ITRM20110024A1 - Uso di antagonisti del recettore p75ntr e/o di agonisti del recettore trka per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche. - Google Patents

Description

Uso di antagonisti del recettore p75NTR e/o di agonisti del recettore TrkA per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche

La presente invenzione concerne l’uso di antagonisti del recettore p75NTR e/o di agonisti del recettore TrkA per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche. In particolare, l’invenzione concerne l’uso di antagonisti del recettore p75NTR e/o di agonisti del recettore TrkA, eventualmente in associazione con NGF, per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche quali, ad esempio, artrite reumatoide, artrite idiopatica giovanile sclerosi multipla, psoriasi, Lupus Eritematoso.

Le malattie infiammatorie croniche sono un gruppo di malattie caratterizzate da infiammazione cronica che porta a danno tissutale e perdita di funzione del tessuto bersaglio. Le cause di queste malattie non sono note nel dettaglio. Le terapie si basano sull’uso di farmaci anti-infiammatori non steroidei, cortisonici e immunosoppressori. I trattamenti sono efficaci solo in una modesta percentuale dei pazienti e sono gravati da effetti collaterali. Più recentemente l’introduzione di alcuni farmaci biologici ha migliorato la percentuali di risposta. Rimane comunque evidente che una considerevole percentuale dei pazienti affetti da malattie infiammatorie croniche non presenta una risposta clinicamente soddisfacente e anche questi farmaci sono gravati da effetti collaterali nel breve e nel lungo termine.

Alla luce di quanto esposto sopra appare pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di nuove terapie per il trattamento e la prevenzione delle malattie infiammatorie croniche che superino gli svantaggi della tecnica nota.

Il Nerve Growth Factor o fattore di crescita nervoso (NGF) (1) é il capostipite di una famiglia di fattori di crescita, le Neurotrofine, che include il BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) e le neurotrofine 3, 4 e 5 (NT-3, NT-4 e NT-5) (2). NGF esercita le sue azioni sulle cellule bersaglio attraverso il legame a due recettori, il recettore p75NTR ed il recettore TrkA, presenti sulla superficie cellulare e che si distinguono per una diversa interazione con l’NGF. Mentre il recettore p75NTR lega tutte le neurotrofine (BDNF,NT3,NT4), il recettore TrkA lega esclusivamente l’NGF (3). Il legame di NGF a TrkA determina la fosforilazione dei residui di tirosina del recettore (4) e l’attivazione di proteine di segnale, secondi messaggeri e fattori di trascrizione (5). Fino ad ora, la maggior parte delle azioni biologiche descritte per l’NGF sono state ritenute indotte dall’attivazione di TrkA e delle vie di segnale ad esso collegate che regolano l’attivazione o inattivazione di geni controllati da NGF (6). Fino a pochi anni fa si riteneva che la funzione di p75NTR, che à ̈ la proteina capostipite della superfamiglia dei recettori TNF (7), fosse quella di aumentare l’affinità di legame tra NGF e TrkA, creando dei recettori eterodimerici, p75-TrkA ad alta affinità (8). Studi recenti di analisi biochimica strutturale hanno invece dimostrato che TrkA e p75NTR formano degli omodimeri con NGF e non eterodimeri (9,10,11) per cui attualmente si ritiene che il legame di NGF attivi in modo indipendente vie di segnale per ciascuno dei suoi due recettori. L’azione biologica di NGF dipende quindi da una convergenza di segnali attivati da TrkA e da p75NTR piuttosto che da interazioni dirette tra i due recettori a livello della superficie extracellulare (9). Le principali vie di segnale intracellulare attivate da TrkA sono Ras, fosfatidil-inositolo-3 chinasi (PI3-chinasi), fosfolipasi C-γ1 (PLC-γ1) e i loro effettori a valle, che includono la stimolazione attraverso Ras della cascata delle mitogen-activated protein (MAP) chinasi, la stimolazione PI3-chinasi dipendente di Akt e la formazione indotta dalla PLC-γ1 di IP-3 e diacilglicerolo, i quali, a loro volta, determinano la mobilizzazione del calcio intracellulare (12).

p75NTR non ha subunità catalitiche intracellulari ma si lega a degli adattatori come la sortilina, NOGO, RhoGDI, Traf6 etc., attivando in questo modo delle vie di segnale intracellulare. Tra le vie di segnale attivate da p75-NTR ci sono la cascata di segnali attivata dalla chinasi c-Jun,(JNK) l’attivazione di NF-kB, l’attivazione di sfingomielinasi e la conseguente formazione di ceramidi, e l’attivazione di RhoA (12).

L’NGF à ̈ stato scoperto per la sua azione sul sistema nervoso periferico e i suoi numerosi effetti sulle cellule nervose sono stati ampiamente descritti (1); ma studi pubblicati negli ultimi venti anni hanno dimostrato che l’NGF agisce anche su cellule del sistema immunitario (13).

Diverse popolazioni di cellule immunitarie differenziate esprimono recettori per NGF: i timociti, i linfociti B e T, i monociti e i macrofagi, i basofili , gli eosinofili ed i mastociti (14-18). L’aggiunta di NGF al terreno di coltura dei granulociti determina il rilascio di mediatori chimici, aumenta la fagocitosi e prolunga la loro sopravvivenza, inibendo l’apoptosi (19-22). I linfociti maturi invece aumentano la loro proliferazione e la sintesi di citochine in presenza di NGF, che inoltre induce il differenziamento in plasma cellule dei linfociti B (15, 23,24).

Alcune di queste cellule immunitarie non solo utilizzano l’NGF ma lo possono anche sintetizzare. I mastociti (25) e gli eosinofili (26) esprimono mRNA per NGF e la immunoreattività per NGF à ̈ principalmente localizzata nei granuli citoplasmatici. L’espressione di mRNA per NGF à ̈ stata descritta anche nei linfociti (15,16) e la sintesi di NGF aumenta nei linfociti B e nei T-helper dopo attivazione con specifici stimoli (15,16). La neutralizzazione dell’NGF endogeno nei linfociti B con specifici anticorpi anti-NGF induce la scomparsa di bcl-2 ed una massiccia frammentazione del DNA (15), tutti eventi che caratterizzano la morte cellulare per apoptosi. Anche i monociti e i macrofagi, se attivati con l’endotossina batterica, producono NGF (18) e la neutralizzazione dell’NGF endogeno influisce sulla sintesi di citochine, mediatori e sulla presentazione dell’antigene (27).

La produzione basale di NGF presente nei tessuti umani aumenta sensibilmente nei tessuti infiammati in diverse malattie infiammatorie croniche e/o autoimmuni. Dopo i primi studi in vivo che hanno dimostrato che i livelli di NGF sono aumentati nel liquido cerebrospinale dei pazienti con Sclerosi Multipla (28), nel siero di pazienti con Lupus Eritematoso sistemico (29), nei liquidi sinoviali di pazienti con Artrite Reumatoide (30), sono attualmente numerosi i dati sperimentali che dimostrano un aumento della sintesi di NGF nei siti di infiammazione in diverse patologie e in modelli animali di infiammazione (31).

L’aumento di citochine infiammatorie, come IL-1β, TNF-α and IL-6, nel sito di infiammazione induce la sintesi di NGF in diversi tipi cellulari come sinoviociti, fibroblasti, cellule endoteliali e gliali (32-36). Anche le cellule immunitarie coinvolte nell’immunità innata hanno una sintesi basale di NGF che aumenta dopo la stimolazione con antigeni specifici o con citochine (18,25,26,27). La scoperta di recettori specifici per NGF, il TrkA ed il recettore promiscuo pan-neurotrophin-p75 (p75NTR), su cellule dell’immunità innata ha fatto ipotizzare un’azione diretta di NGF ma non à ̈ ancora chiaramente definito il ruolo svolto dall’NGF nella risposta infiammatoria.

Alcuni esperimenti su modelli animali di malattie infiammatorie hanno dimostrato che l’aggiunta di NGF esogeno, dopo induzione della malattia, riduce l’insorgenza e la gravità dei sintomi clinici. La somministrazione di NGF esogeno ritarda l’insorgenza dell’EAE nelle scimmie marmoset, riducendo il numero e la gravità delle lesioni (37). Questo effetto dell’NGF sulla risposta infiammatoria nell’EAE à ̈ stato osservato anche in modelli murini (38,39) e, ad ulteriore conferma dei risultati nel modello murino di EAE, il trattamento con anticorpi anti- NGF aggrava i sintomi e aumenta il numero delle lesioni infiammatorie (40). Risultati simili sono stati ottenuti in un modello di colite in cui la deprivazione di NGF, ottenuta con gli anticorpi anti-NGF, peggiora significativamente il fenomeno infiammatorio (41). Nell’uomo la somministrazione topica di NGF à ̈ stata utilizzata con successo per il trattamento di ulcere corneali e ulcere da decubito (42,43). Il meccanismo attraverso cui si realizza l’effetto anti-infiammatorio dell’NGF non à ̈ stato ancora definito.

Il tipo e la quantità delle citochine presenti nel sito di infiammazione à ̈ in gran parte dipendente dai monociti/macrofagi (M/M), cellule dell’immunità innata. L’attivazione degli M/M e la conseguente produzione di citochine infiammatorie si realizza in seguito al riconoscimento di segnali di pericolo sia microbiologico (infezioni) che endogeno (danno cellulare) attraverso due sistemi recettoriali: i recettori Toll-like (TLRs) e i recettori NOD-like (NLRs). La stimolazione dei TLRs attiva segnali intracellulari e fattori di trascrizione, tra questi il più noto à ̈ NF-kB, che inducono e regolano la sintesi di citochine infiammatorie. La disregolazione di queste vie di segnale sembra essere coinvolta nell’insorgenza e progressione delle malattie autoimmuni ed infiammatorie (44).

I monociti hanno un ruolo chiave nella risposta infiammatoria e sono coinvolti sia nella risposta innata, svolgendo il ruolo di sentinella per i patogeni, sia nella risposta adattativa, trasferendo “l’informazione†sul patogeno ai linfociti T (presentazione dell’antigene) e regolandone l’attivazione ed il differenziamento anche grazie al tipo e alla quantità di citochine presenti nel sito di iniziazione della risposta.

I Monociti/Macrofagi esprimono recettori per NGF, sia TrkA che p75NTR. L’espressione di TrkA à ̈ finemente regolata in queste cellule ed aumenta nei monociti e nei macrofagi dopo attivazione con l’endotossina batterica LPS (17, 18), ma si riduce durante il differenziamento dei monociti in cellule dendritiche (45).

I monociti producono NGF in modo autocrino dopo attivazione con LPS (18,27). Utilizzando anticorpi neutralizzanti l’NGF, si à ̈ compreso che la sintesi autocrina di NGF serve a diminuire, dopo l’attivazione dei monociti con lo stimolo infiammatorio LPS, l’espressione di MHC di classe II e della molecola di costimolazione B7.2, riducendo così la capacità dei monociti di presentare l’antigene ai linfociti T (27). Anche la microglia, la componente macrofagica specializzata localizzata nel sistema nervoso centrale, risponde all’NGF diminuendo l’espressione di MHC di classe II e di molecole di costimolazione (46).

Non sono noti gli effetti di NGF sulla produzione delle citochine infiammatorie classiche, quali interleuchina 6 (IL-6), tumor necrosis factor (TNF-α) e interleuchina 1 beta (IL-1β). Queste tre citochine sono considerate i principali drivers nell’induzione e nel mantenimento della flogosi cronica e costituiscono attualmente i principali bersagli terapeutici dei nuovi approcci basati su farmaci biologici nelle malattie infiammatorie croniche.

Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che il Nerve Growth Factor (NGF) ed il suo recettore p75-NTR sono coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria e della sintesi di citochine infiammatorie. In particolare, l’espressione dei recettori dell’NGF, p75NTR e TrkA, à ̈ modulata in modo diverso durante la risposta infiammatoria e, a seconda delle condizioni di coltura, della cinetica di somministrazione dell’NGF e degli stimoli infiammatori, l’NGF può regolare in modo diametralmente opposto la risposta infiammatoria dei monociti, influenzando le vie di segnale attivate dai ligandi dei Toll-like receptors (TLRs) e modificando la sintesi di citochine. Questa azione contrastante dipende dal tipo e numero di recettori per NGF espressi dal monocita: quando prevale l’espressione di TrkA, l’NGF ha un effetto antiinfiammatorio, diminuendo la sintesi di citochine infiammatorie indotte dai ligandi dei TLRs e attivando vie di segnale che inducono la sintesi di mediatori anti-infiammatori. Al contrario, con un’espressione elevata di p75-NTR, l’NGF aumenta l’espressione dei TLRs di superficie, aumenta la sintesi di citochine infiammatorie indotte dall’attivazione dei TLRs, riducendo contemporaneamente la sintesi di citochine antiinfiammatorie.

Questa duplice azione dipende dalla capacità dei due recettori di NGF di attivare vie di segnale intracellulare distinte tra loro, che possono amplificare o antagonizzare le vie di segnale attivate dai ligandi dei TLRs. Quindi l’NGF può avere effetti diametralmente opposti a seconda della capacità recettoriale della cellula. L’analisi di cellule mononucleate provenienti da pazienti con Artrite Idiopatica Giovanile, ha dimostrato che questi pazienti presentano un’aumentata espressione di p75-NTR ed una ridotta espressione di TrkA. Nei controlli sani l’espressione di TrkA à ̈ invece sempre maggiore di quella di p75NTR. In maniera analoga, nel tessuto sinoviale di pazienti con artrite reumatoide à ̈ presente un’aumentata espressione di p75 e una diminuita espressione di TrkA, con un rapporto trkA/p75 nettamente a favore dell’espressione di p75NTR. Questo dato dimostra che la regolazione dell’NGF e dei suoi recettori à ̈ un meccanismo importante della risposta infiammatoria e che la sua disregolazione rappresenta un meccanismo patogenetico non ancora descritto. Sulla base di questi riscontri sperimentali ed altri dati presenti in letteratura scientifica, la presente invenzione mira all’utilizzo di inibitori di p75NTR, recettore di NGF, e delle altre neurotrofine nella modulazione della risposta infiammatoria locale e sistemica. Si prospetta quindi l’uso di NGF modificato, di agonisti di TrkA, degli anticorpi anti-p75NTR, degli inibitori farmacologici di p75NTR nel trattamento di malattie infiammatorie croniche.

L’aver identificato il ruolo di NGF e delle sue pathways recettoriali nella modulazione dell’infiammazione fornisce il razionale per il design di nuove molecole e di nuove strategie farmacologiche per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche.

Alla luce dei risultati qui descritti, gli agonisti di TrkA e gli antagonisti di p75NTR, e gli inibitori farmacologici delle vie di segnale dell’NGF rappresentano molecole utili per modulare la risposta infiammatoria in malattie infiammatorie croniche (o in malattie) in cui il rapporto recettoriale TrkA/p75 sia alterato, determinando immuno-attivazione o immuno-soppressione.

Fino ad adesso gli agonisti ed antagonisti dei recettori NGF sono stati concepiti per regolare alterazioni neuronali (terapia del dolore, neuropatie etc) o la sopravvivenza neuronale (malattia di Alzheimer) basandosi su meccanismi noti e ben descritti che coinvolgono l’NGF. Infatti, attualmente, sono in iniziale sperimentazione clinica due anticorpi monoclonali, uno neutralizzante NGF stesso e uno neutralizzante TrkA, per la terapia del dolore in neuropatie diabetiche ed infiammatorie.

Esistono inoltre in letteratura alcuni composti che sono stati sintetizzati ed utilizzati per inibire il legame tra NGF e p75NTR o TrkA in esperimenti in vivo ed in vitro (51-67). Il loro impiego à ̈ stato finalizzato alle malattie neurodegenerative. Al presente sono stati descritti i seguenti composti:

- anticorpi monoclonali e anticorpi chimerici neutralizzanti o recettori solubili, come quelli già utilizzati negli esperimenti eseguiti nel nostro laboratorio e come l’anticorpo monoclonale contro TrkA umanizzato MNAC13 ora BXL1H5 (Bioxell); l’anticorpo monoclonale che blocca il legame NGF-TrkA, il tanezumab noto precedentemente come RN624 (Pfizer); recettore solubile TrkAD5 (soluble TrkA-NGF binding domain, noto precedentemente come REN 1820); l’anticorpo monoclonale 5C3 agonista di TrkA (68); l’anticorpo monoclonale neutralizzante anti-p75NTR ME20.4; gli anticorpi monoclonali neutralizzanti p75NTR MLR-1,MLR2, MLR3; l’anticorpo anti-p75NTR umano clone HB-8737, l’anticorpo policlonale antip75NTR neutralizzante (REX).

- analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF che legano p75NTR, come l’ NGF C(30-35), o che legano TrkA ,come l’NGF C92-97, impedendo il legame con NGF (51-55) o che funzionano come agonisti di TrkA come il D3 (56) o l’ NGF ricombinante mutato come il NGFKKE/7-84-103(57,58).

- il composto PD90780 che lega NGF impedendone il legame con p75NTR influenzando parzialmente anche il legame con TrkA (59-61); l’amide gambogica una piccola molecola che mima l’azione di NGF e che rappresenta un nuovo agonista selettivo di TrkA (62,63).

- i composti della famiglia LM11A e tra questi i LM11A-24 derivati dalla caffeina e LM11A-31 derivati dalla isoleucina. Si tratta di piccole molecole non peptidiche che si legano a p75NTR nel sito di legame specifico per NGF inibendo in modo selettivo la capacità di legare NGF di p75NTR ma non interferendo in alcun modo con il legame tra NGF e TrkA (64-67);

- molecole non peptidiche a basso peso molecolare comprendenti il 3-aza-biciclo[3.2.1]ottano e derivati monomerici e dimerici che legano TrkA ma non p75NTR e funzionano come agonisti delle neurotrofine umane (brevetto US 7625892).

I dati qui riportati dimostrano che gli antagonisti di p75NTR, siano questi monoclonali neutralizzanti, chimere o antagonisti, da soli od in associazione con NGF o agonisti di TrkA, attivano pathways intracellulari che inibiscono la risposta infiammatoria, determinando una riduzione della produzione di citochine infiammatorie e un aumento della produzione di citochine anti-infiammatorie.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un composto scelto tra antagonisti di p75NTR, agonisti di TrkA o loro combinazioni per l’uso nel trattamento delle malattie infiammatorie croniche.

I composti antagonisti di p75NTR possono essere scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali e monoclonali che legano p75NTR, chimerici neutralizzanti o recettori solubili, analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF che legano p75NTR.

Gli anticorpi monoclonali possono essere scelti nel gruppo che consiste in chimera TrkA/Fc umana ricombinante, chimera NGFR/TNFRSF16/Fc umana ricombinante comprate da R&D Systems; anticorpo monoclonale anti-nerve growth factor receptor p75 umano, clone ME20.4 comprato da Chemicon; anticorpo monoclonale ME24.1, anticorpi monoclonali MLR-1, MLR2, MLR3, anticorpo anti-p75NTR umano clone HB-8737 (ATCC).

L’anticorpo policlonale può essere ad esempio l’anticorpo policlonale neutralizzante anti-p75NTR (REX)).

Gli analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF che legano p75NTR possono essere scelti tra NGF C30-35, composto PD90780, composti LM11A.

I composti LM11A possono essere scelti nel gruppo che consiste in LM11A-24 derivati dalla caffeina o LM11A-31 derivati dalla isoleucina.

Gli agonisti di TrkA possono essere scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali e monoclonali che legano TrkA, come l’anticorpo monoclonale 5C3 (68), analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF come NGF C92-97 o NGF ricombinante mutato come NGFKKE/7-84-103, peptide D3, l’amide gambogica, e i derivati del 3-aza-biciclo [3, 2, 1]ottano (US7,625,892) quali ad esempio quelli di formula (I) o loro dimeri di formula (II) o (III):

R1

R2

Y Z

R3N R6

R5

Xa R4

(I)

R1R'1

R2R'2

Y Y ZRN N Z

3R6

Q

R5R'5

a a

<X>R4X<R'>4

(II)

R R'1

1

R2R'2

YY

R3N ZZ

N R'3

Q'

a<R5>a

XR'5

R4R'4X

(III)

in cui:

R1 e R'1, uguali o differenti tra loro, sono scelti tra H, C1-8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, eterociclo, arilC1-8alchil; eterocicloC1-8alchil, RR'N-C1-8alchil, RR'N-aril, FmocNR'-aril, BocNR'-aril, CBzNR'-aril, RO-aril, R(O)C-aril, RO(O)C-aril, RR'N(O)C-aril; FmocNR'-C1-8alchil, BocNR'-C1-8alchil, CbzNR'-C1-8alchil, FmocNR'-C1-8aril, BocNR'-C1-8aril e CbzNR'-C1-8aril,

R2 e R'2, uguali o differenti tra loro, sono scelti tra H, C1-8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, arilC1-8alchil, eterocicloC1-8alchil, amminoC1-

8alchil, amminoaril, C1-8alchilossiaril, idrossiaril, idrossiC1-8alchil, carbossiC1-8alchil, metilossicarbonilC1-8alchil, carbossiaril, carboalchilossiaril, alchilcarbamoilaril e -(catene laterali di amminoacidi), o

R1 e R2, considerate assieme, e R1' e R2', considerate assieme, sono C1-4alchil, C2-4alchenil, cicloalchil o cicloalchil benzofuso, per formare un ponte di 3, 4, 5, 6 termini,

R3 e R3' sono scelti dal gruppo che consiste in H, C1-

8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, arilC1-8alchil, eterocicloC1-8alchil, RR'NC1-8alchil, RR'Naril, RO-C1-8alchil, RO(O)C-C1-8alchil, R(O)C-C1-

8alchil, RC(O)O-C1-8alchil, RC(O)N(R)C1-8alchil, RO-aril, RO(O)C-aril, R(O)C-aril RC(O)O-aril, RC(O)N(R)aril, -CH(catena laterale amminoacidica)CO2R, -CH(catena laterale amminoacidica)C(O)NR, -CH(CO2R)- catena laterale amminoacidica, CH(CONRR')- catena laterale amminoacidica, Fmoc, Boc e Cbz,

R4, R'4 R5, e R'5, uguali o differenti tra loro, sono scelti tra H, C1-8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, eterociclo, arilC1-8alchil e eterocicloC1-8alchil,

R6 Ã ̈ scelto tra H, C1-8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, arilC1-8alchil, eterociclo, eterocicloC1-8alchil; -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NRR', CH2OR, CH2NRR', -C(O)NH-CH(catena laterale amminoacidica)C(O)OR, CH2NR-Fmoc, CH2NR-Boc e CH2NR-CBz,

R e R', uguali o differenti tra loro, sono scelti tra H, C1-8alchil, C2-8alchenil, C2-8alchinil, cicloalchil, aril, eterociclo, arilC1-8alchil; eterocicloC1-8alchil; gruppo protettore, -C(O)CH-(catena laterale amminoacidica)-NHT, -NH-CH(catena laterale amminoacidica)COOT e -CH(catena laterale amminoacidica)COOT, in cui T Ã ̈ scelto tra H e C1-8alchil;

X e X', uguali o differenti tra loro, sono scelti tra O e S, quando a à ̈ un doppio legame, or X e X' sono entrambe H, quando a à ̈ un legame singolo,

Y e Z, uguali o differenti tra loro, sono scelti tra O, S, SO, SO2 e N-R, in cui R Ã ̈ come definito sopra;

Q à ̈ scelto tra C-O, CH2, CO-NH-CH (catena laterale amminoacidica)-CO, CONR(CH2)nCO, CONR-C2-8alchenil-CO C(O)O(CH2)nCO, CH2OC(O)(CH2)nCO, e CH2NRC(O)(CH2)nCO, in cui n à ̈ compreso tra 2 e 6, e R à ̈ come definito sopra,

Q' à ̈ scelto tra C(O)OCH2, C(O)NRCH2, CH2OC(O), CH2NRC(O), CONR(CH2)nNRCO, CONR-C2-8alkenyl-NRCO, C(O)O(CH2)nNRCO, CONR(CH2)nOC(O), CH2OC(O)(CH2)nOC(O)CH2, CH2NRC(O)(CH2)nNRC(O)CH2, CH2OC(O)(CH2)nNRC(O)CH2, CH2NRC(O)(CH2)nOC(O)CH2, CH2NR(CH2)nNRCH2, CH2O(CH2)nOCH2, CH2O(CH2)nNRCH2, e CH2NR(CH2)nOCH2, in cui n à ̈ compreso tra 2 e 6, e R à ̈ come definito sopra, e in cui i gruppi alchile, alchenil, alchinil, cicloalchil, aril e i gruppi eterociclici sopra riportati sono eventualmente sostituiti.

Preferibilmente, i composti sono quelli della seguente formula (I)

R1

R2

O O

R3N R6

X

(I)

con i seguenti numero di composto, X, R1, R2, R3 e R6: 1, O, H, H, PhCH2, (R)-CO2Me

2, O, H, H, PhCH2, (S)-CO2Me

(R)-CON

3, O, H, H, PhCH2,

(R)-CON

4, O, H, H, PhCH2,

5, O, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me

6, O, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me

7, O, H, (R)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me

8, O, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me

9, O, H, (R)-CH2Ph, PhCH2, (S)-CO2Me

10, O, H, (R)-CH2Ph, PhCH2, (R)-CO2Me

11, O, H, (S)-CH2Ph, PhCH2, (S)-CO2Me

12, O, H, (S)-CH2Ph, PhCH2, (R)-CO2Me

13, O, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me

14, O, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me

15, O, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me

16, O, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me

17, O, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me

18, O, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me

19, O, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me

20, O, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me

21, O, H, -CH2, PhCH2, (R)-CO2Me

, O, H, -CH2, PhCH2, (S)-CO2Me

, O, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me , S, H, H, PhCH2, (R)-CO2Me

, S, H, H, PhCH2, (R)-CONH(CH2)2NH2 , S, H, H, PhCH2, (R)-CONH(CH2)2OH , O, Ph, H, PhCH2, (R)-CO2Me

, O, Ph, H, PhCH2, (S)-CO2Me

, O, Ph, H, CH(Ph)2, (R)-CO2Me

, O, Ph, H, CH(Ph)2, (S)-CO2Me

, O, NO2-Ph, H, Ph, (S)-CO2Me

, H, H, H, H, (R)-CO2H

, H, H, H, H, (S)-CO2H

, H, H, H, H, (R)-CO2Me

, H, H, H, H, (S)-CO2Me

, H, H, H, PhCH2, (R)-CO2H

, H, H, H, PhCH2, (S)-CO2H

, H, H, H, Fmoc, (R)-CO2H

, H, H, H, Fmoc, (S)-CO2H

, H, H, H, PhCH2, (R)-CO2Me

, H, H, H, PhCH2, (S)-CO2Me

, H, H, H, Boc, (R)-CO2Me

, H, H, H, Boc, (S)-CO2Me

, H, H, H, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, H, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, H, H, (R)-CONHMe

, H, H, H, H, (S)-CONHMe

, H, H, H, Ac, (R)-CONHMe

, H, H, H, Ac, (S)-CONHMe

, H, H, H, PhCH2, (R)-CONHMe

, H, H, H, PhCH2, (S)-CONHMe

, H, H, H, Fmoc, (R)-CONHMe

, H, H, H, Fmoc, (S)-CONHMe

(R)-CON

, H, H, H, PhCH2,

(R) CONH

, H, H, H, PhCH2,

(R)-CON

, H, H, H, PhCH2,

, H, H, H, PhCH2, (R)-CONH(CH2)2OH , H, H, H, H, (R)-CH2OH

, H, H, H, H, (S)-CH2OH

, H, H, H, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, H, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, H, H, Boc, (R)-CH2OH

, H, H, H, Boc, (S)-CH2OH

, H, H, H, PhCH2, (R)-CH2OH

, H, H, H, PhCH2, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CH2OH , H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CH2OH , H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CH2OH , H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CH2OH , H, H, (S)-COOH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-COOH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-COOH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-COOH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OBn, H, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OBn, H, (S)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OBn, H, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OBn, H, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OH, H, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OH, H, (S)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OH, H, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OH, H, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me 0, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me 1, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me 2, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me 3, H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (R)-CH2OH 4, H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (S)-CH2OH 5, H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (R)-CH2OH 6, H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (S)-CH2OH 7, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (R)-CH2OH 8, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (S)-CH2OH 9, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CH2OH 110, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CH2OH

111, H, H, -CH2, PhCH2, (R)-CO2Me

112, H, H, -CH2, PhCH2, (S)-CO2Me

113, H, H, -CH2, PhCH2, (R)-CH2OH

114, H, H, -CH2, PhCH2, (S)-CH2OH

115, H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (R)-CH2OH 116, H, H, (S)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (S)-CH2OH 117, H, H, (S)-CH2CH(Me)2, H, (R)-CH2OH

118, H, Ph, H, H, (R)-CO2Me

119, H, Ph, H, Fmoc, (R)-CO2Me

120, H, Ph, H, PhCH2, (R)-CO2Me

121, H, Ph, H, CH(Ph)2, (R)-CO2Me

122, H, Ph, H, H, (S)-CO2Me

123, H, Ph, H, Fmoc, (S)-CO2Me

124, H, Ph, H, PhCH2, (S)-CO2Me

125, H, Ph, H, CH(Ph)2, (S)-CO2Me

126, H, p-NH2-C6H4, H, Ph, (S)-COOMe

127, H, p-NH2-C6H4, H, Ph, (S)-COOh

128, H, p-NH2-C6H4, H, Ph, (S)-CONHCH2CO2Me 129, H, p-NH-(Asp(O<t>Bu)-NH2)C6H4, H, Ph, (S)-CO2Me 130, H, p-NH-(Asp(O<t>Bu)NH2)-C6H4, H, Ph, (S)-CO2H 131, H, p-NH-(Asp(O<t>Bu)-NH2)C6H4, H, Ph, (S)-CONH-Lys(NHBoc)-OMe

132, H, p-NH-(Asp(OH)-NH2)-C6H4, H, Ph, (S)-CONH-Lys-OMe

133, H, p-NO2-C6H4, H, Ph, (S)-COOH

134, H, p-NO2-C6H4, H, Ph, (S)-COOMe

135, H, p-NO2-C6H4, H, Ph, (S)-CONHCH2CO2Me 136, H, Ph, H, H, (R)-CH2OH

137, H, Ph, H, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, Ph, H, PhCH2, (R)-CH2OH

, H, Ph, H, CH(Ph)2, (R)-CH2OH , H, Ph, H, H, (S)-CH2OH

, H, Ph, H, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, Ph, H, PhCH2, (S)-CH2OH

, H, Ph, H, CH(Ph)2, (S)-CH2OH , H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CO2H , H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CO2H , H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CH2OH , H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CH2OH , H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CH2OH , H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CH2OH , H, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CH2OH , H, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CH2OH , H, H (R)-Me, PhCH2, (R)-CH2OH , H, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CH2OH , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2H , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2H 168, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2Me

169, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2Me

170, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2Me

171, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2Me

172, H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me

173, H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me

174, H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me

175, H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me

176, H, H, (R)-PhCH2, H, (R)-CO2Me

177, H, H, (R)-PhCH2, H, (S)-CO2Me

178, H, H, (S)-PhCH2, H, (R)-CO2Me

179, H, H, (S)-PhCH2, H, (S)-CO2Me

180, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CH2OH

181, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CH2OH

182, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CH2OH

183, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CH2OH

184, H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-CH2OH

185, H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (S)-CH2OH

186, H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (R)-CH2OH

187, H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (S)-CH2OH

188, H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-COOH

189, O, p-NO2Ph, H, Ph, CONH(CH2)6NH2

Inoltre, i composti sono quelli della seguente formula (I)

R1

R2

O

3N O

R R6

X

con i seguenti numero di composto, X, R1, R2, R3 e R6: 190, O, H, H, PhCH2, (R)-CO2Me

191, O, H, H, PhCH2, (S)-CO2Me

192, O, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me

193, O, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me

194, O, H, (R)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me

195, O, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me

196, O, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me

197, O, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me

198, O, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me

199, O, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me

200, O, H, (S)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (R)-CO2Me 201, O, H, (S)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (S)-CO2Me 202, O, H, (R)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (R)-CO2Me 203, O, H, (R)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (S)-CO2Me 204, O, H, H, PhCH2, (R)-CONHMe

205, O, H, H, PhCH2, (S)-CONHMe

206, O, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CONHMe

207, O, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CONHMe

208, O, H, (R)-Me, PhCH2, (R)-CONHMe

209, O, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CONHMe

210, O, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-CONHMe

211, O, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (S)-CONHMe

212, O, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (R)-CONHMe

213, O, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (S)-CONHMe

214, O, H, (S)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (R)-CONHMe 215, O, H, (S)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (S)-CONHMe 216, O, H, (R)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (R)-CONHMe 217, O, H, (R)-CH2CH(Me)2, PhCH2, (S)-CONHMe 218, H, H, H, Fmoc, (R)-CO2H

, H, H, H, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, H, Fmoc, (S)-CO2H

, H, H, H, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CO2H

, H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CO2H

, H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-Me, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CO2H

, H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CO2H

, H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, (R)-Me, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2H , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2H , H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2H , H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-PhCH2, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CO2Me

, H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Bn, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Bn, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Bn, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Bn, (S)-CO2Me , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (R)-CO2Me , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (S)-CO2Me , H, H, (S)-Me, H, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-Me, Bn, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-Me, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, H, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, Bn, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-Me, H, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-Me, Bn, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-Me, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, H, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, Bn, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-Me, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-CH2CH(Me)2, H, (R)-CH2OH , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Bn, (R)-CH2OH , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (R)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, H, (R)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Bn, (R)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (R)-CH2OH , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, H, (S)-CH2OH , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Bn, (S)-CH2OH , H, H, (S)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (S)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, H, (S)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Bn, (S)-CH2OH , H, H, (R)-CH2CH(Me)2, Fmoc, (S)-CH2OH , H, H, (S)-PhCH2, H, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-PhCH2, Bn, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, H, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, Bn, (R)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (R)-CH2OH

, H, H, (S)-PhCH2, H, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-PhCH2, Bn, (S)-CH2OH

, H, H, (S)-PhCH2, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, H, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, Bn, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-PhCH2, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (S)-CH2OH

, H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CH2OH 309, H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CH2OH

310, H, H, (R)-CH2OH, Fmoc, (R)-CH2OH

311, H, H, (R)-CH2OH, PhCH2, (R)-CH2OH

312, H, H, (R)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CH2OH

313, H, H, (R)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CH2OH

314, H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (S)-CH2OH

315, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (S)-CH2OH

316, H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (S)-CH2OH

317, H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (S)-CH2OH

318, H, H, (S)-CH2OH, Fmoc, (R)-CH2OH

319, H, H, (S)-CH2OH, PhCH2, (R)-CH2OH

320, H, H, (S)-CH2OBn, Fmoc, (R)-CH2OH

321, H, H, (S)-CH2OBn, PhCH2, (R)-CH2OH

Inoltre, i composti sono quelli della seguente formula (II):

R1R'1

R2R'2

O ORO

3N N<O>R6

O

(II)

con i seguenti numero di composto, R1, R2, R3, R’1, R’2 e R6:

322, H, H, H, H, H, CO2Me,

323, H, H, H, H, H, CONHMe

324, H, H, PhCH2, H, H, CO2Me

325, H, H, PhCH2, H, H, CONHMe

326, H, H, Fmoc, H, H, CO2Me

, H, H, Fmoc, H, H, CONHMe

, H, H, Boc, H, H, CO2Me

, H, H, Boc, H, H, CONHMe

, H, PhCH2, H, H, H, CO2Me

, H, PhCH2, H, H, H, CONHMe

, H, PhCH2, PhCH2, H, H, CO2Me

, H, PhCH2, PhCH2, H, H, CONHMe

, H, PhCH2, Fmoc, H, H, CO2Me

, H, PhCH2, Fmoc, H, H, CONHMe

, H, PhCH2, Boc, H, H, CO2Me

, H, PhCH2, Boc, H, H, CONHMe

, H, H, H, H, PhCH2, CO2Me

, H, H, H, H, PhCH2, CONHMe

, H, H, PhCH2, H, PhCH2, CO2Me

, H, H, PhCH2, H, PhCH2, CONHMe

, H, H, Fmoc, H, PhCH2, CO2Me

, H, H, Fmoc, H, PhCH2, CONHMe

, H, H, Boc, H, PhCH2, CO2Me

, H, H, Boc, H, PhCH2, CONHMe

, H, PhCH2, H, H, PhCH2, CO2Me

, H, PhCH2, H, H, PhCH2, CONHMe

, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, CO2Me , H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, CONHMe , H, PhCH2, Fmoc, H, PhCH2, CO2Me , H, PhCH2, Fmoc, H, PhCH2, CONHMe , H, PhCH2, Boc, H, PhCH2, CO2Me , H, PhCH2, Boc, H, PhCH2, CONHMe , Ph, H, H, H, H, CO2Me

, Ph, H, H, H, H, CONHMe

, Ph, H, PhCH2, H, H, CO2Me

, Ph, H, PhCH2, H, H, CONHMe , Ph, H, Fmoc, H, H, CO2Me

, Ph, H, Fmoc, H, H, CONHMe

, Ph, H, Boc, H, H, CO2Me

, Ph, H, Boc, H, H, CONHMe

, H, H, H, Ph, H, CO2Me

, H, H, H, Ph, H, CONHMe

, H, H, PhCH2, Ph, H, CO2Me

, H, H, PhCH2, Ph, H, CONHMe , H, H, Fmoc, Ph, H, CO2Me

, H, H, Fmoc, Ph, H, CONHMe

, H, H, Boc, Ph, H, CO2Me

, H, H, Boc, Ph, H, CONHMe

, Ph, H, H, Ph, H, CO2Me

, Ph, H, H, Ph, H, CONHMe

, Ph, H, PhCH2, Ph, H, CO2Me , Ph, H, PhCH2, Ph, H, CONHMe , Ph, H, Fmoc, Ph, H, CO2Me

, Ph, H, Fmoc, Ph, H, CONHMe , Ph, H, Boc, Ph, H, CO2Me

, Ph, H, Boc, Ph, H, CONHMe

, H, H, H, H, CH2OH, CO2Me

, H, H, H, H, CH2OH, CONHMe

, H, H, PhCH2, H, CH2OH, CO2Me , H, H, PhCH2, H, CH2OH, CONHMe , H, H, Fmoc, H, CH2OH, CO2Me , H, H, Fmoc, H, CH2OH, CONHMe , H, H, Boc, H, CH2OH, CO2Me , H, H, Boc, H, CH2OH, CONHMe , H, PhCH2, H, H, CH2OH, CO2Me 387, H, PhCH2, H, H, CH2OH, CONHMe

388, H, PhCH2, PhCH2, H, CH2OH, CO2Me

389, H, PhCH2, PhCH2, H, CH2OH, CONHMe

390, H, PhCH2, Fmoc, H, CH2OH, CO2Me

391, H, PhCH2, Fmoc, H, CH2OH, CONHMe

392, H, PhCH2, Boc, H, CH2OH, CO2Me

393, H, PhCH2, Boc, H, CH2OH, CONHMe

394, Ph, H, H, H, CH2OH, CO2Me

395, Ph, H, H, H, CH2OH, CONHMe

396, Ph, H, PhCH2, H, CH2OH, CO2Me

397, Ph, H, PhCH2, H, CH2OH, CONHMe

398, Ph, H, Fmoc, H, CH2OH, CO2Me

399, Ph, H, Fmoc, H, CH2OH, CONHMe

400, Ph, H, Boc, H, CH2OH, CO2Me

401, Ph, H, Boc, H, CH2OH, CONHMe

Inoltre, i composti sono quelli della seguente formula (III):

R R'1

1

R2R'2

OO

R3N OO

N R'3

Q'

X X

(III)

con i seguenti numero di composto, R1, R2, R3, R'1, R'2, R’3, X, Q'

402, H, H, H, H, H, H, O, CO-NH(CH2)2NH-CO 403, H, H, H, H, H, H, O, CO-NH(CH2)4NH-CO 404, H, H, H, H, H, H, O, CO-NH(CH2)6NH-CO 405, H, H, H, H, H, H, O, CO-N(C2H4)N-CO 406, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)2NH-CO

407, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)4NH-CO

408, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)6NH-CO

409, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, O, CO-N(CH2H4)N-CO

410, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

411, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)4NH-CO

412, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)6NH-CO

413, H, H, PhCH2, H, H, PhCH2, H, CO-N(C2H4)N-CO

414, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, O, CO-NH(CH2)2NH-CO

415, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, O, CO-NH(CH2)4NH-CO

416, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, O, CO-NH(CH2)6NH-CO

417, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, O, CO-N(C2H4)N-CO

418, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

419, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, H, CO-NH(CH2)4NH-CO

420, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, H, CONH(CH2)6NH-CO

421, H, PhCH2, PhCH2, H, PhCH2, PhCH2, H, CO-N(C2H4)N-CO

422, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)2NH-CO

423, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)4NH-CO

424, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, O, CO-NH(CH2)6NH-CO

425, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, O, CO-N(CH2)4)N-CO

426, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

427, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)4NH-CO

428, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)6NH-CO

429, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-N(C2H4)N-CO

430, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

431, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)4NH-CO

432, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-NH(CH2)6NH-CO

433, Ph, H, PhCH2, Ph, H, PhCH2, H, CO-N(C2H4)N-CO

434, Ph, H, Ph, Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)2NH-CO 435, Ph, H, Ph, Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)4NH-CO 436, Ph, H, Ph, Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)6NH-CO 437, Ph, H, Ph, Ph, H, Ph, O, CO-N(C2H4)N-CO 438, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, O, CO-H(CH2)2NH-CO

439, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)3NH-CO

440, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)4NH-CO

441, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)5NH-CO

442, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)6NH-CO

443, NO2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-N(C2H4)N-CO

444, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)2NH-CO

445, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)3NH-CO

446, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)4NH-CO

447, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)5NH-CO

448, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-NH(CH2)6NH-CO

449, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, O, CO-N(C2H4)N-CO

450, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

451, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)3NH-CO

452, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, H, CONH(CH2)4NH-CO

453, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)5NH-CO

454, NO2-Ph, H, Ph, NO2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)6NH-CO

455, NO2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-N(C2H4)N-CO

456, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)2NH-CO

457, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)3NH-CO

458, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)4NH-CO

459, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)5NH-CO

460, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-NH(CH2)6NH-CO

461, NH2-Ph, H, Ph, NH2-Ph, H, Ph, H, CO-N(C2H4)N-CO.

Le malattie infiammatorie croniche che possono essere trattate secondo la presente invenzione possono essere artrite reumatoide, artrite idiopatica giovanile, malattie infiammatorie croniche intestinali (Morbo di Crohn, colite ulcerosa), spondilite anchilopoietica, psoriasi, sclerosi multipla, Lupus eritematoso, scleroderma, Sindrome di Sjogren.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione di composti antagonisti di p75NTR e/o agonisti di TrkA e/o NGF per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nella cura e nella prevenzione delle malattie infiammatorie croniche.

Inoltre, la presente invenzione riguarda un metodo diagnostico in vitro consistente nella valutazione del rapporto dell’espressione dei recettori TrkA e p75NTR, in cui un rapporto minore di 1 à ̈ indicativo di uno sbilanciamento a favore di p75NTR e pertanto predice, in pazienti con malattie infiammatorie croniche, la risposta al trattamento con inibitori di p75NTR da soli o in combinazione di agonisti di TrkA o di terapie attualmente in uso.

Il metodo si basa sulla determinazione quantitativa dei livelli di mRNA per p75NTR e TrkA valutati in biopsie di tessuti infiammati, ad esempio sinovia, pelle, rene, intestino, o in cellule ottenute da fluidi biologici, ad esempio sangue, urine, liquido sinoviale, liquor cefalorachidiano, saliva.

Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo di screening in vitro per valutare l’effetto anti-infiammatorio di antagonisti farmacologici di p75NTR o di agonisti di TrKA comprendente o consistente nelle seguenti fasi: a) mettere in contatto un campione biologico di paziente affetto da malattia infiammatoria cronica con detto antagonista o agonista; b) misurare i livelli di citochine pro infiammatorie, quali ad esempio IL-1, IL-6 e TNF, dopo stimolazione con ligandi dei TLR. Il modello utilizza monociti di sangue periferico o sinoviociti da sinovia o fibroblasti da cute.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati in cui:

Figura 1 mostra gli effetti della preincubazione con NGF nei monociti umani e successiva stimolazione TLRs (Condizione A). La pre-incubazione di 18 ore con NGF non influisce sull’espressione del TLR2 (pannello A) e TLR4 (pannello B) nelle cellule incubate con il solo terreno di coltura (Ctrl) ma aumenta sensibilmente l’espressione costitutiva del TLR2 e TLR4 dopo stimolazione con il ligando specifico di ciascun recettore (pannelli A e B). Le cellule pre-incubate con NGF quando sono poi stimolate con i ligandi specifici dei TLR 2,4,5, producono maggiore quantità di citochine infiammatorie (pannelli, C, D, E) che à ̈ NGF dose dipendente (pannello E). In assenza dei ligandi specifici per i TLRs, il solo NGF non ha alcun effetto sull’espressione o il rilascio di citochine nei monociti non stimolati (pannelli C, D).

Figura 2 mostra gli effetti dell’aggiunta di NGF a monociti successivamente alla stimolazione di TLR (Condizione B). I monociti umani sono stati stimolati con ligandi di TLRs e contemporaneamente à ̈ stato somministrato NGF. L’aggiunta di NGF ai diversi ligandi di TLR determina una riduzione nell’espressione di TLR2 (pannello A) ed una riduzione nella produzione di IL-6 (pannello B), di TNF-α (pannello C) e di IL-1β che à ̈ NGF dose dipendente (pannello D). Anche in questa condizione sperimentale il solo NGF non modifica l’espressione costitutiva di TLRs o la sintesi di citochine infiammatorie nelle cellule non stimolate con il ligando (Crtl).

Figura 3 mostra gli effetti dell’aggiunta di NGF in monociti attivati con ligandi dei TLR (Condizione B) sulla sintesi citochine anti-infiammatorie. I monociti umani sono stati stimolati con ligandi di TLRs e contemporaneamente à ̈ stato somministrato NGF. L’aggiunta di NGF ai diversi ligandi di TLR determina un aumento nel rilascio di IL-1 ra, che à ̈ l’antagonista del recettore di IL-1β (pannello A) ed aumenta l’espressione di produzione di IL-10 (pannello B).

Figura 4 mostra l’espressione dei recettori di NGF nelle diverse condizioni di coltura e dopo stimolazione dei TLR. I monociti quiescenti, non attivati con i ligandi di TLR, esprimono livelli basali sia di TrkA che p75 NTR, con TrkA più espresso di p75NTR (pannello A). La stimolazione con i ligandi di TLRs induce un sensibile aumento dell’espressione di TrkA (Pannello B) con una cinetica di espressione diversa a seconda se le cellule sono stimolate con LPS e LTA (pannello B e C). L’espressione di p75NTR non varia in modo sostanziale dopo la stimolazione con i ligandi di TLR (pannello A). Quando NGF viene aggiunto dopo la stimolazione dei TLRs si induce un ulteriore aumento dell’espressione di TrkA, mentre non ci sono effetti rilevanti di NGF sull’espressione di p75NTR (pannello A). Quando i monociti vengono pre-incubati per 18 ore con NGF in assenza di stimolazione con TLRs, si ha un aumento dell’espressione di p75NTR ed una riduzione dell’espressione di TrkA, (pannello D).

Figura 5 mostra gli effetti dell’NGF sulle vie di segnale attivate dopo stimolazione dei TLR nelle diverse condizioni coltura. Quando i monociti vengono pre-incubati con NGF si ha un aumento dell’espressione di p75NTR e si osserva un aumento della fosforilazione di IkB e una diminuzione dell’IkB totale in seguito alla stimolazione con ligandi TLR (pannello A, Us monociti non stimolati con ligandi TLR). Invece quando l’NGF viene aggiunto insieme ai ligandi TLR, nella condizione in cui TrkA à ̈ più espresso, si ha un aumento della fosforilazione di AKT (pannello B, risultati di monociti ottenuti da donatori diversi- Us monociti non stimolati con ligandi TLR).

Figura 6 mostra l’effetto dell’aggiunta di NGF ai ligandi dei TLR sulla traslocazione nucleare di NFkB. Dopo attivazione dei TLR con i ligandi si ha traslocazione di NFkB che passa dal citoplasma al nucleo (pannello A), mentre l’aggiunta di NGF insieme in questo caso all’LPS, ligando di TLR4, riduce la traslocazione nucleare di NFkB (pannello B).

Figura 7 mostra l’effetto dell’inibizione di TrkA o di p75NTR sui monociti in assenza di ligandi dei TLR. L’aggiunta di NGF a monociti quiescenti (Us), in assenza dei ligandi di TLR, non induce la sintesi di citochine infiammatorie (pannello A) e non altera la fosforilazione di IkB o di erk (pannello B). La stessa assenza di effetti si ha quando viene neutralizzato il recettore p75NTR. Al contrario l’inibizione di TrkA e l’aggiunta di NGF, che quindi si può legare al solo recettore p75 NTR, inducono la fosforilazione di IkB ed erk (pannello B) e la sintesi di IL-6 (pannello A) mai indotte dal solo NGF.

Figura 8 mostra l’effetto dell’inibizione di TrkA sui monociti in presenza di ligandi dei TLR. Quando si attivano i TLRs in presenza di anticorpi anti-TrkA o di chimera TrkA, l’aggiunta di NGF determina un aumento della fosforilazione di IkB (pannello A) e un aumento nella sintesi della citochina infiammatoria IL-6 (pannello B).

Figura 9 mostra l’effetto dell’inibizione di TrkA sulla traslocazione nucleare di NFkB in presenza di ligandi dei TLR. Dopo attivazione dei TLR, si osserva la traslocazione di NFkB che passa dal citoplasma al nucleo (pannello A). In presenza della chimera TrkA, che blocca il legame di NGF a TrkA, NGF lega solo p75NTR, e si osserva un evidente aumento della traslocazione nucleare di NFkB (pannello B).

Figura 10 mostra l’effetto dell’inibizione di p75NTR sulla traslocazione nucleare di NFkB in presenza di ligandi dei TLR. Dopo attivazione dei TLR, si osserva la traslocazione di NFkB che passa dal citoplasma al nucleo (pannello A). In presenza della chimera p75NTR, che blocca il legame di NGF a p75NTR, NGF lega solo TrkA, e si osserva un’evidente diminuzione della traslocazione nucleare di NFkB (pannello B).

Figura 11 mostra l’espressione TrkA e p75NTR in pazienti con Artrite Idiopatica Giovanile. Nelle cellule mononucleari (MNC) provenienti da liquidi sinoviali e da sangue di pazienti con Artrite Idiopatica Giovanile (AIG) à ̈ presente un’aumentata espressione di p75NTR ed una ridotta espressione di TrkA, mentre nei controlli sani l’espressione di TrkA à ̈ sempre maggiore di quella di p75NTR (Pannello A). Nei pazienti il rapporto TrkA/p75NTR à ̈ estremamente ridotto rispetto ai controlli sani (Pannello B).

Figura 12 mostra l’espressione di TrkA e di p75NTR in pazienti con Artrite Reumatoide. Il tessuto sinoviale proveniente da articolazioni infiammate di pazienti adulti affetti da artrite reumatoide à ̈ caratterizzato da un elevata espressione di p75NTR ed una ridotta espressione di TrkA mentre nei controlli sani TrkA à ̈ sempre più espresso di p75NTR.

Figura 13 mostra la formula del composto PD90780.

Figura 14 mostra le formule dei composti LM11A-7, LM11A-28, LM11A-31, LM11A-24, LM11A-36 e D3.

Esempio 1: Studio della relazione tra espressione dei recettori p75NTR e TrkA e malattia infiammatoria cronica

METODI

Colture cellulari

In questo studio sono stati utilizzati monociti umani ottenuti da Buffy coats dopo separazione su gradiente di Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sweden), separazione su gradienti discontinui di Percoll (Pharmacia, Uppsala, Sweden) come descritto da Sallusto e Lanzavecchia (47) e successiva selezione immunomagnetica negativa (Miltenyi Biotec, Germany). La purezza delle cellule à ̈ stata valutata al FACS e la frazione di monociti CD14 positivi era >95%. Le cellule sono state piastrate ad una concentrazione di 2x10<6>/ml in piastre Falcon da 96 o 12 pozzetti e coltivate a 37°C in una atmosfera umidificata arricchita con 5% CO2 e in un terreno di coltura costituito da RPMI 1640 (Biowhittaker, Walkersville, MD) con 50 Unità/ml penicillina, 50 µg/ml streptomicina, 2mM L-glutamina (tutto da Gibco-BRL Life Technology, Gaithersburg MD) e 5% siero bovino fetale inattivato (FBS) (HyClone Labs, Logan, Utah). Per studiare gli effetti dell’NGF sull’attivazione dei recettori Toll-like nei monociti sono stati disegnati due schemi sperimentali diversi che differiscono nel momento in cui viene somministrato l’NGF, prima o dopo l’attivazione dei TLR con ligandi specifici.

Condizione A) i monociti umani purificati sono stati pre-incubati con 0.1, 1, 10 e 100 ng/ml NGF per 16 ore e successivamente stimolati con i seguenti ligandi dei TLRs: 10 ng/ml LPS, 2µg/ml LTA, 100ng/ml PAM, 1µg/ml Flagellina. I mezzi condizionati e le cellule sono stati raccolti a tempi diversi che vanno da 3 ore a 5 giorni di stimolazione.

Condizione B) i monociti umani purificati sono stati stimolati con ligandi di TLRs e contemporaneamente à ̈ stato aggiunto NGF a diverse concentrazioni da 0.1 a 100ng/ml. Dopo la stimolazione con 10 ng/ml LPS, 2µg/ml LTA, 100ng/ml PAM, 1µg/ml Flagellina. I mezzi condizionati e le cellule sono stati raccolti a tempi diversi che vanno da 3 ore a 5 giorni di stimolazione.

Misurazione Citochine con ELISA

I mezzi condizionati sono stati raccolti dopo 18 ore di stimolazione con i ligandi dei TLR, conservati a -70°C e poi analizzati per misuare la concentrazione di diverse citochine. Le citochine umane IL-6, IL-1ra, IL-1 β, IL-8, TNF-α e IL-10 sono state misurate nei mezzi condizionati con test ELISA Duoset forniti dalla R&D Systems, Minneapolis, MN, seguendo le istruzioni fornite dalla ditta produttrice. La sensibilità degli ELISA era rispettivamente di 5.47 pg/ml per IL-6, 39.06 pg/ml per IL-1ra pg/ml, 7.8 pg/ml per IL-1 β, 31.25 pg/ml per IL-8, 7.8 pg/ml per TNF-α, and 15.62 pg/ml per IL-10.

Estrazione di RNA e analisi PCR Real-time

L’RNA totale à ̈ stato estratto da 2x10<6>monociti per ciascun tipo di trattamento e a tempi diversi di incubazione usando RNeasy® mini kit (Qiagen GmbH, Germany), e seguendo le istruzioni della ditta produttrice. La concentrazione e la purezza dell’RNA estratto sono state misurate allo spettrofotometro e 1µg di RNA totale per ciascun campione à ̈ stato usato per la sintesi di cDNA usando il Superscript VILO cDNA synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Analisi PCR Real-time

La Real-time polymerase chain reaction (PCR) per l’analisi dell’espressione di TrkA, p75-NTR, TLR2, TLR4, IL-6, IL-1 and IL-10 à ̈ stata eseguita su una piattaforma ABI PRISMâ„¢ 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA), usando Taqman Master Mix universale (Applied Biosystems, Foster City, CA). L’espressione di TrkA, p75-NTR, IL-6, IL-1 and IL-10 à ̈ stata misurata utilizzando reagenti degli Assays on Demand della Applied Biosystems (p75-NTR Hs00182120_m1; IL-6 Hs00985639_m1; IL-1β Hs00174097_m1; IL-10 Hs00961622_m1). Le sequenze dei primer e delle sonde per i TLR2 e TLR4 utilizzate sono le seguenti : TLR2 forward primer 5’-CAGCACTGGTGTCTGGCATG – 3’ (SEQ ID NO:1); TLR2 reverse primer 5’ – CAGGCCCACATCATTTTCATATAC – 3’ (SEQ ID NO:2); TLR2 probe 6- FAM – CTGTGCTCTGTTCCTGCTGATCCTGC – TAMRA (SEQ ID NO:3); TLR4 forward primer 5’ – CAGAGTTTCCTGCAATGGATCA – 3’ (SEQ ID NO:4); TLR4 reverse primer 5’ – GCTTATCTGAAGGTGTTGCACAT – 3’ (SEQ ID NO:5); TLR4 probe 6-FAM- CGTTCAACTTCCACCAAGAGCTGCCT – TAMRA (SEQ ID NO:6).

In tutti gli esperimenti ogni reazione di PCR à ̈ stata condotta in duplicato. Tutti i valori di espressione ottenuti per ciascun gene sono stati normalizzati con quello del gene housekeeping, che in questi esperimenti era β-actina. (TaqMan® Endogenous Control human β-actin 4326315E, Applied Biosystems, Foster City, CA).La quantificazione relativa à ̈ stata eseguita usando il metodo comparativo del CT(I livelli di espressione sono stati calcolati come 2^ ∆Ct e poi comparati tra loro) e i risultati ottenuti sono stati espressi in unità arbitrarie (AU).

Western Blot

I monociti sono stati lisati in un tampone RIPA modificato contenente: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.25% Nadeoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM PMSF; 1 µg/ml ciascuno di aprotinina, leupeptina and pepstatina; and 25 mM NaF (tutto dalla Sigma). Dopo risoluzione con SDS-PAGE, le proteine sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK) ed incubate con anticorpi specifici usando procedure standard. Gli anticorpi legati alla nitrocellulosa sono stati evidenziati con chemiluminescenza con ECL (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK). In questi esperimenti sono stati utilizzati anticorpi policlonali contro ERK, phospho-ERK, p38, phospho-p38, Akt, phospho Akt (Ser 473) tutti acquistati dalla Cell Signaling (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); gli anticorpi monoclonali e policlonali contro p65 NF-κB, IκBα provengono dalla Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); gli anticorpi monoclonali contro la tubulina dalla Sigma (Saint Louis, MO).

Traslocazione Nucleare NFkB

I monociti sono stati incubati con i ligandi di TLR, con o senza aggiunta di NGF e degli inibitori dei recettori TrkA e p75-NTR per 30 minuti. Le cellule sono state fissate per 20 minuti in 4% formaldeide in PBS, permeabilizzate in metanolo a freddo per 5 minuti, seguito da una incubazione di 20 minuti con PBS 2% BSA per il blocco dei siti aspecifici. Lo studio al confocale à ̈ stato eseguito utilizzando un microscopio laser confocale Olympus. La tecnologia di acquisizione in modalità sequenziale consente la discriminazione tra le emissioni di diversi fluorofori (ad emissione blu, verde, rossa, infrarossa). La quantificazione dell’intensità nucleare di NF-κB à ̈ stata eseguita utilizzando il programma di analisi di immagine FVAS2.1 della Olympus. I nuclei marcati con il colorante DRAQ5 (Biostatus) sono stati selezionati ed à ̈ stata quantificata l’intensità media di fluorescenza di NF-κB e l’area dei nuclei. Almeno 3 campi diversi per ogni condizione sono stati acquisiti con obiettivo ad immersione 60x e tra 50-100 cellule quantificate per ogni condizione.

Analisi campioni pazienti

Sono stati analizzati 21 campioni di liquido sinoviale e 14 di sangue periferico ottenuti da 27 pazienti con artrite idiopatica giovanile. I campioni dei pazienti sono stati ottenuti previo consenso informato nell'ambito di un progetto sulla valutazione dell’ espressione di geni correlati al decorso dell’artrite giovanile approvato dal Comitato etico del OPBG in data 26.03.2010 con n° protocollo 81/10.

Campioni di sangue periferico di 16 individui sani sono stati utilizzati come controlli. Sono stati inoltre analizzati 6 campioni di tessuto sinoviale ottenuto da pazienti adulti con artrite reumatoide fattore reumatoide positiva.

L’RNA totale à ̈ stato estratto da campioni di tessuto sinoviale o da cellule mononucleate ottenute dopo separazioni su gradiente di Ficoll (Pharmacia) da liquidi sinoviali o da sangue dei pazienti usando Trizol e seguendo le istruzioni della ditta produttrice. La concentrazione e la purezza dell’RNA estratto sono state misurate allo spettrofotometro e 1µg di RNA totale per ciascun campione à ̈ stato usato per la sintesi di cDNA usando il Superscript VILO cDNA synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA).

RISULTATI

Lo scopo della nostra ricerca à ̈ stato quello di comprendere come l’aumentata produzione locale di NGF, durante il processo infiammatorio, possa influenzare la sintesi di citochine da parte dei monociti/macrofagi (M/M) e la risposta immunitaria.

I dati ottenuti hanno dimostrato la presenza di due diversi meccanismi con cui NGF agisce sulla risposta infiammatoria dei monociti. Questi due meccanismi sono stati messi in evidenza utilizzando due sistemi sperimentali la cui principale differenza é il momento in cui si aggiunge NGF, prima o dopo l’attivazione dei TLRs.

Effetti di NGF sulla sintesi di citochine e espressione TLRs

Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando due sistemi sperimentali diversi:

Condizione A) Pre-incubazione con NGF e successiva stimolazione TLRs

I monociti umani purificati sono stati preincubati con NGF e successivamente stimolati con i ligandi dei TLRs. In questa condizione, l’analisi dell’espressione dei TLRs ha dimostrato che la preincubazione con NGF aumenta sensibilmente l’espressione costitutiva del TLR2 e TLR4 dopo stimolazione con il ligando specifico (Figura 1A e 1B). Con la stimolazione di TLR2 (con PAM e LTA), TLR4 (con LPS) e TLR5 (con Flagellina), si osserva nei monociti pre-trattati con NGF un aumento nell’espressione e rilascio di IL-6 (Figura 1C), IL-1β (Figura 1D) e TNF-α (non mostrato) che à ̈ NGF dosedipendente (Figura 1E). In assenza dei ligandi specifici per i TLRs, il solo NGF non ha alcun effetto sull’espressione o il rilascio di citochine nei monociti non stimolati (Figure 1C e 1D).

Condizione B) Stimolazione TLRs e successiva aggiunta di NGF

I monociti umani sono stati stimolati con ligandi di TLRs e contemporaneamente à ̈ stato somministrato NGF. L’aggiunta di NGF durante la stimolazione di TLR determina una riduzione nell’espressione di TLR2 (Figura 2A) ed una riduzione nella produzione di IL-6 (Figura 2B), di TNF-α (Figura 2C) e di IL-1 β che à ̈ NGF dose dipendente (Figura 2D). Inoltre l’aggiunta di NGF ha come effetto quello di aumentare il rilascio di IL-1ra (Figure 3A), che à ̈ un antagonista del recettore di IL-1, e la sintesi di IL-10 (Figura 3B). Anche in questa condizione sperimentale il solo NGF non modifica l’espressione costitutiva di TLRs o la sintesi di citochine infiammatorie o antiinfiammatorie nei monociti non stimolati.

In entrambe le condizioni di coltura l’aggiunta di anticorpi neutralizzanti dell’NGF insieme ad NGF annulla l’effetto di NGF sull’induzione o di inibizione della sintesi di citochine osservabile dopo l’attivazione dei TLR (dati non mostrati).

Analisi dell’espressione recettori di NGF

Poiché l’azione biologica di NGF à ̈ mediata dal suo legame a recettori specifici, abbiamo valutato i livelli di espressione di p75NTR e TrkA nei monociti nelle due diverse condizioni di coltura e modalità di somministrazione. I monociti quiescenti esprimono livelli basali sia di TrkA che p75NTR (Figura 4A). TrkA à ̈ più espresso di p75NTR, con un rapporto TrkA/p75NTR di circa 4. La stimolazione con i ligandi di TLRs induce un sensibile aumento dell’espressione di TrkA (Figura 4A e vedi cinetica della stimolazione con LPS e LTA Figura 4B e 4C) e un leggero aumento dell’espressione di p75NTR. Quando NGF viene aggiunto dopo la stimolazione dei TLRs si induce un ulteriore aumento dell’espressione di TrkA, mentre non ci sono effetti rilevanti di NGF sull’espressione di p75NTR (Figura 4A).

Quando i monociti vengono pre-incubati per 18 ore con NGF abbiamo osservato, in assenza di stimolazione con TLRs, un aumento dell’espressione di p75NTR ed una riduzione dell’espressione di TrkA, con un rapporto TrkA/p75 che passa da 5,6 nelle cellule senza NGF a 0,48 nelle cellule incubate o.n. insieme a NGF (Figura 4D).

Sulla base di questi risultati appare ragionevole ipotizzare che gli effetti opposti osservati per NGF nelle due diverse condizioni di coltura siano dipendenti dai diversi livelli di espressione dei due recettori di NGF. A supporto di questa ipotesi abbiamo osservato che anche le vie di segnale che si attivano nelle due condizioni sono diverse. Quando à ̈ più espresso p75-NTR l’ aggiunta di NGF induce una preferenziale attivazione della via di segnale di NFk-B (Figura 5A), mentre in presenza di elevati livelli di TrkA si osserva un’inibizione della traslocazione nucleare di NFkB (Figura 6) e l’attivazione delle vie di segnale regolate da Akt (Figura 5B), che sono coinvolte nei meccanismi endogeni di inibizione dell’infiammazione (48).

Nel loro insieme questi dati suggeriscono l’ipotesi che l’effetto pro-infiammatorio di NGF presente nella condizione di coltura A sia mediato dal suo legame con il recettore p75, mentre l’effetto anti-infiammatorio presente nella condizione di coltura B sia mediato dal suo legame con il recettore TrkA

Effetti degli inibitori dei recettori di NGF. Allo scopo di dimostrare il ruolo differente dei due recettori di NGF nel mediare l’effetto proinfiammatorio e l’effetto anti-infiammatorio e le specifiche vie di segnale attivate, abbiamo eseguito esperimenti utilizzando inibitori specifici di TrkA e p75NTR. Sono stati utilizzati anticorpi monoclonali neutralizzanti TrkA (policlonale di capra ottenuto dall’immunizzazione con il dominio extra-cellulare della proteina Trka umana ricombinante, R&D Systems) e p75NTR (anticorpo monoclonare clone ME20.4, Chemicon). Sono state anche utilizzate molecole di fusione costituite dal frammento Fc delle Ig umane legato covalentemente alla porzione extracellulare del recettore di TrkA o p75 (sintetizzati e commercializzati dalla R&D Systems). Questi anticorpi chimerici rappresentano di fatto dei recettori solubili in grado di legare l’NGF presente nella coltura cellulare, nei siti di legame specifici per p75NTR o per TrkA e impediscono quindi il legame di NGF con il rispettivo recettore presente sulla cellula.

Quando, in presenza di anticorpi anti-TrkA o di chimera TrkA, à ̈ bloccato il legame tra NGF e TrkA ed à ̈ possibile il legame di NGF con il solo p75NTR, l’aggiunta di NGF a monociti quiescenti, in assenza dei ligandi di TLRs, induce la fosforilazione di IkB, che invece non à ̈ indotta dal solo NGF (Figura 7A, e anche Figura 8A) e la sintesi di citochine infiammatorie (Figura 7B). Quando si attivano i TLRs in presenza di anticorpi anti-TrkA o di chimera TrkA, l’aggiunta di NGF determina un aumento della fosforilazione di IkB e di erk (Figura 8A), una maggiore traslocazione nucleare di NF-kB (Figura 9) ed un aumento nella sintesi delle citochine infiammatorie (Figura 8B). Al contrario, bloccando il legame di NGF con p75NTR con l’anticorpo monoclonale o la chimera, l’aggiunta di NGF, che à ̈ in grado di legare solo TrkA, induce una diminuzione della sintesi di citochine infiammatorie dopo attivazione dei TLRs (Figura 8B). Questa regolazione avviene attraverso l’inibizione della traslocazione di NFkB nel nucleo (Figura 10) e l’attivazione del pathway PI3K/AKT (Figura 9A); à ̈ ben noto che l’attivazione di questa pathway di segnale à ̈ un meccanismo chiave nella limitazione della risposta infiammatoria, che induce la sintesi della citochina anti-infiammatoria IL-10 e riduce la sintesi di citochine infiammatorie (48,49).

I dati ottenuti confermano quanto osservato nelle due condizioni di coltura in cui un recettore era più espresso dell’altro e dimostrano che NGF svolge un’ attività anti-infiammatoria se agisce attraverso TrkA, e un’attività pro-infiammatoria se agisce attraverso p75NTR. L’effetto di NGF dipende quindi dal livello relativo di espressione dei due recettori: ne consegue quindi che una disregolazione nell’espressione dei recettori di NGF potrebbe essere coinvolta nell’insorgenza e nel mantenimento dell’infiammazione cronica.

Analisi cellule mononucleate e tessuti provenienti da pazienti affetti da patologie infiammatorie croniche

Per valutare l’ipotesi che un’alterazione del rapporto TrkA/p75 possa contribuire alla patogenesi delle malattie infiammatorie determinando un’anormale regolazione della risposta infiammatoria, abbiamo analizzato l’espressione dei recettori NGF e il loro rapporto relativo in cellule mononucleari (MNC) provenienti da liquidi sinoviali e da sangue di pazienti con Artrite Idiopatica Giovanile (AIG). I nostri dati indicano che nei pazienti con artrite idiopatica giovanile (n=27) esiste un’aumentata espressione di p75NTR ed una ridotta espressione di TrkA, mentre nei controlli sani (n=16) l’espressione di TrkA à ̈ sempre maggiore di quella di p75NTR (Figura 11A). Nei pazienti à ̈ quindi presente un rapporto TrkA/p75-NTR invertito a favore di p75-NTR (Figura 11B), cioà ̈ del recettore che legando NGF à ̈ in grado di attivare vie di segnale che inducono sintesi di citochine infiammatorie. È da sottolineare che à ̈ già noto che in pazienti con AIG esiste una maggiore produzione di NGF nel tessuto infiammato (50). I nostri dati indicano che questi pazienti sono caratterizzati sia da un rapporto di recettori alterato a favore di p75NTR che da livelli aumentati di NGF, il quale può quindi legarsi preferenzialmente al recettore p75NTR maggiormente espresso, amplificando così la risposta infiammatoria locale delle cellule dell’immunità innata. Allo scopo di verificare se la diminuzione di espressione di TrkA e l’aumento di p75-NTR e la conseguente inversione del rapporto TrkA/p75 rappresentino un fenomeno comune ad altre condizioni infiammatorie, abbiamo valutato l’espressione relativa dei due recettori in tessuto sinoviale proveniente da articolazioni infiammate di pazienti adulti affetti da artrite reumatoide. Le sinovie di questi pazienti sono caratterizzate da un elevata espressione di p75NTR ed una ridotta espressione di TrkA (Figura 12) che, anche in questa patologia infiammatoria, determinano un’ alterazione del rapporto TrkA/p75NTR.

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Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1) Composto scelto tra antagonisti di p75NTR, agonisti di TrkA o loro combinazioni, eventualmente in associazione con NGF, per l’uso nel trattamento delle malattie infiammatorie croniche.
2. 2) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui gli antagonisti di p75NTR sono scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali e monoclonali che legano p75NTR, chimerici neutralizzanti o recettori solubili, analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF che legano p75NTR.
3. 3) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 2, in cui gli anticorpi monoclonali sono scelti nel gruppo che consiste in chimera TrkA/Fc umana ricombinante, chimera NGFR/TNFRSF16/Fc umana ricombinante, anticorpo monoclonale anti-nerve growth factor receptor p75 umano clone ME20.4, anticorpo monoclonale ME24.1, anticorpi monoclonali MLR-1, MLR2, MLR3, anticorpo anti-p75NTR umano clone HB-8737 (ATCC).
4. 4) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 2, in cui l’anticorpo policlonale à ̈ l’anticorpo policlonale anti-p75NTR neutralizzante (REX).
5. 5) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 2, in cui gli analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF che legano p75NTR sono scelti tra NGF C30-35, composto PD90780, composti LM11A.
6. 6) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 5, in cui i composti LM11A sono scelti nel gruppo che consiste in LM11A-24 derivati dalla caffeina o LM11A 31 derivati dalla isoleucina.
7. 7) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui gli agonisti di TrkA sono scelti nel gruppo che consiste in anticorpi policlonali e monoclonale che legano TrkA, analoghi ciclici monomerici e dimerici dell’NGF o NGF ricombinante mutato.
8. 8) Composto per l’uso secondo al rivendicazione 7 in cui l’anticorpo monoclonale à ̈ il 5C3.
9. 9) Composto per l’uso secondo al rivendicazione 7 in cui l’analogo ciclico dell’NGF à ̈ NGF C92-97.
10. 10) Composto per l’uso secondo al rivendicazione 7 in cui l’NGF ricombinante mutato à ̈ il NGFKKE/7-84-103.
11. 11) Composto per l’uso secondo al rivendicazione 7 in cui gli agonisti di TrkA sono scelti tra il peptide D3, l’amide gambogica, derivati del 3-azabiciclo [3,2,1]ottano.
12. 12) Composto per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui le malattie infiammatorie croniche sono scelte nel gruppo che consiste in artrite reumatoide, artrite idiopatica giovanile, malattie infiammatorie croniche intestinali, spondilite anchilopoietica, psoriasi, sclerosi multipla, Lupus eritematoso, scleroderma, Sindrome di Sjogren.
13. 13) Composto per l’uso secondo la rivendicazione 12, in cui le malattie infiammatorie croniche intestinali sono scelte tra Morbo di Crohn, colite ulcerosa.
14. 14) Combinazione di composti antagonisti di p75NTR e/o agonisti di TrkA e/o NGF per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nella cura delle malattie infiammatorie croniche.
15. 15) Metodo diagnostico in vitro comprendente o consistente nella valutazione del rapporto dell’espressione dei recettori TrkA e p75NTR, in cui un rapporto minore di 1 à ̈ predittivo, in pazienti con malattie infiammatorie croniche, di risposta alla terapia con uno o più composti o combinazioni definiti in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 14.
16. 16) Metodo di screening in vitro per valutare l’effetto anti-infiammatorio di antagonisti farmacologici di p75NTR o di agonisti di TrKA comprendente o consistente nelle seguenti fasi: a) mettere in contatto un campione biologico di paziente affetto da malattia infiammatoria cronica con detto antagonista o agonista; b) misurare i livelli di citochine proinfiammatorie dopo stimolazione con ligandi dei TLR.