BR112016001753B1 - Anticorpo, composição de anticorpo, composição farmacêutica, dna e uso de um anticorpo - Google Patents

Anticorpo, composição de anticorpo, composição farmacêutica, dna e uso de um anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPO, COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO, CÉLULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PRODUTO DE DROGA DE COMBINAÇÃO, DNA, MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE CÂNCER E USO DE UM ANTICORPO. A presente invenção destina-se a fornecer um anti corpo dirigido a CAPRIN-1 com atividade antitumor superior a anticorpos convencionais e seu uso como agente terapêutico e/ou preventivo para câncer. A presente invenção fornece um anticorpo dirigido a um polipeptídeo CAPRIN-1 expresso especificamente sobre a superfície de células de câncer e uso do anticorpo como agente terapêutico e/ou preventivo para câncer. A presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e possui reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos e uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende este anticorpo ou fragmento como ingrediente ativo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos e seu uso farmacêutico inovador agente terapêutico e/ou preventivo para câncer etc.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Cânceres são doenças que representam a principal causa de morte. Seu tratamento atual consiste principalmente de terapia cirúrgica, que pode ser combinada com terapia de radiação e/ou quimioterapia. Apesar do desenvolvimento de métodos cirúrgicos inovadores ou da descoberta de agentes de combate ao câncer inovadores nos últimos anos, o tratamento de câncer existente apresenta resultado insuficientemente aprimorado, exceto para alguns tipos de câncer. Com os avanços da biologia molecular ou imunologia do câncer, anticorpos que reagem especificamente com câncer, antígenos de câncer que são reconhecidos por células T citotóxicas, genes que codificam esses antígenos de câncer e similares foram identificados nos últimos anos, elevando as expectativas sobre terapia de câncer específica dirigida aos antígenos do câncer.
[003] Proteína de ativação citoplasmática e associada à proliferação 1 (CAPRIN-1) é conhecida como proteína intracelular que é expressa mediante ativação ou divisão celular de células normais em repouso e forma grânulos de tensão citoplasmática com RNAs intracelulares para participar da regulagem de transporte e tradução de mRNAs. Descobriu-se que esta proteína é especificamente expressa sobre a superfície de células cancerosas e encontra-se em estudo como alvo de drogas de anticorpos para tratamento de câncer (Literatura de Patentes 1 a 19). LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA DE PATENTES Literatura de Patente 1: WO 2010/016526. Literatura de Patente 2: WO 2011/096517. Literatura de Patente 3: WO 2011/096528. Literatura de Patente 4: WO 2011/096519. Literatura de Patente 5: WO 2011/096533. Literatura de Patente 6: WO 2011/096534. Literatura de Patente 7: WO 2011/096535. Literatura de Patente 8: WO 2013/018886. Literatura de Patente 9: WO 2013/018894. Literatura de Patente 10: WO 2013/018892. Literatura de Patente 11: WO 2013/018891. Literatura de Patente 12: WO 2013/018889. Literatura de Patente 13: WO 2013/018883. Literatura de Patente 14: WO 2013/125636. Literatura de Patente 15: WO 2013/125654. Literatura de Patente 16: WO 2013/125630. Literatura de Patente 17: WO 2013/125640. Literatura de Patente 18: WO 2013/147169. Literatura de Patente 19: WO 2013/147176.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[004] Um objeto da presente invenção é a produção de anticorpos que se dirigem a CAPRIN-1 especificamente expressos sobre a superfície de células cancerosas e apresentam atividade antitumores superiores a anticorpos convencionais e o fornecimento do seu uso como agente terapêutico e/ou preventivo para câncer.
SOLUÇÃO DO PROBLEMA
[005] As características da presente invenção são as seguintes:
[006] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e possui reatividade imunológica com proteína CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos como ingrediente ativo.
[007] Em uma de suas realizações, o câncer é câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço.
[008] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de fita simples ou anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico).
[009] O presente relatório descritivo engloba o conteúdo descrito no relatório descritivo e/ou os desenhos do Pedido de Patente Japonês NO: 2013-166164, no qual é baseada a prioridade do presente pedido.
EFEITOS VANTAJOSOS DA PRESENTE INVENÇÃO
[0010]O anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção danifica as células cancerosas. Desta forma, o anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção de câncer.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0011]O anticorpo contra um polipeptídeo de CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser avaliado para determinar a sua atividade antitumores, conforme mencionado posteriormente, examinando ex vivo se exibe ou não atividade citotóxica mediada por imunócitos contra células de tumor que expressam o polipeptídeo ou examinando in vivo a inibição do crescimento de tumores em animais portadores de tumor.
[0012]O anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal e é preferencialmente um anticorpo monoclonal. O anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo que possa exercer atividade antitumores e inclui, por exemplo, anticorpos recombinantes (tais como anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de fita simples (scFv)), anticorpos humanos e seus fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab’)2 e Fv). Estes anticorpos e seus fragmentos podem ser preparados por meio de métodos geralmente conhecidos dos técnicos no assunto. Quando o paciente for um ser humano, é desejável um anticorpo humano ou anticorpo humanizado para evitar ou suprimir a rejeição.
[0013]A expressão “que se liga especificamente à proteína CAPRIN-1” indica que o anticorpo liga-se especificamente à proteína CAPRIN-1 sem ligar-se substancialmente a outras proteínas.
[0014]O paciente de acordo com a presente invenção, cujo câncer deve ser tratado e/ou evitado é um mamífero tal como ser humano, animal de estimação, animal de criação ou animal esportivo e, preferencialmente, é ser humano.
[0015]Serão descritas a seguir a preparação do antígeno, a preparação do anticorpo e a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.
PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO PARA PREPARAÇÃO DE ANTICORPO
[0016] Proteínas ou seus fragmentos utilizados como antígenos sensibilizantes para obter o anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção não são limitados pelas espécies animais que lhes servem de origem, que incluem seres humanos, cães, gatos, bois, cavalos, camundongos, ratos e galinhas. Prefere-se, entretanto, selecionar o agente sensibilizante em vista da compatibilidade com células parentais para uso em fusão celular. Geralmente, são preferidas proteínas derivadas de mamíferos. Particularmente, são preferidas proteínas derivadas de seres humanos. Quando CAPRIN-1 for CAPRIN-1 humana, por exemplo, pode-se utilizar proteína CAPRIN-1 humana, um de seus peptídeos parciais, células que expressam CAPRIN-1 humana ou similares.
[0017]As sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos de CAPRIN-1 humana e seus homólogos podem ser obtidas, por exemplo, por meio de acesso ao GenBank (NCBI, Estados Unidos), utilizando um algoritmo tal como BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5873-5877, 1993; e Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
[0018] Na presente invenção, com referência à sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 16 ou 18) ou sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 17 ou 19) de CAPRIN-1 humana, a CAPRIN-1 alvo é um ácido nucleico ou proteína que consiste de uma sequência que possui identidade de sequências de 70% a 100%, preferencialmente de 80% a 100%, de maior preferência de 90% a 100%, de preferência adicional de 95% a 100%, tal como de 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100% ou 99,5% a 100% com a sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos de ORF ou parte madura da referência (as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19 em comparação entre si diferem de resíduos de aminoácidos na posição 690 e seguintes). Neste contexto, a expressão “% de identidade de sequências” indica percentual (%) da quantidade de aminoácidos (ou bases) idênticos com relação à quantidade total (incluindo o número de lacunas) de aminoácidos (ou bases) quando duas sequências são alinhadas de forma a atingir o grau máximo de similaridade ou identidade com ou sem a introdução de lacunas.
[0019] O fragmento da proteína CAPRIN-1 possui comprimento que varia do comprimento de aminoácido de um epítopo (determinante antigênico), que é a menor unidade reconhecida pelo anticorpo, até menos que o comprimento total da proteína. O epítopo designa um fragmento de polipeptídeo que possui antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferencialmente seres humanos. A sua menor unidade consiste de cerca de sete a doze aminoácidos, tal como de oito a onze aminoácidos.
[0020] Um fragmento de polipeptídeo que compreende a proteína CAPRIN-1 humana mencionada acima ou um de seus peptídeos parciais pode ser sintetizado de acordo com métodos de síntese química, tais como métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonila) ou tBoc (t-butiloxicarbonila) (Seikagaku Jikken Koza 1 (Biochemical Experimental Course in English 1 em inglês), edição da Sociedade Bioquímica Japonesa, Protein Chemistry IV, Chemical Modifications and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Além disso, a proteína CAPRIN-1 humana ou o fragmento de polipeptídeo pode ser sintetizado por meio de métodos rotineiros utilizando diversos sintetizadores de peptídeos comercialmente disponíveis. Alternativamente, polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos são preparados utilizando abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica (Sambrook et al, Molecular Cloning, segunda edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, terceira edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.) e esse polinucleotídeo é incorporado a vetores de expressão, que são então introduzidos em células hospedeiras de forma que o polipeptídeo seja produzido nas células hospedeiras. Desta forma, pode-se obter a proteína CAPRIN-1 humana de interesse ou seu fragmento de polipeptídeo.
[0021] O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser facilmente preparado por meio de abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica ou métodos rotineiros utilizando sintetizadores de ácidos nucleicos disponíveis comercialmente. Um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de um gene CAPRIN-1 humano, por exemplo, pode ser preparado por meio de PCR utilizando uma biblioteca de cDNA ou DNA cromossômico humano como modelo e um par de primers projetado de forma a ser capaz de amplificar a sequência de nucleotídeos. As condições de reação para este PCR podem ser adequadamente determinadas. Exemplos das condições podem incluir, mas sem limitações, trinta ciclos, cada qual envolvendo etapas de reação de 94 °C por trinta segundos (desnaturação), 55 °C por trinta segundos a um minuto (combinação) e 72 °C por dois minutos (alongamento) utilizando DNA polimerase termoestável (tal como Taq polimerase ou Pfu polimerase) e um tampão de PCR contendo Mg2+, seguido por reação a 72 °C por sete minutos. A abordagem de PCR, condições etc. são descritas, por exemplo, em Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, terceira edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (particularmente, Capítulo 15).
[0022] Além disso, primers ou sondas apropriadas podem ser preparadas com base em informações sobre as sequências de nucleotídeos do gene CAPRIN-1 e a sequência de aminoácidos de proteínas CAPRIN-1 e utilizadas na seleção, por exemplo, de uma biblioteca de cDNA humana, para isolar o DNA desejado. Prefere-se que a biblioteca de cDNA seja produzida a partir de células, órgãos ou tecidos que expressam a proteína CAPRIN-1. Exemplos dessas células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados dos testículos, bem como de cânceres ou tumores tais como leucemia, câncer de mama, linfoma, tumor cerebral, câncer do pulmão, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer renal, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, sarcoma, mastocitoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide e câncer da cabeça e do pescoço. Estes procedimentos, incluindo a preparação de sondas ou primers, a construção de uma biblioteca de cDNA, a seleção da biblioteca de cDNA e a clonagem do gene de interesse, são conhecidos dos técnicos no assunto e podem ser realizados de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning, segunda edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989) e Ausubel et al (ibid). Os DNAs que codificam a proteína CAPRIN-1 humana ou seus peptídeos parciais podem ser obtidos a partir do DNA obtido desta forma.
[0023] As células hospedeiras que receberão os vetores de expressão podem ser quaisquer células capazes de expressar o polipeptídeo. Exemplos de células procarióticas incluem, mas sem limitações, E. coli. Exemplos de células eucarióticas incluem, mas sem limitações: células de mamíferos tais como células de rim de macaco COS1 e células de ovário de hamster chinês CHO; linhagem de células de rim embriônico humano HEK293; linhagem de células da pele embriônica de camundongos NIH3T3; células de levedura tais como células de levedura de fissão e levedura de gemulação; células de bicho da seda; e células de ovos de Xenopus.
[0024] No caso de uso de células procarióticas como células hospedeiras, os vetores de expressão que possuem uma origem que permite a reprodução nas células procarióticas, promotor, local de ligação de ribossomos, local de clonagem múltipla, terminal, gene de resistência a drogas, gene complementar auxotrófico etc. são utilizados como vetores de expressão. Exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir a série pUC, pBluescriptII, sistemas de expressão de pET e sistemas de expressão de pGEX. O DNA que codifica o polipeptídeo é incorporado a esses vetores de expressão e células hospedeiras procarióticas podem ser transformadas com esses vetores, seguidos pelo cultivo dos transformadores obtidos de forma que o polipeptídeo codificado pelo DNA seja expresso nas células hospedeiras procarióticas. Neste particular, o polipeptídeo pode ser expresso na forma de proteína de fusão com outra proteína.
[0025] No caso de uso de células eucarióticas como células hospedeiras, os vetores de expressão para células eucarióticas que possuem um promotor, região de divisão, local de adição póli(A) etc. são utilizados como vetores de expressão. Exemplos desses vetores de expressão podem incluir vetores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 e pYES2. Da mesma forma acima, o DNA que codifica o polipeptídeo é incorporado a esses vetores de expressão e as células hospedeiras eucarióticas podem ser transformadas com esses vetores, seguidos pelo cultivo dos transformadores obtidos de forma que o polipeptídeo codificado pelo DNA seja expresso nas células hospedeiras eucarióticas. No caso do uso de vetores de expressão tais como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 ou pEGFP-C1, o polipeptídeo pode ser expresso como diversas proteínas de fusão marcadas com marca His (tais como (His)6 a (His)10), marca FLAG, marca myc, marca HA, GFP ou similares.
[0026] A transferência dos vetores de expressão para as células hospedeiras pode empregar métodos bem conhecidos tais como eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lipossomos, método de DEAE dextran, microinjeção, infecção viral, lipofecção ou ligação com peptídeos que penetram nas células.
[0027] Tratamentos de separação conhecidos na técnica podem ser conduzidos em combinação para isolamento e purificação do polipeptídeo de interesse a partir das células hospedeiras. Seus exemplos incluem, mas sem limitações, tratamento com um desnaturante (tal como ureia) ou tensoativo, ultrassonicação, digestão enzimática, dessalinização, fracionamento e precipitação de solvente, diálise, centrifugação, ultrafiltragem, filtragem de gel, SDS-PAGE, eletroforese de concentração isoelétrica, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.
[0028] O antígeno preparado desta forma pode ser utilizado como antígeno sensibilizante conforme mencionado posteriormente para produzir o anticorpo de acordo com a presente invenção.
ESTRUTURA DE ANTICORPO
[0029]Anticorpos (imunoglobulinas) são normalmente glicoproteínas heteromultiméricas, cada qual compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As imunoglobulinas, exceto por IgM, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150 kDa cada, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve é conectada a uma cadeia pesada por uma única ligação de dissulfeto covalente, embora a quantidade de ligações de dissulfeto varie entre cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada uma dentre as cadeias leve e pesada também possui uma ligação de dissulfeto intracadeias. Cada cadeia pesada possui um domínio variável (região VH) em uma extremidade, seguido por uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável (região VL) em uma extremidade e possui uma região constante isolada na outra extremidade. A região constante de cadeia leve é alinhada com a primeira região constante de cadeia pesada, enquanto o domínio variável de cadeia leve é alinhado ao domínio variável de cadeia pesada. Regiões específicas denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis de anticorpos exibem variabilidade específica e proporcionam especificidade de ligação ao anticorpo. As partes relativamente conservadas das regiões variáveis são denominadas regiões de cadeia principal (FRs). Cada um dentre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada completos possui uma estrutura na qual quatro regiões de cadeia principal são conectadas por meio de três regiões de determinação da complementaridade, ou seja, uma estrutura na qual FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 são conectados nesta ordem a partir do terminal N. Essas três regiões de determinação da complementaridade são denominadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3, nesta ordem, a partir do seu terminal N. De forma similar, as regiões de determinação da complementaridade na cadeia leve são denominadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3. CDRH3 é mais importante para a especificidade de ligação do anticorpo para o seu antígeno. Além disso, CDRs em cada cadeia são mantidas próximas entre si pelas regiões de cadeia principal e contribuem com a formação de um local de ligação de antígenos no anticorpo, em conjunto com as regiões de determinação da complementaridade derivadas da outra cadeia. As regiões constantes não contribuem diretamente com a ligação entre anticorpo e antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como envolvimento em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose (ADCP) mediada pela ligação a um receptor FCY, meia vida/velocidade de liberação mediada por um receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um componente C1q na cascata de complementos.
PREPARAÇÃO DE ANTICORPO
[0030] O anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção indica um anticorpo que possui reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 com comprimento total ou um de seus fragmentos.
[0031] Neste contexto, a “reatividade imunológica” indica a propriedade do anticorpo que se liga ao antígeno CAPRIN-1 (proteína CAPRIN- 1 com comprimento total ou seu polipeptídeo parcial) in vivo. Por meio dessa ligação a CAPRIN-1, o anticorpo de acordo com a presente invenção exerce a função de danificar (tal como matar, suprimir ou regredir) células de tumores. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode danificar tumores, tais como câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático câncer colorretal (por exemplo, câncer do cólon), câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço, por meio de ligação à proteína CAPRIN-1.
[0032] O anticorpo de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado, preferencialmente, desde que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal. O anticorpo de acordo com a presente invenção inclui anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (tais como diacorpos e triacorpos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de fita simples e fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab’)2 e Fv) e similares. Além disso, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina de qualquer classe, tal como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY, ou de qualquer subclasse, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2.
[0033] O anticorpo pode ser adicionalmente modificado por meio de desglicosilação, acetilação, formilação, amidação, fosforilação, PEGilação ou similares, além da glicosilação.
[0034] Serão fornecidos a seguir exemplos de preparação de diversos anticorpos monoclonais.
[0035] Uma linhagem de células de câncer de mama SK-BR-3 que expressa CAPRIN-1, por exemplo, é administrada a um camundongo para imunização. O baço é extraído desse camundongo. Após a separação das células do baço, as células são fundidas com células de mieloma de camundongo. Clones produtores de anticorpos que possuem efeito inibidor do crescimento de células cancerosas são selecionados a partir das células de fusão obtidas (hibridomas). Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais que possuem efeito inibidor do crescimento de células de câncer são isolados e esses hibridomas são cultivados. O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser preparado por meio de purificação a partir do sobrenadante de cultivo de acordo com um método geral de purificação de afinidade.
[0036] Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, conforme segue: em primeiro lugar, os animais são imunizados com o antígeno sensibilizante de acordo com um método conhecido na técnica. Este método de imunização geralmente envolve a injeção intraperitoneal ou subcutânea do agente sensibilizante a mamíferos. Especificamente, o antígeno sensibilizante diluído ou suspenso em PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica ou similares em quantidade apropriada é misturado em seguida, se desejado, com quantidade apropriada de um adjuvante convencional, tal como um adjuvante de Freund completo. Após emulsificação, a emulsão resultante é administrada a cada mamífero várias vezes a cada quatro a 21 dias. Alternativamente, pode ser utilizado um veículo apropriado para imunização com o antígeno sensibilizante.
[0037] Após confirmação da elevação do nível do anticorpo desejado no soro do mamífero imunizado desta forma, imunócitos são coletados do mamífero e submetidos a fusão celular. Exemplos preferidos dos imunócitos incluem particularmente células do baço.
[0038] Células de mieloma de mamíferos são utilizadas como células parentais parceiras a serem fundidas aos imunócitos. Várias linhagens celulares conhecidas na técnica, tais como P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. e Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276, 269270), FO (deSt. Groth, S. F. et al, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al, Nature (1979) 277, 131-133), 240E-1, 240E-W e 240E-W2 são preferencialmente utilizados como células de mieloma.
[0039] A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido na técnica, tal como o método de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[0040] Mais especificamente, a fusão celular é conduzida, por exemplo, na presença de um promotor da fusão celular em um meio nutriente convencional. Utiliza-se, por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou vírus hemaglutinante do Japão (HVJ) como promotor de fusão. Se desejado, pode- se agregar adicionalmente um auxiliar tal como sulfóxido de dimetila para uso a fim de aumentar a eficiência de fusão.
[0041] A razão entre os imunócitos e as células de mieloma utilizadas pode ser definida arbitrariamente. Pode-se utilizar, por exemplo, meio RPMI1640 ou meio MEM apropriado para o crescimento das linhagens de células de mieloma ou meios convencionais para uso neste tipo de cultivo celular como meio para uso na fusão celular. Além disso, pode ser utilizado um suplemento de soro tal como soro de feto de bezerro (FCS) em combinação com o meio.
[0042] Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturados em quantidade previamente determinada do meio. Uma solução de PEG (peso molecular médio: por exemplo, cerca de 1000 a 6000) previamente aquecida a cerca de 37 °C normalmente é adicionada à mistura em concentração de 30 a 60% (p/v) e misturada para formar os hibridomas de interesse. Em seguida, prefere-se remover agentes de fusão celular ou similares desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas repetindo os procedimentos de adição sequencial de um meio apropriado e remoção do sobrenadante por meio de centrifugação.
[0043] Os hibridomas obtidos desta forma são cultivados em um meio seletivo convencional, tal como meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) para seleção. Este cultivo no meio HAT continua por um período (normalmente de vários dias a diversas semanas) suficiente para a morte das células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas de interesse. Em seguida, hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são selecionados e clonados na forma de clones isolados por meio de um método de diluição limitador convencional.
[0044] Além dessa obtenção dos hibridomas por meio de imunização de animais não humanos com antígenos, hibridomas produtores de anticorpos humanos que possuem a atividade desejada (tal como atividade inibidora do crescimento celular) podem ser obtidos por meio da sensibilização de linfócitos humanos, tais como linfócitos humanos infectados por vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas ou seus lisatos in vitro e fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de seres humanos capazes de dividir-se permanentemente, por exemplo, U266 (Registro NO: TIB196).
[0045] Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais preparados desta forma podem ser subcultivados em meio convencional e podem também ser armazenados por longos períodos em nitrogênio líquido.
[0046] Especificamente, o antígeno desejado ou células que expressam o antígeno desejado são utilizados como agentes sensibilizantes em imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos obtidos são fundidos a células parentais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. Células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas) podem ser selecionadas por meio de um método de seleção convencional para preparar o anticorpo de interesse.
[0047] O antígeno pode ser preparado, por exemplo, de acordo com um método que utiliza células animais (Patente Japonesa Publicada (Kohyo) NO: 2007-530068 A (2007)) ou um método que utiliza bacilovírus (por exemplo, Patente Internacional NO: WO 98/46777). Quando o antígeno possuir baixa imunogenicidade, este antígeno pode ser ligado a uma macromolécula imunogênica tal como albumina para imunização. O antígeno pode ser administrado em conjunto com adjuvante para imunização.
[0048] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser obtido na forma de anticorpo recombinante genético produzido utilizando um método de recombinação genética que envolve: clonagem de um gene do anticorpo a partir de um hibridoma; incorporação do gene de anticorpo em vetores apropriados; e transferência dos vetores em hospedeiros (vide, por exemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino Unido pela MacMillan Publishers Ltd., 1990). Especificamente, cDNAs de região variável (região V) do anticorpo são sintetizados a partir dos mRNAs dos hibridomas utilizando transcriptase reversa. Após a obtenção de DNAs que codificam as regiões V do anticorpo de interesse, os DNAs são ligados a DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpos desejadas (regiões C). Os produtos de ligação resultantes são incorporados a vetores de expressão. Alternativamente, os DNAs codificadores de região V de anticorpo podem ser incorporados a vetores de expressão que contêm DNAs de região C de anticorpo. Esses DNAs são incorporados aos vetores de expressão de forma a serem expressos sob o controle de regiões de controle de expressão, tais como um amplificador e um promotor. Em seguida, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e mantidas para expressar o anticorpo.
[0049] O anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal. O anticorpo monoclonal inclui anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais animais não humanos (tais como anticorpos monoclonais de camundongos, ratos, coelhos e galinhas), anticorpos monoclonais quiméricos e similares. O anticorpo monoclonal pode ser preparado por meio do cultivo de hibridomas obtidos por meio da fusão entre células do baço de mamíferos não humanos (tais como camundongos, camundongos produtores de anticorpos humanos, galinhas ou coelhos) imunizados com a proteína CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos e células de mieloma. O anticorpo quimérico é um anticorpo preparado a partir de uma combinação de sequências derivadas de diferentes animais e, por exemplo, é um anticorpo composto de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos de camundongos e regiões constantes de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos. O anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido na técnica e é obtido, por exemplo, por meio de: ligação de DNAs que codificam as regiões V de anticorpos com DNAs que codificam as regiões C de anticorpos humanos; incorporação dos produtos de ligação resultantes a vetores de expressão; e transferência dos vetores para hospedeiros, para a produção de anticorpos.
[0050] Nos exemplos mencionados posteriormente, diversos anticorpos monoclonais humanizados e um anticorpo monoclonal quimérico de coelho/humano foram preparados e confirmou-se que possuem forte efeito antitumores. Todos esses anticorpos monoclonais possuem uma região variável de cadeia pesada (região VH) que compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve (região VL) que compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Esses anticorpos monoclonais incluem o anticorpo humanizado NO: 0 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o anticorpo humanizado NO: 1 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o anticorpo humanizado NO: 2 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o anticorpo humanizado NO: 3 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o anticorpo humanizado NO: 4 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o anticorpo humanizado NO: 5 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o anticorpo humanizado NO: 6 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o anticorpo humanizado NO: 7 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o anticorpo humanizado NO: 8 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o anticorpo humanizado NO: 9 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o anticorpo humanizado NO: 10 que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e um anticorpo quimérico de coelho/humano que consiste de uma região VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[0051] O anticorpo humanizado, também denominado anticorpo humano remodelado, é um anticorpo elaborado. O anticorpo humanizado é construído por meio do enxerto de regiões de determinação da complementaridade de um anticorpo humano com regiões de determinação da complementaridade de um anticorpo derivado de animais humanizados. Também é conhecida sua abordagem de recombinação genética geral.
[0052] Especificamente, sequências de DNA projetadas de forma a ligar, por exemplo, regiões de determinação da complementaridade de anticorpos de camundongos, coelhos ou galinhas, por exemplo, e regiões de cadeia principal de anticorpos humanos são sintetizadas por meio de PCR utilizando diversos oligonucleotídeos preparados que possuem partes terminais sobrepostas entre si. Os DNAs obtidos são ligados a DNAs que codificam regiões constantes de anticorpos humanos. Em seguida, os produtos de ligação resultantes são incorporados a vetores de expressão, que são transferidos em seguida para hospedeiros de produção de anticorpos, para obter o anticorpo de interesse (vide o Pedido de Patente Europeu Publicado NO: EP239400 e a Patente Internacional NO: WO 96/02576). As regiões de cadeia principal de um anticorpo humano conectado por meio das regiões de determinação da complementaridade são selecionadas de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade formem um local de ligação de antígenos favorável. Se necessário, aminoácidos nas regiões de estrutura de regiões variáveis de anticorpos podem ser substituídos de tal forma que as regiões de determinação da complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um local de ligação de antígenos apropriado (Sato, K. et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856). Além disso, essas regiões de cadeia principal podem ser substituídas por regiões de cadeia principal derivadas de diversos anticorpos humanos (vide a Patente Internacional Publicada NO: WO 99/51743).
[0053] Para preparação do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado, aminoácidos em regiões variáveis (por exemplo, FRs) ou regiões constantes podem ser substituídos, por exemplo, por outros aminoácidos.
[0054] A substituição de aminoácidos é a substituição de um ou mais, por exemplo, menos de 15, menos de 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos aminoácidos, preferencialmente de 1 a 9 aminoácidos. O anticorpo substituído deverá ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído.
[0055] Neste contexto, a expressão “funcionalmente equivalente” indica que um anticorpo correspondente possui atividade biológica ou bioquímica similar à do anticorpo de acordo com a presente invenção; especificamente, o anticorpo correspondente possui a função de danificar tumor e essencialmente não causa rejeição quando aplicado a seres humanos, por exemplo. Exemplos dessa atividade podem incluir atividade inibidora do crescimento celular e atividade de ligação.
[0056] É bem conhecido dos técnicos no assunto um método de substituição de aminoácidos que envolve a introdução de mutação em um polipeptídeo como método de preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um certo polipeptídeo. Os técnicos no assunto podem introduzir adequadamente, por exemplo, substituição de aminoácidos no anticorpo de acordo com a presente invenção utilizando mutagênese dirigida a local (Hashimoto-Gotoh, T. et al (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, M. J. e Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, H. J. (1987), Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488-492; e Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766) ou similares, de forma a preparar um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo de acordo com a presente invenção.
[0057] No caso de introdução de substituição de aminoácidos, a substituição é uma substituição de aminoácido desejavelmente conservadora. A substituição de aminoácido conservadora é a substituição entre aminoácidos com propriedades similares tais como carga, cadeias laterais, polaridade e aromaticidade. Os aminoácidos podem ser classificados em termos de propriedades similares, por exemplo, em: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoácidos polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina); aminoácidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).
[0058] Exemplos de anticorpos modificados podem incluir anticorpos ligados com várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG). No anticorpo modificado de acordo com a presente invenção, a substância a ser ligada não é limitada. A fim de obter esse anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser quimicamente modificado. Um método com este propósito já foi estabelecido na técnica.
[0059] O anticorpo que reconhece uma proteína CAPRIN-1 ou um polipeptídeo de fragmento de CAPRIN-1 pode ser obtido por meio de um método geralmente conhecido dos técnicos no assunto. O anticorpo pode ser obtido, por exemplo, por meio de um método que envolve a determinação de epítopo da proteína CAPRIN-1 reconhecido por um anticorpo anti-CAPRIN-1 por meio de método convencional (tal como mapeamento de epítopos ou método de identificação de epítopos mencionado posteriormente) e preparação de anticorpos utilizando um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como imunogene, ou um método que envolve a determinação de epítopos para anticorpos preparados por meio de um método convencional e seleção de anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo do anticorpo anti-CAPRIN-1.
[0060] O anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que possui reatividade imunológica com CAPRIN-1, um anticorpo que reconhece especificamente CAPRIN-1 ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1 e exibe atividade citotóxica contra câncer ou efeito inibidor do crescimento de tumores. Prefere-se que o anticorpo seja um anticorpo que possui uma estrutura que causa pouca ou nenhuma rejeição em animais receptores. Exemplos desses anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (tais como anticorpos quiméricos de seres humanos/coelhos), anticorpos de fita simples e anticorpos biespecíficos quando os animais receptores forem seres humanos. Esses anticorpos são anticorpos recombinantes que possuem regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve derivadas de um anticorpo humano, que possui regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve que compreendem regiões de determinação da complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) derivadas de um anticorpo animal não humano e regiões de cadeia principal (FR1, FR2, FR3 e FR4) derivadas de anticorpo humano ou que possuem regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve derivadas de um anticorpo animal não humano e regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve derivadas de anticorpos humanos. Anticorpos preferidos são os primeiros dois anticorpos.
[0061] Esses anticorpos recombinantes podem ser preparados conforme segue: DNA que codifica o anticorpo monoclonal (tal como anticorpo monoclonal humano, de camundongo, rato, coelho ou galinha) contra CAPRIN- 1 humano é clonado a partir de células produtoras de anticorpos tais como hibridomas e utilizado como modelo em PCR RT ou similar para preparar DNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo. As sequências correspondentes das regiões variáveis de cadeia leve e pesada, as sequências correspondentes de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada região ou as sequências correspondentes de FR1, FR2, FR3 e FR4 em cada região podem ser determinadas com base, por exemplo, no sistema de numeração EU de Kabat (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD (1991)).
[0062] Esse DNA que codifica cada uma dessas regiões variáveis ou um DNA que codifica cada região de determinação da complementaridade é adicionalmente preparado utilizando um método de recombinação genética (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de DNA. Neste contexto, os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados por meio da imunização de animais produtores de anticorpos humanos (tais como camundongos) com CAPRIN-1 humana e, em seguida, fusão de células do baço extirpadas dos animais imunizados com células de mieloma. Além disso, DNAs que codificam regiões constantes e variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos são preparados, se necessário, utilizando um método de recombinação genética ou um sintetizador de DNA.
[0063] Para o anticorpo humanizado, as sequências de codificação de CDR no DNA que codifica a região variável de cadeia leve ou pesada derivada de anticorpos humanos podem ser substituídas por sequências de codificação de CDR correspondentes de anticorpos derivados de animais não humanos (por exemplo, de camundongos, ratos, coelhos ou galinhas) de forma a preparar DNA que codifica anticorpo humanizado. No caso, por exemplo, de anticorpo humanizado no qual as sequências de codificação de CDR derivadas de anticorpos humanos são substituídas por sequências de codificação de CDR correspondentes derivadas de anticorpo de camundongo, cada região variável é constituída por FR1 humana, CDR1 de camundongo, FR2 humana, CDR2 de camundongo, FR3 humana, CDR4 de camundongo e FR4 humana, nesta ordem, a partir do terminal N.
[0064] Para o anticorpo quimérico, o DNA que codifica a região variável de cadeia leve ou pesada de anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou galinha) pode ser ligado ao DNA que codifica uma região constante de cadeia leve ou pesada derivada de anticorpo humano para preparar DNA que codifica o anticorpo quimérico.
[0065] No caso do anticorpo de fita simples, esse anticorpo designa um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve ligadas linearmente por meio de um ligante. Um DNA que codifica o anticorpo de fita simples pode ser preparado por meio da ligação de um DNA que codifica a região variável de cadeia pesada, um DNA que codifica o ligante e um DNA que codifica a região variável de cadeia leve. Neste contexto, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada são ambas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano que possui regiões de determinação da complementaridade isoladas substituídas por regiões de determinação da complementaridade de anticorpos derivados de animais não humanos (por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou galinha). O ligante consiste de doze a dezenove aminoácidos. Seus exemplos incluem (G4S)3, que consiste de quinze aminoácidos (G.-B. Kim et al, Protein Engineering Design and Selection, 2007, 20 (9): 425-432).
[0066] No caso do anticorpo biespecífico (tal como diacorpo), este anticorpo designa um anticorpo capaz de ligar-se especificamente a dois epítopos diferentes. Um DNA que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado por meio da ligação, por exemplo, de um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada A, um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve B, um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada B e um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve A, nesta ordem (desde que o DNA que codifica uma região variável de cadeia leve B e o DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada B sejam ligados por meio de um DNA que codifica um ligante conforme descrito acima). Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia leve e as regiões variáveis de cadeia pesada são ambas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano que possui regiões de determinação da complementaridade isoladas substituídas por regiões de determinação da complementaridade de anticorpos derivados de animais não humanos (por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou galinha).
[0067] Os DNAs recombinantes preparados desta forma podem ser incorporados a um ou mais vetores apropriados, que são transferidos em seguida para células hospedeiras (tais como células de mamíferos, células de leveduras e células de insetos), de tal forma que os DNAs sejam (co)expressos para produzir o anticorpo recombinante de interesse (P. J. Delves, Antibody Production Essential Techniques, 1997, Wiley, P. Shepherd e C. Dean, Monoclonal Antibodies, 2000, Oxford University Press; e J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 1993, Academic Press).
[0068] Exemplos do anticorpo de acordo com a presente invenção preparados por meio de qualquer um dos métodos descritos acima incluem os anticorpos (a) a (l) a seguir, que compreendem uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:: 1, 2 e 3 e um domínio variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 4, 5 e 6, obtidos nos Exemplos mencionados posteriormente: a. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15; b. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15; c. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15; d. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13; e. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; f. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; g. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13; h. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 14; i. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11; j. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11; k. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15; e l. um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 21.
[0069] Neste contexto, as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 1, 2 e 3 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da região variável de cadeia pesada do anticorpo de coelho e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4, 5 e 6 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da região variável de cadeia leve do anticorpo de coelho.
[0070] O anticorpo humanizado, o anticorpo quimérico, o anticorpo de fita simples ou o anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção é, por exemplo, qualquer um dos anticorpos (i) a (xiv) a seguir: i. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e as sequências de aminoácidos de regiões de cadeia principal derivadas de um anticorpo humano, ou suas formas substituídas, e um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e as sequências de aminoácidos de regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos ou suas formas substituídas; ii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e as sequências de aminoácidos de regiões de cadeia principal derivadas de anticorpos humanos; ou suas formas substituídas e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano; e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e as sequências de aminoácidos de regiões de cadeia principal derivadas de anticorpo humano, ou suas formas substituídas, e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; iii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; iv. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; v. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; vi. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; vii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; viiii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; ix. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; x. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; xi. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; xii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; xiii. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos; e xiv. um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos.
[0071] As sequências das regiões de cadeia principal das regiões constantes e variáveis de cadeias leve e pesada de anticorpos humanos são disponíveis, por exemplo, por meio do NCBI (Estados Unidos; GenBank, UniGene etc.). As sequências a seguir podem, por exemplo, referir-se a: Registro NO: J00228 para uma região constante de cadeia pesada IgG1 humana; Registro NO: J00230 para uma região constante de cadeia pesada IgG2 humana; Registro NO: X03604 para uma região constante de cadeia pesada IgG3 humana; Registro NO: K01316 para uma região constante de cadeia pesada IgG4 humana; Registros NO: V00557, X64135, X64133 etc. para uma região constante K de cadeia leve humana; e Registros NO: X64132, X64134 etc. para uma região constante À de cadeia leve humana.
[0072] Preferencialmente, esses anticorpos possuem atividade citotóxica e, portanto, podem exercer efeito antitumores (ou atividade antitumores).
[0073] Cada um dos anticorpos mencionados acima pode ter a substituição, exclusão ou adição de um ou mais aminoácidos em uma sequência de determinação de complementaridade, uma sequência de região de cadeia principal e/ou uma sequência de região constante, desde que o anticorpo resultante possua tal especificidade que possa reconhecer especificamente CAPRIN-1. Neste contexto, o termo “diversos” indica preferencialmente de 1 a 9.
[0074] A constante de afinidade Ka (kon/koff) do anticorpo de acordo com a presente invenção para uma proteína CAPRIN-1 ou seu fragmento é preferencialmente de pelo menos 5 x 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 x 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 x 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 x 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1 ou pelo menos 1014 M-1.
[0075] Um mecanismo subjacente ao efeito antitumores do anticorpo de acordo com a presente invenção sobre células de câncer que expressam CAPRIN-1 é a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras contra as células que expressam CAPRIN-1. A atividade antitumores do anticorpo de acordo com a presente invenção por meio de ADCC pode ser aprimorada por meio da substituição de um ou mais aminoácidos na região constante de cadeia pesada do anticorpo de acordo com a presente invenção ou da remoção de fucose adicionada a N- acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada. A atividade antitumores do anticorpo de acordo com a presente invenção por meio de ADCC pode ser adicionalmente aprimorada pela combinação da substituição de aminoácidos e remoção de fucose da região constante de cadeia pesada.
[0076] Esse anticorpo que não contém fucose adicionada a N- acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada de acordo com a presente invenção pode ser utilizado isoladamente ou pode ser uma composição com anticorpo fucosilado. Prefere-se que a composição de anticorpo seja composta principalmente do anticorpo que não contém fucose.
[0077] O anticorpo no qual um ou mais aminoácidos da região constante de cadeia pesada são substituídos pode ser preparado com referência, por exemplo, à Patente Internacional Publicada NO: WO 2004/063351, Patente Internacional Publicada NO: WO 2011/120135, Patente Norte-Americana NO: 8388955, Patente Internacional Publicada NO: WO 2011/005481, Patente Norte-Americana NO: 6737056 e Patente Internacional Publicada NO: WO 2005/063351. O anticorpo que não contém fucose adicionada a N-acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo na região constante de cadeia pesada ou células que produzem o anticorpo podem ser preparadas, por exemplo, com referência à Patente Norte- Americana NO: 6.602.684, Patente Europeia NO: 1914244 e à Patente Norte- Americana NO: 7.579.170. A composição do anticorpo que não contém fucose adicionada a N-acetilglucosamina em uma cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada e o anticorpo fucosilado ou células que produzem o anticorpo podem ser preparadas, por exemplo, com referência à Patente Norte-Americana NO: 8.642.292.
[0078] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser conjugado a um agente antitumor. A conjugação do anticorpo ao agente antitumor pode ser realizada por meio de um espaçador que contém um grupo (tal como um grupo succinimidila, um grupo formila, um grupo 2-piridilditio, um grupo maleimidila, um grupo alcoxicarbonila ou um grupo hidróxi) reativo com um grupo amino, grupo carboxila, grupo hidróxi, grupo tiol ou similares.
[0079] Exemplos do agente antitumor incluem os agentes antitumores a seguir, conhecidos publicamente na literatura etc.: paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracil, tiotepa, bussulfan, improssulfan, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina. calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamido glicosídeo, ácido aminolevulínico, eniluracil, ansacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglucid, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil- hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilan, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucil, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecan, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina, seus sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis.
[0080] Quando o anticorpo é um anticorpo conjugado a um agente antitumor, o método para avaliar se deve ou não ser exercida atividade antitumores pode envolver, por exemplo, para o anticorpo anti-CAPRIN-1 derivado de camundongos, a reação de um anticorpo secundário ligado a droga que se liga a um anticorpo de camundongo em conjunto com ela para avaliar ex vivo o efeito antitumores sobre as células de câncer humano. Essa avaliação pode ser conduzida utilizando, por exemplo, um anticorpo anti-IgG humano (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)), que é uma segunda imunotoxina ligada com saporina.
[0081] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumor, de forma a produzir efeito terapêutico superior. Esta abordagem é adaptável a pacientes com câncer que expressa CAPRIN-1 antes ou depois do tratamento cirúrgico. Esta abordagem pode ser aplicada, particularmente após a cirurgia, a câncer que expressa CAPRIN-1, que tenha sido tratado convencionalmente com um agente antitumor isolado, para produzir prevenção mais alta de recorrência do câncer ou prolongamento do tempo de sobrevivência.
[0082] Qualquer um dos agentes antitumores descritos acima pode ser utilizado, por exemplo, como agente antitumor para uso na administração combinada com o anticorpo de acordo com a presente invenção. Particularmente, são preferencialmente utilizados ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel ou vinorelbina.
[0083] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser ligado a um radioisótopo conhecido publicamente na literatura etc., tal como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153SM, 212Bi, 32P, 175Lu, 176Lu, 89Sr, 64Cu ou 111In (Hideo Saji, Yakugaku Zasshi 128 (3) 323-332, 8 (2008), Japão). É desejável um radioisótopo eficaz para o tratamento ou diagnóstico de tumor. Esse radioisótopo também é incluído no agente antitumor de acordo com a presente invenção.
EFEITO ANTITUMORES
[0084] Considera-se que o efeito antitumores do anticorpo anti- CAPRIN-1 utilizado na presente invenção sobre células cancerosas que expressam CAPRIN-1 tem lugar com base no mecanismo a seguir ou similar: a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras contra as células que expressam CAPRIN-1 mencionadas acima e a fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) das células que expressam CAPRIN- 1. O escopo da presente invenção não se destina, entretanto, a ser limitado por este mecanismo.
[0085] Portanto, a atividade do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser avaliada, conforme exibido especificamente abaixo nos Exemplos, por meio de medição ex vivo da atividade de ADCC ou atividade de ADCP sobre células de câncer que expressam CAPRIN-1.
[0086] O anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção liga-se à proteína CAPRIN-1 sobre células cancerosas e exibe efeito antitumores por meio da atividade ou similar. Desta forma, o anticorpo anti- CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é presumivelmente útil no tratamento ou prevenção de câncer. Especificamente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo anti-CAPRIN-1 como ingrediente ativo. O anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado para fins de administração a corpos humanos (terapia de anticorpos) é preferencialmente um anticorpo humano ou anticorpo humanizado para reduzir a imunogenicidade.
[0087] Um anticorpo anti-CAPRIN-1 com afinidade de ligação mais alta para a proteína CAPRIN-1 sobre a superfície de células cancerosas exerce atividade antitumores mais forte. Desta forma, o anticorpo de acordo com a presente invenção possui alta afinidade de ligação para a proteína CAPRIN-1 e pode-se, portanto, esperar efeito antitumores mais forte. Consequentemente, o anticorpo de acordo com a presente invenção é adaptável a uma composição farmacêutica destinada a tratamento e/ou prevenção de câncer. Essa alta afinidade de ligação do anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente de pelo menos 5 x 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 x 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 x 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 x 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1 ou pelo menos 1014 M-1, em termos de constante de associação (constante de afinidade) Ka (kon/koff), conforme descrito acima.
LIGAÇÃO A CÉLULAS QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS
[0088] A capacidade do anticorpo de ligar-se a CAPRIN-1 pode ser determinada pelo uso de testes de ligação utilizando, por exemplo, ELISA, Western Blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo, conforme descrito nos Exemplos.
MANCHAS IMUNO-HISTOQUÍMICAS
[0089] O anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser utilizado em imuno-histoquímica por meio de um método bem conhecido dos técnicos no assunto. O anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado para determinar a sua reatividade com CAPRIN-1, por exemplo, utilizando uma seção congelada fixa em paraformaldeído ou acetona ou uma seção embutida em parafina fixa em paraformaldeído de um tecido obtido de paciente durante tratamento cirúrgico ou de um tecido obtido de um animal portador de um tecido de xenoenxerto inoculado com uma linhagem celular que expressa CAPRIN-1 espontaneamente ou após transfecção.
[0090] Para manchas imuno-histoquímicas, o anticorpo reativo com CAPRIN-1 pode ser manchado por meio de vários métodos. O anticorpo pode ser visualizado, por exemplo, por meio de reação com um anticorpo anticamundongos de cabra conjugado a peroxidase de rabanete silvestre, anticorpo anticoelhos de cabra ou anticorpo antigalinhas de cabra.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE TRATAMENTO E/Ou PREVENÇÃO DE CÂNCER
[0091] O alvo da composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado, desde que o alvo seja câncer (células) que expressa um gene CAPRIN-1.
[0092] Os termos “tumor” e “câncer” utilizados no presente relatório descritivo indicam neoplasma maligno e são utilizados de forma intercambiável entre si.
[0093] O câncer alvo na presente invenção pode ser qualquer câncer que expressa a proteína CAPRIN-1 sobre a superfície da membrana celular. O câncer é preferencialmente câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço, conforme mencionado acima.
[0094] Mais especificamente, exemplos desses cânceres incluem, mas sem limitações, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama do tipo complexo, tumor misto maligno das glândulas mamárias, adenocarcinoma papilar intradutos, adenocarcinoma do pulmão, câncer das células escamosas, câncer de células pequenas, câncer de células grandes, glioma que é tumor de tecido neuroepitelial, glioblastoma, neuroblastoma, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodermal embrional, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma do tipo celular pequeno a médio, câncer cecal, câncer do cólon ascendente, câncer do cólon descendente, câncer do cólon transversal, câncer do cólon sigmoide, câncer retal, câncer do ovário epitelial, tumor de células de gérmen, tumor de células estromais, carcinoma dos dutos pancreáticos, carcinoma dos dutos pancreáticos invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma das células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasma mucinoso papilar intradutos, neoplasma cístico mucinoso, pancreatoblastoma, adenoma de células ilhas, tumor de Frants, cistadenocarcinoma do soro, tumor pseudopapilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (síndrome de Werner), tumor de células ilhas não funcionais, somatoestatinoma, VIPoma, câncer do colo do útero, câncer do corpo uterino, fibrossarcoma, sarcoma dos ossos ou das juntas, sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, hepatoblastoma, sarcoma dos tecidos moles, leucemia aguda, leucemia crônica, tumor da medula espinhal, tumor de tecidos moles malignos, tumor do grupo de teratoma e câncer da cabeça e do pescoço, incluindo câncer da hipofaringe, câncer da orofaringe, câncer da língua, câncer da epifaringe, câncer oral, câncer dos lábios, câncer senoide e câncer da garganta.
[0095] Os pacientes receptores são preferencialmente mamíferos, tais como mamíferos incluindo primatas, animais de estimação, animais de criação e animais esportivos e são, de preferência específica, seres humanos, cães e gatos.
[0096] No caso de uso do anticorpo de acordo com a presente invenção como composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada por meio de um método geralmente conhecido dos técnicos no assunto. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, na forma de injeção parenteral de uma solução ou suspensão asséptica com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada, por exemplo, com o anticorpo misturado em uma forma de dosagem unitária necessária para a prática farmacêutica geralmente aceita, em combinação apropriada com veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, agente formador de suspensão, tensoativo, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, veículo, conservante, aglutinante etc. A quantidade do ingrediente ativo nessa preparação é determinada de forma que possa ser atingida uma dose apropriada dentro da faixa prescrita.
[0097] Uma composição asséptica para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo tal como água destilada injetável.
[0098] Exemplos de soluções aquosas para injeção incluem solução salina fisiológica, soluções isotônicas que contêm glicose e outros adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante apropriado, tal como um álcool (especificamente, etanol) ou poliálcool (tal como propileno glicol e polietileno gicol) ou um tensoativo não iônico, tal como polissorbato 80® ou HCO-60.
[0099] Exemplos de soluções oleosas incluem óleo de gergelim e óleo de soja. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com benzoato de benzila ou álcool benzílico como solubilizante. As soluções podem ser adicionalmente misturadas com tampão (tal como uma solução de tampão de fosfato e uma solução de tampão de acetato de sódio), um agente de alívio (tal como cloridrato de procaína), um estabilizante (tal como álcool benzílico e fenol) e um antioxidante. As soluções de injeção preparadas desta forma são normalmente carregadas em ampolas apropriadas.
[00100] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é administrada por via oral ou parenteral, preferencialmente parenteral. Exemplos específicos das suas formas de dosagem incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de administração transpulmonar e agentes de administração percutânea. Exemplos das injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea, por meio das quais a composição farmacêutica pode ser administrada de forma local ou sistêmica.
[00101] Além disso, o método de administração pode ser adequadamente selecionado dependendo da idade, peso, sexo, sintomas etc. do paciente. A dose de composição farmacêutica que contém o anticorpo ou um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso do corpo por dose. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,001 a 100000 mg/corpo do paciente, embora a dose não seja necessariamente limitada a esses valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, idade, sexo, sintomas etc. do paciente, os técnicos no assunto podem selecionar adequadamente a dose e o método.
[00102] A composição farmacêutica que compreende o anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento pode ser administrada a pacientes para o tratamento e/ou prevenção de câncer, preferencialmente câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço.
[00103] A presente invenção engloba ainda um método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção em combinação com o agente antitumor conforme exemplificado acima ou uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumor a pacientes. O anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento pode ser administrado simultânea ou separadamente do agente antitumor ao paciente. No caso de administração separada, qualquer uma das suas composições farmacêuticas pode ser administrada em primeiro lugar ou posteriormente. Seus intervalos de dosagem, doses, vias de administração e a quantidade de doses podem ser adequadamente selecionados por um especialista. No caso de administração simultânea, a forma de dosagem de drogas também inclui, por exemplo, composições farmacêuticas formuladas por meio de mistura do anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento e do agente antitumor com um veículo (ou meio) farmacologicamente aceitável. As descrições acima sobre prescrição, formulação, vias de administração, doses, câncer etc. com relação às composições farmacêuticas e formas de dosagem que contêm o anticorpo de acordo com a presente invenção também são aplicáveis a qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima e formas de dosagem que contêm o agente antitumor.
[00104] A presente invenção também fornece, portanto, um produto de droga de combinação para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumor conforme exemplificado acima e um método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração do produto de droga de combinação. A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo de acordo com a presente invenção ou seu fragmento e o agente antitumor em conjunto com um veículo farmacologicamente aceitável.
POLIPEPTÍDEO E DNA
[00105] A presente invenção fornece adicionalmente um DNA que codifica o anticorpo de acordo com a presente invenção, DNA que codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve do anticorpo e um DNA que codifica a região variável de cadeia leve ou cadeia pesada do anticorpo. Esses DNAs incluem, no caso do anticorpo (a), por exemplo, um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 e 6.
[00106] Como as regiões de determinação de complementaridade codificadas pelos DNAs que possuem essas sequências são regiões que determinam a especificidade do anticorpo, sequências que codificam as outras regiões (ou seja, regiões constantes e regiões de cadeia principal) do anticorpo podem ser sequências derivadas de um anticorpo diferente. Neste contexto, o anticorpo diferente também inclui um anticorpo derivado de organismo não humano, mas é preferencialmente derivado de seres humanos do ponto de vista de redução da reação adversa. Especificamente, para os DNAs mencionados acima, prefere-se que regiões que codificam as regiões de cadeia principal correspondentes da cadeia pesada e cadeia leve e cada região constante compreendam sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes derivadas de anticorpos humanos.
[00107] Exemplos adicionais do DNA que codifica o anticorpo de acordo com a presente invenção incluem DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e um DNA no qual uma região que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Neste contexto, um exemplo da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23. Além disso, um exemplo da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 30. Para esses DNAs, também se prefere que regiões que codificam as regiões constantes correspondentes da cadeia pesada e da cadeia leve compreendam sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes derivadas de anticorpos humanos.
[00108] Esses DNAs de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, por meio do método mencionado acima ou do método a seguir: em primeiro lugar, RNA total é preparado a partir do hibridoma relativo ao anticorpo de acordo com a presente invenção utilizando um kit de extração de RNA disponível comercialmente e cDNA é sintetizado com transcriptase reversa, utilizando primers aleatórios ou similares. Em seguida, o cDNA que codifica o anticorpo é amplificado por meio de PCR utilizando, como primers, oligonucleotídeos que possuem, respectivamente, sequências conservadas nas regiões variáveis correspondentes de um gene de cadeia leve e gene de cadeia pesada de anticorpo de camundongo conhecido. Sequências que codificam regiões constantes podem ser obtidas por meio da amplificação de sequências conhecidas por meio de PCR. A sequência de nucleotídeos do DNA resultante pode ser determinada por meio de métodos de rotina, tais como por meio de integração em plasmídeo ou fago para sequenciamento.
[00109] A presente invenção fornece ainda polipeptídeos e DNAs descritos em (i) a (xv) a seguir com relação aos anticorpos (i) a (xiv): i. polipeptídeo de CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e um DNA que codifica o polipeptídeo; ii. polipeptídeo de CDR de cadeia leve selecionado a partir das sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e um DNA que codifica o polipeptídeo; iii. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 30, respectivamente; iv. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 15 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 30, respectivamente; v. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 15 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 30, respectivamente; vi. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 13 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 28, respectivamente; vii. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 12 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 27, respectivamente; viii. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 12 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 27, respectivamente; ix. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 13 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 28, respectivamente; x. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 14 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 29, respectivamente; xi. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 11 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26, respectivamente; xii. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 11 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 26, respectivamente; xiii. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 15 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 30, respectivamente; xiv. polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21 e DNA que codifica o polipeptídeo, tal como DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32, respectivamente; e xv. polipeptídeo derivado de qualquer um dos polipeptídeos descritos em (i) a (xiv) que compreende a substituição de um ou mais aminoácidos na região constante de cadeia pesada ou um de seus fragmentos e um DNA que codifica o polipeptídeo ou seu fragmento.
[00110] Esses polipeptídeos e DNAs podem ser preparados, conforme descrito acima, utilizando métodos de recombinação genética.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[00111] A presente invenção descrita acima será resumida abaixo. 1. Anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade de SEQ ID NO: 1, 2 e 3 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação da complementaridade de SEQ ID NO: 4, 5 e 6 e possui reatividade imunológica com proteína CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos. 2. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. 3. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e a região constante de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. 4. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. 5. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 6. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. 7. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. 8. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 9. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. 10. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. 11. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. 12. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. 13. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. 14. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 13, em que o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de fita simples ou anticorpo multiespecífico. 15. Anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 13, em que o anticorpo ou seu fragmento é conjugado a um agente antitumor. 16. Anticorpo de acordo com qualquer um dentre 1 a 15, em que o anticorpo compreende a substituição de um ou mais aminoácidos na sua região constante de cadeia pesada. 17. Anticorpo de acordo com qualquer um dentre 1 a 16, em que o anticorpo é um anticorpo que não possui adição de fucose a N- acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada. 18. Composição de anticorpo que compreende um anticorpo de acordo com 17 e um anticorpo de acordo com qualquer um dentre 1 a 16, que possui adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada. 19. Célula que produz um anticorpo de acordo com 17 ou uma composição de anticorpo de acordo com 18. 20. Composição farmacêutica de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 15, anticorpo de acordo com 16 ou 17 ou composição de anticorpo de acordo com 18 como ingrediente ativo. 21. Composição farmacêutica de acordo com 20, em que o câncer é câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço. 22. Produto de droga de combinação para o tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende uma composição farmacêutica de acordo com 20 ou 21 e uma composição farmacêutica que compreende um agente antitumor. 23. DNA que codifica um anticorpo ou seu fragmento de acordo com qualquer um dentre 1 a 16. 24. Método de tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende a administração de anticorpo ou um de seus fragmentos de acordo com qualquer um dentre 1 a 16, anticorpo de acordo com 17, composição de anticorpo de acordo com 18, composição farmacêutica de acordo com 20 ou 21 ou produto de droga de combinação de acordo com 22 a pacientes.
EXEMPLOS
[00112] A presente invenção será descrita mais especificamente a seguir com referência aos Exemplos. O escopo da presente invenção, entretanto, não se destina a ser limitado por estes exemplos específicos.
EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CAPRIN-1 UTILIZANDO COELHOS
[00113] 300 μg de proteína CAPRIN-1 humana preparada no Exemplo 3 de WO 2010/016526 foram misturados com quantidade igual de um adjuvante completo de Freund e utilizados como solução de antígeno por coelho. Utilizou-se mistura com adjuvante incompleto de Freund na segunda imunização ou posterior. A solução de antígeno foi administrada por via intraperitoneal a cada coelho com doze semanas de idade e administrada em seguida por oito vezes a cada duas a três semanas para completar a imunização. Linfócitos foram obtidos do baço de cada coelho extirpado quatro dias após a imunização final e misturados com células de mieloma de coelho 240E-W2 em razão de 1:2. A uma solução de PEG (aquecida a 37 °C) preparada por meio da mistura de 200 μl de meio RPMI contendo 10% de FBS, foram adicionados 800 μl de PEG1500 e a mistura foi mantida em repouso por cinco minutos em células de fusão. Após a centrifugação e remoção do sobrenadante, as células foram suspensas em 300 ml de meio RPMI contendo 10% de FBS suplementado com solução de HAT (meio seletivo de HAT) em concentração de 2% e inoculadas a 100 μl/cavidade em 80 placas com 96 cavidades. Hibridomas gerados por meio da fusão das células do baço e das células de mieloma de coelho foram obtidos por meio de cultivo a 37 °C por sete dias sob condições de 5% de CO2.
[00114] Hibridomas foram selecionados com base na reatividade de anticorpos produzidos pelos hibridomas preparados com a proteína CAPRIN-1. Uma solução de 1 μg/ml de proteína CAPRIN-1 foi adicionada a 100 μl/cavidade às placas com 96 cavidades e as placas foram mantidas em repouso a 4 °C por dezoito horas. Cada cavidade foi lavada com PBS-T por três vezes. Em seguida, uma solução de 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) foi adicionada a 400 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por três horas. A solução foi removida e as cavidades foram lavadas com 400 μl/cavidade de PBS-T por três vezes. Em seguida, cada sobrenadante de cultivo do hibridoma obtido acima foi adicionado a 100 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por duas horas. Cada cavidade foi lavada com PBS-T por três vezes. Em seguida, anticorpo anticoelho marcado com HRP diluído 5000 vezes com PBS foi adicionado a 100 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Cada cavidade foi lavada com PBS-T por três vezes. Em seguida, adicionou-se uma solução de substrato TMB a 100 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso por quinze a trinta minutos para reação cromogênica. Após o desenvolvimento da coloração, a reação foi encerrada por meio da adição de 1 N ácido sulfúrico a 100 μl/cavidade e os valores de absorção foram medidos a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, foram selecionados diversos hibridomas produtores de anticorpos que exibiram altos valores de absorção.
[00115] Os hibridomas selecionados foram adicionados a 0,5 células por cavidade a placas com 96 cavidades e cultivados. Após uma semana, foram observados hibridomas formando colônias isoladas nas cavidades. As células nessas cavidades foram adicionalmente cultivadas e hibridomas foram selecionados com base na reatividade dos anticorpos produzidos pelos hibridomas clonados com uma proteína CAPRIN-1. Como resultado da avaliação da reatividade de cada anticorpo com a proteína CAPRIN-1 por meio do mesmo procedimento acima, foram obtidas diversas linhagens de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais de coelhos que exibiram reatividade com a proteína CAPRIN-1.
[00116] Em seguida, foram selecionados os anticorpos monoclonais de coelhos que exibiram reatividade com a proteína CAPRIN-1 e que exibem reatividade com a superfície de células de câncer humano sobre as quais foi expressa CAPRIN-1. Especificamente, 2 x 105 células de uma linhagem de células de câncer do pulmão humano QG56 e de uma linhagem de células de câncer de mama humano BT-474 cada (obtidas por meio da ATCC) foram centrifugadas em cada tubo de microcentrifugação de 1,5 ml, aos quais foram então adicionados 100 μl do sobrenadante de cultivo de cada um dos hibridomas. O tubo foi mantido em repouso sobre gelo por uma hora. Após lavagem com PBS, adicionou-se um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com FITC (H+L) ou anti-IgG de coelho marcado com Alexa 488 (H+L) diluído cem vezes com PBS(-) contendo 0,5% de FBS (0,5% FBS-PBS(-)) e o tubo foi mantido em repouso sobre gelo por uma hora. Após lavagem com 0,5% FBS- PBS(-), as células foram suspensas em 0,2 μg/ml de iodeto de propídio e 0,5% FBS-PBS(-) e a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur® ou FACSVerse® (Becton, Dickinson & Company). Por outro lado, o mesmo procedimento acima foi conduzido utilizando um meio de cultivo de hibridomas e o resultado foi empregado como amostra para controle negativo. Como resultado, foi selecionado um anticorpo monoclonal anti- CAPRIN-1 de coelho que exibiu intensidade de fluorescência mais forte que a do controle negativo, ou seja, apresentou reação forte com a superfície celular das células de câncer QG56 e BT-474 sobre a expressão de CAPRIN-1.
[00117] Em seguida, fragmentos de amplificação de genes codificadores de região variável quanto ao anticorpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 de coelho obtido acima foram obtidos de acordo com o método descrito no Exemplo 5 de WO 2010/016526 e analisados para determinar suas sequências genéticas e as sequências de aminoácidos por eles codificadas. Especificamente, mRNA foi extraído do hibridoma produtor do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho e o genes da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) desse anticorpo foram obtidos por meio de PCR RT utilizando primers específicos para as sequências de região variável de coelho. Esses genes foram inseridos em vetores de clonagem e suas sequências de nucleotídeos correspondentes foram determinadas de acordo com método rotineiro.
[00118] Confirmou-se que o anticorpo monoclonal anti- CAPRIN-1 de coelho resultante possui uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 20, em que a região variável de cadeia pesada que contém CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e possui uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 21, em que a região variável de cadeia leve que contém CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.
[00119] Confirmou-se em seguida, a reatividade do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho obtido com várias células de câncer humano. O anticorpo obtido reagiu com células de câncer humano que tiveram confirmada a sua expressão do gene de CAPRIN-1, ou seja, células de câncer de mama (BT-474 e MDA-MB-361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI- N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT- 1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de câncer do córtex adrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiplo (IM-9), células de câncer dos testículos (NT/D1), células de câncer da tireoide (TT) ou células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) e a intensidade de fluorescência foi avaliada por meio de citometria de fluxo. 106 células de cada linhagem de células de câncer foram coletadas em cada tubo de microcentrifugação de 1,5 ml e o sobrenadante de cultivo (100 μl) do hibridoma produtor do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho obtido acima foi adicionado a cada tubo e reagiu a 4 °C por uma hora. Após lavagem com 0,5% FBS- PBS(-), adicionou-se um anticorpo anti-IgG de coelho de cabra marcado com FITC (H+L) (fabricado pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído cinquenta vezes com 0,5% FBS-PBS(-) e o tubo foi mantido em repouso a 4 °C por sessenta minutos. Após lavagem com 0,5% FBS- PBS(-), as células foram suspensas em 0.5% FBS-PBS(-) contendo 0,2 μg/ml (concentração final) de iodeto de propídio e a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur® ou FACSVerse® (Becton, Dickinson & Company). Por outro lado, o mesmo procedimento acima foi conduzido para um controle negativo utilizando um meio de cultivo de hibridomas e o resultado preparado foi empregado como amostra para controle negativo. Como resultado, em todas as células de câncer empregadas na avaliação, a intensidade de fluorescência ao empregar o sobrenadante de cultivo do hibridoma produtor do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho foi mais forte que durante o uso do controle negativo. A partir desses resultados, confirmou-se a reação do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho com CAPRIN-1 sobre a superfície da membrana de célula de câncer de células de câncer humano.
EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CAPRIN-1 QUIMÉRICO DE COELHO-HUMANO
[00120] O gene de expressão da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 20 do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho confirmado no Exemplo 1 e o gene de expressão da região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 21 foram inseridos, respectivamente, em um vetor para expressão em células de mamíferos que contêm um inserto genético da região constante de cadeia pesada de IgG1 humano e um vetor de expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia leve de IgG1 humano. Os dois vetores de expressão recombinante preparados foram transferidos para células de mamíferos de acordo com um método rotineiro e foi obtido um sobrenadante de cultivo que contém um anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de coelho-humano (anticorpo quimérico de coelho-humano). O sobrenadante de cultivo obtido que contém o anticorpo quimerizado foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar o anticorpo quimérico.
EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CAPRIN-1 HUMANIZADOS
[00121] Em seguida, com base na informação sobre as sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos de CDR1 a CDR3 na região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho confirmado no Exemplo 1 e CDR1 a CDR3 na sua região variável de cadeia leve, foi projetada uma sequência de nucleotídeos de forma a poder expressar a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7, em que a região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente. Esta foi inserida em um vetor de expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia pesada de IgG1 humano. De forma similar, foi projetada uma sequência de nucleotídeos para poder expressar a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11, em que a região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. Esta foi inserida em um vetor de expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia leve de IgG1 humano. Esses dois vetores de expressão recombinantes foram transferidos para células de mamíferos de acordo com um método rotineiro e foi obtido um sobrenadante de cultivo que contém o anticorpo humanizado NO: 0 que consiste da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11.
[00122] De forma similar, foi obtido um sobrenadante de cultivo que contém o anticorpo humanizado NO: 1 e consiste da sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 8, em que a região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11.
[00123] De forma similar, foram adicionalmente obtidos sobrenadantes de cultivo que contêm os anticorpos humanizados NO: 2 a 10 a seguir: - anticorpo humanizado NO: 2 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 8 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 12, em que a região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente; - anticorpo humanizado NO: 3 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 8 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 13, em que a região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente; - anticorpo humanizado NO: 4 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 12; - anticorpo humanizado NO: 5 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 13; - anticorpo humanizado NO: 6 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 15, em que a região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente; - anticorpo humanizado NO: 7 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 8 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 15; - anticorpo humanizado NO: 8 que consiste da sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 9, em que a região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 15; - anticorpo humanizado NO: 9 que consiste da sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 10, em que a região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 14, em que a região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente; e - anticorpo humanizado NO: 10 que consiste da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 10 e da sequência de aminoácidos com comprimento total de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 15.
[00124] Cada um dos sobrenadantes de cultivo obtidos que contêm os anticorpos humanizados NO: 0 a NO: 10 foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar os anticorpos humanizados.
EXEMPLO 4 ESPECIFICIDADE DE ANTÍGENOS DE ANTICORPO QUIMÉRICO DE COELHO-HUMANO E ANTICORPOS HUMANIZADOS NO: 0 A 10 E SUA REATIVIDADE COM CÉLULAS DE CÂNCER
[00125] A reatividade específica do anticorpo quimérico de coelho-humano preparado no Exemplo 2 e dos anticorpos humanizados NO: 0 a 10 preparados no Exemplo 3 com a proteína CAPRIN-1 foi confirmada em seguida por meio de ELISA de acordo com método de rotina. Especificamente, em primeiro lugar, uma solução de PBS contendo 5 μg/ml de proteína CAPRIN- 1 foi adicionada a 100 μl/cavidade a placas com 96 cavidades e as placas foram mantidas em repouso a 4 °C por dezoito horas. Cada cavidade foi lavada com PBS-T. Em seguida, adicionou-se uma solução de bloqueio que consiste de uma solução de PBS contendo 5% de leite desnatado a 400 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por três horas. A solução foi removida e cada cavidade foi lavada com PBS-T. Em seguida, uma solução contendo cada um dentre o anticorpo quimérico de coelho-humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 ajustados a 1 μg/ml com PBS contendo 0,2% de leite desnatado foi adicionada a 50 μl/cavidade a cada cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Uma cavidade à qual foi adicionado um anticorpo IgG humano que se confirmou não reagir com a proteína CAPRIN-1 à mesma concentração de anticorpo acima e uma cavidade à qual nenhum anticorpo foi adicionado foram preparadas como controles negativos em conjunto. Cada cavidade foi lavada com PBS-T por três vezes. Em seguida, anticorpo anti-IgG humano marcado com HRP diluído 3000 vezes com PBS contendo 0,2% de leite desnatado foi adicionado a 50 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Cada cavidade foi lavada com PBS-T por três vezes. Em seguida, adicionou-se uma solução de substrato TMB (fabricada pela Thermo Fischer Scientific, Inc.) a 100 μl/cavidade e as placas foram mantidas em repouso por um a trinta minutos para reação cromogênica. Após o desenvolvimento da coloração, a reação foi encerrada por meio da adição de 1 N ácido sulfúrico a 100 μl/cavidade e os valores de absorção foram medidos a 450 nm e 630 nm utilizando um espectrômetro de absorção. Adicionalmente, cavidades sobre as quais a proteína CAPRIN-1 não foi imobilizada (cavidades não imobilizadas) foram preparadas em conjunto e cada anticorpo foi adicionado e testado de forma similar. Como resultado, o valor de absorção da cavidade empregada como controle negativo à qual foi adicionado um anticorpo IgG humano que se confirmou não reagir com a proteína CAPRIN-1 foi tão baixo quanto o da cavidade à qual nenhum anticorpo foi adicionado, enquanto as cavidades às quais foram adicionados o anticorpo quimérico de coelho-humano correspondente e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 exibiram altos valores de absorção equivalentes. O anticorpo quimérico de coelho-humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 nas cavidades sobre as quais a proteína CAPRIN-1 não foi imobilizada exibiram valor de absorção meramente equivalente ao do controle negativo. A partir desses resultados, confirmou-se que o anticorpo quimérico de coelho-humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 reagem especificamente com a proteína CAPRIN-1.
[00126] Confirmou-se em seguida a reatividade do anticorpo quimérico de coelho-humano e dos anticorpos humanizados NO: 0 a 10 que reagem especificamente com a proteína CAPRIN-1 com várias células de câncer humano e células de câncer de camundongo. Cada um dentre o anticorpo quimérico de coelho-humano purificado e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 reagiu com células de câncer humano que tiveram confirmada a sua expressão do gene de CAPRIN-1, ou seja, células de câncer de mama (BT-474 e MDA-MB-361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI-N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT-1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI- AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de câncer do córtex adrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiplo (IM-9), células de câncer dos testículos (NT/D1), células de câncer da tireoide (TT) ou células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) e a intensidade de fluorescência foi avaliada por meio de citometria de fluxo. Especificamente, 5 x 105 células de cada linhagem de células de câncer foram coletadas em cada tubo de microcentrifugação de 1,5 ml e cada um dentre o anticorpo quimérico de coelho-humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 foi adicionado a 50 μg/ml (concentração final) a cada tubo e reagiu a 4 °C por uma hora. Após lavagem por duas vezes com 0,5% FBS-PBS(-), adicionou-se um anticorpo anti-IgG humano de cabra marcado com Alexa 488 (H+L) (fabricado pela Life Technologies Corp.) diluído por cem vezes com 0,5% FBS-PBS(-) e o tubo foi mantido em repouso a 4 °C por sessenta minutos. Após lavagem com 0,5% FBS- PBS(-), as células foram suspensas em 0,5% FBS-PBS(-) contendo 0,2 μg/ml (concentração final) de iodeto de propídio e a intensidade da fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur® ou FACSVerse® (Becton, Dickinson & Company). Por outro lado, o mesmo procedimento acima foi conduzido utilizando um meio de cultivo de hibridomas e o resultado preparado foi empregado como controle negativo. Como resultado, em todas as células de câncer empregadas na avaliação, a intensidade de fluorescência do anticorpo quimérico de coelho-humano e dos anticorpos humanizados NO: 0 a 10 foi mais forte que no caso de uso do controle negativo. A partir desses resultados, confirmou-se que o anticorpo quimérico de coelho-humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 reagem com a proteína CAPRIN-1 expressa sobre a superfície de membrana de células de câncer humano.
EXEMPLO 5 ATIVIDADE ANTITUMORES DE ANTICORPO QUIMÉRICO DE COELHO-HUMANO E ANTICORPOS HUMANIZADOS NO: 0 A 10 CONTRA VÁRIAS CÉLULAS DE CÂNCER HUMANO
[00127] O anticorpo quimérico de coelho-humano preparado no Exemplo 2 e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10 preparados no Exemplo 3 foram avaliados em seguida para determinar seus efeitos antitumores sobre diversas células de câncer humano com base na atividade de ADCC.
[00128] Os anticorpos anti-CAPRIN-1 a seguir foram empregados como anticorpos comparativos para o anticorpo quimérico de coelho- humano e os anticorpos humanizados NO: 0 a 10: - anticorpos descritos em WO 2010/016526, ou seja, anticorpo comparativo 1 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 27 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 2 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 29, em que o anticorpo comparativo 3 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 30 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 31, em que o anticorpo comparativo 4 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 32 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 33, em que o anticorpo comparativo 5 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 35, em que o anticorpo comparativo 6 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 36 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 37, em que o anticorpo comparativo 7 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 38 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 39, em que o anticorpo comparativo 8 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 40 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 41, em que o anticorpo comparativo 9 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 43, em que o anticorpo comparativo 10 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 e o anticorpo comparativo 11 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 46 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 47; - anticorpos descritos em WO 2011/096517, ou seja, anticorpo comparativo 12 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 47 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 13 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 53; - anticorpos descritos em WO 2011/096528, ou seja, anticorpo comparativo 14 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 47 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 15 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 51 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 55, em que o anticorpo comparativo 16 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 59 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 63, em que o anticorpo comparativo 17 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 80, em que o anticorpo comparativo 18 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 88 e o anticorpo comparativo 19 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 92 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 96; - anticorpo descrito em WO 2011/096519, ou seja, anticorpo comparativo 20 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 46 nesta literatura; - anticorpos descritos em WO 2011/096533, ou seja, anticorpo comparativo 21 que contém região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 22 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 47 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51 e o anticorpo comparativo 23 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 67; - anticorpos descritos em WO 2011/096534, ou seja, anticorpo comparativo 24 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 47 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 25 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51 e o anticorpo comparativo 26 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 67; - anticorpos descritos em WO 2013/018894, ou seja, anticorpo comparativo 27 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 28 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 23, em que o anticorpo comparativo 29 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 53, em que o anticorpo comparativo 30 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 58 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 62, em que o anticorpo comparativo 31 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 65, em que o anticorpo comparativo 32 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 69 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 73 e o anticorpo comparativo 33 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 77 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 81; - anticorpo descrito em WO 2013/018892, ou seja, anticorpo comparativo 34 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 nesta literatura; - anticorpo descrito em WO 2013/018891, ou seja, anticorpo comparativo 35 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 nesta literatura; - anticorpo descrito em WO 2013/018889, ou seja, anticorpo comparativo 36 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 nesta literatura; - anticorpo descrito em WO 2010/018883, ou seja, anticorpo comparativo 37 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 nesta literatura; - anticorpo descrito em WO 2013/125636, ou seja, anticorpo comparativo 38 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 nesta literatura; - anticorpos descritos em WO 2013/125654, ou seja, anticorpo comparativo 39 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 52 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 54 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 40 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 23, em que o anticorpo comparativo 41 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 23, em que o anticorpo comparativo 42 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 18, em que o anticorpo comparativo 43 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 33, em que o anticorpo comparativo 44 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 43 e o anticorpo comparativo 45 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 49 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 43; - anticorpo descrito em WO 2013/125630, ou seja, anticorpo comparativo 46 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15 nesta literatura; e - anticorpos descritos em WO 2013/125640, ou seja, anticorpo comparativo 47 que contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15 nesta literatura, em que o anticorpo comparativo 48 contém uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 25.
[00129] Cada um dos anticorpos comparados mencionados acima (anticorpos comparativos 1 a 48) foi preparado conforme segue: o gene de expressão da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e o gene de expressão da região variável de cadeia leve foram inseridos, respectivamente, em um vetor pcDNA4/myc-His para expressão em células de mamíferos (fabricado pela Life Technologies Corp.) que contém um inserto genético da região constante de cadeia pesada de IgG1 humano e um vetor pcDNA3.1/myc-His para expressão em células de mamíferos (fabricado pela Life Technologies Corp.) que contém um inserto genético da região constante de cadeia leve de IgG1 humano; os dois vetores de expressão recombinantes preparados foram transferidos para células de mamíferos de acordo com um método rotineiro; o anticorpo humanizado ou quimerizado humano obtido foi purificado utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.); o tampão foi substituído por PBS(- ); e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.).
[00130] Uma cavidade à qual se adicionou um anticorpo controle de isotipo, uma cavidade à qual não foi adicionado nenhum anticorpo e uma cavidade à qual foi adicionado um anticorpo que reage com a proteína CAPRIN-1, mas não exibe reatividade com a superfície de células de câncer humano sobre as quais CAPRIN-1 foi expressa, foram preparadas como controles negativos. Cada anticorpo foi adicionado a 5 μg/ml (concentração final) a placas com 96 cavidades com fundo em V.
[00131] Células NK humanas separadas de células mononucleares do sangue periférico humano utilizando um método rotineiro foram utilizadas como células efetoras. As células mononucleares do sangue periférico humano foram separadas utilizando uma solução de separação com gravidade específica Histopaque para separação de células mononucleares do sangue periférico (Sigma-Aldrich Corp.) e reagiram com anticorpos (anticorpo anti-CD3 humano, anticorpo anti-CD20 humano, anticorpo anti-CD19 humano, anticorpo anti-CD11c humano e anticorpo anti-HLA-DR (BD Pharmingen) marcados com uma tintura fluorescente FITC. Uma população celular que contém células NK que não foram manchadas com esses anticorpos foi separada utilizando um selecionador celular (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson & Company)). Alternativamente, foi utilizada uma população celular separada utilizando um kit de separação de células NK humanas (fabricado pela Miltenyi Biotec K. K.). Foram preparadas as placas com 96 cavidades e fundo em V às quais foi adicionado cada um dos anticorpos e as células NK humanas foram adicionadas a 0,4 até 2,0 x 105 células/cavidade.
[00132] Células de câncer de mama (BT-474 e MDA-MB- 361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI-N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT-1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), câncer do córtex adrenal (A-673), tumor de Ewing (RD-ES), linfoma de Hodgkin (RPMI1666), mesotelioma (NCI-H2452), mieloma múltiplo (IM-9), câncer dos testículos (NT/D1), câncer da tireoide (TT) e câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) foram utilizadas como células alvo. 106 células de cada linhagem de células de câncer humano mencionadas acima foram coletadas em cada tubo centrífugo de 50 ml. 100 μCi de cromo 51 (fabricado pela PerkinElmer, Inc.) foram adicionados e o tubo foi incubado a 37 °C por uma hora. Em seguida, as células foram lavadas com meio RPMI1640 contendo 10% de FBS por três vezes, adicionadas a 2 x 103 células/cavidade às placas com 96 cavidades e fundo em V às quais foram adicionadas as células efetoras e cada anticorpo conforme descrito acima e reagiram a 37 °C por quatro horas sob condições de 5% de CO2. Após a reação, 50 μl de um sobrenadante de cultivo contendo cromo 51 liberado para o sobrenadante de cultivo por células de câncer danificadas foram recuperados de cada cavidade e adicionados a LumaPlate-96 (fabricado pela PerkinElmer, Inc.) com o fundo de cada cavidade revestido com um cintilador sólido e secos. A quantidade de cromo 51 liberada para o sobrenadante de cultivo por células de câncer danificadas foi medida para calcular os efeitos antitumores dos anticorpos anti- CAPRIN-1 sobre as células cancerosas.
[00133] Como resultado, para as células de câncer de mama (BT-474), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 54% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 50% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 46% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 25% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 10% ou menos.
[00134] Para as células de câncer de mama (MDA-MB-361), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 52% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 45% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 40% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 25% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00135] Para as células de câncer colorretal (HT-29), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 43% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 40% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 35% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 3% ou menos.
[00136] Para as células de câncer do pulmão (QG56), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 46% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 42% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 38% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 22% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 10% ou menos.
[00137] Para as células de câncer do estômago (NCI-N87), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 45% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 38% ou mais e o anticorpo NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 34% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 8% ou menos.
[00138] Para as células de câncer uterino (HEC-1-A), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 52% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 45% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 40% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00139] Para as células de câncer da próstata (22Rv1), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 49% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 45% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 38% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 12% ou menos.
[00140] Para as células de câncer pancreático (Panc10.5), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 30% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 24% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 2% ou menos.
[00141] Para as células de câncer do fígado (Hep3B), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 28% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 25% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 21% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 12% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00142] Para as células de câncer do ovário (SKOV3), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 31% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 27% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00143] Para as células de câncer renal (Caki-2), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 37% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 33% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 26% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00144] Para as células de tumor cerebral (U-87MG), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 36% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 29% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 24% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00145] Para as células de câncer da bexiga (T24), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 36% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 33% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 30% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00146] Para as células de câncer da bexiga (HT-1376), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 45% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 40% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 28% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 7% ou menos.
[00147] Para as células de câncer do esôfago (OE33), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 33% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 30% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00148] Para as células de leucemia (OCI-AML5), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 20% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 18% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 15% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00149] Para as células de linfoma (Ramos), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 20% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 18% ou mais e o anticorpo NO: 9, o anticorpo NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 15% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00150] Para as células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 30% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 25% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00151] Para as células de fibrossarcoma (HT-1080), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 30% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 25% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 20% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00152] Para as células de melanoma (G-361), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 25% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 21% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 15% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 8% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00153] Para as células de câncer do córtex adrenal (A-673), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 50% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 46% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 40% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 8% ou menos.
[00154] Para as células de tumor de Ewing (RD-ES), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 48% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 40% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 31% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00155] Para as células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 40% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 36% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 30% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00156] Para as células de mesotelioma (NCI-H2452), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 39% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 31% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00157] Para as células de mieloma múltiplo (IM-9), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 35% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 30% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 27% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 10% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 6% ou menos.
[00158] Para as células de câncer dos testículos (NT/D1), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 37% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 30% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 25% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 11% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00159] Para as células de câncer da tireoide (TT), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 42% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 35% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 30% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 15% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 5% ou menos.
[00160] Para as células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu), o anticorpo humanizado NO: 7, o anticorpo humanizado NO: 10 e o anticorpo humanizado NO: 6 exibiram efeito antitumores de 50% ou mais, o anticorpo humanizado NO: 3, o anticorpo humanizado NO: 4, o anticorpo humanizado NO: 2 e o anticorpo humanizado NO: 5 exibiram atividade de 40% ou mais e o anticorpo humanizado NO: 9, o anticorpo humanizado NO: 1, o anticorpo humanizado NO: 0, o anticorpo quimérico de coelho-humano e o anticorpo humanizado NO: 8 exibiram atividade de 35% ou mais. Por outro lado, todos os anticorpos comparativos 1 a 48 exibiram atividade de 20% ou menos e todos os grupos controle negativos exibiram atividade de 8% ou menos.
[00161] Estes resultados demonstraram que os anticorpos humanizados NO: 0 a NO: 10 e o anticorpo quimérico de coelho-humano exibem efeito antitumores significativamente mais forte sobre câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço que o dos anticorpos comparativos.
[00162] Além disso, os anticorpos humanizados NO: 0 a NO: 10 e o anticorpo quimérico de coelho-humano exibem efeito antitumores significativamente mais forte sobre câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço conforme descrito acima que o de todos os anticorpos contra CAPRIN-1 descritos nos Exemplos de WO 2010/016526, WO 2011/096517, WO 2011/096528, WO 2011/096519, WO 2011/096533, WO 2011/096534, WO 2011/096535, WO 2013/018886, WO 2013/018894, WO 2013/018892, WO 2013/018891, WO 2013/018889, WO 2013/018883, WO 2013/125636, WO 2013/125654, WO 2013/125630, WO 2013/125640, WO 2013/147169 e WO 2013/147176.
[00163] O efeito antitumores foi exibido na forma de atividade citotóxica contra as linhagens de células de câncer que foi determinada por meio da mistura de cada anticorpo contra CAPRIN-1, células efetoras e células alvo incorporadas a cromo 51, cultivo das células por quatro horas e da medição da quantidade de cromo 51 liberada para o meio após o cultivo, seguida pelo cálculo de acordo com a fórmula* a seguir: * Fórmula: atividade citotóxica (%) = (quantidade de cromo 51 liberada das células alvo quando são adicionados o anticorpo contra CAPRIN-1 e células efetoras - quantidade de cromo 51 liberada naturalmente das células alvo) / (quantidade de cromo 51 liberada das células alvo às quais se adiciona 1 N ácido clorídrico - quantidade de cromo 51 liberada naturalmente das células alvo) x 100.
EXEMPLO 6-1
[00164] Preparação de anticorpos monoclonais anti- CAPRIN-1 humanizados nos quais o aminoácido em região constante de cadeia pesada foi substituído:
[00165] Anticorpos anti-CAPRIN-1 que possuem uma região constante de cadeia pesada descrita em SEQ ID NO: 33, na qual uma parte dos aminoácidos na região constante de cadeia pesada do anticorpo humanizado NO: 0, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 ou NO: 10 obtido no Exemplo 3 foi substituída (denominada a seguir anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados). DNA que codifica a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada que possui a região constante de cadeia pesada mencionada acima e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 foi sintetizado e inserido em um vetor para expressão em células de mamíferos de acordo com um método rotineiro. Além disso, DNA que codifica os aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foi inserido em um vetor de expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético que codifica a região constante de cadeia leve de IgG1 humano para preparar um vetor de expressão recombinante. Os dois vetores de expressão recombinantes preparados foram transferidos para células de mamíferos de acordo com um método rotineiro e foi obtido um sobrenadante de cultivo de anticorpo anti- CAPRIN-1 do tipo I elaborado NO: 0 do anticorpo humanizado NO: 0. Sobrenadantes de cultivo que contêm anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10 descritos no Exemplo 3 foram adicionalmente obtidos da mesma forma acima para os anticorpos humanizados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10, respectivamente. Cada um dos sobrenadantes de cultivo obtidos que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10 foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados.
[00166] Em seguida, foram preparados anticorpos anti- CAPRIN-1 que possuem uma região constante de cadeia pesada descrita em SEQ ID NO: 34, na qual uma parte dos aminoácidos na região constante de cadeia pesada do anticorpo humanizado NO: 0, NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 ou NO: 10 obtido no Exemplo 3 foi substituída (denominados a seguir anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados). DNA que codifica a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada que possui a região constante de cadeia pesada mencionada acima e uma região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 foi sintetizado e foi inserido em um vetor para expressão em células de mamíferos de acordo com um método rotineiro. Além disso, conforme preparado acima, DNA que codifica os aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foi inserido em um vetor de expressão em células de mamíferos que possuem um inserto de gene que codifica a região constante de cadeia leve de IgG1 humano para preparar um vetor de expressão recombinante. Esses dois vetores de expressão recombinantes foram transferidos para células de mamíferos de acordo com um método rotineiro e foi obtido um sobrenadante de cultivo de anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborado NO: 0. Sobrenadantes de cultivo que contêm anticorpos anti- CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10 descritos no Exemplo 3 foram adicionalmente obtidos da mesma forma acima para os anticorpos humanizados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10, respectivamente. Cada um dos sobrenadantes de cultivo obtidos que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10 foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados.
EXEMPLO 6-2
[00167] Preparação de anticorpos anti-CAPRIN-1 que possuem cadeia de açúcar sem fucose adicionada a N-acetilglucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada.
[00168] Em seguida, anticorpos anti-CAPRIN-1 que possuem uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N-acetilglucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeos ligadas à região constante de cadeia pesada do anticorpo humanizado NO: 0, NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 ou NO: 10 obtido no Exemplo 3 (denominados a seguir anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados) foram obtidos por meio do método a seguir: um vetor de expressão de células de mamíferos que contém gene de resistência a neomicina que abriga um gene de GDP-6-deóxi-D-lixo-4-hexulose reductase (RMD), que é uma enzima que não catalisa a reação de conversão de GDP-6-deóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose, foi transferido para células CHO da linhagem de células de mamíferos de acordo com um método rotineiro empregando um reagente de transfecção Reagente FreeStyle® MAX (Life Technologies Corp.). As células de CHO transfectadas foram cultivadas em um meio contendo G-418 para preparar um conjunto estável de células de CHO que expressam RMD. A partir deste conjunto estável, sete células de CHO que expressam constitutivamente RMD foram clonadas por meio do método de diluição por limitação. O nível de expressão genética de RMD em cada uma das sete células de RMD-CHO clonadas foi avaliado três vezes em semanas alternadas por meio de PCR quantitativa para selecionar células de CHO constitutivamente e expressando de forma estável o gene RMD (células de RMD-CHO). Da mesma forma que no Exemplo 3, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e o gene que codifica os aminoácidos da região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foram transferidos, respectivamente, por meio de um vetor para expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia pesada de IgG1 humano e um vetor para expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia leve de IgG1 humano para as células de RMD-CHO que expressam constitutivamente RMD de acordo com um método rotineiro e foi obtido um sobrenadante de cultivo que contém anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborado NO: 0. Sobrenadantes de cultivo que contêm anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10 descritos no Exemplo 3 foram adicionalmente obtidos da mesma forma acima para os anticorpos humanizados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10, respectivamente. Cada um dos sobrenadantes de cultivo obtidos que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar uma composição de anticorpo que contém o anticorpo anti- CAPRIN-1 do tipo III elaborado NO: 0. De forma similar, foram obtidos produtos purificados de anticorpos contendo anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 1 a NO: 10. A proporção do anticorpo anti-CAPRIN-1 que contém uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada contidas em cada uma dessas composições de anticorpos purificadas foi avaliada utilizando LabChip® GXII (Perkin Elmer, Inc.) e, consequentemente, foi de 80% ou mais em todos os casos.
[00169] Da mesma forma que no Exemplo 3, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 7 e o gene que codifica os aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foram transferidos, respectivamente, por meio de um vetor que contém gene de resistência à higromicina para expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia pesada de IgG1 humano e um vetor que contém gene de resistência à higromicina para expressão em células de mamíferos que possuem um inserto genético da região constante de cadeia leve de IgG1 humano para as células de RMD-CHO de acordo com um método rotineiro e as células resultantes foram cultivadas em um meio contendo higromicina B para preparar um conjunto estável que expressa o anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborado NO: 0. A partir deste conjunto estável, células que expressam de forma estável e constitutiva o anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborado NO: 0 foram preparadas por meio do método de diluição por limitação. A proporção do anticorpo anti-CAPRIN-1 que contém uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada contidas em cada uma das composições de anticorpos purificadas que compreendem os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 produzidos pelas células correspondentes foi avaliada utilizando LabChip® GXII (Perkin Elmer, Inc.) e, consequentemente, foi de 80% ou mais em todos os casos.
EXEMPLO 6-3
[00170] Preparação de anticorpos anti-CAPRIN-1 que possuem substituição de aminoácidos em região constante de cadeia pesada e possuem cadeia de açúcar sem fucose adicionada a N-acetilglucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada:
[00171] Em seguida, foram preparados anticorpos anti- CAPRIN-1 que possuem uma região constante de cadeia pesada descrita em SEQ ID NO: 34 na qual uma parte de aminoácidos na região constante de cadeia pesada do anticorpo humanizado NO: 0, NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 ou NO: 10 descrito no Exemplo 3 foi substituída e que possuem uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N- acetilglucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada do anticorpo (denominados a seguir anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados). DNA que codifica a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada que possui a região constante de cadeia pesada variante preparada no Exemplo 6-1 e a região variável de cadeia pesada de IgG1 humano representada por SEQ ID NO: 7 foi sintetizado e inserido em um vetor de expressão em células de mamíferos de acordo com um método rotineiro, enquanto DNA que codifica os aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foi sintetizado e inserido em um vetor para expressão em células de mamíferos que possuem um inserto de gene codificador dos aminoácidos da região constante de cadeia leve de IgG1 humano e os vetores resultantes foram transferidos para as células RMD-CHO que expressam constitutivamente GDP-6-deóxi-D-lixo-4-hexulose reductase (RMD) preparada no Exemplo 6-2. Foi obtido um sobrenadante de cultivo de anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborado NO: 0 do anticorpo humanizado NO: 0. Sobrenadantes de cultivo que contêm anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10 foram adicionalmente obtidos da mesma forma acima para os anticorpos humanizados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10, respectivamente, descrita no Exemplo 3. Cada um dos sobrenadantes de cultivo obtidos que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 foi purificado de acordo com um método rotineiro utilizando Proteína Hitrap A Sepharose FF (fabricada pela GE Healthcare Japan Corp.). O tampão foi substituído por PBS(-) e o resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm (fabricado pela Merck Millipore Corp.) para preparar uma composição de anticorpo que contém o anticorpo anti- CAPRIN-1 do tipo IV elaborado NO: 0. De forma similar, foram obtidos produtos purificados de anticorpos que contêm anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 1 a NO: 10. A proporção do anticorpo anti-CAPRIN-1 que contém uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada contidas em cada uma dessas composições de anticorpos purificadas foi avaliada utilizando LabChip® GXII (Perkin Elmer, Inc.) e, consequentemente, foi de 80% ou mais em todos os casos.
[00172] DNA que codifica a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada que possui a região constante de cadeia pesada modificada preparada no Exemplo 6-1 e a região variável de cadeia pesada de IgG1 humano representada por SEQ ID NO: 7 foi sintetizado e inserido em um vetor que contém gene de resistência à higromicina para expressão em células de mamíferos de acordo com um método rotineiro, enquanto DNA que codifica os aminoácidos de uma região variável de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 11 foi sintetizado e inserido em um vetor que contém gene de resistência à higromicina para expressão em células de mamíferos que contêm um inserto de gene codificador dos aminoácidos da região constante de cadeia leve de IgG1 humano e os vetores resultantes foram transferidos para as células. As células foram cultivadas em um meio que contém higromicina B para preparar um conjunto estável que expressa anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborado NO: 0. A partir deste conjunto estável, células que expressam de forma estável e constitutiva o anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborado NO: 0 foram preparadas por meio do método de diluição por limitação. Células que expressam de forma estável e constitutiva anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10 foram adicionalmente preparadas da mesma forma acima para os anticorpos humanizados NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7, NO: 8, NO: 9 e NO: 10, respectivamente, descritos no Exemplo 3. A proporção do anticorpo anti-CAPRIN-1 que contém uma cadeia de açúcar sem adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar entre todas as cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo ligadas à região constante de cadeia pesada contidas em cada uma das composições de anticorpos purificadas que compreendem os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 produzidos pelas células correspondentes foi avaliada utilizando LabChip® GXII (Perkin Elmer, Inc.) e, consequentemente, foi de 80% ou mais em todos os casos.
EXEMPLO 7 ESPECIFICIDADE DE ANTÍGENOS DE ANTICORPOS ANTI-CAPRIN-1 DO TIPO ELABORADO E SUA REATIVIDADE COM CÉLULAS DE CÂNCER
[00173] A reatividade específica dos anticorpos anti- CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10, as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 e as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 (denominados a seguir anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado) preparadas nos Exemplos 6-1 a 6-3 com a proteína CAPRIN-1 foi confirmada da mesma forma que no Exemplo 4. Como resultado, o valor de absorção da cavidade à qual foi adicionado um anticorpo IgG humano que se confirmou não reagir com a proteína CAPRIN-1, utilizado como controle negativo, foi tão baixo quanto o da cavidade à qual nenhum anticorpo foi adicionado, enquanto todas as cavidades às quais foram adicionados os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado, respectivamente, exibiram altos valores de absorção equivalentes. Todos os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado nas cavidades sobre as quais a proteína CAPRIN-1 não foi imobilizada exibiram valor de absorção meramente equivalente ao do controle negativo. A partir desses resultados, confirmou-se que todos os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado reagem especificamente com a proteína CAPRIN-1.
[00174] Em seguida, a reatividade de cada anticorpo anti- CAPRIN-1 do tipo elaborado com várias células de câncer humano foi confirmada da mesma forma que no Exemplo 4. Células de câncer de mama (BT-474 e MDA-MB-361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI-N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT-1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de câncer do córtex adrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiplo (IM-9), células de câncer dos testículos (NT/D1), células de câncer da tireoide (TT) e células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) foram utilizadas nesta avaliação. Como resultado, a intensidade de fluorescência de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado foi mais forte em todas as células de câncer empregadas na avaliação que no caso de uso do controle negativo. A partir desses resultados, confirmou-se que todos os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado reagem especificamente com a proteína CAPRIN-1 presente sobre a superfície de membrana de células de câncer humano.
EXEMPLO 8 ATIVIDADE ANTITUMORES DE ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 DO TIPO ELABORADO CONTRA VÁRIAS CÉLULAS DE CÂNCER HUMANO
[00175] Os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado (os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10, as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 e as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10) preparados nos Exemplos 6-1 a 6-3 foram avaliados para determinar seus efeitos antitumores sobre várias células de câncer humano com base na atividade de ADCC da mesma forma que no Exemplo 5. Uma cavidade à qual se adicionou um anticorpo controle de isotipo, uma cavidade à qual não foi adicionado nenhum anticorpo e uma cavidade à qual foi adicionado um anticorpo que reage com a proteína CAPRIN-1, mas não exibe reatividade com a superfície de células de câncer humano sobre as quais CAPRIN-1 foi expresso, foram preparadas como controles negativos. Os anticorpos humanizados NO: 0 a NO: 10, que foram os anticorpos anti-CAPRIN-1 não elaborados correspondentes, foram utilizados como anticorpos comparativos. Cada anticorpo foi adicionado a 0,01 a 1 μg/ml (concentração final) a placas com 96 cavidades e fundo em V.
[00176] Células de câncer de mama (BT-474 e MDA-MB- 361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI-N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT-1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de câncer do córtex adrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiplo (IM-9), células de câncer dos testículos (NT/D1), células de câncer da tireoide (TT) e células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) foram utilizadas como células alvo. 106 células de cada linhagem de células de câncer humano mencionada acima foram coletadas em cada tubo centrífugo de 50 ml. 100 μCi de cromo 51 (fabricado pela PerkinElmer, Inc.) foram adicionados e o tubo foi incubado a 37 °C por uma hora. Em seguida, as células foram lavadas com meio RPMI1640 contendo 10% de FBS por três vezes, adicionadas a 2 x 103 células/cavidade às placas com 96 cavidades e fundo em V às quais se adicionou cada um dos anticorpos e reagiram.
[00177] Células NK humanas separadas de células mononucleares do sangue periférico humano utilizando um método rotineiro foram utilizadas como células efetoras. As células NK humanas adicionadas a 0,4 a 2,0 x 105 células/cavidade às placas com 96 cavidades e fundo em V às quais adicionou-se cada um dos anticorpos e as células alvo humanas foram preparadas e reagiram a 37 °C por quatro horas sob condições de 5% de CO2. Após a reação, 50 μl de um sobrenadante de cultivo contendo cromo 51 liberado por células de câncer lesionadas foram recuperados de cada cavidade. A quantidade de cromo 51 liberada para o sobrenadante de cultivo a partir de células de câncer lesionadas foi medida da mesma forma que no Exemplo 5 para calcular os efeitos antitumores dos anticorpos anti-CAPRIN-1 sobre as células de câncer.
[00178] Como resultado, para as células de câncer de mama (BT-474), os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado, ou seja, os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10, as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 e cada uma das composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 exibiu efeito antitumores mais forte que o dos controles negativos. Os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, os anticorpos anti-CAPRIN-I do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10 e as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti- CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 exibiram o mesmo nível do efeito antitumores exibido pelos anticorpos não elaborados correspondentes (anticorpos humanizados NO: 0 a NO: 10) utilizados como anticorpos comparativos, que foram concentrações de cerca de 1/13 a 1/20 das concentrações de anticorpos não elaboradas, respectivamente. Para que as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti- CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 atinjam o mesmo nível de efeito antitumores dos anticorpos não elaborados correspondentes, as concentrações foram cerca de 1/150 das concentrações de anticorpos não elaborados, respectivamente. Esses resultados demonstraram que os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo elaborado (os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10 e as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10 e os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10) exibem aumento da atividade antitumores em comparação com os anticorpos não elaborados correspondentes. Estes resultados também demonstraram que as composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti- CAPRIN-1 do tipo IV elaborados NO: 0 a NO: 10 produzem efeito antitumores mais forte que o dos anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo I elaborados NO: 0 a NO: 10, dos anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo II elaborados NO: 0 a NO: 10 e das composições de anticorpos correspondentes que contêm os anticorpos anti-CAPRIN-1 do tipo III elaborados NO: 0 a NO: 10.
[00179] Além disso, foi obtido efeito antitumores mais forte similar para as células de câncer de mama (MDA-MB-361), células de câncer colorretal (HT-29), células de câncer do pulmão (QG56), células de câncer do estômago (NCI-N87), células de câncer uterino (HEC-1-A), células de câncer da próstata (22Rv1), células de câncer pancreático (Panc10.5), células de câncer do fígado (Hep3B), células de câncer do ovário (SKOV3), células de câncer renal (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células de câncer da bexiga (T24 e HT-1376), células de câncer do esôfago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de câncer da vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrossarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de câncer do córtex adrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiplo (IM-9), células de câncer dos testículos (NT/D1), células de câncer da tireoide (TT) e células de câncer da cabeça e do pescoço (FaDu) utilizadas na avaliação.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00180] O anticorpo de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento e/ou prevenção de câncer.
[00181] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Claims (11)

1. ANTICORPO, caracterizado por compreender: - uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade de SEQ ID NO: 1, 2 e 3; e - uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade de SEQ ID NO: 4, 5 e 6; e - ue possui reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou um de seus fragmentos.
2. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: (i) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; ou (ii) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; ou (iii) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; ou (iv) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; ou (v) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; ou (vi) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; ou (vii) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; ou (viii) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ix) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ou (x) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ou (xi) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; ou (xii) a região variável de cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e a região variável de cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
3. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de fita simples ou um anticorpo multiespecífico.
4. ANTICORPO, ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento ser conjugado a um agente antitumor.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a substituição de um ou mais aminoácidos na sua região constante de cadeia pesada.
6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser desprovido da adição de fucose a N- acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada.
7. COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO, caracterizada por compreender um anticorpo conforme definido na reivindicação 6 e um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 que possui adição de fucose a N-acetilglicosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo ligada à região constante de cadeia pesada.
8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 6, ou uma composição de anticorpo conforme definida na reivindicação 7, como um ingrediente ativo, e um ou mais veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis.
9. DNA, caracterizado por codificar um anticorpo, conforme definido na reivindicação 2, (i) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 30; (ii) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 30; (iii) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 30; (iv) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 28; (v) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 27; (vi) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 27; (vii) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 28; (viii) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 29; (ix) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 26; (x) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 26; (xi) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 30; (xii) compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32.
10. USO DE UM ANTICORPO, ou de um fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um anticorpo, conforme definido na reivindicação 6, uma composição de anticorpo, conforme definida na reivindicação 7, uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 8, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir câncer.
11. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer do pulmão, tumor cerebral, câncer do estômago, câncer uterino, câncer do ovário, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do esôfago, leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer da vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, câncer do córtex adrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer dos testículos, câncer da tireoide ou câncer da cabeça e do pescoço.
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