BR112014021099A2 - anticorpo, composição farmacêutica, dna e método de tratamento e/ou prevenção de câncer e uso de um anticorpo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, DNA E MÉTODO D E TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE CÂNCER E USO DE UM ANTICORPO. A presente invenção fornece um anticorpo dirigido a uma proteína antigênica de câncer expressa especificamente sobre a superfície de células de câncer e seu uso como agente terapêutico e/ou preventivo para o câncer. Especificamente, a presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que possui reatividade imunológica com um polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SE Q ID N° 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos e uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo ou seu fragmento como ingrediente ativo.

Description

“ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, DNA E MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE CÂNCER E USO DE UM ANTICORPO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao novo uso de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um fragmento do mesmo em uma droga tal como um agente terapêutico e/ou preventivo para o câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é a principal causa de morte. Esta doença atualmente é tratada principalmente por meio de terapia cirúrgica em combinação com terapia de radiação e/ou quimioterapia. Apesar do recente desenvolvimento de métodos cirúrgicos inovadores e da descoberta de novos agentes de combate ao câncer, o tratamento de câncer existente apresenta resultado insuficientemente aprimorado, exceto para alguns tipos de câncer. Com os recentes avanços da biologia molecular ou imunologia do câncer, foram identificados anticorpos que reagem especificamente com câncer, antígenos de câncer que são reconhecidos por células T citotóxicas, genes que codificam esses antígenos de câncer e similares, elevando as expectativas sobre terapia de câncer específica dirigida aos antígenos do câncer (Literatura Não de Patente 1).

[003] Para reduzir a reação adversa da terapia de câncer, deseja-se que peptídeos, polipeptídeos ou proteínas reconhecidas como antígenos de câncer existam raramente em células normais e existam especificamente em células cancerígenas. Em 1991, Boon et al (Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer, Bélgica) isolaram um antígeno de melanoma humano MAGE1 reconhecido por células T positivas para CD8 por meio de um método de clonagem da expressão de cDNA utilizando linhagens de células de câncer autólogas e células T reativas ao câncer (Literatura Não de Patente 2).

Em seguida, foi relatado um método SEREX (identificação sorológica de antígenos por meio de clonagem de expressão recombinante), que adota uma abordagem de clonagem da expressão genética para identificar antígenos de tumores reconhecidos por anticorpos produzidos em resposta a câncer autólogo in vivo em pacientes com câncer (Literatura Não de Patente 3 e Literatura de Patente 1). Segundo este método, foram isolados alguns antígenos de câncer que são raramente expressos em células normais e são especificamente expressos em câncer (Literatura Não de Patente 4 a 9). Além disso, terapia celular utilizando imunócitos que reagem especificamente com antígenos do câncer ou imunoterapia específica de câncer utilizando vacinas ou similares que compreendem antígenos de câncer encontra-se em testes clínicos dirigidos a alguns dos antígenos de câncer isolados.

[004] Nos últimos anos, surgiram no mundo diversas drogas de anticorpos para o tratamento de câncer, dirigidos a proteínas antigênicas sobre células cancerígenas. Essas drogas receberam atenção devido à sua certa eficácia como agentes terapêuticos específicos do câncer. A grande maioria das proteínas antigênicas dirigidas pelas drogas, entretanto, também é expressa em células normais. Como resultado da administração dos anticorpos, células cancerígenas e células normais que expressam os antígenos são danificadas, inconvenientemente resultando em reação adversa. Desta forma, caso antígenos de câncer expressos especificamente sobre a superfície de células cancerígenas possam ser identificados e anticorpos dirigidos aos antígenos possam ser utilizados como drogas, pode-se esperar que essas drogas de anticorpos atinjam tratamento com menos reações adversas.

[005] Proteína citoplasmática e associada à proliferação 1 (CAPRIN-1) é conhecida como proteína intracelular que é expressa mediante ativação ou divisão celular de células normais em repouso e forma grânulos de tensão citoplasmática com RNAs em células para participar da regulagem de transporte e tradução de mRNAs. Descobriu-se que esta proteína é especificamente expressa sobre a superfície de células cancerígenas e encontra-se sob estudo como alvo de drogas de anticorpos para tratamento de câncer (Literatura de Patentes 2).

[006] Lista de citações:

[007] Literatura de patentes:

[008] Literatura de Patente 1: Patente Norte-Americana nº

5.698.396.

[009] Literatura de Patente 2: WO 2010/016526.

[0010] Literatura não de patentes:

[0011] Literatura Não de Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy, 1997, Vol. 24, págs. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japão)

[0012] Literatura Não de Patente 2: Bruggen, P. et al, Science, 254: 1643-1647 (1991)

[0013] Literatura Não de Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92: 11810-11813 (1995)

[0014] Literatura Não de Patente 4: /nt. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

[0015] Literatura Não de Patente 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

[0016] Literatura Não de Patente 6: /nt J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

[0017] Literatura Não de Patente 7: /nt J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

[0018] Literatura Não de Patente 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

[0019] Literatura Não de Patente 9: Hum. Mol. Genet. 6: 33-39,

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0020] Un objeto da presente invenção é a produção de anticorpos que se dirigem a CAPRIN-1 especificamente expressos sobre a superfície de células cancerígenas e apresentam atividade antitumoral superiores a anticorpos convencionais e o fornecimento do seu uso como agente terapêutico e/ou de prevenção para câncer.

SoLução DO PROBLEMA

[0021] A presente invenção possui os aspectos a seguir:

[0022] A presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que possui reatividade imunológica com um polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que possui a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos, e uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo ou seu fragmento como ingrediente ativo.

[0023] Em uma realização da presente invenção, o câncer é câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

[0024] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou anticorpo policlonal.

[0025] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de fita simples ou anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico).

[0026] O presente relatório descritivo inclui o conteúdo do Pedido de Patente Japonês nº 2012-035342, do qual o presente pedido reivindica prioridade.

EFEITOS VANTAJOSOS DA PRESENTE INVENÇÃO

[0027] O anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção danifica as células cancerígenas. Desta forma, o anticorpo contra CAPRIN-1 é útil no tratamento ou prevenção de câncer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0028] O anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece e liga-se a um polipeptídeo parcial previamente determinado de CAPRIN1 e possui atividade antitumorall Mais especificamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece (ou seja, possui reatividade imunológica com) um polipeptídeo parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipeptídeo CAPRIN-1 parcial) que consiste da sequência de aminóacidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos. Na presente invenção, demonstrou-se que este anticorpo exibe atividade antitumoral. A presente invenção refere-se a todos os anticorpos que se ligam aos fragmentos de proteínas CAPRIN-1 conforme descrito acima e exibem atividade antitumoral.

[0029] O anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo que possa exercer atividade antitumoral e inclui, por exemplo, anticorpos recombinantes (tais como anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de fita simples (scFv)), anticorpos humanos e seus fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab'), e Fv). Estes anticorpos e seus fragmentos podem ser preparados por meio de métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Desejavelmente, o anticorpo de acordo com a presente invenção possui reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou seu polipeptídeo parcial, ou seja, ele se liga à proteína CAPRIN-1 por meio de reação entre antígeno e anticorpo e, preferencialmente, liga-se especificamente à proteína CAPRIN-1. Neste contexto, a expressão “que se liga especificamente à proteína CAPRIN-1" indica que o anticorpo liga-se especificamente à proteína CAPRIN-1 sem ligar-se substancialmente a outras proteínas. O anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal e, entretanto, pode ser um anticorpo policlonal desde que anticorpos homogêneos possam ser produzidos de forma estável. No caso de paciente humano, é desejável um anticorpo humano ou anticorpo humanizado para evitar ou suprimir a rejeição.

[0030] O anticorpo contra um polipeptídeo CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser avaliado para determinar a sua atividade antitumoral, conforme descrito posteriormente, examinando in vivo a inibição do crescimento de tumores em animais portadores de câncer ou examinando ex vivo a presença ou ausência de atividade citotóxica mediada por complementos ou imunócitos exibida pelo anticorpo contra células de tumores que expressam o polipeptídeo.

[0031] O paciente que receberá o tratamento e/ou prevenção de câncer de acordo com a presente invenção é um mamífero tal como ser humano, animal de estimação, animal de criação ou animal esportivo e, preferencialmente, é ser humano.

[0032] A seguir, a presente invenção será descrita com mais detalhes.

PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO PARA PREPARAÇÃO DE ANTICORPO

[0033] Proteínas ou seus fragmentos utilizados como antígenos sensibilizantes para obter o anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção não são limitadas pelas espécies animais que lhes servem de origem, que incluem seres humanos, cães, gatos, bois, cavalos, camundongos, ratos e galinhas. As proteínas ou seus fragmentos, entretanto, são preferencialmente selecionadas em vista da compatibilidade com células parentais para uso em fusão celular. Geralmente, são preferidas proteínas derivadas de mamíferos. Particularmente, são preferidas proteínas derivadas de seres humanos. Quando CAPRIN-1 for CAPRIN-1 humana, por exemplo, podem ser utilizadas proteínas CAPRIN-1 humanas, seus peptídeos parciais ou células que expressam CAPRIN-1 humana.

[0034] As sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos de CAPRIN-1 humana e seus homólogos podem ser obtidas, por exemplo, por meio de acesso ao GenBank (NCBl, Estados Unidos), utilizando um algoritmo tal como BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5873-5877, 1993; e Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402, 1997).

[0035] Na presente invenção, com referência à sequência de nucleotídeos (SEQ ID Nº 1 ou 3) ou sequência de aminoácidos (SEQ ID Nº 2 ou 4) de CAPRIN-1 humana, a CAPRIN-1 alvo é um ácido nucleico ou proteína que consiste de uma sequência que possui identidade de sequências de 70% a 100%, preferencialmente de 80% a 100%, de maior preferência de 90% a 100%, de preferência adicional de 95% a 100%, tal como de 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100% ou 99,5% a 100% com a sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos de ORF ou parte madura da sequência de referência. Observe-se que as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 e SEQ ID Nº 4 em comparação entre si diferem de resíduos de aminoácidos na posição 690 e seguintes. Neste contexto, a expressão “% de identidade de sequências” indica um percentual (%) da quantidade de aminoácidos (ou bases de nucleotídeos) idênticos com relação à quantidade total de aminoácidos (ou bases de nucleotídeos) quando duas sequências são alinhadas de forma a atingir o grau máximo de similaridade ou identidade com ou sem a introdução de lacunas.

[0036] Como fragmento de proteína CAPRIN-1, um fragmento que compreende um epítopo (ou determinante antigênico), que é a menor unidade reconhecida por um anticorpo e possui comprimento que varia do comprimento de aminoácido do epítopo até menos que o comprimento total da proteína CAPRIN-1, pode ser utilizado. O epítopo designa um fragmento de polipeptídeo que possui antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferencialmente seres humanos. A sua unidade menor consiste de cerca de sete a doze aminoácidos, tal como de oito a onze aminoácidos. O fragmento de proteína CAPRIN-1 a ser utilizado na preparação do anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente um fragmento que é reconhecido pelo anticorpo de acordo com a presente invenção e compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 (que corresponde à sequência das posições 237 a 252 na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 ou 4) ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos ou compreende pelo menos um epítopo que consiste de cerca de sete a doze aminoácidos consecutivos, tais como oito a onze aminoácidos consecutivos em qualquer uma dessas sequências de aminoácidos.

[0037] As proteínas CAPRIN-1 humanas acima e fragmentos de polipeptídeos que compreendem seus peptídeos parciais podem ser sintetizados de acordo com métodos de síntese química, tais como métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonila) e tBoc (t-butiloxicarbonila) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Course in English) 1, edição da Sociedade

Bioquímica Japonesa, Protein Chemistry IV, Chemical Modifications and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japão), 1981). Além disso, esses polipeptíidecos podem ser sintetizados por meio de métodos convencionais utilizando diversos sintetizadores de peptídeos comercialmente disponíveis.

[0038] Alternativamente, polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos podem ser preparados utilizando abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica (Sambrook et al, Molecular Cloning, segunda edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, terceira edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.) e incorporados a vetores de expressão, que são então introduzidos em células hospedeiras para produzir os polipeptídeos nas células hospedeiras. Desta forma, podem ser obtidas as proteínas CAPRIN-1 humanas ou seus fragmentos de polipeptídeos de interesse.

[0039] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos podem ser facilmente preparados por meio de abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica ou métodos convencionais utilizando sintetizadores de ácidos nucleicos disponíveis comercialmente. Un DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de um gene CAPRIN-1 humano, por exemplo, pode ser preparado por meio de PCR utilizando uma biblioteca de cDNA ou DNA cromossômico humano como modelo e um par de primers projetado de forma a ser capaz de amplificar a sequência de nucleotídeos. Condições de reação para este PCR podem ser adequadamente determinadas. Exemplos das condições podem incluir, mas sem limitações, trinta ciclos, cada qual envolvendo etapas de reação de 94 “ºC por trinta segundos (desnaturação), 55 ºC por trinta segundos a um minuto (combinação) e 72 ºC por dois minutos (alongamento) utilizando DNA polimerase termoestável (tal como Taq polimerase ou Pfu polimerase) e um tampão de PCR contendo Mg?*, seguido por reação a 72 ºC por sete minutos. A abordagem de PCR, condições etc. são descritas, por exemplo, em Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, terceira edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (particularmente, Capítulo 15).

[0040] Além disso, primers ou sondas apropriadas podem ser preparadas com base em informações sobre as sequências de nucleotídeos de genes CAPRIN-1 e as sequências de aminoácidos de proteínas CAPRIN-1 e utilizadas na seleção, por exemplo, de uma biblioteca de cDNA humana, para isolar o DNA desejado. Preferencialmente, essa biblioteca de cDNA é produzida a partir de células, órgãos ou tecidos que expressam proteínas CAPRIN-1. Exemplos dessas células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados dos testículos ou de cânceres ou tumores tais como leucemia, câncer de mama, linfoma, tumor do cérebro, câncer do pulmão, câncer pancreático e câncer colorretal. Estas operações, incluindo a preparação de sondas ou primers, a construção de uma biblioteca de cDNA, a seleção da biblioteca de cDNA e a clonagem do gene de interesse, são conhecidas dos técnicos no assunto e podem ser realizadas de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning, segunda edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989) e Ausubel et al (ibid). DNAs que codificam as proteínas CAPRIN-1 humanas e seus peptídeos parciais podem ser obtidos a partir do DNA obtido desta forma.

[0041] As células hospedeiras nas quais são introduzidos os vetores de expressão podem ser quaisquer células capazes de expressar os polipeptídeos acima. Exemplos de células procarióticas incluem, mas sem limitações, E. coli Exemplos de células eucarióticas incluem, mas sem limitações: células de mamíferos tais como células de rim de macaco COS1 e células de ovário de hamster chinês CHO; linhagem de células de rim embriônico humano HEK293; linhagem de células da pele embriônica de camundongos NIH3T3; células de levedura tais como células de levedura de fissão e levedura de gemulação; células de bicho da seda; e células de ovos de Xenopus.

[0042] No caso de uso de células procarióticas como células hospedeiras, os vetores de expressão utilizados possuem uma origem que permite a reprodução nas células procarióticas, promotor, local de ligação de ribossomos, local de clonagem múltipla, terminal, gene de resistência a drogas, gene complementar auxotrófico etc. Exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir série pUC, pBluescript Il, sistemas de expressão pET e sistemas de expressão pGEX. Os DNAs que codificam os polipeptídeos acima podem ser incorporados a esses vetores de expressão, com os quais células hospedeiras procarióticas são transformadas em seguida, seguidos pelo cultivo dos transformadores obtidos de forma que os polipeptídeos codificados pelos DNAs sejam expressos nas células hospedeiras procarióticas. Neste particular, os polipeptídeos podem ser expressos na forma de proteínas de fusão com outras proteínas.

[0043] No caso de uso de células eucarióticas como células hospedeiras, os vetores de expressão para células eucarióticas que possuem um promotor, região de divisão, local de adição poli(A) etc. são utilizados como vetores de expressão. Exemplos desses vetores de expressão podem incluir vetores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, PcDNAS e pYES2. Da mesma forma acima, os DNAs que codificam os polipeptídeos acima podem ser incorporados a esses vetores de expressão, com os quais células hospedeiras eucarióticas são transformadas em seguida, seguidos pelo cultivo dos transformadores obtidos de forma que os polipeptídeos — codificados pelos DNAs sejam expressos nas células hospedeiras eucarióticas. No caso do uso de vetores de expressão tais como

PIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Ni1 ou pEGFP-C1, os polipeptídeos podem ser expressos como diversas proteínas de fusão marcadas com marca His (tais como (His); a (His);so), marca FLAG, marca myc, marca HA, GFP ou similares.

[0044] Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras utilizando métodos bem conhecidos tais como eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lipossomos, método de DEAE dextran, microinjeção, infecção viral, lipofecção e ligação com peptídeos que penetram nas células.

[0045] O polipeptídeo de interesse pode ser isolado e purificado das células hospedeiras por meio de uma combinação de operações de separação conhecidas na técnica. Seus exemplos incluem, mas sem limitações, tratamento com um desnaturante (tal como ureia) ou tensoativo, ultrassonicação, digestão enzimátca, dessalinização, fracionamento e precipitação de solvente, diálise, centrifugação, ultrafiltragem, filtragem de gel, SDS-PAGE, eletroforese de concentração isoelétrica, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.

[0046] Os antígenos preparados desta forma podem ser utilizados como antígenos sensibilizantes conforme descrito posteriormente para produzir o anticorpo de acordo com a presente invenção.

ESTRUTURA DE ANTICORPO

[0047] Anticorpos (imunoglobulinas) são normalmente glicoproteínas heteromultiméricas, cada qual compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As imunoglobulinas, exceto por IgM, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150 kDa cada, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve é conectada a uma cadeia pesada por uma única ligação de dissulfeto covalente, embora a quantidade de ligações de dissulíeto entre cadeias pesadas varie entre diferentes isotipos de imunoglobulina.

Cada uma das cadeias leve e pesada também possui uma ligação de dissulfeto intracadeias.

Cada cadeia pesada possui um domínio variável (região VH) em uma extremidade, seguido por uma série de regiões constantes.

Cada cadeia leve possui um domínio variável (região VL) em uma extremidade e possui uma região constante isolada na outra extremidade.

À região constante de cadeia leve é alinhada com a primeira região constante de cadeia pesada, enquanto o domínio variável de cadeia leve é alinhado ao domínio variável de cadeia pesada.

Regiões específicas denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis de anticorpos exibem variabilidade específica e proporcionam especificidade de ligação ao anticorpo.

As partes relativamente conservadas das regiões variáveis são denominadas regiões de estrutura (FRs). Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada completos compreende quatro FRs conectadas por meio de três CDRs.

Essas trêê CDRs são denominadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3 nesta ordem a partir do lado terminal N da cadeia pesada.

De forma similar, as CDRs são denominadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3 na cadeia leve.

CDRH3 é mais importante para a especificidade de ligação do anticorpo para o seu antígeno.

Além disso, CDRs em cada cadeia são mantidas próximas entre si pelas regiões de FR e contribuem com a formação de um local de ligação de antígenos no anticorpo, em conjunto com CDRs na outra cadeia.

As regiões constantes não contribuem diretamente com a ligação entre anticorpo e antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como envolvimento em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada pela ligação a um receptor Fcy, meia vida/velocidade de liberação mediada por um receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um componente C1q na cascata de complementos.

PREPARAÇÃO DE ANTICORPO

[0048] O anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção indica um anticorpo que possui reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 com comprimento total ou seu fragmento. Particularmente, o anticorpo anti- CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga imunologicamente a um polipeptídeo parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipeptídeo CAPRIN-1 parcial) que é um peptídeo que consiste da sequência de aminoácidos que contém epítopos descrita em SEQ ID Nº 5 ou um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo de acordo com a presente invenção reconhece um epítopo que consiste de cerca de sete a doze aminoácidos consecutivos, tais como oito a onze aminoácidos consecutivos, na sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos. Este anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é capaz de ligação específica à proteína CAPRIN-1 com comprimento total. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser obtido por meio da seleção de um anticorpo que se liga imunologicamente ao polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos, de acordo com um método de rotina a partir de anticorpos obtidos com proteínas CAPRIN-1 ou seus fragmentos como antígenos.

[0049] Neste contexto, a “reatividade imunológica” indica a propriedade do anticorpo que se liga ao antígeno CAPRIN-1 (proteína CAPRIN- 1 com comprimento total ou seu polipeptídeo parcial) in vivo. Por meio dessa ligação a CAPRIN-1, o anticorpo de acordo com a presente invenção exerce a função de prejuízo (tal como morte, supressão ou regressão) a células de tumores. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode danificar tumores, tais como câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal (tal como câncer do cólon), câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma, por meio de ligação à proteína CAPRIN-1.

[0050] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo. Exemplos do tipo de anticorpo de acordo com a presente invenção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de fita simples e fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab'), e Fv). Além disso, o anticorpo é qualquer tipo de molécula de imunoglobulina, tal como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY ou qualquer subclasse, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2.

[0051] Além disso, o anticorpo pode ser modificado por meio de acetilação, formilação, amidação, fosforilação, PEGilação ou similares, bem como glicosilação.

[0052] Serão exibidos a seguir exemplos de preparação de diversos anticorpos.

[0053] Quando o anticorpo de acordo com a presente invenção for um anticorpo monoclonal, por exemplo, uma linhagem de células de câncer de mama SK-BR-3 que expressa CAPRIN-1 é administrada a cada camundongo para imunização. O baço é extraído a partir deste camundongo. Após a separação das células do baço, as células são fundidas com células de mieloma de camundongo. Clones produtores de anticorpos que possuem efeito inibidor do crescimento de células cancerígenas são selecionados a partir das células de fusão obtidas (hibridomas). Alternativamente, clones produtores de anticorpos que se ligam a um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos podem ser selecionados. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais que possuem efeito inibidor do crescimento de células cancerígenas ou os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais contra o polipeptídeo de SEQ ID Nº 5 ou similares são isolados e cultivados. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser preparado por meio de purificação a partir do sobrenadante de cultivo de acordo com um método geral de purificação de afinidade.

[0054] Os hibridomas produtores de anticorpos monocionais podem ser preparados, por exemplo, conforme segue. Em primeiro lugar, os animais são imunizados com antígenos sensibilizantes de acordo com um método conhecido na técnica. Este método de imunização geralmente envolve a injeção intraperitoneal ou subcutânea dos agentes sensibilizantes a mamíferos. Especificamente, os antígenos sensibilizantes são diluídos ou suspensos em PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica ou similares em uma quantidade apropriada e misturados em seguida, se desejado, com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional, tal como um adjuvante de Freund completo. Após emulsificação, a emulsão resultante é administrada a cada mamífero várias vezes a cada quatro a 21 dias. Alternativamente, pode ser utilizado um veículo apropriado para imunização com antígenos sensibilizantes.

[0055] Após confirmação da elevação do nível do anticorpo desejado no soro do mamífero imunizado desta forma, imunócitos são coletados do mamífero e submetidos a fusão celular. Exemplos preferidos dos imunócitos incluem particularmente células do baço.

[0056] Células de mieloma de mamíferos são utilizadas como células parentais parceiras a serem fundidas aos imunócitos. Várias linhagens celulares conhecidas na técnica, tais como P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. e Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276, 269- 270), FO (deSt. Groth, S. F. et al, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, |. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al, Nature (1979) 277, 131-133) são preferencialmente utilizados como células de mieloma.

[0057] A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido na técnica, tal como o método de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[0058] Mais especificamente, a fusão celular é conduzida, por exemplo, na presença de um promotor da fusão celular em um meio nutriente convencional. Utiliza-se, por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou vírus hemaglutinante do Japão (HVJ) como promotor de fusão. Se desejado, pode- se adicionar um auxiliar tal como sulfóxido de dimetila para uso a fim de aumentar a eficiência de fusão.

[0059] A razão entre os imunócitos e as células de mieloma utilizadas pode ser definida arbitrariamente. A quantidade dos imunócitos, por exemplo, é preferencialmente definida em uma a dez vezes a quantidade das células de mieloma. Exemplos do meio que podem ser utilizados na fusão celular incluem meios RPMI1640 e MEM apropriados para o crescimento das linhagens de células de mieloma bem como meios convencionais para uso neste tipo de cultivo celular. Além disso, pode ser utilizado um suplemento de soro tal como soro de feto de bezerro (FCS) em combinação com esses meios.

[0060] Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturados em uma quantidade previamente determinada do meio. Uma solução de PEG (peso molecular médio: por exemplo, cerca de 1000 a 6000) previamente aquecida a cerca de 37 ºC normalmente é adicionada à mistura em concentração de 30 a 60% (p/v) e misturada para formar os hibridomas de interesse. Em seguida, os procedimentos de adição sequencial de um meio apropriado e remoção do sobrenadante por meio de centrifugação são preferencialmente repetidos para remover agentes de fusão celular ou similares desfavoráveis ao crescimento dos hibridomas.

[0061] Os hibridomas obtidos desta forma são cultivados em um meio de seleção convencional, tal como meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) para seleção. Este cultivo no meio HAT continua por um período (normalmente de vários dias a várias semanas) suficiente para a morte das células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas de interesse. Em seguida, hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são selecionados e clonados na forma de clones isolados por meio de um método de diluição limitador convencional.

[0062] Além dessa obtenção dos hibridomas por meio de imunização de animais não humanos com antígenos, hibridomas produtores de anticorpos humanos que possuem a atividade desejada (tal como atividade inibidora do crescimento celular) podem ser obtidos por meio da sensibilização de linfócitos humanos, tais como linfócitos humanos infectados por vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas ou seus lisatos in vitro e fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de seres humanos capazes de dividir permanentemente, por exemplo, U266 (Acesso nº TIB196).

[0063] Os hibridomas produtores de anticorpos monocionais preparados desta forma podem ser subcultivados em meio convencional e podem também ser armazenados por longos períodos em nitrogênio líquido.

[0064] Especificamente, os antígenos desejados ou células que expressam os antígenos desejados são utilizados como agentes sensibilizantes em imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos obtidos são fundidos a células parentais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. Células produtoras de anticorpos monoclionais (hibridomas) podem ser selecionadas por meio de um método de seleção convencional para preparar os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais contra os antígenos desejados.

[0065] Outro exemplo do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção é um anticorpo policlonal. O anticorpo policlonal pode ser obtido, por exemplo, conforme segue: - Soro é obtido de animais pequenos tais como camundongos, camundongos produtores de anticorpos humanos ou coelhos imunizados com proteínas CAPRIN-1 naturais ou proteínas CAPRIN-1 recombinantes expressas como proteínas de fusão com GST ou similares em micro-organismos tais como E. coli ou seus peptídeos parciais. Alternativamente, soro pode ser obtido de mamíferos imunizados com fragmentos de CAPRIN-1 como antígenos sensibilizantes, em que cada qual é um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais,

preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos (preferencialmente, um polipeptídeo que consiste de qualquer uma dessas sequências de aminoácidos) ou um polipeptídeo que compreende pelo menos um epítopo (preferencialmente, que consiste do epítopo) que consiste de cerca de sete a doze aminoácidos consecutivos, tais como oito a onze aminoácidos consecutivos, na sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, de maior preferência 90% ou mais, de preferência adicional 95% ou mais com a sequência de aminoácidos. O soro obtido desta forma pode ser purificado utilizando, por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, colunas de proteína A ou proteína G, cromatografia de troca de íons DEAE ou colunas de afinidade acopladas a proteínas CAPRIN-1 ou peptídeos sintéticos para preparar anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1. O anticorpo policlonal de acordo com a presente invenção inclui anticorpos obtidos a partir de animais produtores de anticorpos humanos (tais como camundongos) imunizados com proteínas CAPRIN-1.

[0066] Neste contexto, por exemplo, camundongos KM (Kirin Pharma Co,., Ltd./Medarex) e camundongos Xeno (Amgen Inc.) são conhecidos como camundongos produtores de anticorpos humanos (tais como Patentes Internacionais nº WO 02/43478 e WO 02/092812). Anticorpos policlonais humanos completos podem ser obtidos do sangue desses camundongos imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou seus fragmentos. Alternativamente, células do baço podem ser isoladas dos camundongos imunizados desta forma e fundidas com células de mieloma. Desta forma, podem ser obtidos anticorpos monoclonais humanos.

[0067] Os antígenos podem ser preparados, por exemplo, de acordo com um método que utiliza células animais (Patente Japonesa

Publicada (Kohyo) nº 2007-530068 A (2007)) ou um método que utiliza bacilovírus (por exemplo, Patente Internacional nº WO 98/46777). Antígenos que possuem baixa imunogenicidade podem ser ligados a macromoléculas imunogênicas tais como albumina para imunização. Os antígenos podem ser administrados em conjunto com adjuvantes para imunização.

[0068] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser obtido na forma de anticorpo recombinante genético que é produzido utilizando um método de engenharia genética que envolve: clonagem de genes do anticorpo a partir de hibridomas; incorporação dos genes de anticorpo em vetores apropriados; e introdução dos vetores em hospedeiros (vide, por exemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino Unido pela MacMillan Publishers Ltd., 1990). Especificamente, cDNAs de região variável de anticorpo (região V) são sintetizados a partir dos mMRNAs de hibridomas utilizando transcriptase reversa. Após a obtenção de DNAs que codificam as regiões de anticorpo V de interesse, os DNAs são ligados a DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpos desejadas (regiões C). Os produtos de ligação resultantes são incorporados a vetores de expressão. Alternativamente, os DNAs codificadores de região V de anticorpo podem ser incorporados a vetores de expressão que contêm DNAs de região C de anticorpo. Esses DNAs são incorporados aos vetores de expressão de forma a serem expressos sob o controle de regiões de controle de expressão, tais como um amplificador e um promotor. Em seguida, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e mantidas para expressar anticorpos.

[0069] O anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo geneticamente elaborado (anticorpo quimérico, anticorpo humanizado etc.) ou similares.

[0070] O anticorpo monoclional inclui anticorpos monocionais humanos, anticorpos monoclonais animais não humanos (tais como anticorpos monoclonais de camundongos, ratos, coelhos e galinhas), anticorpos monoclonais quiméricos e similares. O anticorpo monoclonal pode ser preparado por meio do cultivo de hibridomas obtidas pela fusão entre células do baço de mamíferos não humanos (tais como camundongos, camundongos produtores de anticorpos humanos, galinhas ou coelhos) imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou seus fragmentos e células de mieloma. O anticorpo quimérico é um anticorpo preparado a partir de uma combinação de sequências derivadas de diferentes animais e, por exemplo, é um anticorpo composto de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos de camundongos e regiões constantes de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos. O anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido na técnica que envolve, por exemplo: ligação de DNAs que codificam regiões V de anticorpos de camundongos com DNAs que codificam regiões C de anticorpos humanos; incorporação dos produtos de ligação resultantes a vetores de expressão; e introdução dos vetores em hospedeiros de forma que sejam produzidos anticorpos.

[0071] Anticorpos — monoclonaisº= que possuem reatividade imunológica com o polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 e possuem efeito antitumoral são preparados por meio do método descrito nos Exemplos detalhados abaixo.

[0072] O anticorpo humanizado, também denominado anticorpo humano remodelado, é um anticorpo elaborado. O anticorpo humanizado é construído por meio de enxerto de CDRs de anticorpos derivadas de um animal imunizado em regiões determinantes da complementaridade de um anticorpo humano. Também é conhecida sua abordagem de recombinação genética geral.

[0073] Especificamente, por exemplo, sequências de DNA projetadas de forma a ligar CDRs de anticorpos de camundongos, coelhos ou galinhas e regiões de estrutura (FRs) de anticorpos humanos são sintetizadas por meio de PCR utilizando diversos oligonucleotídeos preparados que possuem partes terminais sobrepostas entre si. Os DNAs obtidos são ligados a DNAs que codificam regiões constantes de anticorpos humanos. Em seguida, os produtos de ligação resultantes são incorporados a vetores de expressão, que são introduzidos em seguida em hospedeiros de produção de anticorpos, para obter o anticorpo de interesse (vide o Pedido de Patente Europeu nº EP239400 e a Patente Internacional nº WO 96/02576). As FRs de anticorpos humanos conectadas por meio de CDRs são selecionadas de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade formam um local de ligação de antígenos favorável. Se necessário, aminoácidos nas regiões de estrutura de regiões variáveis de anticorpos podem ser substituídos de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um local de ligação de antígenos apropriado (Sato, K. et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856). Além disso, as FRs podem ser substituídas por regiões de estrutura derivadas de anticorpos humanos de classe ou subclasse diferente (vide a Patente Internacional nº WO 99/51743).

[0074] As regiões de estrutura humanas conectadas por meio de CDRs são selecionadas de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade formam um local de ligação de antígenos favorável. Se necessário, aminoácidos nas regiões de estrutura de regiões variáveis de anticorpos podem ser substituídos de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um local de ligação de antígenos apropriado (Sato, K. et al, Cancer Research 1993,

53: 851-856).

[0075] Aminoácidos em regiões variáveis (porexemplo, FRs) ou regiões constantes do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado preparadas desta forma podem ser substituídos, por exemplo, por outro aminoácidos.

[0076] A substituição de aminoácidos é a substituição, por exemplo, de menos de 15, menos de 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos aminoácidos, preferencialmente de 1 a 5 aminoácidos e, de maior preferência, 1 ou 2 aminoácidos. O anticorpo substituído deverá ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. A substituição é desejavelmente substituição de aminoácidos conservadora, que é a substituição entre aminoácidos com propriedades similares tais como carga, cadeias laterais, polaridade e aromaticidade. Os aminoácidos podem ser classificados em termos de propriedades similares, por exemplo, em: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoácidos polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina); aminoácidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

[0077] Exemplos de anticorpos modificados podem incluir anticorpos ligados com várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG). No anticorpo modificado de acordo com a presente invenção, a substância a ser ligada não é limitada. Esse anticorpo modificado pode ser obtido por meio de modificação química do anticorpo obtido. Um método com este propósito já foi estabelecido na técnica.

[0078] Neste contexto, a expressão “funcionalmente equivalente”

indica que um anticorpo correspondente possui atividade biológica ou bioquímica similar à do anticorpo de acordo com a presente invenção; especificamente, o anticorpo correspondente possui a função de danificar tumor e essencialmente não causa rejeição quando aplicado a seres humanos, por exemplo. Exemplos dessa atividade podem incluir atividade inibidora do crescimento celular e atividade de ligação.

[0079] É bem conhecido dos técnicos no assunto um método de preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um certo polipeptídeo, que envolve a introdução de mutações em polipeptídeos. Os técnicos no assunto podem introduzir, por exemplo, uma mutação apropriada no anticorpo de acordo com a presente invenção utilizando mutagênese dirigida a local (Hashimoto-Gotoh, T. et al (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, M. J. e Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al (1984), Nucleic Aciads Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, H. J. (1987), Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488-492; e Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766) ou similares, de forma a preparar um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo de acordo com a presente invenção.

[0080] O anticorpo mencionado acima que reconhece um epítopo de proteína CAPRIN-1 ou um polipeptídeo de fragmento de CAPRIN-1 que compreende o epítopo pode ser obtido por meio de um método conhecido dos técnicos no assunto. O anticorpo pode ser obtido, por exemplo, por meio de um método que envolve a determinação do epítopo da proteína CAPRIN-1 reconhecido pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 obtido que possui efeito inibidor do crescimento de células de câncer por meio de um método convencional (tal como mapeamento de epítopos ou um método de identificação de epítopos descrito posteriormente) e preparação de anticorpos utilizando um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como imunogene, ou um método que envolve a determinação de epítopos para anticorpos preparados por meio de um método convencional e seleção de anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo do anticorpo anti-CAPRIN-1. Neste contexto, o “epiítopo” designa um fragmento de polipeptídeo que possui antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferencialmente seres humanos. A sua menor unidade consiste de cerca de sete a doze aminoácidos, tal como de oito a onze aminoácidos.

[0081] O anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que possui reatividade imunológica com CAPRIN-1, um anticorpo que reconhece especificamente CAPRIN-1 ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1 e exibe atividade citotóxica contra câncer ou efeito inibidor do crescimento de tumores. O anticorpo é preferencialmente um anticorpo que possui uma estrutura que causa pouca ou nenhuma rejeição em animais receptores. Exemplos desses anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (tais como anticorpos quiméricos de seres humanos-camundongos), anticorpos de fita simples e anticorpos biespecíficos quando os animais receptores forem seres humanos. Estes anticorpos possuem regiões variáveis de cadeia leve e pesada derivadas de anticorpos humanos ou possuem regiões variáveis de cadeia leve e pesada com regiões de determinação da complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) derivadas de anticorpos animais não humanos e regiões de estrutura (FR1, FR2, FR3 e FR4) derivadas de anticorpos humanos. Alternativamente, esses anticorpos são anticorpos recombinantes que possuem regiões variáveis de cadeia leve e pesada derivadas de anticorpos animais não humanos e regiões constantes de cadeia leve e pesada derivadas de anticorpos humanos. O anticorpo de acordo com a presente invenção, preferencialmente, são os dois anticorpos anteriores.

[0082] Esses anticorpos recombinantes podem ser preparados conforme segue: DNAs que codificam anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais humanos, de camundongos, ratos, coelhos e galinhas) contra CAPRIN-1 humano são clonados a partir de células produtoras de anticorpos tais como hibridomas e utilizados como modelos em PCR RT ou similares para preparar DNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos. As sequências correspondentes das regiões variáveis de cadeia leve e pesada, as sequências correspondentes de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada região ou as sequências correspondentes de FR1, FR2, FR3 e FR4 em cada região podem ser determinadas com base no sistema de numeração EU de Kabat (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD (1991)).

[0083] Esse DNA que codifica cada região variável ou um DNA que codifica cada CDR é preparado utilizando um método de engenharia genética (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de DNA. Neste contexto, os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados por meio da imunização de animais produtores de anticorpos humanos (tais como camundongos) com CAPRIN-1 humana e, em seguida, fusão de células do baço extirpadas dos animais imunizados com células de mieloma. Além disso, DNAs que codificam regiões constantes e variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos são preparados, se necessário, utilizando um método de engenharia genética ou um sintetizador de DNA.

[0084] Para o anticorpo humanizado, DNAs nos quais as sequências de codificação de CDR em DNAs que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos são substituídos por sequências de codificação de CDR correspondentes de animais não humanos (anticorpos derivados de camundongos, ratos, coelhos ou galinhas, por exemplo, podem ser preparados e ligados aos DNAs que codificam regiões constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos para preparar um DNA que codifica o anticorpo humanizado).

[0085] Para o anticorpo quimérico, DNAs que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pesada de animais não humanos (tais como anticorpos derivados de camundongos, ratos, coelhos ou galinhas) podem ser ligados a DNAs que codificam regiões constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos para preparar um DNA que codifica o anticorpo quimérico.

[0086] O anticorpo de fita simples designa um anticorpo que compreende regiões variáveis de cadeia leve e pesada ligadas linearmente entre si por meio de um ligante. Un DNA que codifica o anticorpo de fita simples pode ser preparado por meio da ligação de um DNA que codifica a região variável de cadeia pesada, um DNA que codifica o ligante e um DNA que codifica a região variável de cadeia leve. Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são ambas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano no qual CDRs isoladas são substituídas por CDRs de animais não humanos (tal como um anticorpo derivado de camundongo, rato, coelho ou galinha). O ligante consiste de doze a dezenove aminoácidos. Seus exemplos incluem (G,S)3, que consiste de quinze aminoácidos (G. B. Kim et al, Protein Engineering Design and Selection, 2007, 20 (9): 425-432).

[0087] O anticorpo biespecífico (tal como diacorpo) designa um anticorpo capaz de ligar-se especificamente a dois epítopos diferentes. Um DNA que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado, por exemplo, por meio da ligação de um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada A, um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve B, um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada B e um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve A, nesta ordem (desde que o DNA que codifica uma região variável de cadeia leve B e o DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada B sejam ligados por meio de um DNA que codifica um ligante conforme descrito acima). Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são ambas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano no qual CDRs isoladas são substituídas por CDRs de animais não humanos (tais como anticorpos derivados de camundongo, rato, coelho ou galinha).

[0088] Os DNAs recombinantes preparados desta forma podem ser incorporados a um ou mais vetores apropriados, que são introduzidos em seguida em células hospedeiras (tais como células de mamíferos, células de leveduras e células de insetos) e os DNAs são (co)expressos para produzir anticorpos recombinantes (P. J. Delves, Antibody Production Essential Techniques, 1997, Wiley, P. Shepherd e C. Dean, Monoclonal Antibodies, 2000, Oxford University Press; e J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 1993, Academic Press).

[0089] Exemplos do anticorpo de acordo com a presente invenção preparados por meio de qualquer dos métodos descritos acima incluem o anticorpo (a) a seguir: a um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nº 8, 9 e 10 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nº 12, 13 e 14 (tal como um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 11 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 15); e regiões variáveis de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. As sequências de aminoácidos exibidas por SEQ ID Nº 12,

13 e 14 correspondem a regiões variáveis de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente.

[0090] Exemplos do anticorpo humanizado, do anticorpo quimérico, do anticorpo de fita simples ou do anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção incluem os anticorpos (i) a (iii): lh. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 8, 9 e 10, respectivamente, e regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 12, 13 e 14, respectivamente, e regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos; ii. um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 8,9 e 10, respectivamente, e regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos e uma região constante de cadeia pesada derivada de anticorpos e uma cadeia leve que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 12, 13 e 14, respectivamente, e regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos e uma região constante de cadeia leve derivada de anticorpos humanos; e ii. um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 11 e uma região constante de cadeia pesada derivada de anticorpos humanos e uma cadeia leve que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 15 e uma região constante de cadeia leve derivada de anticorpos humanos.

[0091] As sequências das regiões constantes e variáveis de cadeias leve e pesada de anticorpos humanos são disponíveis, por exemplo, por meio do NCBI (Estados Unidos; GenBank, UniGene etc.). As sequências a seguir podem, por exemplo, referir-se a: Acesso nº JO0228 para uma região constante de cadeia pesada IgG1 humana; Acesso nº JO0230 para uma região constante de cadeia pesada IgG2 humana; Acesso nº XO03604 para uma região constante de cadeia pesada IgG3 humana; Acesso nº K01316 para uma região constante de cadeia pesada IgG4 humana; Acessos nº VOO557, X64135, X64133 etc. para uma região constante « de cadeia leve humana; e Acessos nº X64132, X64134 etc. para uma região constante À de cadeia leve humana.

[0092] Preferencialmente, esses anticorpos possuem atividade citotóxica e, portanto, podem exercer efeito antitumoral.

[0093] As sequências específicas acima das regiões variáveis de cadeia leve e pesada e CDRs em cada anticorpo são fornecidas meramente por fins ilustrativos. É evidente que o anticorpo de acordo com a presente invenção não é limitado pelas sequências específicas. Podem ser preparados hibridomas capazes de produzir anticorpos humanos anti-CAPRIN-1 humana ou anticorpos de animais não humanos (tais como anticorpos de camundongo) diferentes dos descritos acima e anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas podem ser recuperados e determinados como sendo (ou não) os anticorpos de interesse utilizando atividade de ligação imunológica contra CAPRIN-1 humana e atividade citotóxica como indicadores. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais de interesse são identificados desta forma. Em seguida, os DNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos de interesse são produzidos a partir dos hibridomas e sequenciados conforme descrito acima. Os DNAs podem ser utilizados para preparação de diferentes anticorpos.

[0094] Cada um dos anticorpos acima pode ter a substituição, exclusão ou adição de um ou mais aminoácidos, particularmente em uma sequência de região de estrutura e/ou uma sequência de região constante, desde que o anticorpo possua tal especificidade que possa reconhecer especificamente CAPRIN-1. Neste contexto, o termo “diversos” indica preferencialmente de 2 a 5, de maior preferência 2 ou 3.

[0095] A constante de afinidade Ka (Kiga/Kaesiga) do anticorpo de acordo com a presente invenção para uma proteína CAPRIN-1 ou seu fragmento é preferencialmente de pelo menos 10” M', pelo menos 10º M”, pelo menos 5 x 10º M', pelo menos 10º M', pelo menos 5 x 10º M', pelo menos 10º M'', pelo menos 5 x 10"º M'!, pelo menos 10** M'", pelo menos 5 x 10" M, pelo menos 10"? M' ou pelo menos 10"? M*,

[0096] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A conjugação do anticorpo com o agente antitumoral pode ser realizada por meio de um espaçador que contém um grupo reativo com um grupo amino, grupo carboxila, grupo hidróxi, grupo tiol ou similares (tal como um grupo succinimidila, um grupo formila, um grupo 2-piridilditio, um grupo maleimidila, um grupo alcoxicarbonila ou um grupo hidróxi).

[0097] Exemplos do agente antitumoral incluem os agentes antitumores a seguir, conhecidos pela literatura etc.: paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracil, tiotepa, bussulfan, improssulfan, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina. calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, = sarcodictina, —espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, — melfalan, — novembichina, — fenesterina, — prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, — aclacinomicina, —actinomicina, autramicina,y azasserina, bleomicina, — cactinomicina, carabicina, — carminomicina, — carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-0x0-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, = quelamicina, — rodorubicina, —estreptonigrina, —estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamido glicosídeo, ácido aminolevulínico, eniluracil, ansacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglucid, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilan, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucil, gencitabina, 6- tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecan, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina, seus sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis.

[0098] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumoral para produzir um efeito terapêutico superior. Esta abordagem é adaptável a pacientes com câncer que expressa CAPRIN-1 antes ou depois da operação cirúrgica. Esta abordagem pode ser aplicada, particularmente após a cirurgia, a câncer que expressa CAPRIN-1, que tenha sido tratado convencionalmente com um agente antitumoral isolado, para produzir prevenção mais alta de recorrência do câncer ou prolongamento do tempo de sobrevivência.

[0099] Exemplos do agente antitumoral utilizado na administração combinada com o anticorpo de acordo com a presente invenção incluem os agentes antitumores a seguir conhecidos pela literatura etc.: paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, S5-fluorouracil, tiotepa, bussulfan, improssulfan, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, — trietilenomelamina, * trietilenofosforamida, — trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina. calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, = mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretaminay melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil, carmustina, —clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, ccomomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-0x0-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido — micofenólico, nogalamicina, olivomiícinay peplomíicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatinay zorubicinay denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-

azauridina, carmoíur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamido glicosídeo, ácido aminolevulínico, eniluracil, ansacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, aceto de eliptínio, epotilona, etoglucid, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilan, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucil, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecan, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina, seus sais (conhecidos na técnica) e derivados (conhecidos na técnica) farmaceuticamente aceitáveis. Destes agentes — antitumores, são utilizados de forma particularmente preferida ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel ou vinorelbina.

[00100] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser ligado a um radioisótopo conhecido pela literatura etc., tal como 2'At, 1$!1, 1, *y, 1Re, *Re, ***Sm, 2?Bi, *?P, Lu, Lu, *Sr, Cu ou "In (Hideo Saji, Yakugaku Zasshi 128 (3) 323-332, 8 (2008), Japão). É desejável um radioisótopo eficaz para o tratamento ou diagnóstico de tumor. Esse radioisótopo também é incluído no agente antitumoral de acordo com a presente invenção.

IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPO

[00101] Conforme exibido nos Exemplos abaixo, o anticorpo de acordo com a presente invenção liga-se a um epítopo na sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5. Um exemplo de método de confirmação de epítopos para o anticorpo de acordo com a presente invenção inclui um método que envolve a imobilização de epítopos no polipeptídeo de SEQ ID Nº sobre uma placa e avaliação do anticorpo para determinar a sua reatividade com este epítopo. Especificamente, um epítopo no polipeptídeo de SEQ ID Nº 5 é imobilizado sobre uma placa por meio de reação com um grupo funcional eletrofílico por meio de um espaçador tais como oligoetileno glicol. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode reagir com a placa e ter examinada sua reatividade com o epítopo por meio de reação com um anticorpo secundário marcado (tal como marcado com peroxidase de rabanete silvestre (HRP)) que se liga ao anticorpo de acordo com a presente invenção (ou seja, de forma a confirmar o epítopo ao qual se liga o anticorpo de acordo com a presente invenção). Como o epítopo no polipeptídeo de SEQ ID Nº 5 a ser imobilizado sobre uma placa, é utilizada uma sequência que, por si própria, compreende pelo menos o epítopo na sequência de SEQ ID Nº 5 ou sua porção modificada (tal como resíduos N-terminais ou C-terminais modificados com diversos aminoácidos quaisquer ou uma proteína tal como KLH ou um (poli)peptídeo modificado com uma proteína MAP). O anticorpo de acordo com a presente invenção necessita apenas ligar-se a qualquer um desses (poli)peptídeos.

[00102] Por outro lado, alguns anticorpos de acordo com a presente invenção podem não reagir com o polipeptídeo de SEQ ID Nº 5, ou seja, o epítopo pode não ser confirmado no método acima. Neste caso, o epítopo para o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser confirmado por meio de reação do anticorpo com o antígeno sob condições de solução que facilitam a ligação antígeno-anticorpo, obtendo o complexo de antígeno e anticorpo por meio de um método de imunoprecipitação, separando em seguida um polipeptídeo parcial ligado ao anticorpo e analisando a sua sequência de aminoácidos. Neste contexto, o antígeno pode ser, por exemplo,

o próprio polipeptídeo de SEQ ID Nº 5 ou uma de suas partes modificadas. Alternativamente, mesmo uma proteína CAPRIN-1 pode ser utilizada, desde que o epítopo reativo com o anticorpo de acordo com a presente invenção possa ser confirmado por meio do método acima.

EFEITOS ANTITUMORAIS

[00103] O efeito antitumoral do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção sobre células cancerígenas que expressam CAPRIN-1 parece ser causado pelo mecanismo a seguir: citotoxicidade celular dependente de anticorpo mediada por células efetoras (ADCC) contra as células que expressam CAPRIN-1I e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra as células que expressam CAPRIN-1. O mecanismo não se destina, entretanto, a limitar o escopo da presente invenção.

[00104] Sabe-se que o efeito antitumoral com base no mecanismo correlaciona-se à quantidade de moléculas alvo expressas sobre a superfície de células cancerígenas às quais se liga o anticorpo (Niwa, R., Clinical Cancer Research, 15 de março de 2005; 11 (6): 2327-2336). À quantidade de moléculas alvo expressa sobre a superfície de células cancerígenas pode ser examinada utilizando um kit de teste existente capaz de medir a quantidade de moléculas da superfície celular. Especificamente, a quantidade de moléculas alvo às quais se liga o anticorpo pode ser determinado por meio de: reação de anticorpos primários tais como anticorpos contra as moléculas alvo com células cancerígenas; sua reação com anticorpos com marca fluorescente contra os anticorpos primários em conjunto com esferas para uma curva de calibragem com a quantidade conhecida de moléculas; medição da intensidade média de fluorescênca das amostras e preparação de uma curva de calibragem.

[00105] Desta forma, o anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção pode ser examinado para determinar a sua atividade, conforme exibido especificamente nos Exemplos abaixo, por meio de teste da atividade de ADCC ou CDC contra células cancerígenas que expressam CAPRIN-1 ex vivo ou da determinação da quantidade de moléculas CAPRIN-1 expressas sobre a superfície de células cancerígenas ao utilizar o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção como anticorpo primário.

[00106] O anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção liga-se a uma proteína CAPRIN-1 sobre células cancerígenas e exibe efeito antitumoral ao longo da atividade. Desta forma, o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é considerado útil no tratamento ou prevenção de câncer. Especificamente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo anti- CAPRIN-1 como ingrediente ativo. O anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado para fins de administração a corpos humanos (terapia de anticorpos) é preferencialmente um anticorpo humano ou anticorpo humanizado para reduzir a imunogenicidade.

[00107] Um anticorpo anti-CAPRIN-1 com afinidade de ligação mais alta para uma proteína CAPRIN-1 sobre a superfície de células cancerígenas exerce atividade antitumoral mais forte. Desta forma, o anticorpo de acordo com a presente invenção possui alta afinidade de ligação para a proteína CAPRIN-1 e pode-se, portanto, esperar efeito antitumoral mais forte. Consequentemente, o anticorpo de acordo com a presente invenção é adaptável a uma composição farmacêutica destinada a tratamento e/ou prevenção de câncer. O anticorpo de acordo com a presente invenção possui alta afinidade de ligação com uma constante de associação (constante de afinidade) Ka (Kon/Kot) de preferencialmente pelo menos 10” M', pelo menos 10º M', pelo menos 5 x 10º M, pelo menos 10º M', pelo menos 5 x 10º M”, pelo menos 10ºº M', pelo menos 5 x 10ºº M, pelo menos 10" M, pelo menos 5 x 10"* M, pelo menos 10"? M ou pelo menos 10"? M'", conforme descrito acima.

[00108] Uma quantidade maior de moléculas CAPRIN-1 que pode ligar-se a anticorpos anti-CAPRIN-1 sobre a superfície de células cancerígenas produz atividade antitumoral mais forte. Desejavelmente, para fins de esperar o efeito antitumoral, a quantidade dessas moléculas CAPRIN-1 é de 10º ou mais, preferencialmente 10º ou mais, por célula cancerígena à qual o anticorpo se liga, conforme determinado utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção. Tumor (células cancerígenas) que possui uma grande quantidade de moléculas CAPRIN-1 sobre a superfície celular é particularmente preferida como câncer para receber o anticorpo de acordo com a presente invenção.

LIGAÇÃO A CÉLULAS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS

[00109] A capacidade do anticorpo de ligar-se a CAPRIN-1 pode ser determinada pelo uso de testes de ligação utilizando, por exemplo, teste ELISA, Western Blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo, conforme descrito nos Exemplos.

MANCHAS IMUNO-HISTOQUÍMICAS

[00110] O anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado para determinar a sua reatividade com CAPRIN-1 por meio de um método imuno-histoquímico bem conhecido dos técnicos no assunto utilizando uma seção congelada fixada em paraformaldeído ou acetona ou uma seção embutida em parafina fixa em paraformaldeído de um tecido obtido de paciente durante uma operação cirúrgica ou de um animal portador de um tecido de xenoenxerto inoculado com uma linhagem celular que expressa CAPRIN-1 espontaneamente ou após transfecção.

[00111] Para manchas imuno-histoquímicas, o anticorpo reativo com CAPRIN-1 pode ser manchado por meio de vários métodos. O anticorpo pode ser visualizado, por exemplo, por meio de reação com um anticorpo anticamundongos de cabra conjugado a peroxidase de rabanete silvestre, anticorpo anticoelhos de cabra ou anticorpo antigalinhas de cabra. CoMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE TRATAMENTO E/Ou PREVENÇÃO DE

CÂNCER

[00112] Um alvo da composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado, desde que o alvo seja câncer (células) que expressa um gene CAPRIN-1.

[00113] Os termos “tumor” e “câncer” utilizados no presente indicam neoplasma maligno e são utilizados de forma intercambiável entre si.

[00114] O câncer alvo na presente invenção é câncer que expressa um gene que codifica proteína CAPRIN-1 e é preferencialmente câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

[00115] Exemplos específicos desses cânceres incluem, mas sem limitações, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama do tipo complexo, tumor misto maligno das glândulas mamárias, adenocarcinoma papilar intradutos, adenocarcinoma do pulmão, câncer das células escamosas, câncer de células pequenas, câncer de células grandes, glioma que é tumor de tecido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodermal embrional, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma do tipo celular pequeno a médio, câncer cecal, câncer do cólon ascendente, câncer do cólon descendente, câncer do cólon transversal, câncer do cólon sigmoide, câncer retal, câncer do ovário epitelial, tumor de células de gérmen, tumor de células estromais, carcinoma dos dutos pancreáticos, carcinoma dos dutos pancreáticos invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma das células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasma mucinoso papilar intradutos, neoplasma cístico mucinoso, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma do soro, tumor papilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (síndrome de Werner), tumor de células ilhas não funcionais, somatoestatinoma e ViPoma.

[00116] Os pacientes receptores são preferencialmente mamíferos, tais como mamíferos incluindo primatas, animais de estimação, animais de criação e animais esportivos e são, de preferência específica, seres humanos, cães e gatos.

[00117] No caso de uso do anticorpo de acordo com a presente invenção em uma composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada por meio de um método conhecido dos técnicos no assunto. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, na forma de injeção parenteral de uma solução ou suspensão asséptica com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada, por exemplo, com o anticorpo misturado em uma forma de dosagem unitária necessária para a prática farmacêutica geralmente aceita, em combinação com veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, agente formador de suspensão, tensoativo, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, veículo, conservante, aglutinante etc., conforme apropriado. A quantidade do ingrediente ativo nessa preparação é determinada de tal forma que possa ser atingida uma dose apropriada dentro da faixa indicada.

[00118] Uma composição asséptica para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo tal como água destilada injetável.

[00119] Exemplos de soluções aquosas para injeção incluem solução salina fisiológica, soluções isotônicas que contêm glicose e outros adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante apropriado, tal como um álcool (especificamente, etanol) ou poliálcool (tal como propileno glicol e polietileno gicol) ou um tensoativo não iônico, tal como polissorbato 806 ou HCO-60.

[00120] Exemplos de soluções oleosas incluem óleo de gergelim e óleo de soja. As soluções podem ser utilizadas em combinação com benzoato de benzila ou álcool benzílico como solubilizante. As soluções podem ser adicionalmente misturadas com tampão (tal como uma solução de tampão de fosfato e uma solução de tampão de acetato de sódio), um agente de alívio (tal como cloridrato de procaína), um estabilizante (tal como álcool benzílico e fenol) ou um antioxidante. As soluções de injeção preparadas desta forma são normalmente carregadas em ampolas apropriadas.

[00121] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é administrada por via oral ou parenteral, preferencialmente parenteral. Exemplos específicos das suas formas de dosagem incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de administração transpulmonar e agentes de administração percutânea. Exemplos das injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea, por meio das quais a composição farmacêutica pode ser administrada de forma local ou sistêmica.

[00122] Além disso, o método de administração pode ser adequadamente selecionado dependendo da idade, peso, sexo, sintomas etc. do paciente. A dose de composição farmacêutica que contém o anticorpo ou um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso do corpo por dose. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,001 a 100000 mg/corpo do paciente, embora a dose não seja necessariamente limitada a esses valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, idade, sexo, sintomas etc. do paciente, os técnicos no assunto podem selecionar adequadamente a dose e o método.

[00123] A composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção pode ser administrada a pacientes para o tratamento e/ou prevenção de câncer, preferencialmente câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

[00124] A presente invenção engloba ainda um método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção em combinação com o agente antitumoral conforme exemplificado acima e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral a pacientes. O anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento pode ser administrado simultânea ou separadamente do agente antitumoral ao paciente. No caso de administração separada dessas composições farmacêuticas, qualquer um deles pode ser administrado em primeiro lugar ou posteriormente. Seus intervalos de dosagem, doses, vias de administração e a quantidade de doses podem ser adequadamente selecionados por um especialista. As outras formas de dosagem farmacêuticas a serem administradas simultaneamente também incluem, por exemplo, composições farmacêuticas, cada qual formulada por meio da mistura do anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento ou do agente antitumorall em um veículo (ou meio) farmacologicamente aceitável... Una instrução que descreve prescrição, formulação, vias de administração, doses, câncer etc. com relação às composições farmacêuticas e formas de dosagem que contêm o anticorpo de acordo com a presente invenção podem também ser fixadas a qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima e formas de dosagem que contêm o agente antitumoral.

[00125] A presente invenção também fornece, portanto, uma combinação farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral conforme exemplificado acima e um método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração da combinação farmacêutica. A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção e o agente antitumoral em conjunto com um veículo farmacologicamente aceitável.

PoLIPEPTÍDEO E DNA

[00126] A presente invenção fornece adicionalmente um DNA que codifica o anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento (fragmento de ligação de anticorpos). Esse DNA pode ser um DNA que codifica as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo ou pode ser um DNA que codifica as regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada do anticorpo. O DNA pode também ser um DNA que codifica cada uma ou uma combinação das regiões de determinação da complementaridade do anticorpo. O DNA inclui, por exemplo, um DNA de codificação de região variável de cadeia pesada que compreende sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 8, 9 e 10 e um DNA de codificação de região variável de cadeia leve que compreende sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº 12, 13 e 14, no caso do anticorpo (a).

[00127] As regiões de determinação da complementaridade (CDRs) codificadas pelo DNA que possui essas sequências servem de regiões que determinam a especificidade do anticorpo. Sequências que codificam as outras regiões (ou seja, regiões constantes e regiões de estrutura) do anticorpo podem, portanto, ser sequências derivadas de outros anticorpos. Neste contexto, “outros anticorpos” também incluem anticorpos derivados de organismos não humanos, mas são preferencialmente os derivados de seres humanos do ponto de vista de redução de reações adversas. Especificamente, no DNA descrito acima, regiões que codificam cada região de estrutura e cada região constante nas cadeias leve e pesada preferencialmente compreende sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos derivadas de anticorpos humanos correspondentes.

[00128] Exemplos adicionais do DNA que codifica o anticorpo de acordo com a presente invenção incluem um DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 11 e um DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 15, no caso do anticorpo (a). Neste contexto, a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 11 é, por exemplo, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID Nº 16. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 15 é, por exemplo, a sequência de nucleotídeos de

SEQ ID Nº 17.

[00129] Quando esse DNA compreende uma região que codifica cada região constante nas cadeias leve e pesada, a região compreende preferencialmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos correspondente (sequência de aminoácidos de cada região constante nas cadeias leve e pesada).

[00130] Esses DNAs de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, por meio dos métodos descritos acima ou do método a seguir. Em primeiro lugar, RNAs totais são preparados a partir de hibridomas produtores do anticorpo de acordo com a presente invenção utilizando um kit de extração de RNA disponível comercialmente e cDNAs são sintetizados a partir deles utilizando transcriptase reversa e primers aleatórios ou similares. Em seguida, os cDNAs codificadores de anticorpos são amplificados por meio de PCR utilizando primers de oligonucleotídeos para sequências conservadas de cada região variável em genes de cadeia leve e pesada de anticorpos de camundongos conhecidos. Sequências que codificam as regiões constantes podem ser obtidas por meio da amplificação por PCR de sequências conhecidas. A sequência de nucleotídeos do DNA pode ser incorporada a um plasmídeo ou fago para sequenciamento, por exemplo, e determinada de acordo com métodos convencionais.

[00131] A presente invenção fornece ainda os polipeptídeos e DNAs a seguir referentes ao anticorpo (a): lh. polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 11 e DNA que codifica o polipeptídeo (tal como DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID Nº 16); ii. polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 15 e DNA que codifica o polipeptídeo (tal como DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID Nº 17); ii. polipeptídeo de CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos exibidas por SEQ ID Nº 8, 96 10 e um DNA que codifica o polipeptídeo; e iv. polipeptídeo de CDR de cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos exibidas por SEQ ID Nº 12, 13 e 14 e um DNA que codifica o polipeptídeo.

[00132] Esses polipeptídeos e DNAs podem ser preparados utilizando métodos de engenharia genética conforme descrito acima.

RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

[00133] Os aspectos da presente invenção descritos acima são resumidos abaixo.

1 Anticorpo ou seu fragmento que possui reatividade imunológica com um polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos.

2. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que o anticorpo ou seu fragmento possui atividade citotóxica contra uma célula cancerígena que expressa uma proteína CAPRIN-1.

3. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou anticorpo policlonal.

4. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 3, em que o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de fita simples ou anticorpo multiespecífico.

5. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 4, em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nº 8, 9 e 10 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nº 12, 13 e 14 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente) e possui reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1.

6. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 4, em que o anticorpo ou seu fragmento é conjugado a um agente antitumoral.

7. Composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende um anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer um dentre 1 a 6 como ingrediente ativo.

8. Composição farmacêutica de acordo com 7, em que o câncer é câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

9. Combinação farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a composição farmacêutica conforme definido em qualquer um dentre 7 ou 8 e uma composição farmacêutica que compreende um agente antitumoral.

10. — DNA que codifica o anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer um dentre 1 a 5.

11. “Método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração do anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer um dentre 1 a 6, composição farmacêutica conforme definido em qualquer um dentre 7 ou 8 ou combinação farmacêutica conforme definido em

9 a pacientes.

EXEMPLOS

[00134] A presente invenção será descrita mais especificamente a seguir com referência aos Exemplos. O escopo da presente invenção, entretanto, não se destina a ser limitado por estes exemplos específicos. EXEMPLO 1 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM CADA TECIDO

[00135] A expressão do gene CAPRIN-1 em tecidos normais humanos e caninos e várias linhagens celulares examinadas por meio de PCR RT de acordo com o Exemplo 1 (4) de WO 2010/016526. Como resultado, a sua forte expressão foi exibida nos testículos dentre os tecidos caninos saudáveis, enquanto a expressão foi exibida em câncer de mama canino e tecidos de adenocarcinoma. Como resultado do exame também da expressão em tecidos humanos, a expressão foi observada apenas nos testículos entre tecidos normais, como ocorre com o gene CAPRIN-1 canino. Por outro lado, com relação a células cancerígenas, a expressão foi detectada em muitos tipos de linhagens de células cancerígenas, incluindo oito linhagens de células de câncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT- 20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1) e quatro linhagens de células de câncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPc-3). Estes resultados demonstraram que CAPRIN-1 é expressa nas linhagens de células de câncer de mama e nas linhagens de células de câncer pancreático, enquanto a sua expressão não é detectada em tecidos normais diferentes dos testículos. EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL DE CAMUNDONGO CONTRA CAPRIN-1

PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE CAMUNDONGOS

[00136] 100 ug de uma proteína CAPRIN-1 humana que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 conforme preparado no

Exemplo 3 de WO 2010/016526 foram misturados com quantidade igual de adjuvante MPL+TDM (fabricado pela Sigma-Aldrich Corp.). Esta mistura foi utilizada como solução de antígeno por camundongo. A solução de antígeno foi administrada por via intraperitoneal a cada camundongo Balb/c com seis semanas de idade (fabricada pela Japan SLC, Inc.). Em seguida, sete reforços foram realizados semanalmente para completar a imunização. Três dias após a administração final, o baço de cada camundongo foi extirpado e moído entre duas lâminas de vidro esterilizadas. Lavagem com PBS(-) (fabricado pela Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), centrifugação a 1500 rpm por dez minutos e remoção do sobrenadante foram repetidas três vezes para obter células do baço. As células do baço obtidas foram misturadas com células de mieloma de camundongos SP2/0 (adquiridas da ATCC) em razão de 10:1. 200 ul de meio RPM/1640 que contém 10% de FBS foram aquecidos a 37 ºC e misturados com 800 ul de PEG1500 (fabricado pela Boehringer Ingelheim GmbH) e a solução de PEG preparada desta forma foi adicionada à mistura celular, que foi mantida em repouso em seguida por cinco minutos para fusão celular. Após centrifugação a 1700 rpm por cinco minutos e remoção do sobrenadante, as células foram suspensas em 150 ml de um meio RPMI1640 contendo 15% de FBS suplementado com o equivalente a 2% de uma solução de HAT (meio de seleção HAT da Gibco). Esta suspensão foi inoculada em quinze placas com 96 cavidades (Nunc) a 100 ul/cavidade. As células do baço e as células de mieloma foram fundidas por cultivo por sete dias a 37 ºC e 5% de CO, para obter hibridomas.

[00137] Os hibridomas resultantes foram selecionados pela afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra as proteínas CAPRIN-1 como indicador. Uma solução de 1 pg/ml da proteína CAPRIN-1 preparada por meio da abordagem descrita no Exemplo 3 de WO 2010/016526 foi adicionada a uma placa com 96 cavidades a 100 ul/cavidade e mantida em repouso a 4 ºC por dezoito horas. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) (fabricada pela Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionada a 400 ul/cavidade e mantida em repouso à temperatura ambiente por três horas. À solução em cada cavidade foi descartada e cada cavidade foi lavada por três vezes com 400 ul de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtido acima foi adicionado ao presente a 100 ul/cavidade e mantido em repouso à temperatura ambiente por duas horas. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos anti-lgG de camundongo marcados com HRP (H+L) (fabricados pela Invitrogen Corp.) PBS foram adicionados a 100 ul/(cavidade de uma diluilção a 5000 vezes com PBS e mantidos em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricada pela Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada a 100 ul/cavidade e mantida em repouso por quinze a trinta minutos para desenvolver reação de cores. Após o desenvolvimento da coloração, a reação foi encerrada pela adição de 1 N ácido sulfúrico a 100 ul/cavidade. A absorção foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, foram selecionados vários hibridomas produtores de anticorpos que possuem alta absorção.

[00138] Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa com 96 cavidades a 0,5 células/cavidade e cultivados na placa. Uma semana mais tarde, foram observados hibridomas que formam colônias isoladas nas cavidades. As células nessas cavidades foram adicionalmente cultivadas e os hibridomas clonados foram selecionados pela afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra a proteína CAPRIN-1 como indicador. Uma solução de 1 ug/ml da proteína CAPRIN-1 preparada por meio da abordagem descrita no Exemplo 3 de WO 2010/016526 foi adicionada a uma placa com 96 cavidades a 100 ul/cavidade e mantida em repouso a 4 ºC por dezoito horas. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de 0,5% de BSA foi adicionada a 400 ul/cavidade e mantida em repouso à temperatura ambiente por três horas. A solução em cada cavidade foi descartada e cada cavidade foi lavada por três vezes com 400 ul de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtido acima foi adicionado ao presente a 100 ulícavidade e mantido em repouso à temperatura ambiente por duas horas. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos anti-lgG de camundongo marcados com HRP (H+L) (fabricados pela Invitrogen Corp.) foram adicionados a 100 ul/cavidade de uma diluição a 5000 vezes com PBS e mantidos em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Cada cavidade foi lavada por três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricada pela Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada a 100 ul/cavidade e mantida em repouso por quinze a trinta minutos para causar reação de cores. Após o desenvolvimento da coloração, a reação foi encerrada pela adição de 1N ácido sulfárico a 100 ul/cavidade. A absorção foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, foram obtidas 61 linhagens de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais reativos com a proteína CAPRIN-1.

[00139] Em seguida, estes anticorpos monoclonais foram selecionados em busca de anticorpos reativos com a superfície de células de câncer de mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 10º células de uma linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-231V foram centrifugadas em um tubo microcentritugador de 1,5 ml. 100 ul do sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtido acima foram adicionados e mantidos em repouso por uma hora sobre gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-lgG de camundongo de cabra marcados com FITC (fabricados pela Invitrogen Corp.) diluídos quinhentas vezes com PBS contendo 0,1% de FBS foram adicionados e mantidos em repouso por uma hora sobre gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCAalibur (Becton, Dickinson & Company). Por outro lado, a mesma operação acima foi realizada utilizando o soro de cada camundongo Balb/c com seis semanas de idade não tratado diluído quinhentas vezes com um meio de cultivo de hibridoma, em vez de anticorpos, para preparar um controle. Como resultado, foi selecionado um anticorpo monoclonail (anticorpo anti- CAPRIN-1 nº 1) que possui intensidade de fluorescência mais forte que a do controle, ou seja, reativo com a superfície das células de câncer de mama.

2. Identificação de epítopo CAPRIN-1 reconhecido por anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 nº 1.

[00140] Os anticorpos monoclonais reativos à superfície de células cancerígenas contra CAPRIN-1 (anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1) obtidos no capítulo 1 foram utilizados para identificar uma região de epítopo de CAPRIN-1 reconhecida desta forma. 93 possíveis peptídeos, cada qual consistindo de doze a dezesseis aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína CAPRIN-1 humana, foram sintetizados e cada um foi dissolvido em concentração de 1 mg/ml em DMSO.

[00141] Cada peptídeo foi dissolvido em concentração de 30 pg/ml em uma solução de 0,1 M de tampão carbonato de sódio (pH 9,6). À solução foi adicionada a 100 ul/cavidade a uma placa com 96 cavidades (Nunc, produto nº 436006) e mantida em repouso por uma noite a 4 ºC. A solução em cada cavidade foi descartada e 10 mM de etanolamina/0,1 M de solução tampão de carbonato de sódio (pH 9,6) foram adicionados a 200 ul/cavidade e mantidos em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, a solução em cada cavidade foi descartada e cada cavidade foi lavada por duas vezes com PBS contendo 0,5% de Tween 20 (PBST) para preparar uma placa imobilizada por peptídeo.

[00142] O sobrenadante do cultivo celular que contém o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 foi adicionado a 50 ul/cavidade à placa obtida desta forma. Após agitação à temperatura ambiente por uma hora, a solução em cada cavidade foi descartada e cada cavidade foi lavada por três vezes com PBST. Em seguida, adicionou-se uma solução de anticorpo secundário contendo anticorpos anti-lgG de camundongo marcados com HRP (fabricados pela Invitrogen Corp.) diluídos a 3000 até 4000 vezes com PBST a 50 ul/cavidade. A solução em cada cavidade foi descartada em seguida e cada cavidade foi lavada por seis vezes com PBST.

[00143] Uma solução de substrato TMB (fabricada pela Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada a 100 ul/cavidade e mantida em repouso por quinze a trinta minutos para desenvolver reação de cores. Após o desenvolvimento da coloração, a reação foi encerrada pela adição de 1N ácido sulfárico a 100 ul/cavidade. A absorção foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrômetro de absorção.

[00144] Como resultado, o polipeptídeo de SEQ ID Nº 5 foi identificado como sequência parcial de CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 obtido no Exemplo 2 (1).

3. Clonagem de genes de região variável de anticorpo anti- CAPRIN-1 nº 1:

[00145] Os anticorpos monoclonais obtidos no Exemplo 2 (1) foram analisados para determinar as suas sequências genéticas codificadoras de regiões variáveis e suas sequências de aminoácidos de acordo com o método descrito no Exemplo 5 de WO 2010/016526. Como resultado, o anticorpo monoclonal nº 1 compreendeu uma região variável de cadeia pesada que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 11 e uma região variável de cadeia leve que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 15. Uma sequência genética que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal nº 1 obtido é exibida em SEQ ID Nº 16 e uma sequência genética que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal nº 1 é exibida em SEQ ID Nº

17.

[00146] Também se demonstrou que: o anticorpo monoclonal nº 1 obtido no Exemplo 2 (1) compreende a região variável de cadeia pesada que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 11 e a região variável de cadeia leve que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 15, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada consistem das sequências de aminoácidos exibidas por SEQ ID Nº 8, 9 e 10, respectivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia leve consistem das sequências de aminoácidos exibidas por SEQ ID Nº 12, 13 e 14, respectivamente.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL CONTRA POLIPEPTÍDEO CAPRIN-1

PARCIAL PRESENTE SOBRE A SUPERFÍCIE DE CÉLULAS CANCERÍGENAS

[00147] A fim de obter anticorpos policlonais contra polipeptídeos CAPRIN-1 parciais presentes sobre a superfície de células cancerígenas, foram sintetizados o polipeptídeo (peptídeo derivado de CAPRIN-1 exibido em SEQ ID Nº 5) que compreende a região de epítopo para o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 obtido no Exemplo 2, um polipeptídeo que corresponde a uma região de resíduo de aminoácido nº 50 a 98 na sequência de aminoácidos de CAPRIN-1 humana de SEQ ID Nº 2 e um polipeptídeo que corresponde a uma região de resíduo de aminoácidos número 233 a 305 de SEQ ID Nº 2. Cada um desses peptídeos (1 mg) foi misturado como antígeno com volume igual de solução de adjuvante de Freund incompleto (IFA). Essa mistura foi administrada por via subcutânea a cada coelho quatro vezes a cada duas semanas. Em seguida, coletou-se sangue para obter antissoro contendo cada anticorpo policlonal. Este antissoro foi adicionalmente purificado utilizando um veículo de proteína G (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) e a substituição do meio por PBS foi conduzida para obter anticorpos policlonais contra polipeptídeos CAPRIN-1 parciais presentes sobre a superfície de células cancerígenas. Além disso, o soro de coelho que não recebeu antígeno foi purificado utilizando um veículo de proteína G da mesma forma acima e utilizado como anticorpo controle. EXEMPLO 4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA CAPRIN-1 SOBRE A SUPERFÍCIE DA

MEMBRANA DE CÉLULAS CANCERÍGENAS

[00148] Em seguida, oito linhagens de células de câncer de mama (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1) que se observou possuírem alto nível de expressão de gene CAPRIN-1 foram examinadas para determinar a sua expressão de proteínas CAPRIN-1 sobre a superfície celular. 5 x 10º células de cada uma das linhagens de células de câncer de mama humano que se observou possuírem expressão genética no Exemplo acima foi centrifugada em um tubo microcentrifugador de 1,5 ml. 2 ug (5 ul) de cada um dos anticorpos policlonais contra o peptídeo derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID Nº 5) preparado conforme descrito acima no Exemplo 3 e 95 ul de PBS contendo 0,1% de soro de feto bovino foram adicionados, misturados e mantidos em repouso por uma hora sobre gelo. Após lavagem com PBS, 1 ul de anticorpos anti-lgG de coelho de cabra marcados com Alexa 488 (fabricada pela Invitrogen Corp.) e 98 ul de PBS contendo 0,1% de soro de feto bovino (FBS) foram adicionados, misturados com as células e mantidos em repouso por trinta horas sobre gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCAalibur (Becton, Dickinson & Company). Por outro lado, como controle, o mesmo processo acima foi realizado utilizando o anticorpo controle preparado conforme descrito acima no Exemplo 3 no lugar dos anticorpos policlonais contra peptídeos derivados de CAPRIN-1. Como resultado, todas as linhagens das células de câncer administradas com os anticorpos anti-CAPRIN-1 exibiram intensidade de fluorescência pelo menos 35% mais forte que a do controle. Isso demonstrou que proteínas CAPRIN-1 são expressas sobre a superfície de membrana celular das linhagens de células de câncer humano. À velocidade de aumento da intensidade da fluorescência acima foi expressa como a velocidade de aumento da intensidade média de fluorescência (MFI) em cada linhagem celular e calculada de acordo com a fórmula a seguir:

[00149] velocidade de aumento da intensidade média de fluorescência (velocidade de aumento da intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI controle)) / (MFI controle) x 100.

[00150] Além disso, a intensidade de fluorescência foi medida em duas linhagens de células de câncer renal (Caki-1 e Caki-2), uma linhagem de células de câncer de bexiga urinária (T24), uma linhagem de células de câncer do ovário (SKOV3), duas linhagens de células de câncer do pulmão (QG56 e A549), uma linhagem de células de câncer de próstata (PC3), uma linhagem de células de câncer de cérvix uterino (SW756), uma linhagem de células de fibrossarcoma (HT1080), duas linhagens de células de tumor do cérebro (T98G e U87MG), uma linhagem de células de câncer gástrico (MNK28), três linhagens de células de câncer colorretal (Lovo, DLD-1 e HCT- 116) e quatro linhagens de células de câncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa- 2, Panc-1 e BxPC-3) utilizando a mesma abordagem acima. Como resultado, todas as células de câncer exibiram intensidade de fluorescência pelo menos 35% mais forte que a do controle.

[00151] Como ocorre com os resultados obtidos acima, a expressão de proteína CAPRIN-1 sobre a superfície de membrana de células cancerígenas também foi confirmada utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 obtido no Exemplo 2. EXEMPLO 5 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL QUIMÉRICO DE CAMUNDONGO-HUMANO

[00152] O fragmento de amplificação genética que compreende a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 obtido no Exemplo 2 foi tratado nas duas extremidades com enzimas de restrição, purificado em seguida e inserido de acordo com um método rotineiro em um vetor pc/DNA4/myc-His (fabricado pela Invitrogen Corp.) que já contém insertos de uma sequência líder derivada de anticorpos de camundongo e uma região constante de cadeia H de IgG; humano que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 6. Além disso, o fragmento de amplificação genética que compreende a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 foi tratado nas duas extremidades com enzimas de restrição, purificado em seguida e inserido de acordo com um método rotineiro em um vetor PcDNA3.1/myc-His (fabricado pela Invitrogen Corp.) que já contém insertos de uma sequência líder derivada de anticorpos de camundongo e uma região constante de cadeia L de IgG; humano que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 7.

[00153] Em seguida, o vetor recombinante que contém o inserto da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 e o vetor recombinante que contém o inserto da região variável de cadeia leve foram introduzidos em células CHO-K1 (obtidas por meio do Banco de Células Riken). Especificamente, 2 x 10º células de CHO-K1 foram cultivadas em 1 ml de meio F12 de Ham (fabricado pela Invitrogen Corp.) contendo 10% de FBS por cavidade de uma placa de cultivo de doze cavidades e lavadas com PBS(-).

Em seguida, adicionou-se 1 ml de um meio F12 de Ham novo contendo 10% de FBS por cavidade. 250 ng de cada um dos vetores dissolvidos em 30 ul de OPptiMEM (fabricado pela Invitrogen Corp.) foram misturados com 30 ul de reagente de transfecção Polyfect (fabricado pela Qiagen N. V.) e essa mistura foi adicionada a cada cavidade. As células CHO-K1 cotransfectadas com os vetores recombinantes foram cultivadas em meio F12 de Ham contendo 10% de FBS suplementado com 200 ug/ml de Zeocina (fabricada pela Invitrogen Corp.) e 200 pg/ml de Geneticina (fabricada pela Roche Diagnostics K. K.) e inoculadas em seguida em uma placa com 96 cavidades a 0,5 células/cavidade para preparar linhagens celulares que produzem de forma estável o anticorpo monoclonal quimérico de camundongo-humano nº 1 que contém as regiões variáveis do anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1, obtidas no Exemplo 2.

[00154] Cada linhagem celular preparada foi cultivada por cinco dias em um frasco de 150 cm? a 5 x 10º células/ml utilizando 30 ml! de meio OptiCHO livre de soro (fabricado pela Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultivo que contêm o anticorpo monoclonal quimérico de camundongo-humano nº 1.

[00155] Além disso, foram preparadas linhagens celulares que produzem de forma estável anticorpos quiméricos de camundongos- humanos | a 26 como amostras comparativas da mesma forma acima, utilizando, respectivamente, os anticorpos comparativos a seguir: anticorpos monoclonais derivados de camundongos anti-CAPRIN-1 descritos em WO 2010/016526, ou seja, anticorpo comparativo 1 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 26 (descrita em WO 2010/016526, o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 27, um anticorpo comparativo 2 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 28 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 29, um anticorpo comparativo 3 que contém a região variável de cadeia pesada de

SEQ ID Nº 30 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 31, um anticorpo comparativo 4 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 32 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 33, um anticorpo comparativo 5 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 34 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 35, um anticorpo comparativo 6 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 36 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 37, um anticorpo comparativo 7 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 38 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 39, um anticorpo comparativo 8 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 40 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 41, um anticorpo comparativo 9 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 42 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 43, um anticorpo comparativo 10 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 44 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 45 e um anticorpo comparativo 11 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 46 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 47; anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO 2011/096517, ou seja, anticorpo comparativo 12 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 (descrita em WO 2011/096517; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 47 e um anticorpo comparativo 13 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº ; anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO 2011/096528, ou seja, anticorpo comparativo 14 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 (descrita em WO 2011/096528; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 47, um anticorpo comparativo 15 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 51 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 55, um anticorpo comparativo 16 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 59 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 63, um anticorpo comparativo 17 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 76 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 80, um anticorpo comparativo 18 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 84 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 88, um anticorpo comparativo 19 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 92 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 96; um anticorpo monoclonal anti- CAPRIN-1 descrito em WO 2011/096519, ou seja, anticorpo comparativo 20 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 42 (descrita em WO 2011/096519; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 46; anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO 2011/096533, ou seja, anticorpo comparativo 21 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 (descrita em WO 2011/096533; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 51, um anticorpo comparativo 22 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 47 e a região variável de cadeia leve de SEQID Nº51 e um anticorpo comparativo 23 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 63 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 67; e anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO 2011/096534, anticorpo comparativo 24 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 (ali descrita; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 47, um anticorpo comparativo 25 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 43 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 51 e um anticorpo comparativo 26 que contém a região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 63 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 67. Cada linhagem celular preparada foi cultivada por cinco dias em um frasco de 150 cm? a 5 x 10º células/ml utilizando 30 ml! de meio OptiCHO livre de soro (fabricado pela Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultivo contendo cada um dos anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de camundongos-humanos 1 a 26. EXEMPLO 6 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 SOBRE A SUPERFÍCIE DE VÁRIAS CÉLULAS CANCERÍGENAS UTILIZANDO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CAPRIN-1

[00156] Em seguida, as oito linhagens de células de câncer de mama (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- 231V e MRK-nu-1), as duas linhagens de células de câncer renal (Caki-1 e Caki-2), a linhagem de células de câncer de bexiga urinária (T24), a linhagem de células de câncer do ovário (SKOV3), as duas linhagens de câncer do pulmão (QG56 e A549), a linhagem de células de câncer de próstata (PC3), a linhagem de células de câncer de cérvix uterino (SW756), a linhagem de células de fibrossarcoma (HT1080), as duas linhagens de células de tumor do cérebro (T98G e U87MG), a linhagem de células de câncer gástrico (MNK28), as três linhagens de células de câncer colorretal (Lovo, DLD-1 e HOT-116) e as quatro linhagens de células de câncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPC-3) que se observou apresentarem expressão de gene CAPRIN- 1 foram examinadas para determinar a sua expressão de proteínas CAPRIN-1 sobre a superfície celular utilizando os sobrenadantes de cultivo que contêm o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 obtido no Exemplo 2. 10º células de cada linhagem celular foram centrifugadas em cada tubo microcentrifugador de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultivo (100 ul) que contém o anticorpo foi adicionado ao tubo e mantido em repouso por uma hora sobre gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-lgG de camundongo de cabra marcados com FITC (H+L) (fabricados pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluídos com PBS contendo 0,1% de FBS foram adicionados e mantidos em repouso a 4 ºC por trinta minutos. Após lavagem com PBS, a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCAalibur (Becton, Dickinson & Company). A amostra de controle negativo utilizada foram células preparadas por meio de reação da linhagem celular apenas com anticorpos secundários. Como resultado, o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 exibiu reatividade com intensidade de fluorescência pelo menos 30% mais forte que a do controle negativo. Isso demonstrou que proteínas CAPRIN-1 são expressas sobre a superfície de membrana celular das linhagens de células de câncer humano acima. A velocidade de aumento da intensidade da fluorescência foi expressa como a velocidade de aumento da intensidade média de fluorescência (MFI) em cada linhagem celular e calculada de acordo com a fórmula a seguir:

[00157] velocidade de aumento da intensidade média de fluorescência (velocidade de aumento da intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI controle)) / (MFI controle) x 100.

EXEMPLO 7

ATIVIDADE ANTITUMORAL CONTRA CÉLULAS DE CÂNCER DE ANTICORPO CONTRA PEPTÍDEO DERIVADO DE CAPRIN-1 (SEQID Nº 5)

[00158] A fim de avaliar cada anticorpo contra o peptídeo derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID Nº 5) para determinar a resistência da sua citotoxicidade contra células cancerígenas que expressam CAPRIN-1, foi determinada a atividade de ADCC. Os anticorpos policlonais contra o peptídeo (SEQ ID Nº 5) preparados no Exemplo 3 foram utilizados nesta avaliação. Conduziu-se avaliação similar utilizando anticorpos policlonais contra outros peptídeos derivados de CAPRIN-1 humanos (anticorpos policlonais contra resíduos de aminoácidos 50 a 98 na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 de CAPRIN-1 humana e anticorpos policlonais contra os resíduos de aminoácidos 233 a 305, que foram preparados no Exemplo 3) como anticorpos comparativos e os anticorpos de controle derivados de soro de coelho preparados no Exemplo 3 como controle negativo.

[00159] A linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-231V, a linhagem de células de câncer colorretal DLD-1, a linhagem de células pancreáticas humanas Capan-2 e a linhagem de células de câncer do pulmão humano QG56 que se observou possuírem expressão de CAPRIN-1 foram coletadas a 10º células cada em um tubo centrifugador de 50 ml e foram adicionados a ele 100 uCi de cromo 51, seguidos por incubação a 37 ºC por duas horas. Em seguida, as células foram lavadas por três vezes com meio RPMI1640 que contém 10% de soro de feto de bezerro e adicionadas a 2 x 10º células/cavidade a uma placa com fundo em V e 96 cavidades. Cada um dos anticorpos policlonais contra o peptídeo derivado de CAPRIN-1 humano (SEQ ID Nº 5) e dois tipos de anticorpos policlonais contra outros peptídeos derivados de CAPRIN-1 humanos (anticorpos policlonais contra resíduos de aminoácidos 50 a 98 em SEQ ID Nº 2 de CAPRIN-1 humano e anticorpos policlonais contra resíduos de aminoácidos 233 a 305) conforme descrito acima foi adicionado a 1 ug/cavidade. Linfócitos separados de sangue periférico humano de acordo com um método convencional foram adicionalmente agregados a 4 x 10º células/cavidade e cultivados por quatro horas a 37 ºC e 5% de CO». Após o cultivo, a quantidade de cromo (Cr) 51 liberada de células de câncer danificadas foi medida no sobrenadante de cultivo para calcular a atividade de ADCC contra as células cancerígenas dos anticorpos policlonais contra cada peptídeo derivado de CAPRIN-1 humana. Como resultado, os dois anticorpos policlonais obtidos por meio de imunização com os peptídeos CAPRIN-1 humanos parciais que possuem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 50 a 98 ou resíduos de aminoácidos 233 a 305 de SEQ ID Nº 2 de CAPRIN-1 humana apresentaram atividade de menos de 8% contra a linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-231V, a linhagem de células de câncer colorretal humano DLD-1, a linhagem de células pancreáticas humanas Capan-2 e a linhagem de células de câncer do pulmão humano QGB56. Por outro lado, observou-se que os grupos administrados com os anticorpos policlonais contra o peptídeo derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID Nº 5) possuem atividade citotóxica de 27% ou mais para todas as linhagens de células cancerígenas. Os anticorpos de controle negativo apresentaram atividade de menos de 5% para todas as células cancerígenas. Estes resultados demonstraram que o anticorpo contra CAPRIN-1 exibido em SEQ ID Nº 5 exerce forte atividade citotóxica contra células cancerígenas que expressam CAPRIN-1.

[00160] Estes resultados sobre atividade citotóxica foram obtidos, conforme descrito acima, por meio de mistura do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfócitos e 2 x 10º células de cada linhagem de células cancerígenas que incorporou cromo 51; cultivo das células por quatro horas; após o cultivo, medição da quantidade de cromo 51 liberada no meio; e cálculo da atividade citotóxica contra a linhagem de células cancerígenas de acordo com a fórmula a seguir*: * Fórmula: atividade citotóxica (%) = quantidade de cromo 51 liberada das células alvo tratadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e linfócitos / quantidade de cromo 51 liberada de células alvo tratadas com IN ácido clorídrico x 100.

[00161] O anticorpo monoclonal quimérico de seres humanos-camundongos nº 1 e nº 2 obtidos no Exemplo 5 foram avaliados para determinar sua atividade citotóxica contra células de câncer humano. O sobrenadante de cultivo de cada linhagem celular produtora dos anticorpos foi purificada utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Após substituição do meio com PBS(-), a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 um (fabricado pela Millipore

Corp.). O anticorpo resultante foi utilizado para teste de atividade.

A linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-231V, a linhagem de células de câncer colorretal humano DLD-1, a linhagem de células pancreáticas humanas Capan-2 e a linhagem de células de câncer do pulmão humano QG56 foram coletadas a 10º células cada em um tubo centrifugador de 50 ml e foram adicionados a ele 100 uCi de cromo 51, seguidos por incubação a 37 ºC por duas horas.

Em seguida, as células foram lavadas por três vezes com meio RPMI1640 que contém 10% de FBS e adicionadas a 2 x 10º células/cavidade à placa com fundo em V e 96 cavidades para preparar células alvo.

Os anticorpos purificados (anticorpo anti- CAPRIN-1 quimérico de camundongos e humanos nº 1 e os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de camundongos e humanos 1 a 26 obtidos no Exemplo 5) foram adicionadosa 0,75 ug/cavidade.

Uma população celular que contém células NK humanas foi separada utilizando um método convencional de linfócitos do sangue periférico humano preparados de acordo com um método convencional.

Especificamente, a população celular que contém células NK humanas utilizada foi preparada conforme segue: células mononucleares do sangue periférico humano separadas utilizando uma solução de separação por gravidade específica Histopaque para separação de células mononucleares do sangue periférico (Sigma-Aldrich Corp.) reagiram com anticorpos marcados com tintura fluorescentes FITC (anticorpo anti-CD3 humano, anticorpo anti-CD20 humano, anticorpo anti-CD19 humano, anticorpo anti-CD11c humano ou anticorpo anti- HLA-DR (Becton, Dickinson & Company)) e uma população celular que contém células NK não manchadas com os anticorpos foi separada utilizando um selecionador celular (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson & Company)). Alternativamente, uma população celular que contém células NK humanas foi separada com kit de separação de células NK humanas (fabricado pela Miltenyi Biotec K.

K.). A população de células separadas que contém células NK foi adicionada à placa a de 2 x 10º células/cavidade e cultivada por quatro horas a 37 ºC, 5% de CO,. Após o cultivo, a quantidade de cromo 51 liberada de células de tumor danificadas foi medida no sobrenadante de cultivo para calcular a atividade citotóxica dos anticorpos anti-CAPRIN-1 contra as células cancerígenas.

A amostra de controle negativo utilizada foi preparada com anticorpos controle de isotipos.

Como resultado, os anticorpos de controle de isotipos utilizados apresentaram atividade citotóxica de menos de 5% para todas as linhagens de células de câncer e os anticorpos monoclionais comparativos quiméricos de seres humanos-camundongos 1 a 26 utilizados apresentaram atividade citotóxica de menos de 5% contra MDA-MB-231V, menos de 8% contra DLD-1, menos de 6% contra Capan-2 e menos de 6% contra QG56. Por outro lado, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de camundongo e humano nº 1 apresentou atividade citotóxica de 14% ou mais contra MDA-MB-231V, 21% ou mais contra DLD-1, 27% ou mais contra Capan- 2 e 20% ou mais contra QG56. De forma similar, os anticorpos controle de isotipos e os anticorpos comparativos | a 26 empregados apresentaram atividade citotóxica de menos de 4% contra todas as outras células cancerígenas, ou seja, linhagens de células de câncer de mama T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MCF7 e MRK-nu-1, uma linhagem de células de glioma T98G, uma linhagem de células de câncer do pulmão A549, uma linhagem de células de câncer renal Caki-1, uma linhagem de células de câncer de cérvix uterino SW756, uma linhagem de células de câncer de bexiga urinária T24, uma linhagem de células de câncer gástrico MKN28, uma linhagem de câncer colorretal SWA480, uma linhagem de células de leucemia AMLS e uma linhagem de células de linfoma Ramos.

Por outro lado, observou-se que os anticorpos monoclonais quiméricos de camundongos e humanos possuem atividade citotóxica contra essas linhagens celulares de 10% ou mais.

Estes resultados demonstraram que os anticorpos contra o peptídeo derivado de CAPRIN-1 exibido em SEQ ID Nº 5 danificam células cancerígenas que expressam CAPRIN-1 por meio da sua atividade de ADCC e demonstraram que o anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 quimérico de camundongo e humano nº 1 exibe atividade citotóxica mais forte contra células de câncer humano que os anticorpos comparativos 1 a 26.

[00162] Estes resultados sobre atividade citotóxica foram obtidos, conforme descrito acima, por meio de mistura do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfócitos (população celular que contém células NK) e 2 x 10º células de cada linhagem de células cancerígenas com cromo 51 incorporado; cultivo das células por quatro horas; após o cultivo, medição da quantidade de cromo 51 liberada no meio; e cálculo da atividade citotóxica contra a linhagem de células cancerígenas de acordo com a fórmula a seguir*: * Fórmula: atividade citotóxica (%) = quantidade de cromo 51 liberada das células alvo tratadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e linfócitos (população celular contendo células NK) / quantidade de cromo 51 liberada de células alvo tratadas com 1 N ácido clorídrico x 100.

EXEMPLO 8

[00163] Quantidade de moléculas de CAPRIN-1 sobre a superfície de diversas células cancerígenas reconhecidas por anticorpo anti- CAPRIN-1 nº 1:

[00164] Uma linhagem de células de câncer de mama humano (MDA-MB-231V), uma linhagem de células de câncer renal (Caki-1), uma linhagem de células de câncer de bexiga urinária (T24), uma linhagem de células de câncer do ovário (SKOV3), linhagens de células de câncer do pulmão (QG56 e A549), uma linhagem de células de câncer pancreático (Capan-2), uma linhagem de células de câncer de próstata (PC3), uma linhagem de células de câncer de cérvix uterino (SW756), uma linhagem de células de fibrossarcoma (HT1080), uma linhagem de células de tumor cerebral (T98G), uma linhagem de células de câncer gástrico (MKN28), linhagens de células de câncer colorretal (Lovo e DLD-1), uma linhagem de células de leucemia (AML5) e uma linhagem de células de linfoma (Ramos) foram examinadas para a quantidade de moléculas de CAPRIN-1 sobre a sua superfície celular reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 nº 1 utilizando um kit de teste de números moleculares “QIFIKIT” (fabricado pela Dako Japan Inc.). De forma similar, a quantidade de moléculas de CAPRIN-1 sobre a superfície das diversas células cancerígenas também foi examinada utilizando os anticorpos monoclonais comparativos anti-CAPRIN-1 a 26 preparados no Exemplo 5.

[00165] Segundo o protocolo ligado ao kit, cada anticorpo (anticorpos anti-CAPRIN-1 nº 1 ou qualquer dos anticorpos comparativos 1 a 26) foi diluído em 5 ug/ml (concentração final) com PBS e essa diluição foi adicionada a cada linhagem celular e reagiu por trinta minutos. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-lgG de camundongo secundários com marcas fluorescentes ligados ao kit foram adicionados, em conjunto com esferas de calibragem ligadas ao kit, a cada linhagem celular e mantidos em repouso por 45 minutos sobre gelo. Cada linhagem celular e as esferas de calibragem foram lavadas com PBS. Em seguida, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson & Company) para obter um valor médio de intensidade da fluorescência (média). Além disso, um valor médio de intensidade da fluorescência (média) foi obtido por meio do mesmo teste acima para os anticorpos comparativos. A amostra de controle negativo utilizada foi preparada com anticorpos controle de isotipos e também foi obtida a média. Cada valor médio de intensidade de fluorescência (média) foi empregado para calcular a quantidade de moléculas de acordo com o protocolo anexo ao kit. Como resultado, a quantidade de moléculas de CAPRIN-1 sobre a superfície das várias células cancerígenas reconhecidas pelo anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 nº 1 e os anticorpos comparativos 12 a 26 foi de 10º ou mais por célula para todas as linhagens de células de câncer humano examinadas. Por outro lado, as quantidades de moléculas reconhecidas pelos anticorpos comparativos 1 a 11 foram de menos de 10º por célula.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00166] O anticorpo de acordo com a presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção de câncer.

[00167] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO, ou seu fragmento, caracterizado pelo fato de que possui reatividade imunológica com um polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos.

2. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento possui atividade citotóxica contra uma célula cancerígena que expressa uma proteína CAPRIN-1.

3. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

4, ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo multiespecífico.

5. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com uma das reivindicações | a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nos 8, 9 e 10 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente), e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID Nos 12, 13 e 14 (CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente), e possui reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1.

6. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento é conjugado a um agente antitumoral.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, para o tratamento e/ou prevenção de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 6 como ingrediente ativo.

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor do cérebro, câncer gástrico, câncer de cérvix uterino, câncer do ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

9. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, para o tratamento e/ou prevenção do câncer, caracterizada pelo fato de que compreende a composição farmacêutica conforme definida em qualquer das reivindicações 7 ou 8 e uma composição farmacêutica que compreende um agente antitumoral.

10. — DNA, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 5.

11. MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE CÂNCER, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 6, ou seu fragmento, da composição farmacêutica conforme definida em qualquer das reivindicações 7 ou 8 ou da combinação farmacêutica conforme definida na reivindicação 9 a pacientes.

12. USODE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 6, ou seu fragmento, de uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer das reivindicações 7 ou 8 ou de uma combinação farmacêutica conforme definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de câncer.

ResuMO “ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, DNA E MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE CÂNCER E USO DE UM ANTICORPO”

A presente invenção fornece um anticorpo dirigido a uma proteína antigênica de câncer expressa especificamente sobre a superfície de células de câncer e seu uso como agente terapêutico e/ou preventivo para o câncer.

Especificamente, a presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que possui reatividade imunológica com um polipeptídeo CAPRIN-1 parcial que consiste da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº 5 ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de sequências de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos e uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo ou seu fragmento como ingrediente ativo.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 DOONO o » Campo 2 none Outras Informações: - Nome do Arquivo: 2014 10 14 1939-0023 Sequence listing GCS- PPT.txt - Data de Geração do Código: 14-10-2014 - Hora de Geração do Código: 15:12:56 - Código de Controle: : - Campo 1: C6GCO3424CBFDO010B - Campo 2: DB99EE372EA06816 Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList) :: Versão 2.1.0