BR112014022708B1 - Uso de uma proteína ligante de neurotrofina p75ntr e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

USO DE UMA PROTEÍNA LIGANTE DE NEUROTROFINA P75NTR, USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, USO DE UMA VETOR DE EXPRESSÃO REPLICÁVEL, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT. A presente invenção refere-se ao uso de uma proteína ligante de neurotrofina p75NTR, p75NTR(NBP), no tratamento da dor e/ou um sintoma de dor.

Description

Estado da Técnica
[0001] As neurotrofinas, fator de crescimento neurotrófico (NGF), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3), e neurotrofinas 4/5 (NT-4/5) atuam através de quatro receptores: o receptor neurotrófico p75 de baixa afinidade (p75NTR), e os receptores tirosina quinase de alta afinidade; TrkA, TrkB, e TrkC. O receptor de baixa afinidade p75NTR liga e é ativado pelas quatro neurotrofinas e tem sido reportado para funcionar independentemente de outros receptores. No entanto, os receptores Trk são mais seletivamente ativados, ou seja, NGF é o ligante seletivo para TrkA, BDNF o ligante para TrkB e NT-3, 4/5 os ligantes para TrkC. Além disso, tem sido relatado, quando as proteínas p75NTR e Trk são co-expressas, elas formam complexos, que alteram a sinalização de ambos os receptores (Huang e Reichardt, 2003). De fato, tem sido sugerido que p75NTR facilita a seletividade de cada uma das neutrofinas para o respectivo receptor Trk.
[0002] A p75NTR é um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR-SF) e foi o primeiro membro desta superfamília a ser caracterizado completamente. A superfamília (codificada por cerca de 30 genes em seres humanos) é definida pelos domínios de ligação constituídos por um ou mais (geralmente quatro) repetições de um domínio rico em cisteína de 40 aminoácidos (CRD), que foi identificado pela primeira vez em p75NTR (Johnson et al ., 1986;. Radeke et al, 1987).
[0003] Uma característica incomum da estrutura de p75NTR é a existência de um dímero ligado por ligação dissulfeto, formada via resíduos de cisteinil dentro dos domínios transmembranares. Esta ligação dissulfeto é necessária para a efetiva sinalização dependente de neurotrofina por p75NTR e desempenha um papel importante na formação de um domínio intracelular e extracelular (Vilar et al., 2009b). As neurotrofinas existem fisiologicamente como dímeros não covalentemente associados (Bothwell e Shooter, 1977), com uma meia-vida de distribuição de cerca de 5 minutos (Tria et al., 1994). A ativação de P75NTR dependente de neurotrofina envolve a associação de um dímero de neurotrofina com CRDs 2-4 dos dois domínios extracelulares de um dímero de p75NTR (HE e Garcia, 2004). Estudos recentes apoiam um modelo no qual a ligação da neurotrofina faz com que os dois domínios extracelulares de dímeros p75NTR se movam juntos, forçando os domínios intracelulares a se afastarem num movimento semelhante ao caracol centrada na ligação dissulfeto e permitindo a associação dos domínios intracelulares com as proteínas adaptadoras de sinalização, FNIR e TRAF6 (Vilar et al., 2009a, 2009b). Ligações dissulfeto no domínio intra-transmembrana, como as presentes em p75NTR, não foram descritas anteriormente em outros membros da família TNFR-SF, ou em qualquer outra proteína de membrana.
[0004] p75NTR sofre uma clivagem proteolítica sequencial pela atividade da α-secretase, i-secretase e metaloproteinases de matriz (MMPs), liberando seu domínio intracelular (ICD) para o citoplasma, de uma maneira análoga à via de sinalização dependente de clivagem de Notch e proteína precursora de β- amilóide (Jung et al, 2003; Kanning et al, 2003). A liberação citoplasmática de p75NTR ICD por esta via promove a sinalização por associação com NRIF (Kenchappa et al., 2006). O papel do domínio extracelular de p75NTR, seguida pela clivagem proteolítica pela atividade da α-secretase i-secretase e as MMPs não é totalmente compreendido.
[0005] Tem sido documentado que NGF e outras neurotrofinas (BDNF, NT-3 e NT-4/5) desempenham um papel significativo em patologia, por exemplo, dor devido a osteoartrite, pancreatite, artrite reumatóide, psoríase, prurido e esclerose múltipla (Watanabe et al ., 2010; Raychaudhuri et al, 2011; Barthel et al, 2009; Truzzi et al, 2011;. McDonald et al, 2011; Yamaoka et al, 2007). Foi demonstrado que os anticorpos seletivos para qualquer uma das neurotrofinas; ou NGF ou BDNF, NT-3 e NT-4/5 reduzem significativamente a dor. Além disso, anticorpos dirigidos aos receptores de neurotrofina p75NTR trkA, trkB ou Trk C também têm demonstrado ser eficazes em modelos de dor (Orita S et al, 2010;. Svensson P et al, 2010; Iwakura et al, 2010; Cirilio et al, 2010; Pezet et al, 2010; Hayashi et al, 2011; Chu et al, 2011; Ueda et al, 2010; Ghilardi et al, 2010; Fukui et al, 2010.). Fukui et al., (2010) em um modelo de dor (alodinia mecânica seguida por esmagamento do nervo ciático) demonstrou uma eficácia significativa nos terminais relacionados à dor seguido ao tratamento com um anticorpo anti-p75NTR. Foi concluído a partir deste estudo que o tratamento com um anticorpo inibidor p75NTR reduziu a expressão de CGRP e p75NTR resultando numa redução significativa da dor.
[0006] A presente invenção demonstra o domínio extracelular de p75NTR, exógeno ou endógeno após clivagem a partir da membrana celular, atua como uma proteína ligadora de neurotrofina ou receptor solúvel de cada uma das neurotrofinas NGF, BDNF, NT-3 e NT-4/5 e desempenha um papel significativo na função, fisiologia e homeostase da função de neurotrofina. Além disso, nós descrevemos a utilização do domínio extracelular de p75NTR para modular ou neutralizar as ações patológicas dos fatores neurotróficos, incluindo o NGF, BDNF, NT-3 e NT4/5, por exemplo, em modelos de alodinia estática e de hiperalgesia térmica. Assim, a proteína de ligação da neurotrofina p75NTR encontra uso no tratamento da dor e outras patologias relacionadas ao fator neurotrófico, como a psoríase, eczema, artrite reumatóide, cistite, endometriose e osteoartrite.
Breve descrição da invenção
[0007] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de ligação p75NTR neurotrofina, (NBP), para uso no tratamento e/ou prevenção da dor, e/ou tratamento dos sintomas de dor ou para melhorar, controlar, reduzir sua incidência, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou seus sintomas. De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de ligação p75NTR neurotrofina para utilização de acordo com o primeiro aspecto, em que, o p75NTR (NBP) compreende p75NTR (NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares. Preferencialmente, o p75NTR (NBP) está ligado a uma ou mais moléculas auxiliares, através de um ou mais ligantes. De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica o p75NTR (NBP) ou p75NTR (NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares da p75NTR (NBP) de acordo com os primeiro ou segundo aspectos a molécula de ácido nucleico pode ainda compreender a codificação de uma sequência de sinal. Também é proporcionada a utilização da molécula de ácido nucleico para o tratamento da dor. De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão replicável para transfecção de uma célula, o vetor compreende a molécula de ácido nucleico do terceiro aspecto, preferencialmente, o vetor é um vetor viral. Também é proporcionada a utilização do vetor para o tratamento da dor. De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecida uma célula hospedeira que abriga a molécula de ácido nucleico, quer do terceiro ou quarto aspecto. De acordo com um sexto aspecto da invenção, é proporcionado o p75NTR (NBP) para utilização de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as formas preferidas da mesma, ou o ácido nucleico ou o vetor para uso de acordo com o terceiro e quarto aspectos, em que o p75NTR (NBP) ou a molécula de ácido nucleico ou vetor é para utilização separada, sequencial ou simultânea de uma combinação com um segundo composto farmacologicamente ativo.
Descrição das figuras
[0008] Figura 1. Sequência do domínio extracelular de p75NTR, domínios de ligação de neurotrofina em negrito.
[0009] Figura 2. Fragmentos peptídicos padrão de p75NBPP e co- imunoprecipitação de p75NTR (NBP) e NGF demonstrando o complexo p75NTR(NBP)-NGF no plasma humano.
[0010] Figura 3. Confirmação da sequência MS/MS do WADAECEEIPGR (SEQ ID NO 7.) Pico mostrado na Figura 2.
[0011] Figura 4. p75NTR(NBP) inibe a função de NGF em celular U20S expressando TrkA e em linhagem celular U20S co-expressando TrkA e p75NTR.
[0012] Figura 5. p75NTR(NBP) solúvel inibe a função de BDNF em linhagem celular U20S expressando TrkA e em linhagem celular U20S co-expressando TrkA e p75NTR.
[0013] Figura 6. Dados Biocore demonstrando p75NTR(NBP) ligação a BDNF e a competição entre anti-BDNF e p75NTR(NBP).
[0014] Figura 7. p75NTR(NBP) inibição da atividade de NGF em células PC12.
[0015] Figura 8. Proteína ligante de Neurotrofina p75NTR(NBP) inibe efeito de dor por BDNF em modelo de excitabilidade nervosa.
[0016] Figura 9. Proteína ligante de Neurotrofina p75NTR(NBP) inibe hiperalgesia em modelo UVIH.
[0017] Figura 10. SEQ ID NO. 1 Sequência completa de aminoácidos de p75NTR humano.
[0018] Figura 11. SEQ ID NO. 2 Domínio extracelular de p75NTR humano incluindo sequência de sinal.
[0019] Figura 12. SEQ ID NO. 3 Domínio extracelular de p75NTR humano sem sequência de sinal.
[0020] Figura 13. SEQ ID NO. 4 Domínio de ligação 1 de neurotrofina humano p75NTR(NBP).
[0021] Figura 14. SEQ ID NO. 5 Domínio de ligação 2 de neurotrofina humano p75NTR(NBP).
[0022] Figura 15. SEQ ID NO.6 Domínio de ligação 3 de neurotrofina humano p75NTR(NBP).
[0023] Figura 16. SEQ ID NO. 7 Domínio de ligação 4 de neurotrofina humano p75NTR(NBP).
[0024] Figura 17. SEQ ID NO. 8 Domínio de ligação 5 de neurotrofina humano p75NTR(NBP).
[0025] Figura 18. SEQ ID NO. 9 Transferrina humana.
[0026] Figura 19. SEQ ID NO. 10 Albumina humana.
[0027] Figura 20. SEQ ID NO. 11 Fc de IgG1 humano.
[0028] Figura 21. SEQ ID NO. 12 Fc de IgG2 humano.
[0029] Figura 22. SEQ ID NO. 13 Fc de IgG3 humano.
[0030] Figura 23. SEQ ID NO. 14 Fc de IgG4 humano.
[0031] Figura 24. SEQ ID NO. 15 Fragmento Fc humano modificado para tempo de meia vida plasmática estendida.
[0032] Figura 25. SEQ ID NO. 16 Fragmento Fc humano modificado para ausência de funções efetoras.
[0033] Figura 26. SEQ ID NO. 17 p75NTR(NBP)-Fc ligante.
[0034] Figura 27: SEQ ID NO. 18 p75NTR(NBP)-Fc ligante.
[0035] Figura 28: SEQ ID NO. 19 p75NTR(NBP)-Fc ligante.
Descrição detalhada da invenção
[0036] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é fornecida uma proteína ligante de neurotrofina p75NTR, (p75NTR(NBP)), para utilização no tratamento da dor, ou para a prevenção e/ou tratamento da dor e/ou sintomas de dor ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou seus sintomas. Preferencialmente, a proteína ligante p75NTR neurotrofina, p75NTR (NBP), é peguilada, e posteriormente preferencialmente é glicosilada.
[0037] A proteína ligante de neurotrofina p75NTR, p75NTR(NBP), preferencialmente, compreende: (a) um ou mais domínio de ligação de neurotrofina 1 [SEQ ID NO. 4], 2 [SEQ ID NO. 5], 3 [SEQ ID NO. 6], 4 [SEQ ID NO. 7] ou 5 [SEQ ID NO. 8]. Posteriormente, preferencialmente p75NTR(NBP) compreende (b) cada domínio de ligação neurotrofina 1 [SEQ ID NO. 4], 2 [SEQ ID NO. 5], 4 [SEQ ID NO. 7] e 5 [SEQ ID NO. 8] ou (c) cada um domínio de ligação de neurotrofina 1 [SEQ ID NO. 4], 3 [SEQ ID NO. 6], 4 [SEQ ID NO. 7] e 5 [SEQ ID NO. 8]. Além disso, preferencialmente o p75NTR(NBP) compreende um domínio extracelular 2 [SEQ ID NO. 3], ou uma porção do mesmo que compreende (a), (b) ou (c) acima. Além disso, preferencialmente o p75NTR (NBP) compreende um domínio extracelular 1 [SEQ ID NO. 2] ou uma porção do mesmo que compreende (a), (b) ou (c) acima.
[0038] De preferência, o p75NTR(NBP) liga-se a cada uma das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5, de preferência de NGF humano, NT3, BDNF e NT4/5. Além disso, de preferência o p75NTR(NBP) liga-se a cada uma das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5, preferencialmente de NGF humano, NT3, BDNF e NT4/5, preferencialmente, com uma constante de ligação equivalente a ou a mesma que a sequência completa nativa p75NTR [SEQ ID NO. 1]. As constantes de ligação podem ser determinadas utilizando os ensaios aqui descritos, como ressonância de plasma de superfície a 20 °C, os ensaios para as constantes de ligação de proteínas nativas são conhecidos e compreendem ensaios baseados em células conhecidas na arte. Preferencialmente, o p75NTR(NBP) protege um ou mais das neurotrofinas acima mencionados da degradação no plasma ou outros fluidos corporais, in vitro ou in vivo, e/ou manter um equilíbrio homeostático de uma ou mais das neurotrofinas acima mencionadas comparado com a sua biologicamente forma livre.
[0039] A p75NTR(NBP) da presente invenção, liga-se preferencialmente a um ou mais de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kd) entre cerca de 0,1 nM a cerca de 50 nM. Em algumas formas preferidas, a afinidade de ligação (Kd) é entre cerca de 0,1 nM e qualquer valor cerca de 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 1,5 nM, 2 nM, 2,5 nM, 3 nM, 3,5 nM, 4 nM, 4,5 nM, 5 nM, 5,5 nM, 6 nM, 6,5 nM, 7 nM, 7,5 nM, 8 nM, 8,5 nM, 9 nM, 9,5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM, 40 nM , 45 nM ou 50 nM, como medido em um ensaio de ligação in vitro para NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, tal como aqui descrito, de preferência como medido por ressonância de plasma de superfície, a 20 °C. Em algumas outras formas preferidas posteriores, a afinidade de ligação (Kd) é ou é inferior a qualquer aproximadamente 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 950 pM ou 1 nM, como medido em um ensaio de ligação in vitro para p75NTR(NBP) com as neurotrofinas, tal como aqui descrito, preferencialmente, como medido por ressonância de plasma de superfície, a 20 °C. Em outra forma posterior mais preferida, a afinidade de ligação (Kd) é de cerca de 0,3 nM ou de cerca de 1 nM, como medido em um ensaio de ligação in vitro para p75NTR(NBP) com as neurotrofinas, como aqui descrito, de preferencialmente, tal como medido por ressonância de plasma de superfície, 20 °C.
[0040] Além disso, preferencialmente p75NTR(NBP) afeta a atividade funcional das neurotrofinas acima mencionadas, (definida como modulando ou para cima ou para baixo a regulação da atividade funcional das neurotrofinas) NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, por exemplo, a atividade funcional das referidas neurotrofinas resultantes da sua interação com seus respectivos receptores.
[0041] De preferência, o p75NTR(NBP) afeta a atividade funcional de BDNF como avaliado por ensaio funcional de qualquer um de crescimento e diferenciação de neurônios e sinapses, sobrevivência e diferenciação de células neuronais em cultura, a sinalização de Trk, estimulação do desenvolvimento axonal in vitro ou in vivo.
[0042] De preferência, o p75NTR(NBP) afeta a atividade funcional de NGF, tal como avaliado através da medição de ligação de NGF e a ativação de TrkA, como demonstrado em ensaios clássicos de sobrevivência de neurônios (como fornecido em Cowan, WM, Hamburger, V., Levi-Montalcini, R .. Annu Rev. Neurosci 2001;. 24:551-600).
[0043] De preferência, o p75NTR(NBP) afeta a atividade funcional de NT3, avaliada pela medição de ligação de NT3 e ativação da atividade do receptor Trk endógeno, tal como demonstrado na fosforilação do receptor Trk, ensaio de fosforilação da proteína quinase ativado por mitogênio ou ensaio de sobrevivência das células e os ensaios de extensão de neurites.
[0044] De preferência, o p75NTR(NBP) afeta a atividade funcional de NT4/5, como avaliada pela medição de NT4/5 em ensaios de fosforilação e ativação in vitro ou in vivo, por exemplo, os ensaios de fosforilação da proteína básica de mielina (MBP) ou, alternativamente, num ensaio in vivo de angiogênese Matrigel do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)/angiogênese induzida por fator de crescimento de básico de fibroblastos.
[0045] De preferência, o p75NTR(NBP) liga-se aos resíduos de contato de uma ou mais das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5, como mostrado em He e Garcia (2001) Science, 301, páginas 870805.
[0046] De preferência, o p75NTR(NBP) é solúvel, preferencialmente solúvel em solução aquosa, preferencialmente, solúvel em fluido biológico tal como soro, plasma, sangue.
[0047] - De acordo com um segundo aspecto da presente invenção é fornecido um p75NTR(NBP) para utilização de acordo com o primeiro aspecto, em que, o p75NTR(NBP) compreende p75NTR(NBP), preferencialmente a p75NTR(NBP) do primeiro aspecto, ligado a uma ou mais moléculas auxiliares. De preferência, o p75NTR(NBP) está ligado a uma ou mais moléculas auxiliares, através de um ou mais ligantes.
[0048] De preferência, a uma ou mais moléculas auxiliares são selecionadas a partir de; (a) de transferrina ou uma porção sua, preferencialmente, a transferrina é transferrina humana, preferencialmente a SEQ ID NO. 9, (b), albumina ou uma porção da mesma, preferencialmente, a albumina é albumina humana, de preferencialmente a SEQ ID NO. 10 (c), uma imunoglobulina Fc ou uma porção sua, preferencialmente a Fc de imunoglobulina é Fc de imunoglobulina humana, (d) uma cadeia de polímero de polietilenoglicol (e) uma cadeia de carboidrato.
[0049] Tal como aqui utilizado, o termo, "Fc de imunoglobulina" ou "Fc de Ig" é entendida para significar a porção carboxi terminal de uma região constante da cadeia de imunoglobulina, de preferência, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, ou uma porção sua. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende 1) um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3, opcionalmente, com uma região de dobradiça da imunoglobulina, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, opcionalmente, com uma região de dobradiça da imunoglobulina, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, opcionalmente, com uma região de dobradiça da imunoglobulina, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, opcionalmente, com uma região de dobradiça da imunoglobulina, ou 5) uma combinação de dois ou mais domínios selecionados de CH1, CH2 e CH3, opcionalmente, combinado com uma região de dobradiça de imunoglobulina. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende pelo menos uma região de dobradiça da imunoglobulina, um domínio CH2 e um domínio CH3, e, opcionalmente, um domínio CH1. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste de uma Fc ou uma porção de um Fc de uma imunoglobulina do isotipo selecionado de IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, adicional preferencialmente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgA, mais preferivelmente de IgG2 ou IgG4, mais preferivelmente de IgG2.
[0050] Opcionalmente, a Fc de imunoglobulina compreende também as mutações de aminoácidos, deleções, substituições ou modificações químicas, que servem para minimizar a fixação de complemento ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou que melhorem a afinidade de ligação ao receptor Fc. Mais preferivelmente, o Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em qualquer um de: (a) um domínio CH2 ou uma porção sua e um domínio CH3, ou parte do mesmo, (b) um domínio CH2 ou parte do mesmo, ou (c) um domínio CH3 ou uma porção sua, em que o Fc da imunoglobulina ou uma porção sua é do isotipo selecionado de IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ainda mais preferencialmente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, sIgA, mais preferivelmente de IgG2 ou IgG4, mais preferivelmente de IgG2.
[0051] De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste da região carboxi terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina e pode compreender a CH2 e/ou CH3, ou suas partes, a partir de isotipos de anticorpos IgG, IgA ou IgD, ou CH2 e/ou CH3 e/ou domínios de CH4, ou suas partes, de IgM ou IgE. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou é constituída por um fragmento de Fc, que compreende, principalmente, CH3 e uma pequena porção de CH2, como é derivável de digestão por pepsina da imunoglobulina. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste da região completa de Fc, compreendendo CH2 e CH3, ligado adicionalmente a região de dobradiça que é um curto segmento da cadeia pesada e que conecta as regiões CH1 e CH2 da imunoglobulina intacta, como pode ser produzido pela digestão com papaína da imunoglobulina. De preferência, a região de dobradiça de imunoglobulina compreende ou consiste de uma região de dobradiça ou de parte de uma região de dobradiça derivada de uma IgG preferencialmente de IgG humana, mais de preferência, selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, mais preferencialmente de IgG1 ou, é alternativamente, uma espécie ou variante alélica das formas anteriores de região de dobradiça. A região de dobradiça ou uma parte de uma região de dobradiça da imunoglobulina pode estar localizada na extremidade C ou N-terminal da região Fc, de preferência, na extremidade N-terminal.
[0052] De acordo com uma preferida forma da presente invenção, o Fc de imunoglobulina compreende preferivelmente ou consiste de um Fc ou uma porção de um Fc de uma imunoglobulina que compreende uma ou mais mutações de aminoácidos da sequência de tipo selvagem na região de CH2 que reduz a função efetora Fc. Preferivelmente, estas mutações são A330, P331 para S330, S331 (numeração de aminoácido com referência à sequência de tipo selvagem de IgG2, em que a região CH2 está na região constante da cadeia pesada de IgG2: [Eur. J. Immunol (1999) 29:2613 -2624]. Preferencialmente o Fc da imunoglobulina está glicosilada e altamente carregado em pH fisiológico, portanto, ajudando a solubilizar o p75NTR(NBP). A região Fc permite também a detecção do p75NTR(NBP) por anti Fc de ELISA, por exemplo, em propósitos de diagnóstico. A p75NTR(NBP) da invenção é preferencialmente sintetizada em células que glicosilam a Fc Ig de preferência em sítios normais de glicosilação.
[0053] De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste de uma região Fc de imunoglobulina humana de sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, ou uma espécie ou variante alélica dos mesmos ou a domínios CH2 e CH3, ou suas porções derivadas a partir da SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
[0054] De acordo com a presente invenção, o p75NTR(NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares, de preferência demonstra propriedades biológicas vantajosas de solubilidade melhorada do p75NTR(NBP) e/ou estabilidade de p75NTR(NBP) e/ou meia-vida melhorada no soro do p75NTR(NBP). A solubilidade melhorada é desejável, de modo que a biodisponibilidade do p75NTR(NBP) seja maximizada na administração e dosagem precisa do p75NTR(NBP) possa ser conduzida e determinada. A solubilidade melhorada é vantajosa para sobrepujar o problema dos agregados que são indesejáveis causando dor na liberação in vivo, levando a uma inflamação potencial. A meia-vida melhorada no soro tem a vantagem de facilitar a níveis reduzidos ou reduzindo a frequência da dose necessária durante a sua utilização no tratamento, a fim de conseguir ou manter o efeito terapêutico equivalente do p75NTR(NBP) liberado. Uma meia-vida prolongada e maior estabilidade no sangue ou soro tem a vantagem de permitir que um regime de dosagem com doses menos frequentes e/ou a níveis de dosagem mais baixos, consequentemente, reduzam a toxicidade potencial ou os efeitos colaterais in vivo. Neste caso, o p75NTR(NBP) é mais potente no seu efeito terapêutico e/ou mais estável na circulação. As doses menores ou menos frequentes resultantes são vantajosas em minimizar quaisquer potenciais efeitos tóxicos ou efeitos colaterais potencialmente associados à administração de p75NTR(NBP). O peso molecular do p75NTR(NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares, também é aumentado acima do p75NTR(NBP) sozinho, isto tem a vantagem de que a molécula será bem retida na circulação sanguínea quando administrados por via intravenosa, reduzindo o risco de penetração de locais não desejados, por exemplo, o sistema nervoso central e tornando a molécula apropriada para retenção ou concentração nos tecidos-alvo.
[0055] De preferência, o p75NTR(NBP) ligado a uma ou mais moléculas auxiliares demonstra uma melhor solubilidade do p75NTR(NBP) e/ou uma melhor estabilidade de p75NTR(NBP) e/ou meia-vida melhorada no soro em comparação com p75NTR (NBP) não são ligados. De preferência, a solubilidade melhorada é a solubilidade numa solução aquosa, tal como água, de preferência com excipientes, tais como tampões e/ou sais de preferência num pH fisiológico, de preferência entre pH 5 a pH 8, preferencialmente cerca de pH 7, ou a solubilidade em um fluido biológico, como soro ou sangue. De preferência, a estabilidade melhorada é a estabilidade da atividade ou a integridade estrutural da proteína p75NTR(NBP), devido aos efeitos de desnaturação, a oxidação, a fragmentação ou agregação durante um período de tempo, durante um período de armazenamento ou após congelamento e descongelamento. A estabilidade estrutural pode ser avaliada por medidas convencionais de desnaturação, a oxidação, a agregação ou a agregação, a estabilidade da atividade pode ser medida por ensaios de ligação ou funcionais aqui descritos, os métodos de medição da meia-vida da proteína no soro são conhecidos.
[0056] De preferência, o p75NTR(NBP) ligado a uma ou mais moléculas auxiliares pode ser expressa em níveis elevados a partir de uma variedade de células hospedeiras de mamíferos para fornecer uma única espécie e pode ser eficientemente purificada por cromatografia de afinidade, por exemplo, por ligação à proteína A de Staphylococcus aureus. De preferência o p75NTR(NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares podem dimerizar e preferencialmente o dímero tem maior afinidade para as neurotrofinas NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, em comparação com p75NTR(NBP) não tão ligados. A ligação mais estreita tem a vantagem de uma potência mais elevada e um efeito terapêutico mais elevado, como avaliado para os efeitos p75NTR(NBP), por exemplo, como determinado por ensaios funcionais de neurotrofina aqui revelados. Potência mais elevada tem a benefício de que a p75NTR(NBP) pode ser utilizado em quantidades de dose mais baixas para atingir o mesmo efeito terapêutico, portanto, reduzindo a toxicidade ou os efeitos colaterais potenciais in vivo.
[0057] De preferência, a p75NTR(NBP) da invenção tem uma meia- vida in vivo de cerca de ou mais de qualquer um de 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 ou 210 horas +/- 1 hora, ainda mais preferivelmente a p75NTR(NBP) da invenção tem uma meia-vida in vivo de cerca de 24 horas ou mais.
[0058] Além disso, de preferência a p75NTR(NBP) da invenção tem uma meia-vida in vitro de cerca de ou mais de qualquer um de 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 , 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 , 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 , 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 ou 210 dias de +/- 1 dia, mais preferencialmente a p75NTR(NBP) da invenção tem uma meia-vida in vitro de cerca de ou mais que 6 dias. De preferência, a estabilidade é medida a cerca do pH fisiológico, numa solução aquosa tamponada, de preferência a 20 °C ou 37 °C.
[0059] De acordo com as formas preferidas acima mencionadas, preferencialmente a meia vida in vivo é meia vida em ratos ou meia vida em humanos, mais preferencialmente em humanos. De preferência, a meia vida é determinada a partir de medições no soro dos níveis de p75NTR(NBP) da invenção após a administração in vivo, por exemplo, por injeção intravenosa ou subcutânea.
[0060] Ainda de acordo com o segundo aspecto da invenção, o ligante é preferencialmente selecionado a partir de: (a) uma ligação covalente, (b) uma ligação não covalente, (c), de uma ligação peptídica, (d) um aminoácido ou de uma pluralidade de aminoácidos compreendendo um peptídeo. De preferência, o p75NTR(NBP) está ligado a mais do que uma molécula auxiliar, opcionalmente cada molécula auxiliar é a mesma ou diferente ou uma mistura da mesma e diferente. Além disso, de preferência a mais de uma molécula auxiliar compreende um multímero ou uma pluralidade de moléculas auxiliares ligadas ao p75NTR(NBP) através de um ligante, e em que cada molécula pode ser a mesma ou diferente ou uma mistura de mesma e diferente.
[0061] De preferência, o ligante compreende ou consiste em um ou uma pluralidade de aminoácidos ou compreende ou consiste de uma sequência polipeptídica de aminoácidos, de preferência cerca de 1 a cerca de 25 aminoácidos, de preferência, qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos mais preferencialmente qualquer um de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 aminoácidos, mais preferencialmente 13 aminoácidos.
[0062] De preferência, o ligante compreende ou consiste de uma sequência polipeptídica de aminoácidos que não tem qualquer estrutura secundária estável, como alfa-hélice, cadeia beta, hélice 310 e hélice pi, hélice poliprolina, folha alfa. De preferência a região de ligação compreende ou consiste de uma sequência polipeptídica de aminoácidos que define um polipeptídio flexível ou dinâmico ou não estruturado, como, por exemplo, uma alça flexível, espiral aleatória ou curva flexível, tais polipeptídeos não estruturados são frequentemente encontradas conectando regiões de estrutura secundária em grande molécula de proteína.
[0063] De preferência, o ligante é uma sequência polipeptídica de aminoácidos que compreende mais do que ou cerca de 50% de glicina e/ou alanina e/ou serina no p75NTR(NBP), ainda mais preferencialmente mais do que ou cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de glicina e/ou alanina e/ou serina no p75NTR(NBP). De preferência a região de ligação compreende ou consiste de uma sequência polipeptídica de aminoácidos que compreende ambas glicina e serina, de preferência, com uma proporção maior de glicina que serina, de preferência a região de ligação compreende ou consiste em ligadores flexíveis, SEQ ID NO. 17 (GGGGS)n (n = 1 a 4), ou ligadores em hélice, SEQ ID NO. 18 (EAAAK)n (n = 2 to5) ou ligadores polipeptídicos incluindo predominantemente resíduos de aminoácidos selecionados de glicina, serina, alanina, treonina variando de 1 a 10 repetições de cada aminoácido e qualquer combinação dos mesmos.
[0064] De preferência, o ligante supera ou previne o impedimento estérico da molécula auxiliar que poderia interferir com a capacidade de ligação a neutrofina acima mencionada ou a atividade biológica do p75NTR(NBP), quando comparada com p75NTR(NBP), que não está ligado a uma molécula auxiliar. Por isso, a região ligante preferencialmente permite flexibilidade entre o p75NTR(NBP) e a molécula auxiliar e permite a retenção da ou melhoria da atividade biológica acima mencionada de p75NTR(NBP), em comparação com p75NTR(NBP) livre ou nativo não tão ligados como determinado pela ligação a neurotrofinas usando ensaios de ligação, tais como aqui descrito.
[0065] Ainda de preferência, o ligante é imunologicamente inerte, tal que não provoca a lise mediada por complemento, não estimula a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), não ativa a microglia ou células T. De preferência a região de ligação é reduzida, em uma ou mais destas atividades.
[0066] Ainda de preferência, o ligante compreende ou consiste de um polipeptídeo conhecido ou predito a partir da análise estrutural ou predição estrutural a ser um polipeptídeo flexível ou dinâmico ou não estruturado ou a ausência de uma estrutura secundária estável.
[0067] Mais preferencialmente, o ligante compreende ou consiste em uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO. 19 (GGGGS).
[0068] A p75NTR(NBP) da invenção pode também compreender um sítio de clivagem proteolítica, opcionalmente interposto entre a p75NTR(NBP) e a molécula auxiliar. O sítio de clivagem proteolítica pode ser localizado no ligante ou na junção do ligante com o p75NTR (NBP) e/ou a molécula auxiliar. O p75NTR(NBP) pode opcionalmente ser clivado a partir da molécula auxiliar antes da formulação e ou a administração ou para fins terapêuticos.
[0069] De preferência, o ligante e/ou uma ou mais moléculas auxiliares não prejudicam ou não afetam significativamente o p75NTR(NBP): (a) efeito sobre a atividade funcional das neurotrofinas (definida como modulando para cima ou para baixo a regulação da atividade funcional das neurotrofinas) NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, (b) afinidade de ligação para qualquer de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação de cerca de 0,1 nM a cerca de 50 nM (c) capacidade de se ligar a cada uma das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5, de preferência de NGF, NT3, BDNF e NT4/5 humanos.
[0070] De acordo com uma forma preferida dos aspectos um e dois da presente invenção, é fornecido um p75NTR(NBP) da presente invenção é fornecido um p75NTR(NBP) para uso no tratamento da dor, em que o p75NTR(NBP) consiste de: (A) um p75NTR(NBP) da sequência SEQ ID NO. 3, e, opcionalmente, (B) um Fc de imunoglobulina, e ainda opcionalmente consistindo da sequência SEQ ID NO. 11 e, opcionalmente, (C) de um ligante, opcionalmente, que consiste da SEQ ID NO. 19.
[0071] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica o p75NTR(NBP) ou p75NTR(NBP) ligado a uma ou mais moléculas auxiliares de acordo com primeiro ou segundo aspecto. De preferência, a molécula de ácido nucleico é para uso no tratamento da dor.
[0072] De acordo com uma forma preferida da presente invenção, a molécula de ácido nucleico pode ainda compreender uma região que codifica uma sequência sinal, preferencialmente uma sequência sinal p75NTR, por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA.
[0073] De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão replicável para transfecção de uma célula, o vetor compreende a molécula de ácido nucleico do terceiro aspecto, de preferência, o vetor é um vetor viral. De preferência, o vetor é para ser usado no tratamento da dor.
[0074] Ainda de acordo com o terceiro ou quarto aspectos do invento, é fornecido um método de expressão da molécula de ácido nucleico ou o vetor da invenção para produzir ou secretar o p75NTR(NBP) ou p75NTR(NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares. De preferência, o método compreende a introdução da molécula de ácido nucleico ou vetor numa célula e expressão do ácido nucleico na mesma para produzir ou secretar o p75NTR(NBP) ou p75NTR(NBP), ligado a uma ou mais moléculas auxiliares. De preferência, a molécula de ácido nucleico ou vetor é introduzido na célula in vitro, alternativamente in vivo. De preferência, o p75NTR(NBP) expresso ou p75NTR(NBP) ligado a uma ou mais moléculas auxiliares é expresso in vitro, ainda opcionalmente isolado e purificado, alternativamente, de preferência o p75NTR(NBP) expresso ou p75NTR(NBP) ligado a um ou mais moléculas auxiliares é expressa in vivo, de preferência, a expressão in vivo constitui a terapia genética. De preferência, o vetor é um vetor de expressão replicável, opcionalmente para a transfecção de uma célula de mamífero, de preferência, o vetor é um vetor viral.
[0075] De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecida uma célula hospedeira que contém a molécula de ácido nucleico ou vetor quer do terceiro ou quarto aspecto, de preferência, a célula é uma célula de mamífero.
[0076] De acordo com um sexto aspecto da invenção é fornecido o p75NTR(NBP) para utilização de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as formas preferidas da mesma, ou o ácido nucleico ou um vetor para uso de acordo com o terceiro e quarto aspectos, em que a dor ou sintoma de dor é selecionado a partir de: (a) dor aguda e/ou dor espontânea, (b) a dor crônica e/ou dor em curso, (c) dor inflamatória, incluindo qualquer uma de dor artrítica, dor resultante de osteoartrite ou artrite reumatoide, resultante de doenças inflamatórias do intestino, psoríase e eczema (d) dor nociceptiva, (e) dor neuropática, incluindo a neuropatia diabética dolorosa ou dor associada à neuralgia pós herpética, (f) hiperalgesia, (g) alodinia, (h) dor central, dor central pós-acidente vascular cerebral, dor resultante de esclerose múltipla, dor resultante de lesão medular, ou dor resultante de doença de Parkinson ou epilepsia, (i) dor do câncer,
[0077] (j) dor pós operatória, (k) dor visceral, incluindo dor visceral digestiva e dor visceral não digestiva, dor devido a distúrbios gastrointestinais (GI), dor resultante de distúrbios intestinais funcionais (FBD), dor resultante de doenças inflamatórias intestinais (IBD), dor resultante da dismenorreia, dor pélvica, cistite, cistite intersticial ou pancreatite,
[0078] (l) a dor músculo esquelética, mialgia, fibromialgia, espondilite, artropatias soro negativas (não-reumatóides), reumatismo não articular,distrofinopatias, Glicogenólise, polimiosite, Piomiosite, (m) dor cardíaca ou vascular, dor devido a angina, infarto do miocárdio, estenose mitral, pericardite, fenômeno de Raynaud, escleroderma ou isquemia do músculo esquelético, (n) dor de cabeça incluindo enxaqueca, enxaqueca com aura, enxaqueca sem aura dor de cabeça pulsátil, cefaleia do tipo tensional. (o) dor orofacial, incluindo dor dental, dor miofascial temporomandibular ou zumbido, ou (p) a dor nas costas, bursite, dores menstruais, enxaqueca, dor referida, neuralgia trigeminal, hipersensibilização, a dor resultante de trauma e/ou degeneração da coluna vertebral ou acidente vascular cerebral.
[0079] De acordo com um sétimo aspecto da invenção é fornecido o p75NTR(NBP) para utilização de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor para utilização de acordo com o terceiro e quarto aspectos, em que o p75NTR(NBP) ou a molécula de ácido nucleico ou vetor é para utilização isolada, sequencial ou simultânea combinados com um segundo composto farmacologicamente ativo. De preferência, o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação é selecionado a partir de; • um analgésico opióide, por exemplo, morfina, heroína, a hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanil, cocaína, codeína, diidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina e pentazocina; um medicamento antiinflamatório não esteróide (AINE), por exemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindaco, tolmetina ou zomepirac; um sedativo barbitúrico, por exemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, meto-hexital, pentobarbital, phenobartital, secobarbital, talbutal, theamylal ou tiopental; um benzodiazepínico tendo uma ação sedativa, por exemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam; um antagonista H1 tendo uma ação sedativa, por exemplo, difenidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina; um sedativo como glutetimida, meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona; um relaxante do músculo esquelético, por exemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol ou orphrenadine; um antagonista do receptor de NMDA, por exemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidróxi-N-metilmorfinano), ou seu metabólito dextrorfano ((+)-3-hidróxi-N-metilmorfinano), cetamina, memantina, pirroloquinolina quinina, ácido cis- 4-(fosfonometil)-2-piperidinocarboxílico, budipina, EN- 3231 (MorphiDex®, uma formulação de combinação de morfina e dextrometorfano), topiramato, neramexano ou perzinfotel incluindo um antagonista de NR2B, por exemplo ifenprodil, traxoprodil ou (-)-(R)-6-{2-[4-(3-fluorofenil)-4-hidróxi- 1-piperidinil]-1-hidróxietil-3,4-dihidro-2(1H) quinolinona; um alfa-adrenérgicos, por exemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinil, ou 4- amino-6,7-dimetoxi-2-(5-metano-sulfonamido-1,2,3,4- tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil)-quinazolina; um antidepressivo tricíclico, por exemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina ou nortriptilina; um anticonvulsivante, por exemplo, carbamazepina, lamotrigina, topiramato ou valproato; uma taquicinina (NK) antagonista, particularmente um antagonista de NK-3, NK-2 ou NK-1, por exemplo, (αR,9R)-7- [3,5-bis(trifluorometil)benzil]-8,9,10,11-tetrahidro-9- metil-5-(4-metilphenil)-7H-[1,4]diazocino[2,1-g][1,7]- naftiridine-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1- [3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorophenil)-4- morfolinil]-metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK- 869), aprepitant, lanepitant, dapitant e 3-[[2-metoxi-5- (trifluorometoxi)fenil]-metilamino]-2- fenilpiperidina(2S,3S); um antagonista muscarínico, por exemplo, oxibutinina, tolterodina, propiverina, cloreto de tropsium, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratrópio; um inibidor seletivo da COX-2, por exemplo, celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib, ou lumiracoxib; um analgésico de alcatrão de carvão, em particular paracetamol; um neuroléptico como droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazine, trifluoperazina, flufenazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazol, blonanserina, iloperidona, perospirona, racloprida, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidone, amissulprida, balaperidona, palindor, eplivanserina, osanetant, rimonabant, meclinertant, Miraxion® ou sarizotan; um agonista do receptor vaniloide (por exemplo resinferatoxin) ou antagonista (por exemplo, capsazepina); um beta-adrenérgico, como o propranolol; um anestésico local como a mexiletina; um corticosteroide como a dexametasona; um agonista ou antagonista do receptor 5-HT, particularmente um agonista 5-HT1B/1D, tais como eletriptano, sumatriptano, naratriptano, zolmitriptano ou rizatriptano; um antagonista do receptor 5-HT2A tal como R(+)-alfa-(2,3- dimetoxi-fenil) -1 - [2 - (4-fluorofeniletil)]-4- piperidinametanol (MDL-100907); um analgésico colinérgico (nicotínico), como isproniclina (TC-1734), (E)-N-metil-4-(3-piridinil)-3-buteno-1-amino (RJR-2403), (R) - 5 - (2-azetidinilmetoxi)-2-cloropiridina (ABT-594) ou nicotina; Tramadol®; um inibidor de PDEV, como 5-[2-etoxi-5-(4-metil-1- piperazinil-sulfonil)fenil]-1-metil-3-n-propil-1,6- dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona (sildenafil), (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-hexahidro-2-metil-6-(3,4- metilenodioxifenil)-pirazino[2',1':6,1]-pirido[3,4- b]indol-1,4-diona (IC-351 ou tadalafil), 2-[2-etoxi-5-(4- etil-piperazina-1-il-1-sulfonil)-fenil]-5-metil-7-propil- 3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (vardenafil), 5-(5- acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-etil-3- azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7- ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1- isopropil-3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3- d]pirimidin-7-ona, 5-[2-etoxi-5-(4-etilpiperazin-1- ylsulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-[2-metoxietil]-2,6- dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 4-[(3-cloro-4- metoxibenzil)amino]-2-[(2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1- il]-N-(pirimidin-2-ilmetil)pirimidina-5-carboxamida, 3-(1- metil-7-oxo-3-propil-6,7-dihidro-1H-pirazolo[4,3- d]pirimidin-5-il)-N-[2-(1-metilpirrolidin-2-il)etil]-4- propoxibenzenosulfonamida; um canabinoide; antagonista do receptor metabotrópico de glutamato subtipo 1 (mGluR1); um inibidor da recaptação da serotonina, tais como a sertralina, o metabólito da sertralina demetilsertralina, fluoxetina, norfluoxetina (desmetil fluoxetina), fluvoxamina, paroxetina, citalopram, o metabólito do citalopram desmetilcitalopram, escitalopram, d,l- fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxetina, nefazodona, cericlamina e trazodona; um inibidor da recaptação de noradrenalina (norepinefrina), como maprotilina, lofepramina, mirtazepina, oxaprotilina, fezolamina, tomoxetina, mianserina, bupropiona, o metabólito bupropiona hidroxibupropriona, nomifensina e viloxazina (Vivalan®), especialmente um inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina, como a reboxetina, em particular (S,S)-reboxetina; um inibidor seletivo duplo da recaptação de serotonina- noradrenalina, como venlafaxina, o metabólito da venlafaxina O-desmetilvenlafaxina, clomipramina, o metabólito da clomipramina desmetilclomipramina, a duloxetina, milnacipran e imipramina; um inibidor da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) tal como S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, S-[2 - [(1-iminoetil)-amino]etil]-4,4-dioxo-L-cisteína, S-[2-[(1- iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-cisteína, ácido (2S, 5Z)- 2-amino-2-metil-7-[(1-iminoetil)amino]-5-heptenóico, 2- [[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)-butil]tio]-5- cloro-3-piridinocarbonitrilo; 2-[[(1R, 3S)-3-amino-4- hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-4-clorobenzonitrilo,(2S, 4R)-2-amino-4-[[2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]tio]-5- tiazolebutanol,2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5- tiazolil)butil]tio]-6 (trifluorometil)-3- piridinacarbonitrilo, 2-[[(1R,3S)-3- amino-4-hidroxi-1-(5- tiazolil)butil]tio]-5- clorobenzonitrilo, N-[4-[2-(3- clorobenzilamino)etil] fenil]tiofeno-2-carboxamidina,ou guanidinoetildissulfito; • um inibidor da acetilcolinesterase, como donepezil; • um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4) como N- [({2-[4-(2-etil-4,6-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-1- il)fenil]etil}amino)-carbonil]-4-metilbenzenesulfonamida ou ácido 4-[(1S)-1-({[5-cloro-2-(3-fluorofenoxi)piridina- 3-il] carbonil}amino)etil] benzóico; • um antagonista de leucotrieno B4; como ácido 1-(3-bifenil- 4-ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)- ciclopentanocarboxílico (CP-105696), ácido 5-[2-(2-carboxietil) -3-[6-(4- metoxifenil)-5E-hexenil]oxifenoxi] valerico (ONO-4057) ou DPC-11870, • um inibidor da 5-lipoxigenase, como zileuton, 6-[(3-fluoro- 5-[4-metoxi-3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il])fenoxi- metil]-1-metil-2-quinolona (ZD-2138), ou 2,3,5-trimetil-6- (3-piridilmetil), 1,4-benzoquinona (CV-6504); • um bloqueador de canal de sódio, como lidocaína; ou • um antagonista 5-HT3, como ondansetron; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos deles.
[0080] De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratar, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de qualquer dor ou da dor já mencionada e/ou sintomas de dor em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos.
[0081] De preferência o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um animal de companhia, tal como um cavalo, um gato ou cão ou um animal de exploração, como a ovelha, vaca ou porco. Mais preferivelmente, o mamífero é um ser humano.
[0082] De acordo com um nono aspecto da presente invenção proporciona-se uma composição farmacêutica por qualquer um ou mais para tratar, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de qualquer dor ou da dor já mencionada/ou sintomas, compreendendo o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo e sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.
[0083] De preferência, o p75NTR(NBP) de acordo com os primeiro, segundo ou sétimo aspectos ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto é preparada para ou adequadas para administração oral, sublingual, bucal, tópica, retal, inalação, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intra-óssea, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intra-articular, periarticular, administração local ou epicutânea.
[0084] De preferência, o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto é preparada para, ou adequada para administração antes e/ou durante e/ou após o aparecimento da dor ou para tal uso.
[0085] De preferência, o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto ser para ou preparada para administração entre uma vez a sete vezes por semana, mais de preferência entre uma a quatro vezes por mês, de preferência entre mais uma vez até seis vezes por período de 6 meses, mais preferencialmente uma a doze vezes por ano. De preferência, o medicamento é para ser ou preparado para ser administrado perifericamente em um período selecionado de: uma vez por dia, uma vez em cada dois, três, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, mensalmente, uma vez em cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada sete meses, uma vez a cada oito meses, uma vez a cada nove meses, uma vez a cada dez meses, uma vez a cada onze meses ou anualmente.
[0086] Além disso, de preferência o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto é para ser ou preparado para ser administrado perifericamente por uma via selecionada a partir de uma ou mais de; via oral, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, via transdérmica, via subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular, via intracardíaca, através de administração intraóssea, intradérmica, intraperitoneal, por via transmucosa, por via vaginal, via intravítrea, epidérmica, intra-articular, peri-articular ou localmente.
[0087] De preferência, o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto ser para ou ser preparado para administração a uma concentração de entre cerca de 0,1 a cerca de 200mg/ml; preferencialmente, em qualquer uma de cerca de 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200mg/ml +/- cerca de 10% de erro, mais preferencialmente a cerca de 50mg/ml.
[0088] De preferência, o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto ser para ou ser preparado para administração a uma concentração de entre cerca de 0,1 a cerca de 200mg/kg de peso corporal; preferencialmente, em qualquer uma de cerca de 0,5, 1, 5, 20 10,15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110 , 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou cerca de 200mg/kg de peso corporal +/- cerca de 10% de erro, mais preferencialmente a cerca de 10mg/kg.
[0089] De acordo com um décimo aspecto do presente invento, é proporcionado um kit compreendendo: (a) o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto; e (b) instruções para a administração de uma quantidade eficaz do referido p75NTR(NBP), molécula de ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica a um indivíduo por qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento da dor e/ou sintomas de dor ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou sintomas de dor.
[0090] O kit pode incluir um ou mais recipientes que contêm o p75NTR(NBP), ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica aqui descrita e as instruções para o uso de acordo com qualquer um dos métodos e utilizações da presente invenção. O kit pode ainda incluir uma descrição da seleção de um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação se esse indivíduo tem uma dor ou um sintoma de dor ou está sob risco de ter. As instruções para a administração da composição farmacêutica pode incluir informação sobre a dose, esquema de dose e vias de administração para o tratamento pretendido.
[0091] De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente invenção fornece-se o p75NTR(NBP) de acordo com o primeiro, segundo ou sétimo aspecto ou as formas preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do nono aspecto para uso em qualquer uma ou mais de prevenção ou o tratamento ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão de um estado ou os sintomas de uma condição associada com qualquer uma ou mais das neurotrofinas O NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5.
[0092] O NGF (Fator de crescimento do nervo) liga-se com, pelo menos, duas classes de receptores: o p75NTR e TrkA, uma tirosina- quinase transmembrana, que está envolvida no crescimento axonal, ramificação e alongamento. Condições e sintomas associados com o NGF são conhecidos. O NGF é expresso e associado com condições inflamatórias e dor [Protein Sequence NP_002497.2, NP_038637]. Além disso, o NGF tem mostrado desempenhar um papel em um número de doenças cardiovasculares, como a aterosclerose coronariana, obesidade, diabetes do tipo 2, e síndrome metabólica, bem como na esclerose múltipla. Níveis plasmáticos reduzidos de NGF (e também de BDNF) têm sido associados com síndromes coronarianas agudas e síndromes metabólicas. O NGF também está relacionado com vários distúrbios psiquiátricos, tais como demência, depressão, esquizofrenia, autismo, síndrome de Rett, a anorexia nervosa e bulimia nervosa, e também tem sido implicada no desenvolvimento da doença de Alzheimer e desordens neurodegenerativas. NGF também tem mostrado acelerar a cicatrização de feridas e há evidências de que ele poderia ser útil no tratamento de úlceras na pele e úlceras na córnea, ele tem demonstrado reduzir a degeneração neural e para promover a regeneração do nervo periférico em ratos.
[0093] BDNF (Fator neurotrófico derivado do cérebro) é uma neurotrofina que embasa o crescimento e sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento do sistema nervoso [Protein Sequence NP_001137277.1, NP_001041604]. BDNF liga-se aos receptores de superfície celular TrkB e p75NTR e também modula a atividade do receptor nicotínico Alfa-7. Condições e sintomas associados com o BDNF são conhecidos. Foi demonstrado que o BDNF desempenha um papel importante na transmissão da dor fisiológica e patológica, particularmente em modelos de dor aguda, dor inflamatória e dor neuropática, onde a síntese de BDNF é encontrada significativamente aumentada; O BDNF também demonstrou ser regulado positivamente em condições de dor crônica, bem como outras condições tais como eczema e psoríase. A regulação negativa de BDNF é vista em depressão, esquizofrenia, transtorno obsessivo-compulsivo, doença de Alzheimer, doença de Huntington, síndrome de Rett, e demência, bem como anorexia nervosa e bulimia nervosa.
[0094] Neurotrofina-4 (NT-4), também conhecido como neurotrofina-5 (NT-5), é um fator neurotrófico que sinaliza predominantemente através do p75NTR e receptores TrkB e promove a sobrevivência dos neurônios simpáticos sensoriais periféricos. O peptídeo maduro desta proteína é idêntico em todos os mamíferos examinados, incluindo humanos, porco, ratazana e rato. [Sequência Proteína NP_006170, NP_937833]. O NT-4 é sintetizado pela maioria dos neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) e aqueles nos gânglios simpáticos paravertebral e pré-vertebral, espinha dorsal e corno ventral e se encontra expresso em muitos tecidos incluindo a próstata, timo, placenta e músculo esquelético. Condições e sintomas associados com o NT-4/5 são conhecidos. Defeitos em NT4/5 estão associados com a susceptibilidade ao glaucoma primário de ângulo aberto. A Neurotrofina 4, também tem demonstrado contribuir para a sobrevivência de células no câncer de mama e é um alvo para inibir o crescimento do tumor. Sabe-se que o NT-4/5 está envolvido em sistemas de sinalização da dor tal como a dor nociceptiva, a regulação positiva de NT-4/5, também é observada em condições inflamatórias crônicas da pele, tais como dermatite, eczema, lesões de prurido da dermatite atópica. A regulação negativa de NT-4/5 é observada na doença de Alzheimer, e a doença de Huntington.
[0095] Neurotrofina-3 (NT-3), é uma neurotrofina estruturalmente relacionada com a beta-NGF, BDNF, e NT-4, e que controla a sobrevivência e diferenciação de neurônios de mamíferos e a manutenção do sistema nervoso adulto, e pode afetar desenvolvimento de neurônios no embrião quando é expressa na placenta humana. Condições e sintomas associados com a NT3 são conhecidos. Camundongos deficientes de NTF3 gerados pela fragmentação do gene exibem graves defeitos de movimento dos membros. O NT-3 sinaliza por meio de receptores Trk e promove crescimento e sobrevivência do nervo e células da glia [NP_001096124.1 Proteína de Sequência e NP_032768]. As sequências de aminoácidos de ser humano, rato e ratazana NT-3 são idênticos. O NT3 e do seu receptor cognato, a tirosina- quinase C (TrkC), são conhecidos por modular a dor neuropática e dor nociceptiva e o mecanismo de nocicepção e proporiocepção, por exemplo, a expressão NT3 está aumentada em pequenas células de DRG de animais neuropáticos. A expressão NT-3 também está associada a neuropatias tais como a polineuropatia diabética e neuropatia associada ao HIV, neuropatia de fibras grossas incluindo atrofia, estando também envolvida no desenvolvimento de hiperalgesia (uma diminuição do limiar de um estímulo normalmente nocivo), alodinia (um estímulo não nocivo se torna nocivo), e dor espontânea (dor na ausência aparente de estímulo) e é um conhecido modulador da dor muscular.
[0096] A invenção será descrita agora por referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos para ilustrar, mas não limitam a invenção.
[0097] Os seguintes Exemplos são para fornecer ilustração não para limitar a invenção.
Exemplos: Exemplo 1. O complexo Neurotrofina-p75NTR(NBP) endógeno é detectado ao plasma humano
[0098] Um ensaio, utilizando esferas magnéticas de NGF (Millipore Corp, MA) e imunoprecipitação utilizando o anticorpo policlonal de NGF anti-humano biotinilado de cabra (Novus Biologicals, CO), seguido de SISCAPA (Siscapa http://siscapa.com/home.html), então, subsequentemente determinada em LC-MS/MS (LLOQ 7 pg/ml) foi utilizado para fornecer evidência direta da existência de um complexo p75NTR/NGF no plasma humano. O anticorpo policlonal anti-NGF, foi utilizado para quantificar NGF livre no soro/plasma humano.
[0099] As sequências de peptídeos (CAYGYYQDETTGR (SEQ ID NO. 4) VCEAGSGLVFSCQDK (SEQ ID NO. 6) WADAECEEIPGR (SEQ ID NO. 7) do domínio extracelular de p75NTR (como mostrado na Figura 2) foram selecionadas como padrões p75NTR por LC-MS/MS seguida à digestão de p75NTR quimérica. A co-imunoprecipitação de p75NTR detectada no ensaio de NGF total (como descrito acima) foi capaz de demonstrar a presença dos peptídeos controle de p75NTR fornecendo evidências de um complexo p75-NGF solúvel no soro humano. Interações similares de p75NTR(NBP) e BDNF, NT-3 e NT4/5 também foram determinadas utilizando co-imunoprecipitação com os respectivos anticorpos para BDNF, NT-3 e NT4/5. Estes estudos demonstram a presença de uma proteína ligadora da neurotrofina p75 solúvel no plasma de seres humanos, ligado a qualquer de NGF, BDNF, NT-3 e NT4/5.
[0100] Os dados apresentados na Figura 2 mostram fragmentos padrão do peptídeo p75NTR(NBP) solúveis e de co- imunoprecipitação de p75NTR(NBP) e NGF demonstrando o complexo p75NTR(NBP) no plasma humano. É evidente a partir dos resultados de estudos da co-imunoprecipitação p75NTR(NBP)-NGF no plasma humano, que os peptídeos principais envolvidos na ligação no complexo neurotrofina-p75NTR(NBP) são: WADAECEEIPGR (SEQ ID NO. 7), CAYGYYQDETTGR (SEQ ID NO. 4), VCEAGSGLVFSCQDK (SEQ ID NO. 6), adicionalmente, nós determinamos que a sequência LDSVTSDVVSATEPCKP (SEQ ID NO. 8) também é importante na ligação.
[0101] Os experimentos foram repetidos com BDNF e NT-3, mostrando a importância das mesmas regiões chave de ligação do p75NTR(NBP) e demonstrando a co-imunoprecipitação de p75NTR(NBP) com BDNF e NT-3 demonstrando os complexos p75NTR(NBP)-BDNF e p75NTR(NBP)- NT-3 no plasma humano.
Exemplo 2. O p75NTR(NBP) solúvel inibe a função do NGF na linhagem celular U20S expressando TrkA e em linhagem celular U20S co-expressando TrkA e p75NTR.
[0102] Os efeitos de p75NTR(NBP) sobre a função do NGF foi explorado em células U20S expressando TrkA e U20S células que co-expressam TrkA e p75NTR (Discoverx Corp CA). O ensaio foi realizado em conformidade com a metodologia de PathHunter (Discoverx Corp CA) resumidamente, as células U20S que expressam TrkA e TrkA + p75NTR foram adquiridas de DiscoveRx Corporation. As células U20S expressando TrkA e células co-expressando TrkA + p75NTR foram plaqueadas em meio mínimo essencial (MEM; Sigma Aldrich) + 0,5% de soro de cavalo (Sigma Aldrich), a uma densidade de 40.000 células/poço e incubadas à 37°C durante a noite. As placas foram retiradas da estufa 30 minutos antes da utilização e armazenadas à temperatura ambiente.
[0103] NGFα (Sigma Aldrich) e p75NTR(NBP)-Fc (p75NTR(NBP) SEQ ID NO.2 acoplado com IgG-Fc SEQ ID NO. 12 usando ligante SEQ ID NO. 17) ou p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP) SEQ ID NO. 2) ou p75NTR(NBP), acoplado a albumina, a SEQ ID NO. 10, ou p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP) SEQ ID NO. 2) acoplada a transferrina, a SEQ ID NO. 9, foram diluídos em solução salina balanceada de Hanks tampão (HBSS Sigma Aldrich), mais 0,25% de BSA. O NGF foi diluído em série para se obter concentrações que variam de 0nM a 200nM. P75NTR(NBP), acoplado a Fc de IgG, albumina ou transferrina foi diluída em HBSS para obter uma concentração de p75NTR de 100ng/ml.
[0104] 5μl de cada uma das concentrações de NGF (0-200nM) e 5μl de p75NTR(NBP)+/-transportador foram adicionados a cada poço. Na tentativa de compreender o impacto sobre a pré-incubação p75NTR(NBP)+/-transportador e NGF foram incubados à temperatura ambiente durante 20 minutos antes da adição de 10 μl desta mistura a cada poço. Imediatamente após a adição de NGF e p75NTR(NBP)+/-transportador 12μl solução de detecção (Discoverx Corp CA) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 60 minutos antes da leitura num leitor de placas Parkard Victor 2. Foram observadas as curvas de dose-resposta e desvios nas curvas de resposta à adição de p75NTR(NBP). Foram observadas supressão e desvios nas curvas de resposta de dose de NGF independentemente do transportador utilizado, p75NTR(NBP), sem transportador, p75NTR(NBP)-Fc, p75NTR(NBP)-albumina ou p75NTR(NBP)- transferrina (ver Figura 4).
Exemplo 3. O p75NTR(NBP) inibe a função de BDNF em células U20S expressando TrkB e células U20S co-expressando TrkB e p75NTR.
[0105] Os efeitos de p75NTR(NBP) na função de BDNF foi explorado em células U20S expressando TrkB e células U20S co-expressando TrkB e p75NTR (Discoverx Corp CA). O ensaio foi realizado em conformidade com a metodologia de PathHunter (Discoverx Corp CA) Resumidamente, as células U20S expressando TrkB e TrkB+p75NTR foram adquiridas da DiscoveRx Corporation. As células U20S expressando TrkB e as células que co-expressando TrkB+p75NTR foram semeadas em meio mínimo essencial (MEM; Sigma Aldrich) + 0,5% de soro de cavalo (Sigma Aldrich), a uma densidade de 40000 células/poço e incubadas a 37°C durante a noite. As placas foram removidas da estufa, 30 minutos antes de utilizar e armazenado à temperatura ambiente.
[0106] BDNFα (Sigma Aldrich) e p75NTR(NBP)-Fc(p75NTR(NBP) SEQ ID NO.2 acoplado com IgG-Fc SEQ ID NO. 12 usando ligante SEQ ID NO. 17) ou p75NTR(NBP)(p75NTR(NBP) SEQ ID NO. 2) ou p75NTR(NBP), acoplado à albumina, SEQ ID NO. 10, ou p75NTR(NBP)(p75NTR(NBP) SEQ ID NO. 2) acoplada à transferrina, a SEQ ID NO. 9, foram diluídos em solução tampão salina balanceada de Hanks (HBSS Sigma Aldrich), mais 0,25% de BSA. O BDNF foi diluído em série para obter concentrações que variam de 0nM a 200nM. O P75NTR(NBP) acoplado a Fc-IgG, albumina ou transferrina foi diluída em HBSS para obter uma concentração de p75NTR(NBP) 100ng/ml.
[0107] 5μl de cada uma das concentrações de BDNF (0-200nM) e 5 μl de p75NTR(NBP)+/-transportador foram adicionados a cada poço. Para tentar compreender o impacto na pré-incubação de p75NTR(NBP)+/-transportador e BDNF foram deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos antes de adicionar 10μl desta mistura a cada poço. Imediatamente após a adição de BDNF e p75NTR(NBP)+/-transportador foi adicionado 12μl de solução de detecção (Discoverx Corp CA) a cada poço e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 60 minutos antes da leitura num leitor de placas Parkard Victor 2. Foram observadas as curvas de dose-resposta e desvios nas curvas à adição de p75NTR(NBP). Foram observadas supressão e desvios nas curvas de dose-resposta de BDNF independentemente do transportador utilizado p75NTR(NBP) sem transportador, p75NTR(NBP)-Fc, p75NTR(NBP)-albumina ou p75NTR(NBP)-transferrina (ver Figura 5).
Exemplo 4. Dados Biocore demonstrando a ligação de p75NTR(NBP) a BDNF e a competição entre o anti-BDNF e p75NTR(NBP).
[0108] P75-Fc (p75NTR(NBP)-Fc), (500μg/ml) foi diluído para uma concentração de 25gμ/ml em 10 mM de acetato em pH 5.0 e imobilizada no chip Biocore usando o tampão de corrida HBS-P (0,005% P20) + 1mg/ml de BSA. Foi preparada uma solução estoque de BDNF (a partir de sistemas R e D) 2μM em HBS-P (0,005% P20) + 1mg/ml BSA. O experimento de competição de BDNF foi conduzido com p75 e na presença ou ausência de MAB248 (sistemas RandD anti-corpos de BDNF) nas seguintes concentrações: i) MAB248 (500nm) isolado, ii) O BDNF (20nM) + MAB248 (500nM) iii) BDNF (20nm) sozinho e iv) O BDNF (20nM) + MAB248 (100nM). Todas as amostras foram preparadas a partir de soluções estoque e diluídas em tampão de corrida; HBS-P (0,005% P20) + 1mg/ml de BSA. Todas as amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da injeção. Um sensorgrama manual foi iniciado ao longo do chip Biocore a um fluxo de 50μl/min. Cada amostra foi injetada durante 30 segundos, na ordem indicada acima em um ciclo sensorgrama separado. A regeneração foi realizada, quando necessário, com NaOH 5mM por 12 segundos ciclo (10μl). Como representado na figura 6 p75NTR(NBP) liga o BDNF.
Exemplo 5. A inibição de p75NTR(NBP) na atividade de NGF em células PC12
[0109] Foi demonstrado que o p75NTR(NBP) inibe significativamente a atividade do NGF em células PC-12 e células N2OS que expressando TrkA e/ou TrkA mais p75 na superfície celular, Figura 7.
[0110] Células PC12 de baixa passagem (passagem número 20-24) foram cultivadas diretamente em placas de 96 poços em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal bovino e 10% de soro de cavalo inativado por calor e penicilina- estreptomicina (10U/ml, 0,1mg/ml), e incubadas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2, 37°C. O NGF (50ng/ml) foi adicionado ao meio de crescimento para diferenciar as células PC12. A concentração da dose do p75NTR(NBP) de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,5, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1 ng/ml foi adicionada a cada poço da placa. A placa foi incubada a 37°C por 24 horas, e o número de células foi determinado por um contador de células. Como mostrado na Figura 8, a adição de p75NTR(NBP) ao meio bloqueou significativamente a diferenciação de células PC-12 para o seu fenótipo axonal. Na presença de NGF as células PC-12 diferenciam e formam um fenótipo neuronal semelhante. Este foi inibido de um modo dependente da dose em resposta a p75NTR (NBP). Concluiu-se desses estudos que p75NTR(NBP) bloqueia a ação de NGF.
Exemplo 6. A Proteína Ligante Neurotrófica p75NTR(NBP) inibe efeito do BDNF na hiperalgesia mecânica em modelo de excitabilidade nervosa.
[0111] Ratos Sprague Dawley machos foram anestesiados com isoflurano (5% em oxigênio para a indução, 1,5-2,0% em oxigênio para manutenção). A medula espinhal foi exposta por laminectomia lombar para descobrir a região de L4-L6 da espinha, e um microeletrodo de tungstênio inserido no corno dorsal para gravar a partir de um isolado de neurônios de ampla faixa dinâmica. Neurônios WDR individuais foram isolados tal que a amplitude de pico da unidade registrada foi de pelo menos três vezes o nível do ruído de linha de base. As respostas foram amplificadas utilizando um amplificador AC acoplado a um neurolog e gravado utilizando o software Spike2 CED. Antes da aplicação da droga, três respostas de linha de base estável (<10% de variação) foram obtidas para uma gama de estímulos naturais (escova, von Frey, compressão e calor). O estímulo da escova foi aplicado passando um fio de algodão fino no centro do campo receptivo periférico. Filamentos de von Frey e calor (usando um jato de água constante fixado em 43 graus) foram aplicadas durante um período de 10 segundos. Uma compressão foi aplicada por um período de 5 segundos. Uma vez que foram obtidas respostas de linha de base estáveis, BDNF isolado (500ng em BSA a 0,1%) ou BDNF (500ng)+p75NTR(NBP) (500ng pré-incubados durante 40 minutos antes da injeção) foi aplicada para o centro do campo receptivo, num volume de 25μl utilizando uma seringa de insulina. Os efeitos das drogas foram seguidos durante 150 minutos e os testes realizados em intervalos de 10 min. Ao término do experimento, o rato foi sacrificado por deslocamento cervical.
[0112] Como demonstrado na Figura 8, o BDNF causou um aumento significativo na excitabilidade neuronal e este foi amplificado após o estímulo. A adição de p75NTR(NBP) reduziu significativa a excitabilidade neuronal em resposta a todos os estímulos; salina, BDNF, escova e compressão. É evidente que p75NTR(NBP) reduz a excitabilidade neuronal e, subsequentemente, a dor. Exemplo 7 - Proteína ligante Neurotrófica p75NTR(NBP) inibe a hiperalgesia no modelo UVIH
Exposição de animais para UV
[0113] Ratos Sprague Dawley machos Charles River (175-200g) foram anestesiados com uma mistura de 2% de isofluorano em O2. A anestesia foi mantida através de um cone de nariz, enquanto a superfície plantar da pata traseira direita foi irradiada com 300mJ/cm2 de UV (sistema Saalmann CupCube, Saalmann GmbH, Alemanha; X=280-400nm). A fonte de irradiação foi adaptada para a superfície plantar da pata de ratos usando colar de liberação (8x12mm), ligado à fonte UV (Pfizer Facilities Management e Engineering Team). A intensidade das fontes de UV foi calibrada com o radiômetro 1400A ABLE com o filtro SEL005/WBS320/TD (ABLE Instruments and Controls Ltd). A exposição aos raios UV usados, causa eritema cutâneo em ratos sem tratamento e sem outros eventos adversos (sem perda de peso corporal, nenhum sinal de stress ou desconforto óbvio).
Avaliação da Hiperalgesia Térmica
[0114] A hiperalgesia térmica foi avaliada usando o teste plantar em rato (Ugo Basile, Itália) seguindo um método modificado de Hargreaves et al (1988). Os ratos foram habituados ao aparelho (15-30 minutos) antes do teste. O teste plantar consistiu em três caixas individuais de perspex em uma mesa de vidro elevada. Dois ratos foram alojados em cada caixa de modo que 6 ratos/aparelhos possam ser testados simultaneamente.
[0115] Uma fonte de calor infravermelha móvel foi aplicada diretamente abaixo da superfície plantar da pata traseira do rato. A latência de retirada da pata (PWL) foi definida como o tempo (em segundos) que o rato leva para retirar a sua pata traseira da fonte de calor. A fonte foi calibrada para dar uma resposta de 8-12 segundos em animais não tratados (105- 120mW/cm2). Um ponto de corte automático de 20 segundos foi ajustado para evitar danos nos tecidos.
[0116] Foram feitos cinco registros das patas traseiras de cada rato durante a medida das linhas de base (ratos sem tratamento prévio antes da exposição à UV, Dia 0) e a confirmação de aparecimento de hiperalgesia (dia 1). Foram realizadas duas sessões por dia nos dias 0 e 1.
[0117] Três gravações por pata foram coletadas ao invés das linhas de base e cada ponto de teste durante a avaliação da eficácia de medicamentos no dia 2, 3 e 4 (48, 72 e 96 horas após a exposição aos raios UV, respectivamente). A pata ilesa foi sempre avaliada primeiro.
[0118] A hiperalgesia térmica é definida como animais que apresentem média PWL <5 sec, que são selecionados para os estudos.
Avaliação da Alodinia Estática
[0119] Os animais são habituados a gaiolas de teste com fundo de arame antes da avaliação da alodinia. Os animais são familiarizados com os pêlos de von Frey pela aplicação de filamento 15g, 8g+4G no primeiro dia de habituação, filamento de 4g no segundo dia antes de uma medição completa para cima para baixo ser realizada. A alodinia estática é avaliada pela aplicação de pêlos de von Frey (Stoelting, Wood Dale, Illinois, EUA), em ordem crescente de força (0,6, 1, 1,4, 2, 4, 6, 8, 10, 15 e 26 gramas) ao plantar superfície das patas traseiras. Cada filamento de von Frey é aplicada à pata por um máximo de 6 segundos, ou até ocorrer uma resposta de retirada. Uma vez que uma resposta de retirada a um fio de pêlo de von Frey é estabelecida, a pata é retestada, começando com o filamento abaixo daquele que produziu a retirada e, posteriormente, com os filamentos restantes em ordem decrescente de força até que não haja retirada. A força máxima de 26g levanta a pata assim como desencadeia uma resposta, representando deste modo o ponto de corte. Cada animal tem as duas patas traseiras testadas desta forma. A quantidade mais baixa de força requerida para produzir uma resposta é registrada como limiar de retirada da pata (PWT) em gramas. A alodinia estática é definida como presente se os animais respondem a um estímulo de, ou inferior a, 4g, que é inócua, em ratos normais.
[0120] Os animais são medidos antes do teste e aqueles exibindo alodinia que atende aos critérios de inclusão são randomizados em PWL e são dosados. O composto de teste é dosado e em tempos pré-determinados (dependendo das propriedades farmacocinéticas do composto de teste), sequentes medidas de dose são feitas em tempos determinados após a administração e todos os dados são coletados para análise. Como demonstrado na Figura 9 os dados de PWL 10mg/kg de p75NTR(NBP) por via subcutânea (denominado NBPP- Fc) é mostrado em comparação com o controle, o ibuprofeno 100mg/kg e 10mg/kg de anticorpo anti-NGF por via subcutânea, os dados para a avaliação hiperalgesia térmica mostrou medidas equivalentes em cada caso. Citações Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24. Barthel C, Yeremenko N, Jacobs R, Schmidt RE, Bernateck M, Zeidler H, Tak PP, Baeten D, Rihl M. 2009. Nerve growth factor and receptor expression in rheumatoid arthritis and spondyloarthritis. Arthritis Res Ther. 11:R82.Bothwell MA, Shooter EM. 1977. Dissociation equilibrium constant of beta nerve growth factor. J Biol Chem 252:8532-8536. Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. 2011. Mitochondrial dependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia. Pain. 152:1832-7. Cirillo G, Cavaliere C, Bianco MR, De Simone A, Colangelo AM, Sellitti S, Alberghina L, Papa M. 2010. Intrathecal NGF administration reduces reactive astrocytosis and changes neurotrophin receptors expression pattern in a rat model of neuropathic pain. Cell Mol Neurobiol. 30:51-62. Cowan, W.M. 2001. Viktor Hamburger and Rita Levi-Montalcini: the path to the discovery of nerve growth factor. Annu. Rev. Neurosci. 24:551-600. 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Claims (15)

1. Uso de uma proteína ligante de neurotrofina p75NTR, a p75NTR(NBP), caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar a dor, em que a p75NTR(NBP) se liga a qualquer de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kd) de entre 0,1 nM a 50 nM, medida por ressonância de plasma de superfície, a 20°C.
2. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a p75NTR(NBP) compreender: (a) p75NTR(NBP), ligada a uma ou mais (b) moléculas auxiliares selecionadas a partir de: (b) transferrina ou uma porção sua, (c) albumina ou uma porção sua, (d) um Fc de imunoglobulina ou uma porção sua, (e) uma cadeia de polímero de polietileno glicol.
3. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a p75NTR(NBP) ser ligada a uma ou mais moléculas auxiliares por meio de um ou mais ligantes.
4. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a p75NTR(NBP) ser uma p75NTR(NBP) humana.
5. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a p75NTR(NBP) compreender um ou mais do domínio de ligação da neurotrofina 1 [SEQ ID NO. 4], 2 [SEQ ID NO. 5], 3 [SEQ ID NO. 6], 4 [SEQ ID NO. 7] ou 5 [SEQ ID NO. 8].
6. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a p75NTR(NBP) compreender: (a) uma ou mais da SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 ou SEQ ID NO. 8, (b) SEQ ID NO. 3 ou uma parte sua que compreenda (a), ou (c) SEQ ID NO. 2 ou uma parte sua que compreenda (a).
7. Uso da p75NTR (NBP), de acordo com a qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado por o ligante ser selecionado a partir de: (a) uma ligação covalente, (b) ligação não covalente, (c) uma ligação peptídica, [0001] (d) um aminoácido ou uma pluralidade de aminoácidos que compreendem um peptídeo.
8. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado por a p75NTR(NBP) estar ligada a mais de uma molécula auxiliar, opcionalmente, cada molécula auxiliar é a mesma ou diferente ou uma mistura da mesma e diferente.
9. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a mais de uma molécula auxiliar compreender um multímero de moléculas auxiliares ligadas ao p75NTR(NBP) através de um ligante, e em que cada molécula pode ser a mesma ou diferente ou uma mistura da mesma e diferente.
10. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o p75NTR(NBP) consistir em: (a) uma p75NTR(NBP) da sequência SEQ ID NO. 3, e opcionalmente (b) um Fc de imunoglobulina, opcionalmente, em que o Fc da imunoglobulina é selecionado a partir da SEQ ID NO. 12, 15 e 16, e ainda mais opcionalmente (c) um ligante, opcionalmente, em que o ligante é selecionado a partir da SEQ ID NO. 17, 18 e 19.
11. Uso de uma proteína ligante de neurotrofina p75NTR, a p75NTR(NBP), caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar a dor, em que a p75NTR(NBP) compreende um ou mais do domínio de ligação da neurotrofina 1 [SEQ ID NO. 4], 2 [SEQ ID NO. 5], 3 [SEQ ID NO. 6], 4 [SEQ ID NO. 7] ou 5 [SEQ ID NO. 8].
12. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a p75NTR(NBP) compreender: (a) uma ou mais da SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 ou SEQ ID NO. 8, (b) SEQ ID NO. 3 ou uma parte sua que compreenda (a), ou (c) SEQ ID NO. 2 ou uma parte sua que compreenda (a).
13. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por a dor ou o sintoma de dor ser selecionado a partir de: (a) dor aguda e/ou dor espontânea, (b) dor crônica e/ou dor espontânea, (c) dor inflamatória, incluindo qualquer uma de dor artrítica, dor resultante de osteoartrite ou artrite reumatóide, resultante de doenças inflamatórias do intestino, (d) dor nociceptiva, (e) dor neuropática, incluindo neuropatia diabética dolorosa ou dor associada a nevralgia pós-herpética, (f) hiperalgesia, (g) alodinia, (h) dor central, dor pós-acidente vascular central, dor resultante de esclerose múltipla, dor resultante de lesão da medula espinal, ou dor resultante de doença de Parkinson ou epilepsia, (i) dor de câncer, (j) dor pós-operatória, (k) dor visceral, incluindo dor visceral digestiva e dor visceral não digestiva, dor devido a gastrointestinal (GI) desordens, dor resultante de distúrbios funcionais do intestino (FBD), dor resultante de doenças inflamatórias do intestino (IBD), dor resultante de dismenorreia, dor pélvica, cistite, cistite ou pancreatite intersticial, (l) dor músculo-esquelético, mialgia, fibromialgia, espondilite, artropatias soro-negativo (não-reumatóides), reumatismo não articular, distrofinopatias, Glicogenólise, polimiosite, piomiosite, (m) dor vascular ou cardíaca, dor de angina, infarto do miocárdio, estenose mitral, pericardite, fenômeno de Raynaud, esclerodermia, isquemia do músculo esquelético, (n) dor de cabeça incluindo enxaqueca, enxaqueca com aura, enxaqueca sem aura cefaleia em salvas, cefaleia do tipo tensional. (o) dor orofacial, incluindo dor dental, dor miofascial temporomandibular ou zumbido, ou (p) dor nas costas, bursite, dores menstruais, enxaqueca, dor referida, neuralgia trigeminal, hipersensibilização, dor resultante de trauma e/ou degeneração da medula ou acidente vascular cerebral.
14. Uso da p75NTR(NBP), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por a p75NTR(NBP) ser de uso isolado, sequencial ou simultâneo em uma combinação com um segundo composto farmacologicamente ativo, preferencialmente em que o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação é selecionada a partir de; • um analgésico opióide, por exemplo, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanil, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina ou pentazocina; • um fármaco antiinflamatório não-esteróide (AINE), por exemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindaco, tolmetina ou zomepiraco; • um sedativo barbitúrico, por exemplo, amobarbital, probarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobarbital, secobarbital, talbutal, tamilal ou tiopental; • um benzodiazepínico com ação sedativa, por exemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam; • um antagonista H1 com ação sedativa, por exemplo, difenidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina; • um sedativo como glutetimida, meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona; • um relaxante muscular, por exemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol ou orfrenadina; • um antagonista do receptor de NMDA, por exemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidróxi-N-metilmorfinano), ou o seu metabólito dextrorfano ((+)-3-hidróxi-N-metilmorfinano), cetamina, memantina, pirroloquinolina quinina, ácido cis-4- (fosfonometil)-2-piperidinocarboxílico, budipina, EN-3231 (MorphiDex®, uma formulação da combinação de morfina e dextrometorfano), topiramato, neramexano ou perzinfotel incluindo um antagonista de NR2B, p.ex. ifenprodil, traxoprodil ou (-)-(R)-6-{2-[4-(3-fluorofenil)-4-hidróxi-1-piperidinil]-1- hidroxietil-3,4-dihidro-2(1H)-quinolinona; • um alfa-adrenérgico, por exemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinil, ou 4-amino- 6,7-dimetoxi-2-(5-metano-sulfonamido-1,2,3,4- tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil) quinazolina; • um antidepressivo tricíclico, por exemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina ou nortriptilina; • um anticonvulsivo, por exemplo, carbamazepina, lamotrigina, topiramato ou valproato; • um antagonista de taquicinina (NK), particularmente um antagonista NK-1, NK-2 ou NK-3, por exemplo, (αR,9R)-7-[3,5- bis(trifluorometil)benzil]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4- metilfenil)-7H-[1,4]diazocino[2,1-g][1,7]-naftiridina-6-13- diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5- bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4 morfolinil]- metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), aprepitanto, lanepitanto, dapitanto e 3-[[2-metoxi-5- (trifluorometoxi)fenil]-metilamino]-2-fenilpiperidina(2S, 3S); • um antagonista muscarínico, por exemplo, a oxibutinina, tolterodina, propiverina, cloreto de trópsio, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratrópio; • um inibidor seletivo da COX-2, por exemplo, celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib, ou lumiracoxib; • um analgésico de alcatrão de carvão, em particular paracetamol; • um neuroléptico como droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazina, trifluoperazina, flufenazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazol, blonanserina, iloperidona, perospirona, racloprida, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidona, amissulprida, balaperidona, palindor, eplivanserina, osanetant, rimonabant, meclinertant, Miraxion® ou sarizotan; • um agonista do receptor vaniloide (por exemplo resinferatoxin) ou antagonista (por exemplo, capsazepina); • um beta-adrenérgicos, como o propranolol; • um anestésico local tal como mexiletina; • um corticosteroide, como a dexametasona; • um agonista do receptor 5-HT ou antagonista, especialmente um agonista 5-HT1B/1E como eletriptano, sumatriptano, naratriptano, zolmitriptano, ou rizatriptano; • um antagonista do receptor 5-HT2A como R(+)-alfa-(2,3- dimetoxifenil)-1-[2-(4-fluorofeniletil)]-4-piperidinametanol (MDL-100907); • um analgésico colinérgico (nicotínico), como isproniclina (TC- 1734), (E)-N-metil-4-(3-piridinil)-3-buten-1-amina (RJR-2403), (R)-5-(2-azetidinilmetoxi)-2-cloropiridina (ABT-594) ou de nicotina; • Tramadol®; • um inibidor de PDEV, como 5-[2-etoxi-5-(4-metil-1-piperazinil- sulfonil)fenil]-1-metil-3-n-propil-1,6-dihidro-7H- pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona (sildenafil), (6R,12aR)- 2,3,6,7,12,12a-hexahidro-2-metil-6-(3,4-metilenedioxifenil)- pirazino[2',1':6,1]-pirido[3,4-b]indol-1,4-diona (IC-351 ou tadalafil), 2-[2-etoxi-5-(4-etil-piperazin-1-il-1-sulfonil)- fenil]-5-metil-7-propil-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (vardenafil), 5-(5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1- etil-3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7- ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-isopropil- 3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 5- [2-etoxi-5-(4-etilpiperazin-1-ilsulfonil)piridin-3-il]-3-etil- 2-[2-metoxietil]-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7- ona, 4-[(3-cloro-4-metoxibenzil)amino]-2-[(2S)-2- (hidroximetil)pirrolidin-1-il]-N-(pirimidin-2 ilmetil)pirimidina-5-carboxamida, 3-(1-metil-7-oxo-3-propil- 6,7-dihidro-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)-N-[2-(1- metilpirrolidin-2-il)etil]-4-propoxibenzenosulfonamida; • um canabinoide; • um antagonista do receptor metabotrópico do glutamato subtipo 1 (mGluR1); • um inibidor da recaptação da serotonina, como a sertralina, o metabólito da sertralina demetilsertralina, fluoxetina, norfluoxetina (metabólito desmetil da fluoxetina), fluvoxamina, paroxetina, citalopram, o metabólito do citalopram desmetilcitalopram, escitalopram, d,l-fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxetina, nefazodona, cericlamina e trazodona; • um inibidor da recaptação de noradrenalina (norepinefrina), como maprotilina, lofepramina, mirtazepina, oxaprotilina, fezolamina, tomoxetina, mianserina, bupropiona, o metabólito da bupropiona hidroxibupropriona, nomifensina e viloxazina (Vivalan®), especialmente um inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina tais como reboxetina, em particular (S,S) reboxetina; • um inibidor seletivo duplo da recaptação de serotonina- noradrenalina, como venlafaxina, o metabólito da venlafaxina O- desmetilvenlafaxina, clomipramina, o metabólito de clomipramina desmetilclomipramina, a duloxetina, milnaciprano e imipramina; • um inibidor da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) tal como S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, S-[2 -[(1- iminoetil)-amino]etil]-4,4-dioxo-L-cisteína, S-[2-[(1- iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-cisteína, ácido (2S, 5Z)-2- amino-2-metil-7-[(1-iminoetil)amino]-5-heptenóico, 2-[[(1R,3S)- 3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)-butil]tio]-5-cloro-3- piridinocarbonitrilo; 2-[[(1R, 3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5- tiazolil)butil]tio]-4-clorobenzonitrilo,(2S, 4R)-2-amino-4-[[2- cloro-5-(trifluorometil)fenil]tio]-5-tiazolebutanol,2- [[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-6 (trifluorometil)-3-piridinacarbonitrilo, 2-[[(1R,3S)-3- amino- 4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-5- clorobenzonitrilo, N-[4- [2-(3-clorobenzilamino)etil] fenil]tiofeno-2-carboxamidina,ou guanidinoetildissulfito; • um inibidor da acetilcolinesterase, como donepezil; • um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4) como N- [({2-[4-(2-etil-4,6-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-1- il)fenil]etil}amino)-carbonil]-4-metilbenzenesulfonamida ou ácido 4-[(1S)-1-({[5-cloro-2-(3-fluorofenoxi)piridina-3-il] carbonil}amino)etil]benzóico; •um antagonista de leucotrieno B4; como ácido 1-(3-bifenil-4- ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)- ciclopentanocarboxílico (CP- 105696), ácido 5-[2-(2-carboxietil) -3-[6-(4-metoxifenil)-5E- hexenil]oxifenoxi]valerico (ONO-4057) ou DPC-11870, • um inibidor da 5-lipoxigenase, como zileuton, 6-[(3-fluoro-5- [4-metoxi-3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il])fenoxi-metil]-1- metil-2-quinolona (ZD-2138), ou 2,3,5-trimetil-6-(3- piridilmetil), 1,4-benzoquinona (CV-6504); • um bloqueador de canal de sódio, como lidocaína; ou • um antagonista 5-HT3, como ondansetron; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos dos mesmos.
15. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender a p75NTR(NBP), conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente para uso em qualquer um ou mais para prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor.
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