BR112014013649A2 - métodos e agentes para o tratamento de doenças virais e usos dos referidos agentes - Google Patents

Abstract

métodos e agentes para o tratamento de doenças virais e usos dos referidos agentes. a invenção refere-se a um método para o tratamento de infecções e coinfecções virais através do uso de agentes inibitórios que impedem que motivos de uma proteína estrutural viral ímpar se liguem a proteínas hospedeiras provenientes da família de proteínas adaptadoras de clatrina e subsequentemente previnem a replicação viral.

Description

"MÉTODOS E AGENTES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS VIRAIS E USOS DOS REFERIDOS AGENTES". Referência cruzada a Pedidos relacionados

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US Série Nº 61/567.491, depositado em 6 de dezembro de 2011, cujo re- latório está aqui incorporado em sua integridade a título de referência. Declaração Referente à Pesquisa Patrocinada pelo Governo Federal

[0002] Esta invenção foi feita com o patrocínio do governo segun- do o contrato AIO79406 conferido pelo National Institutes of Health. O governo possui certos direitos nesta invenção. Campo da Invenção

[0003] A presente invenção refere-se à virologia. Mais especifica- mente, a invenção refere-se ao tratamento de doenças virais através da inibição de interações de proteínas adaptadoras de clatrina da célu- la hospedeira e motivos YXXO& ou dileucina virais ou sua regulação. Antecedentes da Invenção

[0004] Infecções humanas com Lentiviridae, tais como HIV, e Fla- viviridae, tais como HCV, apresentam desafios significativos para a saúde global. Embora drogas anti-HCV potentes se encontrem em de- senvolvimento clínico e os índices de resposta a regimes à base de interferon tenham melhorado com a inclusão de inibidores de protease (PI), a resistência, as interações droga-droga, e a toxicidade cumulati- va continuam lançando desafios. Estratégias antivirais mais eficazes continuam, portanto, sendo necessárias para combater a pandemia de HCV. Além disso, são necessárias novas estratégias antivirais para inclusão em regimes de recuperação para o tratamento de HIV em pa- cientes que não respondem à terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) devido à resistência do vírus. Sumário da Invenção

[0005] Em resumo, as modalidades desta descrição incluem com-

postos, composições, composições farmacêuticas, e métodos de tra- tamento de um hospedeiro com uma infecção viral. Em uma modalida- de, vírus suscetíveis de acordo com a presente invenção incluem vírus compreendendo pelo menos uma proteína compreendendo um motivo YXXO ou um motivo dileucina, doravante denominados "vírus fixadores de AP de clatrina", Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções por HCV/HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatrina que não HCV, métodos de tratamento da replicação de tais vírus em um hospedeiro, métodos de inibição da ligação de uma proteína estrutural viral compreendendo os motivos YXX&S ou dileucina às subunidades u hospedeira de complexos AP1-AP4 de clatrina, tais como AP2M1, AP1IM1, AP3M1, ou AP4AM1, e métodos de tratamento de fibrose hepática relacionada com hepatite viral em um hospedeiro, entre outros.

[0006] Um método exemplificativo de tratamento de um hospedeiro com uma infecção viral deccorente de vírus fixadores de AP de clatri- na, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coin- fecções por HCV/HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatrina que não HCV, entre outros, pode incluir: administrar ao hospedeiro uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibitório para reduzir a carga viral no hospedeiro. Em uma modalidade, o agente ini- bitório é selecionado do grupo que consiste em agentes que inibem competitivamente a ligação entre uma proteína viral compreendendo os motivos YXXOS ou dileucina e uma proteína hospedeira selecionada do grupo que consiste nas subunidades u de AP1-AP4 de clatrina; e agentes que inibem a atividade de quinase proteica hospedeira das quinases que modulam a atividade de proteínas hospedeiras selecio- nadas do grupo que consiste em subunidades u de AP1-AP4 de clatri-

na. Um método exemplificativo de tratamento de infecção viral de vírus fixadores de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coin- fecções, tais como coinfecções por HCV/HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatrina que não HCV, em um hospedeiro, entre outros, pode incluir: administrar um agente inibitório ao hospedeiro tendo tal infecção ou infecções virais. Em uma modalidade, o agente inibitório é selecionado do grupo que consiste em agentes que inibem competitivamente a ligação entre uma proteína estrutural viral compre- endendo os motivos YXX&S ou dileucina e uma proteína hospedeira se- lecionada do grupo que consiste em AP2M1, e agentes que inibem a atividade de quinase proteica hospedeira das quinases que modulam a atividade de proteínas hospedeiras selecionadas do grupo que consis- te em AP2M1 e outras subunidades u de complexos de AP de clatrina. Em algumas modalidades, esses inibidores inibem GAK (quinase as- sociada à clicina G) ou AAK1 (quinase 1 associada ao adaptador 1), que incluem compostos tais como erlotinib, sunitinib, ou PKC-412. Por- tanto, os agentes inibitórios pertencem a duas classes: (1) inibidores de ligação competitivos; e (2) agentes que inibem a atividade de qui- nase proteica hospedeira das quinases que modulam a atividade de de proteínas hospedeiras tais como AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de clatrina.

[0007] Um método exemplificativo de inibição da ligação dos moti- vos YXXOS ou dileucina a polipeptídios hospedeiros, entre outros, inclui administrar um agente inibitório ao hospedeiro tendo a viral infecção. Em uma modalidade, o agente inibitório é selecionado do grupo que consiste em agentes que inibem competitivamente a ligação entre uma proteína estrutural viral compreendendo os motivos YXX&S ou dileucina e uma proteína hospedeira selecionada dentre AP2M1 ou outras subu- nidades u de complexos de AP de clatrina, e agentes que inibem a ati-

vidade de quinase proteica de quinases que modulam a atividade de proteínas hospedeiras selecionadas do grupo que consiste em AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de clatrina.

[0008] Uma composição farmacêutica exemplificativa para tratar um hospedeiro tendo uma infecção viral de vírus fixadores de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções por HCV/HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatri- na que não HCV, entre outros, pode incluir um agente inibitório. Em uma modalidade, o agente inibitório é selecionado do grupo que con- siste em agentes que inibem competitivamente a ligação entre uma proteína estrutural viral compreendendo os motivos YXX&S ou dileucina e uma proteína hospedeira selecionada dentre AP2M1 e/ou outras su- bunidades u de complexos de AP de clatrina, e agentes que inibem a atividade de quinase proteica de quinases que modulam a atividade de proteínas hospedeiras secretadas do grupo que consiste em AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de clatrina.

[0009] Uma composição exembplificativa, entre outros, inclui um agente inibitório. Em uma modalidade, o agente inibitório é seleciona- do do grupo que consiste em agentes que inibem competitivamente a ligação entre uma proteína viral compreendendo os motivos YXXS ou dileucina e uma proteína hospedeira selecionada do grupo que consis- te em AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de cla- trina, e agentes que inibem a atividade de quinase proteica de quina- ses que modulam a atividade de proteínas hospedeiras selecionadas do grupo que consiste em AP2M1 e/ou outras subunidades nu de com- plexos de AP de clatrina.

[0010] Em um aspecto, a presente invenção oferece um método de tratamento de uma coinfecção por HCV-HIV através da administração de uma quantidade eficaz de um agente que inibe a ligação de HCV e HIV às proteínas hospedeiras selecionadas do grupo que consiste em AP2M1 e outras subunidades u de complexos de AP de clatrina. Em uma modalidade, o agente inibitório inibe AAK1 ou GAK. Em uma outra modalidade, o agente é selecionado do grupo que consiste em erloti- nib, sunitinib, e PKC412. Em uma outra modalidade, o agente previne a ligação de uma proteína estrutural de Lentiviridae ou Flaviviridae contendo um motivo YXXO ou dileucina a uma proteína hospedeira se- lecionada do grupo que consiste em AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de clatrina. Em ainda uma outra modalidade, o agente inibe AAK.

[0011] Em um outro aspecto, a invenção oferece um método de inibir infecções por pelo menos um vírus que não HCV, um outro mem- bro de Flaviviridae, ou um membro de Lentiviridae, ou combinações dos mesmos, através da administração a um paciente como necessi- dade do mesmo de uma quantidade eficaz de um agente que inibe a ligação de uma proteína estrutural de um vírus contendo um motivo YXXO ou dileucina a uma proteína hospedeira selecionada do grupo que consiste em AP2M1 e/ou outras subunidades nu de complexos de AP de clatrina. Em uma modalidade, o agente inibe AAK1 ou GAK. Em uma outra modalidade, o agente é selecionado do grupo que consiste em erlotinib, sunitinib, e PKC-412.

[0012] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um mé- todo de rastreamento de agentes antivirais através do contato de um vírus suscetível já descrito neste relatório ou uma proteína viral com um agente candidato e uma proteína selecionada do grupo que consis- te em AP2M1 e/ou outras subunidades u de complexos de AP de cla- trina, e determinição de um efeito do agente candidato sobre a ligação do vírus à proteína hospedeira.

[0013] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um mé-

todo de rastreamento de agentes antivirais através do contato de um vírus suscetível já descrito neste relatório com um agente candidato e uma célula expressando uma proteína selecionada do grupo que con- siste em AP2M1 e outras subunidades u de complexos de AP de clatri- na, e determinação do efeito do agente candidato sobre a montagem ou brotamente viral. Em uma modalidade, o agente candidato inibe a atividade de AAK1 ou GAK.

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um mé- todo de inibição da montagem ou brotamento de vírus fixadores de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções por HCV/HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatri- na que não HCV, em uma célula hospedeira através do contato da cé- lula hospedeira com um agente que previne a ligação de uma proteína estrutural viral contendo um motivo YXX& ou dileucina a uma proteína hospedeira selecionada do grupo que consiste em AP2M1 e outras su- bunidades u de complexos de AP de clatrina. Em uma modalidade, o agente bloqueia a ligação da proteína estrutura viral à proteína hospe- deira. Em uma outra modalidade, o agente compete com h a proteína estrutural viral pela ligação à proteína hospedeira. Em uma outra mo- dalidade, o agente compete com a proteína hospedeira pela ligação à proteína estrutural viral. Em ainda uma outra modalidade, o método envolve o rastreamento de inibidores de AAK1I1 e GAK para vírus não pertencentes aos Flaviviridae. Breve Descrição dos Desenhos

[0015] Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da invenção. A invenção pode ser melhor entendida com referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste relatório:

[0016] FIG. 1: Mostra um núcleo viral com um motivo YXXS$ que se liga à AP2M1. (A) Representação esquemática de um núcleo. A lo- calização do motivo identificado está indicada. (B)-(C) Sequências de consenso de motivos YXXOE de proteínas humanas (B) e virais (C) re- presentativas. (D) A sequência de consenso todos os isolados de HCV, clones usados neste estudo, mutantes de núcleo modificados geneti- camente. (E) Imagens fluorescentes de um chip microfluídico e repre- sentação esquemática. Esquerda: AP2MI-V5-his foi ancorado à super- fície do dispositivo via sua interação com anticorpos anti-His e marca- do com anticorpos anti-V5-FITC. Meio: núcleo T7-tagged ou NS3 foram incubados com AP2M1 ligado à superfície e marcados com anticorpos anti-T7-Cy3. As interações foram capturadas mecanicamente por MI- TOMI. O sinal Cy3 representando a proteína viral ligada está mostrado depois de uma lavagem. Direita: uma sobreposição dos sinais Cy3 e FITC, representando a relação presa viral ligada para isca humana. F. Curvas de ligação in vitro de núcleo-T7 e NS3-T7 à AP2M1 superficial ligada. O eixo Y representa a relação proteína viral ligada para AP2M1 superficial ligada.

[0017] FIG. 2: Mostra um núcleo viral ligando AP2M1 nas células e no contexto de infecção por HCV. (A) Representação esquemática do formato de PCAs. A e B representam proteínas da presa e da isca, e GLucl/2 são fragmentos de Gaussia luciferase. (B) As células foram cotransfectadas com combinações dos plasmídios indicados abaixo do gráfico com aqueles indicados na legenda. O eixo Y representa a lumi- nescência relativa ao sinal núcleo-AP2MI.

[0018] FIG. 2: Mostra um núcleo viral que se liga a AP2M1 nas cé- lulas e no contexto da infecção causada por HCV. (A) Representações esquemáticas do formato de PCAs. A e B representam proteínas presa e isca e GLuc1/2 são fragmentos de luciferase de Gaussia. (B) As célu- las foram cotransfectadas com combinações de plasmídeos indicadas abaixo do gráfico com aquelas indicadas na legenda. O eixo Y repre- senta a luminescência relativa ao sinal de núcleo-AP2M1. A barra em bandas à direita representa AP2M1 se ligando à proteína de carga do hospedeiro TFR. (C) Ligação de núcleo-AP2M1 na presença de AP2M1 livre, núcleo ou NESI. O eixo Y representa a proporção de lu- minescência (o sinal de luminescência médio detectado nas células transfectadas com Gluc1-AP2M1 e Gluc2-núcleo dividido pela média de luminescência medida nos poços de controle transfectados com Gluc1-AP2M1 e um vetor Gluc2 vazio com aqueles transfectados com Gluc2-núcleo e um vetor Gluc1 vazio em relação à ligação de núcleo- AP2M1 na presença de PUC19 vazio. (D) Imunoprecipitações (IPs) nas membranas de células infectadas com HCV. Painéis à esquerda: Anti- corpos anti-AP2M1 ou IgG foram utilizados para IP. As membranas fo- ram submetidas a imunoblot com anticorpos anti-fosfo-AP2M1, anti- AP2M1, antinúcleo e antiactina. Cal-A representa caliculina-A. Painéis à direita: Anticorpos anti-núcleo ou IgG foram utilizados para IP. As membranas foram submetidas a imunoblot com anticorpos anti-núcleo, anti-AP2M1 e antiactina. (E) Imagens de microscopia IF confocal re- presentativas de AP2M1 e núcleo em células Huh-7.5 3 dias pós- eletroporação com J6/JFH HCV RNA. Os dados representam mé- dias+s.d. (barras de erro) provenientes de três experimentos indepen- dentes em triplicatas (n>20 em E). * p <0,05, ** p <0,01, *** p<0,001.

[0019] FIG. 3: Mostra um motivo YXXO do núcleo que medeia a ligação de AP2M1 e a montagem viral, funcionalmente intercambiável com outros sinais de YXXO. (A) Ligação do tipo selvagem (WT) e mu- tantes do núcleo a AP2M1 por PCAs. O eixo Y representa a proporção de luminescência (o sinal de luminescência médio detectado nas célu- las transfectadas com Gluc1-AP2M1 e as várias formas de Gluc2- núcleo dividido pela média de luminescência medida nos poços de controle transfectados com Gluc1-AP2M1 e um vetor Gluc2 vazio com aqueles transfectados com o respectivo Gluc2-núcleo e um vetor Gluc1 vazio) em relação à ligação de núcleo-AP2M1 WT. (B) Replicação do RNA de HCV através de ensaios com luciferase de Renilla em 6 h (branco) e 72 h (preto) pós-eletroporação com J6/JFH(p7-Rluc2A) car- regando as mutações correspondentes. AE1-E2 é um controle defeitu- oso em relação à montagem. GNN é um mutante de polimerase defei- tuoso em relação à replicação. (C) Capacidade de infecção extracelu- lar através de ensaios da luciferase em células Huh-7.5 puras infecta- das com sobrenadantes derivados das células submetidas à eletropo- ração. (D) Capacidade de infecção intracelular através de ensaios da luciferase em células Huh-7.5 puras infectadas com lisados de células clarificados derivados das células submetidas à eletroporação. (E) Ti- tulos da capacidade de infecção intra- e extracelular medidos através de ensaios de diluição limitante. TCIDs5so é uma dose infecciosa de cul- tura de tecidos de 50%. (F) Liberação do RNA viral dentro do sobrena- dante de cultura em 72 h pós-eletroporação medida por gRT-PCR. (G) Liberação da proteína do núcleo de HCV dentro do sobrenadante de cultura em 72 h pós-eletroporação determinada por ELISA em relação ao controle WT. (H) Níveis de proteína do núcleo através da análise de western em lisados preparados partindo de células infectadas com ví- rus carregando as mutações correspondentes. São mostradas as mé- dias e o s.d. (barras de erro) de resultados provenientes de pelo menos três experimentos independentes em triplicatas. As linhas horizontais tracejadas representam níveis de fundo da atividade da luciferase. ULR é unidades de luz relativas. * p <0,05, ** p <0,01, *** p<0,001.

[0020] FIG. 4: Mostra a inibição da montagem de HCV através da eliminação de AP2M1. (A) Níveis da proteína AP2M1 através da análi- se de western quantitativa em clones estáveis que carregam constru- ções lentivirais de ShRNA que se direcionam ao gene AP2M1 e uma sequência não direcionadora (NT). São mostrados dados de membra-

na representativos e combinados provenientes de três medidas inde- pendentes. O eixo Y representa a proporção de AP2M1 para a proteína actina em relação ao controle NT. (B) Proporção de AP2M1/S18 RNA por gRT-PCR em clones estáveis selecionados em relação ao controle NT. (C) Os clones indicados eram submetidos à eletroporação com J6/JFH(p7-ULRC2A). Replicação do RNA de HCV nestes clones atra- vés de ensaios da luciferase em 9 h (branco) e 72 h (preto) pós- eletroporação. (D) Capacidade de infecção extracelular medida através de ensaios da luciferase em células puras inoculadas com sobrenadan- tes derivados dos vários clones de células estáveis. (E) Capacidade de infecção intracelular através de ensaios da luciferase em células Huh-

7.5 puras infectadas com lisados de células clarificados derivados das células submetidas à eletroporação. (F) Títulos de capacidade de in- fecção intra- e extracelular medidos através de ensaios de diluição limitante. TCID5so é uma dose infecciosa de cultura de tecidos de 50%. (G) Liberação do RNA viral dentro do sobrenadante de cultura em 72 h pós-eletroporação medida por gRT-PCR. (H) Liberação da proteína do núcleo de HCV dentro do sobrenadante de cultura em 72 h pós- eletroporação, que é determinada por ELISA. (1) Produção de vírus in- feccioso em relação ao controle NT (painel superior) e níveis de prote- ína AP2M1 através de uma análise de western blot (painel inferior) nas células concorrentemente transduzidas com lentivírus expressando ShAP2M1 e cDNA de AP2M1 WT resistente a ShRNA (AP2M1-WT). São mostradas as médias e o s.d. (barras de erro) de resultados pro- venientes de pelo menos três experimentos independentes. ULR é uni- dades de luz relativas. * p <0,05, ** p <0,01, *** p<0,001.

[0021] FIG. 5: Mostra que a interrupção da ligação núcleo-AP2M1 inibe o recrutamento de AP2M1 para LD e altera a localização subcelu- lar do núcleo e sua colocalização com E2. Análise de imunofluorescên- cia confocal quantitativa (IF) da localização subcelular do núcleo e co-

localização de AP2M1 e núcleo-E2 nas células Huh-7.5. (A) Uma ima- gem fundida representativa de AP2M1 endógena (azul) e do marcador de LD, Bodipy (verde), em células Huh-7.5 naiíve. (B)-(D) Imagens fun- didas de células Huh-7.5 infectadas com J6/JFH HCV se coraram em relação ao núcleo (vermelho), ao marcador de LD, Bodipy (verde) e à AP2M1 (azul). (E) Porcentagem de colocalização dos sinais indicados em células naive (brancas) ou infectadas (pretas) através de uma aná- lise de colocalização quantitativa de (A)-(D). (F) Uma imagem fundida de quatro canais.

As setas em amarelo na inserção indicam a colocali- zação do núcleo e da AP2M1 ao LD. (G)-(J) Imagens fundidas repre- sentativas e análise de colocalização quantitativa de AP2M1 (verme- lho) e do marcador lipídico, LipidTOX (azul), em células Huh-7.5 trans- fectadas com plasmídeos expressando apenas AP2M1-mCherry (G) ou AP2M1-mCherry com núcleo WT (H) ou núcleo Y136A mutante (1). À expressão do núcleo (verde) nas células mostradas nos painéis (H) e (1) é demonstrada nos respectivos painéis inferiores. (K)-(P) Imagens fundidas representativas e análise de colocalização quantitativa do nú- cleo (vermelho) e (K) Bodipy (verde), demonstrando maior localização do núcleo ao LD nas células Huh-7.5 submetidas à eletroporação com o RNA de J6/JFH HCV carregando a mutação nuclear Y136A (painel direito) comparado com o núcleo WT (painel esquerdo). (L) Bodipy (verde) nas células de controle (NT) (painel esquerdo) ou Huh-7.5 com AP2M1 eliminada (painel direito) submetidas à eletroporação com o RNA de J6/J/FH HCV, exibindo uma localização dramática do núcleo ao LD nas células com AP2M1 eliminada. (M). TGN46 (verde), de- monstrando menor localização do núcleo a TGN em células Huh-7.5 submetidas à eletroporação com RNA de J6/JFH carregando a muta- ção nuclear Y136A (painel direito) comparado com o núcleo WT (pai- nel esquerdo). (N) TGN46 (verde) em células de controle (NT) (painel esquerdo) ou Huh-7.5 com AP2M1 eliminada (painel direito) submeti-

das à eletroporação com RNA de J6/JFH, exibindo menor localização do núcleo a TGN nas células com AP2M1 eliminada. (O) E2 (verde), demonstrando a menor colocalização do núcleo e E2 em células Huh-

7.5 submetidas à eletroporação com RNA de J6/JFH carregando a mu- tação nuclear Y136A (painel direito) comparado com o núcleo WT (painel esquerdo). (P) E2 (verde) em células de controle (NT) (painel esquerdo) ou Huh-7.5 com AP2M1 eliminada (painel direito) submeti- das à eletroporação com RNA de J6/JFH HCV, exibindo menor coloca- lização do núcleo e E2 nas células com AP2M1 eliminada. São mos- tradas imagens representativas no aumento de x60. Os gráficos repre- sentam a análise de colocalização quantitativa de pilhas Z utilizando coeficientes de Manders. Os valores indicam valores médios de M2 representados na forma da porcentagem de colocalização (a fração de intensidade verde que coincide com a intensidade vermelha ou no caso das FIGURAS (G)-(l), a fração de intensidade azul que coincide com a intensidade vermelha) + s.d. (barras de erro); n = 10-15. * p <0,05, ** p <0,01, *** p<0,001.

[0022] FIG. 6: Mostra que AAK1 e GAK regulam a ligação núcleo- AP2M1 e estão envolvidos na montagem do HCV. (A) Mecanismos re- guladores de ligação de AP2M1 às proteínas de carga do hospedeiro que carregam os sinais YXXO. (B) Ligação do núcleo a TI56A AP2M1 do tipo selvagem e mutante por PCAs (preto) e microfluidos (branco). (C)-(E) Huh-7.5 foram transfectadas com plasmídeos que codificam T156A AP2M1 WT ou mutante e foram submetidas à eletroporação com J6/JFH(p7-ULRc2A) 48 h pós-transfecção. (C) Viabilidade celular através de ensaios à base de alamarBlue em 48 h pós-transfecção em relação ao controle de AP2M1 WT. (D) Replicação do RNA de HCV nas células que superexpressam T156A AP2M1 WT ou mutante atra- vés de ensaios da luciferase em 6 h (preto) e 72 h (branco) pós- eletroporação com J6/JFH(p7-ULRC2A). (E) Capacidade de infecção extracelular (preto) e intracelular (branco) através de ensaios da lucife- rase em células Huh-7.5 puras infectadas com sobrenadantes ou lisa- dos de células derivados das células indicadas, respectivamente, em relação ao controle WT. (F)-(G) Células Huh7.5 foram transfectadas com os siRNAs correspondentes. (F) Proporção de AAK1 (esquerda) ou GAK (direita) para o RNA S18 nestas células em relação às se- quências NT por gRT-PCR. (G) Análise de western quantitativa.

Os números representam AAK1 (superior) ou GAK (inferior) para propor- ções da proteína actina em relação ao controle. (H) Ligação núcleo- AP2M1 por PCAs em células Huh-7.5 com AAK1 ou GAK eliminado por SiRNAs.

O eixo Y representa a proporção de luminescência (o sinal de luminescência médio detectado nas células transfectadas com Gluc1-AP2M1 e Gluc2-núcleo dividido pela média da luminescência medida em células NT transfectadas com Gluc1-AP2M1 e um vetor Gluc2 vazio com aquelas transfectadas com Gluc2-núcleo e um vetor Gluc1 vazio) em relação ao controle NT. (1)-(K) Células com AAK1 ou GAK eliminado foram submetidas à eletroporação com J6/JFH(p7- ULRc?2A). (1) Viabilidade celular através de ensaios à base de alamar- Blue em células com eliminação em relação ao controle NT. (J) Repli- cação do RNA de HCV nestas células através de ensaios da luciferase em 6 h (preto) e 72 h (branco) pós-eletroporação. (K) Capacidade de infecção extracelular (preto) e intracelular (branco) através de ensaios da luciferase em células Huh-7.5 puras infectadas com sobrenadantes ou lisados de células derivados das células indicadas, respectivamen- te, em relação ao controle NT. (L) Ligação do núcleo a AAK1I1 e GAK por PCAs.

O eixo Y representa a proporção de luminescência em rela- ção à ligação núcleo-AP2M1. Os dados representam as médias e o s.d. (barras de erro) provenientes de pelo menos dois experimentos em triplicatas.

ULR é unidades de luz relativas. * p <0,05, ** p <0,01, ** p<0,001.

[0023] FIG. 7: Inibição farmacológica da ligação núcleo-AP2M1 e montagem de HCV. (A) Reguladores de AP2M1 e os inibidores desco- bertos. (B) As Kds de ligação dos inibidores a AAK1 ou GAK (Karaman e outros, Nat Biotechnol 26: 127-132, 2008). IC50s para o efeito destes compostos sobre a ligação núcleo-AP2M1 e EC50s para seu efeito so- bre a capacidade de infecção extracelular, a capacidade de infecção intracelular e a infecção viral com HCV crescido em cultura de células (HCVecc). (C) Inibição da ligação núcleo-AP2M1 pelos compostos me- dida por PCAs. (D)-(G) Células Huh-7.5 submetidas à eletroporação com J6/JFH(p7-ULRc2A) foram tratadas diariamente com erlotinib, su- nitinib ou PKC-412 durante 3 dias. Os sobrenadantes e os lisados de células foram coletados em 72 h e utilizados para inocular células Huh-

7.5 puras. Curvas de resposta à dose dos efeitos dos inibidores sobre a capacidade de infecção extracelular (D) e intracelular (E) em relação aos controles não tratados. Estes compostos não possuem efeito sobre a replicação do RNA do HCV (F) ou a viabilidade celular (G) através de ensaios à base de luciferase e AlamarBlue, respectivamente (GNN é um mutante de polimerase defeituoso em relação à replicação). (H) O efeito dos inibidores sobre a fosforilação de AP2M1 através da análise de western de lisados de células coletados após a eletroporação com J6/JFH(p7-ULRC2A) e tratamento com os compostos na presença de Caliculina A (Cal-A). Membranas representativas "blotted" com anti- fofo-AP2M1 (p-AP2M1) e anticorpos antiactina e análise quantitativa partindo de 3 experimentos são mostrados. O eixo Y representa a pro- porção de pAP2M1/proteína actina em relação a controles não trata- dos. (1) O efeito dos inibidores sobre a infecção viral (preto) e a viabili- dade celular (cinza) nas células infectadas com HCVcc após 72 h de tratamento diário em relação a controles não tratados. Os dados repre- sentam as médias e o s.d. (barras de erro) provenientes de pelo menos três experimentos em triplicatas. ULR é unidades de luz relativas. * p

<0,05, ** p <0,01, *** p<0,001.

[0024] FIG. 8: A eliminação transitória de AP2M1 por siRNAs a- grupados inibe a montagem do HCV. (A) Proporção de AP2M1/RNA S18 medida por gRT-PCR em células Huh-7.5 transfectadas com um conjunto de quatro siRNAs (ON-TARGETplus SMARTpools, Dharma- con) que se direcionam a AP2M1 ou um conjunto de sequências não direcionadoras (NT) em 48 h pós-transfecção em relação aos controles NT. (B) Níveis da proteína AP2M1 por análise de western quantitativa nas células 48 h pós-transfecção com os siRNAs agrupados corres- pondentes. Os números representam a proporção de AP2M1 para a proteína actina em relação ao controle NT. (C) Viabilidade celular por ensaios com alamarBlue 48 h pós-transfecções com siRNAs em rela- ção ao controle NT. (D) As células foram submetidas à eletroporação com J6/JFH(p7-ULRc2A) em 48 h após a transfecção com os siRNAs agrupados indicados. Replicação do RNA do HCV nestas células atra- vés de ensaios da luciferase em 6 h (preto) e 72 h (branco) pós- eletroporação. (E) Capacidade de infecção extracelular (preto) e intra- celular (branco) medida em células Huh-7.5 puras infectadas com so- brenadantes ou lisados de células clarificados derivados de células submetidas à eletroporação que carregam os siRNAs indicados atra- vés de ensaios da luciferase, respectivamente. (F) Produção de vírus infeccioso medida através de ensaios de diluição limitante. (G) Capa- cidade de infecção extracelular (preto) e intracelular (branco) medida por ensaios de formação de focalização em células Huh-7.5 puras in- fectadas com sobrenadantes ou lisados de células clarificados deriva- dos de células Huh-7.5 com eliminação de forma transitória de AP2M1 por siRNAs e infectadas com vírus J6/JFH crescido em cultura (título: 1,2x10” TCIDso/mL). Os resultados são relativos aos controles NT. São mostradas as médias + s.d. (barras de erro) de resultados provenien- tes de pelo menos dois experimentos independentes. ULR é unidades de luz relativas. TCID5so é 50% da dose infecciosa da cultura de tecido.

[0025] FIG. 9: Mostra que a eliminação ou a inibição farmacológica de AAK1 e GAK anula a replicação do HIV-1 em células TZM-b1 (célu- las HeLa positivas para CXCR4 que expressam CD4 e CCR5 e ainda contêm integrados genes repórteres para luciferase e B-galactosidase de E. coli, ambos sob o controle de uma sequência de repetição de terminal longo do HIV (gene tat)). (A) Replicação do HIV em células com AAK1 ou GAK eliminado em relação ao controle NT. (B) O efeito antiviral de inibidores de AAK1I1 e GAK sobre a replicação do HIV em relação ao controle não tratado.

[0026] FIG. 10: Mostra o ensaio de ligação proteína-proteína à ba- se de Microfluidos. Três células unitárias individuais (das centenas em um dispositivo de microfluido) são mostradas neste esquema.

[0027] Compartimentos e válvulas micromecânicas. Uma válvula é criada onde um canal de controle atravessa um canal de fluxo. A mem- brana fina resultante na junção entre os dois canais pode ser desviada por acionamento hidráulico. A utilização de sistemas de válvulas multi- plex permite que um grande número de microválvulas elastoméricas realize manipulações fluidas complexas dentro destes dispositivos.

[0028] Protocolo experimental. & representa anticorpos anti- histidina biotinilados ligados à superfície (mostrados em B1 e B2). &€ representa a proteína humana de isca marcada com FITC ligada à su- perfície (mostrada em B3). & representa a proteína viral de presa mar- cada com Cy3 (mostrada em B4 e B5). 1) O dispositivo de microfluido foi ligado a uma lâmina de vidro e submetido à configuração da super- fície que resultou em uma área circular revestida com anticorpos anti- histidina biotinilados dentro de cada célula unitária (ver c). 2) As prote- Ínas humanas de isca marcadas com V5-his foram expressas do chip utilizando mistura de transcrição/tradução (TNT) in vitro e foram carre- gadas dentro do dispositivo. 3) Estas proteínas se ligavam aos anticor-

pos anti-his de superfície. 4) As proteínas virais marcadas com T7 fo- ram expressas do chip pela mesma mistura de TNT in vitro de mamífe- ro na presença de membranas microssomais e carregadas dentro do dispositivo junto com anticorpos anti-V5 marcados com FITC e anti-T7 marcados com Cy3. 5) As "válvulas em sanduíche" foram fechadas pa- ra permitir a incubação da proteína viral com as proteínas humanas e sua marcação com os respectivos anticorpos fluorescentes. 6) MITOMI foi então realizado através do acionamento da "membrana de botão" facilitando a captura de complexos ligados à superfície enquanto são expelidas quaisquer moléculas em fase de solução. As "válvulas em sanduíche" foram abertas seguidas por uma breve lavagem para re- mover material não ligado. 7) O dispositivo foi verificado por um scan- ner de ordem. A proteína viral capturada e as proteínas humanas liga- das à superfície foram detectadas. A proporção de proteína viral ligada em relação à proteína humana expressa foi calculada para cada ponto de dado através da medida do sinal mediano de Cy3 em relação ao sinal mediano de FITC (representado por O, mostrado em B7).

[0029] Configuração da superfície. 1) A área de superfície acessí- vel foi derivatizada através do fluxo de uma solução de BSA biotinilada (A) através de todos os canais de fluxo. 2) Uma solução de Neutravi- dina (43) foi carregada. 3) A membrana de "botão" foi ativada. 4) Toda a área de superfície acessível remanescente exceto por uma área cir- cular de 60 um mascarada pelo botão foi protegida contra corrosão com solução biotinilada (8). 5) A membrana de "botão" foi aberta. 6) Uma solução de anticorpos anti-his biotinilados (É) foi carregada permitindo a funcionalização específica da área circular previamente mascarada. 7) Proteína humana expressa in vitro (<S ) ligada aos anti- corpos biotinilados que revestem a área circular separada. Cada uma das etapas descritas foi seguida por uma lavagem com PBS.

[0030] FIG. 11: Mostra que as mutações YXXO no núcleo não afe- tam a replicação do RNA do HCV através de ensaios de qRT-PCR. Replicação do RNA do HCV, através de qRT-PCR em células Huh-7.5 72 h após a eletroporação com J6/JFH(p7-ULRc2A) carregando as mu- tações YXXO no núcleo correspondentes em relação ao controle WT. AE1I-E2 é um controle defeituoso em relação à montagem. GNN é um mutante de polimerase defeituoso em relação à replicação. São mos- tradas as médias e o s.d. (barras de erro) de resultados provenientes de dois experimentos independentes em triplicatas.

[0031] FIG. 12: Mostra que a eliminação de AP2M1 não possui e- feito sobre a replicação do RNA do HCV através de ensaios de gRT- PCR. Replicação do RNA do HCV, através de gqRT-PCR em células Huh-7.5 carregando os sShRNAs correspondentes 72 h após a eletropo- ração com J6/JFH(p7-ULRc2A) em relação ao controle NT. São mos- tradas as médias e o s.d. (barras de erro) de resultados provenientes de dois experimentos independentes em triplicatas.

[0032] FIG. 13: Mostra que a eliminação transitória de AP2M1 por SIiRNAs agrupados inibe a montagem do HCV. (A) Proporção de AP2M1/RNA S18 medida por gRT-PCR em células Huh-7.5 transfecta- das com um conjunto de quatro siRNAs (ON-TARGETplus SMARTpo- ols, Dharmacon) que se direcionam à AP2M1 ou um conjunto de se- quências não direcionadoras (NT) em 48 h pós-transfecção em relação aos controles NT. (B) Níveis da proteína AP2M1 por análise de western quantitativa nas células 48 h pós-transfecção com os siRNAs agrupa- dos correspondentes. Os números representam a proporção de AP2M1 para a proteína actina em relação ao controle NT. (C) Viabilidade celu- lar através de ensaios com alamarBlue 48 h pós-transfecções com SIRNAs em relação ao controle NT. (D) As células foram submetidas à eletroporação com J6/JFH(p7-ULRc2A) em 48 h após a transfecção com os siRNAs agrupados indicados. Replicação do RNA do HCV nes-

tas células através de ensaios da luciferase em 6 h (preto) e 72 h (branco) pós-eletroporação. (E) Capacidade de infecção extracelular (preto) e intracelular (branco) medida em células Huh-7.5 puras infec- tadas com sobrenadantes ou lisados de células clarificados derivados de células submetidas à eletroporação que carregam os siRNAs indi- cados através de ensaios da luciferase, respectivamente. (F) Produção de vírus infeccioso medida através de ensaios de diluição limitante. (G) Capacidade de infecção extracelular (preto) e intracelular (branco) me- dida por ensaios de formação de focalização em células Huh-7.5 puras infectadas com sobrenadantes ou lisados de células clarificados deri- vados de células Huh-7.5 com eliminação de forma transitória de AP2M1 por siRNAs e infectadas com vírus J6/JFH crescido em cultura (título: 1,2x10º TCIDso/mL). Os resultados estão em relação aos contro- les NT. São mostradas as médias + s.d. (barras de erro) de resultados provenientes de pelo menos dois experimentos independentes. ULR é unidades de luz relativas. TCIDso é 50% da dose infecciosa de cultura de tecido.

[0033] FIG. 14: Mostra que uma mutação no núcleo Y136A não parece afetar a localização do núcleo nas membranas do RE em célu- las infectadas com HCV. (A) Análise de imunofluorescência confocal quantitativa (IF) em relação à localização do núcleo na membrana do RE em células Huh-7.5 infectadas com HCV crescido em cultura. (A) e (B) são imagens fundidas representativas do núcleo (vermelho) e do marcador do RE, calreticulina (verde), demonstrando uma localização parcial comparável do núcleo na membrana do RE em células Huh-7.5 infectadas com o vírus WT (A) ou com vírus carregando a mutação no núcleo Y136A (B). São mostradas imagens representativas no aumen- to de x60. (C) Análise de colocalização de pilhas Z utilizando coeficien- tes de Manders (com um valor mais alto representando mais colocali- zação). Os valores indicam os valores de M2 médios representados na forma da porcentagem de colocalização (a fração de intensidade verde que coincide com a intensidade vermelha + s.d. (barras de erro); n = 10-15).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0034] Antes que a presente descrição seja descrita em maiores detalhes, deve ser entendido que esta descrição não está limitada a modalidades particulares descritas e a modalidade da invenção com tal, evidentemente, pode variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não é pretendido que seja limitante, uma vez que o âmbito da presente descrição será limitado apenas pelas reivindica- ções em anexo.

[0035] Como será evidente para os peritos na técnica após a leitu- ra desta descrição, cada uma das modalidades individuais descritas e ilustradas aqui possui componentes distintos e características que po- dem ser facilmente separadas de ou combinadas com as característi- cas de qualquer uma das outras várias modalidades sem se afastar do âmbito ou do espírito da presente descrição. Qualquer método citado pode ser realizado na ordem dos eventos citados ou em qualquer outra ordem que é logicamente possível.

[0036] Antes das modalidades da presente descrição serem des- critas em detalhes, deve ser entendido que, a não ser que seja indica- do de outra maneira, a presente descrição não está limitada a materi- ais, reagentes, materiais de reação, processos de manufatura particu- lares ou similar, uma vez que os tais podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui é para as finalidades de descrição das modalidades particulares apenas e não é pretendido que seja limitante. Também é possível na presente descrição que as eta- pas possam ser executadas em sequência diferente quando isto for logicamente possível. Como utilizado no relatório descritivo e nas rei-

vindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" in- cluem referentes no plural a não ser que o contexto determine clara- mente o contrário. Assim, por exemplo, referência a "um composto" inclui um grande número de compostos. Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a um número de ter- mos que devem ser definidos como possuindo os significados a seguir a não ser que uma intenção contrária seja evidente. Definições

[0037] Na descrição e na reivindicação do assunto de objetivo di- vulgado, a terminologia a seguir será utilizada de acordo com as defi- nições apresentadas a seguir.

[0038] Por "vírus Flaviviridae" entende-se qualquer vírus da família Flaviviridae, incluindo aqueles vírus que infectam humanos e animais não humanos. As sequências de polinucleotídeo e polipeptídeos que codificam estes vírus são bem conhecidas na técnica e podem ser en- contradas no banco de dados do GenBank do NCBI, por exemplo, na forma dos números de Acesso do Genbank NC 004102, ABO31663, D11355, D11168, AJ238800, NC 001809, NC 001437, NC 004355, NC 004119, NC 003996, NC 003690, NC 003687, NC 003675, NC 003676, NC 003218, NC 001563, NC 000943, NC 003679, NC 003678, NC 003677, NC 002657, NC 002032 e NC 001461, cu- jos conteúdos das entradas no banco de dados são incorporados aqui como referências em sua totalidade.

[0039] Como utilizado aqui, os termos "tratamento," "tratando" e "tratar" são definidos como atuando sobre uma doença, um distúrbio ou um estado de saúde com um agente para reduzir ou melhorar os efei- tos farmacológicos e/ou fisiológicos da doença, do distúrbio ou do es- tado de saúde e/ou seus sintomas. "Tratamento", como utilizado aqui, cobre qualquer tratamento de uma doença em um hospedeiro (por e- xemplo, um mamífero, tipicamente um humano ou animal não humano de interesse veterinário) e inclui: (a) a redução do risco de ocorrência da doença em um indivíduo determinado como sendo predisposto à doença, mas ainda não diagnosticado como infectado com a doença, (b) o impedimento do desenvolvimento da doença e (c) o alívio da do- ença, isto é, causando a regressão da doença e/ou aliviando um ou mais sintomas da doença. "Tratamento" entende-se ainda como a- brangendo o fornecimento de um agente de inibição para fornecer um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma doença ou um esta- do de saúde. Por exemplo, "tratamento" abrange o fornecimento de um agente de inibição de uma doença ou um agente patogênico que forne- ce efeitos intensificados ou desejáveis no indivíduo (por exemplo, re- dução da carga do agente patogênico, redução de sintomas da doença etc.).

[0040] Como utilizado aqui, os termos "tratar de forma profilática" ou "tratamento de forma profilática" referem-se à prevenção completa- mente ou parcialmente de uma doença ou um sintoma da mesma e/ou pode ser terapêuticos em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou um efeito adverso que pode ser atribuído à doença.

[0041] Como utilizado aqui, o termo "hospedeiro", "indivíduo", "pa- ciente" ou "organismo" inclui humanos e mamíferos (por exemplo, ca- mundongos, ratos, porcos, gatos, cachorros e cavalos). Os hospedei- ros típicos aos quais os compostos da presente descrição podem ser administrados serão mamíferos, particularmente primatas, especial- mente humanos. Para aplicações veterinárias, uma ampla variedade de indivíduos será adequada, por exemplo, animais de criação tais como gado, ovinos, caprinos, bovinos, suínos e similares; aves tais como frangos, patos, gansos, perus e similares; e animais domestica- dos, particularmente animais de companhia tais como cachorros e ga- tos. Para aplicações de diagnóstico ou pesquisa, uma ampla variedade de mamíferos pode ser indivíduos adequados, incluindo roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), coelhos, primatas e suínos, tais como porcos intracruzados e similares. O termo "hospedeiro vivo" refere-se a um hospedeiro como citado anteriormente ou outro orga- nismo que está vivo. O termo "hospedeiro vivo" refere-se ao hospedei- ro ou ao organismo inteiro e não apenas uma parte cortada (por exem- plo, um fígado ou outro órgão) do hospedeiro vivo.

[0042] O termo "composto isolado" significa um composto que foi substancialmente separado de ou enriquecido em relação a, outros compostos com os quais ocorre na natureza. Os compostos isolados são geralmente pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos 90% puros, pelo menos 98% puros ou pelo menos aproximadamente 99% puros, em peso. A presente descrição é entendida como incluindo dias- tereoisômeros, bem como suas formas enanciomericamente puras ra- cêmicas e resolvidas e sais farmaceuticamente aceitáveis das mes- mas.

[0043] O termo "forma de dosagem unitária", como utilizado aqui, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e/ou animais, cada unidade conten- do uma quantidade predeterminada de um composto (por exemplo, um composto antiviral, que é descrito aqui) calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um dilu- ente, um carreador ou um veículo farmaceuticamente aceitável. As es- pecificações para as formas de dosagem unitária dependem do com- posto particular empregado, da rota e da frequência de administração, do efeito que será atingido e da farmacodinâmica associada com cada composto no hospedeiro.

[0044] Um "excipiente farmaceuticamente aceitável", um "diluente farmaceuticamente aceitável", um "carreador farmaceuticamente acei- tável" ou um "adjuvante farmaceuticamente aceitável" significa um ex- cipiente, um diluente, um carreador e/ou um adjuvante que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente segu- ra, não tóxica e nem biologicamente nem de outra maneira indesejável e inclui um excipiente, um diluente, um carreador e um adjuvante que são aceitáveis para uso veterinário e/ou uso farmacêutico humano. "Um excipiente, um diluente, um carreador e/ou um adjuvante farma- ceuticamente aceitável" como utilizado no relatório descritivo e nas rei- vindicações inclui um e mais tais excipientes, diluentes, carreadores e adjuvantes.

[0045] Como utilizado aqui, uma "composição farmacêutica" en- tende-se como abrangendo uma composição adequada para adminis- tração a um indivíduo, tal como um mamífero, especialmente um ser humano. Em geral uma "composição farmacêutica" é estéril e prefe- rencialmente livre de contaminantes que são capazes de ativar uma resposta indesejável dentro do indivíduo (por exemplo, o(s) compos- to(s) na composição farmacêutica é de grau farmacêutico). As compo- sições farmacêuticas podem ser planejadas para administração aos indivíduos ou pacientes que necessitam das mesmas através de um número de vias de administração diferentes incluindo oral, intravenosa, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, intratraqueal, in- tramuscular, subcutânea, por inalação e similares.

[0046] O termo "quantidade terapeuticamente eficiente" como utili- zado aqui se refere àquela quantidade de uma modalidade do agente (que pode ser referido como um composto, um agente de inibição e/ou um fármaco) que é administrada que aliviará até alguma extensão um ou mais dos sintomas da doença, isto é, infecção, que é tratada e/ou àquela quantidade que irá prevenir, até alguma extensão, um ou mais dos sintomas da doença, isto é, infecção, que o hospedeiro que será tratado possui ou está em risco de desenvolver.

[0047] Os vírus são agentes infecciosos intracelulares pequenos que se replicam através do uso do maquinário da célula hospedeira. A montagem e o brotamento viral de Flaviviridae permanecem pouco en- tendidos, embora dados recentes sugiram que a via endocítica pode estar envolvida, tal como com o Vírus da Hepatite C (HCV). As proteí- nas do hospedeiro estão envolvidas nestes processos, embora antes da presente descrição, as proteínas do hospedeiro envolvidas na me- diação da montagem e do brotamento tardios não fossem direcionadas como agentes antivirais. A presente descrição, entretanto, fornece mé- todos e composições antivirais que se direcionam às proteínas do hos- pedeiro para montagem e brotamento tardios. Em particular, as proteí- nas adaptadoras da clatrina do hospedeiro e seus agentes reguladores envolvidos nas vias endocíticas ou secretoras são alvos eficientes. À função das proteínas adaptadoras da clatrina e seus agentes regulado- res na produção de Flaviviridae infeccioso era previamente desconhe- cida. A presente descrição demonstra que as proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro, tais como AP2M1, AP1M1, AP3M1 e APAM1 e suas proteínas reguladoras, tais como, mas não limitadas a AAK1I e GAK são alvos adequados para terapias antivirais. Em adição, a pre- sente descrição fornece um novo motivo de aminoácido viral que me- deia a interação com uma proteína do hospedeiro.

[0048] Um motivo YXXO conservado foi descoberto dentro da pro- teína do núcleo do HCV, uma proteína de membrana de 191 aminoáci- dos que forma o capsídeo viral (FIG. 1). Este motivo YXXO é conser- vado ao longo de todos os isolados de HCV disponíveis nos bancos de dados até hoje. Este motivo também foi descoberto nas proteínas es- truturais de outro Flaviviridae e outros vírus. Este motivo YXXO está em conformidade com o sinal de seleção consenso YXXQO dentro das proteínas de membrana de carga do hospedeiro, reconhecido pela su- bunidade py de complexos de proteína adaptadora da clatrina (AP) (FIG. 1a). AP2M1 medeia a endocitose dependente da clatrina, o pro- cesso através do qual as proteínas de carga são selecionadas para dentro de fossas revestidas com clatrina destinadas para fusão com endossomas iniciais. O reconhecimento dos motivos YXXO ou de di- leucina dentro das proteínas retrovirais por AP2M1 ou AP1M1 foi mos- trado como estando envolvido na mediação da montagem e do brota- mento de retrovírus (FIG. 1b) (Batonick e outros, Virology 342:190-200, 2005; Camus e outros, Molec Biol Cell 18:3193-3203, 2007; Berlioz- Torrent e outros, J Virol 73: 1350-1361, 1999; Byland e outros, Molec Biol Cell 18:414-425, 2007; Wyss e outros, J Virol 75:2982-2992, 2001; Ohno e outros, Virology 238:305-315, 1997; Boge e outros, J Biol Chem 273: 15773-15778, 1998; Egan e outros, J Virol 70:6547-6556, 1996; Rowell e outros, J Immunol 155:473-488, 1995; Lodge e outros, EMBO J 16:695-705, 1997; Deschambeault e outros, J Virol 73:5010- 5017, 1999). Entretanto, a função de AAK1 e GAK na infecção por HIV não foi estudada e estes mecanismos não foram direcionados farmaco- logicamente. Consequentemente, a presente descrição fornece méto- dos e composições para o tratamento ou para a prevenção de infecção viral de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae sem ser HCV, HIV, Lentiviridae sem ser HIV, vírus que se ligam à AP da clatrina, que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV ou coinfecções tais como coinfecções com HCV/HIV.

[0049] A inibição da interação entre o motivo YXXO viral e as pro- teínas adaptadoras do hospedeiro, tais como, mas não limitadas a AP2M1, resulta na produção reduzida de vírus infeccioso de HCV, Fla- viviridae, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatri- na, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV ou coinfecções tais como coin- fecções por HCV/HIV. Em adição, a inibição da atividade de proteínas que regulam as proteínas adaptadoras da clatrina pode resultar na produção reduzida de vírus infeccioso de HCV, Flaviviridae, Flaviviri- dae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae, vírus que se ligam à AP da clatrivrca sem ser HCV ou coinfecções tais como coinfecções por HCV/HIV. Assim, abordagens planejadas para interromper a interação do motivo YXXO virais com proteínas adaptadoras da clatrina, tais co- mo AP2M1 e similares, podem ser úteis para a inibição da produção de vírus infeccioso.

[0050] A regulação da atividade de muitas proteínas ocorre através da ação de proteína quinases e proteína fofatases. GAK e AAK1 são duas proteína quinases que modulam a atividade de AP2M1 e outras subunidades uy de complexos AP da clatrina, indicando que a adminis- tração de inibidores de proteína quinases tal como erlotinib, sunitinib ou PKC-412 pode abolir a interação de AP2M1 e outras subunidades yu de complexos AP da clatrina com motivos YXXO ou de dileucina virais, inibindo assim a infecção viral de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV, HIV, Lentiviridae sem ser HIV ou coinfecções tais como coinfecções por HCV/HIV, como é descrito em maiores detalhes a se- guir.

[0051] As modalidades da presente descrição, portanto, fornecem métodos de tratamento de uma infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV ou qualquer outro vírus envelopado que sequestra AP2M1 outras subunidades py de complexos AP da clatri- na/AAK1I/GAK, composições (incluindo agentes de inibição e combina- ções de tais agentes com outras terapias antivirais) para o tratamento de uma infecção por tais vírus e similares. Em particular, as modalida- des da presente invenção fornecem métodos de tratamento de infec-

ções causadas por vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatri- na sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV e composições para o tratamento destas infecções ou qualquer outro vírus envelopado que se liga às proteínas adaptadoras da clatri- na, tal como AP2M1 ou é regulado por AAK1 ou GAK.

[0052] As modalidades da presente descrição fornecem métodos de tratamento de forma profilática de uma infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfec- ções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV, composições (incluindo agen- tes de inibição e combinações de tais agentes com outras terapias an- tivirais) para o tratamento de forma profilática de uma infecção por tais vírus e similares. Em particular, as modalidades da presente invenção fornecem métodos de tratamento de forma profilática de HCV e/ou HIV e composições para o tratamento de HCV e/ou HIV. Em uma modali- dade alternativa, a presente invenção fornece métodos para o trata- mento de infecção por HCV/HIV ou Flaviviridae sem ser HCV. Embora a discussão apresentada aqui possa descrever a invenção em relação ao HCV, deve ser observado que a descrição refere-se não somente ao HCV, mas também aos vírus que se ligam à AP da clatrina, Flavivi- ridae, Lentiviridae, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCVI/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatri- na sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV e composições para o tratamento destas infecções ou qualquer outro vírus envelopado que se liga à AP2M1 ou outras subunidades yu de complexos AP da clatrina ou é regulado por AAK1 ou GAK ou qual- quer outro vírus envelopado que se liga às proteínas adaptadoras da clatrina, tais como AP2M1 e similares ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina e esta interação é regulada por AAK1I/GAK.

[0053] Em vista do reconhecimento de que proteínas virais que compreende um motivo YXXO ou de dileucina podem mediar a intera- ção com as proteínas do hospedeiro, as modalidades da presente in- venção fornecem composições (incluindo composições farmacêuticas) que incluem um agente de inibição que pode ser utilizado para tratar um hospedeiro infectado por um vírus da família de vírus Flaviviridae. Em particular, o agente de inibição pode ser utilizado para tratar hos- pedeiros infectados com infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se li- gam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV ou pacientes sofrendo de coinfecções, em particular HCV e HIV ou Flaviviridae sem ser HCV. Consequentemen- te, dois tipos de agentes de inibição encontram uso aqui: (1) aqueles que inibem a interação entre a proteína viral que compreende o motivo YXXO ou de dileucina e proteínas adaptadoras da clatrina do hospe- deiro, tal como AP2M1 e outras subunidades py de complexos AP da clatrina; e (2) aqueles que inibem a atividade de quinase que regula as proteínas do hospedeiro. Em algumas modalidades, o agente de inibi- ção inibe AAK1 ou GAK.

[0054] Como descrito nos Exemplos, foi observado que o motivo YXXO do HCV em uma proteína estrutural se liga à proteína do hospe- deiro AP2M1. Esta interação foi utilizada para identificar agentes de inibição que interferem com a interação e assim podem ser candidatos para o desenvolvimento clínico como fármacos para o tratamento de infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Len- tiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser

Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV.

[0055] Os agentes de inibição descritos aqui são úteis no trata- mento de infecções virais, em que o vírus é um vírus contendo o moti- vo YXXO e Y é um resíduo de tirosina, X é qualquer aminoácido e O é um resíduo hidrofóbico volumoso. Estes podem incluir, mas não estão limitados a, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e valina. Os a- gentes de inibição descritos aqui são úteis no tratamento de infecções virais, em que o vírus compreende um vírus que contém motivo de di- leucina. Os motivos de dileucina podem incluir, mas não estão limita- dos a leucina-leucinay isoleucina-leucinay leucina-isoleucina, [D/EJXXXL[L/I]] ou DXXLL (em que X é qualquer aminoácido). Os vírus que incluem motivos YXXQO ou de dileucina incluem, entre outros, Len- tiviridae, tal como HIV e vírus da família Flaviviridae. Os exemplos de Flaviviridae incluem, mas não estão limitados a, flavivírus, pestivírus e vírus da hepatite C. Outros vírus que incluem motivos YXXO ou de di- leucina incluem vírus da febre amarela (YFV); vírus da Dengue, inclu- indo Dengue dos tipos 1-4; vírus da Encefalite Japonesa; vírus da En- cefalite do Vale de Murray; vírus da Encefalite de St. Louis; vírus do Oeste do Nilo; vírus de encefalite carregado pelo carrapato; vírus da Hepatite C (HCV); vírus Kunjin; vírus da encefalite da Europa Central; vírus da encefalite de primavera-verão da Rússia; vírus de Powassan; vírus da doença da Floresta de Kyasanur; vírus de Ilheus; vírus Apoi; vírus GB A e B; vírus da doença de Louping e vírus da febre hemorrá- gica de Omsk.

[0056] Em uma modalidade, os agentes de inibição (por exemplo, agentes anti-HCV) para uso na inibição da replicação do HCV e no tra- tamento da infecção causada por HCV, são de interesse particular. Flaviviridae sem ser HCV e vírus envelopados sem ser Flaviviridae também são de interesse. O HCV considerado pela descrição pode ser de qualquer genótipo (genótipo 1, 2, 3, 4, 5, 6 e similares), bem como subtipos de um genótipo de HCV (por exemplo, 1a, 1b, 2a, 2b, 3a etc.). Devido ao fato de que o genótipo 1 do HCV é tipicamente o mais difícil de tratar, os métodos e as composições da invenção para o tratamento de infecções causadas pelo genótipo 1 do HCV e subtipos do genótipo 1 são de interesse particular. Em uma modalidade, as coinfecções por HCV são de interesse. Em particular, as coinfecções por HCV/HIV são de interesse.

[0057] Embora o relatório descritivo a seguir refira-se ao HCV, tal referência é somente para esclarecimento e não é pretendida como limitante da descrição que é descrita em maiores detalhes a seguir pa- ra o HCV. Como observado anteriormente, os métodos e as composi- ções da invenção podem ser aplicados a qualquer vírus que possua um motivo YXXO ou de dileucina em uma proteína estrutural (por e- xemplo, infecção viral de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV, coinfecções tais como coinfecções por HCV/HIV), Lentiviridae ou HIV. As composições e os métodos também podem ser aplicados a coin- fecções e infecções por Flaviviridae sem ser HCV e vírus envelopados sem ser Flaviviridae.

[0058] A presente descrição também descreve métodos livres de células in vitro de identificação de agentes (agentes de inibição) que modulam a ligação entre uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina e uma proteína adaptadora da clatrina do hos- pedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina. Um agente de teste que inibe a ligação de proteínas virais que contêm motivos YXXQO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro in- cluindo proteínas adaptadoras da clatrina, tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina, pode ser adicionalmente testado em relação a sua capacidade de inibir a replicação viral em um ensaio à base de células. Por exemplo, um agente de teste de interes- se pode ser colocado em contato com uma célula de mamífero que carrega todo ou parte de um genoma do HCV e o efeito do agente de teste sobre a replicação do HCV pode ser determinado. As células a- dequadas incluem células de fígado de mamífero que são permissivas em relação à replicação do HCV, por exemplo, uma linhagem de célula de hepatócito humano imortalizado que é permissiva para o HCV. Por exemplo, uma célula de mamífero adequada é hepatócito Huh7 ou um subclone do hepatócito Huh7, por exemplo, Huh-7.5. As linhagens de células adequadas são descritas, por exemplo, em Blight e outros (J Virol 76: 13001, 2002) e Zhang e outros (J Virol 78: 1448, 2004). Em uma modalidade, o genoma do HCV na célula compreende um repór- ter, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica lucifera- se, uma proteína fluorescente ou outra proteína que forneça um sinal detectável; e a determinação do efeito, se algum, do agente de teste sobre a replicação do HCV é conseguida através da detecção de um sinal proveniente do repórter. Outros sistemas de ensaios virais são conhecidos na técnica.

[0059] Em uma modalidade, os agentes de teste são grupamentos orgânicos. Nesta modalidade, que é descrita de forma geral na WO 94/24314, que é incorporada aqui como referência, os agentes de teste são sintetizados partindo de uma série de substratos que podem ser quimicamente modificados. "Quimicamente modificado" aqui inclui rea- ções químicas tradicionais, bem como reações enzimáticas. Estes substratos geralmente incluem, mas não estão limitados a, grupos al- quila (incluindo alcanos, alcenos, alcinos e heteroalquila), grupos arila (incluindo arenos e heteroarila), alcoóis, éteres, aminas, aldeídos, ce- tonas, ácidos, ésteres, amidas, compostos cíclicos, compostos hetero- cíclicos (incluindo purinas, pirimidinas, benzodiazepinas, beta-lactams, tetraciclinas, cefalosporinas e carboidratos), esteroides (incluindo es-

trogênios, androgênios, cortisona e ecodisona etc.), alcaloides (incluin- do ergotinas, vinca, curare, pirollizdina e mitomicinas), compostos or- ganometálicos, compostos que carregam heteroátomos, aminoácidos e nucleosídeos. As reações químicas (incluindo enzimáticas) podem ser realizadas sobre os grupamentos para formar novos substratos ou a- gentes candidatos que podem então ser testados utilizando os presen- tes métodos.

[0060] Assim, em modalidades específicas, um agente de teste de interesse (por exemplo, um agente de inibição da invenção) inibe a re- plicação viral em pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos apro- ximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo me- nos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximada- mente 80% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, comparada com o nível de replicação do HCV na ausência do agente de teste.

[0061] Em particular, as modalidades da presente invenção inclu- em agentes de inibição que inibem a ligação de proteínas virais que contêm um motivo YXXQO ou de dileucina às proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina em pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximada- mente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproxi- madamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos a- proximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais,

comparada com a ligação de proteínas virais que contêm um motivo YXXQO ou de dileucina às proteínas adaptadoras da clatrina do hospe- deiro tal como AP2M1 ou outras subunidades yu de complexos AP da clatrina na ausência do agente de teste.

[0062] Ainda em outra modalidade, o agente de inibição é um que inibe a ligação de uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina com uma concentração inibidora de 50% (IC5o) de aproximadamente 100 uM até 50 UM, aproximadamente 50 uM até 25 UM, aproximada- mente 25 uM até 10 UM, aproximadamente 10 uM até 5 uM, aproxima- damente 5 uM até 1 uM, aproximadamente 1 uM até 500 nM, aproxi- madamente 500 nM até 400 nM, aproximadamente 400 nM até 300 nM, aproximadamente 300 nM até 250 nM, aproximadamente 250 nM até 200 nM, aproximadamente 200 nM até 150 nM, aproximadamente 150 nM até 100 nM, aproximadamente 100 nM até 50 nM, aproxima- damente 50 nM até 30 nM, aproximadamente 30 nM até 25 nM, apro- ximadamente 25 nM até 20 nM, aproximadamente 20 nM até 15 nM, aproximadamente 15 nM até 10 nM, aproximadamente 10 nM até 5 nM ou menor que aproximadamente 5 nM.

[0063] Ainda em outra modalidade, o agente de inibição inibe a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXX9O ou de dileucina às proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina. Em uma modalidade, o agente de inibição inibe a ligação de pelo me- nos uma proteína viral que contém um motivo YXXQO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades p de complexos AP da clatrina com uma ICs59y de menos que aproximada- mente 500 nM, por exemplo, em algumas modalidades, o agente de inibição inibe a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas estruturais do hospedei- ro tal como AP2M1 ou outras subunidades p de complexos AP da cla- trina com uma ICs59 de aproximadamente 500 nM até 400 nM, aproxi- madamente 400 nM até 300 nM, aproximadamente 300 nM até 250 nM, aproximadamente 250 nM até 200 nM, aproximadamente 200 nM até 150 nM, aproximadamente 150 nM até 100 nM, aproximadamente 100 nM até 50 nM, aproximadamente 50 nM até 30 nM, aproximada- mente 30 nM até 25 nM, aproximadamente 25 nM até 20 nM, aproxi- madamente 20 nM até 15 nM, aproximadamente 15 nM até 10 nM, a- proximadamente 10 nM até 5 nM ou menos que aproximadamente 5 nM.

[0064] Ainda em outra modalidade, o agente de inibição, quando colocado em contato com uma célula infectada por vírus (por exemplo, uma célula do fígado infectada por HCV), inibe a replicação viral na célula em pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproxima- damente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos apro- ximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo me- nos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, comparada com o nível de replicação viral em uma célula infectada por vírus não coloca- da em contato com o agente de inibição.

[0065] Ainda em outra modalidade, o agente de inibição, quando colocado em contato com uma célula infectada por vírus (por exemplo, uma célula do fígado infectada por HCV), reduz a quantidade de partí- culas virais infecciosas produzidas pela célula infectada em pelo me- nos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%,

pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximada- mente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproxi- madamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos a- proximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80% ou pelo me- nos aproximadamente 90% ou mais, comparada com o número de par- tículas virais infecciosas produzidas pela célula não colocada em con- tato com o agente de inibição.

[0066] Ainda em outra modalidade, em adição à determinação do efeito de um agente de teste sobre a inibição de proteínas virais que contêm um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina, os agentes de teste são avaliados em rela- ção a qualquer atividade citotóxica que possam exibir em direção a uma célula eucariótica viva, utilizando ensaios bem conhecidos, tais como exclusão com corante azul de tripano, um ensaio com MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-i1)-2,5-difenil-2H-tetrazólio) e simila- res. Os agentes que não exibem atividade citotóxica significativa po- dem ser considerados agentes preferidos para o desenvolvimento adi- cional como fármacos.

[0067] Ainda em outra modalidade, o agente de inibição, quando administrado em uma ou mais doses a um indivíduo infectado com um vírus que é descrito aqui (por exemplo, um ser humano), reduz a carga viral no indivíduo em pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo me- nos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximada- mente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproxi-

madamente 80% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, com- parada com a carga viral no indivíduo não tratado com o agente de ini- bição. Agentes de Inibição

[0068] As modalidades da presente descrição fornecem agentes de inibição que podem ser utilizados para tratar um hospedeiro infec- tado por um vírus da família de vírus Flaviviridae. Em particular, Flavi- viridae sem ser HCV. Em particular, o agente de inibição pode ser utili- zado para tratar hospedeiros infectados com vírus da Hepatite C ou coinfecções, em particular HCV + HIV. O agente de inibição pode estar em um ou mais dos grupos a seguir: inibidores de proteína quinases AAK1 ou GAK, que regulam adaptador da clatrina de proteína viral, tal como AP2M1 (ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina), se ligam e medeiam a montagem e/ou o brotamento do vírus. Uma vez que a AP2M1 e outras subunidades py de complexos AP da clatrina medeiam vários estágios nos ciclos de vida de vários vírus, a inibição de AP2M1 e outras subunidades py de complexos AP da clatrina, tal como através da inibição de suas proteína quinases ou fosfatases re- guladoras, pode afetar ou inibir vários vírus. Consequentemente, as proteína quinases que regulam estas proteínas do hospedeiro podem ser funcionalmente relevantes em outras famílias de vírus. Embora não seja exclusivamente específico (como a maioria dos compostos), os inibidores de proteína quinases descobertos se ligam a AAK1I ou GAK com altas afinidades comparadas com as de seus outros alvos e não possuem efeito sobre a replicação do RNA do HCV, demonstrando uma seletividade relativamente boa.

[0069] Outros agentes que encontram uso como inibidores de GAK e AAK1 incluem, mas não estão limitados a, RNAi, antissenso, ribozi- mas ou moléculas pequenas que competem com erlotinib, sunitinib ou PKC-412 pela ligação a GAK ou AAK1. Em adição, os inibidores que são capazes de competir com motivos YXXO ou de dileucina pela liga- ção às proteínas do hospedeiro incluem, mas não estão limitados a, agentes de ligação tais como anticorpos direcionados para YXXO ou dileucina ou contra AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina. Em adição, proteínas de ligação negativa dominante ou aptâmeros podem inibir GAK ou AAK1. Em outra modalidade, recepto- res de "armadilha" ou polipeptídeos que correspondem ao sítio de liga- ção a YXXO ou dileucina da AP2M1 e outras subunidades py de com- plexos AP da clatrina podem inibir GAK ou AAK1.

[0070] As modalidades da presente invenção incluem sais dos a- gentes de inibição. As modalidades da presente invenção incluem pro- fármacos dos agentes de inibição. As modalidades da invenção inclu- em nas composições, composições farmacêuticas, composições líqui- das, composições em gel e similares, cada uma contendo um agente de inibição identificado aqui e cada uma destas composições, em uma modalidade, pode estar na forma de uma formulação de liberação con- trolada ou de liberação prolongada. Em uma modalidade, o agente de inibição pode ser utilizado em combinação com outro agente utilizado para tratar uma infecção por vírus da família Flaviviridae e como ob- servado anteriormente, qualquer um dos agentes (o agente de inibição e o outro agente) ou ambos os agentes podem estar na forma de uma liberação controlada ou uma liberação prolongada. Em alguns casos, o termo "agente de inibição" pode ser referido como um agente ativo ou um fármaco. Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração

[0071] As modalidades da presente descrição incluem um ou mais agentes de inibição identificados aqui e formulados com um ou mais excipientes, diluentes, carreadores e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em adição, as modalidades da presente invenção incluem tais agentes de inibição formulados com uma ou mais substâncias au-

xiliares farmaceuticamente aceitáveis. Em particular, um ou mais agen- tes de inibição podem ser formulados com um ou mais excipientes, di- luentes, carreadores e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis para a obtenção de uma modalidade de uma composição da invenção.

[0072] Em uma modalidade, o agente de inibição pode ser combi- nado com outro agente antiviral para preparar uma composição da in- venção e a composição pode incluir um ou mais excipientes, diluentes, carreadores e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0073] Em uma modalidade, um agente de inibição que inibe a li- gação de uma proteína que contém um motivo YXXO ou de dileucina a uma proteína adaptadora da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina (referido a seguir como "um agente ativo de objetivo" ou "fármaco") pode ser formulado com um ou mais excipientes, diluentes, veículos e/ou adjuvantes far- maceuticamente aceitáveis.

[0074] Uma ampla variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis foram amplamente descritos em uma variedade de publica- ções, incluindo, por exemplo, Gennaro (2000), "Remington: The Scien- ce and Practice of Pharmacy"; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999); e Handbook of Pharmaceutical Excipi- ents (2000).

[0075] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, carreadores ou diluentes, estão facilmente dispo- níveis para o público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuti- camente aceitáveis, tais como agentes de ajuste e tamponantes do pH, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizadores, agentes umectantes e similares, estão facilmente disponíveis para o público.

[0076] Em uma modalidade da presente descrição, o agente de inibição é administrado ao hospedeiro utilizando quaisquer meios ca-

pazes de resultar no efeito desejado (por exemplo, redução na carga viral, redução na fibrose do fígado, aumento na função do fígado e si- milares). Assim, o agente de inibição pode ser incorporado dentro de uma variedade de formulações para administração terapêutica. Por exemplo, o agente de inibição pode ser formulado em composições farmacêuticas através da combinação com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados e pode ser formulado em preparações nas formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis.

[0077] Nas formas de dosagem farmacêutica, o agente de inibição pode ser administrado na forma de seus sais farmaceuticamente acei- táveis ou um agente ativo de objetivo pode ser utilizado isoladamente ou em associação apropriada, bem como em combinação, com outros compostos farmaceuticamente ativos. Os métodos e os excipientes a seguir são meramente exemplos e não são de forma alguma limitantes.

[0078] Para preparações orais, o agente de inibição pode ser utili- zado isoladamente ou em combinação com aditivos apropriados para produzir comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tal como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com agentes aglutinantes, tal como celulose cristali- na, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com agentes de desintegração, tal como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose de sódio; com lubrificantes, tal como talco ou estearato de magnésio; e se desejado, com diluentes, agentes tampo- nantes, agentes umectantes, conservantes e agentes aromatizantes.

[0079] As modalidades do agente de inibição podem ser formula- das em preparações para injeção através de dissolução, suspensão ou emulsificação do mesmo em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos de ácidos alifáti-

cos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno gli- col; e se desejado, com aditivos convencionais tais como solubilizan- tes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizantes e conservantes.

[0080] As modalidades do agente de inibição podem ser utilizadas na formulação em aerossol que será administrada através de inalação. As modalidades do agente de inibição podem ser formuladas em pro- pelentes aceitáveis pressurizados tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e similares.

[0081] Além disso, as modalidades do agente de inibição podem ser produzidas em supositórios através da mistura com uma variedade de bases tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. As modalidades do agente de inibição podem ser administradas de forma retal através de um supositório. O supositório pode incluir veícu- los tais como manteiga de cacau, carboceras e polietileno glicóis, que se fundem à temperatura do corpo e ainda ficam solidificados à tempe- ratura ambiente.

[0082] Podem ser fornecidas formas de dosagem unitária para administração oral ou retal, tais como xaropes, elixires e suspensões, em que cada unidade de dosagem, por exemplo, colher de chá, colher de sopa, comprimido ou supositório, contém uma quantidade pré- determinada de uma composição que contém um ou mais agentes de inibição. Similarmente, as formas de dosagem unitária para adminis- tração por injeção ou intravenosa podem compreender o agente de ini- bição em uma composição na forma de uma solução em água esterili- zada, solução salina normal ou outro carreador farmaceuticamente a- ceitável.

[0083] As modalidades do agente de inibição podem ser formula- das em uma composição injetável de acordo com a invenção. Tipica- mente, as composições injetáveis são preparadas na forma de solu-

ções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também po- dem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou o ingrediente ativo (agente de inibição) encapsulado em veículos de |li- possomos de acordo com a invenção.

[0084] Em uma modalidade, o agente de inibição é formulado para fornecimento através de um sistema de fornecimento contínuo. O ter- mo "sistema de fornecimento contínuo" é utilizado de forma intercam- biável aqui com "sistema de fornecimento controlado" e abrange dis- positivos de fornecimento contínuo (por exemplo, controlado) (por e- xemplo, bombas) em combinação com cateteres, dispositivos de inje- ção e similares, cuja uma ampla variedade é conhecida na técnica.

[0085] Bombas de infusão mecânica ou eletromecânica também podem ser adequadas para uso com a presente descrição. Os exem- plos de tais dispositivos incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 4.692.147; 4.360.019; 4.487.603; 4.360.019; 4.725.852;

5.820.589; 5.643.207; 6.198.966; e similares. Em geral, o fornecimento do agente de inibição pode ser realizado utilizando qualquer um de uma variedade de sistemas de bombas que podem ser reabastecidos. As bombas fornecem liberação controlada coerente ao longo do tempo. Em algumas modalidades, o agente de inibição é uma formulação lí- quida em um reservatório impermeável ao fármaco e é fornecido de uma maneira contínua para o indivíduo.

[0086] Em uma modalidade, o sistema de fornecimento de fármaco é um dispositivo pelo menos parcialmente implantável. O dispositivo implantável pode ser implantado em qualquer local de implantação a- dequado utilizando métodos e dispositivos bem conhecidos na técnica. Um local de implantação é um local dentro do corpo de um indivíduo em que um dispositivo de fornecimento de fármaco é introduzido e po- sicionado. Os locais de implantação incluem, mas não estão necessa-

riamente limitados a um local subdérmico, subcutâneo, intramuscular ou outro adequado dentro do corpo de um indivíduo. Os locais de im- plantação subcutânea são utilizados em algumas modalidades por causa da conveniência no implante e na remoção do dispositivo de for- necimento de fármaco.

[0087] Os dispositivos de liberação de fármaco adequados para uso na descrição podem ser baseados em qualquer uma de uma vari- edade de modos de operação. Por exemplo, o dispositivo de liberação de fármaco pode ser baseado em um sistema de difusão, um sistema convectivo ou um sistema que pode sofrer erosão (por exemplo, um sistema à base de erosão). Por exemplo, o dispositivo de liberação de fármaco pode ser uma bomba eletroquímica, uma bomba osmótica, uma bomba eletro-osmótica, uma bomba de pressão de vapor ou uma matriz de ruptura osmótica, por exemplo, quando o fármaco for incor- porado dentro de um polímero e o polímero fornece a liberação da formulação de fármaco concomitante com a degradação de um materi- al polimérico impregnado com fármaco (por exemplo, um material po- limérico impregnado com fármaco biodegradável). Em outras modali- dades, o dispositivo de liberação de fármaco é baseado em um siste- ma de eletrodifusão, uma bomba eletrolítica, uma bomba efervescente, uma bomba piezelétrica, um sistema hidrolítico etc.

[0088] Os dispositivos de liberação de fármaco baseados em uma bomba de infusão mecânica ou eletromecânica também podem ser adequados para uso com a presente descrição. Os exemplos de tais dispositivos incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 4.692.147; 4.360.019; 4.487.603; 4.360.019; 4.725.852 e simila- res. Em geral, um método de tratamento de objetivo pode ser realizado utilizando qualquer de uma variedade de sistemas de bombas não permutáveis que podem ser reabastecidas. As bombas e outros siste- mas convectivos são geralmente preferidos devido a sua liberação controlada geralmente mais coerente ao longo do tempo. Bombas os- móticas são utilizadas em algumas modalidades devido as suas vanta- gens combinadas de liberação controlada mais coerente e seu tama- nho relativamente pequeno (ver, por exemplo, o Pedido de Patente Publicado PCT no. WO 97/27840 e Pat. U.S. Nos. 5.985.305 e

5.728.396). Os exemplos de dispositivos controlados osmoticamente adequados para uso na descrição incluem, mas não estão necessari- amente limitados àqueles descritos nas Pat. U.S. Nos. 3.760.984;

3.845.770; 3.916.899; 3.923.426; 3.987.790; 3.995.631; 3.916.899;

4.016.880; 4.036.228; 4.111.202; 4.111.203; 4.203.440; 4.203.442;

4.210.139; 4.327.725; 4.627.850; 4.865.845; 5.057.318; 5.059.423;

5.112.614; 5.137.727; 5.234.692; 5.234.693; 5.728.396; e similares.

[0089] Em algumas modalidades, o dispositivo de fornecimento de fármaco é um dispositivo implantável. O dispositivo de fornecimento de fármaco pode ser implantado em qualquer local de implantação ade- quando utilizando métodos e dispositivos bem conhecidos na técnica. Como observado aqui, um local de implantação é um local dentro do corpo de um indivíduo no qual um dispositivo de fornecimento de fár- maco é introduzido e posicionado. Os locais de implantação incluem, mas não estão necessariamente limitados a um local subdérmico, sub- cutâneo, intramuscular ou outro adequado dentro do corpo de um indi- víduo.

[0090] Em algumas modalidades, um agente ativo é fornecido utili- zando um sistema de fornecimento de fármaco implantável, por exem- plo, um sistema que pode ser programado para a obtenção da adminis- tração do agente. Os exemplos de sistemas implantáveis que podem ser programados incluem bombas de infusão implantáveis. Os exem- plos de bombas de infusão implantáveis ou dispositivos úteis em asso- ciação com tais bombas são descritos, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 4.350.155; 5.443.450; 5.814.019; 5.976.109; 6.017.328;

6.171.276; 6.241.704; 6.464.687; 6.475.180; e 6.512.954. Um exemplo adicional de dispositivo que pode ser adaptado para a presente descri- ção é a Bomba de Infusão Synchromed (Medtronic).

[0091] Os veículos excipientes adequados para o agente de inibi- ção são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou similar e combinações dos mesmos. Em adição, se desejado, o ve- ículo pode conter menores quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou de emulsificação ou agentes tamponan- tes do pH. Os métodos de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos ou serão evidentes após a consideração desta descrição, para os peritos na técnica. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceu- tical Sciences, 17º edição, 1985. A composição ou a formulação que será administrada irá, em qualquer evento, conter uma quantidade do agente de inibição adequada para atingir o estado desejado no indiví- duo que será tratado.

[0092] As composições da presente invenção incluem aquelas que compreendem uma matriz de liberação prolongada ou de liberação controlada. Em adição, as modalidades da presente invenção podem ser utilizadas em associação com outros tratamentos que utilizam for- mulações de liberação prolongada. Como utilizado aqui, uma matriz de liberação prolongada é uma matriz feita de materiais, geralmente polí- meros, que são degradáveis por hidrólise enzimática ou à base de áci- do ou por dissolução. Uma vez inserida dentro do corpo, a matriz é ati- vada por enzimas e fluidos corporais. De forma desejável, uma matriz de liberação prolongada é escolhida partindo de materiais biocompatí- veis tais como lipossomos, polilactidas (ácido poliláctico), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactida coglicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli(orto)ésteres, polipep- tídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos car- boxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos nuclei-

cos, poliaminoácidos, aminoácidos tais como fenilalanina, tirosina, iso- leucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e sili- cone. As matrizes biodegradáveis ilustrativas incluem uma matriz de polilactida, uma matriz de poliglicolida e uma matriz de polilactida co- glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico).

[0093] Em outra modalidade, a composição farmacêutica da pre- sente descrição (bem como composições de combinação) é fornecida em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente de ini- bição pode ser administrado utilizando infusão intravenosa, uma bom- ba osmótica implantável, um adesivo transdermal, lipossomos ou ou- tros modos de administração. Em uma modalidade, uma bomba pode ser utilizada (Sefton 1987; Buchwald e outros 1980; Saudek e outros 1989). Em outra modalidade, materiais poliméricos são utilizados. Ain- da em outra modalidade um sistema de liberação controlada é coloca- do em proximidade do alvo terapêutico, isto é, do fígado, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica. Ainda em outra modali- dade, um sistema de liberação controlada é colocado em proximidade do alvo terapêutico, requerendo assim apenas uma fração da dose sis- têmica. Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na re- visão por Langer (1990).

[0094] Em outra modalidade, as composições da presente inven- ção (bem como composições de combinação separadamente ou jun- tas) incluem aquelas formadas através da impregnação de um agente de inibição descrito aqui dentro de materiais absortivos, tais como su- turas, bandagens e gaze ou revestido sobre a superfície de materiais em fase sólida, tais como grampos cirúrgicos, zíperes e cateteres para fornecer as composições. Outros sistemas de fornecimento deste tipo serão facilmente evidentes para os peritos na técnica em vista da pre- sente descrição. Métodos de Tratamento

[0095] As modalidades da presente invenção incluem métodos de tratamento de uma infecção através da infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfec- ções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV. Em particular, os agentes de inibição descritos aqui podem ser utilizados para tratar uma infecção por um vírus da família de vírus Flaviviridae. Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de tratamento de um hospedei- ro infectado com um vírus como descrito anteriormente através da ad- ministração ao hospedeiro de uma quantidade terapeuticamente efici- ente de um agente de inibição em uma ou mais doses, para reduzir a carga viral no hospedeiro.

[0096] As modalidades da presente invenção incluem métodos de tratamento de forma profilática de uma infecção por uma infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCVWV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV. Em particular, os agentes de inibição descritos aqui podem ser utilizados para tratar de forma profilática uma infecção por um vírus da família de vírus Flavivi- ridae. Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de tratamento de forma profilática de um hospedeiro infectado com um vírus da família de vírus Flaviviridae através da administração ao hos- pedeiro de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de inibição em uma ou mais doses, para reduzir a carga viral no hos- pedeiro. Em uma modalidade, um método de tratamento de forma pro- filática de um hospedeiro infectado com um vírus da família de vírus Flaviviridae, o método compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de inibi-

ção para reduzir a carga viral no hospedeiro. Detalhes adicionais em relação a clemizol e dosagem de clemizol são descritos anteriormente.

[0097] Em uma modalidade, os agentes de inibição descritos aqui são utilizados em combinação com outro agente (por exemplo, um a- gente antiviral) para tratar uma infecção com infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfec- ções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV. Em uma modalidade, os agen- tes de inibição descritos aqui são utilizados em combinação com outro agente (por exemplo, um agente antiviral) para tratar de forma profiláti- ca uma infecção com um vírus da família de vírus Flaviviridae. As mo- dalidades do método envolvem a administração a um indivíduo que necessita da mesma de um ou mais agentes de inibição que inibem a ligação de proteínas virais que contêm um motivo YXXO ou de dileuci- na às proteínas adaptadoras da clatrina do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades pu de complexos AP da clatrina. Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma infecção por flavivírus, por exemplo, uma infecção causada por HCV e métodos de redução da fibrose do fígado que pode ocorrer co- mo sequela de uma infecção causada por HCV.

[0098] Em uma modalidade, o agente de inibição inclui um ou mais de agentes de inibição descritos anteriormente. Em várias modalida- des, o agente de inibição é um inibidor de proteína quinase, tal como inibidores de AAK1 ou GAK, que regulam a ligação de proteína viral- AP2M1 ou a ligação de uma proteína viral a outras subunidades p de complexos AP da clatrina e mediam a montagem e/ou o brotamento do vírus ou variantes destas proteínas dos mesmos.

[0099] Em uma modalidade, uma quantidade eficiente do agente de inibição é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um hospedeiro (por exemplo, ser humano) que necessita da mesma, reduz a carga viral no indivíduo em pelo menos aproxima- damente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos apro- ximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo me- nos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximada- mente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproxi- madamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, com- parada com a carga viral no indivíduo não tratado com o agente de ini- bição.

[00100] A carga viral pode ser medida através da medida do título ou do nível de vírus no soro.

[00101] Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) e um teste de DNA ramificado (DDNA). Os ensaios quantitativos para a medida da carga viral (título) de RNA DO HCV foram desenvolvidos. Muitos tais ensaios estão disponíveis comercialmente, incluindo uma PCR com transcrição reversa quantitativa (GRT-PCR) (Amplicor HCV Monitor.TM., Roche Molecular Systems, New Jersey); e um ensaio de amplificação de sinal de DNA ramificado [Quantiplex'" HCV RNA Assay (bDNA), Chiron Corp., Emeryville, CA.]. Ver, por exemplo, Gretch e outros (1995). Também é de interesse um teste de ácido nucleico (NAT) vendido pela Chiron Corporation sob o nome comercial Procleix"", cujo NAT testa simultaneamente em relação à presença de HIV-1 e HCV (Vargo e ou- tros 2002).

[00102] Em algumas modalidades, uma quantidade eficiente do a- gente de inibição é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um hospedeiro (por exemplo, humano) que necessita da mesma, aumenta a função do fígado no indivíduo em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo me- nos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximada- mente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproxi- madamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos a- proximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, comparada com a função do fígado no indivíduo não tratado com o a- gente de inibição.

[00103] Em algumas modalidades, uma quantidade eficiente do a- gente de inibição é uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um hospedeiro (por exemplo, um humano) que neces- sita da mesma, reduz a fibrose do fígado no hospedeiro em pelo me- nos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximada- mente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproxi- madamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos a- proximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo me- nos aproximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% ou mais, comparada com o grau de fibrose do fígado no indivíduo não tra- tado com o agente de inibição.

[00104] As modalidades da presente descrição fornecem métodos, agentes de inibição e formulações farmacêuticas úteis no tratamento de pacientes sofrendo de uma infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCVWV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV. Em uma modalidade, o paciente é coin- fectado com Flaviviridae sem ser HCV. Em uma modalidade, o pacien- te é infectado com HCV, mas não é sabido que é infectado com outro vírus, incluindo, mas não limitado ao HIV. Em outra modalidade, o pa- ciente é infectado com HCV e um ou mais vírus adicionais, incluindo, mas não limitados ao HIV. Em uma modalidade, o paciente é tratado para uma infecção viral através da administração apenas de um único agente de inibição que é descrito aqui como útil no tratamento de in- fecção causada por HCV. Em outra modalidade, o paciente é tratado para uma infecção viral através da administração de ambos os agentes de inibição descritos aqui como úteis no tratamento de infecção causa- da por HCV bem como um ou mais agentes adicionais conhecidos co- mo sendo úteis no tratamento de infecção viral, incluindo, mas não |li- mitados a fármacos para o tratamento de HIV, tal como Atripla, Com- plera, Combivir, Retrovir, Truvada, Viracept, Fuzeon, Selzentry, Isen- tress ou similar. Em uma modalidade, o um ou mais agentes adicionais não incluem um antagonista de CCR-5. Em outra modalidade, o um ou mais agentes adicionais incluem um antagonista de CCR-5 e o pacien- te é infectado com HCV, mas não é sabido se é infectado (ou não é infectado) com HIV.

Dosagens

[00105] As modalidades do agente de inibição podem ser adminis- tradas a um hospedeiro em uma ou mais doses. Em uma modalidade, o agente de inibição pode ser administrado em uma quantidade de a- proximadamente 10 mg até 1000 mg por dose, por exemplo, aproxi- madamente 10 mg até 20 mg, aproximadamente 20 mg até 25 mg, a-

proximadamente 25 mg até 50 mg, aproximadamente 50 mg até 75 mg, aproximadamente 75 mg até 100 mg, aproximadamente 100 mg até 125 mg, aproximadamente 125 mg até 150 mg, aproximadamente 150 mg até 175 mg, aproximadamente 175 mg até 200 mg, aproxima- damente 200 mg até 225 mg, aproximadamente 225 mg até 250 mg, aproximadamente 250 mg até 300 mg, aproximadamente 300 mg até 350 mg, aproximadamente 350 mg até 400 mg, aproximadamente 400 mg até 450 mg, aproximadamente 450 mg até 500 mg, aproximada- mente 500 mg até 750 mg ou aproximadamente 750 mg até 1000 mg por dose.

[00106] Em uma modalidade, a quantidade do agente de inibição por dose é determinada em uma base em peso do corpo. Por exemplo, em uma modalidade, o agente de inibição pode ser administrado em uma quantidade de aproximadamente 0,5 mg/kg até 100 mg/Kg, por exemplo, aproximadamente 0,5 mg/kg até 1 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg até 2 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg até 3 mg/kg, aproxi- madamente 3 mg/kg até 5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg até 7 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg até aproximadamente 10 mg/kg, a- proximadamente 10 mg/kg até 15 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg até 20 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg até 25 mg/Kg, aproximada- mente 25 mg/kg até 30 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg até 40 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg até 50 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg até 60 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg até 70 mg/kg, apro- ximadamente 70 mg/kg até 80 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg até 90 mg/kg ou aproximadamente 90 mg/kg até 100 mg/kg ou mais que aproximadamente 100 mg/kg.

[00107] Os peritos irão facilmente considerar que os níveis de do- ses podem variar como uma função do agente de inibição específico administrado, da gravidade dos sintomas e da suscetibilidade do indi- víduo a efeitos colaterais. As dosagens preferidas para certo composto são facilmente determináveis pelos peritos na técnica através de uma variedade de meios.

[00108] Em uma modalidade, várias doses do agente de inibição são administradas. A frequência de administração do agente de inibi- ção pode variar dependendo de qualquer uma de uma variedade de fatores, por exemplo, gravidade dos sintomas e similares. Por exem- plo, em uma modalidade, o agente de inibição é administrado uma vez ao mês, duas vezes ao mês, três vezes ao mês, em semanas alterna- das (gow), uma vez por semana (qw), duas vezes por semana (biw), três vezes por semana (tiw), quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, em dias alternados (god), diariamente (qd), duas vezes ao dia (gid) ou três vezes ao dia (tid). Como discutido anteriormente, em uma modalidade, o agente de inibição é administra- do continuamente.

[00109] A duração da administração do agente de inibição, por e- xemplo, o período de tempo ao longo do qual o agente de inibição é administrado, pode variar, dependendo de qualquer uma de uma vari- edade de fatores, por exemplo, resposta do paciente etc. Por exemplo, o agente de inibição pode ser administrado ao longo de um período de tempo de aproximadamente um dia até uma semana, aproximadamente duas semanas até quatro semanas, aproximadamente um mês até dois meses, aproximadamente dois meses até quatro meses, aproximada- mente quatro meses até seis meses, aproximadamente seis meses até oito meses, aproximadamente oito meses até 1 ano, aproximadamente 1 ano até 2 anos ou aproximadamente 2 anos até 4 anos ou mais. Vias de Administração

[00110] As modalidades da presente invenção fornecem métodos e composições para a administração do agente de inibição a um hospe- deiro (por exemplo, um humano) utilizando qualquer método disponível e rota adequada para o fornecimento de fármaco, incluindo métodos in vivo e ex vivo, bem como vias de administração sistêmicas e localizadas.

[00111] As vias de administração incluem vias de administração in- tranasais, intramusculares, intratraqueais, subcutâneas, intradermais, aplicação tópica, intravenosas, retais, nasais, orais e outras entéricas e parenterais. As vias de administração podem ser combinadas, se de- sejado ou ajustadas dependendo do agente e/ou do efeito desejado. Um agente ativo pode ser administrado em uma única dose ou em vá- rias doses.

[00112] As modalidades do agente de inibição podem ser adminis- tradas a um hospedeiro utilizando métodos convencionais disponíveis e vias adequadas para o fornecimento de fármacos convencionais, in- cluindo vias sistêmicas ou localizadas. Em geral, as vias de adminis- tração consideradas pela descrição incluem, mas não estão limitadas a, vias entéricas, parenterais ou por inalação.

[00113] As vias de administração parenterais sem ser a administra- ção por inalação incluem, mas não estão limitadas às vias tópicas, transdermais, subcutâneas, intramusculares, intraorbitais, intracapsula- res, intraespinhais, intraesternais e intravenosas, isto é, qualquer rota de administração sem ser através do canal alimentar. A administração parenteral pode ser conduzida para efetuar fornecimento sistêmico ou local do agente de inibição. Quando o fornecimento sistêmico for dese- jado, a administração envolve tipicamente a administração tópica ou mucosal invasiva ou absorvida de forma sistêmica de preparações farmacêuticas.

[00114] O agente de inibição também pode ser fornecido ao indiví- duo através de administração entérica.

[00115] As vias de administração entéricas incluem, mas não estão limitadas ao fornecimento oral e retal (por exemplo, utilizando um su- positório).

[00116] Os métodos de administração do agente de inibição através da pele ou da mucosa incluem, mas não estão limitados à aplicação tópica de uma preparação farmacêutica adequada, à transmissão transdermal, à injeção e à administração epidérmica. Para a transmis- são transdermal, promotores de absorção ou iontoforeses são métodos adequados. A transmissão iontoforética pode ser realizada utilizando "adesivos" disponíveis comercialmente que fornecem seu produto con- tinuamente por pulsos elétricos através da pele intacta ao longo de pe- ríodos de vários dias ou mais. Terapias de Combinação

[00117] As modalidades da presente invenção incluem métodos, agentes de inibição e formulações farmacêuticas para o tratamento de infecção viral. As modalidades dos agentes de inibição e formulações farmacêuticas úteis nos métodos da presente descrição podem ser empregadas em combinação com outros agentes antivirais para tratar infecção viral. Em uma modalidade, de acordo com os métodos da presente invenção, um agente de inibição que é utilizado para tratar um hospedeiro infectado por infecção viral de vírus que se ligam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se li- gam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser HCV é utilizado em combinação com um ou mais outros agentes antivirais para tratar a infecção. Em uma modalidade, de acordo com os métodos da presente invenção, um agente de inibi- ção que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que con- tém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina (também referido aqui como um "antagonista de YXXO ou dileucina do HCV") pode ser utilizado em combinação com um ou mais outros agen- tes antivirais para tratar infecção viral.

[00118] Por exemplo, a prática médica atual para tratar infecção causada por HCV tipicamente emprega terapia de combinação com ribavirina (tal como Rebetol ou Copegus), um interferon-alfa (tal como interferon alfa 2b) ou interferon peguilado (tal como Pegasys, comer- cializado pela Roche ou PEG-Intron, comercializado pela Schering Plough) e um inibidor de protease. De acordo com os métodos da pre- sente descrição, um composto de inibição pode ser utilizado em com- binação com estas terapias padronizadas para tratar infecção causada por HCV.

[00119] Um número de inibidores de protease e de polimerase do HCV está aprovado ou em desenvolvimento para o tratamento de in- fecção causada por HCV e de acordo com os métodos da presente descrição, a coadministração de um agente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXX$O ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina e um inibidor de protease do HCV pode ser eficaz no tratamento de HCV. Em uma modalidade, um interferon alfa e/ou um análogo de nucleosídeo tal como ribavirina é/são também empregado(s) nesta terapia de combinação. Os inibido- res de protease do HCV adequados incluem, mas não estão limitados a, telaprevir (VX-950, Vertex), BILN 2061 e BI12202 (Boehringer Inge- lheim), boceprevir (SCH 503034, Schering Plough), ITMN191 (Ro- che/Intermoune/Array BioPharma), MK-7009 (Merck), TMC435350 (Ti- botec/Medivir), ACH-1095 e ACH-806 (Achillion/Gilead) e outros inibi- dores de NS3/NS4A protease, incluindo, mas não limitados a, compos- tos em desenvolvimento por Presídio.

[00120] De acordo com os métodos da presente descrição, a coad- ministração de um agente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXQO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades yu de complexos AP da clatrina e um inibidor de RNA polimerase do HCV pode ser eficaz no tratamento de HCV. Em uma modalidade, um inter- feron alfa e/ou um análogo de nucleosídeo tal como ribavirina e/ou um inibidor de protease do HCV é/são também empregado(s) nesta tera- pia de combinação. Os inibidores de RNA polimerase do HCV ade- quados incluem, mas não estão limitados a, valopicitabina (NM283, Idenix/Novartis), HCV-796 (Wyeth/ViroPharma), R1626 (Roche), R7128 (Roche/Pharmasset), GS-9190 (Gilead), MK-0608 (Merck), PSI- 6130 (Pharmasset) e PFE-868,554 (PFE). Em uma modalidade, o mé- todo fornece tratamentos de combinação com agentes que inibem A- AK1 e GAK.

[00121] Um número de agonistas do receptor similar a toll (TLR) está em desenvolvimento para o tratamento de infecção causada por HCV e de acordo com os métodos da presente descrição, a coadminis- tração de um antagonista de YXXO ou dileucina que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subu- nidades yu de complexos AP da clatrina e um agonista de TLR pode ser eficaz no tratamento de HCV. Em uma modalidade, um interferon alfa e/ou um análogo de nucleosídeo tal como ribavirina e/ou um inibidor de protease do HCV e/ou um inibidor de RNA polimerase do HCV é/são também empregado(s) nesta terapia de combinação. Os agonistas de TLR adequados incluem, mas não estão limitados a, agonistas de TLR7 [isto é, ANA245 e ANA975 (Anadys/Novartis)] e agonistas de TLRA9 [isto é, Actilon (Coley) e IMO-2125 (Idera)].

[00122] Um número de derivados de tiazolida está em desenvolvi- mento para o tratamento de infecção causada por HCV e de acordo com os métodos da presente descrição, a coadministração de um an- tagonista que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina e uma tiazolida, incluindo, mas não limitada a, Nitazoxanida (Alinia ou outras formulações de liberação prolongada de nitazoxanida ou outras tiazolidas, Romark Laboratories) pode ser eficaz no tratamento de HCV. Em uma modalidade, um interferon alfa e/ou um análogo de nu- cleosídeo tal como ribavirina e/ou um inibidor de protease do HCV e/ou um inibidor de RNA polimerase do HCV e/ou um agonista de TLR é/são também empregado(s) nesta terapia de combinação.

[00123] Em outra modalidade dos métodos da presente descrição, a coadministração de um agente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de di- leucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subuni- dades yu de complexos AP da clatrina e um inibidor de ciclofilina [isto é, NIM-811 (Novartis) e DEBIO-025 (Debiopharm)] e/ou um inibidor de alfa-glucosidase [isto é, Celgosivir (Migenix)] e/ou um ou mais agentes de uma ou mais das outras classes de agentes terapêuticos para HCV discutidos aqui é utilizada para tratar infecção causada por HCV.

[00124] Outros agentes que podem ser utilizados em combinação com agentes de inibição da presente descrição que previnem a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subu- nidades py de complexos AP da clatrina incluem (i) agentes que se di- recionam a NS5A, incluindo, mas não limitados a, A-831 (Arrow Thera- peutics), AZD2836 (Astra Zeneca) e agentes em desenvolvimento pela XTL/Presidio ou BMS (ver as Publicações PCT WO 2006/133326 e WO 2008/021928, incorporadas aqui como referência); (ii) agentes que se direcionam a TBC1D20 e/ou interação com NSS5A com TBC1D20 (ver a Publicação PCT WO 2007/018692 e o Pedido de Patente U.S. No. de Série 11/844.993, incorporados aqui como referência), (iii) a- gentes que se direcionam à atividade de GTPase de NS4B (ver a Pu- blicação PCT WO 2005/032329 e a Publicação do Pedido de Patente

US 2006/0199174, incorporados aqui como referência); (iv) agentes que inibem a associação com a membrana mediada pelas hélices anfi- páticas do HCV, tais como aqueles encontrados em NS5A, NS4B e NS5B (ver a Publicação PCT WO 2002/089731, supra), (v) agentes que se direcionam a domínios PIP2 ou BAAPP nas proteínas do HCV, tais como aqueles encontrados em NS4B e NS5A (ver o Pedido de Pa- tente U.S. Provisório 60/057.188, supra); (vi) agentes que se direcio- nam à entrada, à montagem ou à liberação do HCV, incluindo anticor- pos para correceptores; (vii) agentes que se direcionam à NS3 helica- se do HCV; (vili) siRNAs, SshRNAs, RNAs antissenso ou outras molécu- las baseadas no RNA que se direcionam às sequências no HCV; (ix) agentes que se direcionam a microRNA122 ou outros micro-RNAs que modulam a replicação do HCV; (x) agentes que se direcionam às inte- rações ou às vias de PD-1, PD-L1 ou PD-L2 (ver as Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2008/0118511, 2007/0065427, 2007/0122378, incorporadas aqui como referência); e (xi) agentes que se direcionam à função de hélice anfipática do HCV, tais como inibido- res de AH2.

[00125] Em outra modalidade da presente descrição, um agente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina é utilizado em combinação com um ou mais fármacos capazes de tra- tar uma infecção por HIV para tratar um paciente que está coinfectado com HIV e HCV. Em outra modalidade da presente descrição, um a- gente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina é utilizado em combinação com um ou mais fármacos capazes de tratar uma infecção por HBV para tratar um paciente que está coinfectado com HBV e HCV. Em uma modalidade, um agente de inibição que previne a ligação de pelo menos uma proteína viral que contém um motivo YXXO ou de dileucina às proteínas do hospedeiro tal como AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina é utilizado em combinação com um inibidor de PD-L1 para tratar uma infecção viral.

[00126] Como mencionado anteriormente, as modalidades da pre- sente incluem a administração de um agente de inibição identificado aqui (ou através da utilização de uma modalidade da verificação da invenção) em associação com pelo menos um agente terapêutico adi- cional para tratar uma infecção viral. Os agentes terapêuticos adicio- nais adequados incluem, mas não estão limitados a, ribavirina; um análogo de nucleosídeo (por exemplo, levovirina, viramidina etc.); um inibidor de NS3; um inibidor de NS5; um interferon; e um agente de controle de efeitos colaterais.

[00127] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adequado adicional inclui ribavirina. A ribavirina, 1-B-D-ribofuranosil- 1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida, disponível na ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif., é descrita no Merck Index, composto No. 8199, Décima Primeira Edição. Sua produção e formulação são descritas na Pat. U.S. No. 4.211.771. A descrição também considera o uso de deriva- dos de ribavirina (ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 6.277.830).

[00128] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adequado adicional inclui levovirina. A levovirina é o L-enanciômero de ribavirina e exibe a propriedade de aumentar uma resposta imuno- lógica de Th1 em relação a uma resposta imunológica de Th2. A levo- virina é fabricada pela ICN Pharmaceuticals.

[00129] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adequado adicional inclui viramidina. A viramidina é um derivado de3- carboxamidina de ribavirina e atua como um pró-fármaco de ribavirina.

É eficientemente convertida em ribavirina por adenosina desaminases.

[00130] Os análogos de nucleosídeo que são adequados para uso em uma terapia de combinação incluem, mas não estão limitados a, ribaviri- na, levovirina, viramidina, isatoribina, um nucleosídeo de L-ribofuranosil que é divulgado na Pat. U.S. No. 5.559.101 e abrangido pela Fórmula | da Pat. U.S. No. 5.559.101 (por exemplo, 1-B-L-ribofuranosiluracila, 1- B-L-ribofuranosil-5-fluorouracila, 1-B-L-ribofuranosilcitosina, 9-B-L-ribo- furanosiladenina, 9-B-L-ribofuranosilhipoxantina, 9-B-L-ribofuranosilgua- nina, 9-B-L-ribofuranosil-6-tioguanina, 2-amino-ao-L-ribofurani[1',2': 4,5] oxazolina, O>2,O>-anidro-1-a-L-ribofuranosiluracila, 1-o-L-ribofurano- siluracila, 1-(2,3,5-tri-O-benzoil-a-ribofuranosi!)-4-tiouracila, 1-a-L-ribo- furanosilcitosina, 1-a-L-ribofuranosil-4-tiouracila, 1-o-L-ribofuranosil-5- fluorouracila, 2-amino-B-L-arabinofurano[1',2':4,5]oxazolina, O2,O,z-ani- dro-B-L-arabinofuranosiluracila, 2'-desóxi-B-L-uridina, 3'5'-Di-O-benzoil- 2'desóxi-4-tio B-L-uridina, 2'-desóxi-B-L-citidina, 2'-desóxi-B-L-4-tiouri- dina, 2-desóxi-B-L-timidina, 2'-desóxi-B-L-5-fluorouridina, 2',3'-didesóxi- B-L-uridina, 2'-desóxi-B-L-S-fluorouridina e 2'-desóxi-B-L-inosina); um composto que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.423.695 e abrangido pela Fórmula | da Pat. U.S. No. 6.423.695; um composto que é divulgado na Publicação de Patente U.S. No. 2002/0058635 e abrangido pela Fór- mula 1 da Publicação de Patente U.S. No. 2002/0058635; um análogo de nucleosídeo que é divulgado no WO 01/90121 A2 (Idenix); um aná- logo de nucleosídeo que é divulgado no WO 02/069903 A2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.); um análogo de nucleosídeo que é divulgado no WO 02/057287 A2 ou no WO 02/057425 A2 (ambos da Merck/Isis); e similares.

[00131] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adequado adicional pode incluir inibidores de NS3 do HCV. Os inibido- res de proteína-3 que não é estrutural (NS3) do HCV adequados inclu- em, mas não estão limitados a, um tripeptídeo que é divulgado nas

Pat. U.S. Nos. 6.642.204; 6.534.523; 6.420.380; 6.410.531; 6.329.417;

6.329.379; e 6.323.180 (Boehringer-Ingelheim); um composto que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.143.715 (Boehringer-Ingelheim); um com- posto macrocíclico que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.608.027 (Boe- hringer-Ingelheim); um inibidor de NS3 que é divulgado nas Pat. U.S. Nos. 6.617.309; 6.608.067; e 6.265.380 (Vertex Pharmaceuticals); um composto de azapeptídeo que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.624.290 (Schering); um composto que é divulgado na Pat. U.S. No. 5.990.276 (Schering); um composto que é divulgado em Pause e outros (2003); inibidor de NS3 BILN 2061 (Boehringer-Ingelheim; Lamarre e outros (2002) e Lamarre e outros (2003); inibidor de NS3 VX-950 (Vertex Pharmaceuticals; Kwong e outros (2003); inibidor de NS3 SCH6 (Abib e outros (2003); Program and Abstracts of the 54" Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD, 2003); qualquer um dos inibidores da NS3 protease divulgados na WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 ou WO 02/060926 (por exemplo, compostos 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 e 127 divulgados na tabela das páginas 224-226 na WO 02/060926); um inibidor da NS3 protease que é divulgado em qualquer uma das Publicações de Patentes U.S. Nos. 2003/019067, 2003/0187018 e 2003/0186895; e similares.

[00132] Em uma modalidade, o inibidor de NS3 utilizado em uma terapia de combinação da invenção é um membro da classe de inibido- res de NS3 específicos, por exemplo, inibidores de NS3 que inibem a atividade de NS3 serina protease e que não exibem atividade inibidora significativa contra outras serina proteases tal como elastase de leucó- citos humanos, elastase pancreática suína ou quimotripsina pancreáti- ca bovina ou cisteína proteases tal como a catepsina B do fígado hu- mano.

[00133] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adequado adicional inclui inibidores de NS5B. Os inibidores da proteína-5 que não é estrutural do HCV adequados (NS5; RNA polimerase depen- dente de RNA) incluem, mas não estão limitados a, um composto que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.479.508 (Boehringer-Ilngelheim); um com- posto que é divulgado em qualquer um dos Pedidos de Patentes Interna- cionais Nos. PCT/CA0O2/01127, PCT/CA0O2/01128 e PCT/CAO2/01129, todos depositados em 18 de julho de 2002 pela Boehringer Ingelheim; um composto que é divulgado na Pat. U.S. No. 6.440.985 (ViroPhar- ma); um composto que é divulgado na WO 01/47883, por exemplo, JTK-003 (Japan Tobacco); um análogo de dinucleotídeo que é divulga- do em Zhong e outros (2003); um composto de benzotiadiazina que é divulgado em Dhanak e outros (2002); um inibidor de NS5B que é di- vulgado no WO 02/100846 A1 ou no WO 02/100851 A2 (ambas da Shire); um inibidor de NS5B que é divulgado na WO 01/85172 A1 ou no WO 02/098424 A1 (ambas da Glaxo SmithKline); um inibidor de NS5B que é divulgado no WO 00/06529 ou no WO 02/06246 A1 (am- bas da Merck); um inibidor de NS5B que é divulgado no WO 03/000254 (Japan Tobacco); um inibidor de NS5B que é divulgado na EP 1 256.628 A2 (Agouron); JTK-002 (Japan Tobacco); JTK-109 (Ja- pan Tobacco); e similares.

[00134] Em uma modalidade, o inibidor de NS5 utilizado nas terapi- as de combinação da invenção é um membro da classe dos inibidores de NS5 específicos, Por exemplo, inibidores de NS5 que inibem a RNA polimerase dependente de RNA de NS5 e que não possuem efeitos inibidores significativos em direção a outras RNA polimerases depen- dentes de RNA e em direção a RNA polimerases dependentes de DNA.

[00135] Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um interferon, por exemplo, interferon-alfa (IFN-a). Qual-

quer IFN-a conhecido pode ser utilizado nos métodos de tratamento da invenção. O termo "interferon-alfa" como utilizado aqui se refere a uma família de polipeptídeos relacionados que inibem a replicação viral e a proliferação celular e modulam a resposta imunológica. O termo "IFN- oi" inclui IFN-a que ocorre naturalmente; IFN-o sintético; IFN-a derivati- zado (por exemplo, IFN-a PEGuilado, IFN-a glicosilado e similares); e análogos de IFN-a que ocorrem naturalmente ou sintéticos; essencial- mente qualquer IFN-a que possua atividades antiviral, como descrito para IFN-a que ocorre naturalmente.

[00136] Os interferons o. adequados incluem, mas não estão limita- dos a, IFN-a que ocorre naturalmente (incluindo, mas não limitado a, IFN-02a, IFN-02b que ocorrem naturalmente); interferon o-2b recombi- nante tal como interferon Intron-A disponível na Schering Corporation, Kenilworth, N.J.; interferon o-2a recombinante tal como interferon Rofe- ron disponível na Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.; interferon a-2C re- combinante tal como interferon Berofor a2 disponível na Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn.; interferon a-n1, uma mistura purificada de interferons a naturais tal como Sumiferon dispo- nível na Sumitomo, Japão ou como interferon Wellferon a-n1 (INS) disponível na Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Grã-Betanha; e interferon o-n3 uma mistura de interferons a naturais feita pela Interferon Scien- ces e disponível na Purdue Frederick Co., Nonwalk, Conn., sob o nome comercial Alferon.

[00137] O termo "IFN-a" também abrange IFN-o consenso. O IFN-o consenso (também referido como "CIFN" e "IFN-con" e "interferon con- senso") abrange, mas não está limitado às sequências de aminoácidos denominadas IFN-con,, IFN-con? e IFN-con3 que são divulgadas nas Pat. U.S. Nos. 4.695.623 e 4.897.471; e interferon consenso que é de- finido pela determinação de uma sequência consenso de interferons alfa que ocorrem naturalmente (por exemplo, Infergen.RTM,, Intermou- ne, Inc., Brisbane, CA.). IFN-con; é o agente de interferon consenso no produto Infergen'Y alfacon-1. O produto de interferon consenso Infer- gen'“ é referido aqui por seu nome comercial (InfergenT") ou por seu nome genérico (interferon alfacon-1). As sequências de DNA que codi- ficam IFN-con podem ser sintetizadas como descrito nas patentes mencionadas anteriormente ou outros métodos padronizados. Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adicional é CIFN.

[00138] Em uma modalidade, polipeptídeos de fusão que compre- endem um I|FN-a e um polipeptídeo heterólogo também podem ser uti- lizados nas terapias de combinação da invenção. Os polipeptídeos de fusão de IFN-a adequados incluem, mas não estão limitados a, Albufe- ron-alpha'” [um produto de fusão da albumina humana e IFN-a; Hu- man Genome Sciences; ver, por exemplo, Osborn e outros (2002)]. Também são adequadas para uso na presente descrição formas emba- ralhadas de IFN-o. Ver, por exemplo, Masci e outros (2003). Outros interferons adequados incluem, Multiferon (Viragen), Medusa Interferon (Flamel Technology), Locteron (Octopus) e Omega Interferon (Intarci- al/Boehringer Ingelheim).

[00139] O termo "IFN-o'" abrange ainda derivados de IFN-a que são derivatizados (por exemplo, são quimicamente modificados em relação ao peptídeo que ocorre naturalmente) para alterar certas propriedades tal como meia-vida no soro. Como tal, o termo "IFN-o'" inclui IFN-a gli- cosilado; IFN-o. derivatizado com polietileno glicol ("IFN-a PEGuilado"); e similares.

[00140] O IFN-a PEGuilado e os métodos para a produção do mesmo, são discutidos, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.382.657;

5.981.709; e 5.951.974. O IFN-a PEGuilado abrange conjugados de PEG e qualquer uma das moléculas de IFN-a descritas anteriormente,

mas não limitadas a, PEG conjugado ao interferon alfa-2a (Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley, N.J.), interferon alfa 2b (Intron, Schering- Plough, Madison, N.J.), interferon alfa-2c (Berofor Alfa, Boehringer In- gelheim, Ingelheim, Alemanha); e interferon consenso que é definido através da determinação de uma sequência consenso de interferons alfa que ocorrem naturalmente (InfergenT“, Intermoune, Inc., Brisbane, CA).

[00141] Em uma modalidade, os polipeptídeos do IFN-a podem ser modificados com um ou mais grupamentos de polietileno glicol, isto é, PEGuilados. A molécula de PEG de um polipeptídeo de IFN-a PEGuUi- lado é conjugada a uma ou mais cadeias laterais de aminoácido do polipeptídeo IFN-a. Em uma modalidade, o IFN-a PEGuilado contém um grupamento PEG apenas sobre um aminoácido. Em outra modali- dade, o IFN-a PEGuilado contém um grupamento PEG sobre dois ou mais aminoácidos, por exemplo, o IFN-a contém um grupamento PEG ligado a dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácidos diferentes. O IFN-a pode ser acoplado diretamente ao PEG (isto é, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila ou um grupo carbonila.

[00142] Para determinar a combinação ótima de um agente de inibi- ção, tal como PKC-412, erlotinib, sunitinib e similares, com outros a- gentes anti-HCV, ensaios de replicação do HCV e/ou estudos com a- nimais podem ser realizados na presença de várias combinações dos vários agentes anti-HCV. A inibição de replicação aumentada na pre- sença de um agente adicional (acima daquela observada com monote- rapia) é evidência para o benefício potencial da terapia de combina- ção.

[00143] Por exemplo, os ensaios de replicação do HCV que empre- gam um genoma de HCV ligado ao repórter de luciferase na presença de várias combinações de PKC-412, erlotinib, sunitinib e similares. Em tais ensaios, a atividade da luciferase é diretamente proporcional à re- plicação do genoma de RNA do HCV.

[00144] Em uma modalidade, agentes de controle de efeitos colate- rais podem ser utilizados nos métodos de tratamento da invenção e estes incluem agentes que são eficientes no controle de dor; agentes que melhoram o desconforto gastrointestinal; analgésicos, anti-inflama- tórios, antipsicóticos, antineuróticos, ansiolíticos e agentes hematopoi- éticos. Em adição, as modalidades da invenção consideram o uso de qualquer composto para o cuidado paliativo de pacientes sofrendo de dor ou qualquer outro efeito colateral no curso de tratamento com uma terapia de objetivo. Os exemplos de agentes paliativos incluem aceta- minofen, ibuprofen, outros NSAIDs, bloqueadores de H2 e antiácidos. Em uma modalidade, a descrição fornece um método de tratamento com agentes que inibem GAK e agentes que inibem AAK1. Em uma modalidade, tal cotratamento fornece efeitos sinérgicos, tais como efei- tos antivirais. Hospedeiros Adequados para Tratamento

[00145] Os hospedeiros adequados para tratamento com uma mo- dalidade do agente de inibição ou uma modalidade do método incluem hospedeiros que são infectados com infecção viral de vírus que se li- gam à AP da clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecções, tais como coinfecções com HCV/HIV, Flaviviridae sem ser HCV, vírus que se ligam à AP da clatrina sem ser Flaviviridae ou vírus que se |i- gam à AP da clatrina sem ser HCV. Como utilizado aqui, o termo Fla- viviridae inclui qualquer membro da família Flaviviridae, incluindo, mas não limitado a, vírus da Dengue, incluindo vírus da Dengue 1, vírus da Dengue 2, vírus da Dengue 3, vírus da Dengue 4 (ver, por exemplo, Nos. de Acesso do GenBank M23027, M19197, A34774 e M14931); Vírus da febre amarela; vírus do Oeste do Nilo; vírus da Encefalite Ja- ponesa; vírus da Encefalite de St. Louis; Vírus da Diarreia Viral Bovina

(BVDV); e vírus da Hepatite C (HCV); e qualquer sorotipo, linhagem, genótipo, subtipo, quasi-espécie ou isolado de qualquer um dos anteri- ores. Quando o Flaviviridae for HCV, o HCV é qualquer um de um nú- mero de genótipos, subtipos ou quasi-espécies, incluindo, por exemplo, genótipo 1, incluindo 1a e 1b, 2, 3, 4, 6 etc. e subtipos (por exemplo, 2a, 2b, 3a, 4a, 4c etc.) e quasi-espécies.

[00146] Os hospedeiros adequados para tratamento com modalida- des da presente invenção incluem pacientes com falha no tratamento. O termo "pacientes com falha no tratamento" (ou "falhas no tratamen- to") como utilizado aqui geralmente refere-se a pacientes infectados com HCV que falharam em responder à terapia anterior para HCV (re- feridos aqui como "incapazes de resposta") ou que responderam inici- almente à terapia anterior, mas nos quais a resposta terapêutica não foi mantida (referidos como "reincidentes"). A terapia anterior geral- mente pode incluir o tratamento com qualquer agente antiviral sem ser um agente de inibição da presente descrição.

[00147] Os hospedeiros adequados para tratamento com modalida- des da presente descrição incluem indivíduos que foram clinicamente diagnosticados como infectados com HCV. Os indivíduos que são in- fectados com HCV podem ser identificados através da detecção do RNA do HCV em seu sangue e/ou possuindo um anticorpo anti-HCV em seu soro.

[00148] Os indivíduos que são clinicamente diagnosticados como infectados com HCV incluem indivíduos puros (por exemplo, indivíduos não previamente tratados para HCV).

[00149] Os hospedeiros adequados para tratamento com modalida- des da presente descrição incluem indivíduos que possuem qualquer título de HCV detectado. O paciente pode ser infectado com qualquer genótipo de HCV (genótipo 1, incluindo 1a e 1b, 2, 3, 4, 6 etc. e subti- pos (por exemplo, 2a, 2b, 3a etc.)), particularmente um genótipo difícil de tratar tal como o genótipo 1 do HCV e subtipos particulares de HCV e quasi-espécies.

[00150] São também adequados para tratamento os hospedeiros positivos para HCV (como descrito anteriormente) que exibem fibrose grave ou cirrose inicial (classe A ou inferior de Child's-Pugh não des- compensada) ou cirrose mais avançada (classe B ou C de Child's- Pugh descompensada) devida à infecção crônica causada por HCV e que são virêmicos apesar do tratamento antiviral prévio ou que possu- em uma contraindicação para terapia com um agente antiviral conheci- do.

[00151] Em uma modalidade, os hospedeiros positivos para HCV com fibrose do fígado em estágio 3 ou 4 de acordo com o sistema de classificação METAVIR, que é conhecido na técnica, são adequados para tratamento com os métodos da presente descrição. Em outra mo- dalidade, os hospedeiros adequados para tratamento com modalida- des da presente descrição são pacientes com cirrose descompensada com manifestações clínicas, incluindo pacientes com cirrose hepática bastante avançada, incluindo aqueles à espera de transplante de fíga- do. Ainda em outra modalidade, os hospedeiros adequados para tra- tamento com modalidades da presente descrição incluem pacientes com graus mais brandos de fibrose incluindo aqueles com fibrose inici- al (estágios 1 e 2 nos sistemas de classificação METAVIR, Ludwig e Scheuer; ou estágios 1, 2 ou 3 no sistema de classificação de Ishak, dos quais todos são conhecidos na técnica). Em uma modalidade, o método encontra uso no tratamento de HCV pós-transplante de fígado para carcinoma hepatocelular induzido pelo HCV. Em uma modalida- de, isto serve para prevenir a reinfecção do enxerto.

[00152] Em uma modalidade da presente descrição, para ajudar a selecionar de forma ótima pacientes mais prováveis de se beneficiar da terapia, bem como para monitorar a eficácia da terapia -- especial-

mente mediante vírus mutantes resistentes ao fármaco potencial -- o uso de testes de diagnóstico apropriados fornecidos pela presente in- venção pode ser de enorme benefício. Por exemplo, a avaliação da sensibilidade do vírus específico encontrado em certo paciente à tera- pia considerada pode ajudar a identificar a melhor combinação entre paciente candidato e a terapia apropriada correspondente.

[00153] Em uma modalidade, o método fornece o tratamento de pa- cientes infectados com vírus que é descrito aqui, particularmente aque- les infectados com HCV que também são afligidos de câncer, tal como câncer hepático. Ensaios

[00154] A presente descrição fornece ainda métodos in vitro e à ba- se de células de seleção de agentes antivirais. Em uma modalidade, a descrição fornece métodos para a detecção da interação entre o moti- vo YXXO e as proteínas do hospedeiro. Em uma modalidade, a pre- sente descrição fornece um ensaio de ligação para detectar as proteí- nas ou os agentes que inibem a ligação de motivos YXXO ou de dileu- cina à AP2M1 ou outras subunidades py de complexos AP da clatrina. Por exemplo, a descrição fornece um método em que agentes candida- tos que são descritos aqui são colocados em contato com um Flaviviri- dae e AP2M1 ou outras subunidades yu de complexos AP da clatrina. A ligação do Flaviviridae às proteínas é detectada como é conhecido na técnica. A atividade reduzida na presença de um agente candidato em relação aos controles indica a identificação de um inibidor de ligação. Em outra modalidade, ensaios de ligação à base de células são utili- zados. Em outra modalidade, ensaios de células são utilizados para verificar os efeitos sobre a montagem ou o brotamento viral. Nesta modalidade, os agentes candidatos são colocados em contato com um Flaviviridae e uma célula que expressa AP2M1 ou outras subunidades up de complexos AP da clatrina. Os efeitos celulares, tal como viral o brotamento ou a montagem ou a ligação entre o Flaviviridae e a célula podem ser analisados através de métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, um ensaio de replicação é utilizado. Um exemplo de um ensaio de replicação é representado na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2011/0052536 A1, que é expressamente incorporada aqui como referência. A ligação, o brotamento ou a montagem reduzida e similares, do vírus na presença do agente candidato em relação aos controles indica a identificação de um inibidor de ligação ou um agente antiviral. Em algumas modalidades, um ensaio de afinidade microflui- dica in vitro, que é conhecido na técnica, é também utilizado para pos- sibilitar a detecção de interações proteicas fracas e transitórias.

[00155] Em uma modalidade, ensaios de complementação de prote- ína-fragmento, que são descritos aqui e que são conhecidos na técni- ca, são utilizados para validar a interação entre núcleo e AP2M1. Em outra modalidade, um ensaio de co-imunoprecipitação é utilizado para identificar a interação entre as proteínas.

EXEMPLOS

[00156] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar moda- lidades preferidas da invenção e para apresentar um entendimento cla- ro dos princípios da descrição. Deve ser considerado pelos peritos na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas como constituindo mo- dos preferidos para sua prática. Entretanto, os peritos na técnica de- vem, à luz da presente descrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda se obter um resultado igual ou similar sem se afastar do concei- to, do espírito e do âmbito da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisio- logicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes des-

critos aqui enquanto que resultados iguais ou similares serão atingidos. Todos os tais substitutos e modificações similares evidentes para os peritos na técnica são considerados como estando dentro do espírito, do âmbito e do conceito da invenção que são definidos pelas reivindi- cações em anexo.

[00157] Muitas variações e modificações podem ser feitas nas mo- dalidades descritas anteriormente da descrição sem se afastar subs- tancialmente do espírito e dos princípios da descrição. É pretendido que todas tais modificações e variações sejam incluídas aqui dentro do âmbito desta descrição. Exemplo 1 Identificação de um motivo YXXO dentro do núcleo de HCV

[00158] A inspeção da sequência primária da proteína do núcleo de HCV revela um motivo YIP(V/L) conservado motivo dentro do segundo domínio (D2) da proteína (FIGURAS 1A, D). Este motivo está em con- formidade com o sinal consenso de seleção de YXXO reconhecido pe- la AP2M1 (Ohno, J Cell Sci 119:3719-3721, 2006; Nakatsu e outros, Cell Struct Funct 28:419-429, 2003; Owen e outros, Ann Rev Cell De- vel Biol 20: 153-191, 2004). O núcleo se liga à AP2M1

[00159] As interações de sinais de seleção com adaptadores da cla- trina e componentes endociíticos são tipicamente fracas (Kd de ligação em uma faixa de UM), transitórias (Nakatsu e outros, Cell Struct Funct 28:419-429, 2003; Aguilar e outros, J Biol Chem 276: 13145-13152, 2001) e envolvem proteínas de membrana e assim dificultam o estudo através de tecnologias padronizadas (Cusick e outros, Hum Mol Genet 2005; Bailer Curr Opin Microbiol 12:453-459, 2009). Para determinar se o núcleo de HCV se liga à AP2M1, foram utilizadas plataformas pro- teômicas que superam estes desafios. Ensaios de afinidade mucroflui- dicos in vitro se baseiam na captura mecânica de interações molecula-

res (MITOMI), que elimina o problema de "off-rate" que enfrenta plata- formas atuais e assim permite estudar interações fracas e transitórias, com consumo de proteínas em nanolitros (Maerkl e outros, Science 315:233-237, 2007; Einav e outros, Nat Biotech 26: 1019-1027, 2008; Gerber e outros, Nat Meth 6:71-74, 2009). Um formato microfluidico que possibilita uma análise em alta fidelidade de interações proteína- proteína (P-Pls) foi utilizado (Gerber e outros, Nat Meth 6:71-74, 2009). A expressão de proteína in vitro na presença de membranas micros- somais e experimentos de ligação com MITOMI foram realizados es- sencialmente como descrito (Maerkl e outros, Science 315:233-237, 2007; Einav e outros, Nat Biotech 26:1019-1027, 2008; Gerber e ou- tros, Nat Meth 6:71-74, 2009) (FIG. 9). Estes ensaios detectavam a |li- gação de AP2M1 ao núcleo. O grau de ligação se correlacionava com a concentração crescente do núcleo (FIG. 1F). A ligação de fundo de AP2M1 a uma proteína do HCV de controle, NS3, era 4-20 vezes me- nor e não aumentava significativamente com maior concentração de proteína.

[00160] Para determinar se a interação núcleo-AP2M1 ocorre nas células, ensaios de complementação de proteína-fragmento (PCAs) baseados na reconstituição reversível de um repórter de luciferase de Gaussia princeps foram utilizados (FIG. 2A). O formato atual foi otimi- zado para sinal intensificado, fornecendo assim um meio altamente sensível para medir o desafio de P-PIls (Cassonnet e outros, Nat Meth 8:990-992, 2011). O sinal de luciferase significativo foi detectado em células Huh-7.5 cotransfectadas com plasmídeos que codificam os dois fragmentos repórteres fundidos às proteínas de presa e de isca (Gluc1-AP2M1 e GLuc2-núcleo). Os níveis de ligação de fundo foram adaptados nas células cotransfectadas com as construções de Gluc1- AP2M1 ou GLuc2-núcleo e o vetor recíproco vazio, os dois vetores Gluc vazios ou GLuc1 fundido a três proteínas não relacionadas (SPI-

RE, RAC1 e ARPC). A afinidade aparente de AP2M1 ao núcleo era maior que ao receptor da transferrina (TFR), uma proteína de carga do hospedeiro que carrega um sinal de YXXO, conhecido por ser reco- nhecido pela AP2M1 (Gminard e outros, Traffic 5, 181-193, 2004) (FIG. 2B). A ligação não era específica para o genótipo, uma vez que as pro- teínas do núcleo derivadas dos genótipos 2a (Lindenbach e outros, Science 309:623-626, 2005) ou 1b (Lohmann e outros, Science 285: 110-113, 1999) demonstravam níveis comparáveis de ligação à AP2M1. Além disso, não havia diferenças significativas na ligação do núcleo as duas isoformas de AP2M1(a/b) (FIG. 2B). Resultados com- paráveis foram demonstrados em células Huh-7.5 (derivadas da hepa- toma humano), representando o modelo celular mais relevante (FIG. 2B) e células 293T (dados não mostrados). A ligação parecia específi- ca, uma vez que concentrações crescentes de núcleo livre ou AP2M1, mas não de proteína de interação de sinal de exportação nuclear (NE- SI), uma proteína de controle envolvida na mediação da montagem do vírus da hepatite D (Wang e outros, J Virol 79:8113-8120, 2005), dimi- nuíam progressivamente a ligação núcleo-AP2M1 (FIG. 2C).

[00161] Para determinar se o núcleo se liga à AP2M1 no contexto de infecção autêntica causada por HCV, ensaios de co-imunopreci- pitação em frações de membrana preparadas partindo de células Huh-

7.5 infectadas com HCV crescido em cultura de células (J6/JFH) foram realizados (Lindenbach e outros, Science 309:623-626, 2005). A AP2M1 podia abaixar o núcleo quando anticorpos anti-AP2M1, mas não controles de IgG eram adicionados aos lisados de membrana. À ligação foi significativamente aumentada pela caliculina A [um inibidor da desfosforilação de AP2M1, que "tranca" a AP2M1 em sua confor- mação ativa de ligação a YXXO (Ricotta e outros, J Biol Chem 283:5510-5517, 2008)] (FIG. 2D). A ligação em condições recíprocas foi similarmente demonstrada (FIG. 2D). A colocalização de núcleo com AP2M1 em células Huh-7.5 72 h após a eletroporação com RNA de J6/JFH HCV também foi investigada. A análise de imunofluorescên- cia (IF) confocal quantitativa revelou uma colocalização extensiva do núcleo e AP2M1 nestas células (com 67+6% de colocalização de AP2M1 corada pontualmente com o núcleo) (FIG. 2E).

Motivo YXXO do núcleo na ligação a AP2M1 e montagem do HCV

[00162] Utilizando uma série de mutações pontuais (FIG. 1D), foi testado o fato da ligação à AP2M1 ser mediada pelo motivo YXXO do núcleo. Uma mutação do núcleo Y136A reduzia a ligação à AP2M1 medida por PCAs em —10 vezes comparada com o núcleo do tipo sel- vagem (WT), enquanto que uma mutação V(O%0)139A causava menos inibição de ligação (FIG. 3A). Para estudar a função do motivo YXXO do núcleo na infecção causada por HCV, estas mutações foram intro- duzidas no genoma do HCV J6/JFH(p7-ULRc2A) — um vírus repórter que contém luciferase de Renilla que se replica e produz altos títulos de vírus em células Huh-7.5 (Murray e outros, J Virol 81: 10220-10231, 2007). As células foram submetidas à eletroporação com RNA transcri- to in vitro gerado partindo de cada construção. A replicação do RNA do HCV destes mutantes virais era comparável com aquela do vírus WT, que é medida por ensaios ligados ao gene repórter da luciferase (FIG. 3B) e gRT-PCR (FIGURAS 11 e 12). Em contraste, um mutante defei- tuoso em relação à polimerase, J6/JFH(p7-ULRcC2A)-GNN, não se re- plicava. Ensaios com luciferase em células naive inoculadas com so- brenadantes derivados de células submetidas à eletroporação com ge- noma viral carregando a mutação nuclear Y136A mediram níveis inde- tectáveis de capacidade de infecção extracelular. A mutação V139A diminuía a capacidade de infecção em —1,5 logs comparada com o ví- rus WT (FIG. 3C). A capacidade de infecção intracelular, medida em células puras infectadas com sobrenadantes clarificados derivados de células lisadas submetidas à eletroporação, espelhava a capacidade de infecção extracelular diminuída (FIG. 3D), sugerindo que o motivo YXXO do núcleo medeia a montagem de vírions e não a liberação. Es- sencialmente nenhum vírus infeccioso foi produzido de forma intra ou extracelular por controles defeituosos em relação à montagem (AE1- E2) ou à replicação (GNN). Os títulos de capacidade de infecção do vírus WT medidos através de ensaios de diluição limitante eram com- paráveis àqueles previamente relatados com este sistema repórter (Kopp e outros, J Virol 84:1666-1673, 2010). Coerente com os ensaios da luciferase descritos anteriormente, enquanto a mutação do núcleo V139A diminuía os títulos de capacidade de infecção extra e intracelu- lar em —-1-1,5 log comparada com o vírus WT, um título de nível de ca- pacidade de infecção indetectável foi medido com vírus carregando a mutação do núcleo Y136A ou a deleção E1-E2 (FIG. 3E). O efeito de mutações do núcleo sobre a capacidade de infecção se correlacionava com seu efeito sobre a ligação à AP2M1. Para excluir a possibilidade de que as mutações do núcleo afetavam a capacidade de infecção causando a desmontagem das partículas ou a produção de partículas contendo proteína e RNA do núcleo defeituosas, foi determinada a produção de partículas não infecciosas.

[00163] Os níveis detectáveis de RNA do HCV e de liberação de proteínas do núcleo foram medidos em sobrenadantes de células que carregam genomas replicantes através de ensaios de gqRT-PCR e ELI- SA, respectivamente, como descrito (Murray e outros, J Virol 81: 10220-10231, 2007; Kopp J Virol 84: 1666-1673, 2010) (FIG. 3F, 3G). Todavia, os níveis liberados pelos mutantes do núcleo Y136A e V139A não eram significativamente maiores que aqueles liberados pelo mu- tante AE1-E2 defeituoso em relação à montagem, sugerindo que partí- culas não infecciosas não eram produzidas. A expressão no núcleo não foi afetada pelas mutações, uma vez que a análise de western (FIG. 3H) e a microscopia por fluorescência (dados não mostrados) demons-

travam expressão de proteína nos níveis WT. A reversão do fenótipo de capacidade de infecção foi detectada através de ensaio da lucifera- se em células Huh-7.5 infectadas com HCV carregando mutações do núcleo Y136A e V139A após duas semanas de passagem. Esta rever- são coincidia com a emergência de revertentes de sítio primário atra- vés da análise de sequenciamento. Estes resultados fornecem evidên- cia adicional para o requerimento da manutenção de um motivo YXXO funcional para sustentar a replicação do HCV. Juntos, estes dados su- gerem que o motivo de ligação à AP2M1 dentro do núcleo é necessário para a montagem viral in vitro.

O motivo YXXO do núcleo é funcionalmente intercambiável com outros sinais de seleção de YXXO

[00164] Para determinar se o motivo YXXO do núcleo é funcional- mente intercambiável com sinais homólogos, uma mutação V139L, "que permuta" assim a sequência do núcleo do genótipo 2a por aquela do genótipo 1b foi introduzida. Similarmente, as sequências YTPL e YRRL, conhecidas por mediarem a ligação de HLA-DM (Ohno e outros, J Bioll Chem 273:25915-25921, 1998) e o receptor de trombopoietina (Hitchcock e outros, Blood 112:2222-2231, 2008) à AP2M1, respecti- vamente, foram utilizadas para substituir a sequência YXXO do núcleo (FIG. 1D). A ligação de núcleo que carrega estas sequências à AP2M1 era comparável a ou maior que aquela do núcleo WT, que é determi- nada por PCAs (FIG. 3A). Estas mutações não tinham efeito sobre a replicação do RNA do HCV (FIG. 3B). Em correlação com seu fenótipo bioquímico, a capacidade de infecção intracelular e extracelular dos mutantes do núcleo V139L e YTPL era comparável com aquela do ví- rus WT (FIG. 3C, 3D). Esta capacidade de intercâmbio funcional sus- tenta que o motivo YXXO do núcleo exerce sua função através de inte- rações com proteínas das células hospedeiras. Apesar de sua ligação eficiente à AP2M1 (FIG. 3A) e da estabilidade por análise de western

(FIG. 3H), o mutante YRRL não produzia níveis detectáveis de vírus infeccioso (FIG. 3C, 3D). De forma interessante, este mutante liberava o RNA do HCV e a proteína do núcleo dentro dos sobrenadantes de células submetidas à eletroporação em níveis comparáveis àqueles do núcleo WT, provavelmente refletindo a produção de partículas não in- fecciosas (FIG. 3F, 3G). O mutante YRRL pode assim ter impacto so- bre outra função do núcleo na produção de vírus infeccioso que é inde- pendente de sua ligação à AP2M1.

AP2M1 na montagem do HCV

[00165] A relevância funcional de AP2M1 para o ciclo de vida do HCV foi determinada. Clones de Huh-7.5 estáveis carregando constru- ções lentivirais de RNA de grampo de cabelo curto (SNRNA) que se direcionam a regiões distintas no gene AP2M1 ou uma sequência sem direcionamento (NT) foram estabelecidos. A supressão eficiente dos níveis de AP2M1 foi conseguida (FIG. 4A, 4B), sem efeitos citostáticos ou citotóxicos evidentes. O efeito da eliminação de AP2M1 sobre a produção de vírus infeccioso foi estudado nestes clones após a eletro- poração com RNA de J6/JFH(p7-ULRC2A). O nocaute de AP2M1 não tinha efeito sobre a replicação do RNA do HCV que é medida nestes clones estáveis através de ensaios da luciferase (FIG. 4C) e gRT-PCR 72 h após a eletroporação (dados não mostrados). Os sobrenadantes coletados em 72 h pós-eletroporação foram utilizados para inocular células Huh-7.5 puras seguido por ensaios da luciferase em 72 h pós- inoculação. Como mostrado na FIG. 4D, a eliminação de AP2M1 redu- ziu a capacidade de infecção extracelular em >2 logs comparada com o controle NT. A capacidade de infecção intracelular, medida em célu- las puras infectadas com sobrenadantes clarificados derivados de célu- las lisadas submetidas à eletroporação, espelhavam a capacidade de infecção extracelular diminuída (FIG. 4E) e se correlacionavam com o grau de eliminação de AP2M1. Medidas de títulos de capacidade de infecção intra ou extracelular através de ensaios de diluição limitante demonstraram resultados coerentes (FIG. 4F). A eliminação de AP2M1 não aumentou a produção de partículas não infecciosas, como é suge- rido pelos níveis de RNA do HCV e a liberação de proteínas do núcleo medida em sobrenadantes de células através de ensaios de gqRT-PCR e ELISA, respectivamente (FIG. 4G, 4H). Efeitos similares sobre a pro- dução de vírus infeccioso foram demonstrados em células Huh-7.5 com eliminação transitória de AP2M1 por siRNAs e submetidas à eletropo- ração com o RNA de J6/JFH(p7-ULRC2A) ou infectadas com vírus J6/JFH crescido em cultura (título: 1,2x10º TCIDso/mL) (Lindenbach e outros, Science 309:623-626, 2005). Os efeitos de silenciamento da AP2M1 endógena sobre a produção de vírus infeccioso foram recupe- rados pela expressão ectópica de AP2M1 WT resistente ao ShRNA que carrega uma mutação "oscilante" dentro do sítio direcionado pelo ShRNA, excluindo enormemente a possibilidade de efeitos fora do alvo causando o fenótipo observado (FIG. 41). Ambas as abordagens de RNAi estáveis e transitórias sugerem que a AP2M1 é importante para a montagem eficiente do HCV.

A interrupção da ligação núcleo-AP2M1 anula o recrutamento de AP2M1 para LD, altera a localização subcelular do núcleo e a colocali- zação do núcleo com E2

[00166] Para testar a hipótese de que o defeito na montagem do HCV resultante de mutações nucleares de YXXO ou do silenciamento de AP2M1 se correlaciona com alterações na localização subcelular de AP2M1 e/ou do núcleo, uma análise de imunofluorescência (IF) confo- cal quantitativa foi realizada. 10-15 células escolhidas aleatoriamente foram analisadas para cada categoria em relação ao grau de localiza- ção do núcleo ou da AP2M1 em vários compartimentos intracelulares utilizando o software ImageJ (JACoP) e os Coeficientes de Colocaliza- ção de Manders (MCC). Os últimos foram escolhidos, uma vez que medem estritamente a co-ocorrência independente de proporcionalida- de de sinal (Dunn e outros, Am J Physiol-Cell Physiol 300:C723-C742, 2011). A AP2M1 endógena se colocalizava minimamente com o mar- cador de LD, Bodipy, em células Huh-7.5 naíive, com 8,2% de colora- ção LD positiva para AP2M1 (FIG. 5A, 5E). Em contraste, a infecção com o vírus J6/JFH parecia aumentar significativamente a localização de AP2M1 em LD, com 40+8% de LD sendo positivos para AP2M1 (FIG. 5B, 5E) (valor-p=0,0006). Similarmente e como descrito anteri- ormente (Kopp e outros, J. Virol. 84: 1666-1673, 2010; Boulant e ou- tros, Journal of General Virology 88:2204-2213, 2007; Coller e outros, PLoS pathogens 8:e1002466-e1002466, 2012), o núcleo ficava parci- almente localizado em LD (37+14% de LD positivo para o núcleo) (FIG. 5C, 5E). Além disso, a colocalização parcial do núcleo com AP2M1 ocorria em parte em LD (FIG. 5D, 5F).

[00167] Para testar se o núcleo está envolvido na mediação da loca- lização aumentada de AP2M1 em LD medida em células infectadas com HCV, AP2M1-mCherry foi superexpressa isoladamente ou em combinação com o núcleo WT ou o mutante do núcleo Y136A através da transfecção de células Huh-7.5. LD foi marcado com HCS LipidTOX (Invitrogen). Similarmente às células naive, a AP2M1 ficava minima- mente localizada em LD em células Huh-7.5 superexpressando AP2M1 isoladamente (8+2% de LD positivo para AP2M1) (FIG. 5G, 5J). Em contraste, como nas células infectadas, quando coexpressada com o núcleo WT, a AP2M1 parecia se acumular significativamente em LD, com 51,8+20% de LD sendo positivos para AP2M1 (valor-p=4,8x10*) (FIG. 5H, 5J). Nenhum tal aumento na colocalização foi demonstrado, entretanto, quando a AP2M1 foi coexpressa com núcleo carregando a mutação Y136A (com 10% de LD positivos para AP2M1) (valor p=0,001) (FIG. 51, 5J), sugerindo que o motivo YXXO do núcleo pode mediar o recrutamento de AP2M1 para LD.

[00168] O efeito da interrupção da interação núcleo-AP2M1 sobre a localização do núcleo em LD, RE e TGN e sua colocalização com a proteína do envelope E2 nas células submetidas à eletroporação com RNA de J6/JFH HCV foi testado. Como previamente sabido, o núcleo se localizava em todos estes compartimentos intracelulares (Kopp e outros, J. Virol. 84, 1666-1673, 2010; Boulant e outros, Journal of Ge- neral Virology 88, 2204-2213, 2007) (com a porcentagem de colocali- zação variando de 30 até 45%). De forma interessante, a localização do núcleo carregando a mutação Y136A em LD era significativamente maior que a do núcleo WT (78+13% vs. 32+16%, respectivamente, va- lor-p=2,7x10) (FIG. 5K). Similarmente, a porcentagem de colocaliza- ção do núcleo com o marcador de LD era dramaticamente aumentada de 25+10% em células NT para 87+6,6% após o silenciamento de AP2M1 (valor-p=1,55x10?) (FIG. 5L). Embora NE a mutação do núcleo Y136A nem a eliminação de AP2M1 tivessem um efeito evidente sobre a colocalização do núcleo com o marcador de RE, calreticulina (Figura 14), ambas estavam associadas a um decréscimo significativo na co- localização do núcleo com o marcador de TGN, TGN46 (FIG. 5M, 5N) e a proteína do envelope E2 (FIG. 50, 5P).

[00169] Juntos, estes resultados sugerem que a interação do núcleo com a AP2M1 facilita o recrutamento de AP2M1 para LD e que o defei- to observado na montagem do HCV após a interrupção da interação núcleo-AP2M1 está associado ao acúmulo de núcleo em LD, à coloca- lização diminuída do núcleo com E2 e ao tráfego prejudicado do núcleo para TGN. AAK1 e GAK regulam a ligação núcleo-AP2M1 e estão envolvidos na montagem do HCV

[00170] A fosforilação de T156 dentro da AP2M1 pelas seri- na/treonina quinases AAK1I e GAK (Ricotta e outros, Journal of Cell Biology 156, 791-795, 2002; Korolchuk e outros, Traffic 3, 428-439,

2002; Zhang e outros, Traffic 6, 1103-1113, 2005) estimula a ligação de AP2M1 aos sinais de tirosina da proteína de carga e é transitória devido à desfosforilação por PP2A (Ricotta e outros, Journal of Biolo- gical Chemistry 283, 5510-5517, 2008) (FIG. 6A). Na verdade, a calicu- lina A (um inibidor de PP2A) aumentava a ligação do núcleo à AP2M1 (FIG. 2D) e uma mutação de AP2M1 T156A prejudicava a mesma (FIG. 6B). Para estudar o efeito da superexpressão de AP2M1 carre- gando a mutação T156A sobre a produção de HCV infeccioso, as célu- las Huh-7.5 foram transfectadas com plasmídeos que codificam WT ou mutante T156A de AP2M1. 48 h pós-transfecção as células foram submetidas à eletroporação com RNA do HCV J6/JFH(p7-ULRc2A) e submetidas à replicação do RNA do HCV e aos ensaios de capacidade de infecção, como descrito anteriormente. A superexpressão do mutan- te de AP2M1 T156A não tinha efeito sobre a viabilidade celular e era dispensável para a replicação do RNA do HCV e ainda reduzia signifi- cativamente a capacidade de infecção extra e intracelular comparado com AP2M1 WT (FIG. 6C-E), coerente com um efeito negativo domi- nante sobre a montagem do HCV.

[00171] Para estudar a hipótese de que AAK1 e GAK estão envolvi- dos na regulação da interação de AP2M1 com o núcleo, experimentos de ligação foram realizados em células Huh-7.5 que sofreram elimina- ção de AAK1 ou GAK por siRNAs (FIG. 6F, 6G). A eliminação de AAK1 ou GAK significativamente diminuiu a ligação núcleo-AP2M1 compara- da com NT, que é medida por PCAs (FIG. 6H), com nenhum efeito cito- tóxico evidente (dados não mostrados). As células que sofreram elimi- nação de AAK1 e GAK foram então submetidas à eletroporação com RNA do HCV J6/JFH(p7-ULRcC2A). Embora a eliminação de AAK1 ou GAK não tivesse efeito citotóxico e fosse dispensável para a replicação do RNA do HCV, esta significativamente reduzia a capacidade de in- fecção intracelular e extracelular (FIG. 61-K).

[00172] O efeito de AAK1 e GAK sobre a montagem do HCV não resultava de sua ligação direta ao núcleo (FIG. 6L). Estes resultados fornecem evidência para o envolvimento de AAK1 e GAK na regulação da ligação núcleo-AP2M1 e na mediação da montagem do HCV. Além disso, validam a importância de AP2M1 para a montagem eficiente do HCV através de uma abordagem de interferência dominante, susten- tando assim os dados de RNAi.

Inibidores farmacológicos de AAK1 e GAK interrompem a ligação nú- cleo-AP2M1 e a montagem do HCV

[00173] A análise de mapas de calor e os ensaios de afinidade de inibidores de quinases (Karaman e outros, Nat Biotech 26, 127-132, 2008) revelaram compostos, tais como sunitinib e PKC-412, que se ligam a AAK1 e erlotinib que se liga a GAK, com altas afinidades (faixa de nM) (Karaman e outros, Nat Biotech 26, 127-132, 2008) (FIG. 7A, 7B). Estes compostos inibiam a ligação núcleo-AP2M1 de uma manei- ra dependente da dose, que é determinada por PCAs (FIG. 7C), com concentrações inibidoras máximas médias (IC50s) de -0,04-0,2 UM. Quando utilizados para tratar células Huh-7.5 submetidas à eletropora- ção com o genoma do HCV J6/JFH(p7-ULRC2A), estes compostos ti- veram um efeito dependente da dose dramático sobre a capacidade de infecção extra (FIG. 7D) e intracelular (FIG. 7E) em 72 h (com concen- tração eficiente máxima média (EC50s) de 0,15-1,8 uM) (FIG. 7B). Não havia efeito sobre a replicação do RNA do HCV e nenhuma toxicidade celular evidente (FIG. 7F, 7G). Na verdade, o efeito inibidor sobre a ligação núcleo-AP2M1 e capacidade de infecção estava associado com reduções nos níveis de fosfo-AP2M1 nas células relevantes por análise de western (FIG. 7H,). Por último, estes compostos inibiam significativamente a infecção viral em células Huh-7.5 infectadas com HCV crescido em cultura de tecido (título: 6,3x10º TCIDso/mL) (FIG. 71, 7B,). Estes resultados fornecem validação farmacológica para o envol-

vimento de AAK1 e GAK na regulação da interação núcleo-AP2M1 e para a função de AP2M1 na montagem do HCV. Além disso, fornecem compostos candidatos que se direcionam à montagem. Exemplo 2 A eliminação ou a inibição farmacológica de AAK1 e GAK anulam a replicação do HIV-1

[00174] Há um conjunto de provas substancial que sustenta que as interações de AP1M1 e AP2M1 com Gag e Env (gp41) do HIV medei- am várias etapas críticas ao longo da via de montagem/liberação (Ba- tonick e outros, Virology 342: 190-200, 2005; Camus e outros, Molec Biol Cell 18:3193-3203, 2007; Berlioz-Torrent e outros, J Virol 73: 1350-1361, 1999; Biland e outros, Molec Biol Cell 18:414-425, 2007; Wyss e outros, J Virol 75:2982-2992, 2001; Ohno e outros, Virology 238:305-315, 1997; Boge e outros, J Biol Chem 273: 15773-15778, 1998; Egan e outros, J Virol 70:6547-6556, 1996; Rowell e outros, J Immunol 155:473-488, 1995; Lodge e outros, EMBO J 16:695-705, 1997; Deschambeault e outros, J Virol 73:5010-5017, 1999). De manei- ra mais importante, um motivo de tirosina dentro de Env medeia o es- palhamento de célula para célula (Gminard e outros, Traffic 5, 181-193, 2004; Lindenbach e outros, Science 309, 623-626, 2005), um meca- nismo que se acredita ser responsável pela replicação do HIV em an- damento apesar de ART (Sigal e outros, Nature All, 95-98, 2011), pos- sivelmente via AP1IM1 que se espalha para membranas basolaterais. Entretanto, a função de AAK1 e GAK na infecção com HIV não foi es- tudada e estes mecanismos não foram direcionados farmacologica- mente.

[00175] Para estar a hipótese de que AAK1 e GAK são importantes para a infecção com HIV, foram utilizadas células TZM-b1 derivadas de Hela, que expressam CD4, CCR5 e CXCR4, bem como B- galactosidase e genes repórteres de luciferase de vaga-lume que res-

pondem à transcrição do HIV (Wei e outros, Antimicrobial agents and chemotherapy 46: 1896-1905, 2002). As células foram transfectadas com siRNAs se direcionando a AAK1I, GAK ou uma sequência NT se- guidos pela infecção com o clone NL4-3 de HIV-1 infeccioso (Adachi e outros, J Virol 59:284-291, 1986), como descrito (Zhou e outros, Cell Host & Microbe 4:495-504, 2008). A atividade da luciferase foi medida em 96 h pós-infecção. A eliminação de AAK1 e GAK inibiu significati- vamente a replicação do HIV (Fig. 10). Para testar o efeito de inibido- res farmacológicos de AAK1 e GAK contra HIV, células TZM-b1 deri- vadas de HeLa infectadas com HIV-1 foram tratadas diariamente com diluições em série de sunitinib, erlotinib ou PKC-412 durante 4 dias se- guidos por ensaios da luciferase. Um efeito antiviral de resposta à do- se significativo foi observado sem efeito sobre a viabilidade (Fig. 10). À EC5o de erlotininb era de 1,4+0.3 (valor de P - 0,0058), sunitinib — 0,8+0,4 (valor de P — 0,1) e PKC-412 - 8,5+4 (valor de P — 0,1). Uma vez que estes estudos foram conduzidos 96 h pós-infecção, estes ava- liaram todos os estágios de infecção desde a entrada até a liberação e o espalhamento (Zhou e outros, Cell Host & Microbe 4:495-504, 2008) e, portanto, sugerem que AAK1 e GAK são importantes para a replica- ção geral do HIV.

Métodos

[00176] Plasmídeos. Os ORFs que codificam AP2M1, GAK, AAK1, TFR, SPIRE, RAC1, ARPC e NESI foram selecionados da biblioteca de Human ORFeome de clones de cDNA (Rual e outros, Genome re- search 14, 2128-2135, 2004) (Open biosystems) e recombinados nos vetores pc/DNA-Dest40 (para marcação V5-his C-terminal), pPGLuc (pa- ra marcação com fragmento de luciferase de Gaussia princeps (Glue)) (Cassonnet e outros, Nat Methods 8, 990-992, 2011) e/ou pCherry (pa- ra marcação com a proteína de fluorescência mCherry) utilizando tec- nologia gateway (Invitrogen). Os ORFs que codificam o núcleo de comprimento completo marcado com T7 e NS3 foram amplificados partindo dos vetores descritos (Blight e outros, Science 290, 1972- 1974, 2000) e ligados dentro do pcDNA3.1 (Invitrogen). O pFL- J6/JFH(p7-ULRc2A) (Murray e outros, J Virol 81, 10220-10231, 2007) foi um presente do Dr. C. M. Rice (Tscherne e outros, J Virol 80, 1734- 1741, 2006). As mutações no núcleo YXXO e as mutações de AP2M1 foram introduzidas dentro destes plasmídeos através de mutagênese direcionada ao sítio (utilizando o kit QuikChange (Stratagene)). Anticorpos e compostos. Ver as Tabelas 1 e 2.

[00177] RNAi e recuperação do silenciamento gênico. 40-100 nM de siRNAs individuais ou agrupados (FIG. 8) foram transfectados den- tro das células utilizando siIlMPORTER (Upstate, Millipore) 48 h antes da eletroporação do RNA do HCV. Cinco MISSION Lentiviral Trans- duction Particles (Sigma) individuais carregando RNAs de grampo de cabelo curtos (ShRNAs) que se direcionam a vários sítios no RNA da AP2M1 e um shRNA de controle foram utilizados para transduzir célu- las Huh-7.5 de acordo com o protocolo do fabricante. Os reagentes de RNAi utilizados neste estudo são resumidos na Tabela 3. A recupera- ção de AP2M1 foi realizada através da transdução de células Huh-7.5 com eliminação de forma estável de AP2M1 com lentivírus expressan- do AP2M1 resistente a SDRRNA AP2M1 48 h antes da eletroporação com o genoma de HCV.

[00178] Ensaios de afinidade microfluídicos. A fabricação e o planejamento dos dispositivos foram realizados essencialmente como descritos (Maerkl e outros, Science 315, 233-237, 2007). Proteínas humanas marcadas com V5-his e proteínas virais marcadas com T7 foram expressas partindo do chip através da mistura de transcri- ção/tradução (TNT) in vitro de mamífero (Promega) (na presença de membranas microssomais). O dispositivo foi submetido à configuração de superfície, resultando em uma área circular revestida com anticor-

pos anti-his biotinilados dentro de cada célula unitária (Einav e outros, Nature Biotechnology 26, 1019-1027, 2008; Gerber e outros, Nature methods 6, 71-74, 2009). Experimentos de ligação proteína-proteína foram realizados como descrito (Gerber e outros, Nature methods 6, 71-74, 2009). Sucintamente, proteínas de isca humanas foram carre- gadas dentro do dispositivo e ligadas aos anticorpos anti-his na super- fície. As proteínas virais e humanas foram incubadas no chip e marca- das com anticorpos anti-T7-Cy3 e anti-V5-FITC, respectivamente. As interações foram capturadas mecanicamente por MITOMI (Maerkl e outros, Science 315, 233-237, 2007; Einav e outros, Nature Biotechno- logy 26, 1019-1027, 2008; Gerber e outros, Nature methods 6, 71-74, 2009). Após uma breve lavagem para remover material não ligado não capturado, os complexos de proteína capturados foram detectados por um scanner de ordem (Tecan). A proporção de proteína de presa viral ligada para a de isca humana expressa foi calculada para cada ponto de dado através da medida da proporção do sinal mediano de Cy3 pa- ra o sinal mediano de FITC. A concentração de proteína nos lisados foi determinada através de análise de western quantitativa contra curvas padrão de proteínas marcadas com T7. Os experimentos foram condu- zidos pelo menos três vezes, cada vez com >20 réplicas. Ver a FIG. 10 para um protocolo detalhado.

[00179] Culturas de células. As células Huh-7.5 e as células 293T foram mantidas em meio essencial mínimo modificado por Dulbecco (Gibco) suplementado com 1% de L-glutamina (Gibco), 1% de penicili- na, 1% de estreptomicina (Gibco), 1X aminoácidos não essenciais (Gibco) e 10% de soro fetal bovino (Omega Scientific). As linhagens de células foram passadas três vezes por semana após o tratamento com 0,05% de tripsina - 0,02% de EDTA e semeadas em uma diluição de 1:4.

[00180] Ensaios de complementação de proteína-fragmento. Os ensaios de ligação foram realizados essencialmente como descritos (Cassonnet e outros, Nat Methods. 8, 990-992, 2011). Combinações de plasmídeos que codificam proteínas de presa (A) e isca (B), cada um fundido com um fragmento da proteína luciferase de Gaussia princeps (Gluc1i e Gluc2) ou vetores de controle foram cotransfectadas em célu- las 293T ou Huh-7.5 plaqueadas em placas de 96 poços em triplicatas. Em 24 h pós-transfecção, as células foram lisadas e submetidas a en- saios com gene repórter da luciferase padronizados utilizando sistema de ensaio de luciferase de Renilla (Promega). Os resultados foram ex- pressos na forma de luminescência ou de taxa de luminescência. À última representa o sinal de luminescência médio detectado nas célu- las transfectadas com Gluc1-A e Gluc2-B dividido pela média de lumi- nescência medida em poços de controle transfectados com Gluc1-A e um vetor Gluc2 vazio com aquelas transfectadas com Gluc2-B e um vetor Gluc1 vazio. Ensaios de competição e estudos planejados para determinar o efeito inibidor de compostos ou siRNAs foram realizados como anteriormente, exceto pelo fato de que a ligação foi medida na presença de proteínas livres em excesso, dos inibidores ou dos siR- NAs, respectivamente. Os experimentos foram realizados pelo menos três vezes em triplicatas.

[00181] Co-imunoprecipitações. As membranas foram preparadas partindo de -20x10º células Huh-7.5 infectadas com HCV (J6/JFH) (Lindenbach e outros, Science 309, 623-626, 2005), como descrito an- teriormente (Einav e outros, J Virol 78, 11288-11295, 2004). Sucinta- mente, as células foram coletadas através do tratamento com tripsina, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em tampão HME (20 mM de HEPES [pH 7,4], 1 mM de EDTA, 2 mM de MgCl2), suplementadas com fluoreto de fenilmetilsulfonila até uma concentração final de 1 mM e um coquetel de inibidores de proteases (Sigma). As células foram lisadas através de dois ciclos de congelamento-descongelamento em gelo seco-etanol e então passadas através de uma agulha de calibre 27,5 10 vezes. Os núcleos foram removidos por centrifugação a 250 xg durante 10 min e o sobrenadante pós-nuclear foi submetido à ultracen- trifugação a 100.000 xg durante 30 min para a obtenção da preparação de membrana. Todas as etapas foram realizadas a 4C . As proteínas totais de membrana foram diluídas em 1 mL de tampão TDB (2,5% de Triton X-100, 25 mM de trietanolamina-CI [DH 8,6], 20 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,2% de NaN;3) (Einav e outros, J Virol 78, 11288-11295, 2004) e incubadas durante 30 min a 37ºC com 100 nM de caliculina-A ou DMSO. Devido à natureza fraca e transitória das interações, 25 mM do agente de reticulação ditiobis-succinimidil-propionato (DSP) (Pier- ce) foram adicionados para permitir ligação covalente das proteínas de interação já ligadas. As amostras foram incubadas durante 2 h em ge- lo. 1 M de Tris foi adicionado para interromper a atividade de DSP. Os lisados foram então clarificados por centrifugação durante 10 min a 1000xg, seguidos por 30 min de ultracentrifugação dos sobrenadantes em 100.000xg. As pelotas de membrana foram ressuspensas em 100 | de tampão HME (20 mM de NaHEpes (pH 7,4), 1 MM de EDTA (pH 8), 2 mM de MgClz) e o tampão TDB foi adicionado para um volume final de 1 mL. As amostras foram incubadas durante toda a noite com anti- corpos anti-AP2M1, anticorpos antinúcleo ou controles de IgG e esfe- ras magnéticas de proteína G (Millipore). Os imunoprecipitados foram analisados por western blotting. Os experimentos foram realizados du- as vezes em duplicatas.

[00182] Transcrição in vitro de RNA viral e transfecção. O RNA do HCV foi gerado e fornecido para dentro de células Huh-7.5, como descrito anteriormente (Lindenbach e outros, Science 309, 623-626, 2005; Murray e outros, J Virol 81, 10220-10231, 2007). Sucintamente, o RNA foi sintetizado partindo do molde de J6/JFH(p7-ULRCc2A) linea- rizado com Xbal utilizando o kit T7 MEGAscript de acordo com o proto-

colo do fabricante (Ambion). As misturas de reação foram incubadas durante 3 h a 37 e então submetidas ao tratamento com DNase du- rante 15 min a 37 T. O RNA viral foi purificado uti lizando o RNeasy kit (Qiagen). O RNA foi quantificado através da absorbância em 260 nm e sua qualidade foi verificada por eletroforese em gel de agarose. As cé- lulas Huh-7.5 subconfluentes foram tratadas com tripsina e coletadas por centrifugação a 700g durante 5 min. As células foram então lava- das três vezes em PBS isento de RNase gelado (BioW/hittaker) e res- suspensas a 1,5*10 células/ml em PBS. 5 ug do RNA do tipo selva- gem ou do mutante J6/JFH(p7-ULRCc2A) transcrito in vitro foram mistu- rados com 400 uL de células Huh-7.5 lavadas em uma cubeta com a- bertura de 2 mm (BTX) e imediatamente submetidos a pulsos (0,82 kV, cinco pulsos de 99 us) com um eletroporador BTX-830. Após uma re- cuperação de 15 min a 250, as células foram diluídas em 30 mL de meio de crescimento pré-aquecido e plaqueadas em placas de cultura de tecido de 96, 24, 6 poços e P100.

[00183] Replicação do RNA do HCV através de ensaios da luci- ferase. A replicação do RNA do HCV foi medida em 6-9 h e 72 h pós- eletroporação, como descrito (Murray e outros, J Virol 81, 10220- 10231, 2007). As células submetidas à eletroporação plaqueadas em quadruplicatas em placas de 96 poços foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas com 30uL de tampão de lise de Renilla (Promega). Após min de agitação à temperatura ambiente, a atividade da luciferase foi quantificada utilizando um substrato de luciferase de Renilla (Pro- mega) e um luminômetro Tecan (Tecan) de acordo com os protocolos dos fabricantes.

[00184] Ensaios de replicação do HIV. Células TZM-b1 derivadas de Hela, que expressam CD4, CCR5 e CXCR4, bem como B- galactosidase e genes repórteres de luciferase de vaga-lume que res- pondem à transcrição do HIV (Wei e outros, Antimicrobial agents and chemotherapy 46, 1896-1905, 2002) foram utilizadas nestes ensaios. As células foram transfectadas com siRNAs que se direcionam a A- AK1, GAK ou uma sequência NT seguida pela infecção com o clone NL4-3 de HIV-1 infeccioso (Adachi e outros, J Virol 59, 284-291, 1986), como descrito (Zhou e outros, Cell Host & Microbe 4, 495-504, 2008). A atividade da luciferase foi medida em 96 h pós-infecção. Para testar o efeito de inibidores farmacológicos de AAK1 e GAK contra HIV, célu- las TZM-b1 derivadas de HeLa infectadas com HIV-1 foram tratadas diariamente com diluições em série de sunitinib, erlotinib ou PKC-412 durante 4 dias seguidos por ensaios da luciferase.

[00185] Capacidade de infecção extracelular. Os sobrenadantes de cultura de células Huh-7.5 submetidas à eletroporação com RNA de J6/JFH(p7-ULRC2A) e plaqueadas em placas P100 foram coletados em 72 h pós-eletroporação, clarificados (com um filtro com tamanho de poro de 0,22 um) e utilizados para infectar células Huh-7.5 puras du- rante 72 h em triplicatas antes da lise em tampão de lise de Renilla (Promega). A atividade da luciferase em 20uL de lisados de células foi quantificada como descrito anteriormente. Para determinar o efeito de erlotinib, sunitinib e PKC-412 sobre a produção de vírus infeccioso, as células submetidas à eletroporação foram crescidas na presença dos inibidores com trocas de meio diárias durante 72 h antes da coleta dos sobrenadantes ou lisados de células. Os resultados representam valo- res de ULR de log 10 por placa de cultura de tecido de 10 cm. Os ex- perimentos foram repetidos três vezes, cada vez com quadruplicatas.

[00186] Ensaios de capacidade de infecção intracelular. Como descrito por Murray e outros (J Virol 81, 10220-10231, 2007), 72 h pós- eletroporação com RNA de J6/JFH(p7-ULRC2A) as células foram tra- tadas com tripsina, coletadas por centrifugação, ressuspensas em 500uL de meio, lisadas por ciclos de congelamento-descongelamento e peletizadas duas vezes a 3.650xg. Os sobrenadantes clarificados diluídos em meio completo foram utilizados para inocular células Huh-

7.5 puras em triplicatas, seguido pela lise e ensaios da luciferase em 72 h. Os resultados representam valores de ULR de log 10 por placa de cultura de tecido de 10 cm. Os experimentos foram repetidos três vezes, cada vez com quadruplicatas.

[00187] Titulação do vírus. Os títulos extracelulares e Intracelula- res foram determinados através de ensaios de diluição limitante base- ados na coloração imuno-histoquímica em relação ao núcleo. 50% da dose infecciosa de cultura de tecido (TCIDso) foram calculados, como descritos (Lindenbach e outros, Science 309, 623-626, 2005). Os resul- tados são expressos na forma de TCIDso/mL. Os títulos mínimos medi- dos com o mutante AE 1-E2 foram utilizados para a subtração do fundo.

[00188] ELISA do núcleo. A concentração de proteína do núcleo liberada foi medida nos sobrenadantes de cultura de células clarifica- dos coletados em 72 h pós-eletroporação por ELISA (Cell Biolabs) contra curvas padrão de antígeno de núcleo recombinante, de acordo com as instruções do fabricante.

[00189] Ensaios de viabilidade. Após 24, 48 e 72 h de tratamento com compostos inibidores ou silenciamento com siRNAs, as células foram incubadas durante 2-4 h a 37ºC na presença de 10% de reagen- te AlamarBlue (TREK Diagnostic Systems), como descrito (Einav e ou- tros, Nature Biotechnology 26, 1019-1027, 2008). As placas foram en- tão verificadas e a fluorescência foi detectada através da utilização de FLEXstation Il 384 (Molecular Devices, Inc.).

[00190] Estudos de infecção. 6x10º células Huh-7.5 semeadas em placas de 96 poços foram infectadas em triplicatas com HCV J6/JFH crescido em cultura de células (título: 1,2x10º TCIDso/mL). As capaci- dades de infecção extracelular e intracelular foram medidas por ensai- os de formação de focalização (Lindenbach e outros, Science 309, 623-626, 2005) em células Huh-7.5 puras infectadas com sobrenadan-

tes ou lisados de células clarificados derivados das células infectadas em 72 h pós-infecção.

[00191] Para determinar o efeito antiviral de erlotinib, sunitinib e PKC-412, 6x10º células Huh-7.5 semeadas em placas de 96 poços fo- ram infectadas em triplicatas com HCV crescido em cultura de células (J6/JFH(p7-ULRCc2A)) (título: 6,3x10º TCIDso/mL) com uma MOI (multi- plicidade de infecção) de 0,1. Seis horas após a infecção e diariamente depois disso, as células foram lavadas e o meio foi substituído por meio contendo diluições em série dos compostos inibidores. Em 72 h, as amostras foram submetidas a ensaios de viabilidade, seguidos por ensaios de luciferase padronizados (Promega).

[00192] Análise de revertentes. Células Huh-7.5 submetidas à ele- troporação com J6/JFH(p7-ULRcC2A) carregando as mutações Y136A ou V139A foram propagadas. Os sobrenadantes de cultura foram cole- tados a cada poucos dias e utilizados para inocular células Huh-7.5 puras para a determinação da capacidade de infecção extracelular a- través de ensaios da luciferase 72 h após a inoculação. O RNA celular total foi extraído de clones que demonstraram reversão do fenótipo de capacidade de infecção (no dia 8 pós-eletroporação para clones de Y136A e dia 14 para clones mutantes V139A) utilizando o reagente TRizol (Invitrogen). A reação de transcrição reversa e a amplificação através da PCR foram realizadas utilizando o kit de POR com trans- criptase reversa (RT-PCR) Superscript One-Step (Invitrogen) Um segmento de —-1 kb carregando a sequência que codifica o núcleo foi amplificado. Os produtos da PCR foram purificados partindo dos géis de agarose através do kit de purificação de DNA Ultra Clean 15 (MoBi- o) e submetidos ao sequenciamento automático em um sequenciador de DNA ABI Prism 377 DNA (Sequetech). A presença de reversão de sítio primário foi confirmada por duas sequências independentes utili- zando oligos para frente e inversos.

[00193] Extração de RNA e gRT-PCR. O RNA total foi isolado par- tindo das células ou 1 mL de sobrenadantes de cultura de células utili- zando TRlzol (Invitrogen) ou o kit QiaAmp UltraSens kit (Qiagen), res- pectivamente. As misturas de qRT-PCRs foram montadas em triplica- tas utilizando 0,5 ug ou 4ul de RNA e High-Capacity RNA-to-cCDNA (Applied Biosystems). Os reagentes de TaqMan são listados na Tabela

4. A amplificação e a análise foram realizadas utilizando o sistema StepOnePlus Real-Time-PCR (Applied Biosystems). S18 foi utilizado como um controle.

[00194] Western blot. Os lisados de células foram submetidos a análises de western utilizando anticorpos primários seguidos por anti- corpos secundários conjugados com HRP. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando NIH Image.

[00195] Microscopia confocal por imunofluorescência quantita- tiva. As células Huh-7.5 foram submetidas à eletroporação com RNA de HCV J6/JFH ou infectadas com vírus J6/JFH crescido em cultura, semeadas sobre lâminas e incubadas durante 72 h a 37. As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS, lavadas com PBS, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min e bloqueadas durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA. As células fixa- das foram incubadas com anticorpos primários contra a proteína do núcleo, AP2M1, TGNA46, calreticulina ou E2 à temperatura ambiente durante 1 h (ver a Tabela 1). Anticorpos secundários (Alexa Fluor 488 anticoelho caprino, Alexa Fluor 594 anticamundongo caprino, Alexa Fluor 647 IgG anticaprino de frango e Alexa Fluor 647 anti-humano ca- prino) (Invitrogen) foram incubados durante 1 h à temperatura ambien- te. A coloração de LD com Bodipy-488/503 (Invitrogen) foi realizada como descrito (Kopp e outros, J Virol 84, 1666-1673, 2010). As lâminas foram então lavadas três vezes em PBS e montadas com reagente an- tidescoloração ProLong Gold (Invitrogen). Alternativamente, as células

Huh-7.5 foram cotransfectadas com plasmídeos expressando AP2M1- YFP e/ou Núcleo-mCherry. LD foram corados com HCS LipidTOX (Invi- trogen). Todas as lâminas foram analisadas utilizando microscópio confocal Zeiss LSM 510, A colocalização foi quantificada em 10-15 cé- lulas escolhidas aleatoriamente de cada amostra utilizando o Software de colocalização ImageJ (JACoP) e Coeficientes de Colocalização de Manders (MCC). Os valores limites foram determinados utilizando au- to threshold (plugin, ImageJ). Apenas pixels cujos valores de intensi- dade vermelhos e verdes eram ambos anteriormente seus limites res- pectivos foram considerados como sendo pixels com sondas colocali- zadas. Os MCCs foram então calculados como as frações de fluores- cência total na região de interesse que ocorre nestes pixels "colocais" (com um valor mais alto representando maior mais colocalização). Os valores de coeficiente M2 representados como a porcentagem média de colocalização são mostrados.

[00196] Análise estatística. As IC50s e as EC50s foram medidas através do ajuste dos dados a uma curva logística de três parâmetros, como descrito (Einav e outros, Nature Biotechnology 26, 1019-1027, 2008). Os valores-p foram calculados utilizando teste de Student não pareado de uma cauda. Exemplo 3 O efeito de erlotinib, sunitinib e PKC-412 sobre a fosforilação de AP2M1.

[00197] Para determinar o efeito dos compostos inibidores sobre a fosforilação de AP2M1, as células Huh-7.5 carregando RNA de J6/JFH(p7-ULRC2A) foram tratadas diariamente com várias concentra- ções dos compostos ou com DMSO. Uma vez que a fosforilação de AP2M1 é transitória (devido à atividade da fosfatase PP2A (Ricotta e outros, J Biol Chem 283:5510-5517, 2008), para permitir a captura do estado de AP2M1 fosforilado, os lisados foram preparados em 72 h após uma incubação de 30 min das células com 100 nM do inibidor PP?2A, caliculina A (Cal-A) ou um controle de DMSO. As amostras fo- ram então submetidas a SDS-PAGE e blotting com anticorpos que se direcionam à forma de AP2M1 fosforilada ou à actina. Na verdade, proporções significativamente mais baixas de AP2M1 fosforilada para a actina foram medidas em lisados preparados partindo de células tra- tadas com sunitinib, erlotinib ou PKCA412, comparadas com o controle de DMSO (Fig. 6H). As proporções de fosfo-AP2M1 para actina foram progressivamente diminuídas através do aumento das concentrações de sunitinib e erlotinib de uma maneira dependente da dose. Estes re- sultados sugerem que AAK1 ou GAK são potencialmente inibidos por estes compostos em células Huh-7.5 carregando HCV infeccioso. O efeito dos compostos sobre a replicação do RNA do HCV, a capaci- dade de infecção intracelular, a capacidade de infecção extracelular e a replicação do HCV.

[00198] Para determinar o efeito de erlotinib, sunitinib e PKC-412 sobre a produção de vírus infeccioso, as células Huh-7.5 foram subme- tidas à eletroporação com o genoma de HCV J6/JFH(p7-ULRc2A) (Murray e outros, J Virol 81: 10220-10231, 2007), plaqueadas em pla- cas de 6 poços e tratadas diariamente com diluições em série dos compostos ou DMSO. Em 72 h pós-eletroporação, a viabilidade celular foi medida por ensaios à base de AlamarBlue seguidos por ensaios da luciferase para a determinação da replicação do RNA do HCV. Os so- brenadantes de cultura de células e os lisados foram coletados em 72 h partindo de amostras paralelas e utilizados para inocular células Huh-7.5 naive para a determinação da capacidade de infecção extrace- lular e intracelular, respectivamente. Os ensaios da luciferase foram realizados nestas células em 72 h pós-inoculação.

[00199] Para determinar o efeito destes compostos sobre a replica- ção do HCV, 6x10º células Huh-7.5 semeadas em placas de 96 poços foram infectadas em triplicatas com HCV crescido em cultura de célu- las (J6/JFH(p7-ULRc2A)) titulado em 6,3x10º TCIDsoW/mL com uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1. Em 6 h pós-eletroporação, as célu- las foram lavadas e o meio foi substituído por diluições em série dos compostos inibidores. As células foram tratadas diariamente durante 72 h e então submetidas aos ensaios de viabilidade seguidos por en- saios de luciferase padronizados.

[00200] Alternativamente, 6x10º células Huh-7.5 semeadas em pla- cas de 96 poços foram infectadas em triplicatas com HCV crescido em cultura de células J6/JFH (título: 1,2x10º TCIDsoW/mL com uma MOI de 0,1) e submetidas a ensaios de formação de focalização, como descri- to (Lindenbach e outros, Science 309:623-626, 2005). Após 72 h de tratamento diário com os compostos, as células foram fixadas em 4% de formaldeído e permeabilizadas com saponina. A proteína do núcleo de HCV foi detectada com anticorpos monoclonais antinúcleo primários e conjugados com Alexa 594 anticamundongo caprino secundários. As focalizações foram contadas sob um microscópio invertido.

[00201] Os experimentos foram repetidos duas vezes, cada um com 4 réplicas. O sinal foi normalizado em relação às amostras crescidas na presença da concentração correspondente de DMSO. As EC50s foram medidas através do ajuste dos dados a uma curva logística de três parâmetros utilizando a fórmula Y=a+(b-a)/(1+10º(X-c)) (a, bec representam ligação mínima, ligação máxima e logEC50, respectiva- mente) (BioDataFit, Chang Bioscience, Inc). Tabela 1. Anticorpos utilizados neste estudo Anticorpos Origem Anti-penta-his biotinilado Qiagen Anti-V5 conjugado com FITC Invitrogen Antimarcação T7 conjugado com ficoeritrihna Abcam Anti-AAK1 de coelho Abcam

Tabela 1. -continuação- Anticorpos Origem Anti-AP2M1 de coelho Santa Cruz Biotechnology Anti-AP2M1 caprino Santa Cruz Biotechnology Anti-fosfo-AP2M1 de coelho (T156) Cell signaling Anti-TGN46 de coelho Abcam Anti-calreticulina de coelho Enzo Life Sciences Anti-GAK de camundongo MBL international corporation Anti-núcleo de camundongo Austral Biologicals Anti-E2 humano (CBH5) Dr.

Steven K foung Anti-actina de camundongo Sigma IgG anticamundongo conjugado com HRP Cell signaling IgG anticoelho conjugado com HRP Cell signaling Tabela 2. Compostos utilizados neste estudo Compostos Origem PKC-412 Sigma Malato de sunitinib Sigma 15 Erlotinib LC Laboratories Caliculina A Cell Signaling Tabela 3. RNAi utilizado neste estudo Tipo de RNAi Alvo de Catálogo Origem Sequência ONTARGETpls SMARThoolks — APIMI — LQOOSITO000002 — Dhanuaços aPINA caos Dhanmocon — GUUAAGOGGUOCAACAUUL Apa) 006 — Damon — GOGAGAGGGUAUCAAGUAL APaH roms Dhauocon — AGUUUGAGCUVAUGAGGUA APM) sooinos Dhamecon — GAACCGAAGOUGAACUACA Não se direciona D01S510-10.05 Dhamacon — Não disponível SRNAS AAKI Refas Asbioo — GGUGUGCAAGAGAGAAAUDOU GAK Reto Dbammacon — AACGAAGGAACAGEUGALUCA Não se direciona D-001210-01-05 Dhamocon — Não disponível MISSIONAMRNAS aeee TRONO Sem ESAAGTTOGACTICATOAGCRCETTITO me TÉO a EROUDtaaNtao AbIMI TRCNOCONOGO241 Sigma COGGGCTGGATGAGATICTAGACTICICGA idos em ” GAAGTCTAGAATCTCATOCAGOTTITIG a TO CNAE Não se direciona — sunconev Sigoa Não disponível

Tabela 4. Sondas e iniciadores de Taqgman utilizados neste estudo Nome do iniciador Sequência ou £ de catálogo do ensaio HCV Para frente CTICACGCAGAAAGCGTCTA HCV Inversa CAAGCACCCTATCAGGCAGT Sonda HCV Tagman MGB [6FAM|-TATGAGTGTCGTGCAGCCTC-IMGB-NFQ] AP2MI HS01037584 ml GAK HS00178347 ml AAKI HS00208618 ml SI8 1hs999999 ml

[00202] Todos os reagentes listados nesta tabela foram obtidos na Applied Biosystems, Inc (ABI).

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Agente para uso em um método de tratamento de coin- fecção por HCV-HIV, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a ligação de um dos referidos vírus HCV e HIV a uma subunidade nu hospedeira de complexos de proteína adaptadora (AP) de clatrina.

2. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida subunidade u é selecionada do grupo que consiste em subunidades u de complexos de AP1, AP2, AP3 e AP4 de clatrina.

3. Agente de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida subunidade u é selecionada do grupo que consiste em AP2M1, AP1M1, AP3M1 e APAM1.

4. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente inibe AAK1 ou GAK.

5. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente é selecionado do grupo que consiste em erlotinib, sunitinib e PKC-412, ou sais farmaceuticamente aceitá- veis, ou combinações dos mesmos.

6. Agente para uso em um método de inibição de infecções por um Lentiviridae, HIV, coinfecção por HCV/HIV, Flaviviridae que não o HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não os Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatrina que não o HCV, caracterizado pe- lo fato de que o agente inibe a ligação de uma proteína estrutural do referido vírus compreendendo um motivo YXX& ou dileucina a uma subunidade u hospedeira de complexos de proteína adaptadora (AP) de clatrina.

7. Agente de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida subunidade up é selecionada a partir do gru- po consistindo em subunidades py de complexos de API, AP2, AP3 e AP4 de clatrina.

8. Agente de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida subunidade u é selecionada do grupo que consiste em AP2M1, AP1M1, AP3M1 e APAM1.

9. Agente de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente inibe AAK1 ou GAK.

10. Agente de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente é selecionado do grupo que consiste em erlotinib, sunitinib e PKC-412, ou sais farmaceuticamente aceitá- veis, ou combinações dos mesmos

11. Método de rastreamento ex vivo para agentes antivirais, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar um vírus fixador de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixadores de AP de clatri- na que não HCV ou proteína do mesmo com um agente candidato e uma subunidade pu hospedeira de complexos de proteína adaptadora (AP) de clatrina, e determinar um efeito do referido agente candidato sobre a ligação do referido vírus fixador de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixador de AP de clatrina que não HCV à referida proteína.

12. Método ex vivo de rastreamento para agentes antivirais, caracterizado pelo fato de que compreende: contactar um vírus fixador de AP de clatrina, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, Flaviviridae que não HCV, vírus fixadores de AP de clatrina que não Flaviviridae, ou vírus fixador de AP de clatrina que não HCV vírus com um agente candidato e uma célula expres- sando uma subunidade hospedeira de complexos de proteína adapta- dora (AP) de clatrina e determinar o efeito do referido agente candida- to sobre a montagem ou brotamento viral.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que o referido agente candidato inibe a atividade de AAK1 ou GAK.

14. Método ex vivo de inibição da montagem ou brotamento de um Flaviviridae, um vírus que não um Flaviviridae, ou um vírus que não HCV em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a referida cerca de com um agente que previne a ligação de uma proteína estrutural viral compreendendo um motivo YXXOD ou dileucina a uma subunidade pu hospedeira de complexos de proteína adaptadora (AP) de clatrina, e com isso a referida montagem ou brotamento é inibido.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o referido agente bloqueia a ligação da referida proteína estrutural à referida proteína hospedeira.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o referido agente compete com a referida proteína estrutural pela ligação à referida proteína hospedeira.

17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o referido agente compete com a referida proteína hospedeira pela ligação à referida proteína estrutural.

18. Uso de uma quantidade eficaz de um agente como de- finido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a pre- paração de uma composição farmacêutica que iniba a ligação de um dos vírus HCV e HIV a uma subunidade u hospedeira de complexos de proteína adaptadora (AP) de clatrina.

19. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, ou de processo, ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada, ou ilustrada no pedido de patente.