na região constante (por exemplo, CH1, CH2, CH3, e/ou CL1) em relação à uma proteína de ligação aqui descritos.
[00104] Adicionalmente, a identidade substancial existe quando os segmentos de ácido nucleíco hibridam sob condições de hibridação seletivas (por exemplo, sob condições de hibridação com estringênciaelevada), para complementaro filamento. Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular ou me uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
[00105] O motivo de sequências para os biopolímeros pode incluir as posições que podem ser variadas de aminoácidos. Por exemplo, o símbolo "X", em tal contexto se refere geralmente a qualquer aminoácido (por exemplo, qualquer um dos vinte aminoácidos naturais), a menos que especificado de outra forma, por exemplo, se referir a qualquer aminoácido não-cisteína. Outros aminoácidos permitidos também podem ser indicados, por exemplo, utilizando parênteses e barras. Por exemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que alanina, triptofano, fenilalanina, asparagina e glutamina são permitidos nessa posição particular.
[00106] A significância estatística pode ser determinada por qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Exemplos de testes estatísticos incluem: o teste T de estudante, o teste U não-paramétrico de Mann Whitney e o teste estatístico não paramétrico de Wilcoxon. Algumas relações estatisticamente significativas têm um valor de P inferior a 0,05 ou 0,02. As proteínas de ligação particulares podem mostrar uma diferença, por exemplo, na especificidade ou na ligação, que são estatisticamente significativas (por exemplo, um valor de P <0,05 ou 0,02). Os termos "induzir", "inibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "reduzir" ou algo semelhante, por exemplo, que denotam distinguir diferenças qualitativas ou quantitativas entre dois estados, e pode se referir a uma diferença, por exemplo, uma diferença estatisticamente significativa, entre os dois estados.
[00107] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade da proteína para eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela, em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da composição é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00108] Uma "dose terapeuticamente eficaz" preferencialmente modula um parâmetro mensurável de uma doença ou de um transtorno. Por exemplo, uma dosagem terapeuticamente eficaz pode reduzir o grau de um sintoma da doença ou transtorno em pelo menos cerca de 20%, preferencialmente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60%, e particularmente preferencial em pelo menos cerca de 80% em comparação com o sintoma antes do tratamento. A capacidade de um composto em modular um parâmetro mensurável, por exemplo, um parâmetro associado à doença, pode ser avaliado em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em transtornos e condições humanas. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto em modular um parâmetro in vitro.
[00109] "Tratamento" de uma doença ou transtorno em um indivíduo (incluindo, por exemplo, "tratamento" de um indivíduo possuindo ou em risco de desenvolver uma doença ou transtorno) se refere a submeter o indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de um fármaco, de tal modo que pelo menos um sintoma da doença é prevenido, curado, aliviado, diminuído ou semelhante.
[00110] Uma "doença associada com uma proteína dobrada incorretamente ou agregação" é uma doença que surge, pelo menos em parte, devido a uma alteração (por exemplo, uma obstrução) no processo de dobragem ou na estabilidade da estrutura dobrada da proteína. A obstrução do processo de dobragem, o aumento na agregação e a desestabilização da estrutura da proteína nativa podem causar patologias deperda de função ou ganho de função. A doença associada com o dobramento incorreto da proteína ou com a agregação inclui, mas não está limitado a: amiloidose sistêmica, crioglobulinemia e a doença das células falciformes. As doenças neurológicas associadas com o dobramento incorreto da proteína ou com a agregação incluem doença de Creutzfeldt- Jakob (associada com proteínas príons), doença de Alzheimer, outras doenças amilóides tais como polineuropatia amilóide familiar (PAF).
I. Utilização nível de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) como um biomarcador nos ensaios de diagnóstico e prognóstico para doenças autoimunes.
[00111] Níveis elevados de HMWK clivado foram encontrados em doenças autoimunes como a artrite reumatoide (AR), a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC). Exemplo 1 abaixo. Assim, HMWK clivado pode servir como um biomarcador fiável para diagnosticaruma doença autoimune (por exemplo, AR, UC e CD), monitorar o progresso de uma tal doença autoimune e avaliar a eficácia de um tratamento para a doença.
[00112] Assim, são aqui descritos métodos de diagnóstico e de prognóstico para uma doença autoimune (por exemplo, AR, UC e CD) com base no nível de HMWK clivado em umaamostra biológica (por exemplo, uma amostra plasmática) obtida a partir de um paciente candidato.
[00113] Cininogênio com alto peso molecular (HMWK), também conhecido como o fator de Williams-Fitzgerald-Flaujeac ou o fator de Fitzgerald ou o fator de calicreína de HMWK, é uma proteína do sistema de coagulação do sangue, bem como do sistema de calicreína-cinina. É uma proteína que absorve para a superfície dos biomateriais que entram em contato com sangue in vivo. Cininogênio com alto peso molecular (HMWK) existe no plasma como um único polipeptídeo (1-cadeia) de vários domínios (domínios de 1 a 6) de proteína com um peso molecular de aproximadamente 110 kDa. O HMWK é clivado por pKal dentro do domínio 4 para libertar o aminoácido 9, a bradicinina peptídeo pró-inflamatória e uma forma de 2 cadeias do HMWK (cininogênio clivado). As 2 cadeias de HMWK são a cadeia pesada, a qual contém os domínios de 1 a 3 de HMWK, e a cadeia leve, a qual contém os domínios 5 e 6 de HMWK. As cadeias pesada e leve têm um peso molecular de cerca de 56 e 46 quilodaltons, respectivamente.
[00114] O gene humano que codifica HMWK é o cininogênio 1 (KNG1). O KNG1 é transcrito e, alternativamente emendado para formar mRNAs que codificam o HMWK ou o cininogênio com baixo peso molecular (LMWK). Um exemplo de sequência de proteína de HMWK é fornecido abaixo:
[00115] >gi|156231037|ref.|NP_001095886.1|precursor cininogênio-1 isoforma 1 [Homo sapiens]
[00116] MKLITILFLCSRLLLSLTQESQSEEIDCNDKDLFKAVDAA LKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKT WQDCEYKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQ YDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVV AGLNFRITYSIVQTNCSKENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIA SFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENN ATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKL GQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGEI KEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTRRHDWGHEKQRKHNLGHG HKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGHGHKFKLDDDLEHQGGHVL DHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASSSEDSTTPSAQTQ EKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQSDDDWIPDI QIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSVSEINPTTQMKESYYFDLTDG LS (SEQ ID NO: 5).
[00117] Cininogênio com alto peso molecular (HMWK) intacto pode ser ensaiado, por exemplo, usando coagulante ou métodos imunológicos, por exemplo, radioimunoensaio (ver, por exemplo, Kerbiriou- Nabias, D.M., Br. J.Haematol., 1984, 56 (2):2734-86). Um anticorpo monoclonal para a cadeia leve de HMWK humano é conhecido. Ver, por exemplo, Reddigari, S.R. & Kaplan, A.P., Blood, 1999, 74:695-702. Um ensaio para HMWK que se baseia em um substrato cromogênico também pode ser usado. Ver, por exemplo, Scott, CF. et al. Thromb Res, 1987, 48(6):685-700; Gallimore, M. J. et al. Thromb Res, 2004, 114(2):91-96.
[00118] Cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK), também aqui referido como "cininogênio clivado", pode ser avaliado, por exemplo, utilizando métodos descritos no Exemplo 1, por exemplo, Western blot. Os anticorpos que ligam especificamente o HMWK clivado, tais como, por exemplo, o clone 11h05 de rato mAb pode ser utilizado. Adicionalmente, o HMWK clivado pode ser avaliado utilizando espectrometria de massa. Técnicas Immunoblotting para avaliar os níveis de HMWK clivado são conhecidas pelo versado na técnica. Ver, por exemplo, Buhler R. et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 1995, 6(3):223-232.
[00119] Sequências exemplificativas das cadeias pesada e leve de cininogênio clivado são fornecidos abaixo.
[00120] > cininogênio clivado-1 cadeia pesada
[00121] QESQSEEIDCNDKDLFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVL YRITEATKTVGSDTFYSFKYEIKEGDCPVQSGKTWQDCEYKDAAKAATGE CTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPISTQSPDLE PILRHGIQYFNNNTQHSSLFMLNEVKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCSK ENFLFLTPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQP PTKICVGCPRDIPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQV VAGKKYFIDFVARETTCSKESNEELTESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWE KKIYPTVNCQPLGMISLMK (SEQ ID NO: 6).
[00122] > cininogênio clivado-1 cadeia leve
[00123] SSRIGEIKEETTVSPPHTSMAPAQDEERDSGKEQGHTR RHDWGHEKQRKHNLGHGHKHERDQGHGHQRGHGLGHGHEQQHGLGH GHKFKLDDDLEHQGGHVLDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKKNGKHNGWK TEHLASSSEDSTTPSAQTQEKTEGPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIAT MMPPISPAPIQSDDDWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWKSV SEINPTTQMKESYYFDLTDGLS (SEQ ID NO: 7).
[00124] Em alguns exemplos, os níveis de HMWK intacto e HMWK clivado são medidos por meio de uma análise de Western blot, por exemplo, análise de Western blotSimple Western™ Protein Simple®.Os ensaios Simple Western™ são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Rustandi et al.Qualitative and quantitative evaluation of Simon™, a new CE- based automated Western blot system as applied to vaccine development. Electroforese. 2012 setembro; 33(17):2790-7). Produtos Simple Western™ também estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, ProteinSimple®, Santa Clara, CA).
[00125] Para a prática de qualquer um dos métodos de diagnóstico e/ou prognóstico aqui descritos, umaamostra biológica (por exemplo, uma amostra de fluido biológico tal como uma amostra de plasma ou uma amostra de soro) pode ser obtida a partir de um indivíduo candidato (por exemplo, um paciente humano candidato) para medir o nível de HMWK clivado. Um indivíduo pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano. Mamíferos não-humanos incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda, animais de esporte, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos. Um indivíduo humano pode ser um paciente humano suspeito de ter uma doença autoimune, como aquelas aqui descritas, por exemplo, AR, CD ou UC.
[00126] Aamostra biológica obtida a partir do indivíduo pode ser uma amostra de tecido ou de fluido. Exemplos de amostras de fluido incluem, mas não estão limitados a, saliva, sangue, plasma, soro e urina. Em algumas modalidades, aamostra biológica do indivíduo compreende leucócitos, por exemplo, uma amostra de sangue. Aamostra biológica pode ser obtida a partir do paciente utilizando qualquer método conhecido pelo versado na técnica, por exemplo, punção venosa, biópsia, ou um cotonete. Antes da análise, um inibidor de protease ou um coquetel inibidor de protease pode ser adicionadoàamostra biológica para inibir a clivagem do HMWK in vitro. Qualquer inibidor de protease conhecido pelo versado na técnica pode ser utilizado nos métodos aqui descritos.
[00127] O nível de HMWK clivado pode ser medido por qualquer ensaio adequado conhecido pelo versado na técnica (ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. A tecnologia de microarranjos é descrita nos Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, ou Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., eds., John Wiley &Sons, Inc., Nova Iorque).
[00128] Em algumas modalidades, o nível da proteína de HMWK clivado na amostra é medida. Os ensaios para a detecção de níveis de proteína de HMWK clivados incluem, mas não estão limitados a, imunoensaios (também aqui referidos de base imunológica ou ensaios de base imunológica, por exemplo, Western blot, imunohistoquímica e ensaios ELISA), espectrometria de massa, e ensaios multiplex baseado em grânulos. Tais ensaios para a detecção do nível de proteína são conhecidos no estado da técnica.
[00129] Em alguns exemplos, o nível de HMWK clivado é medido por um ensaio de Western blot, o qual pode envolver a detecção LiCor tal como aqui descrito. Em outros exemplos, o nível de proteína de HMWK clivado é medido por um ensaio de imuno-histoquímica, o qual pode envolver um parceiro de ligação, como um anticorpo, o qual se liga especificamente ao HMWK clivado ou se liga especificamente ao HMWK clivado e não clivado.
[00130] Parceiros de ligação para a detecção de proteína podem ser configurados usando métodos conhecidos no estado da técnica e como aqui descritos. Em algumas modalidades, os parceiros de ligação de proteína de HMWK, por exemplo, anticorpos de HMWK anti-clivados, se ligama uma parte ou integralmente à sequência de aminoácidos da proteína de HMWK. Outros exemplos de métodos de detecção e de quantificação de proteína incluem imunoensaios multiplex como descrito, por exemplo, na Patente dos US N°s. 6.939.720 e 8.148.171, e no Pedido de Patente US publicado No. 2008/0255766, e micro-arranjosde proteínas, como descrito, por exemplo, no Pedido de Patente US publicadoN° 2009/0.088.329. Qualquer parceiro de ligação adequado para o HMWK clivado é contemplado para a detecção de um nível HMWK clivado. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação é qualquer molécula que se liga especificamente a uma proteína de HMWK ou a uma proteína de HMWK clivado. Tal parceiro de ligação pode se ligarà versão clivada do HMWK (por exemplo, o HMWK clivado) com afinidade muito mais elevada, em comparação com a sua ligação ao HMWK não clivado. Em alguns casos, o parceiro de ligação como um anticorpo pode se ligar apenas à versão de HMWK clivado.
[00131] O anticorpo a ser utilizado no método aqui descrito pode estar em qualquer forma, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo de comprimento total ou um dos seus fragmentos de ligação ao antigênico, tais como Fab, F(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab e sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, scFv ou fragmentos dAb. Os métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos pelo versado na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". (2a Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nova Iorque, (1990), e Roitt et al., "Immunology" (2a Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), WO2006/040153, WO2006/122786 e WO2003/002609). Ver também as descrições aqui.
[00132] Em outras modalidades, os parceiros de ligação utilizados para medir o nível de HMWK clivado podem ser moléculas de peptídeos não-anticorpos ou aptâmeros que se ligam especificamente ao HMWK clivado. Métodos para produzir moléculas de peptídeos e aptâmeros são também conhecidos pelo versado na técnica (ver, por exemplo, publicação do Pedido de Patente US No. 2009/0075834, Patentes US Nos. 7.435.542, 7.807.351, e 7.239.742).
[00133] Uma vez que o nível do HMWK clivado em uma amostra biológica obtida de um indivíduo candidato é determinado, ele pode ser comparado com um nível de controle para determinar se o indivíduo tem, está em risco de desenvolver ou suspeito de ter uma doença autoimune, como AR, CD ou UC.
[00134] Em algumas modalidades, o nível de controle é um nível de HMWK clivado em uma amostra de controle, como uma célula, tecido ou fluido obtido a partir de um indivíduosaudável ou de uma população de indivíduos saudáveis, os quais, preferencialmente, são da mesma espécie que o indivíduo candidato. Como é aqui usado, um indivíduo saudável é um assunto que é aparentemente livre da doença alvo (por exemplo, AR, CD ou UC) no momento em que o nível HMWK é medido ou não tem antecedentes da doença.
[00135] Em algumas modalidades, um nível de controle é um nível de HMWK clivado que é indetectável ou abaixo de um nível de base/ ruído obtido utilizando um método padrão de detecção (por exemplo, Western blot ou imuno-histoquímica). Preferencialmente, o método padrão de detecção é o mesmo método utilizado para medir o nível de HMWK clivado na amostra do indivíduo candidato.
[00136] O nível de controle também pode ser de um nível predeterminado. Um tal nível predeterminado pode representar o nível do HMWK clivado em uma população de indivíduos que não têm ou não estão em risco de desenvolver uma doença autoimune como aqui descrita. O nível predeterminado pode ter uma variedade de formas. Por exemplo, pode ser um único valor residual final, como uma mediana ou média. Em algumas modalidades, um tal nível predeterminado pode ser estabelecido com base em grupos comparativos, como onde um grupo definido é conhecido por ter uma doença autoimune alvo (por exemplo, AR, UC ou CD) e outro grupo definido é conhecido por não ter a doença autoimunealvo. Alternativamente, o nível predeterminado pode ser um intervalo, por exemplo, um intervalo que representa os níveis de HWMK clivado em uma população de controle dentro de um percentil predeterminado.
[00137] O nível predeterminado pode depender da população particular selecionada. Por exemplo, um indivíduo aparentemente saudável (sem doença detectável ou sem antecedentes de uma doença autoimune alvo como AR, CD ou UC) terá uma faixa 'normal' diferente de HMWK clivado do que uma população terá, cujos membros têm ou estão em risco de ter a doença autoimune alvo, a qual pode estar em remissão. Por conseguinte, os níveis predeterminadosselecionados podem levar em consideração a categoria, na qual um indivíduo se encontra. Faixas apropriadas e categorias podem ser selecionadas com não mais do que a experimentação de rotina pelos versados na técnica.
[00138] O nível de controle como aqui descrito pode ser determinado pela tecnologia de rotina. Em alguns exemplos, o nível de controle pode ser obtido por meio da realização de um método convencional (por exemplo, o mesmo ensaio para a obtenção do nível de HMWK clivado em uma amostra de ensaio como aqui descrito) em uma amostra de controle, como também aqui descrito. Em outros exemplos, os níveis de HMWK clivado podem ser obtidos a partir de membros de uma população de controle e os resultados podem ser analisados por, por exemplo, um programa computacional, a fim de se obter o nível de controle (de um nível predeterminado) que representa o nível de HWMK clivado na população de controle.
[00139] Ao comparar o nível de HMWK clivado de uma amostra obtida a partir de um indivíduo candidato em relação ao nível de controle, como aqui descrito, pode-se determinar, se o indivíduo candidato tem ou está em risco de desenvolver uma doença autoimune alvo. Por exemplo, se o nível de HMWK clivado do indivíduo candidato se desvia do nível de controle (por exemplo, de forma elevada ou reduzida, em comparação com o nível de controle), o indivíduo candidato pode ser identificado como tendo ou em risco de ter a doença autoimune alvo.
[00140] Como aqui utilizado, "um elevado nível ou um nível acima de umcontrole" significa que o nível de HMWK clivado é mais elevado do que um nível de controle, como um limiar predeterminado ou um nível de HMWK clivado em uma amostra de controle. Níveis de controle são descritos em detalhe aqui. Um nível elevado de HMWK clivado inclui um nível HMWK clivado que é, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais acima de um nível de controle. Um nível elevado de HMWK clivado também inclui o aumento de um fenômeno de um estado zero (por exemplo, nenhum HMWK clivado ou indetectável em um controle) para um estado não-zero (por exemplo, alguns HMWK clivados ou HMWK clivadodetectável em uma amostra).
[00141] Como aqui utilizado, "uma diminuição do nível ou um nível abaixo de um controle" significa que o nível de HMWK clivado é menor do que um nível de controle, como um limiar predeterminado ou um nível de HMWK clivado em uma amostra de controle. Níveis de controle são descritos em detalhe aqui. Uma diminuição do nível de HMWK clivado inclui um nível HMWK clivado que é, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais inferior a um nível de controle. Uma diminuição do nível de HMWK clivado também inclui um fenômeno decrescente a partir de um estado não- zero (por exemplo, alguns HMWK clivados ou HMWK clivadodetectável em uma amostra) para um estado zero (por exemplo, nenhum HMWK clivado ou indetectável em um controle).
[00142] Em algumas modalidades, se um nível elevado (por exemplo, pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%) de HMWK clivado é observado em uma amostra biológica obtida de um paciente candidato com AR, aquele candidato é diagnosticado como tendo ou em risco de surgirAR. Se um nível moderado (por exemplo, cerca de 10 a 30%) de HMWK clivado é observado em uma amostra biológica obtida de um pacientecandidato com UC ou CD, aquele candidato é diagnosticado como tendo ou em risco de ter UC ou CD.
[00143] Ademais, o nível de HMWK clivado pode ser utilizado como um biomarcador para monitorar o desenvolvimento de uma doença autoimune, como AR, UC e CD. Por exemplo, pelo menos duas amostras biológicas (por exemplo, amostras de soro ou plasma) podem ser obtidas a partir de um indivíduo humano tendo ou em risco de desenvolver uma doença autoimune alvo, como AR, UC ou CD, em momentos distintos. Em alguns exemplos, a segunda amostra biológica pode ser obtida em pelo menos um mês (por exemplo, 3 meses, 6 meses, 9 meses ou 12 meses) após a primeira amostra biológica é obtida. Os níveis de HMWK clivado podem ser medidos em pelo menos duas amostras biológicas. Se o nível de HMWK clivado é elevado ao longo do tempo (por exemplo, o nível de HMWK clivado em uma amostra biológica obtida depois é mais elevado do que em uma amostra biológicaanteriormente obtida, por exemplo, empelo menos 20%, 50%, 70%, 90%, 1 vez, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes), é indicada a evolução da doença no indivíduo (por exemplo, tendo um maior risco de desenvolver a doença autoimune ou a doença autoimuneagrava no indivíduo).
[00144] Além disso, o nível de HMWK clivado também pode ser utilizado como um biomarcador para avaliar a capacidade de resposta de um indivíduo para um tratamento anti-autoimune, por exemplo, os tratamentos aqui descritos. Por exemplo, múltiplas amostras biológicas podem ser obtidas a partir de um paciente humano submetido a um tratamento durante o curso do tratamento e os níveis de HMWK clivado podem ser medidosconforme a tecnologia de rotina, como as aqui descritas. Se o nível de HMWK clivado em um paciente humano submetido a um tratamento permanece diminuindo ao longo do decurso do tratamento (por exemplo, o nível de HMWK clivado em uma amostra biológica obtida posteriormente é menor do que em uma amostra biológica anteriormente obtida, por exemplo, por pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes), isso indica que o paciente humano reage ao tratamento. Por outro lado, se o nível de HMWK clivado permanece substancialmente o mesmo ao longo do decurso do tratamento (por exemplo, o nível de HMWK clivado em uma amostra biológica obtida posteriormente é substancialmente idêntico ou diminui em menos de 20%, por exemplo, 15%, 10%, ou 5% em relação à de uma amostra biológica obtida anteriormente), isso indica que o paciente humano não reage ao tratamento.
[00145] Quando um indivíduo é identificado como tendo, ou em risco de ter uma doença autoimune (por exemplo, AR, UC ou CD) por qualquer um dos métodos aqui descritos, um tratamento adequado pode ser executado para tratar a doença. Em alguns exemplos, o indivíduo pode ser tratado por um ou mais inibidores de pKal como aqui descrito. Quando um indivíduo é determinado como não reagente a um tratamento por qualquer dos métodos aqui descritos, uma dose e/ou frequência mais elevada da dosagem de um agente terapêutico (por exemplo, um inibidor de pKal) pode ser administrada ao indivíduo. Alternativamente, o indivíduo pode mudar para um tratamento diferente. Por outro lado, a dosagem ou a frequência da dosagem do agente terapêutico é mantida, reduzida ou interrompida em um indivíduo identificado como reagente ao tratamento ou quando não há necessidade de tratamento subsequente.
II. Tratamento de doenças autoimunes
[00146] São aqui também descritos métodos para o tratamento de doenças associadas com o sistema calicreína plasmática (pKal), incluindo, mas não se limitando a, edema diabético macular, proliferação da retina, trauma cerebral, lesão aguda da medula espinal, amiloidose localizada, doenças autoimunes, como a psoríase, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide, vasculite, nefrite do lúpus eritematoso sistêmico, mastocitose sistêmica, queimaduras graves e a dor neuropática (diabética e neuralgia pós-herpética). Tais métodos compreendem a administração a um indivíduo em necessidade do tratamento (por exemplo, um paciente humano tendo ou em risco de desenvolver a doença) de uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de calicreína por meio de uma via adequada.
(A) Calicreína plasmática
[00147] Exemplos de sequências de calicreína plasmática, com as quais as proteínas de ligação de calicreína plasmática podem ser desenvolvidas, podem incluir sequências de aminoácidosde calicreína plasmáticade humanos, camundongos ou ratos, uma sequência que é 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma dessas sequências ou um fragmento deste, por exemplo, de uma sequência fornecida abaixo.
[00148] A sequência de calicreína plasmática humana que foi utilizada em seleções e na triagem subsequente de proteínas de ligação é mostrada abaixo (número de registro NP_000883.2). A calicreína plasmática humana (86 kDa) que foi usada foi purificada a partir do plasma humano e ativada com o Fator Xlla por um fornecedor comercial. O Fator Xlla ativa apré-calicreína por clivagem da sequência de polipeptídeo em um único local (entre Arg371-I1e372, local de clivagem marcado por "/" na sequência a seguir) para gerar calicreína plasmática ativa, a qual, em seguida, consiste em dois polipeptídeos ligados por dissulfureto; uma cadeia pesada de cerca de 52 kDa e um domínio catalítico de cerca de 34 kDa [Colman e Schmaier, (1997) "Contact System: A Vascular Biology Modulator With Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes" Blood, 90, 3819-3843].
[00149] As sequências de aminoácidos de pré-calicreína a partir de humano, camundongo, rato, e as sequências de mRNA que codifica o mesmo, encontram-se ilustradas abaixo. As sequências de pré-calicreína são as mesmas que a calicreína plasmática, exceto pelo fato de que a calicreína plasmática ativa (pkal) possui uma cadeia simples de polipeptídeo clivada em uma posição simples (indicada por “/”) para gerar duas cadeias. As sequências fornecidas a seguir são sequências completas que incluem as sequências de sinal. Por secreção, a partir da célula que expressa, espera-se que as sequências de sinais sejam removidas.
[00150] Exemplos de proteínas de calicreína plasmática de várias espécies podem ser encontradas no GenBank com os números de registro NP_000883.2 (proteína pKal humana), NM_000892 (mRNApKal humano), NP_032481.1 (proteína pKal de camundongo), NM_008455.2 (mRNApKal de camundongo), NP_036857.2 (proteína pKal de rato) e NM_012725 (mRNApKal de rato).
(B) Os inibidores de calicreína
[00151] Inibidores de Domínio de Kunitz. Um certo número de inibidores úteis de calicreína, tecido e/ou calicreína plasmática, incluem um domínio de Kunitz. Exemplos de inibidores de domínio de Kunitz são descritos no Pedido de Patente US Publicação US20100183625, o qual é aqui incorporado por referência.
[00152] Como aqui utilizado, um "domínio de Kunitz" é um domínio de polipeptídeo que possui pelo menos 51 aminoácidos e que contém pelo menos dois, e preferencialmente três, dissulfetos. O domínio é dobrado, de tal modo que a primeira e a sexta cisteína, a segunda e quarta, e a terceira e quinta cisteína formam ligações de dissulfetos (por exemplo, em um domínio de Kunitz possuindo 58 aminoácidos, as cisteínas podem estar presentes em posições correspondentes aos aminoácidos 5, 14, 30, 38, 51, e 55, de acordo com o número de sequências homólogas de BPTI fornecidas abaixo, e dissulfetos podem formar entre as cisteínas na posição 5 e 55, 14 e 38, e 30 e 51), ou, se dois dissulfetos estão presentes, eles podem formar entre um subconjunto correspondente de cisteínas dos mesmos. O espaçamento entre as respectivas cisteínas pode ser dentro de 7, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 aminoácidos do seguinte espaçamento entre as posições correspondentes a: 5 a 55, 14 a 38, e 30 a 51, de acordo com a numeração da sequência de BPTI fornecida abaixo. A sequência de BPTI pode ser usado como uma referência para se referir a posições específicas em qualquer domínio de Kunitz genérico. Comparação de um domínio de Kunitz de interesse em relação ao BPTI pode ser executada por meio da identificação do melhor alinhamento de ajuste, em que o número de cisteínas alinhadas é maximizado.
[00153] A estrutura 3D (em resolução elevada) do domínio de Kunitz do BPTI é conhecida. Uma das estruturas de raios-X está depositada no Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". A estrutura 3D de alguns homólogos de BPTI (Eigenbrot et al, (1990) Protein Engineering, 3 (7):591- 598; Hynes et al, (1990) Biochemistry, 29:10018-10022) são conhecidos. Pelo menos oitenta e uma sequências do domínio de Kunitz são conhecidas. Homólogos humanos conhecidos incluem três domínios de Kunitz de LACI também conhecido como inibidor da via do fator tecidual (TFPI) (Wun et al., (1988) J. Biol Chem. 263 (13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al., (1989) J. Biol Chem, 264(31):18832-18837), dois domínios de Kunitz de Inibidor inter-α-tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol Chem, 263 (34):18104-18107), um domínio de Kunitz de colágeno, três domínios de Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994). PNAS USA, 91:3353-3357), os domínios de Kunitz de fator de crescimento de hepatócitos ativador do inibidor tipo 1, os domínios de Kunitz de fator de crescimento de hepatócitos ativador do tipo inibidor 2, os domínios de Kunitz descritos na Publicação de Patente US No: 20040152633. O LACI é um fosfoglicoproteínade soro humano com um peso molecular de 39 kDa contendo três domínios de Kunitz.
[00154] Os domínios de Kunitz acima são referidos como LACI- K1 (resíduos de 50 a 107), LACI-K2 (resíduos de 121 a 178) e LACI-K3 (de 213 a 270). A sequência de cDNA de LACI é relatada em Wun et al. (J. Biol Chem, 1988, 263(13):6001-6004). Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20) relata estudos de mutação, em que os resíduos de P1 de cada um dos três domínios de Kunitz foram alterados. LACI-K1 inibe o Fator VIIa (F.VIIa), quando F.VIIa está complexado com o fator de tecido e LACI-K2 inibe o Fator Xa.
[00155] As proteínas contendo domínios de Kunitz exemplificativos incluem os seguintes, com números de registroSwiss-Prot em parênteses: A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216), A4_MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241), AMBP_PLEPL (P36992), APP2_HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943), AXP1_ANTAF (P81547), AXP2_ANTAF (P81548), BPT1_BOVIN (P00974), BPT2_BOVIN (P04815), CA17_HUMAN (Q02388), CA36_CHICK (P15989), CA36_HUMAN (P12111), CRPT_BOOMI (P81162), ELAC_MACEU (O62845), ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI_HUMAN (O95925), EPPI_MOUSE (Q9DA01), HTIB_MANSE (P26227), IBP_CARCR (P00993), IBPC_BOVIN (P00976), IBPI_TACTR (P16044), IBPS_BOVIN (P00975), ICS3_BOMMO (P07481), IMAP_DROFU (P11424), IP52_ANESU (P10280), ISC1_BOMMO (P10831), ISC2_BOMMO (P10832), ISH1_STOHE (P31713), ISH2_STOHE (P81129), ISIK_HELPO (P00994), ISP2_GALME (P81906), IVB1_BUNFA (P25660), IVB1_BUNMU (P00987), IVB1_VIPAA (P00991), IVB2_BUNMU (P00989), IVB2_DABRU (P00990), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P00986), IVB3_VIPAA (P00992), IVBB_DENPO (P00983), IVBC_NAJNA (P19859), IVBC_OPHHA (P82966), IVBE_DENPO (P00984), IVBI_DENAN (P00980), IVBI_DENPO (P00979), IVBK_DENAN (P00982), IVBK_DENPO (P00981), IVBT_ERIMA (P24541), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P82968), SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKD1_BOVIN (Q28201), TKD1_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100), AMBP_BOVIN (P00978), AMBP_HUMAN (P02760), AMBP_MERUN (Q62577), AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_MOUSE (Q07456), AMBP_PIG (P04366), AMBP_RAT (Q64240), IATR_HORSE (P04365), IATR_SHEEP (P13371), SPT1_HUMAN (O43278), SPT1_MOUSE (Q9R097), SPT2_HUMAN (O43291), SPT2_MOUSE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_MOUSE (O35536), TFPI_HUMAN (P10646), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE (O54819), TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445), YN81_CAEEL (Q03610)
[00156] Uma variedade de métodos pode ser usada para identificar um domínio de Kunitz a partir de um banco de dados de sequência. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos conhecida de um domínio de Kunitz, uma sequência de consenso, ou um motivo (por exemplo, o ProSite Motif) podem ser comparados com o banco de dados de sequências GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), por exemplo, utilizando BLAST; comparandoo banco de dados Pfam de HMMs (modelo escondido de Markov) (por exemplo, usando os parâmetros padrão para pesquisar Pfam; comparando com o banco de dados SMART; ou comparando com o banco de dados ProDom. Por exemplo, o número de registro Pfam PF00014 de Lançamento de Pfam 9 fornece inúmeros domínios de Kunitz e um HMM para identificar os domínios de Kunitz.Uma descrição do banco de dados Pfam pode ser encontrado em Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405- 420 e uma descrição detalhada de HMMs pode ser encontrada, por exemplo, em Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; e Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314. O banco de dados SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, Heidelberg, DE) de HMMs como descritos em Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95:5857 e Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231.O banco de dados SMART contém domínios identificados pela caracterização com os modelos escondidos de Markov do programa de pesquisa HMM-2 (R. Durbin et al.(1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press). O banco de dados também é anotado e monitorizado. O banco de dados de domínio de proteína ProDom consiste em uma compilação automática de domínios homólogos (Corpet et al. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). As versões atuais do ProDomsão construídas usando pesquisas de PSI-BLAST recursiva (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry23:333- 340) da SWISS-PROT 38 e do banco de dados de proteínasTREMBL. O banco de dados gera automaticamente uma sequência de consenso para cada domínio. Prosite lista o domínio de Kunitz como um motivo e identifica proteínas que incluem um domínio de Kunitz. Ver, por exemplo, Falquet et al. Nucleic Acids Res. 30:235-238 (2002).
[00157] Os domínios de Kunitz interagem com a protease alvo usando, principalmente, os aminoácidos em duas regiões de loop("loops de ligação"). A primeira região do loop é entre cerca de resíduos correspondentes aos aminoácidos de 13 a 20 de BPTI. A segunda região do loop é entre cerca de resíduos correspondentes aos aminoácidos de 31 a 39 de BPTI. Uma biblioteca exemplificativa de domínios de Kunitz varia de uma ou mais posições de aminoácidos na primeira e/ou na segunda região de loop. Posições particularmente úteis para variar, quando rastrear domínios de Kunitz que interagem com a calicreína ou quando selecionar para variantes de afinidade melhoradas, incluem: posições 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34, e 39 com respeito à sequência de BPTI. Pelo menos algumas destas posições são esperadas para estarem em contato estreito com a protease alvo. Também é útil variar as outras posições, por exemplo, posições que são adjacentes às posições acima mencionadas na estrutura tridimensional.
[00158] A "região de estrutura" de um domínio de Kunitz é definida como aqueles resíduos que são uma parte do domínio de Kunitz, mas excluindo especificamente resíduos na primeira e segunda região de loops deligação, isto é, sobre os resíduos que correspondem aos aminoácidos de 13 a 20 de BPTI e de 31 a 39 de BPTI. Por outro lado, os resíduos que não estão no loop deligação podem tolerar uma ampla faixa de substituição de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas e/ou não conservativas).
[00159] Em uma modalidade, estes domínios de Kunitz são formas variantes da estrutura em forma de loop incluindo o domínio de Kunitz 1 da proteína humanadoinibidor dacoagulação associado à lipoproteína (LACI). LACI contém três estruturas internas bem definidas de loop de peptídeoque são domínios de Kunitz paradigma (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Variantes do domínio de Kunitz 1 de LACI aqui descritas foram rastreadas, isoladas e ligadas à calicreína com maior afinidade e especificidade (ver, por exemplo, Patente US Nos. 5.795.865 e 6.057.287). Estes métodos também podem ser aplicados em outras estruturas de domínio de Kunitz para obter outros domínios de Kunitz que interagem com a calicreína, por exemplo, a calicreína plasmática. Moduladores úteis da função de calicreína tipicamente se ligam e/ou inibem a calicreína, como determinado usando as ligações de calicreína e os ensaios de inibição.
[00160] Um polipeptídeo exemplificativo que inclui um domínio de Kunitz que inibe a calicreína plasmática tem ou inclui a sequência de aminoácidos definida pelos aminoácidos de 3 a 60 da SEQ ID NO: 2. Outro polipeptídeo exemplificativo que inclui um domínio de Kunitz que inibe a calicreína plasmática tem ou inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
[00161] Um polipeptídeo exemplificativo inclui a sequência de aminoácidos:
[00162] Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO:1).
[00163] "Xaa" se refere a uma posição em que uma cadeia peptídica, a qual pode ser qualquer uma de um número de diferentes aminoácidos. Em um primeiro exemplo, Xaa pode ser qualquer aminoácido exceto a cisteína. Em outro exemplo, um ou mais dos seguintes se aplicam: Xaa10 pode ser Asp ou Glu; Xaa11 pode ser Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala ou Thr; Xaa13 pode ser Pro, Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys ou Gln; Xaa15 pode ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn ou Gln; Xaa16 pode ser Ala, Gly, Ser, Asp ou Asn; Xaa17 pode ser Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln ou Thr; Xaa18 pode ser His, Leu, Gln ou Ala; Xaa19 pode ser Pro, Gln, Leu, Asn ou Ile; Xaa21 pode ser Trp, Phe, Tyr, His ou Ile; Xaa31 pode ser Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, lie ou Thr; Xaa32 pode ser Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly ou Val; Xaa34 pode ser Ile, Thr, Ser, Vai, Ala, Asn, Gly ou Leu; Xaa35 pode ser Tyr, Trp ou Phe; Xaa39 pode ser Glu, Gly, Ala, Ser ou Asp. Os aminoácidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 e Xaa54 podem ser qualquer aminoácido.
[00164] Além disso, cada um dos primeiros quatro (Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4) e pelo menos três (9Xaa56, Xaa57 ou Xaa58) aminoácidos da SEQ ID NO: 1 podem, opcionalmente, estar presentes ou ausentes e podem ser qualquer aminoácido, se estiver presente, por exemplo, qualquer aminoácido não cisteína.
[00165] Em uma modalidade, o polipeptídeo tem uma sequência com uma ou mais das seguintes propriedades: Xaa11 pode ser Asp, Gly, Ser ou Val; Xaa13 pode ser Pro, Arg, His ou Asn; Xaa15 pode ser Arg ou Lys; Xaa16 pode ser Ala ou Gly; Xaa17 pode ser Ala, Asn, Ser ou Ile; Xaa18 pode ser His, Leu ou Gln; Xaa19 pode ser Pro, Gln ou Leu; Xaa21 pode ser Trp ou Phe; Xaa31 é Glu; Xaa32 pode ser Glu ou Gln; Xaa34 pode ser Ile, Thr ou Ser; Xaa35 é Tyr; e Xaa39 pode ser Glu, Gly ou Ala.
[00166] Um polipeptídeo exemplificativo pode incluir os seguintes aminoácidos: Xaa10 é Asp; Xaa11 é Asp; Xaa13 pode ser Pro ou Arg; Xaa15 é Arg; Xaa16 pode ser Ala ou Gly; Xaa17 é Ala; Xaa18 é His; Xaa19 é Pro; Xaa21 é Trp; Xaa31 é Glu; Xaa32 é Glu; Xaa34 pode ser Ile ou Ser; Xaa35 é Tyr; e Xaa39 é Gly.
[00167] Também é possível utilizar porções dos polipeptídeos aqui descritos. Por exemplo, os polipeptídeos podem incluir domínios de ligação para os epítopos específicos de calicreína. Por exemplo, o loop de ligação dos domínios de Kunitz pode ser ciclizado e utilizado isoladamente ou pode ser enxertado em outro domínio, por exemplo, uma estrutura de outro domínio de Kunitz. Também é possível remover um, dois, três, ou quatro aminoácidos do terminal N de uma sequência de aminoácidos aqui descrita, e/ou um, dois, três, quatro ou cinco aminoácidos do terminal C de uma sequência de aminoácidos aqui descrita.
[00168] Exemplos adicionais da sequência incluem aqueles que diferem por pelo menos um aminoácido, mas menos do que sete, seis, cinco, quatro, três ou duas diferenças de aminoácidos em relação à uma sequência de aminoácidos aqui descrita, por exemplo, uma sequência de aminoácidos provida acima. Em uma modalidade, menos do que três, duasou umadiferença existe em um dos loops de ligação. Por exemplo, o primeiro loop de ligação pode não ter diferenças em relação a uma sequência de aminoácidos aqui descrita, por exemplo, uma sequência de aminoácidos fornecida acima. Em outro exemplo, nem o primeiro nem o segundo loop de ligação difere de uma sequência de aminoácidos aqui descrita, por exemplo, uma sequência de aminoácidos fornecida acima.
[00169] Ainda outros polipeptídeos que inibem a calicreína plasmática incluem uma sequência de cerca de 58 aminoácidos de 3 a 60 aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo de PEP-1 tendo a sequência de 60aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Os termos "PEP-1" e "DX88" como aqui utilizado se referem ambos a sequência de 60 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo é diferente da aprotinina, por exemplo, se difere da aprotinina em pelo menos um, dois, três, cinco, dez ou quinze aminoácidos.
[00170] Os polipeptídeos aqui descritos podem ser feitos sinteticamente utilizando qualquer protocolo de síntese de polipeptídeo convencional e equipamento. Por exemplo, a síntese gradual de um polipeptídeo pode ocorrer por remoção de um grupo de proteção ao terminal de amino (N) a partir de um primeiro (isto é, carboxi-terminal) aminoácido, e acoplandoa extremidade carboxilo do próximo aminoácido na sequência do polipeptídeo. Este aminoácido é também adequadamente protegido. O grupo carboxilo do aminoácido de entrada pode ser ativado para reagir com o N-terminal do aminoácido ligado por meio da formação em um grupo reativo, como a formação em uma carbodiimida, um anidrido de ácido simétrico ou em um grupo de "éster ativo", como hidroxibenzotriazol ou pentafluorofenil ésteres. Métodos preferenciais de síntese de peptídeos em fase sólida incluem o método BOC, o qual utiliza tert-butiloxicarbonil como grupo de proteção de amino-I, e o método de FMOC, o qual utiliza 9-fluorenilmetiloxicarbonil para proteger o amino-alfa dos resíduos de aminoácidos. Ambos os métodos são bem conhecidos pelo versado na técnica (Stewart, J. e Young, J., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., São Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky, M. e Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nova Iorque 1984)). Se desejado, os amino-terminal e/ou carboxi-terminal adicionais podem ser configurados na sequência de aminoácido e adicionados durante a síntese polipeptídica.
[00171] Os polipeptídeos também podem ser produzidos utilizando a tecnologia recombinante. Métodos recombinantes podem empregar qualquer um de uma série de células e vetores de expressão correspondentes, incluindo, mas não limitados a vetores de expressão bacterianos, vetores de expressão de levedura, vetores de expressão de baculovírus, vetores de expressão virais de mamífero, e semelhantes. Um polipeptídeo aqui descrito pode ser produzido por um animal transgênico, por exemplo, na glândula mamaria de um animal transgênico. Em alguns casos, pode ser necessário ou vantajoso fundir a sequência de codificação para um polipeptídeo que inibe a calicreína (por exemplo, um polipeptídeo que inclui um domínio de Kunitz) para outra sequência de codificação em um vetor de expressão para formar um polipeptídeo de fusão que seja facilmente expressa em uma célula hospedeira. Parte ou toda a sequência adicional pode ser removida, por exemplo, por digestão com protease.
[00172] Um sistema de expressão recombinante exemplificativo para a produção de um polipeptídeoque inibe a calicreína (por exemplo, um polipeptídeoque inclui um domínio de Kunitz) é um vetor de expressão de levedura, o qual permite que uma sequência de ácido nucleíco que codifica a sequência de aminoácidos para o polipeptídeo inibidor seja ligada,no mesmo quadro de leitura, a uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência peptídica líder de pré-processamento MATαde Saccharomyces cerevisiae, a qual por sua vez está sob o controle de um promotor de levedura operacional. O plasmídeo de expressão de levedura recombinante resultante pode ser transformado por meio de métodos convencionaisem células de um hospedeirode levedura compatível e adequado, o qual as células são capazes de expressar a proteína recombinante a partir do vetor de expressão de levedura recombinante. Preferencialmente, uma célula de levedura hospedeira transformada com um tal vetor de expressão recombinante também é capaz de processar a proteína de fusão para fornecer um polipeptídeo inibidor ativo. Um outro hospedeiro de levedura exemplificativo para a produção de polipeptídeos recombinantes é Pichia pastoris.
[00173] Como referido acima, os polipeptídeos que inibem a calicreína podem incluir um polipeptídeo de domínio de Kunitz aqui descrito. Alguns polipeptídeos podem incluir uma sequência de flanqueamento adicionais, preferencialmente de um a seis aminoácidos em comprimento, na extremidadedo amino-terminal e/ou carboxi-terminal, desde que estes aminoácidos adicionais não diminuam significativamente a afinidade de ligação da calicreína ou a atividade de inibição de calicreína, de modo a impedir a utilização nos métodos e composições aqui descritos. Tais aminoácidos adicionais podem ser deliberadamente adicionados para expressar um polipeptídeo em uma célula hospedeira recombinante particular ou podem ser adicionados para proporcionar uma função adicional, por exemplo, para fornecer um liganteà outra molécula ou para fornecer um motivo de afinidade que facilita a purificação do polipeptídeo. Preferencialmente, o(s) aminoácido(s) adicional(is)não inclui(em) a cisteína, a qual poderia interferir com as pontes de dissulfeto do domínio de Kunitz.
[00174] Um polipeptídeo do domínio de Kunitz exemplificativo inclui a sequência de aminoácidos de 3 a 60 resíduos da SEQ ID NO:2. Quando expressos e processados em um sistema de expressão de proteína de fusão de levedura (por exemplo, com base no plasmídeo de expressão de integração de pHIL-D2), um tal polipeptídeo de domínio de Kunitz retém um amino-terminal adicional de dipeptídeo Glu-Ala a partir da fusão com a sequência peptídica líder MAT alfa de pré-processamento de S. cerevisiae. Quando secretado a partir da célula hospedeira de levedura, a maior parte do peptídeo líder é processado a partir da proteína de fusão para se obter um polipeptídeo funcional (aqui referido como "PEP-1") possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
[00175] Um domínio típico de Kunitz, por exemplo, que inclui SEQ ID NO: 1, contém um número de posições invariantes, por exemplo, posições correspondentes à posição 5, 14, 30, 33, 38, 45, 51 e 55 no esquema de numeração de BPTI é a cisteína. O espaçamento entre estas posições podem variar à medida permitida dentro da dobra do domínio de Kunitz, por exemplo, de modo que as três ligações de dissulfeto são formadas. Outras posições como, por exemplo, as posições 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53 e 54, ou as posições correspondentes a estas posições, podem ser qualquer aminoácido (incluindo aminoácidos de ocorrênciacodificados não geneticamente). Em uma modalidade particularmente preferencial, um ou mais aminoácidos correspondem a aquelas de uma sequência nativa. Em uma modalidade, pelo menos uma posição variável é diferente a partir daquelade sequência nativa. Em ainda outra modalidade preferencial, os aminoácidos podem ser cada um desses substituídosindividual ou coletivamente por uma substituição de aminoácidos conservativa ou não conservativa.
[00176] As substituições conservativas de aminoácidos substituem um aminoácido com outro aminoácido de natureza química semelhante e podem não ter efeito sobre a função da proteína. Substituições não conservativas de aminoácidos substituem um aminoácido com outro aminoácido de estrutura química diferente. Exemplos de substituições conservativas de aminoácidos incluem, por exemplo, Asn- >Gln, Arg->Lys e Ser->Thr. Em uma modalidade preferencial, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e/ou 21 destes aminoácidos podem ser selecionadosindependente ou coletivamente, em qualquer combinação, para corresponder à posição correspondente da SEQ ID NO: 2.
[00177] Outras posições, por exemplo, as posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 e 45, ou as posições correspondentes a essas posições podem ser qualquer um de um conjunto selecionado de aminoácidos. Por exemplo, SEQ ID NO:1 define um conjunto de sequências possíveis. Cada membro deste conjunto contém, por exemplo, uma cisteína nas posições 5, 14, 30, 51 e 55, e qualquer um de um conjunto específico de aminoácidos nas posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 e 45, ou posições correspondentes a essas posições. Em uma modalidade preferencial, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e/ou 19 destes aminoácidos podem ser selecionadosindependente ou coletivamente, em qualquer combinação, para corresponder à posição correspondente da SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo tem, preferencialmente, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95, 97, 98, ou 99% de identidade da SEQ ID NO: 2.
[00178] A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de homologia entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferencial, a porcentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos é determinadautilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444-453, o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz BLOSUM62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ainda em uma outra modalidade preferencial, a porcentagem de homologia entre duas sequências de nucleotídeos é determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG, utilizando a NWSgapdna. A matriz CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um conjunto de parâmetros particularmente preferencial(eo que deve ser utilizado, se o praticante está incerto sobre quais parâmetros devem ser aplicados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de homologia) éuma matriz de pontuação BLOSUM62 com uma penalidade paralacunas de 12, uma penalidade para lacunas estendidas de 4, e uma penalidade paralacunas de quadro de leitura 5.
[00179] Inibidores de proteína de ligação. Em outras modalidades, os inibidores de calicreína são proteínas de ligação, tais como anticorpos. Proteínas de ligação exemplificativas como anticorpos estão descritas, por exemplo, na Publicação PCT WO2012/094587 e na Publicação do Pedido de Patente US 20100183625, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[00180] Em um aspecto, a invenção apresenta uma proteína (por exemplo, uma proteína isolada), a qual se liga à calicreína plasmática (por exemplo, calicreína plasmática humana) e inclui pelo menos uma região variável de imunoglobulina. Por exemplo, a proteína inclui uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (HC) de imunoglobulina e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia leve (LC) de imunoglobulina. A proteína pode se ligar e inibir a calicreína plasmática, por exemplo, a calicreína plasmáticahumana.
[00181] A proteína pode incluir uma ou mais das seguintes características: (a) uma CDR humana ou região de estrutura humana; (b) a sequência de domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3), as quais são pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idênticas a uma CDR de um domínio variável de HC aqui descrito; (c) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma ou mais CDRs(por exemplo, 1, 2, ou 3), as quais são pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idênticas a uma CDR de um domínio variável de LC aqui descrito; (d) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina é pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idêntica a um domínio variável de LC aqui descrito (por exemplo, em geral, ou em regiões de estrutura ou CDRs); (e) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina é pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% idêntica a um domínio variável de HC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDRs); (f) a proteína se liga a um epítopo ligado por uma proteína aqui descrita, ou compete para a ligação com uma proteína aqui descrita;(g) uma CDR primata ou região de estrutura primata; (h) a sequência de domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma CDR1 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais de 2 ou 3 aminoácidos da CDR1 de um domínio variável de HC aqui descrito; (i) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma CDR2, que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 aminoácidos da CDR2 de um domínio variável de HC aqui descrito; (j) a sequência de domínio variável de HC de imunoglobulina compreende uma CDR3, que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, ou 6 aminoácidos da CDR3 de um domínio variável de HC aqui descrito; (k) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR1 que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais de 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos da CDR1 de um domínio variável de LC aqui descrito; (l) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR2, que difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3 ou 4 aminoácidos da CDR2 de um domínio variável de LC aqui descrito; (m) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina compreende uma CDR3, que difere em pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos da CDR3 de um domínio variável de LC aqui descrito; (n) a sequência do domínio variável de LC de imunoglobulina difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de um domínio variável de LC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDRs); e (o) a sequência do domínio variável de HC de imunoglobulina difere por pelo menos um aminoácido, mas por não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de um domínio variável de HC aqui descrito (por exemplo, em geral ou em regiões de estrutura ou CDR).
[00182] A proteína de ligação de calicreína plasmática pode ser uma proteína isolada (por exemplo, pelo menos 70, 80, 90, 95, ou 99% livre de outras proteínas). A proteína de ligação de calicreína plasmáticapode inibir a calicreína plasmática, por exemplo, a calicreína plasmáticahumana. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de calicreína plasmáticanão se liga à pré-calicreína (por exemplo, a pré-calicreína humana), mas se liga à forma ativa de calicreína plasmática(por exemplo, a calicreína plasmáticahumana).
[00183] Em certas modalidades, a proteína se liga no ou perto do local ativo do domínio catalítico da calicreína plasmática, ou de um fragmento seu, ou se liga a um epítopo, o qual se sobrepõe com o local ativo da calicreína plasmática. Em alguns aspectos, a proteína se liga ao mesmo epítopo ou compete para a ligação com uma proteína aqui descrita.
[00184] Em algumas modalidades, a proteína se liga ou compete com o mesmo epítopo como M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67- G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04. Ver, por exemplo, a Publicação PCT WO2012/094587 e a Publicação do Pedido de Patente US 20100183625.
[00185] Em algumas modalidades, a proteína se liga a um ou mais aminoácidos que formam a tríade catalítica da calicreína plasmática: His434, Asp483, e/ou Ser578 (numeração baseada na sequência humana).
[00186] Em algumas modalidades, a proteína se liga a um ou mais aminoácidos de Ser479, Tyr563, e/ou Asp585 (numeração baseada na sequência humana).
[00187] A proteína pode se ligar a calicreína plasmática, por exemplo, a calicreína plasmáticahumana, com uma afinidade de ligação de pelo menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 e 1011 M-1. Em uma modalidade, a proteína se liga à calicreína plasmática humana com uma Koff mais lenta do que 1x10-3, 5x10-4s-1, ou 1x10-4s-1. Em uma modalidade, a proteína se liga a calicreína plasmática humana com uma Konmais rápida do que 1x102, 1x103, ou 5x103 M-1s-1. Em uma modalidade, a proteína se liga à calicreína plasmática, mas não se liga à calicreína teciduale/ou a pré-calicreína plasmática, por exemplo, a proteína se liga à calicreína tecidual e/ou à pré- calicreína plasmática menos eficaz, (por exemplo, 5-, 10-, 50-, 100-, ou 1000 vezes menos ou nada, por exemplo, como comparado para um controle negativo) do que se liga à calicreína plasmática.
[00188] Em uma modalidade, a proteína inibe a atividade de calicreína plasmática humana, por exemplo, com um Ki inferior a 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 e 10-10 M. A proteína pode ter, por exemplo, um valor de IC50 inferior a 100 nM, 10 nM ou 1 nM. Por exemplo, a proteína pode modular a atividade de calicreína plasmática, bem como a produção do Fator XIIa (por exemplo, a partir do Fator XII) e/ou a bradicinina (por exemplo, a partir docininogênio com alto peso molecular (HMWK)). A proteína pode inibir a atividade de calicreína plasmática e/ou a produção do Fator XIIa (por exemplo, a partir do Fator XII) e/ou a bradicinina (por exemplo, a partir de cininogênio de alto peso molecular (HMWK)). A afinidade da proteína para a calicreína plasmática humana pode ser caracterizada por um KDde menos do que 100 nm, inferior a 10 nM, ou inferior a 1 nM. Em uma modalidade, a proteína inibe a calicreína plasmática, mas não inibe a calicreína tecidual (por exemplo, a proteína inibe a calicreína tecidualmenos eficaz (por exemplo, 5-, 10-, 50-, 100-, ou 1000 vezes menos ou nada, por exemplo, em comparação com um controle negativo) do que inibe a calicreína plasmática.
[00189] Em algumas modalidades, a proteína tem uma constante de inibição aparente (Ki, app) de menos do que 1000, 500, 100, ou 10 nM.
[00190] As proteínas de ligação de calicreína plasmática podem ser anticorpos. Anticorpos de ligação de calicreína plasmática podem ter as suas sequências de domínio variável de HC e LC incluídas em um único polipeptídeo (por exemplo, scFv) ou em diferentes polipeptídeos (por exemplo, IgG ou Fab).
[00191] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano) possuindo as cadeias leves e/ou pesadas de anticorpos selecionadas a partir do grupo que consiste em M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referido como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referido como DX-2930), X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[00192] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano) tendo um ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3) de cadeia pesadaselecionadas a partir das CDRs correspondentes de um grupo de cadeias pesadas que consistem em M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referida como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115D01, X115-F02, X124-G01 (também aqui referida como DX-2930), X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[00193] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano) tendo um ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3) de cadeia leve selecionadas a partir das CDRs correspondentes do grupo de cadeias leves consistindo de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (também aqui referida como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- F02, X124-G01 (também aqui referida como DX-2930), X115-G04, M29D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[00194] Em uma modalidade preferencial, a proteína é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humano) tendo um ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3) de cadeia pesada e um ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, ou 3) de cadeia leve selecionadas a partir deCDRs correspondentes do grupo de cadeias leves consistindo de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, A01-X101 (também aqui referida como DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- F02, X124-G01 (também aqui referida como DX-2930), X115-G04, M29D09, M145-D11, M06-D09 e M35-G04.
[00195] Em uma modalidade, as sequências de domínio variável de HC e LC são componentes da mesma cadeia de polipeptídeo. Em uma outra, as sequências de domínio variável de HC e LC são componentes de diferentes cadeias polipeptídicas.Por exemplo, a proteína é uma IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. A proteína pode ser um Fab solúvel.
[00196] Em outras implementações, a proteína inclui uma Fab2', scFv, minicorpo, fusão scFv::Fc, fusão Fab::HSA, fusão HSA::Fab, fusão Fab::HSA::Fab, ou outra molécula que compreende o local de combinação de antígenode uma das proteínas de ligação da presente invenção. As regiões VH e VL desses Fab podem ser providos como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGuilado, scFv PEGuilado, Fab2PEGuilado, VH::CH1::HSA + LC, HSA::VH::CH1 + LC, LC::HSA + VH::CH1, HSA::LC + VH::CH1, ou outra construção adequada.
[00197] Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo humano ou humanizado, ou é um não imunogênico em um humano. Por exemplo, a proteína inclui uma ou mais regiões de estrutura de anticorpo humano, por exemplo, todas as regiões de estrutura humana ou regiões de estrutura de pelo menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idênticas as regiões de estrutura humana.Em uma modalidade, a proteína inclui um domínio Fc humano ou um domínio de Fc, o qual é de pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntico a um domínio de Fc humano.
[00198] Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo de primata ou primatizado, ou é um não imunogênico em um humano. Por exemplo, a proteína inclui uma ou mais regiões de estrutura de anticorpo primata, por exemplo, todas as regiões de estrutura de primatas, ou regiões de estrutura pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idênticas as regiões de estrutura primata. Em uma modalidade, a proteína inclui um domínio de Fc primata, ou um domínio de Fc, o qual é pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntico a um domínio de Fc primata. "Primata" inclui seres humanos (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes e Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibões, macacos, lêmures, aie-aies (Daubentonia madagascariensis), e társios.
[00199] Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo de primata para a calicreína plasmática humana é caracterizada por umaKD inferior a 1000, 500, 100 ou 10 nM, por exemplo, inferior a 10 nM ou inferior a 1 nM.
[00200] Em uma modalidade, a proteína inclui as regiões de estrutura humana, ou regiões de estrutura que são pelo menos 95, 96, 97, 98, ou 99% idênticas às regiões de estrutura humana.Em certas modalidades, a proteína não inclui sequências de camundongos ou coelhos (por exemplo, não é um anticorpo de murinae ou coelho).
[00201] Em alguns aspectos, a invenção proporciona a utilização de proteínas (por exemplo, proteínas de ligação, por exemplo, anticorpos) (por exemplo, as proteínas aqui descritas), as quais se ligam a calicreína plasmática (por exemplo, a calicreína plasmática humana) e incluem pelo menos uma região variável de imunoglobulina em métodos para o tratamento de uma doença ou transtorno aqui descrito. Por exemplo, a proteína de ligação de calicreína plasmática inclui uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (HC) de imunoglobulina e uma sequência de domínio variável de cadeia leve (LC) de imunoglobulina. Um certo número de proteínas de ligação exemplificativas de calicreína plasmática são aqui descritas.
[00202] Os anticorpos podem ser descobertos por meio do rastreio de uma biblioteca utilizando uma calicreína alvo, bem como por outros métodos. Por exemplo, a proteína de calicreína ou uma região da mesma pode ser utilizada como um antígeno em um animal não humano, por exemplo, em um roedor. Os anticorpos humanizados podem ser gerados por meio da substituição de sequências da região variável de Fv, as quaisnão estão diretamente envolvidas na ligação de antígeno com sequências equivalentes a partir de regiões variáveis de Fv humano. Os métodos gerais para gerar anticorpos humanizados são fornecidos por Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques. 4:214, e por Queen et al. nas Patentes US Nos. 5.585.089, US 5.693.761 e US 5.693.762. Estes métodos incluem isolar, manipular e expressar as sequências de ácidos nucléicos que codificam a totalidade ou parte das regiões variáveis de Fv de imunoglobulina a partir de pelo menos uma cadeia pesada ou leve. Numerosas fontes de tal ácido nucleíco estão disponíveis. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem ser obtidos a partir de uma hibridoma que produz um anticorpo em relação à um alvo predeterminado, conforme descrito acima. O DNA recombinante que codifica o anticorpo humanizado, ou um fragmento deste, pode então ser clonado em um vetor de expressão apropriado.
[00203] Proteínas de ligação de calicreína de imunoglobulina (por exemplo, proteínas de ligação de calicreína de IgG ou Fab) podem ser modificadas para reduzir a imunogenicidade. A imunogenicidade reduzida é desejável em proteínas de ligação de calicreína destinados a serem utilizados como agentes terapêuticos, uma vez que reduz a possibilidade de que o indivíduo desenvolva uma resposta imunitária contra a molécula terapêutica. Técnicas úteis para reduzir a imunogenicidade de proteínas de ligação de calicreína incluem deleção/alteração de epítopos de células T humanas potenciais e “linha germinal” de sequências fora das CDRs (por exemplo, a estrutura e Fc).
[00204] Um anticorpo de ligação de calicreína pode ser modificado por deleção específica de epítopos de células T humanas ou "desimunização" por meio de métodos descritos em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resumidamente, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo são analisados para peptídeos que se ligam a MHC Classe II; estes peptídeos representam epítopos de células T potenciais (conforme definido nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de epítopos de células T potenciais, uma abordagem de modelagem de computador denominado "filamento peptídico" pode ser aplicado, e, além disso, um banco de dados de peptídeos de ligação humana de MHC classe II pode ser procurado por motivos presentes nas sequências de VH e VL, como descrito em WO 98/52976 e WO 00/34317. Estes motivosse ligam a qualquer um dos 18 alótipos principais DR de MHC classe II e, portanto, constituem os epítopos de células T potenciais. Epítopos de células T potenciais detectados podem ser eliminados por meio da substituição de um pequeno número de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis, ou, preferencialmente, por meio de substituições de um único aminoácido. Tanto quanto possível, são feitas substituições conservativas, frequentemente, mas não exclusivamente, pode ser utilizado um aminoácido comum nesta posição em sequências de anticorpos da linha germinal humana. Sequências de linha germinal humana são divulgadas em Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16 (5):237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817. O diretório V BASE fornece um diretório completo de sequências de região variável de imunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Após as alterações "desimunizantes”serem identificadas, os ácidos nucléicos que codificam para VH e VL podem ser construídos por metagênese ou outros métodos sintéticos (por exemplo, síntese de novo,substituição de cassete, e assim por diante). A sequência variável mutagenizada pode, opcionalmente, ser fundida com uma região constante humana, por exemplo, IgG1 humana ou regiões constantesK.
[00205] Em alguns casos, um epítopo de célula T potencial irá incluir resíduos, os quais são conhecidos ou previstos para serem importantes para a função do anticorpo. Por exemplo, os epítoposde células T potenciais estão geralmente tendenciosos em direção as CDRs. Ademais, os epítopos de células T potenciais podem ocorrer em resíduos de estrutura importantes para a estrutura e a ligação do anticorpo. Alterações para eliminar estes epítopos potenciais vão, em alguns casos, requerer mais análises, por exemplo, fazendo e testando as cadeias com e sem a mudança. Sempre que possível, os epítopos de células T potenciais que sobrepõem as CDRs foram eliminados por substituições fora das CDRs. Em alguns casos, uma alteração dentro de uma CDR é a única opção, e, assim, as variantes com e sem esta substituição devem ser testadas. Em outros casos, a substituição necessária para remover um epítopo de célula T potencial é em uma posição de resíduo dentro da estrutura que pode ser crítica para a ligação do anticorpo. Nestes casos, as variantes com e sem estas substituições devem ser testadas. Assim, em alguns casos, várias regiões variáveis de cadeia pesada e leve de variantes desimunizadas foram concebidas e várias combinações de cadeias pesada/leve testadas, a fim de identificar o anticorpo desimunizado ideal. A escolha do anticorpo desimunizado final pode então ser feita considerando a afinidade de ligação das diferentes variantes em conjunto com a extensão de desimunização, isto é, o número de epítopos de células T potenciais restantes na região variável. A desimunizaçãopode ser usada para modificar qualquer anticorpo, por exemplo, um anticorpo que inclui uma sequência não- humana, por exemplo, um anticorpo sintético, anticorpo de murino, outro anticorpo monoclonal não-humano ou um anticorpo isolado a partir de uma biblioteca de exibição.
[00206] Os anticorpos de ligação de calicreína são "alinhados de forma germinal" por reverter um ou mais aminoácidos não alinhados de forma germinal nas regiões de estruturaemaminoácidos correspondentes da linha germinal do anticorpo, desde que as propriedades de ligação sejam substancialmente retidas. Métodos semelhantes podem também ser utilizados na região constante, por exemplo, nos domínios de imunoglobulina constante.
[00207] Os anticorpos que se ligam a calicreína, por exemplo, um anticorpo aqui descrito, pode ser modificado, a fim de tornar as regiões variáveis do anticorpo mais semelhantes a uma ou mais sequências de linha germinal. Por exemplo, um anticorpo pode incluir um, dois, três, ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, na estrutura, CDR, ou na região constante, para se tornar mais semelhante a uma sequência delinha germinalde referência. Um método exemplificativo de linha germinalpode incluir a identificação de uma ou mais sequências de linha germinalque são semelhantes (por exemplo, mais semelhante em um banco de dados particular) as sequências do anticorpo isolado. As mutações (ao nível dos aminoácidos) são então feitas no anticorpo isolado, de modo incremental ou em combinação com outras mutações. Por exemplo, uma biblioteca de ácido nucleico que inclui sequências que codificam algumas ou todas as possíveis mutações da linha germinal é feita. Os anticorpos mutantes são então avaliados, por exemplo, para identificar um anticorpo que tem um ou mais resíduos adicionais de linha germinal relativa ao anticorpo isolado e que continua a ser útil (por exemplo, tem uma atividade funcional). Em uma modalidade, o maior número possível de resíduos da linha germinalé introduzidoem um anticorpo isolado.
[00208] Em uma modalidade, a metagênese é usada para substituir ou inserir um ou mais resíduos de linha germinal em uma estrutura e/ou na região constante. Por exemplo, um resíduo de estrutura de linha germinal e/ou de região constante pode ser a partir de uma sequência da linha germinal que é semelhante (por exemplo, mais semelhante) a região não variável a ser modificada. Após a metagênese, a atividade (por exemplo, atividades de ligação ou outras atividades funcionais) do anticorpo pode ser avaliada para determinar, se o resíduo da linha germinal ou resíduos são tolerados (isto é, não anulam a atividade). A metagênese semelhante pode ser executada nas regiões de estrutura.
[00209] A seleção de uma sequência de linha germinal pode ser executada de maneiras diferentes. Por exemplo, uma sequência de linha germinal pode ser selecionada, se satisfaz um critério predeterminado para a seletividade ou semelhança, por exemplo, pelo menos uma determinada porcentagem de identidade, por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5% de identidade. A seleção pode ser executada utilizando pelo menos 2, 3, 5, ou 10 sequências da linha germinal. No caso de CDR1 e CDR2, identificaruma sequência de linha germinal semelhante pode incluir selecionar uma tal sequência. No caso da CDR3, identificar uma sequência de linha germinal semelhante pode incluir selecionar uma tal sequência, mas pode incluir o uso de duas sequências de linha germinal que contribuem separadamente para a porção aminoterminal e a porção carboxi-terminal. Em outras implementações, mais do que uma ou duas sequências de linha germinal são utilizadas, por exemplo, para formar uma sequência de consenso.
[00210] Em uma modalidade, no que diz respeito a uma sequência de domínio variável de referência particular, por exemplo, uma sequência aqui descrita, uma sequência de domínio variável relativa tem pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% das posições de aminoácidos de CDR, as quais não são idênticas aos resíduos nas sequências de CDRde referência, os resíduos que são idênticos aos resíduos nas posições correspondentes em uma sequência de linha germinal humana (isto é, uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico da linha germinal humana).
[00211] Em uma modalidade, no que diz respeito a uma sequência de domínio variável de referência particular, por exemplo, uma sequência aqui descrita, uma sequência de domínio variável relativa tem pelo menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% das regiões de FR idênticas à sequênciade FR a partir de uma sequência delinha germinal humana, por exemplo, uma sequência de linha germinalrelativa a sequência de domínio variável de referência.
[00212] Deste modo, é possível isolar um anticorpo que possui uma atividade semelhante a um determinado anticorpo de interesse, mas é mais semelhante a uma ou mais sequências de linha germinal, particularmente uma ou mais sequências de linha germinal humana. Por exemplo, um anticorpo pode ser pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5% idêntica a uma sequência de linha germinal em uma região fora das CDRs (por exemplo, nas regiões de estrutura). Ademais, um anticorpo pode incluir pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de linha germinal em uma região CDR, sendo o resíduo de linha germinala partir de uma sequência de linha germinal de semelhante (por exemplo, mais semelhante) para a região variável a ser modificado. As sequências de linha germinal de interesse primário são sequências de linha germinal humana. A atividade do anticorpo (por exemplo, a atividade de ligação, conforme medido por KA) pode estar dentro de um fator ou 100, 10, 5, 2, 0,5, 0,1, e 0,001 do anticorpo original.
[00213] As sequências de linha germinal de genes de imunoglobulina humana foram determinadas e estão disponíveis a partir de várias fontes, incluindo o Sistema Internacional de Informação de Imunogenética (IMGT), disponível através da world wide web em imgt.cines.fr, eo diretório V BASE (compilado por Tomlinson, IA et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido, disponível através da world wide webem vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).
[00214] As sequências de referência de linha germinal exemplificativas para Vkappa incluem: O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10 e A14. Ver, por exemplo, Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14 (18):4628-3.
[00215] Uma sequência de referência de linha germinal para o domínio variável de HC pode ser baseada em uma sequência que tem estruturas canônicas particulares, por exemplo, estruturas de 1 a 3 em H1 e H2 de loops hipervariáveis. As estruturas canônicas dos loops hipervariáveis de um domínio variável de imunoglobulina podem ser inferidas a partir da sua sequência, tal como descrito em Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); e Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Sequências exemplificativas com uma estrutura de 1 a 3 incluem: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP- 35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53 e DP -54.
[00216] Polipeptídeos úteis também podem ser codificados por um ácido nucleíco que hibrida com um ácido nucleíco que codifica um polipeptídeo aqui descrito. Os ácidos nucléicos podem hibridar sob condições com estringência baixa, média, elevada, ou muito elevada. Como aqui utilizado, o termo "hibridar sob condições com estringência baixa, média, elevada, ou muito elevada" descreve as condições de hibridação e lavagem. Orientações para a execução de reações de hibridação podem ser encontradas em Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, em que são incorporadas por referência. Métodos aquosos e não aquosos são descritos na referência e qualquer um deles pode ser utilizado. As condições específicas de hibridação aqui referidas são as seguintes: (1) condições de hibridação com baixa estringência em cloreto de sódio/citrato de sódio 6x (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por duas lavagens em SSC 0,2X, 0,1% de SDS a pelo menos 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser elevada até 55 °C para as condições com baixa estringência); (2) condições de hibridação com média estringência em SSC 6X a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2X, 0,1% de SDS a 60 °C; (3) condições de hibridação com elevada estringência em SSC 6X a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2X, 0,1% de SDS a 65 °C; e (4) condições de hibridação com estringência muito elevada são 0,5 M de fosfato de sódio, 7% de SDS a 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2X, 1% de SDS a 65 °C.
[00217] Produção de proteínas. Métodos padrões de ácidos nucléicos recombinantes podem ser utilizados para expressar uma proteína que se liga a calicreína plasmática. Geralmente, uma sequência de ácido nucleíco que codifica a proteína é clonada em um vetor de expressão de ácido nucleíco. Evidentemente, se a proteína inclui múltiplas cadeias polipeptídicas, cada uma das cadeias pode ser clonada em um vetor de expressão, por exemplo, os mesmos ou diferentes vetores, que são expressos nas células iguais ou diferentes.
[00218] Produção de anticorpos. Alguns anticorpos, por exemplo, Fab, podem ser produzidos em células bacterianas, por exemplo, células de E. coli. Por exemplo, se o Fab é codificado por sequências em um vetor de phage display que inclui um codão de terminação reprimível entre a entidade de exibição e uma proteína do bacteriófago (ou seu fragmento), o ácido nucleíco de vetor pode ser transferido em uma célula bacteriana que não é pode suprimir um codão de terminação. Neste caso, o Fab não é fundido à proteína do gene III e é segregada no periplasma e/ou no meio circundante.
[00219] Os anticorpos também podem ser produzidos em células eucarióticas. Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, scFv) são expressos em uma célula de levedura, tais como Pichia (ver, por exemplo, Powers et al., 2001, J. Immunol. Methods. 251:123-35), Hanseula, ou Saccharomyces.
[00220] Em uma modalidade preferencial, os anticorpos são produzidos em células de mamífero. As células hospedeiras de mamífero preferenciais para expressar os anticorpos clones ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufman e Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de linhagem linfocítica, por exemplo, células de mieloma NS0 e células SP2, células COS, células HEK293T (J. Immunol. Methods. (2004) 289 (1-2):65-80), e uma célula a partir de um animal transgênico, por exemplo, um mamífero transgênico. Por exemplo, a célula é uma célula epitelial mamaria.
[00221] Em adição à sequência de ácido nucleíco que codifica o domínio de imunoglobulina diversificada, os vetores de expressão recombinantes podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras, nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patente dos US N°s. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira, na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferenciais incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para a utilização em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).
[00222] Em um sistema exemplificativo para a expressão recombinante de um anticorpo, ou de uma porção de ligação ao antígeno deste mesmo, umvetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO-dhfr por transfecção mediada por fosfato decálcio. No vetor de expressão recombinante, os genes de cadeia leve e pesada de anticorpo são cada um deles ligado operacionalmente a elementos reguladores intensificadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus e semelhantes, tais como um elemento regulador intensificador de CMV/intensificadores de AdMLP ou umelemento regulador intensificador de SV40/intensificadores de AdMLP) para conduzir elevados níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, o qual permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão de cadeias pesadas e leves de anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. As técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar células hospedeiras, selecionar os transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Por exemplo, alguns anticorpos podem ser isolados por meio da cromatografia de afinidade com uma matriz acoplada à proteína A ou proteína G.
[00223] Para os anticorpos que incluem um domínio de Fc, o sistema de produção de anticorpos pode produzir anticorpos, em que a região Fc é glicosilada. Por exemplo, o domínio Fc de moléculas de IgG é glicosilada na asparagina 297 no domínio CH2. Este asparagina é o local para modificação com oligossacarídeos do tipo biantenária. Tem sido demonstrado que esta glicosilação é necessária para as funções efetoras mediadas por receptores Fcg e complemento C1q (Burton e Woof, 1992, Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). Em uma modalidade, o domínio Fc é produzido em um sistema de expressão de mamífero, o qual glicosila adequadamente o resíduo correspondente em asparagina 297. O domínio Fc pode também incluir outras modificações pós-translacional eucarióticas.
[00224] Os anticorpos também podem ser produzidos por um animal transgênico. Por exemplo, na Patente US. No. 5.849.992 descreve um método de expressar um anticorpo na glândula mamária de um mamífero transgênico. Um transgene é construído, o qual inclui um intensificador específico do leite e ácidos nucléicos que codificam o anticorpo de interesse e uma sequência de sinal para secreção. O leite produzido por fêmeas de tais mamíferos transgênicos inclui, segregado nele, o anticorpo de interesse. O anticorpo pode ser purificado a partir do leite, ou para algumas aplicações, usado diretamente.
[00225] (C) Modificações
[00226] É possível modificar os polipeptídeos que inibem a calicreína em uma variedade de maneiras. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser anexados a uma ou mais porções de polietilenoglicol para estabilizar o composto ou para prolongar os tempos de retenção, por exemplo, em, pelo menos, 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 50, 100, 500 ou 1000 vezes.
[00227] Em uma modalidade, uma proteína de ligação de calicreína é fisicamente associada com uma porção, a qual aumenta a sua estabilização e/ou retenção em circulação, por exemplo, no sangue, soro, linfa, ou em outros tecidos, por exemplo, em, pelo menos, 1,5, 2, 5, 10, ou 50 vezes. Por exemplo, uma proteína de ligação de calicreína pode ser associada com um polímero, por exemplo, um polímero substancialmente não antigênico, tal como um óxido de polialquileno ou óxido de polietileno. Polímeros apropriados irão variar substancialmente em peso. Os polímeros com pesos médios de número molecular variam desde cerca de 200 a cerca de 35.000 (ou cerca de 1.000 a cerca de 15.000, e de 2.000 a cerca de 12.500) podem ser usados. Por exemplo, uma proteína de ligação de calicreína pode ser conjugadacom um polímero solúvel em água, por exemplo, polímeros de polivinilo hidrófilos, por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. Uma pluralidade de porções de polímero pode ser anexada a um polipeptídeo, por exemplo, pelo menos duas, três, ou quatro de tais porções, por exemplo, possuindo um peso molecular médio de cerca de 2.000 a 7.000 Daltons. Uma lista não limitativa desses polímeros inclui homopolímeros de óxido de polialquileno tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropileno glicóis, polióis polioxietilenados, os copolímeros e seus copolímeros de bloco destes, desde que a solubilidade na água dos copolímeros de bloco seja mantida.
[00228] Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado com um polímero solúvel em água, por exemplo, um polímero de polivinilo hidrófilo, por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. Uma lista não limitativa desses polímeros inclui homopolímeros de óxido de polialquileno, tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropileno glicóis, polióis polioxietilenados, seus copolímeros e os copolímeros de bloco destes, desde que a solubilidade na água dos copolímeros de bloco seja mantida. Polímeros úteis adicionais incluem os polioxialquilenos, tais como polioxietileno, polioxipropileno e copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbômeros; polissacáridos ramificados ou não ramificados que compreendem os monômeros de sacarídeos D-manose, De L-galactose, fucose, frutose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurônico, ácido siálico, ácido D-galacturônico, ácido D-manurônico (por exemplo, ácido polimanurônico ou ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glicose e ácido neuramínico incluindo homopolissacarídeos e heteropolissacarídeos, tais como lactose, amilopectina, amido, hidroxietilamido, amilose, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicogênio ou a subunidade de polissacarídeo de mucopolissacariídeos ácidos, como ácido hialurônico; polímeros de álcoois de açúcar, tais como polissorbitol e polimanitol; heparina ou heparana.
[00229] É possível que uma ou mais estruturas e/ou resíduos de aminoácido de CDR de uma proteína de ligação inclua uma ou mais mutações (por exemplo, substituições (por exemplo, substituições conservativas ou substituições de aminoácidos não essenciais), inserções ou deleções) em relação à uma proteína de ligação aqui descrita. Uma proteína de ligação de calicreína plasmática pode ter mutações (por exemplo, substituições (por exemplo, substituições conservativasou substituições de aminoácidos não essenciais), inserções ou deleções) (por exemplo, pelo menos uma, duas, três, ou quatro, e/ou menos do que 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou mutações) em relação à uma proteína de ligação aqui descrita, por exemplo, mutações que não têm um efeito significativo sobre a função da proteína. As mutações podem estar presentes em regiões de estrutura, CDRs, e/ou em regiões constantes. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma região de estrutura. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma CDR. Em algumas modalidades, as mutações estão presentes em uma região constante. Seja ou não uma substituição particular tolerada, isto é, que não vai afetar negativamente as propriedades biológicas, tais como a atividade de ligação pode ser projetada, por exemplo, por meio da avaliação caso a mutação é conservativa ou pelo método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.
[00230] Uma proteína de ligação de calicreína também pode estar associada com uma proteína portadora, por exemplo, uma albumina de soro, tais como albumina de soro humano. Por exemplo, uma fusão translacional pode ser utilizada para associar a proteína portadora com a proteína de ligação a calicreína.
(D) Tratar doenças autoimunes associadas com o sistema de calicreína
[00231] Um ou mais dos inibidores de pKal como aqui descritos podem ser utilizados para o tratamento de doenças associadas com o sistema de pKal, incluindo, mas não limitando,o edema macular diabético, proliferação da retina, trauma cerebral, lesão aguda da medula espinhal, amiloidose localizada, doenças autoimunes, tais como psoríase, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide, vasculite, nefrite do lúpus eritematoso sistêmico, mastocitose sistêmica, queimaduras graves e dor neuropática (diabética e neuralgia pós-herpética).
[00232] Um indivíduo que está em risco (por exemplo, um paciente humano) dedesenvolveruma doença autoimune ou outras doenças associadas ao pKal aqui mencionados pode ser, por exemplo, um indivíduo que tem uma doença associada com o desenvolvimento da doença, um indivíduo que tem sido exposto a um fator ambiental associado com o desenvolvimento da doença, um indivíduo que tem um histórico familiar da doença ou um indivíduo que transporta um gene associado com o desenvolvimento da doença.
[00233] Os indivíduos podem ser humanos em necessidade de tratamento para a doença autoimune ou uma das outras doenças associadasao pKal (por exemplo, os seres humanos com a doença ou em risco de desenvolver a doença) ou indivíduos não humanos (por exemplo, um animal cobaia com uma doença autoimune ou um das outras doençasassociadas ao pKal).
[00234] Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo (por exemplo, um paciente humano), o qual está em risco de desenvolveruma doença autoimune, tal como a artrite reumatoide (AR), a doença de Crohn (CD) ou a colite ulcerosa (UC). As doenças autoimunes são doenças causadas por uma resposta imune anormal ao próprio corpo de um indivíduo. A resposta imune anormal pode ser contra um determinado órgão ou tecido, dependendo do tipo de doença autoimune.
[00235] A AR é uma doença inflamatória crônica, a qual afeta geralmente as articulações, tais como as articulações sinoviais das mãos e/ou pés. A resposta inflamatória na ARfrequentemente causa a destruição da cartilagem e a fusão das articulações, o que resulta na perda de função e mobilidade. Os sintomas da AR incluem inchaço nas articulações e/ou articulações quentes, rigidez, nódulos reumatoides, fadiga, febre e perda de peso. Os tratamentos exemplificativos para AR incluem fisioterapia, órteses, analgésicos, antiinflamatórios, esteróides e drogas anti-reumáticas modificadoras da doença (DMARDs).
[00236] A CD é uma doença inflamatória do intestino, a qual pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal. Os sintomas incluem dor abdominal, diarréia, febre, fadiga e perda de peso. Os tratamentos exemplificativos para CD incluem corticosteróides, drogas de ácido 5- aminossalicílico, azatioprina, metotrexato, infliximabe, adalimumabe, certolizumabe, natalizumabe, adaptaçõesalimentares e cirurgia.
[00237] UC é uma doença inflamatória do intestino que normalmente afeta o intestino grosso. Os sintomas incluem diarréia com sangue e/ou contendo muco, perda de peso, anemia, dores abdominais, e sangue no reto. Os tratamentos exemplificativos para UC incluem drogas 5- aminossalicílico, ácido corticosteróides, azatioprina, budesonida, infliximabe, adalimumabe e cirurgia.
(E) Terapia de Combinação
[00238] O inibidor de calicreína plasmática pode ser administrado juntamente com outro agente terapêutico como parte de uma terapia de combinação para uma doença ou transtorno aqui descrito.
[00239] A terapia de combinação com um inibidor de calicreína e outro agente terapêutico pode ser fornecida em diversas configurações diferentes. Em situações em que o inibidor de calicreína é para ser administrado por injeção intra-articular, o inibidor de calicreína e o agente terapêutico podem ser co-administrados como uma única composição, ou eles podem ser administrados por injeções separadas. Em algumas situações, o inibidor de calicreína e o agente terapêutico são administrados em estreita proximidade temporal (por exemplo, um curto intervalo de tempo entre as injeções, como durante a mesma sessão de tratamento), ou, mais amplamente espaçados, dependendo da programação desejada de administração para os dois componentes da terapia de combinação. Quando o inibidor da calicreína é para ser administrado por meio da administração sistêmica (parenteral), o inibidor de calicreína e o agente terapêutico podem ser administrados em estreita proximidade temporal ou mais espaçados, dependendo da programação de dosagem pretendida para os dois componentes da terapia de combinação.
[00240] Em outras modalidades, o inibidor de calicreína pode ser administrado em combinação com outros compostos úteis para o tratamento ou para a prevenção da inflamação que está envolvida nas doenças autoimunes. Agentes antiinflamatórios exemplificativos incluem, por exemplo, esteróides (por exemplo, cortisol, cortisona, fludrocortisona, prednisona, 6[alfa]-metilprednisolona, triamcinolona, betametasona ou dexametasona), fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDS (por exemplo, aspirina, acetaminofeno, tolmetina, ibuprofeno, ácido mefenâmico, piroxicam, nabumetona, o rofecoxib, celecoxib, etodolaco ou de nimesulida). Em uma outra modalidade, o outro agente terapêutico é um antibiótico (por exemplo, vancomicina, penicilina, amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cefixima, rifampinmetronidazol, doxiciclina ou estreptomicina). Em uma outra modalidade, o outro agente terapêutico é um inibidor de PDE4 (por exemplo, roflumilaste ou o rolipram). Em uma outra modalidade, o outro agente terapêutico é um anti-histamínico (por exemplo, ciclizina, hidroxizina, prometazina ou difenidramina).
[00241] Outros exemplos de agentes antiinflamatórios incluem, por exemplo, aceclofenaco, acemetacina, ácido e-acetamidocaproico, acetaminofeno, acetaminosalol, acetanilida, ácido acetilsalicílico, S- adenosilmetionina, alclofenaco, alclometasona, alfentanilo, algestona, alilprodina, alminoprofeno, aloxiprina, alfaprodina, bis (acetilsalicilato) dealumínio, amcinonida, amfenaco, aminoclortenoxazina, ácido 3-amino-4- hidroxibutírico, 2-amino-4-picolina, aminopropilona, aminopirina, amixetrina, salicilato de amônia, ampiroxicam, amtolmetina guacilo, anileridina, antipirina, antrafenina, apazona, beclometasona, bendazaco, benorilato, benoxaprofeno, benzpiperilona, benzidamina, bencilmorfina, bermoprofeno, betametasona, betametasona-17-valerato, bezitramida, [alfa]-bisabolol, bromfenaco, p-bromoacetanilida, ácido acético 5-bromosalicílico, bromosaligenina, bucetina, ácido buclóxico, bucoloma, budesonida, bufexamaco, bumadizona, buprenorfina, butacetina, butibufeno, butorfanol, carbamazepina, carbifeno, carprofeno, carsalam, clorobutanol, cloroprednisona, clortenoxazina, salicilato de colina, cincofeno, cinmetacina, ciramadol, clidanaco, clobetasol, clocortolona, clometacina, clonitazeno, clonixina, clopiraco, cloprednol, cravo, codeína, brometo de metilo de codeína, fosfato de codeína, sulfato de codeína, cortisona, cortivazol, cropropamida, crotetamida e ciclazocina.
[00242] Outros exemplos de agentes antiinflamatórios incluem deflazacort, dehidrotestosterona, desomorfina, desonida, desoximetasona, dexametasona, 21-isonicotinato de dexametasona, dexoxadrol, dextromoramida, dextropropoxifeno, desoxicorticosterona, dezocina, diampromida, diamorfona, diclofenaco, difenamizol, difenpiramida, diflorasona, diflucortolona, diflunisal, difluprednato, di-hidrocodeína, enol acetato de dihidrocodeínona, dihidromorfina, acetilsalicilato dihidroxialumínio, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, diprocetil, dipirona, ditazol, droxicam, emorfazona, ácido enfenamico, enoxolona, epirizol, eptazocina, etersalato, etenzamida, etoheptazina, etoxazeno, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etodolaco, etofenamato, etonitazeno, eugenol, felbinaco, fenbufeno, ácido fenclózico, fendosal, fenoprofeno, fentanilo, fentiazaco, fepradinol, feprazona, floctafenina, fluazacorte, flucloronida, ácido flufenamico, flumetasona, flunisolida, flunixina, flunoxaprofeno, acetonido de fluocinolona, fluocinonida, acetonido de fluocinolona, butilo fluocortina, fluocoitolona, fluoresona, fluorometolona, fluperolona, flupirtina, fluprednideno, fluprednisolona, fluproquazone, flurandrenolida, flurbiprofeno, fluticasona, formocortal e fosfosal.
[00243] Outros exemplos de agentes antiinflamatórios incluem ácido gentísico, glafenina, glucametacina, salicilato de glicol, guaiazuleno, halcinonida, halobetasol, halometasona, haloprednona, heroína, hidrocodona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, succinato de hidrocortisona, hemisuccinato de hidrocortisona, 21-lisinato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hidromorfona, hidroxipetidina, ibufenaco, ibuprofeno, ibuproxam, salicilato de imidazol, indometacina, indoprofeno, isofezolaco, isoflupredona, acetato de isoflupredona, isoladol, isometadona, isonixina, isoxepaco, isoxicam, cetobemidona, cetoprofeno, cetorolaco, p-lactofenetida, lefetamina, levalorfano, levorfanol, levofenacil- moríano, lofentanilo, lonazolaco, lornoxicam, loxoprofeno, acetilsaliciato de lisina, mazipredona, ácido meclofenamico, medrisona, ácido mefenâmico, meloxicam, meperidina, meprednisona, meptazinol, mesalamina, metazocina, metadona, metotrimeprazina, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, metilprednisolona succinato de sódio, suleptnatode metilprednisolona, ácido metiazínico, metofoline, metopon, mofebutazona, mofezolaco, mometasona, morazona, morfina, cloridrato de morfina, sulfato de morfina, salicilato de morfolina e mirofina.
[00244] Outros exemplos de agentes antiinflamatórios incluem nabumetona, nalbufina, nalorfina, salicilato de 1-naftilo, naproxeno, narceína, nefopam, nicomorfina, nifenazona, ácido niflúmico, nimesulida, 5'- nitro-2'-propoxiacetanilida, norlevorfanol, normetadona, normorfina, norpipanona, olsalazina, ópio, oxaceprol, oxametacina, oxaprozina, oxicodona, oximorfona, oxifenbutazona, papaveretum, parametasona, paranilina, parsalmide, pentazocina, perisoxal, fenacetina, fenadoxona, fenazocina, cloridrato de fenazopiridina, fenocol, fenoperidina, fenopirazona, fenomorfano, acetilsaliciato de fenilo, fenilbutazona, salicilato de fenilo, feniramidol, picetoprofeno, piminodina, pipebuzona, piperilona, pirazolaco, piritramida, piroxicam, pirprofeno, pranoprofeno, prednicarbato, prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, proglumetacina, proheptazina, promedol, propacetamol, properidina, propiram, propoxifeno, propifenazona, proquazona, ácido protizínico, proxazol, ramifenazona, remifentanilo, metilsulfatode rimazolio, salacetamida, salicina, salicilamida, ácido salicilamida o-acético, ácido salicílico, ácido salicilsulfúrico, salsalato, salverina, simetrida, sufentanilo, sulfasalazina, sulindaco, superóxido dismutasea, suprofeno, suxibuzona, talniflumato, tenidap, tenoxicam, terofenamato, tetrandrina, thiazolinobutazona, ácido tiaprofenico, tiaramida, tilidina, tinoridina, tixocortol, ácido tolfenâmico, tolmetina, tramadol, triamcinolona, acetonido de triancinolona, tropesina, viminol, xenbucina, ximoprofen, zaltoprofeno e zomepiraco.
(F) Administração
[00245] O paciente é geralmente um humano, mas pode também ser um mamífero não-humano. Pacientes humanos incluem adultos, por exemplo, pacientes entre as idades de 19-25, 26-40, 41-55, 56-75 e 76 e mais velhos e doentes pediátricos, por exemplo, pacientes entre as idades de 0-2, 3-6, 7- 12, e 13-18.
[00246] O termo composição "farmaceuticamente aceitável" se refere a um portador não tóxico ou excipiente que pode ser administrado a um paciente, em conjunto com um inibidor de calicreína aqui descrito. O portador ou excipiente é escolhido para ser compatível com a atividade biológica ou farmacológica da composição. Os inibidores de calicreína (e, no caso da terapia de combinação, o outro agente terapêutico) aqui descritos podem ser administrados localmente ou sistemicamente por meio de qualquer meio adequado para a entrega de uma quantidade inibidora do inibidor e/ou do outro agente terapêutico para um paciente, incluindo, mas não limitando, as administrações sistêmicas, tais como, por exemplo, intravenosa e por inalação. A administração parenteral é particularmente preferencial para o inibidor de calicreína.
[00247] Para administração parenteral, o inibidor de calicreína pode ser injetado por via intravenosa, por via intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea. A administração de injeção subcutânea e intravenosa são vias preferidaspara a administração parenteral. É também útil a injeção local (intra-articular).
[00248] Tipicamente, as composições para a administração por injeção são soluções em tampão aquoso isotônico estéril (por exemplo, solução salina tamponada de fosfato de sódio/potássio). Outros portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina e solução salina tamponada (incluindo tampões como o fosfato ou o acetato), álcool, óleos vegetais, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina, etc. Se necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como a lidocaína para aliviar a dor no local da injeção, conservantes, estabilizantes, agentes umidificantes, emulsionantes, sais, lubrificantes, etc., desde que não reajam prejudicialmente com os compostos ativos. Da mesma forma, a composição pode compreender excipientes convencionais, por exemplo, substâncias portadoras orgânicas ou inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis adequadas para aplicação parenteral, enteral ou intranasal, que não reage prejudicialmente com os compostos ativos. Geralmente, os ingredientes serão fornecidos separadamente ou misturados em conjunto em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou como concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola, saqueta ou frasco indicando a quantidade de agente ativo em unidades de atividade. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo uma “água para injeção" estéril de grau farmacêutico ou uma solução salina. Quando a composição é para ser administrada por injeção, um recipiente (por exemplo, ampola ou frasco) de água estéril para injeção ou uma solução salina pode ser fornecida, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00249] Formulações exemplificativas para a administração subcutânea de um inibidor de calicreína isolado incluem soluções tamponadas contendo um agente de tamponamento (por exemplo, tampão de histidina ou fosfato) e um crioprotetor (por exemplo, sacarose ou sacarose e manitol, opcionalmente incluindo um dextrano, como dextrano 40), e pode ser liofilizados para o armazenamento e distribuição, tal como descrito em na Publicação do Pedido de Patente US No. 2007-0213275 (US Série No. 11/716.278, depositado em 9 março de 2007).
[00250] Em uma modalidade, o inibidor de calicreína é administrado a um paciente como uma infusão intravenosa de acordo com qualquer procedimento aprovado. Em uma outra modalidade, o inibidor de calicreína é administrado a um paciente como um bolus subcutâneo. Em uma outra modalidade, o inibidor de calicreína é administrado a um paciente por injeção intra-articular. A administração intravenosa e intraarticular são normalmente realizadas por um profissional de saúde em um ambiente clínico (por exemplo, hospital, unidades de urgência ou consultório médico) cuidados de saúde, mas injeções subcutâneas podem ser auto-administradas ou administradas por um profissional de saúde.
[00251] Os parâmetros que podem ser avaliados para a determinação de uma dose do inibidor de calicreína para administração sistêmica estão descritos a seguir no que diz respeito a DX-88 (um inibidor de calicreína de ocorrência não natural, SEQ ID NO: 2). O montante total de pré-calicreína em circulação no plasma é relatado para ser na faixa de 500 nM a 600 nM (Silverberg et al., "The Contact System and Its Disorders" in Blood: Principles and Practice of Hematology, Handin, R. et al., eds, JB Lippincott Co., Filadélfia, 1995). Se toda a pré-calicreína é ativada, cerca de 520 nmolar/L de DX-88 (DX88) podem ser utilizados para inibir a calicreína de uma maneira estequiométrica. Um indivíduo com 5L de plasma exigiria uma dose de 2,6 micromolar DX-88, ou cerca de 18 mg com base no peso molecular de DX-88 de 7.054 Daltons. Isto foi calculado da seguinte forma: a Ki de DX88 é de 0,025 nM. Quando se deseja ter uma concentração de calicreína plasmática (PK) de, por exemplo, 1 nM, a seguinte fórmula para um inibidor de ligação forte indica que a concentração de DX-88 livre é de 12,0 nM. Assim, o montante total de DX-88 necessário seria 499+12 ou 511 nM.
[00252]
Figure img0004
[00253] A dose pode ser proporcionalmente reduzida, se a pré- calicreína não é toda ativada ou se uma porção da calicreína é desativada por um inibidor endógeno, por exemplo, inibidor de esterase C1 (C1INH).Assim, em certas modalidades, cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60,80, 120, 250, 500, 600, 700, 800, 1000 mg de DX-88 podem ser administrados a um indivíduo, em uma única dose ou em uma ou mais doses, distribuídos por um período de vinte de quatro horas. A consideração de vários outros fatores pode fornecer uma estimativa mais precisa da dose de DX-88 necessário na prática, tais como a idade do paciente, peso e da gravidade da condição ().
[00254] Em algumas modalidades, o polipeptídeo inibidor de calicreína é administrado em uma dose de cerca de 1-500 mg/m2, preferencialmente cerca de 1-250 mg/m2, de 1-100 mg/m2.
(G) Dispositivos e Kits
[00255] As composições farmacêuticas que incluem o inibidor de calicreína podem ser administradas com um dispositivo médico. O dispositivo pode projetado com características como portabilidade, armazenamentona temperatura ambiente e facilidade de uso, a fim de que ele possa ser usado em ambientes fora de um hospital ou pronto socorro/instalação de atendimento de urgência (por exemplo, pelo paciente ou um cuidador em casa ou no consultório de um médico). O dispositivo pode incluir, por exemplo, uma ou mais carcaças para o armazenamento de preparações farmacêuticas que incluem um inibidor de calicreína isolado e pode ser configurado para fornecer uma ou mais doses unitárias do agente ou dos agentes.
[00256] A administração intravenosa pode ser por bolus ou por infusão, usando dispositivos de injeção ou de infusão apropriados (por exemplo, cateteres, bombas de infusão, implantes e semelhantes). A injeção subcutânea pode ser como uma infusão, por exemplo, utilizando um cateter e uma bomba de infusão ou dispositivo implantável. Muitos outros dispositivos, implantes, sistemas de distribuição e módulos também são conhecidos.
[00257] Quando o inibidor de calicreína é distribuído como um pó liofilizado, ele deve ser reconstituído antes da utilização. A reconstituição manual (por exemplo, adição manual de diluente na formulação liofilizada por meio da injeção através de uma porta de injeção para dentro do recipiente que contém a formulação liofilizada) pode ser utilizada, ou o inibidor de calicreína pode ser fornecido em um dispositivo configurado para a reconstituição automática (por exemplo, a adição automática do diluente para a formulação liofilizada), tal como o injetor líquido de anidro BECTON- DICKINSONBDTM.
[00258] O inibidor de calicreína isolado pode ser provido em um kit. Em uma modalidade, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição incluindo um inibidor de calicreína isoladoe (b) um material de informação, o qual se relaciona com os métodos aqui descritos e/ou com a utilização dos agentes para benefício terapêutico.
[00259] Em certas modalidades, o kit inclui também um outro agente terapêutico. Por exemplo, o kit inclui um primeiro recipiente, o qual contém uma composição que inclui o inibidor de calicreína isolado, e um segundo recipiente que inclui o outro agente terapêutico. O inibidor de calicreína isoladoe o outro agente terapêutico podem ser fornecidos no mesmo recipiente para utilização em métodos, em que o inibidor de calicreína e o agente terapêutico são administrados como uma única composição.
[00260] O material de informação dos kits não é limitado na sua forma. Em uma modalidade, o material de informação pode incluir informações sobre a produção do composto, o peso molecular do composto, a concentração, a data de expiração, lote ou informação do local de produção e assim por diante. Em uma modalidade, o material de informação se refere a métodos de administraçãodo inibidor de calicreína isolado, por exemplo, em uma dose adequada, forma de dosagem ou o modo de administração (por exemplo, uma dose, forma de dosagem, ou o modo de administração aqui descrito), para tratar um sujeito (). A informação pode ser fornecida em uma variedade de formatos, incluem texto impresso, material de leitura no computador, gravação de vídeo ou gravação de áudio, ou uma informação que fornece um link ou endereço ao material substantivo.
[00261] Em adição ao inibidor de calicreína isolado (e, se estiver presente, o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional (is)), a composição no kit pode incluir outros ingredientes, tais como um solvente ou tampão, um estabilizador ou um conservante. O inibidor de calicreína isolado (e outro agente terapêutico, se presente) pode ser proporcionado em qualquer forma, por exemplo, líquido, em pó ou em forma liofilizada, preferencialmente, substancialmente pura e/ou esterilizado. Quando os agentes são fornecidos em solução líquida, a solução líquida é, preferencialmente, uma solução aquosa. Quando os agentes são proporcionados como uma forma seca, a reconstituição é, geralmente, por meio da adição de um solvente adequado. O solvente, por exemplo, água ou tampão estéril, pode ser opcionalmente fornecido no kit.
[00262] O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição ou composições que contêm os agentes. Em algumas modalidades, o kit contém recipientes separados, divisórias ou compartimentos para a composição e o material de informação. Por exemplo, a composição pode estar contida em uma garrafa, frasco ou seringa, e o material de informação pode estar contido em um invólucro de plástico ou em um pacote. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um recipiente único e não dividido. Por exemplo, a composição está contida em uma garrafa, frasco ou seringa, a qual tem anexa a ele o material de informação sob a forma de uma etiqueta. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo, um pacote) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de dosagem unitárias (por exemplo, uma forma de dosagem aqui descrita) dos agentes. Os recipientes podem incluir uma combinação de unidade de dosagem, por exemplo, uma unidade que inclui tanto o inibidor de calicreína isolado, como também o outro agente terapêutico, por exemplo, em uma proporção desejada. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, pacotes de folha, embalagens alveolares ou dispositivos médicos, por exemplo, cada uma contendo uma dose unitária decombinação única. Os recipientes dos kits podem ser estanques ao ar, à prova de água (por exemplo, impermeável a mudanças na umidade ou evaporação), e/ou à prova de luz.
[00263] O kit inclui opcionalmente um dispositivo adequado para a administração da composição, por exemplo, uma seringa ou outro dispositivo de entrega adequado. O dispositivo pode ser proporcionado pré- carregado com um ou ambos os agentes ou pode estar vazio, mas adequado para o carregamento.
Exemplos
[00264] Os seguintes exemplos proporcionam mais uma ilustração e não são limitantes.
Exemplo 1: Associação entre cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) e doenças autoimunes
[00265] Para determinar os níveis de HMWK clivado em doenças autoimunes, as quantidades de HMWK intacto e clivado em amostras de plasma obtidas a partir de pacientes de artrite reumatoide (AR), colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (CD), bem como a partir de indivíduos saudáveis, foram medidos utilizando Western blotcom detecção de LiCor como descrito abaixo.
(i) Preparação de amostras
[00266] O plasma tratado de HMWK deficiente foi preparado por meio da adição de 10 μl de coquetel de inibidores de anti-protease 10X e 90 μl de 100% de plasma de HMWK deficiente. A solução foi deixada em repouso durante pelo menos 30 minutos antes da utilização.
[00267] Um intermédio 1:4 do HMWK de cadeia simples foi preparado por meio da adição de 5 μl de solução de reserva (1,61 mg/mL) em 15 μl de plasma tratadodo HMWK deficiente. Um intermédio 1:4 do HMWK de duas cadeias foi preparado por adição de 5 μl de solução de reserva (2,01 mg/mL) em 15 μl de plasma tratadodo HMWK deficiente.
[00268] 45 μg/mL de uma solução tratada de plasma de controle do HMWK deficiente preparado por adição de 3,35 μL de 1:4 do intermédio deHMWK de cadeia simples e 2,69 mL de 1:4 do intermédio do HWMK de cadeia duplaem 23,96 μL de plasma tratadodo HMWK deficiente.
[00269] Cada amostra foi diluída em 5% de plasma (1:20) em TBS 1X por meio da adição de 5 μL da amostra de plasma para 95 mL de 1X TBS. As amostras não reduzidas foram preparadas por meio da adição de 5 μLde tampão de amostra 4X em 15 μL dos 5%de amostra. As amostras reduzidas foram preparadas por meio da adição de 5 μL de tampão de amostra 4X e 2 μL de 10X agente de reduçãoem 13 μL dos 5%de amostra.
[00270] Todas as amostras foram aquecidas a 95 °C durante 5 minutos, utilizando um bloco de calor. Cada amostra foi brevemente centrifugada para remover qualquer solução da tampa dos tubos de amostra.
(ii) Carregamento, funcionamento e transferência do gel
[00271] Tampão de funcionamento de tris-acetato foi preparado por meio da adição de 100 mL de 20X tampão de funcionamentoem 1.900 mL de água desionizada. Um volume de 4 μL domarcador deproteína de uma cor foi utilizado como um controle em todos os ensaios. Um volume de 13 μLdas amostras não reduzidas e reduzidas foi adicionado em faixas de gel 1. Os géis foram administrados a 125 volts durante cerca de 2 horas.
[00272] O papel de filtro iBlot foi colocado em água desionizada e ensopado durante 5 minutos. A pilha de ânodo, fundo, foi aberta e colocada sobre a superfície de blotting do iBlot com o cobre virado para baixo. Após a conclusão do funcionamentodo gel, duas cassetes de gel foram abertos e os géis removidos. Os géis foram colocados sobre a membrana de transferência. O papel de filtro pré-ensopado foi colocado no topo dos géis.A pilha de cátodo,topo foi aberta e colocada no topo do papel de filtro, com o cobre virado para cima. As bolhas na pilha foram suavemente estendidas utilizando o cilindro de blotting. A esponja descartável foi colocada na tampa do iBlot. O iBlot foi ligado e programa P0 foi selecionado.
[00273] Após a conclusão da transferência do iBlot, abriu- seerturao iBlot e descartou-sea esponja, a pilha de cátodo e os géis. Cada uma das membranas foi removida individualmente a partir do iBlot e colocada em uma bandeja de plástico contendo 20 mL de Tampão de Bloqueio Odyssey. As membranas foram incubadas em um agitador de placas à temperatura ambiente durante 1 hora.
(iii) Ensaio Westernblot com detecção de LiCor
[00274] A solução de anticorpo primário 1 μg/mL foi preparada por meio da adição de 57,14 μL de HMWK de anti-LC de rato, o clone# 11h05 (concentração de estoque de 1,4 mg/mL) em 80 mL do bloqueador Odyssey + 0,2% de Tween-20. O tampão de bloqueio foi removido das bandejas de plástico. Um volume de 20 mL de solução de anticorpo primário foi adicionado em cada bandeja e as membranas foram incubadas em um agitador de placas à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução anti-rato IgG IRDye 680 de cabra foi preparada a uma diluição de 1:15.000 adicionando 5,33 μL da solução de estoque em80 mL do bloqueador Odyssey + 0,2% de Tween-20. A solução de anticorpo primário foi removida das bandejas de plástico. As membranas foram lavadas com 20 mL de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 durante cinco minutos e, em seguida, a lavagem foi descartada. Repetindo 3 vezes para um total de 4 lavagens. Um volume de 20 mL de solução anti-rato IgG IRDye 680 de cabra foi adicionado em cada bandeja. As bandejas foram cobertas com folha de alumínio para proteger as membranas e a solução de anticorpo secundário da luz. As membranas foram incubadas em um agitador de placas à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de anticorpo secundário foi removida das bandejas de plástico. As membranas foram lavadas com 20 mL de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 durante cinco minutos e, em seguida, a lavagem foi descartada. Repetindo 3 vezes para um total de 4 lavagens. As membranas foram lavadas com PBS e examinadas no LiCor Odyssey CLx. As membranas foram cobertas com folha de alumínio e deixada a secar durante a noite. As membranas secas foram colocadas em uma folha de cobertura de proteção e guardadas para uso posterior.
(iv) Resultados:
[00275] O controle,o plasma tratado deficiente em HMWK enriquecido com 45 μg/mL de HMWK simples e de duas cadeias, funcionou conforme o esperado produzindo bandas em torno de 120 e 95 kDa. O plasma humano normal produziu bandas de cerca de 120 e 100 kDa, com 21,3% do HMWK clivado. As amostras de pacientes contendo coquetéis inibidores anti-protease produziu resultados dramaticamente diferentes do que amostras de pacientes coletadas em citrato de sódio. As amostras de pacientes coletados com inibidor anti-protease adicionado continham significativamente mais HMWK de cadeia simples do que HMWK reduzido de cadeia dupla. Este resultado indica que a adição de coquetéis de inibidor de anti-protease é necessária para impedir a clivagem do HMWK após a sua coleta.
[00276] As amostras de plasma a partir de um número de UC, CD, ARe pacientes com AEH foram examinadas neste estudo. A amostra de controle e de plasma humano normal produziu os resultados esperados. A amostra de ataque AEHcontinha mais HWMK clivado do que a amostra basal AEH. Como mostrado na Tabela 1 em seguida e também na Figura 1, uma grande maioria das amostras de pacientes autoimunes, particularmente as amostras de artrite reumatoide, só produziu bandas de 46 kDa, indicando que o nível de HWMK clivado está associado com doenças autoimunes, tais como RA, UC e CD. Mais especificamente, surtos agudos (“flares”) de ARforam descobertosa serem associados com HMWK clivado extensivamente; a doença de Crohn foi descoberta a ter uma quantidade moderada de HMWK clivado; e colite ulcerativa verificou-se ter uma quantidade moderada de HMWK clivado.
[00277] Em suma, os resultados deste estudo indicam a ativação de contato em doenças autoimunes, tais como no plasma de CD, UC, e AR. Consequentemente, um agente que inibe a ativação de contato, tal como um inibidor de pKal (por exemplo, os aqui descritos) pode ser eficaz no tratamento de tais doenças. Além disso, os resultados deste estudo indicam que o nível de HMWK clivado pode servir como um biomarcador de confiança para a identificação de pacientes tendo ou em risco de desenvolver doenças autoimunes, tais como CD, UC, e AR e/ou como um biomarcador para a avaliação da eficácia de um tratamento para uma tal doença autoimune.
[00278] Tabela 1. Níveis de HMWK clivado em pacientes com AR, UC e CD doentes
Figure img0005
Figure img0006
[00279]
Referências
[00280] Os conteúdos de todas as referências citadas, incluindo referências da literatura, patentes emitidas ou pedidos de patente publicados ou não publicados citados ao longo deste pedido, bem como as listadas abaixo são aqui expressamente incorporados por referência na sua totalidade para efeitos ou assunto aqui referenciada. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui, irá controlar.
[00281] Nas reivindicações, artigos como "um", "uma", e "a" pode significar um ou mais do que um, a menos que indicado ao contrário, ou é de outro modo evidente do contexto. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são considerados satisfeitos, se um, mais do que um ou todos os membros do grupo estão presentes em, empregues em, ou de outra forma relevantepara um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário ou evidente de outra maneira a partir do contexto. A presente invenção inclui modalidades, em que exatamente um membro do grupo está presente em, é empregado em, ou é de outro modo relevantepara um determinado produto ou processo. A presente invenção inclui modalidades, em que mais do que um ou todos os membros do grupo se encontram presentes em, empregues em, ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo.
[00282] Ademais, a presente invenção abrange todas as variações, combinações e permutações,em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas e termos descritivos de uma ou mais reivindicações listadas é introduzida em uma outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que depende de outrareivindicação pode ser modificada para incluir um ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação, a qual é dependente da mesma reivindicação base. Aonde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato do grupo Markush, cada subgrupo dos elementos é também descrito, e qualquer elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Ele deve ser entendido que, em geral, quando a presente invenção, ou aspectos da presente invenção, é/são referido(s) como compreendendo elementos particulares e/ou características, certas modalidades da presente invençãoou aspectos da presente invenção consistem, ou consistem essencialmente, em tais elementos e/ou características. Para fins de simplicidade, estas modalidades não foram especificamente definidasaqui inhaec verba. É também de se notar que os termos "compreendendo" e "contendo" destinam-se a ser aberto e permitir a inclusão de elementos ou etapasadicionais. Onde são dados intervalos, os desfechos estão incluídos. Além disso, a menos que indicado de outra forma ou evidente de outra maneira a partir do contexto e da compreensão de um versado na técnica, valores que são expressos em intervalos podem assumir qualquer valor específico ou subintervalos dentro dosintervalosindicados nas diferentes modalidades da presente invenção, ao décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[00283] Este pedido se refere a várias patentes concedidas, pedidos de patentes publicados, artigos de revistase outras publicações, todos os quais são aqui incorporados por referência. Se houver um conflito entre qualquer uma das referências incorporadas e a especificação imediata, a especificação deve controlar. Adicionalmente, qualquer modalidade particular da presente invenção que se encontra dentro do estado da técnica pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Uma vez que tais modalidades são consideradas como conhecidas por um versado na técnica, elas podem ser excluídas, mesmo que a exclusão não é apresentada explicitamente aqui. Qualquer modalidade particular da presente invenção pode ser excluída de qualquer reivindicação, por qualquer motivo, se ou não relacionada com a existência no estado da técnica.
[00284] Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas aqui descritas. O escopo das presentes modalidades aqui descritas não é destinadopara ser limitado à descrição acima, mas sim conforme estabelecido nas reivindicações anexas. Os versados na técnica apreciarão que várias alterações e modificações na presente descrição podem ser feitas sem se afastar da essência ou do escopo da presente invenção, tal como definido nas reivindicações seguintes.

Claims (19)

1. Método para detectar uma doença autoimune em um indivíduo humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende: prover uma amostra biológica de um indivíduo humano suspeito de ter a doença autoimune; e medir um nível de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) na amostra biológica; em que um nível do HMWK clivado elevado na amostra biológica quando comparado com uma amostra controle indica que o indivíduo humano tem ou está em risco para a doença autoimune; em que a doença autoimune é artrite reumatoide, doença de Crohn ou colite ulcerativa; e em que a amostra biológica é uma amostra de soro ou uma amostra de plasma.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende um ou mais inibidores de protease, os quais são adicionados à amostra biológica após a coleta desta.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o nível de HMWK clivado é medido por um ensaio que envolve um agente aglutinante específico para o HMWK clivado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente aglutinante é um anticorpo.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio immunoblotting.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio Western blotting que envolve detecção de LiCor.
7. Método para monitorar o desenvolvimento de uma doença autoimune em um indivíduo humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende: prover uma primeira amostra biológica de um indivíduo humano suspeito de ter uma doença autoimune em um primeiro momento; medir um primeiro nível de cininogênio clivado com alto peso molecular (HMWK) na primeira amostra biológica; prover uma segunda amostra biológica do indivíduo humano em um segundo momento subsequente ao primeiro momento; medir um segundo nível de HMWK clivado na segunda amostra biológica; e avaliar o desenvolvimento da doença autoimune no indivíduo humano com base na mudança dos níveis do HMWK clivado na primeira e na segunda amostra biológica, em que o segundo nível de HMWK clivado maior do que o primeiro nível de HMWK clivado indica que a doença autoimune progride no indivíduo humano ou que o indivíduo humano desenvolveu ou está em risco de desenvolver a doença autoimune; em que a doença autoimune é artrite reumatoide, doença de Crohn ou colite ulcerativa; e em que a primeira e segunda amostra biológica são amostras de soro ou amostras plasmáticas.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a primeira amostra biológica, a segunda amostra biológica, ou ambas, compreende um ou mais inibidores de protease, os quais são adicionados à(às) amostra(s) biológica(s) após a coleta desta(s).
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou segundo nível de HMWK clivado é medido por meio de um ensaio que envolve um agente aglutinante específico para o HMWK clivado.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente aglutinante é um anticorpo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio immunoblotting.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio Western blotting que envolve detecção de LiCor.
13. Método, para avaliar a eficácia de um tratamento para uma doença autoimune em um paciente humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende: prover múltiplas amostras biológicas de um paciente humano submetido a um tratamento para uma doença autoimune durante o curso do tratamento; medir os níveis do cininogênio com alto peso molecular (HMWK) nas múltiplas amostras biológicas; e avaliar a eficácia do tratamento no paciente humano com base na alteração dos níveis de HMKW clivado ao longo do curso do tratamento, em que, se o nível de HMKW clivado diminui durante o curso do tratamento, isso indica que o tratamento é eficaz no paciente humano, em que a doença autoimune é artrite reumatoide, doença de Crohn ou colite ulcerativa; e em que pelo menos uma das múltiplas amostras biológicas é uma amostra de soro ou uma amostra plasmática.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o tratamento envolve pelo menos um inibidor de calicreína plasmática.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das múltiplas amostras biológicas compreende um ou mais inibidores de protease, os quais são adicionados à amostra após a coleta desta.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que os níveis de HMWK clivado nas múltiplas amostras biológicas são medidos por meio de um ensaio que envolve um agente aglutinante específico para o HMWK clivado.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o agente aglutinante é um anticorpo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou um ensaio immunoblotting.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio Western blotting que envolve detecção de LiCor.
BR112016008975-8A 2013-10-21 2014-10-17 Métodos para detectar, monitorar o desenvolvimento e avaliar a eficácia de um tratamento de uma doença autoimune BR112016008975B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361893542P 2013-10-21 2013-10-21
US61/893,542 2013-10-21
PCT/US2014/061242 WO2015061182A1 (en) 2013-10-21 2014-10-17 Diagnosis and treatment of autoimmune diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112016008975A2 BR112016008975A2 (pt) 2017-09-19
BR112016008975B1 true BR112016008975B1 (pt) 2023-02-28

Family

ID=52993412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112016008975-8A BR112016008975B1 (pt) 2013-10-21 2014-10-17 Métodos para detectar, monitorar o desenvolvimento e avaliar a eficácia de um tratamento de uma doença autoimune

Country Status (14)

Country Link
US (3) US10101344B2 (pt)
EP (2) EP3913364A1 (pt)
JP (3) JP6657098B2 (pt)
KR (3) KR102295623B1 (pt)
CN (2) CN105874332B (pt)
AU (3) AU2014340449B2 (pt)
BR (1) BR112016008975B1 (pt)
CA (1) CA2927695C (pt)
DK (1) DK3060908T3 (pt)
ES (1) ES2873204T3 (pt)
IL (4) IL293948A (pt)
PL (1) PL3060908T3 (pt)
PT (1) PT3060908T (pt)
WO (1) WO2015061182A1 (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102523810B1 (ko) 2013-01-20 2023-04-21 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 브래디키닌 매개 장애의 평가 및 치료
JP6657098B2 (ja) 2013-10-21 2020-03-04 ダイアックス コーポレーション 自己免疫疾患の診断と治療
KR102521947B1 (ko) 2013-10-21 2023-04-14 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 시스템 바이오마커를 결정하기 위한 검정법
AU2016340826C1 (en) * 2015-10-19 2023-05-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Immunoassay to detect cleaved high molecular weight kininogen
CN117192130A (zh) * 2016-09-16 2023-12-08 武田药品工业株式会社 用于接触活化***相关的疾病的蛋白生物标记
KR200490846Y1 (ko) 2019-04-09 2020-01-13 이대호 각도조절 브라켓
KR20230050770A (ko) 2021-10-08 2023-04-17 김경민 발로 열 수 있는 반려동물 울타리
WO2024003617A2 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Protein biomarkers for lanadelumab treatment

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
CA1312564C (en) 1985-07-12 1993-01-12 Robert W. Colman Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein and methods of preparing and using same
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5047323A (en) 1986-01-22 1991-09-10 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Method for detecting human kininogen using monoclonal antibodies thereto
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
KR960009766B1 (ko) 1986-09-10 1996-07-24 니혼 소오끼 세이야꾸 가부시기가이샤 생리 활성물질 측정법
US4882272A (en) 1986-10-01 1989-11-21 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education High molecular weight kininogen assay
US5025796A (en) 1988-12-01 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Apparatus and methods for determining in vivo response to thermal stimulation in in an unrestrained subject
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
AU2548992A (en) 1991-08-13 1993-03-16 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Modulation of blood pressure and inhibition of platelet activation with kininogen fragment
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
JP3805785B2 (ja) 1994-01-11 2006-08-09 ダイアックス コープ． カリクレイン阻害クニッツドメイン蛋白質およびその相同体
ATE496288T1 (de) 1995-10-11 2011-02-15 Luminex Corp Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben
US6242210B1 (en) 1997-05-20 2001-06-05 Actinova Limited Treatment of bacterial infections
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US7067713B2 (en) 2000-01-31 2006-06-27 Pharming Intellectual Property B.V. C1 Inhibitor produced in the milk of transgenic non-human mammals
US7678541B2 (en) 2000-11-21 2010-03-16 Hologic, Inc. Methods and compositions for the detection of a nucleic acid using a non-invasive cleavage reaction
US20040152633A1 (en) 2001-05-31 2004-08-05 Jorgensen Marianne Ulrich Kunitz-type sequences and polypeptides
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US6913900B2 (en) 2001-08-29 2005-07-05 Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. Plasma prekallikrein activation and kallikrein production assay
JP4106888B2 (ja) 2001-09-19 2008-06-25 カシオ計算機株式会社 液晶表示装置および携帯端末装置
US8148171B2 (en) 2001-10-09 2012-04-03 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
EP2298278B1 (en) 2002-06-07 2015-11-11 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss and inflammatory response
WO2004001065A2 (en) 2002-06-24 2003-12-31 Cornell Research Foundation, Inc. Exhaustive selection or rna aptamers against complex targets
US20070003552A1 (en) 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
WO2004039487A1 (en) 2002-11-01 2004-05-13 Mcmaster University Multicomponent protein microarrays
WO2005024042A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
EP1700912B1 (en) 2003-11-22 2014-10-29 Techno Medica Co., Ltd. Method of detecting target molecule by using aptamer
EP1598428A1 (en) 2004-05-18 2005-11-23 Georg Dewald Methods and kits to detect Hereditary angioedema type III
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
CA2583017A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
EP2365000A3 (en) 2005-05-18 2013-01-16 Ablynx N.V. Improved nanobodiesTM against tumor necrosis factor-alpha
US8828703B2 (en) 2005-12-29 2014-09-09 Dyax Corp. Protease inhibition
CA2658523C (en) 2006-07-31 2012-06-12 Activesite Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of plasma kallikrein
JP2010510528A (ja) * 2006-11-22 2010-04-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 自己免疫疾患のバイオマーカー
US20080255766A1 (en) 2007-02-16 2008-10-16 Rules-Based Medicine, Inc. Methods and kits for the diagnosis of sickle cell
US20090075887A1 (en) * 2007-08-21 2009-03-19 Genzyme Corporation Treatment with Kallikrein Inhibitors
US20110154517A1 (en) 2007-10-22 2011-06-23 Georg Dewald Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them
JP5348595B2 (ja) * 2008-07-07 2013-11-20 日本臓器製薬株式会社 線維筋痛症の検査法
EP2352762A1 (en) 2008-11-03 2011-08-10 Schering Corporation Inflammatory bowel disease biomarkers and related methods of treatment
EP2369930A4 (en) 2008-12-02 2012-10-03 Joslin Diabetes Ct METHOD OF REDUCING BLOOD PRESSURE FROM PLASMA CALLICINE INHIBITORS
AU2010203712A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
KR101077275B1 (ko) * 2009-05-07 2011-10-27 한국기초과학지원연구원 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
JP5299179B2 (ja) * 2009-09-02 2013-09-25 株式会社リコー 画像形成装置
BR112012014990A2 (pt) 2009-12-18 2016-04-05 Activesite Pharmaceuticals Inc composto, método para tratar uma doença ou condição dependente de calicreína de plasma, e, composição.
US9206123B2 (en) * 2009-12-18 2015-12-08 Activesite Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of inhibitors of plasma kallikrein
RS62853B1 (sr) 2010-01-06 2022-02-28 Takeda Pharmaceuticals Co Proteini koji vezuju kalikrein plazme
EP2593121A2 (en) * 2010-07-13 2013-05-22 University Of Rochester THE cAMP/PKA/HDAC5 PATHWAY AND USES THEREOF
AU2012204202A1 (en) 2011-01-06 2013-07-11 Dyax Corp. Plasma kallikrein binding proteins
CA2838984A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating kallikrein (klkb1) expression
WO2012170947A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating factor 12 expression
KR102523810B1 (ko) 2013-01-20 2023-04-21 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 브래디키닌 매개 장애의 평가 및 치료
JP6657098B2 (ja) 2013-10-21 2020-03-04 ダイアックス コーポレーション 自己免疫疾患の診断と治療
KR102521947B1 (ko) 2013-10-21 2023-04-14 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 시스템 바이오마커를 결정하기 위한 검정법
AU2016340826C1 (en) 2015-10-19 2023-05-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Immunoassay to detect cleaved high molecular weight kininogen
IL295166A (en) * 2020-01-28 2022-09-01 Orgenesis Inc A system for extracellular therapy and a procedure for its preparation

Also Published As

Publication number Publication date
US20190120862A1 (en) 2019-04-25
US10648990B2 (en) 2020-05-12
CN105874332A (zh) 2016-08-17
KR102665705B1 (ko) 2024-05-14
IL284969A (en) 2021-08-31
JP7157089B2 (ja) 2022-10-19
CA2927695C (en) 2022-03-01
KR102485948B1 (ko) 2023-01-06
EP3060908A4 (en) 2017-03-22
IL275368A (en) 2020-07-30
AU2014340449B2 (en) 2019-10-31
JP2017500584A (ja) 2017-01-05
IL293948A (en) 2022-08-01
BR112016008975A2 (pt) 2017-09-19
ES2873204T3 (es) 2021-11-03
KR20210107182A (ko) 2021-08-31
PT3060908T (pt) 2021-05-27
EP3060908A1 (en) 2016-08-31
KR20230010003A (ko) 2023-01-17
KR20160089368A (ko) 2016-07-27
EP3060908B1 (en) 2021-02-24
CA2927695A1 (en) 2015-04-30
JP2022191343A (ja) 2022-12-27
JP2020091296A (ja) 2020-06-11
US10101344B2 (en) 2018-10-16
US20160252533A1 (en) 2016-09-01
AU2022204649A1 (en) 2022-07-21
EP3913364A1 (en) 2021-11-24
DK3060908T3 (da) 2021-05-25
KR102295623B1 (ko) 2021-08-31
CN105874332B (zh) 2019-11-12
AU2020200423B2 (en) 2022-03-31
WO2015061182A1 (en) 2015-04-30
PL3060908T3 (pl) 2021-10-25
US20200371120A1 (en) 2020-11-26
IL245206A0 (en) 2016-06-30
AU2020200423A1 (en) 2020-02-13
CN110658337B (zh) 2023-06-16
CN110658337A (zh) 2020-01-07
IL284969B (en) 2022-07-01
JP6657098B2 (ja) 2020-03-04
IL275368B (en) 2021-08-31
IL245206B (en) 2020-06-30
AU2014340449A1 (en) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020200423B2 (en) Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
US8637454B2 (en) Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
KR102304136B1 (ko) 개선된 약동학을 가지는 항-c5 항체
PT2563813E (pt) Anticorpos anti-c5a e métodos para utilização dos anticorpos
TW202100561A (zh) 血漿胰舒血管素抑制劑及其於治療遺傳性血管水腫發作的用途
BR112021003789A2 (pt) método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae
AU2013205086A1 (en) Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
BR112020003632A2 (pt) método de tratamento de um indivíduo que sofre ou corre risco de desenvolver ahus

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: DYAX CORP. (US)

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED (JP)

B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 17/10/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS