BR112013021562B1

BR112013021562B1 - Anticorpos para cd70

Info

Publication number: BR112013021562B1
Application number: BR112013021562-3A
Authority: BR
Inventors: Karen Silence; Peter ULRICHTS; Johannes Joseph Wilhelmus De Haard; Torsten Dreier; Michael John Scott Saunders; Harald Wajant; Sofie Maria Elvire Gabriels; Mahan Moshir
Original assignee: Argenx Bvba
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2023-01-10
Also published as: WO2012123586A1; JP5982409B2; RU2604196C2; US9765149B2; SI2686347T1; EP2686347B1; US20140141016A1; US20230265201A1; US9765148B2; HUE039849T2; IL228001B; RU2013146106A; US20140235843A1; TR201807202T4; US11072665B2; US11434298B2; BR112013021562A2; AU2012228194B2; JP2014509861A; CN103596979A

Abstract

ANTICORPOS PARA CD70. A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à proteína CD70 humana com elevada afinidade e exibem inibição potente de crescimento de células de tumor.

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se aos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à proteína de CD70 humano com elevada afinidade e exibem potente inibição de crescimento de células de tumor.

ANTECEDENTES

O receptor de citocina CD27 é um membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TFNR), que desempenha um papel em crescimento celular e diferenciação, bem como apoptose. O ligando para CD27 é CD70, que pertence à família de fator de necrose de tumor de ligandos. CD70 é um 193 polipeptídeo de aminoácido tendo um domínio N- terminal hidrofílico de 20 aminoácidos e um domínio C- terminal contendo 2 sítios de glicosilação N-ligados potenciais (Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73:447-56; Bowman et al. (1994) Immunol 152: 1756-61). Baseado nesses aspectos, CD70 foi determinado como sendo uma proteína de transmembrana tipo II tendo uma porção C-terminal extracelular. CD70 é transientemente encontrado em linfócitos T e B ativados e células dendríticas (Hintzen et al. (1994) J. Immunol. 152: 1762- 1773; Oshima et al. (1998) Int. Immunol. 10:517-26; Tesselaar et al. (2003) J. Immunol. 170:33-40).

Além da expressão em células normais, expressão de CD70 foi reportada em diferentes tipos de cânceres incluindo carcinomas de célula renal, cânceres mamários metásticos, tumores cerebrais, leucemias, linfornas e carcinomas de nasofaringe (Junker et al. (2005) J Urol. 173:2150-3; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt e Mentlein (2002) Int J Cancer 98:352-6; Hishima et al. (2000) Am J Surg Pathol. 24:742-6; Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106:491-503). A interação de CD70 com CD27 foi também proposta para desempenhar um papel em doença autoimune mediada por células e a inibição de produção de TNF-alfa (Nakajima et al. (2000) J. Neuroimmuno1. 109:188- 96) . Consequentemente, CD70 representa um alvo para o tratamento de câncer, doenças autoimunes e uma variedade de outras doenças caracterizadas por expressão de CD70. WO 2006/0044643 descreve anticorpos para CD70 contendo um domínio de efetor de anticorpo que pode mediar uma ou mais de ADCC, ADCP, CDC ou ADC e quer manifestar um efeito citostático ou citotóxico em um câncer expressando CD70 ou manifestar um efeito imunossupressor em um distúrbio imunológico de expressão de CD70 na ausência de conjugação a um agente citostático ou citotóxico. Os anticorpos exemplificados aqui são baseados nas regiões de ligação ao antígeno de dois anticorpos monoclonais, denotados 1F6 e WO 2007/038637 descreve anticorpos monoclonais completamente humanos que se ligam a CD70. Esses anticorpos são caracterizados por ligar a CD70 humano com um KD de lxlO'7 M ou menos. Os anticorpos também ligam a, e são internalizados por linhagens de células de tumor de carcinoma de célula renal que expressa CD70, tal como 786-0.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Providos aqui são anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, (referidos aqui como anticorpos para CD7 0) que se ligam à proteína de CD7 0 humano e exibem propriedades que são diferentes, e geralmente superiores, aos anticorpos para CD70 descritos na técnica anterior. As propriedades superiores desses anticorpos são vantajosas com respeito a uso em terapia humana, particularmente tratamento de cânceres expressando CD70 e também distúrbios imunológicos.

Os anticorpos para CD70 descritos aqui são caracterizados por afinidade de ligação extremamente elevada para CD70 humano. Todas as formas de realização preferidas descritas aqui exibem uma afinidade de ligação para CD70 humano recombinante (medido por ressonância de plasmon de superfície Biacore™ como descrito aqui) que é significantemente maior que a dos anticorpos mais potentes de CD70 de técnica anterior propostos para terapia humana, incluindo anticorpos para CD70 de técnica anterior de origem "completamente humana". Além disso, todas as formas de realização preferidas dos anticorpos para CD70 descritas aqui exibem superior ligação (isto é maior afinidade) para CD70 expressado na superfície de linhagens de células humanas, especificamente linhagens de células de câncer humano, quando comparados a anticorpos para CD70 de técnica anterior propostos para terapia humana. Essa ligação superior a CD70 de superfície celular é particularmente marcada com respeito a linhagens de células de câncer humano que expressam CD70 de "baixo número de cópias" e é de relevância direta para uso dos anticorpos em terapia humana. Ainda adicionalmente, formas de realização preferidas dos anticorpos para CD70 descritas aqui exibem ligação substancialmente melhorada a células de câncer isoladas de pacientes humanos, células de câncer particularmente isoladas de pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL), quando comparados a anticorpos para CD70 de técnica anterior propostos para uso terapêutico humano.

Portanto, em um primeiro aspecto da invenção provê-se um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a CD7 0 humano, referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (VH) e pelo menos um domínio variável de cadeia leve (VL), em que referidos 5 domínios VH e VL exibem uma taxa de dissociação (kOff medido por Biacore™) para CD70 humano de menos que 7 x 10’4 s-1, quando testados como um fragmento Fab usando o protocolo Biacore™ padrão descrito aqui.

Em uma forma de realização preferida o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (VH) e pelo menos um domínio variável de cadeia leve (VL), em que referidos domínios VH e VL exibem uma taxa de dissociação para CD70 humano de 5 x 10'4 s'1 ou menos, ou 2 x 10'4s-1 ou menos, ou 1 x 10'4s_1 ou menos. Mais preferivelmente o anticorpo para CD70 exibirá uma taxa de dissociação para CD70 na faixa a partir de 0,4 x IO-4 s'1 a 4,8 x 10'4 s-1, quando testado como um fragmento Fab. Provê-se, também, um anticorpo que se liga a CD70 humano, referido anticorpo compreendendo duas regiões Fab, em que cada uma das regiões Fab liga a CD7 0 humano e exibe uma taxa de dissociação para CD70 humano de 5 x 10*4 s-1 ou menos, ou 2 x 10’4s-1 ou menos, ou 1 x 10'4s-1 ou menos e preferivelmente na faixa a partir de 0,4 x IO-4 s_1 a 4,8 x IO'4 s'1, quando testado como um fragmento Fab. As duas regiões Fab podem ser idênticas ou elas podem diferir em termos de propriedades de ligação, por exemplo, afinidade para CD70 humano. As duas regiões Fab podem se ligar ao mesmo epítopo ou epítopos de sobreposição sobre CD70 humano ou eles podem se ligar a epítopos de não sobreposição distintos em CD70 humano. As duas regiões Fab podem diferir uma da outra em termos de sequência de aminoácidos dentro de um ou ambos dos domínios de VH e VL.

Formas de realização preferidas dos anticorpos para CD70 providos aqui podem, em adição à afinidade de ligação extremamente elevada para CD70, exibir potente bloqueio ou inibição da interação entre CD70 e seu ligando CD27. Os anticorpos para CD70 preferidos que exibem tanto elevada afinidade de ligação a CD70 como potente bloqueio da interação de CD70/CD27, são particularmente vantajosas como agentes terapêuticos para tratamento de indicações de doença onde bloqueio de sinalização de CD70/CD27 aumenta a eficácia terapêutica (por exemplo, além da morte celular mediada pelas funções efetoras do anticorpo para CD70), por exemplo, doenças autoimunes e cânceres que co-expressam CD70 e CD27. Nem todos os anticorpos para CD70 descritos aqui exibem potente bloqueio da interação de CD70/CD27 além de uma elevada afinidade de ligação a CD70. Também são descritos aqui vários anticorpos para CD70 que exibem ligação de afinidade muito elevada para CD70, mas não mostram significante bloqueio da interação de CD70/CD27. As propriedades desses anticorpos são descritas em outras partes aqui. A disponibilidade de anticorpos para CD70 não bloqueantes de elevada afinidade pode aumentar/estender a faixa de possibilidades terapêuticas.

Formas de realização preferidas dos anticorpos para CD70 descritas aqui, exibindo afinidade muito elevada de ligação para CD70 humano, são também caracterizadas por uma combinação de propriedades de ligação que não é exibida por anticorpos para CD70 de técnica anterior propostos para uso terapêutico humano. Consequentemente, os anticorpos para CD70 preferidos descritas aqui são caracterizados por: (a) ligação dentro da sequência de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342) em CD70 humano; (b) reatividade cruzada com homólogos de CD70 de macaco reso (Macaca mulatta) e macaco cinomolgo (Macaca cynomolgus); (c) ligação a ambos, CD70 humano CD70 humano recombinante nativo e desnaturado por calor.

Essa combinação de propriedades de ligação, que não é exibida pelos anticorpos de técnica anterior propostos para uso terapêutico humano, indica ligação a um novo epítopo em CD70 que é diferente aos epítopos ligados por anticorpos para CD70 de técnica anterior.

A combinação de propriedades de ligação exibidas pelos anticorpos para CD70 preferidos é vantajosa no contexto de desenvolvimento de fármaco humano. Em particular, reatividade cruzada com homólogos de CD70 de símios possibilita estudos de toxicologia em anticorpos para CD70 propostos para uso terapêutico humano a ser efetuado em modelos de primata.

Os anticorpos para CD70 preferidos descritos aqui ainda mais exibem propriedades favoráveis que são relevantes para a fabricação comercial como um produto de anticorpo terapêutico. Como discutido aqui, os anticorpos para CD70 preferidos fornecidos aqui exibem expressão de nível extremamente elevada nos sistemas de expressão recombinantes utilizados para a fabricação comercial de produto de tipo clínico de anticorpos terapêuticos. Os níveis de expressão obteníveis com os anticorpos para CD70 preferidos excederam muito os níveis tipicamente alcançados mesmo para produto "completamente humano" de anticorpos terapêuticos. Em adição, os produtos de anticorpo para CD70 preferidos (produzidos por expressão recombinante em um formato adequado para uso terapêutico humano) exibem marcante estabilidade térmica, que é superior a produto típico de anticorpos terapêuticos.

Os anticorpos para CD70 providos aqui com superior afinidade de ligação para CD70 humano e as outras propriedades vantajosas listadas acima são derivados de camelídeo (por exemplo, derivados de lhama). Os anticorpos para CD70 derivados de camelídeos podem ser anticorpos monoclonais isolados ou recombinantemente expressados. Formas de realização preferidas podem ser anticorpo monoclonal humanizado (ou germinalizado, por exemplo, uma variante humanizada de um anticorpo derivado de camelídeo), um anticorpo quimérico (por exemplo, um anticorpo quimérico de camelideo-humano) ou um anticorpo quimérico humanizado (por exemplo, um anticorpo quimérico compreendendo variantes humanizadas de domínios de camelídeos de VH e VL e domínios constantes de um anticorpo humano).

Anticorpos para CD70 derivados de camelídeos podem compreender pelo menos uma alça hipervariável ou região de determinação de complementaridade obtida de um domínio VH ou um domínio VL de uma espécie na família Camelidae. Em uma forma de realização particular, o anticorpo para CD70, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, podem compreender um domínio variável de cadeia pesada (VH) e domínio variável de cadeia leve (VL) , em que os domínios de VH e VL, ou uma ou mais CDRs dos mesmos, são derivados de camelídeo. Em formas de realização particulares o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem compreender domínios de VH e VL de lhama, ou variantes humanas germinalizadas de domínios de VH e VL de lhama. Esse anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, pode exibir "homologia humana elevada", como definido aqui.

Os anticorpos para CD70 derivados de camelídeos descritos aqui tipicamente exibem sequências de aminoácidos de região VH e/ou VL tendo pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) identidade de sequência para a sequência de linhagem germinal de anticorpo humanos correspondente mais próximo.

Outras formas de realização preferidas da invenção incluem variantes humanizadas (ou germinalizadas humanas) dos anticorpos para CD70 derivados de camelídeos. Em particular, a invenção provê variantes humanizadas ou germinalizadas humanas dos anticorpos para CD70 derivados de lhama descritos aqui.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo carne lí de o-humano quimérico que liga CD70 humano, em que as porções de antígeno-ligação do anticorpo (por exemplo, domínios VH e/ou VL ou CDRs dos mesmos) são derivados de camelídeos e as regiões constantes do anticorpo são derivadas de um anticorpo humano. Em particular, a invenção provê um anticorpo de lhama-humano quimérico que liga CD70 humano.

Em outro aspecto da invenção, provê-se uma variante humanizada de um anticorpo camelideo-humano quimérico que liga CD70 humano, em que as porções de antígeno-ligação do anticorpo (por exemplo, domínios VH e/ou VL ou CDRs dos mesmos) são variantes humanizadas de sequências derivadas de camelídeo e as regiões constantes do anticorpo são derivadas de um anticorpo humano. Em particular, a invenção provê uma variante humanizada de um anticorpo de lhama-humano quimérico que liga CD70 humano. Formas de realização preferidas (mas não limitantes) dos anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, são definidas abaixo por referência a características estruturais específicas, isto é, sequências de aminoácidos especificadas de quer CDRs (uma ou mais de SEQ ID Nos: 49-59, 262 ou 263 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37, 249, 258 ou 259 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20, 248, 256 ou 257 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID NOs: 148-168, 271 ou 273 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 ou 270 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos:77- 95, ou 250-253, 267 ou 268 (CDR1 de cadeia leve), ou domínios variáveis inteiros (uma ou mais de SEQ ID NOs: 177- 188, 212-223, 274 ou 275 (VH) OU SEQ ID NOS:189-211, 230- 245, 276 ou 277 (VL) ) . Todos desses anticorpos se ligam a CD70 humano com elevada afinidade, exibindo uma taxa de dissociação (off-rate) para CD70 humano de 5 x 10'4 s'1 ou menos, e tipicamente na faixa a partir de 0,4 x 10'4 s-1 a 4,8 x 10’4 S’1, quando testados como um fragmento Fab.

A invenção também provê variantes humanizadas/ germinalizadas desses anticorpos, mais variantes de afinidade e variantes contendo substituições conservatives de aminoácido, como definido aqui. Especificamente são providos anticorpos quiméricos contendo domínios de VH e VL que são derivados de camelídeo, ou variantes humanas germinalizadas dos mesmos, fusionadas a domínios constantes de anticorpo humanos, em particular IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. O domínio variável de cadeias pesadas definidas acima pode ser utilizado como anticorpos de domínio simples, ou pode ser incluído dentro de um anticorpo convencional de quatro cadeias ou outras proteínas de ligação de antígeno, tal como, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fab's bi- específicos, e fragmentos de Fv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia simples, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) e anticorpos multiespecíficos. Formas de realização preferidas dos anticorpos para CD70 são anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada variável, uma CDR2 de cadeia pesada variável e uma CDR1 de cadeia pesada variável, em que referida CDR3 de cadeia pesada variável compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:262 e SEQ ID NO:263, e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência 13 compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada; referida CDR2 de cadeia pesada variável opcionalmente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 306 [X1X2X3X4X5X6X7X8X9YYADSVKX10] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente D, T, S ou E, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente I, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente N, S, T ou Y, X4 é qualquer aminoácido, preferivelmente N, M, S ou T, X5 é qualquer aminoácido, preferivelmente E, D, Y ou H, Xe é qualquer aminoácido, preferivelmente G, D, S ou N, X7 é qualquer aminoácido, preferivelmente G, Y, S, D ou M, Xe é qualquer aminoácido, preferivelmente T, E, S, N, Y ou R, X9 é qualquer aminoácido, preferivelmente T, A ou R, e X10 é qualquer aminoácido, preferivelmente G ou S, e as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO:258 e SEQ ID NO:259 e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada; e compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 307 [XiYYMN], em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente V, G ou A, sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 08 [X1X2AMS] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente D, T, S, N ou G e X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente Y, S ou P, e as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 256 e SEQ ID NO:257 e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada. O domínio variável de cadeia pesada pode compreender qualquer um das listadas sequências de CDR3 de cadeia pesada variável (HCDR3) em combinação com qualquer uma das sequências de CDR2 de cadeia pesada variável (HCDR2) e qualquer uma das sequências de CDR1 de cadeia pesada variável (HCDR1). Entretanto, algumas combinações de HCDR3 e HCDR2 e HCDR1 são particularmente preferidas, essas sendo as combinações "nativas" que derivam de um domínio VH comum simples. Essas combinações preferidas são listadas em Tabela 6 e Tabela 14A. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode adicionalmente compreender um domínio variável de cadeia leve (VL), que é pareado com o domínio VH para formar um domínio de ligação ao antígeno. Preferidos domínios variáveis de cadeia leve são aqueles compreendendo uma CDR3 de cadeia leve variável, uma CDR2 de cadeia leve variável e uma CDR1 de cadeia leve variável, em que referida CDR3 de cadeia leve variável compreende uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de: SEQ ID NO:148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:271 e SEQ ID NO:273 e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada; referida CDR2 de cadeia leve variável opcionalmente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 310 [X1TX2X3RHS] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou S, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente N, S ou A, e X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente S, N ou T, (b) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 311 [YYSDSX1X2X3QX4S] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente Y, V ou L, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente K ou S, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente H ou N, e X4 é qualquer aminoácido, preferivelmente G ou S, (c) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 312 [X1NX2NRPS] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente V, I ou Y, e X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou T, (d) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 313 [GDNX1X2PL] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente Y, e X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente R ou M, (e) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:314 [X1DDX2RPS] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente D ou G, e X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente S ou I, e as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:113, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO:270, e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada; e referida CDR1 de cadeia leve variável opcionalmente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (f) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:315 [GLX1SGSX2TX3X4X5YPX6] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente S ou T, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente V ou A, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente S ou T, X4 é qualquer aminoácido, preferivelmente S, T ou G, X5 é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou H, Xs é qualquer aminoácido, preferivelmente G, D ou E, (g) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:316 [TLX1SX2X3X4X5GX6YDIS] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente S, N ou I, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente G ou A, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou D, X4 é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou S, X5 é qualquer aminoácido, preferivelmente V ou I, X6 é qualquer aminoácido, preferivelmente N ou S, (h) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:317 [QGGNLXiLYGAN] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente G ou W, (i) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:318 [RGDX1LX2X3YX4X5N] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente S ou T, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente E ou R, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente R ou N, X4 é qualquer aminoácido, preferivelmente G ou H, X5 é qualquer aminoácido, preferivelmente T ou A, (j) sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:319 [GX1X2SGSVTSX3NFPT] , em que Xi é qualquer aminoácido, preferivelmente V ou L, X2 é qualquer aminoácido, preferivelmente K ou T, X3 é qualquer aminoácido, preferivelmente T ou D, e as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:267 e SEQ ID NO:268 e variantes de sequência de qualquer uma das sequências relatadas, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada.

O domínio variável de cadeia leve pode compreender qualquer uma das listadas sequências de CDR3 de cadeia leve variável (LCDR3) em combinação com qualquer uma das sequências de CDR2 de cadeia leve variável (LCDR2) e qualquer uma das sequências de CDR1 de cadeia leve variável (LCDR1). Entretanto, certas combinações de LCDR3 e LCDR2 e LCDR1 são particularmente preferidas, essas sendo as combinações "nativas" que derivam de um domínio comum simples VL. Essas combinações preferidas são listadas em Tabela 7 e Tabela 15A.

Qualquer dado anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo um domínio VH pareado com um domínio VL para formar um sítio de ligação para antígeno de CD70 compreenderão uma combinação de 6 CDRs: CDR3 de cadeia pesada variável (HCDR3), CDR2 de cadeia pesada variável (HCDR2), CDR1 de cadeia pesada variável (HCDR1) , CDR3 de cadeia leve variável (LCDR3) , CDR2 de cadeia leve variável(LCDR2) e CDR1 de cadeia leve variável (LCDR1). Embora todas as combinações de 6 CDRs selecionadas dos grupos de sequência de CDR listados acima sejam permissíveis, e dentro do escopo da invenção, certas combinações de 6 CDRs são particularmente preferidas; essas sendo as combinações "nativas" dentro de um Fab simples exibindo elevada afinidade de ligação a CD70 humano.

Combinações preferidas de 6 CDRs incluem, mas não são limitadas a, as combinações de CDR3 de cadeia pesada variável (HCDR3), CDR2 de cadeia pesada variável (HCDR2), CDR1 de cadeia pesada variável (HCDR1), CDR3 de cadeia leve variável (LCDR3), CDR2 de cadeia leve variável(LCDR2) e CDR1 de cadeia leve variável (LCDR1) selecionada do grupo consistindo de: (i) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:27, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:160, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:119, e LCDR1 compreendendo SEQ ID (ií) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:49, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:26, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:10, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:148, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:109, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:77; (iii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:27, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:149, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:110, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:78; (ív) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:28, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:150, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:111, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:79; (v) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:28, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:151, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:110, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:80; (vi) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:51, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:29, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 152, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:110, e LCDR1 compreendendo SEQ ID (vii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:52, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:30, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:13, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:153, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 112, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:81; (viii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:53, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:31, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:14, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:154, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:113, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:82; (ix) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:54, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:32, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:15, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:155, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:114, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:83; (x) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:55, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:33, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:16, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:156, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:115, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:84; (xi) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:56, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:34, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:17, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:157, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:116, e LCDR1 compreendendo SEQ ID (xíi) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:57, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:35, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 18, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:158, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 117, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 84; (xiii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 58, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 36, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 19, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 159, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 118, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 86; (xiv) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 27, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 161, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:120, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:88; (xv) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 27, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 162, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 121, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 89; (xvi) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 50, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 27, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 11, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 163, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 122, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 90; (xvii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 51, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 29, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 164, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 123, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO:91; (xviií) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 51, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 29, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 164, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 124, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 91; (xix) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 59, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 165, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 125, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 92; (xx) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 59, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 20, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 165, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 126, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 93; (xxi) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 59, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 20, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 166, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 127, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 92; (xxii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO-.59, HCDR2 ' compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 20, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 167, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 128, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 94; (xxiii) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 59, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 20, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 168, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110, e LCDRl compreendendo SEQ ID NO: 95; compreendendo SEQ ID NO: 258, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 256, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 271, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 110, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 267; (xxv) HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 263, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 259, HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 257, LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 273, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 270, e LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 268.

Outros preferidos anticorpos para CD70, exibindo elevada afinidade de ligação a CD70 humano, incluem anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:274 e SEQ ID NO:275 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência a uma das sequências relatadas, e opcionalmente compreendendo um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência a uma das sequências relatadas.

Embora todos os pareamentos possíveis de domínios VH e domínios VL selecionados dos grupos de sequência de domínio de VH e VL listados acima sejam permissíveis, e dentro do escopo da invenção, certas combinações VH e VL são particularmente preferidas; essas sendo as combinações "nativas" dentro de um Fab simples exibindo elevada afinidade de ligação a CD70 humano. Consequentemente, anticorpos preferidos de CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, exibindo ligação de CD70 de afinidade elevada são aqueles compreendendo uma combinação de um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) , em que a combinação é selecionada do grupo consistindo de: (i) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:241; (ii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:177 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:189; (iii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190; (iv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:179 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:191; (v) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:179 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192; (vi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193; (vii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:181 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:194; (viii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:182 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:195; (ix) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:183 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:196; (x) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:184 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197; (xi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:185 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:198; (xii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:186 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:199; (xiii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:187 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:200; (xiv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:201; (xv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:202; (xvi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:203; (xvii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:204; (xviii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:205; (xix) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:180 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:206; (xx) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:207; (xxi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:208; (xxii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:209; (xxiii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:210; (xxiv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:211; (xxv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:274 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:276; (xxvi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:275 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:277.

Para cada uma das combinações de VH/VL específicas listadas acima, é também permissível, e dentro do escopo da invenção, combinar um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou 99% idêntica à sequência de domínio VH relatada com um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou 99% idêntica à sequência de domínio VL relatada. No parágrafo anterior, e em outras partes deste documento, a estrutura dos anticorpos/fragmentos de ligação ao antígeno é definida na base de % identidade de sequência com uma sequência de referência relatada (com uma dada SEQ ID NO). Nesse contexto, % identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada comparando essas duas sequências alinhadas em uma maneira ótima e em que uma sequência de aminoácidos a ser comparada pode compreender adições ou deleções com respeito à sequência de referência para um alinhamento ótimo entre essas duas sequências. A porcentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas para qual o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, dividindo esse número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado obtido por 100 a fim de obter a porcentagem de identidade entre essas duas sequências. Tipicamente, a janela de comparação com corresponde ao comprimento completo da sequência sendo comparada. Por exemplo, é possível usar o programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponível no sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, os parâmetros usados sendo aqueles dados por padrão (em particular para os parâmetros "penalidade de intervalo aberto": 5, e "penalidade de intervalo de extensão": 2; a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa), a porcentagem de identidade entre as duas sequências a ser comparadas sendo calculada diretamente pelo programa.

Os anticorpos para CD70 mais preferidos fornecidos aqui, que exibem uma combinação de propriedades particularmente vantajosa, incluindo ligação de afinidade extremamente elevada para CD70 humano, são aqueles baseados na porção de ligação ao antígeno do Fab derivado de lhama denotado 27B3 nos exemplos aqui apresentados, mais variantes germinalízadas humanas de 27B3, incluindo as variantes germinalizadas identificadas nos exemplos acompanhantes. 27B3 e suas variantes germinalizadas, particularmente variantes baseadas nas CDRs ou domínios variáveis completos de variante 41D12, exibem uma combinação de propriedades extremamente vantajosa, resumida como a seguir: elevada afinidade de ligação a CD70 humano recombinante, forte ligação a CD70 de superfície celular, especificamente ligação a CD70 expressado em linhagens de células de câncer, particularmente linhagens de células que expressam CD70 em "baixo número de cópias" e forte ligação a células de câncer isoladas de amostras de pacientes (CLL) , bloqueio potente da interação de CD70/CD27, função efetora potente particularmente quando expressada como uma quimera com regiões constantes de IgGl humana, e especialmente quando expressada como uma IgGl não fucosilada, reatividade cruzada com homólogos de CD70 de macaco reso e macaco cinomólgo possibilitando estudos de toxicológia em espécies de primata, ligação a ambos, CD70 nativo (isto é, superfície de célula) e desnaturada por calor, níveis parciais ou baixos de internalização em certas linhagens de células de câncer. Todas dessas características em combinação tornam 41D12 e, de fato, outras variantes de 27B3 e os outros anticorpos para CD70 descritos aqui que exibem propriedades similares, um excelente candidato para uso terapêutico no tratamento de doenças associadas a CD70, especificamente cânceres expressando CD70 e distúrbios imunológicos. 27B3, e suas variantes, são caracterizados pela presença da sequência de CDR3 variável de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS).

Consequentemente, formas de realização preferidas do anticorpo para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, são as compreendendo um domínio variável de cadeia pesada em que uma CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante de sequência da mesma, em que a variante de sequência compreende uma, duas ou três substituições de aminoácido na sequência relatada.

As formas de realização mais preferidas são anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que incluem a mesma combinação de CDRs de cadeia pesada como 27B3, ou variantes humanas germinalizadas de 27B3. Consequentemente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender um domínio variável de cadeia pesada em que a CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:50 ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 249 e variantes de a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 24 8 e variantes de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada.

Qualquer combinação de HCDR3, HCDR2 e HCDR1 de dentro dos grupos relatados de sequências de CDR é permissível, e dentro do escopo da invenção, entretanto certas combinações são particularmente preferidas. Consequentemente, em formas de realização preferidas o antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender um domínio variável de cadeia pesada em que a combinação de HCDR3, HCDR2 e HCDR1 é selecionada do seguinte: (a) a CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS) ou um variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 11 (VYYMN) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido(por exemplo, substituições conservatives, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada; (b) a CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:50 (RDAGYSNHVPIFDS) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 249 (DINNEGGATYYADSVKG) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 11 (VYYMN) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido(por exemplo, substituições conservatives, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada. (c) a CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 248 (GYYMN) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada. Em formas de realização preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo também inclui um domínio variável de cadeia leve (VL), pareado com o domínio variável de cadeia pesada. Nos domínios variáveis de cadeia leve preferidos, a CDR3 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:160 ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia leve variável compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:110 e variantes de sequência das sequências relatadas; e a CDR1 de cadeia leve variável compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 e variantes de sequência das sequências relatadas, e em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) nas sequências relatadas.

Qualquer combinação de LCDR3, LCDR2 e LCDR1 de dentro dos grupos relatados de sequências de CDR de cadeia leve é permissível, e dentro do escopo da invenção, entretanto certas combinações são particulamente preferidas. Consequentemente, em formas de realização preferidas o antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem compreender um domínio variável de cadeia leve em que a combinação de LCDR3, LCDR2 e LCDR1 é selecionada a partir do seguinte: (d) a CDR3 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservatives, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada; (e) a CDR3 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE) ou uma variante de a CDR2 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 87 (GLKSGSVTSTNFPT) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada.

Outras combinações de CDR de cadeia leve preferidas para variantes "germinalizadas" de humano de 27B3 são dadas em Tabela 15A. A forma de realização mais preferida do anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) em que a combinação de 6 CDRs que forma o sítio de ligação para CD70 humano é como a seguir: a CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG) ou uma variante de a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 11 (VYYMN) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR3 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE) ou uma variante de sequência da mesma; a CDR2 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS) ou uma variante de sequência da mesma; e a CDR1 de cadeia leve variável compreende ou consiste de SEQ ID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT) ou uma variante de sequência da mesma, em que as variantes de sequência compreendem uma, duas ou três substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas, substituições humanizantes ou variantes de afinidade) na sequência relatada.

Outras combinações preferidas de 6 CDRs são aquelas combinações "nativas" que ocorrem nas variantes humanas germinalizadas de 27B3 listadas em Tabelas 14A (cadeias pesadas) e 15A (cadeias leves). Nas formas de realização preferidas precedentes baseadas em 27B3 e suas variantes germinalizadas, o anticorpo preferivelmente inclui o domínio CHI, região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3 de um anticorpo humano, em particular IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. A forma de realização mais preferida é a IgGl humana. É ainda preferido para o IgGl humana ser engenheirado para maximizar a função efetora em uma ou mais de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Particularmente preferido é uma IgGl não fucosilado humano, por exemplo, uma IgGl não fucosilado produzido usando a tecnologia Potelligent™ de BioWa Inc.

Outros anticorpos preferidos de CD70, exibindo elevada afinidade de ligação a CD70 humano, baseado no Fab denotado 27B3 e variantes humanas germinalizadas de 27B3, incluem anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:274 e SEQ ID NO:275 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência a uma das sequências relatadas, e opcionalmente compreendendo um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:276 e SEQ ID NO:277 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência a uma das sequências relatadas.

Embora todos os pareamentos possíveis de domínios VH e domínios VL selecionados dos grupos de sequência de domínio de VH e VL listados acima sejam permissíveis, e dentro do escopo da invenção, certas combinações VH e VL são particularmente preferidas; essas sendo as combinações "nativas" dentro de um Fab simples exibindo elevada afinidade de ligação a CD70 humano. No caso das variantes germinalizadas de 27B3 relatadas em Tabelas 14B e 15B, pode ser preferido reter o pareamento de VH/VL original. Consequentemente, anticorpos preferidos de CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, exibindo ligação de CD70 de afinidade elevada são aqueles compreendendo uma combinação de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que a combinação é selecionada do grupo consistindo de: (í) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:241; (ii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:178 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190; (iii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo um sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:212 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 230 (iv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:213 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:231; (v) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:214 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:232; (vi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:215 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:235; (vii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:216 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:234; (viii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:217 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:235; (ix) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:218 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:236; (x) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:219 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:237; (xi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:220 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:238; (xii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:221 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:239; (xiii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:222 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:240; (xiv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:224 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:242; (xv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:225 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:243; (xvi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:226 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:244; (xvii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:227 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:245; (xviii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID,NO:228 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:246; (xix) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:229 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:247; (xx) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:244; (xxi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:245. Para cada das combinações de VH/VL específicas listadas acima, é também permissível, e dentro do escopo da invenção, combinar um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou 99% idêntico à sequência de domínio VH relatado com um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou 99% idêntico à sequência de domínio VL relatado. A forma de realização mais preferida é um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo baseado na combinação de ' VH/VL nativa da variante germinalizada humana denotada 41D12. Consequentemente, provê-se também aqui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:223, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:241, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas. Formas de realização em que uma sequência de aminoácidos do domínio VH exibe menos que 100% identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 223 podem, todavia, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 223 (SEQ ID NOs:ll, 27 e 50, respectivamente) enquanto exibindo variação de sequências de aminoácidos dentro das regiões de arcabouço. Da mesma forma, formas de realização em que uma sequência de aminoácidos do domínio VL exibe menos que 100% identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 241 podem, todavia, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO:241 (SEQ ID NOs:250, 116 e 160, respectivamente) enquanto exibindo variação de sequências de aminoácidos dentro das regiões de arcabouço. Nas formas de realização anteriores preferidas baseadas nos domínios de VH e VL de 41D12, ou variantes dos mesmos, o anticorpo preferivelmente inclui o domínio CHI, região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3 de um anticorpo humano, em particular IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. A forma de realização mais preferida é uma IgGl humana. É ainda preferido para IgGl humana ser engenheirada para maximizar função efetora em uma ou mais de ADCC, CDC ou ADCP. Particularmente preferida é uma IgGl humana desfucosilada, preferivelmente preparada usando o sistema de expressão Potelligent™.

Outra forma de realização vantajosa é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:225, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas, e um domínio variável de cadeia leve (VL) , compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:243, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas; ou

Outra forma de realização vantajosa é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:226, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:244, variantes germinalizadas e variantes de afinidade das mesmas e sequências de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas às mesmas.

Aspectos/propriedades de anticorpos para CD70

Nos aspectos e formas de realização acima mencionados, os anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem cada exibir uma ou mais, ou qualquer combinação, das seguintes propriedades ou aspectos:

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a CD70 humano com elevada afinidade, exibindo uma taxa de dissociação para CD7 0 humano de 7 x IO-4 s'1 ou menos, preferivelmente 5 x 10'4 s'1 ou menos, e tipicamente na faixa a partir de 0,4 x 10’4 s’1 a 4,8 x IO’4 s-1, quando testado como um fragmento Fab.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a CD70 humano com elevada afinidade e inibir a interação entre CD70 e CD27. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a CD70 humano, mas não inibem a interação entre CD70 e CD27.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar com elevada afinidade a CD70 humano na superfície de célula expressando CD70.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a CD70 humano na superfície de célula expressando CD70 e ser lentamente ou apenas parcialmente internalizado. Um aspecto chave da invenção é a observação que os anticorpos para CD70 são, de fato, muito pobremente internalizados em um grande número de linhagens celulares expressando CD70, incluindo muitas linhagens de células expressando CD70 de câncer. Essa observação está em contraste direto para relatos prévios publicados que os anticorpos para CD70 são rapidamente internalizados seguindo ligação a linhagens de células de carcinoma de célula renal (ver Adam et al., British Journal of Cancer (2006) 95: 298-306; e WO 2007/038637) e tem implicações diretas para uso terapêutico dos anticorpos. A observação que os anticorpos para CD70 são muito pobremente internalizados após a ligação às células de câncer fortemente suporta a conclusão que as estratégias terapêuticas para tratamento de muitos cânceres de expressão de CD70, e de fato doenças imunológicas associadas a CD70, devem ser baseadas em afinidade de ligação extremamente elevada a CD70, acoplada com função efetora de anticorpo, em particular qualquer uma ou mais de ADCC, CDC ou ADCP, e não no uso de imunoconjugados em que os anticorpo para CD70 são ligados a um agente terapêutico, por exemplo, uma porção de fármaco citotóxico ou citoestático.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar dentro da sequência de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342) em CD70 humano;

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode exibir reatividade cruzada com CD70 de origem símia, especificamente os homólogos de CD70 de macaco reso (Macaca mulatta) e macaco cinomolgo (Macaca cynomolgus).

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a ambos CD70 humano, nativo (por exemplo, CD70 expressado na superfície de uma célula, tal como uma linhagem celular ou uma célula de expressão de CD70 isolado de um paciente humano) e a CD70 humano recombinante desnaturado por calor.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode prover rendimentos de produção muito elevados (>4g/L) em sistemas de expressão de anticorpo recombinante, tal como, por exemplo, a linhagem celular de CHK1SV (proprietário a BioWa/Lonza), como comparado a uma média histórica de l-2g/L para produto de anticorpos terapêuticos, resultando em uma redução substancial em custos de produção.

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser altamente estável sob condições de armazenamento a 37°C de e em ciclos de congelamento-descongelamento, que é também um fator principal de redução de custo.

O anticorpo pode exibir uma ou mais funções efetoras selecionadas de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e fagocitose mediada por célula dependente de proteína de anticorpo (ADCP) contra células expressando CD70 humano na superfície celular.

O anticorpo pode exibir ADCC contra célula expressando CD70, por exemplo, células de câncer ou outras células malignas, ou células imunes.

O anticorpo pode exibir função de ADCC melhorada em comparação a um anticorpo de referência que é um equivalente anticorpo compreendendo um domínio Fc humano nativo. Em uma forma de realização não limitante, a função de ADCC pode ser pelo menos 10x acentuada em comparação ao anticorpo de referência compreendendo um domínio Fc humano nativo. Nesse contexto, "equivalente" pode ser para significar que o anticorpo com função de ADCC melhorada exibe especificidade de ligação ao antígeno substancialmente idêntica e/ou compartilha idêntica sequência de aminoácidos com o anticorpo de referência, exceto para quaisquer modificações feitas (relativas a Fc humano nativo) para os propósitos de aumentar ADCC .

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode inibir crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor in vivo, na ausência de conjugação a um agente citotóxico ou citoestático. Em uma forma de realização não limitante, a inibição de função de crescimento de tumor pode ser pelo menos 10 vezes aumentadas em comparação ao anticorpo de referência SGN70 .

O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode induzir apoptose de célula expressando CD70.

O anticorpo pode conter a região de dobradiça, domínio CH2 e domínio CH3 de uma IgG humano, mais preferivelmente IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.

O anticorpo pode incluir modificações na região de Fc, tais como modificações que aumentam função efetora de anticorpo como explicado em outra parte neste documento. Em particular, o anticorpo pode ser uma IgG não fucosilado.

Em outros aspectos, a invenção também provê moléculas de polinucleotídeo que codificam os anticorpos para CD70 listados acima e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, em adição a vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos, células hospedeiras contendo os vetores e métodos de expressão/produção recombinante dos anticorpos para CD70.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos para CD70 descritos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

Ainda outro aspecto da invenção diz respeito a métodos de tratamento médico usando os anticorpos para CD70 listados acima, particularmente no tratamento de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será ainda entendida com referência aos seguintes exemplos experimentais e as Figuras acompanhantes em que: Figura 1: Mostra a resposta imune testada em ELISA em CD70 recombinante para lhamas imunizados com células 786-0 (topo) e com células Raji (fundo). Figura 2: ilustra inibição de ligação de CD27 a CD70 por Fabs de CD70 derivados de lhama e Fabs de CD70 de referência, medido por ELISA. Figura 3: é uma representação gráfica do sinal para Fab derivado de lhamas testado em um ELISA de ligação (preto) ou em um ELISA de inibição (branco). Figura 4: ilustra inibição de ligação de CD27 a CD70 humano (A&B) ou CD7 0 de reso (C) por mAbs para CD7 0 lhama- humano quimérico e mAbs para CD70 de referência medidos por ELISA. Figura 5: mostra ligação de mAbs para CD70 lhama-humano quimérico a células 786-0 (A) ou células MHH-PREB-1 (B) como demonstrado por análise de FACS. Figura 6: mostra inibição por mAbs de lhama-humano quimérico específicos para CD70 em um teste de potência de co-cultura baseado em célula Raji. Figura 7: mostra os resultados de teste de ADCC de liberação de Cr51 padrão em células 786-0. Figura 8: mostra os resultados de teste CDC em células U266 na presença de soro humano a 9%. Figura 9: demonstra a eficácia de mAbs para CD70 lhama- humano quimérico em um teste de ADCP em células 786-0 Figura 10: ilustra a internalização de anticorpo, avaliada como MFI OUT para diferentes mAbs para CD70 lhama- humano quimérico como uma função de tempo em células 786-0 em dois experimentos independentes. Figura 11: demonstra sobrevivência de camundongos em um modelo de xenoenxerto de Raji após tratamento com mAb para CD70 lhama-humano quimérico 41D12, controle de isotipo e controlado de morte Fc. Figura 12: descreve alinhamentos das sequências de aminoácidos VH e VL de clone 27B3 com as sequências de aminoácidos de segmentos de linhagem germinal humana VH3-38 e VL8-61, respectivamente. Figura 13: mostra análise de filtração de gel de amostras de variantes de mAb germinalizadas 27B3 tomadas após 5 semanas de incubação a 37 °C. Figura 14: mostra a potência em ligação de CD70, como medida usando Biacore, de amostras de mAbs para CD70 germinalizados tomadas em vários pontos de tempo após incubação a várias temperaturas. Figura 15: mostra a afinidade de ligação de mAbs para CD70 para linhagens de células expressando CD70 de câncer. Figura 16: mostra a afinidade de mAbs para CD70 para células de paciente de CLL expressando CD70. Figura 17: mostra lise de células SU-DHL ligadas por mAbs CD70. Figura 18: mostra inibição de ligação de CD27 a CD70 por mAbs CD70, medido por ELISA. Figura 19: mostra um alinhamento de sequências de CD70 de diferentes espécies. Figura 20: mostra a afinidade de ligação de mAbs para CD70 para células U266 humanas, células LCL8864 de macaco reso e células de HSC-F de macaco cinomolgo. Figura 21: mostra inibição de ligação de CD27 a CD70 de humano, macaco reso e macaco cinomolgo por mAbs para CD70 como determinado por ELISA. Figura 22: mostra ligação de mAbs para CD70 a CD70 recombinante desnaturado, avaliada por ELISA. Figura 23: mostra sequências quiméricas de CD70 usadas para mapeamento de epítopo. Figura 24: ilustra internalização de anticorpo para mAbs para CD70 como uma função de tempo em células 786-0.

Definições

"Anticorpo" ou "Imunoglobulina"-- Como usado aqui, o termo "imunoglobulina" inclui um polipeptídeo tendo uma combinação de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves seja possuindo ou não qualquer imunorreatividade específica relevante. "Anticorpos" refere-se a tais conjuntos que tem uma atividade imunorreativa específica significante conhecida para um antígeno de interesse (por. exemplo, CD70 humano) . O termo "anticorpos para CD70" é usado aqui para fazer referência a anticorpos que exibem especificidade imunológica para proteína de CD70 humana. Como explicado em algum ponto aqui, "especificidade" para CD70 humano não exclui reação cruzada com os homólogos de espécies de CD70. Anticorpos e imunoglobulinas compreendem cadeias leves e pesadas, com ou sem uma ligação covalente intercadeia entre as mesmas. As estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente bem entendidas.

O termo genérico "imunoglobulina" compreende cinco classes distintas de anticorpo que podem ser distintas bioquimicamente. Todas as cinco classes de anticorpos estão dentro do escopo da presente invenção, a seguinte discussão será geralmente dirigida para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com relação a IgG, imunoglobulinas compreendem duas cadeias leves idênticas de polipeptídeos de peso molecular aproximadamente 23.000 Daltons, e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53.000-70.000. As quatro cadeias são unidas por ligações dissulfeto em uma configuração "Y" em que as cadeias leves envolvem as cadeias pesadas partindo da boca do "Y" e continuando através da região variável.

As cadeias leves de um anticorpo são classificadas como ou kappa ou lambda (□, □). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve kappa ou lambda. Geralmente, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas uma na outra, e as porções de 'cauda' das duas cadeias pesadas são ligadas a cada outra por ligações covalentes de dissulfeto ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas ou pelos hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente engenheiradas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm a partir de um N-término nas extremidades de garfo da configuração Y para o C-término no fundo de cada cadeia. Os versados na arte irão notar que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (□, □, □, □, □) com algumas subclasses entre as mesmas (por exemplo, Ü1 - ÜÜ4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, igAl, etc. são bem caracterizados e são conhecidos como conferindo especialização funcional. As versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos são discerníveis para o versado na técnica em vista da presente descrição e, assim, estão dentro do escopo da presente invenção.

Como indicado acima, a região variável de um anticorpo permite ao anticorpo seletivamente reconhecer e especificamente ligar epítopos em antígenos. Isto é, o domínio VL e domínio VH de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tri-dimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação ao antígeno presente no final de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido pelas três e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) em cada uma das cadeias VH e VL. "Proteína de CD70" ou "antígeno de CD70": Como usado aqui, os termos "proteína de CD70" ou "antígeno de CD70" ou "CD70" são usados de modo interpermutável e referem-se a um membro da família de ligando TNF que é um ligando para TNFRSF27/CD27. Os termos "Proteína de CD70 humano" ou "antígeno de CD70 humano" ou "CD70 humano" são usados de modo interpermutável para referir especificamente ao homólogo humano, incluindo a Proteína de CD70 humano nativo naturalmente expressada no corpo humano e/ou na superfície de linhagens de células humanas cultivadas, bem como formas recombinantes e fragmentos do mesmo. Exemplos específicos de CD70 humano incluem o polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos mostrada sob Sequência NCBI de referência No. de acesso NP_001243, ou o domínio extracelular do mesmo. "Sítio de ligação": Como usado aqui, o termo "sítio de ligação" compreende uma região do polipeptídeo que é responsável para seletivamente ligar um antígeno alvo de interesse (por exemplo, CD70 humano). Domínios de ligação ou regiões de ligação compreendem pelo menos um sítio de ligação. Os domínios de ligação de exemplo incluem um domínio variável de anticorpo. As moléculas de anticorpo da invenção podem compreender um sítio de ligação único ou sítios de ligação múltiplos (por exemplo, dois, três ou quatro). "Derivado de": Como usado aqui, o termo "derivado de" uma proteína designada (por exemplo, um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) refere-se à origem do polipeptídeo. Em uma forma de realização, a sequência de polipeptídeo ou aminoácido que é derivada de um polipeptídeo de partida particular é uma sequência CDR ou sequência relacionada com a mesma. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos que é derivada de um polipeptídeo de partida particular não é contígua. Por exemplo, em uma forma de realização, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs são derivadas de um anticorpo de partida. Em uma forma de realização, a sequência de polipeptídeo ou aminoácido que é derivada de um polipeptídeo de partida particular ou sequência de aminoácidos têm uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica à da sequência de partida, ou uma porção da mesma em que a porção consiste de pelo menos de pelo menos 3-5 aminoácidos, 5-10 aminoácidos, pelo menos 10-20 aminoácidos, pelo menos 20-30 aminoácidos, ou pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que é de outra forma identificável para um versado na arte como tendo a sua origem na sequência de partida. Em uma forma de realização, a uma ou mais sequências de CDR derivadas do anticorpo de partida são alteradas para produzir as sequências de CDR variantes, por exemplo, variantes de afinidade, em que as sequências de CDR variantes mantêm a atividade de ligação de CD70.

"Derivado de camelídeos": Em determinadas formas de realização preferidas, as moléculas de anticorpo para CD70 da invenção compreendem sequências de aminoácidos de arcabouço e/ou sequências de aminoácidos CDR derivadas de um anticorpo de camelídeo convencional criado por imunização ativa de um camelídeo com antígeno CD70. Contudo, anticorpos para CD70 compreendendo sequências de aminoácidos derivadas de camelídeos podem ser engenheirados para compreender sequências de arcabouço e/ou de região constante derivadas de uma sequência de aminoácidos humana (isto é, um anticorpo humano) ou de outras espécies de mamíferos não camelídeos. Por exemplo, uma região de arcabouço de primata humano ou não humano, porção de cadeia pesada, e/ou porção de dobradiça podem ser incluídas nos anticorpos para CD70 do indivíduo. Em uma forma de realização, um ou mais aminoácidos não camelídeos podem estar presentes na região de arcabouço de anticorpo para CD70 "derivado de camelídeos", por exemplo, uma sequência de aminoácidos de arcabouço de camelídeo pode compreender uma ou mais mutações de aminoácido em que o resíduo de aminoácido de primata humano ou não humano correspondente está presente. Além disso, domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou variantes humanizadas dos mesmos, podem ser ligados aos domínios constantes de anticorpos humanos para produzir uma molécula quimérica, como extensivamente descrita aqui em outra parte. "Substituição conservativa de aminoácido" - Uma "substituição conservativa de aminoácido" é uma em que o resíduo . aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na arte, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina pode ser substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em outra forma de realização, um cordão de aminoácidos pode ser substituído com um cordão estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição de membros da família de cadeia lateral. "Porção de cadeia pesada": Como usado aqui, o termo "porção de cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivadas dos domínios constantes de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio CHI, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, do meio e/ou inferior), um domínio CH2, domínio CH3, ou variante ou fragmento do mesmo. Em uma forma de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode compreender a porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, uma porção de dobradiça, domínio CH2, e domínio CH3) . Em outra forma de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode faltar pelo menos uma porção de domínio constante (por exemplo, todo ou parte do domínio CH2) . Em alguma forma de realização, pelo menos um, e preferencialmente todos, dentre os domínios constantes são derivados de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Por exemplo, em uma forma de realização preferida, a porção de cadeia pesada compreende um domínio de dobradiça completamente humano. Em outra forma preferida de realização, a porção de cadeia pesada compreendendo uma porção Fc completamente humana (por exemplo, sequências de domínio de dobradiça, CH2 e CH3 a partir de uma imunoglobulina humana).

Em algumas formas de realização, os domínios constantes constituintes da porção de cadeia pesada são de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, a porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgGl e a região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3 ou IgG4. Em outras formas de realização, os domínios constantes são domínios quiméricos compreendendo porções de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, a dobradiça pode compreender uma primeira porção de uma molécula de IgGl e uma segunda porção de uma molécula de IgG3 ou IgG4. Como especificado acima, será entendido por um versado na arte que os domínios constantes da porção de cadeia pesada podem ser modificados de modo que eles variam em sequência de aminoácidos a partir da molécula de imunoglobulina naturalmente ocorrendo (tipo selvagem). Isto é, os polipeptídeos da invenção descritos aqui podem compreender alterações ou modificações para um ou mais dos domínios constantes de cadeia pesada (CHI, dobradiça, CH2 ou CH3) e/ou para o domínio de região constante de cadeia leve (CL). As modificações de exemplo incluem adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios. "Quimérica": Uma proteína "quimérica" compreende uma primeira sequência de aminoácidos ligada a uma segunda sequência de aminoácidos com a qual ela não é naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas separadas que são unidas no polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão. Uma proteína quimérica pode ser criada, por exemplo, por síntese química, ou por criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeo são codificadas na relação desejada. Os exemplares anticorpos quiméricos CD70 incluem proteínas de fusão compreendendo domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou variantes humanizadas dos mesmos, fusionados nos domínios constantes de um anticorpo humano, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas. "Região variável" ou "domínio variável" Os termos "região variável" e "domínio variável" são usados aqui de modo interpermutável e são destinados a ter significado equivalente. O termo "variável" refere-se ao fato de que algumas porções dos domínios variáveis VH e VL diferem extensivamente em uma sequência dentre os anticorpos e são usados na ligação e na especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno alvo. Contudo, a variabilidade não é uniformemente distribuída em todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos chamados "alças hipervariáveis" em cada domínio VL e domínio VH que formam parte do sítio de ligação ao antígeno. A primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio de cadeia leve VLambda são referidas aqui como L1(À), L2(À) e L3(À) e podem ser definidas como compreendendo resíduos 24-33 (LI (À) , consistindo 9, 10 ou 11 resíduos de aminoácido), 49-53 (L2(À), consistindo 3 resíduos) e 90-96 (L3(À), consistindo 5 resíduos) no domínio VL (Morea et al. , Methods 20:267-279 (2000)). A primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio de cadeia leve VKappa são referidas aqui como L1(K), L2(K) e L3(K) e podem ser definidas como compreendendo resíduos 25-33 (LI(K), consistindo 6, 7, 8, 11, 12 ou 13 resíduos), 49-53 (L2(K), consistindo 3 resíduos) e 90-97 (L3(K), consistindo 6 resíduos) no domínio VL (Morea et al. , Methods 20:267-279 (2000)). A primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio VH são referidas aqui como Hl, H2 e H3 e podem ser definidas como compreendendo resíduos 25-33 (Hl, consistindo de 7, 8 ou 9 resíduos), 52-56 (H2, consistindo de 3 ou 4 resíduos) e 91-105 (H3, altamente variável em comprimento) no domínio VH (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Salvo de outra forma indicado, os termos Ll, L2 e L3 respectivamente referem-se à primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio VL, e englobam alças hipervariáveis obtidas de ambos os isotipos Vkappa e Vlambda. Os termos Hl, H2 e H3 respectivamente referem a uma primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio VH, e englobam alças hipervariáveis obtidas a partir de qualquer um dos isotipos de cadeia pesada conhecidos, incluindo y, ε, δ, α ou μ.

As alças hipervariáveis Ll, L2, L3, Hl, H2 e H3 podem cada compreender parte da "região de determinação da complementaridade" ou "CDR", como definido abaixo. Os termos "alça hipervariável" e "região de determinação da complementaridade" não são estritamente sinônimos, porque as alças hipervariáveis (HVs) são definidas com base na estrutura, enquanto as regiões de determinação da complementaridade (CDRs) são definidas com base na variabilidade de sequência (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) e os limites de HVs e CDRs podem ser diferentes em alguns domínios VH e VL.

As CDRs dos domínios VL e VH tipicamente podem ser definidas como compreendendo os seguintes aminoácidos: resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio de cadeia leve variável, e resíduos 31-35 ou 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) no domínio de cadeia pesada variável; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Assim, os HVs podem estar compreendidos dentro dos CDRs correspondentes e referências aqui a "alças hipervariáveis" de domínios VH e VL devem ser interpretadas como também englobando os CDRs correspondentes, e vice-versa, salvo de outra forma indicado.

As porções de domínios variáveis mais altamente conservadas são chamadas a região de arcabouço (FR), como definido abaixo. Os domínios variáveis de cadeias nativas pesadas e leves compreendem cada quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente), largamente adotando uma configuração de folha β-, conectada pelas três alças hipervariáveis. As alças hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelos FRs e, com as alças hipervariáveis a partir de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos. A análise estrutural de anticorpos revelou a relação entre a sequência e a forma do sítio de ligação formado pelas regiões de determinação da complementaridade (Chothia et al. , J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontane et al., J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). Apesar de sua elevada variabilidade de sequência, cinco das seis alças adotam apenas um pequeno repertório de conformações de cadeia principal, chamadas "estruturas canônicas". Estas conformações são primeiramente determinadas pelo comprimento das alças e em segundo lugar pela presença de resíduos chave em certas posições nas alças e nas regiões de arcabouço que determinam a conformação através de sua compactação, ligação de hidrogênio ou a capacidade de assumir conformações de cadeia principal incomuns. "CDR" Como usado aqui, o termo "CDR" ou "região de determinação da complementaridade" significa os sítios de combinação de antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de polipeptídeos tanto de cadeia pesada como de cadeia leve. Estas regiões particulares foram descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) e Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) onde as definições incluem a sobreposição 5 ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. Os resíduos de aminoácido que englobam os CDRs como definidos para cada uma das referências acima citadas são especificados para comparação. Preferencialmente, o termo "CDR" é uma CDR como definida por Kabat com base em 10 comparações de sequência. Tabela 1: Definições CDR

Numeração de resíduo segue a nomenclatura de Kabat et al., supra 2 Numeraçao de resíduo segue a nomenclatura de Chothia 15 et al., supra 3Numeração de resíduo segue a nomenclatura de MacCallum et al., supra "Região de arcabouço": O termo "região de arcabouço" ou "região FR" como usado aqui, inclui os resíduos de aminoácido que são parte da região variável, mas não são parte das CDRs (por exemplo, usando a definição de Kabat de CDRs) . Assim, a região variável de arcabouço está entre cerca de 100-120 aminoácidos em comprimento, mas inclui somente os aminoácidos fora das CDRs. Para o exemplo específico da região variável de cadeia pesada e para as CDRs como definidas por Kabat et al., região de arcabouço 1 corresponde ao domínio da região variável englobando aminoácidos 1-30; região de arcabouço 2 corresponde ao domínio da região variável englobando aminoácidos 36-49; região de arcabouço 3 corresponde ao domínio da região variável englobando aminoácidos 66-94, e região de arcabouço 4 corresponde ao domínio da região variável dos aminoácidos 103 até o final da região variável. As regiões de arcabouço para a cadeia leve são similarmente separadas por cada uma das CDRs de região variável de cadeia leve. Similarmente, usando a definição de CDRs por Chothia et al. ou McCallum et al. os limites da região de arcabouço são separados pelos respectivos términos de CDR, como descritos acima. Na forma preferida de realização, as CDRs são como definidas por Kabat.

Em anticorpos de ocorrência natural, as seis CDRs presentes em cada anticorpo monomérico são sequências de aminoácidos curtas, não contíguas, que são especificamente posicionadas para formar o sítio de ligação ao antígeno à medida que o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. 0 restante dos domínios variáveis pesados e leves mostra uma variabilidade inter- molecular em sequência de aminoácidos e são chamadas as regiões de arcabouço. As regiões de arcabouço amplamente adotam uma conformação de folha β e as CDRs formam laços que conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha β. Assim, estas regiões de arcabouço atuam para formar um andaime que fornece posicionamento para as seis CDRs em orientação corrente por interações inter-cadeias, não covalentes. O sítio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo sobre o antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao epítopo de antígeno imunorreativo. A posição das CDRs pode ser prontamente identificada por um versado na arte. "Região de dobradiça": Como usado aqui, o termo "região de dobradiça" inclui a porção da molécula de cadeia pesada que une o domínio CHI ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, assim permitindo às duas regiões de ligação N- terminais ao antígeno se moverem independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, do meio e inferior (Roux et al. J. Imunol. 1998 161:4083). Os anticorpos para CD70 compreendendo uma região de dobradiça "completamente humana" podem conter uma das sequências de região de dobradiça mostradas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Sequências de dobradiça humanas

"Domínio CH2": Como usado aqui, o termo "domínio CH2" inclui a porção da molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas de numeração convencionais 10 (resíduos 244 a 360, sistema de numeração Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração EU, Kabat EA et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991). 0 domínio CH2 é único em que ele não é intimamente pareado com outro domínio. Ao contrário, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também é bem documentado que o domínio CH3 se estende a partir do domínio CH2 para o C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos. "Fragmento" O termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo compreendendo menos resíduos de aminoácido do que anticorpo intacto ou completo ou cadeia de anticorpo. O termo "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se ao fragmento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga ao antígeno ou compete com anticorpo intacto (isto é, com o anticorpo intacto a partir do qual foram derivados) para ligação ao antígeno (isto é, ligação específica a CD70 humano). Como usado aqui, o termo "fragmento" de uma molécula de anticorpo inclui fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, por exemplo, um domínio de anticorpo de cadeia leve variável (VL), um domínio de anticorpo de cadeia pesada variável (VH), um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento de anticorpo de domínio único (DAb). Fragmentos podem ser obtidos, por exemplo, via tratamento químico ou enzimático de um anticorpo intacto ou completo ou cadeia de anticorpo ou por meios recombinantes. "Valência": Como usado aqui, o termo "valência" refere- se ao número de sítios de ligação alvos potenciais em um polipeptídeo. Cada sítio de ligação alvo especificamente liga uma molécula alvo ou sítio específico em uma molécula alvo. Quando um polipeptídeo compreende mais do que um sítio de ligação alvo, cada sítio de ligação alvo pode especificamente ligar as mesmas ou diferentes moléculas (por exemplo, pode ligar a diferentes ligandos ou diferentes antígenos, ou diferentes epítopos sobre o mesmo antígeno). As moléculas de ligação em questão tem pelo menos um sítio de ligação específico para uma molécula CD70 humana. "Especificidade": 0 termo "especificidade" refere-se à capacidade para especificamente ligar (por exemplo, imunorreagir com) um dado alvo, por exemplo, CD70. Um polipeptídeo pode ser monoespecífico e conter um ou mais sítios de ligação que especificamente ligam a alvos ou um polipeptídeo pode ser multiespecífico e conter dois ou mais sítios de ligação que especificamente ligam o mesmo ou diferentes alvos. Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção é específico para mais do que um alvo. Por exemplo, em uma forma de realização, uma molécula de ligação multiespecíf ica da invenção liga a CD70 e uma segunda molécula é expressada em uma célula de tumor. Os anticorpos exemplares que compreendem sítios de ligação ao antígeno que se ligam a antígenos expressados em células de tumor são conhecidos na arte e um ou mais CDRs de tais anticorpos podem ser incluídos em um anticorpo da invenção. "Sintético": Como usado aqui, o termo "sintético" com relação a polipeptídeos inclui polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que não é de ocorrência natural. Por exemplo, polipeptídeos não naturalmente ocorrendo que são formas modificadas de polipeptídeos naturalmente ocorrendo (por exemplo, compreendendo uma mutação como uma adição, substituição ou deleção) ou que compreendem uma primeira sequência de aminoácidos (que pode ou não pode ser de ocorrência natural) que é ligada em uma sequência linear de aminoácidos para uma segunda sequência de aminoácidos (que pode ou não ser de ocorrência natural) à qual não é naturalmente ligado em natureza. "Engenheirado": Como usado aqui, o termo "engenheirado" inclui manipulação de moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeo por meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por copulação enzimática ou química de peptídeos ou alguma combinação destas técnicas). Preferencialmente, os anticorpos da invenção são engenheirados, incluindo, por exemplo, anticorpos humanizados e/ou quiméricos, e anticorpos que foram engenheirados para melhorar uma ou mais propriedades, tal como ligação ao antígeno, estabilidade/meia-vida ou função efetora. "Anticorpo modificado": Como usado aqui, o termo "anticorpo modificado" inclui formas sintéticas de anticorpos que são alteradas de modo que elas não estão naturalmente ocorrendo, por exemplo, anticorpos que compreendem pelo menos duas porções de cadeia pesada mas não duas cadeias pesadas completas (como, anticorpos deletados em domínios ou minibodies); formas multiespecíficas de anticorpos (por exemplo, biespecífico, triespecífico, etc.) alteradas para ligar a dois ou mais diferentes antígenos ou aos diferentes epítopos em um único antígeno); moléculas de cadeia pesada unidas a moléculas scFv e similares. As moléculas ScFv são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, em patente US 5.892.019. Além disso, o termo "anticorpo modificado" inclui formas multivalentes de anticorpos (por exemplo, anticorpos trivalentes, tetravalentes etc., que se ligam a três ou mais cópias do mesmo antígeno) . Em outra forma de realização, um anticorpo modificado da invenção é uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma porção de cadeia pesada faltando um domínio CH2 e compreendendo um domínio de ligação do polipeptídeo compreendendo a porção de ligação de um membro do par de ligando de receptor. O termo "anticorpo modificado" também pode ser usado aqui para fazer referência às variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo para CD70. Será entendido por um versado na arte que um anticorpo para CD70 pode ser modificado para produzir um anticorpo para CD70 variante que varia em sequência de aminoácidos em comparação com o anticorpo para CD7 0 a partir do qual ele foi derivado. Por exemplo, substituições de nucleotídeos ou aminoácidos levando a substituições conservatives ou mudanças em resíduos de aminoácidos "não essenciais" podem ser feitas (por exemplo, em CDR e/ou resíduos de arcabouço). Substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de um ou mais aminoácidos com um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural "Substituições humanizantes" Como usado aqui, o termo "substituições humanizantes" refere-se a substituições de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido presente em uma posição particular no anticorpo de domínio VH ou VL de um anticorpo para CD70 (por exemplo, anticorpo para CD70 derivado de camelídeos) é substituído com um resíduo de aminoácido que ocorre em uma posição equivalente em um domínio VH ou VL humano de referência. O domínio VH ou VL humano de referência pode ser um domínio VH ou VL codificado pela linhagem germinal humana. As substituições humanizantes podem ser feitas nas regiões de arcabouço e/ou CDRs do anticorpo para CD70, definido aqui. "Variantes humanizadas": Como usado aqui o termo "variante humanizada" refere-se a um anticorpo de variante que contém uma ou mais "substituições humanizantes" comparado a um anticorpo para CD70 de referência, em que uma porção do anticorpo de referência (por exemplo, o domínio VH e/ou o domínio VL ou partes do mesmo contendo pelo menos uma CDR) tem um amino derivado de uma espécie não humana, e as "substituições humanizantes" ocorrem dentro das sequências de aminoácido derivadas de uma espécie não humana. "Variantes germinalizadas": o termo "variante germinalizada" é usado aqui para referir-se especificamente a "variantes humanizadas" em que as "substituições humanizantes" resultam em substituição de uma ou mais resíduo de aminoácidos presentes em uma posição(ões) particular(es) no domínio VH ou VL de um anticorpo para CD70 (por exemplo, um anticorpo para CD70 derivado de camelídeo) com um resíduo de aminoácido que ocorre em uma posição equivalente em um domínio VH ou VL humano de referência codificado pela linhagem germinal humana. Ê típico que para qualquer dada "variante germinalizada", o resíduo de substituição de aminoácidos substituídos na variante germinalizada são tomados exclusivamente, ou predominantemente, de um domínio VH ou VL codificado de linhagem germinal humana simples. Os termos "variante humanizada" e "variante germinalizada" são frequentemente usados de’ modo interpermutável aqui. Introdução de uma ou mais "substituições humanizantes" em um domínio VH ou VL derivado de camelídeo (por exemplo, derivado de lhama) resulta em produção de uma "variante humanizada" do domínio VH ou VL derivado de camelídeo (lhama). Se os resíduos de aminoácido substituídos são derivados predominantemente ou exclusivamente de uma sequência de domínio VH ou VL codificada de linhagem germinal humana simples, então o resultado pode ser uma "variante germinalizada humana" do domínio VH ou VL derivado de camelídeo (lhama). "Variantes de afinidade": Como usado aqui, o termo "variante de afinidade" refere-se a "um anticorpo variante que exibe uma ou mais mudanças em sequência de aminoácidos comparado com um anticorpo para CD70 de referência, em que uma variante de afinidade exibe uma afinidade alterada para a proteína de CD70 humana em comparação com o anticorpo de referência. Tipicamente, variantes de afinidade irão exibir uma afinidade melhorada para CD70 humano, como comparado com o anticorpo para CD70 de referência. Preferivelmente, a variante de afinidade irá exibir uma afinidade melhorada para CD7 0 humano, como comparado com o anticorpo para CD70 de referência. A melhora pode ser aparente como um menor KD, para o CD70 humano, ou uma taxa de dissociação mais lenta para CD70 humano ou uma alteração no padrão de reatividade cruzada com os homólogos CD70 não humanos. Variantes de afinidade tipicamente exibem uma ou mais mudanças em sequências de aminoácidos nas CDRs, como comparado com anticorpo para CD70 de referência. Tais substituições podem resultar em substituição do aminoácido original presente em uma dada posição nas CDRs com um resíduo de aminoácido diferente, que pode ser um resíduo de aminoácido naturalmente ocorrendo ou um resíduo de aminoácido não naturalmente ocorrendo. As substituições de aminoácidos podem ser conservativas ou não conservatives. "Homologia humana elevada": Um anticorpo compreendendo um domínio de cadeia pesada variável (VH) e um domínio de cadeia leve variável (VL) será considerado como tendo homologia humana elevada se os domínios de VH e os domínios de VL, tomados juntos, exibem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos para as sequências de VH e VL da linhagem germinal humana correspondente mais próxima. Anticorpos tendo homologia humana elevada podem incluir anticorpos compreendendo domínios VH e VL de anticorpos não humanos nativos ,que exibem identidade de sequência percentual suficientemente elevada para sequências de linhagem germinal humana, incluindo, por exemplo, anticorpos compreendendo domínios VH e VL de anticorpos de camelídeos convencionais, bem como variantes engenheiradas, especialmente humanizadas ou germinalizadas, de tais anticorpos e também anticorpos "completamente humanos".

Em uma forma de realização o domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada pode exibir uma identidade de sequência de aminoácidos ou homologia de sequência de 80% ou mais com um ou mais domínios VH humanos através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4. Em outras formas de realização, a identidade da sequência de aminoácidos ou homologia de sequência entre o domínio VH do polipeptídeo da invenção e a sequência de domínio VH da linhagem germinal humana correspondente mais próxima pode ser de 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou até 99% ou mesmo 100%.

Em uma forma de realização o domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada pode conter uma ou mais (por exemplo, 1 a 10) faltas de correspondência das sequências de aminoácido através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4, em comparação com sequência VH humana correspondida mais próxima.

Em outra forma de realização o domínio VL do anticorpo com homologia humana elevada pode exibir uma identidade de sequência ou homologia de sequência de 80% ou mais com um ou mais domínios VL humanos através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4. Em outra forma de realização, a identidade de sequência de aminoácidos ou homologia de sequência entre o domínio VL do polipeptídeo da invenção e a sequência de domínio VL da linhagem germinal humana correspondente mais próxima pode ser 85% ou mais 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou até 99% ou mesmo 100%.

Em uma forma de realização o domínio VL do anticorpo com homologia humana elevada pode conter uma ou mais (por exemplo, 1 a 10) faltas de correspondência da sequência de aminoácidos através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4, em comparação com a sequência VL humana correspondida mais próxima.

Antes de analisar a porcentagem de identidade de sequência entre o anticorpo com homologia humana elevada e linhagem germinal humana VH e VL, as dobras canônicas podem ser determinadas, o que permite a identificação da família dos segmentos de linhagem germinal humana com a combinação idêntica de dobras canônicas para Hl e H2 ou Ll e L2 (e L3). Subsequentemente o membro da família da linhagem germinal humana que tem o maior grau de homologia de sequência com a região variável do anticorpo de interesse é escolhido para classificar a sequência de homologia. A determinação de classes canônicas de alças hipervariáveis Ll, L2, L3, Hl e H2 de Chothia pode ser realizada com as ferramentas de bioinformática publicamente disponíveis na página da rede www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. A saída do programa mostra as exigências de resíduos chaves em um arquivo de dados. Nos arquivos, as posições de resíduos chaves são mostradas com os aminoácidos permitidos em cada posição. A sequência da região variável do anticorpo de interesse é dada como entrada e é primeiro alinhada com uma sequência de anticorpo de consenso para designar o esquema de numeração Kabat. A análise das dobras canônicas usa um conjunto de gabaritos de resíduos chaves derivados por um método automatizado desenvolvido por Martin e Thornton (Martin et 5 al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Com o segmento particular de linhagem germinal humana V conhecido, que usa a mesma combinação de dobras canônicas para Hl e H2 ou LI e L2 (e L3) , o membro de família de melhor correspondência em termos de homologia de sequência 10 pode ser determinado. Com ferramentas de bioinformática a porcentagem de identidade de sequência entre as sequências de arcabouço de domínio VH e VL de aminoácidos do anticorpo de interesse e sequências correspondentes codificadas pela linhagem germinal humana pode ser determinada, mas 15 alinhamento realmente manual das sequências pode ser aplicado também. As sequências de imunoglobulina humana podem ser identificadas a partir de várias bases de dados de proteína, tal como VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ou a base de dados Puckthun/Honegger 20 (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines. Para comparar a sequência humana para as regiões V de domínios VH ou VL em um anticorpo de interesse um algoritmo de alinhamento de sequência tal como disponível via sítios da web como www.expasy.ch/tools/#align podem ser usados, mas 25 também alinhamento manual com o conjunto limitado de sequências pode ser realizado. As sequências de cadeia leve e pesada da linhagem germinal humana das famílias com as mesmas combinações de dobras canônicas e com o maior grau de homologia com as regiões de arcabouço 1, 2, e 3 de cada cadeia são selecionadas e comparadas com a região variável de interesse; também o FR4 é verificado contra as regiões JH e JK ou JL de linhagem germinal humana. Note-se que no cálculo da homologia de sequência percentual global, os resíduos de FR1, FR2 e FR3 são avaliados usando a sequência de correspondência mais próxima a partir da família de linhagem germinal humana com a combinação idêntica de dobras canônicas. Somente resíduos diferentes dos membros de correspondência mais próxima ou outros da mesma família com a mesma combinação de dobras canônicas são classificados (NB - excluindo quaisquer diferenças codificadas pelo iniciador). Contudo, para fins de humanização, resíduos em regiões de arcabouço idênticas a membros de outras famílias de linhagem germinal humana, que não tem a mesma combinação de dobras canônicas, podem ser considerados "humanos", apesar do fato de que estes são classificados "negativos" de acordo com condições estringentes descritas acima. Esta consideração é baseada na abordagem de "mix and match" para humanização, em que cada um dos FR1, FR2, FR3 e FR4 é separadamente comparado à sua sequência de linhagem germinal humana correspondente mais próxima e a molécula humanizada assim contém uma combinação de diferentes FRs como foi feito por Qu e colaboradores (Qu et al., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) e Ono e colaboradores (Ono et al. , Mol. Imunol. 36:387-395 (1999)). Os limites das regiões de arcabouço individuais podem ser designados usando o esquema de numeração IMGT, que é uma adaptação do esquema numeração de Chothia (Lefranc et al. , NAR 27: 209-212 (1999); imgt.cines.fr).

Anticorpos com homologia humana elevada podem compreender alças hipervariáveis ou CDRs tendo dobras canônicas humanas ou de tipo humano, como discutido em detalhes abaixo. Em uma forma de realização pelo menos uma alça hipervariável ou CDR ou no domínio VH ou no domínio VL do anticorpo com homologia humana elevada pode ser obtida ou derivada de um domínio VH ou VL do anticorpo não humano, por exemplo, um anticorpo convencional a partir de uma espécie de Camelidae, ainda exibe uma estrutura de dobra canônica prevista ou real que é substancialmente idêntica a uma estrutura de dobra canônica que ocorre em anticorpos humanos. É bem estabelecido na arte que apesar das sequências primárias de aminoácidos de alças hipervariáveis presentes em ambos os domínios VH e domínios VL codificados pela linhagem germinal humana serem, por definição, altamente variáveis, todas as alças hipervariáveis, exceto CDR H3 do domínio VH, adotam somente poucas conformações estruturais distintas, chamadas dobras canônicas (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontane et al. Proteins 6:382-94 (1989)), que dependem tanto do comprimento da alça hipervariável como da presença dos assim chamados resíduos de aminoácido canônicos (Chothia et al. , J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As estruturas canônicas reais das alças hipervariáveis em domínios VH ou VLs intactos podem ser determinadas por análise estrutural (por exemplo, cristalografia de raios-X), mas é também possível prever uma estrutura canônica com base em resíduos de aminoácidos chaves que são característicos da estrutura particular (discutido ainda abaixo). Em essência, o padrão específico de resíduos que determina cada estrutura canônica forma uma "assinatura" que permite à estrutura canônica ser reconhecida em alças hipervariáveis do domínio VH ou VL de estrutura desconhecida; estruturas canônicas podem assim ser previstas com base em sequências de aminoácidos primárias apenas.

As estruturas de dobra canônica previstas para as alças hipervariáveis de qualquer dada sequência VH ou VL em um anticorpo com homologia humana elevada podem ser analisadas usando algoritmos que são publicamente disponíveis de www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html, www.biochem.ucl.ac.uk/-martin/antibodies.html e www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase hVk.htm 1. Estas ferramentas permitem que as sequências VH ou VL de pergunta sejam alinhadas contra sequências de domínio VH ou VL humano de estrutura canônica conhecida, e uma previsão da estrutura canônica feita para as alças hipervariáveis da sequência de pergunta. No caso do domínio VH, alças Hl e H2 podem ser classificadas como tendo a estrutura de dobra canônica "substancialmente idêntica" a uma estrutura de dobra canônica conhecida para ocorrer em anticorpos humanos se pelo menos o primeiro, e preferivelmente ambos, dos seguintes critérios são atendidos: 1. Um comprimento idêntico, determinado pelo número de resíduos, para a classe estrutural canônica humana de correspondência mais próxima. 2. Pelo menos 33% de identidade, preferencialmente pelo menos 50% identidade com os resíduos de aminoácidos chaves descritos para as classes estruturais canônicas Hl e H2 humanas correspondentes. (note-se para fins de análise acima que as alças Hl e H2 são tratadas separadamente e cada comparada contra sua classe estrutural canônica humana de correspondência mais próxima)

A análise acima se baseia em previsão da estrutura canônica das alças Hl e H2 do anticorpo de interesse. Se as estruturas reais das alças Hl e H2 no anticorpo de interesse são conhecidas, por exemplo, com base em cristalografia de raios-X, então as alças Hl e H2 no anticorpo de interesse também podem ser classificadas como tendo uma estrutura de dobra canônica "substancialmente idêntica" a uma estrutura de dobra canônica conhecida como ocorrendo em anticorpos humanos se o comprimento da alça difere do da classe estrutural canônica humana de correspondência mais próxima (tipicamente por ±1 ou ±2 aminoácidos), mas a estrutura real das alças Hl e H2 alças no anticorpo de interesse corresponde à estrutura de uma dobra canônica humana.

Resíduos de aminoácido chaves encontrados nas classes estruturais canônicas humanas para as primeira e segunda alças hipervariáveis de domínios VH humanos (Hl e H2) são descritos por Chothia et al. , J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992), cujos conteúdos são incorporados aqui em sua totalidade por referência. Em particular, Tabela 3 na página 802 de Chothia et al., que é especificamente incorporado aqui por referência, relaciona resíduos de aminoácido preferido em sítios chaves para estruturas canônicas Hl encontradas na linhagem germinal humana, enquanto a Tabela 4 na página 803, também especificamente incorporada por referência, relaciona resíduos de aminoácidos preferidos em sítios chaves para as estruturas canônicas H2 de CDR encontradas na linhagem germinal humana.

Em uma forma de realização, ambos Hl e H2 no domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada exibem uma estrutura de dobra canônica prevista ou real que é substancialmente idêntica a uma estrutura de dobra canônica que ocorre em anticorpos humanos.

Anticorpos com homologia humana elevada podem compreender um domínio VH em que as alças hipervariáveis Hl e H2 formam uma combinação de estruturas de dobra canônica que é idêntica a uma combinação de estruturas canônicas conhecidas como ocorrendo em pelo menos um domínio VH de linhagem germinal humana. Observou-se que somente algumas combinações de estruturas de dobra canônica em Hl e H2 realmente ocorrem em domínios VH codificados pela linhagem germinal humana. Em uma forma de realização, Hl e H2 no domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada podem ser obtidos a partir de um domínio VH de espécie não humana, por exemplo, uma espécie Camelidae, e ainda formam uma combinação de estruturas previstas ou reais de dobra canônica que é idêntica a uma combinação de estruturas de dobra canônica conhecidas como ocorrendo em uma linhagem germinal humana ou domínio VH mutado somaticamente. Em formas de realização não limitantes, Hl e H2 no domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada podem ser obtidos a partir de um domínio VH da espécie não humana, por exemplo, uma espécie Camelidae, e formam uma das seguintes combinações de dobra canônica: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 e 3-5.

Anticorpo com homologia humana elevada pode conter um domínio VH que exibe tanto elevada identidade de * sequência/homologia de sequência com VH humano, e que contém alças hipervariáveis exibindo estrutural homologia com VH humano.

Pode ser vantajoso para as dobras canônicas presentes em Hl e H2 no domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada, e as combinações das mesmas, ser "corrigidas" para a sequência de linhagem germinal de VH humano que representa a correspondência mais próxima com o domínio VH do anticorpo com homologia humana elevada em termos de identidade de sequência de aminoácidos primária global. A título de exemplo, se a correspondência de sequência mais próxima é com o domínio VH3 da linhagem germinal humana, então pode ser vantajoso para Hl e H2 formar uma combinação de dobras canônicas que também ocorre naturalmente em um domínio VH3 humano. Isto pode ser particularmente importante no caso dos anticorpos com homologia humana elevada que são derivados de espécie não humanas, por exemplo, anticorpos contendo domínios VH e VL que são derivados de anticorpos de camelídeo convencionais, especialmente anticorpos contendo domínios VH e VL de camelídeo humanizado.

Assim, em uma forma de realização o domínio VH do anticorpo para CD70 com homologia humana elevada pode exibir uma identidade de sequência ou homologia de sequência de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou até 99% ou mesmo 100% com um domínio VH humano através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4, e além disso Hl e H2 no mesmo anticorpo são obtidos a partir de um domínio VH não humano (por exemplo, derivado de uma espécie de Camelidae), mas formam uma combinação de estruturas de dobra canônica previstas ou reais que é a mesma combinação de dobra canônica conhecida como ocorrendo naturalmente no mesmo domínio VH humano.

Em outra forma de realização, LI e L2 no domínio VL do anticorpo com homologia humana elevada são cada obtidos a partir de um domínio VL da espécie não humana (por exemplo, derivados de domínio VL de camelídeos), e cada apresenta uma estrutura de dobra canônica prevista ou real que é substancialmente idêntica a uma estrutura de dobra canônica que ocorre em anticorpos humanos. Como com os domínios VH, as alças hipervariáveis de domínios VL de ambos os tipos VLambda e VKappa podem adotar um número limitado de conformações ou estruturas canônicas, determinadas em parte por comprimento e também pela presença de resíduos de aminoácidos chaves em algumas posições canônicas. Dentro de um anticorpo de interesse tendo homologia humana elevada, alças Ll, L2 e L3 obtidas a partir de domínio VL da espécie não humana, por exemplo, uma espécie de Camelidae, podem ser classificadas como tendo uma estrutura de dobra canônica "substancialmente idêntica" a uma estrutura de dobra canônica conhecida como ocorrendo em anticorpos humanos se pelo menos o primeiro, e preferivelmente ambos, dos seguintes critérios são atendidos: 1. Um comprimento idêntico, determinado pelo número de resíduos, para a classe estrutural humana de correspondência mais próxima. 2. Pelo menos 33% de identidade, preferencialmente pelo menos 50% identidade com os resíduos de aminoácidos chaves descritos para as classes estruturais canônicas humanas Ll ou L2 correspondentes, a partir tanto do repertório VLambda como do VKappa. (note-se para fins da análise acima que as alças Ll e L2 são tratadas separadamente e cada comparada contra sua classe estrutural canônica humana de correspondência mais próxima)

A análise acima se baseia em previsão da estrutura canônica das alças Ll, L2 e L3 no domínio VL do anticorpo de interesse. Se a estrutura real de alças Ll, L2 e L3 é conhecida, por exemplo, com base em cristalografia de raios- X, então alças Ll, L2 ou L3 derivadas do anticorpo de interesse também podem ser classificadas como tendo a estrutura de dobra canônica "substancialmente idêntica" a uma estrutura de dobra canônica conhecida como ocorrendo em anticorpos humanos se o comprimento da alça difere do da classe estrutural canônica humana de correspondência mais próxima (tipicamente por ±1 ou ±2 aminoácidos), mas a estrutura real das alças Camelidae corresponde a uma dobra canônica humana. Resíduos de aminoácido chaves encontrados nas classes estruturais canônica humanas para as CDRs de domínios VLambda e VKappa humanos são descritos por Morea et al. Methods, 20: 267-279 (2000) e Martin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996). O repertório estrutural do domínio VKappa humano é também descrito por Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-4638 (1995), e o do domínio VLambda por Williams et al. J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996). Os conteúdos de todos estes documentos devem ser incorporados aqui por referência. LI e L2 no domínio VL de um anticorpo com homologia humana elevada podem formar uma combinação de estruturas previstas ou reais de dobra canônica que é idêntica a uma combinação de estruturas de dobra canônica conhecidas como ocorrendo em um domínio VL de linhagem germinal humana. Em formas de realização não limitantes, LI e L2 no domínio VLambda de um anticorpo com homologia humana elevada (por exemplo, um anticorpo contendo um domínio VL de derivados de camelídeos ou de uma variante humanizada deste) podem formar uma das seguintes combinações de dobras canônicas: 11-7, 13- 7(A,B,C), 14-7(A,B), 12-11, 14-11 e 12-12 (como definido em Williams et al. J. Mol. Biol. 264:220 -32 (1996) e os mostrados em http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hV L.html). Em formas de realização não limitantes, LI e L2 no domínio Vkappa pode formar uma das seguintes combinações de dobra canônica: 2-1, 3-1, 4-1 e 6-1 (como definido em Tomlinson et al. EmBO J. 14:4628-38 (1995) e como mostrado em http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hV K.html).

Em outra forma de realização, todas as três de Ll, L2 e L3 no domínio VL de um anticorpo com homologia humana elevada podem exibir uma estrutura substancialmente humana. Prefere-se que o domínio VL do anticorpo com homologia humana elevada exiba tanto identidade elevada de sequência/homologia de sequência com VL humano, como também que as alças hipervariáveis no domínio VL exibam estrutural homologia com VL humano.

Em uma forma de realização, o domínio VL do anticorpo para CD70 com homologia humana elevada pode exibir uma identidade de sequência de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou até 99% ou mesmo 100% com um domínio VL humano através das regiões de arcabouço FR1, FR2, FR3 e FR4, e além disso alça hipervariável Ll e alça hipervariável L2 podem formar uma combinação de estruturas de dobra canônica previstas ou reais que é igual que a combinação de dobra canônica conhecida como ocorrendo naturalmente no mesmo domínio VL humano. É visado, como evidente, que os domínios VH exibindo elevada identidade de sequência/homologia de sequência com VH humano, e também homologia estrutural com alças hipervariáveis de VH humano serão combinados com domínios VL exibindo elevada identidade de sequência/homologia de sequência com VL humano, e também homologia estrutural com alças hipervariáveis de VL humano de modo a fornecer anticorpos com homologia humana elevada contendo pareamentos VH/VL (por exemplo, pareamentos VH/V1 derivados de camelídeos) com sequência e homologia estrutural máximas para os pareamentos VH/VL codificados-humanos. Como resumido acima, a invenção refere-se, pelo menos em parte, a anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, que ligam a CD70 humano com elevada afinidade. As propriedades e características dos anticorpos para CD70, e fragmentos de anticorpo, de acordo com a invenção serão agora descritos em outros detalhes.

Ligação de CD70 e afinidade

Em certos aspectos, os anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, aqui proporcionados, ligam a CD70 humano com elevada afinidade. Anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam a CD70 humano com elevada afinidade podem exibir uma afinidade de ligação (KD) para CD70 humano, e mais particularmente o domínio extracelular de CD70 humano, de cerca de lOnM ou menos, ou InM ou menos, ou 0,lnM ou menos, ou 10pM ou menos.

O anticorpo para CD70 (ou fragmento de ligação ao antígeno) pode compreender domínios de VH e VL que, quando os domínios de VH e VL são expressados na forma de um Fab, exibem uma taxa de dissociação (off-rate) para ligação a CD70 humano de menos que 7 x 10"4s_1, preferivelmente menos que 5 x 10'4s-1, ou menos que 2 x 10'4s-1, menos que 1 x 10-4s* 1. Tipicamente a taxa de dissociação cai na faixa a partir de 0,4 x 10’4s-1 a 4,8 x 10-4s-1. Afinidade de ligação (KD) e taxa de dissociação (KOff) podem ser medidas usando técnicas padrão -bem conhecidas dos versados na técnica, tais como, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície (BIAcore), como descrito nos exemplos acompanhantes. Em resumo, 50 μl de amostra a ser testada são adicionados a 200 μl PBS + 0,02% Tween, e diluídos a 1/400 como a seguir: 5 μl de amostra (1 mg/ml) + 195 μl HBS-EP+ (tampão Biacore), ainda diluído 10 μl + 90 μl HVS-EP+ = 2,5 μg/ml. Análise Biacore é efetuada em temperatura ambiente usando um chip CM5 altamente revestido com CD70 (4000 RU) usando o protocolo fornecido do fabricante.

A esse respeito, deve ser notado que embora a taxa de dissociação seja medida para combinações de VH e VL na forma de Fabs, isso não significa que os domínios de VH e VL contribuem igualmente para a ligação de CD70. Para muitas combinações de VH/VL, é o domínio VH que principalmente contribui para a ligação de CD70, com o domínio VL contribuindo para a solubilidade e/ou estabilidade do paramento de VH/VL.

Ligação dos anticorpos para CD70 descrita aqui, ou fragmentos Fab dos mesmos, a CD70 humano recombinante pode também ser avaliada por ELISA.

Os anticorpos para CD70 descritos aqui podem ainda exibir ligação a CD70 expressado na superfície de células intactas, por exemplo, células de carcinoma renal 786-0 e outras linhagens de células de câncer. Ligação de anticorpos para CD70 a célula expressando CD7 0 pode ser avaliada por citometria de fluxo. Os resultados apresentados nos exemplos acompanhantes demonstram que anticorpos preferidos de CD70, incluindo variante 41D12 (quando expressada como IgGl não fucosilada ARGX-110), exibem ligação muito forte a CD70 de superfície celular. De fato, para muitas linhagens de células, ARGX-110 exibe ligação mais forte que anticorpo SGN70 da técnica anterior comparativa. É particularmente notável que ARGX-110 exibe forte ligação a linhagens de células que expressam CD70 em baixo número de cópias, incluindo inter alia as linhagens de células Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Med, JVM-2, HH e EBC-1, e também a células de câncer isoladas de pacientes (por exemplo, pacientes de CLL), em ambos os casos a ligação de ARGX-110 é marcadamente mais forte que SGN70. A ligação "melhorada" a baixo número de cópias linhagens de células e materiais de paciente CLL pode em grande parte refletir a afinidade extremamente elevada de ARGX-110 para CD70 recombinante. Essas características de ligação são de apoio para uma utilidade particular de ARGX-110 (baseado em 41D12) e outros anticorpos para CD70 descritos aqui com propriedades similares em tratamento de câncer, particularmente quando utilizados como uma IgG exibindo função efetora potente (por exemplo, IgGl não fucosilada) ao invés de um imunoconjugado ligado a uma porção citotóxica ou citoestática. A significância de elevada afinidade de ligação (isto é maior afinidade que pode ser conseguida com anticorpos para CD70 de técnica anterior) a CD7 0 recombinante e superfície celular CD70 com respeito à utilidade clínica dos anticorpos é demonstrada nos exemplos acompanhantes experimentando que PBMC amostras são "salpicadas" com linhagens de células de câncer e então tratadas com anticorpos para CD70. No tratamento de sistema com ARGX-110 produzido significantemente mais lise de células de câncer alvo que os anticorpos comparadores de CD70 MDX1411 e SGN70.

Os anticorpos para CD70 descritos aqui exibem elevada afinidade de ligação a CD70 humano, e mais especificamente o domínio extracelular de CD70 humano, mas reatividade cruzada com homólogos não humanos de CD70 não é excluída. De fato, é um aspecto vantajoso de muitos dos anticorpos para CD70 descritos aqui, incluindo 27B3 e suas variantes germinalizadas, particularmente 41D12, que em adição a afinidade de ligação elevada para CD70 humano eles também reagem de modo cruzado com homólogos de CD70 de símios, especificamente os homólogos de CD70 de macaco reso e macaco cinomolgo. Neste aspecto, um anticorpo para CD70 pode ser considerado para exibir reatividade cruzada com um homólogo de CD70 de símio, por exemplo, os homólogos de CD70 de macaco reso e macaco cinomolgo, se a diferença em IC50 para CD70 de humano versus símio (macaco reso ou cinomolgo) em um ELISA DE INIBIÇÃO de CD70-CD27, tal como descrito no exemplo acompanhante 20.2, é menos que 5 vezes, preferivelmente menos que 3 vezes ou menos que 2 vezes. A afinidade de ligação e, portanto, potência de bloqueio, para CD70 humano e símio deve ser amplamente comparável.

Interação entre CD70 e CD27

Em certos aspectos, os anticorpos para CD70, ou 100 fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, providos aqui podem ligar a CD70 humano com elevada afinidade e bloquear a interação entre CD70 e CD27.

A capacidade de anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, para bloquear ligação de CD70 a CD27 pode ser avaliada por Elisa usando quer CD70 recombinante capturado (Flag-TNC-CD70) ou CD70 revestido direto e CD27-Fc recombinante. Os anticorpos para CD70 descritos aqui podem inibir a interação entre CD70 e CD27 com um IC50 de 300 ng/ml ou menos, ou 200 ng/ml ou menos, ou 110 ng/ml ou menos, ou 70 ng/ml ou menos, ou 50 ng/ml ou menos.

A capacidade de anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, para bloquear ligação de CD70 a CD27 pode também ser avaliada em um teste baseado em co-cultura de células Raji (linfoma de célula B humano) e células HI1090-CD27 (linhagem celular epitelial humana transfectada com CD27), como descrito nos exemplos acompanhantes. Os anticorpos para CD70 descritos que inibem a interação entre CD70 e CD27 podem exibir uma IC50 no teste de co-cultura de 500 ng/ml ou menos, ou 300 ng/ml ou menos, ou 100 ng/ml ou menos, ou 50 ng/ml ou menos, ou 30 ng/ml ou menos. Os anticorpos para CD70 preferidos baseados em 27B3 e variantes germinalizadas dos mesmos, incluindo 41D12 (ARGX- 110) exibem bloqueio potente da interação de CD70/CD27 no sistema Elisa. De fato, ARGX-110 é significantemente mais potente em interação de bloqueio de CD70/CD27S que anticorpos comparadores SGN70 e MDX1411. A interação entre CD70 e CD27 pode contribuir para a sobrevivência de célula de tumor, proliferação e/ou supressão imune dentro de microambiente de tumor. Consequentemente, inibição potente da interação de CD70/CD27, além de elevada afinidade de ligação a CD70, pode contribuir para um resultado clínico otimizado no tratamento de certos cânceres de expressão de CD70 ou distúrbios imunológicos, por exemplo, doenças autoimunes e cânceres que co-expressam CD70 e CD27.

Em outras formas de realização, os anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ligar a CD70 humano, mas não inibir a interação entre CD70 e CD27. Anticorpos para CD70 que ligam CD70, mas não inibem a interação entre CD70 e CD27 podem ser avaliados baseados em Elisa usando quer CD70 recombinante capturado (Flag-TNC- CD70) ou CD70 revestido direto e CD27-Fc recombinante. Como demonstrado nos exemplos acompanhantes, um número de Fabs foram identificados que ligam CD70, mas não inibem a interação de CD70/CD27 em uma extensão significante. Em particular, o clone de Fab identificado aqui como 59D10 exibe forte ligação a CD70 recombinante como medido por Biacore, mas não bloqueia a interação de CD70/CD27 em uma extensão significante, quando avaliado por ELISA. Anticorpos para CD70 descritos aqui que ligam CD70, mas não inibem a interação entre CD70 e CD27 podem ainda possuir funções efetoras de anticorpo intactas, isto é uma ou mais de ADCC, CDC, ADCP ou ADC e inibem crescimento de células de tumor in vivo. Anticorpos para CD70 que ligam CD70 com elevada afinidade, mas são não bloqueantes podem ser vantajosamente utilizados como anticorpos de "um braço", ou produtos de Fab PEGuilado ou em qualquer outro formato de anticorpo que proporciona uma interação monovalente estrita com uma célula alvo expressando CD70.

Epítopos de CD70

Em certos aspectos, os anticorpos para CD70 descritos aqui ligam a epítopos dentro do domínio extracelular de CD70 humano. O termo "epítopo" refere-se à(s)porção(ões) de um antígeno (por exemplo, CD70 humano) que contata um anticorpo. Epítopos podem ser lineares, isto é, envolvendo ligação a uma sequência simples de aminoácidos, ou conformacional, isto é, envolvendo ligação a duas ou mais sequências de aminoácidos em várias regiões do antígeno que pode não necessariamente ser contígua. Os anticorpos para CD70 providos aqui podem ligar a diferentes epítopos (sobrepondo-se ou não sobrepondo-se) dentro do domínio extracelular da proteína de CD70 humano. Por exemplo, os Fabs denotados 1C2 e 9E1 nos exemplos acompanhantes claramente se ligam a diferentes epítopos não sobrepostos em CD70 humano. Como notado neste texto em outra parte, o anticorpo de CD70 41D12 preferido (ARGX-110) exibe uma combinação particularmente útil de características de ligação que não é exibida por qualquer anticorpo para CD70 de técnica conhecida anterior, isto é: (a) ligação dentro da sequência de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342) em CD70 humano; (b) reatividade cruzada com homólogos de CD70 de macaco reso (Macaca mulatta) e macaco cinomolgo (Macaca cynomolgus) ; (c) ligação a CD7 0 humano CD70 humano recombinante nativo e desnaturado por calor. Para qualquer dado anticorpo para CD70, a capacidade para ligar CD70 humano dentro da sequência de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342) pode ser prontamente determinada por um versado no técnica, por exemplo, usando a análise de ligação quimérica camundongo-humano de CD70 descrita no exemplo acompanhante 20.4.

Reatividade cruzada com homólogos de CD70 símios pode também ser prontamente determinada por um versado na técnica, por exemplo, por análise de FACS, ressonância de plasmon de superfície (Biacore™) ou usando um ELISA de inibição de CD70-CD27. A respeito disto, um anticorpo para CD70 pode ser considerado para exibir reatividade cruzada com um homólogo de CD70 de símio, por exemplo, os homólogos de CD70 de macaco reso e macaco cinomolgo, se a diferença em IC50 para CD70 humano versus símio (macaco reso ou cinomolgo) em um ELISA DE INIBIÇÃO de CD70-CD27, tal como descrito no exemplo acompanhante 20.2, for menor do que 5 vezes, preferivelmente menor do que 3 vezes ou menor do que 2 vezes.

Os anticorpos para CD70 descritos aqui podem também demonstrar a capacidade para ligar ambos CD70 humano CD70 humano recombinante nativo e desnaturado por calor. Nessa conexão, ligação a CD70 humano "nativo" é indicado por ligar a CD70 expressado na superfície de uma célula de expressão de CD70, tal como qualquer uma das linhagens de células de CD70+ descritas nos exemplos acompanhantes, ou ainda célula expressando CD70 natural isolada de material de paciente (por exemplo, células isoladas de pacientes de CLL como nos exemplos acompanhantes), células T ativadas, etc. Ligação a CD70 humano "nativo" pode, deste modo, ser prontamente testada por um versado na técnica. Ligação a CD70 humano recombinante desnaturado por calor pode ser testada como descrito no exemplo acompanhante 20.3. É preferido que o anticorpo para CD70 deve exibir uma OD a 620 nm de 0,6 ou maior nesse teste, a fim de demonstrar 105 significante ligação a CD70 humano recombinante desnaturado por calor.

Internalização parcial ou lenta

Os anticorpos para CD70 descritos aqui, incluindo o anticorpo preferido de CD70 41D12 (ARGX-110), exibem internalização parcial em linhagens de células de carcinoma renal, significando que quando internalização de anticorpo é testada em células de carcinoma renal 786-0 uma proporção substancial do anticorpo ligado, isto é, pelo menos 30-40%, permanece externa após 6 horas, e ainda após 24 horas, incubação a 37 °C. Além disso, os anticorpos para CD70 podem também exibir uma taxa lenta de internalização. A este respeito, um anticorpo para CD70 é considerado como exibindo internalização lenta se for internalizado em uma taxa mais lenta que um anticorpo para CD70 de referência 9D1 (VH SEQ ID NO:178; VL SEQ ID N0:190).

Como demonstrado nos exemplos acompanhantes, diferentes linhagens de células de câncer exibem significantes diferenças no grau de internalização de anticorpos para CD70. É particularmente significante que a maioria de linhagens de células de câncer exibe menos que 30%, e ainda menos que 10%, internalização de anticorpo para CD70 ligado, mesmo após 6 horas incubação com ARGX-110. Esses resultados suportam claramente a utilidade de variantes engenheiradas para função efetora aumentada) no tratamento de cânceres de expressão de CD70. Foi previamente reportado na literatura científica que CD70 é um alvo "internalizado"; por isso foi proposto desenvolver fármacos de anticorpo para CD70 imunoconjugados para tratamento tanto de cânceres de expressão de CD70 como doenças imunológicas. Portanto, os resultados apresentados aqui, que conclusivamente demonstram que internaiização de anticorpos para CD70 ligados por superfície celular é um evento raro e que a maioria de linhagens de células de expressão de CD70 não internalizam anticorpo para CD70 ligado em uma significante extensão, são extremamente surpreendentes.

Anticorpos para CD70 derivados de camelídeos

Em ainda outros aspectos, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui podem compreender pelo menos uma alça hipervariável ou região de determinação da complementaridade obtida a partir de um domínio VH ou um domínio VL da espécie na família Camelidae. Em particular, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender domínios VH e/ou VL, ou CDRs dos mesmos, obtidos por imunização ativa de camelídeos consanguíneos, por exemplo, lhamas, com um antígeno CD70 humano. Por "alça hipervariável ou região de determinação da complementaridade obtida a partir de um domínio VH ou um domínio VL da espécie na família Camelidae" significa-se que a alça hipervariável (HV) ou CDR tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica, ou substancialmente idêntica, para uma sequência de aminoácidos da alça hipervariável ou CDR que é codificada por um gene de imunoglobulina Camelidae. Neste contexto "gene de imunoglobulina" inclui genes de linhagem germinal, genes de imunoglobulina que sofreram rearranjo, e também genes somaticamente mutados. Assim, a sequência de aminoácidos do HV ou CDR obtido a partir de um domínio VH ou VL de uma espécie Camelidae pode ser idênticos para uma sequência de aminoácidos de HV ou CDR presentes em um anticorpo maduro de Camelidae convencional. O termo "obtido a partir de" neste contexto implica a relação estrutural, no sentido de que os HVs ou CDRs do anticorpo para CD70 corporificam uma sequência de aminoácidos (ou variantes menores da mesma) que foi originalmente codificada por um gene de imunoglobulina Camelidae. Contudo, isto não implica necessariamente uma relação particular em termos do processo de produção usado para preparar o anticorpo para CD70.

Anticorpos para CD70 derivados de camelídeos podem ser derivados a partir de qualquer espécie de camelídeos, incluindo inter alia, lhama, dromedário, alpaca, vicuna, guanaco ou camelo.

Anticorpos para CD70 compreendendo domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou CDRs dos mesmos, são polipeptídeos tipicamente recombinantemente expressados, e podem ser polipeptídeos quiméricos. O termo "polipeptídeo quimérico" refere-se a um polipeptídeo artificial (não naturalmente ocorrendo) que é criado por justaposição de dois ou mais fragmentos de peptídeo que não ocorrem de outra forma contiguamente. Estão incluídas dentro desta definição polipeptídeos quiméricos de "espécies" criadas por justaposição de fragmentos de peptídeos codificados por duas ou mais espécies, por exemplo, camelídeo e humano. CDRs derivadas de camelídeos podem compreender uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID Nos: 49-59, 262 ou 263 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37, 249, 258 ou 259 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20, 248, 256 ou 257 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID NOs: 148-168, 271 ou 273 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 ou 270 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos:77-95, ou 250-253, 267 e .268 (CDR1 de cadeia leve).

Em uma forma de realização o domínio VH completo e/ou o domínio VL completo podem ser obtidos a partir de uma espécie na família Camelidae. Em forma de realização específica, o domínio VH derivado de camelídeos pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NOs: 177-188, 212-223, 274 ou 275, enquanto o domínio VL derivado de camelídeos pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID Nos:189-211, 230-245, 276 ou 277 (VL). O domínio VH derivado de camelídeos e/ou o domínio VL derivado de camelídeos pode então ser submetido a engenharia de proteína, em que uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções ou deleções são introduzidas na sequência de aminoácidos de camelídeo. Estas mudanças engenheiradas preferencialmente incluem substituições de aminoácidos relativo à sequência de camelídeo. Estas mudanças incluem "humanização" ou "germinalização" em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um domínio VH ou VL codificado pelo camelídeo são substituídos com resíduos equivalentes de um domínio VH ou VL codificado humano homólogo.

Os domínios VH e VL de camelídeos isolados obtidos por imunização ativa de um camelídeo (por exemplo, lhama) com um antígeno CD70 humano podem ser usados como uma base para a engenharia dos polipeptídeos de ligação a antígeno de acordo com a invenção. Partindo de domínios VH e VL de camelídeos intactos, é possível engenheirar uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções ou deleções que partem da sequência de camelídeos de partida. Em determinadas formas de realização, estas substituições, inserções ou deleções podem estar presentes nas regiões de arcabouço do domínio VH e/ou do domínio VL. A finalidade destas mudanças em sequência primária de aminoácidos pode ser reduzir de modo presumível as propriedades desfavoráveis (por exemplo, imunogenicidade em hospedeiro humano (também chamada humanização), sítios de heterogeneidade e/ou instabilidade de produtos potenciais (glicosilação, deamidação, isomerização, etc.) ou para melhorar alguma outra propriedade favorável da molécula (por exemplo, solubilidade, estabilidade, biodisponibilidade, etc.). Em outra forma de realização, mudanças nas sequências de aminoácidos primárias podem ser engenheiradas em uma ou mais das alças hipervariáveis (ou CDRs) de um domínio VH e/ou um domínio VL de Camelidae obtidos por imunização ativa. Estas mudanças podem ser introduzidas a fim de acentuar a afinidade de ligação a antígeno e/ou especificidade, ou para reduzir de modo presumível as propriedades desfavoráveis, por exemplo, imunogenicidade em um hospedeiro humano (assim chamada humanização) , sítios de heterogeneidade de produtos em potencial ou instabilidade, glicosilação, deamidação, isomerização, etc., ou para acentuar outra propriedade favorável da molécula, por exemplo, solubilidade, estabilidade, biodisponibilidade, etc.

Assim, em uma forma de realização, a invenção provê um anticorpo para CD70 variante que contém pelo menos uma substituição de aminoácido em pelo menos uma região de arcabouço ou CDR de ou o domínio VH ou o domínio VL em comparação com os domínios VH ou VL derivados de camelídeos, cujos exemplos incluem, mas não são limitados aos domínios VH de camelídeos compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO: 177-188, 212-223, 274 ou 275, e os domínios VL de camelídeos compreendendo as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO: 189-211, 230-245, 276 ou 277.

Em outras formas de realização, são providas moléculas de anticorpo "quiméricas" compreendendo domínios VH e VL derivados de camelídeos (ou variantes engenheiradas dos mesmos) e um ou mais domínios constantes de um anticorpo não camelídeo, por exemplo, domínios constantes codificados humanos (ou variantes engenheiradas dos mesmos). Em tal forma de realização prefere-se que tanto o domínio VH como o domínio VL sejam obtidos a partir da espécie de camelídeo, por exemplo, ambos VH e VL podem ser de Lama glama ou ambos VH e VL podem ser de Lama pacos (antes da introdução de variação de sequência de aminoácido engenheirada). Em tais formas de realização tanto o domínio VH como VL podem ser derivados de um único animal, particularmente um único animal que foi ativamente imunizado com um antígeno CD70 humano.

Como uma alternativa para engenheirar mudanças na sequência de aminoácidos primária de domínios VH e/ou VL de Camelidae, alças hipervariáveis derivadas de camelídeos individuais ou CDRs, ou combinações das mesmas, podem ser isoladas dos domínios VH/VL de camelídeo e transferidas para um arcabouço alternativo (isto é não Camelidae), por exemplo, um arcabouço VH/VL humano, por enxerto de CDR. Em forma de realização particular, não limitativa, os CDRs derivados de camelídeos podem ser selecionados a partir de CDRs tendo as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID NOs: 49-59 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID NOs: 148-168 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos: 77-95 (CDR1 de cadeia leve).

Anticorpos para CD70 compreendendo domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou CDRs dos mesmos, podem tomar várias diferentes formas de realização em que tanto um domínio VH como um domínio VL estão presentes. O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e engloba, mas não é limitado, a anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos. (por exemplo, anticorpos biespecíficos), desde que eles exibam a especificidade imunológica apropriada para uma proteína de CD70 humana. O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto por mutações possíveis naturalmente ocorrendo que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos) sobre o antígeno, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante único ou epítopo sobre o antígeno. "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de anticorpo de comprimento completo, geralmente a ligação ao antígeno ou domínio variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fab's bi-específico, e fragmentos Fv, diabodies, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, um fragmento variável de cadeia única (scFv), e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos (ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-36 (2005), cujos conteúdos são incorporados aqui por referência).

Em formas de realização não limitantes, anticorpos para CD70 compreendendo domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou CDRs dos mesmos, podem compreender domínios CHI e/ou domínios CL, a sequência de aminoácidos sendo totalmente ou substancialmente humana. Onde o polipeptídeo de ligação a antígeno da invenção é um anticorpo destinado para uso terapêutico humano, ele é típico para a região constante completa do anticorpo, ou pelo menos uma parte da mesma, para ter sequências de aminoácidos completamente ou substancialmente humanas. Assim, um ou mais ou qualquer combinação do domínio CHI, região de dobradiça, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CL (e domínio CH4 se presente) pode ser completamente ou substancialmente humano com relação às suas sequências de aminoácidos. Com vantagem, o domínio CHI, região de dobradiça, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CL (e domínio CH4 se presente) podem ter todos sequências de aminoácidos completamente ou substancialmente humanas. No contexto da região constante de um anticorpo humanizado ou quimérico, ou um fragmento de anticorpo, o termo "substancialmente humano" refere-se a uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 99% com a região constante humana. O termo "sequência de aminoácidos humana" neste contexto refere-se a uma sequência de aminoácidos que é codificada por um gene de imunoglobulina humana, que inclui genes de linhagem germinal, rearranjados e somaticamente mutados. A invenção também contempla polipeptídeos 115 compreendendo domínios constantes de sequência "humana" que foram alterados, por um ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos com relação para uma sequência humana, exceto a forma de realização onde a presença de uma região de dobradiça "completamente humana" é expressamente requerida.

A presença da região de dobradiça "completamente humana" nos anticorpos para CD70 da invenção pode ser benéfica tanto para minimizar a imunogenicidade como para otimizar a estabilidade do anticorpo. Como discutido em algum ponto aqui, é contemplado que uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções ou deleções podem ser feitas dentro da região constante da cadeia pesada e/ou cadeia leve, particularmente dentro da região Fc. Substituições de aminoácidos podem resultar na substituição do aminoácido substituído com um aminoácido diferente naturalmente ocorrendo, ou com um aminoácido não natural ou modificado. Outras modificações estruturais são também permitidas, tal como, por exemplo, mudanças no padrão de glicosilação (por exemplo, por adição ou deleção de sítios de glicosilação N- ou O- ligados). Dependendo do uso pretendido do anticorpo, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relação às suas propriedades de ligação para receptores Fc, por exemplo, para modular a função efetora. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, assim permitindo a formação de ligação dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma melhorada capacidade de internalização e/ou morte de células mediada por complementos e citotoxicidade celular dependente de anticorpo melhoradas e (ADCC). Ver Caron et al. , J. Exp. Med. 176:1191 -1195 (1992) e Shopes, B. J. Imunol. 148:2918- 2 922 (1992) . Alternativamente, um anticorpo para CD70 pode ser engenheirado que tem regiões Fc duais e assim pode ter uma lise do complemento melhorada e capacidades ADCC. Ver Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). A invenção também contempla imunoconjugados compreendendo um anticorpo como descrito aqui conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, planta ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). As regiões Fc também podem ser engenheiradas para extensão da meia-vida, como descrito por Chan e Carter, Nature Reviews: Imunology, Vol.10, pp301-316, 2010, incorporado aqui por referência.

Em ainda outra forma de realização, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fey para modificar um ou mais aminoácidos.

Em ainda outra forma de realização, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo falta glicosilação). Glicosilação pode ser alterada por, por exemplo, aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno alvo CD70. Estas modificações de carboidratos podem ser obtidas por; por exemplo, alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultam em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de arcabouço de região variável para assim eliminar a glicosilação neste sítio. Esta aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. São também visados anticorpos para CD70 variantes tendo um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo não fucosilado (como descrito por Natsume et al., Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp7-16, 2009) ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bi- seção aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterada foram demonstrados para aumentar a atividade ADCC de anticorpos, produzindo tipicamente uma melhora de 10 vezes de ADCC relativo a um anticorpo equivalente compreendendo um domínio Fc humano "nativo". Estas modificações de carboidratos podem ser obtidas por, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinário enzimático de glicosilação alterada (como descrito por Yamane-Ohnuki e Satoh, mAbs 1:3, 230-236, 2009). Exemplos de anticorpos não flucosilados com acentuada função ADCC são os produtos usando a tecnologia de Potelligent™ de BioWa. Inc.

A invenção pode, em determinadas formas de realização, englobar anticorpos quiméricos Camelidae/ humanos, e anticorpos quiméricos particulares em que os domínios VH e VL são de sequência completamente de camelídeo (por exemplo, Lhama ou alpaca) e o restante do anticorpo é de sequência totalmente humana. Anticorpos para CD70 podem incluir anticorpos compreendendo variantes "humanizadas" ou "germinalizadas" de domínios VH e VL derivados de camelídeos, ou CDRs dos mesmos, e anticorpos quiméricos carne lí de o/humano, em que os domínios VH e VL contêm uma ou mais substituições de aminoácidos nas regiões de arcabouço em comparação com domínios VH e VL de camelídeos obtidos por imunização ativa de um camelídeo com um antígeno CD70 humano. Esta "humanização" aumenta a % de identidade de sequência com domínios VH ou VL de linhagem germinal humana por substituição de resíduos de aminoácidos sem correspondência em um domínio VH ou VL Camelidae de partida com o resíduo equivalente encontrado em um domínio VH ou VL codificado por linhagem germinal humana.

Os anticorpos para CD70 também podem ser anticorpos enxertados com CDR em que CDRs (ou alças hipervariáveis) derivadas de um anticorpo camelídeo, por exemplo, um anticorpo para CD70 camelídeo criado por imunização ativa com proteína de CD70 humana, ou de outra forma codificado por um gene camelídeo, são enxertados sobre um arcabouço VH e VL humano, com o restante do anticorpo também sendo de origem completamente humana. Estes anticorpos enxertados com CDR CD70 podem conter CDRs tendo as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID Nos: 49-59, 262 ou 263 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37, 249, 258 ou 259 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20, 248, 256 ou 257 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID NOs: 148-168, 271 ou 273 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 ou 270 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos:77-95, ou 250-253, 267 e 268 (CDR1 de cadeia leve).

Anticorpos humanizados, quiméricos e enxertados com CDR de CD70 como descritos acima, particularmente anticorpos compreendendo alças hipervariáveis ou CDRs derivadas de imunização ativa de camelídeos com um antígeno CD70 humano, podem ser prontamente produzidos usando técnicas de manipulação e expressão de DNA recombinante convencionais, fazendo uso de células hospedeiras procarióticas e eucarióticas engenheiradas para produzir o polipeptídeo de 120 interesse e incluindo, mas não limitados, a células bacterianas, células de leveduras, células de mamíferos, células de insetos, células de plantas e algumas das mesmas sendo como descritas aqui e ilustradas nos exemplos anexos.

Anticorpos para CD70 derivados de camelídeos incluem variantes em que a(s) alça(s) hipervariável(s) ou CDR(s) do domínio VH e/ou do domínio VL são obtidas a partir de um anticorpo de camelídeo convencional criado contra CD70 humano, mas em que pelo menos uma das referidas alças hipervariáveis ou CDRs (derivadas de camelídeos) foi engenheirada para incluir uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos, relativas à sequência codificada por camelídeos. Estas mudanças incluem "humanização" das alças hipervariáveis/CDRs. HVs/CDRs derivados de camelídeos que foram engenheirados neste modo podem ainda exibir uma sequência de aminoácidos que é "substancialmente idêntica" para uma sequência de aminoácidos de HV/CDR codificados de camelídeos. Neste contexto, "identidade substancial" pode permitir que não mais do que uma, ou não mais do que duas faltas de correspondência (mis-match) de sequências de aminoácidos com o HV/CDR codificado de camelídeo. As formas de realização particulares do anticorpo para CD70 podem conter variantes humanizadas das sequências de CDR mostradas como SEQ ID Nos: 49-59, 262 ou 263 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37, 249, 258 ou 259 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20, 248, 256 ou 257 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDRs mostradas como SEQ ID NOs: 148-168, 271 ou 273 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 ou 270 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos:77-95, ou 250-253, 267 e 268 (CDR1 de cadeia leve).

Os derivados de anticorpos para CD70 de camelídeos aqui providos podem ser de qualquer isotipo. Anticorpos destinados para uso terapêutico humano serão tipicamente do tipo IgA, IgD, IgE IgG, IgM, com frequência do tipo IgG, em cujo caso eles pertencem a qualquer uma das quarto subclasses IgGl, IgG2a e b, IgG3 ou IgG4. Dentre de cada uma destas sub-classes é permitindo fazer uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções ou deleções dentro da porção Fc, ou fazer outras modificações estruturais, por exemplo, para melhorar ou reduzir as funcionalidades dependentes de Fc.

Humanização de domínios VH e VL derivados de camelídeos

Anticorpos de camelídeos convencionais fornecem um ponto de vantagem vantajoso para a preparação de anticorpos com utilidade como agentes terapêuticos humanos devido aos seguintes fatores, discutidos em US 12/497.239 que é incorporado aqui por referência: 1) % de homologia de sequência elevada entre domínios VH e VL de camelídeos e suas contrapartes humanas; 2) Grau elevado de homologia estrutural entre CDRs de domínios VH e VL de camelídeos e suas contrapartes humanas (isto é, estruturas de dobra canônica de tipo humano e combinações de tipo humano de dobras canônicas).

A plataforma de camelídeo (por exemplo, lhama) também fornece uma vantagem significante em termos da diversidade funcional dos anticorpos para CD70 que podem ser obtidos.

A utilidade de anticorpos para CD70 compreendendo domínios VH camelídeo e/ou VL camelídeo para terapia humana pode ser melhorada ainda por outra "humanização" de domínios VH e VL naturais de camelídeos, por exemplo, para tornar os mesmos menos imunogênicos em um hospedeiro humano. O objetivo geral de humanização consiste em produzir uma molécula em que os domínios VH e VL exibem imunogenicidade mínima quando introduzidos em um indivíduo humano, enquanto retendo a especificidade e a afinidade do sítio de ligação ao antígeno formado pelos domínios VH e VL parentais. Uma abordagem para humanização, assim chamada "germinalização", envolve mudanças de engenharia na sequência de aminoácidos do domínio VH ou VL de camelídeo para levá-lo mais próximo da sequência de um domínio VH ou VL humano.

Determinação de homologia entre um domínio VH de camelídeo (ou VL) e domínios VH humano (ou VL) é uma etapa crítica no processo de humanização, tanto para a seleção de resíduos de aminoácidos de camelídeos a serem mudados (em um dado domínio VH ou VL) como para a seleção do(s) resíduo (s) de aminoácidos de substituição apropriados.

Uma abordagem para a humanização de anticorpos convencionais de camelídeos foi desenvolvida com base em alinhamento de um grande número de novas sequências de domínio VH (e VL) de camelídeos, tipicamente domínios VH (ou VL) somaticamente mutados que são conhecidos como ligando a antígeno alvo, com sequências VH (ou VL) de linhagem germinal humana, sequências de consenso humanas VH (e VL), bem como informação de sequência de linhagem germinal disponível para LLama pacos. As seguintes passagens mostram os princípios que podem ser aplicados para (i) selecionar resíduos de aminoácidos de "camelídeos" para substituição em domínio VH ou VL derivado de camelídeos ou uma CDR do mesmo, e (ii) selecionar a substituição de resíduos de aminoácidos "humanos" para substituir em, quando humanizando, qualquer dado domínio VH (ou VL) de camelídeo. Esta abordagem pode ser usada para preparar variantes humanizadas de CDRs derivadas de camelídeos tendo as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID Nos: 49-59, 262 ou 263 (CDR3 de cadeia pesada), ou SEQ ID Nos: 26-37, 249, 258 ou 259 (CDR3 de cadeia pesada) ou SEQ ID Nos: 10-20, 248, 256 ou 257 (CDR1 de cadeia pesada) ou uma das sequências de CDR mostradas como SEQ ID NOs: 148-168, 271 ou 273 (CDR3 de cadeia leve), ou SEQ ID Nos: 109-128 ou 270 (CDR2 de cadeia leve) ou SEQ ID Nos:77-95, ou 250-253, 267 ou 268 (CDR1 de cadeia leve), e também para a humanização de domínios VH derivados de camelídeo tendo as sequências mostradas como SEQ ID NOs: 177-188, 212-223, 274 ou 275 e de domínios VL derivados de camelídeo tendo as sequências mostradas como SEQ ID Nos:189- 211, 230-245, 276 ou 277. Etapa 1. Selecionar família humana (linhagem germinal) e membro desta família que mostra maior homologia/identidade para a sequência de camelídeo madura a ser humanizada. Um procedimento geral para identificar a linhagem germinal humana correspondente mais próxima para qualquer dado domínio VH (ou VL) de camelídeo é esboçado abaixo. Etapa 2. Selecionar membro específico de família de linhagem germinal humana usada contra linhagem germinal. Preferencialmente esta é a linhagem germinal com a maior homologia ou outro membro de família da linhagem germinal a partir da mesma família. Etapa 3. Identificar as posições preferidas consideradas para a germinalização com base na tabela de utilização de aminoácidos para a linhagem germinal de camelídeo que está mais próxima da linhagem germinal humana selecionada. Etapa 4. Tentar mudar os aminoácidos na linhagem germinal camelídeo que se desvia da linhagem germinal humana mais próxima; germinalização de resíduos FR é preferida sobre resíduos CDR. a. São preferidas as posições que estão desviando da linhagem germinal humana selecionada usada para a linhagem germinal contra, para a qual o aminoácido encontrado na sequência camelídeo não se corresponde com a linhagem germinal Selecionada e não é encontrado em outras linhagens germinais da mesma subclasse (tanto para aminoácidos FR codificados para V bem como para J). b. Posições que estão desviando do membro de família de linhagem germinal selecionado mas que são usados em outras linhagens germinais da mesma família também pode ser endereçados no processo de germinalização. c. Faltas de correspondência adicionais (por exemplo, devido às mutações somáticas adicionais) para a linhagem germinal humana selecionada também podem ser endereçadas.

A seguinte abordagem pode ser usada para determinar a linhagem germinal humana correspondente mais próxima para um dado domínio camelídeo VH (ou VL): Antes de analisar a porcentagem de identidade de sequência entre VH e VL de linhagem germinal Camelidae e humana, as dobras canônicas podem ser primeiro determinadas, o que permite a identificação dos segmentos da família de linhagem germinal humana com a combinação idêntica de dobras canônicas para Hl e H2 ou LI e L2 (e L3) . Subsequentemente, o membro de família de linhagem germinal humana que tem o maior grau de homologia de sequência com a região variável de interesse de Camelidae pode ser escolhido para classificar a sequência de homologia. A determinação de classes canônicas de Chothia de alças hipervariáveis LI, L2, L3, Hl e H2 pode ser realizada com as ferramentas de bioinformática publicamente disponíveis em página da web www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. A saída do programa mostra as exigências chaves do resíduo em um arquivo de dados. Nestes arquivos de dados, as posições de resíduos chaves são mostradas com os aminoácidos permitidos em cada posição. A sequência da região variável do anticorpo é dada como entrada e é primeiro alinhada com uma sequência de consenso do anticorpo para designar o esquema de numeração Kabat. A análise das dobras canônicas usa um conjunto de gabaritos chaves de resíduos derivados por um método automatizado desenvolvido por Martin e Thornton (Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). 0s limites das regiões de arcabouço individuais podem ser designados usando o esquema de numeração IMGT, que é uma adaptação do esquema de numeração de Chothia (Lefranc et al., NAR 27: 209-212 (1999); http://imgt.cines.fr). Com o segmento de linhagem germinal humana V particular conhecido, que usa a mesma combinação de dobras canônicas para Hl e H2 ou LI e L2 (e L3) , o membro de família de melhor correspondência em termos de homologia de sequência pode ser determinado. A porcentagem de identidade de sequência entre sequências de aminoácidos de arcabouço de domínio VH e VL Camelidae e correspondentes sequências codificadas pela linhagem germinal humana podem ser determinadas usando ferramentas de bioinformática, mas alinhamento manual das sequências também pode ser usado. As sequências de imunoglobulina humana podem ser identificadas a partir de várias bases de dados de proteínas, tal como VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ou a base de dados Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh.ch/ antibody/Sequences/Germlines. Para comparar as sequências humanas para as regiões V de domínios VH ou VL Camelidae, um algoritmo de alinhamento de sequência tal como disponível via sites da web como www. expasy. ch/tools/#align pode ser usado, mas também alinhamento manual também pode ser realizado com um conjunto limitado de sequências. As sequências de cadeia leve e pesada de linhagem germinal humana das famílias com as mesmas combinações de dobras canônicas e com o maior grau de homologia com as regiões de arcabouço 1, 2, e 3 de cada cadeia podem ser selecionadas e comparadas com a região variável de Camelidae de interesse; também FR4 é verificado contra as regiões JH e JK ou JL de linhagem germinal humana. Note-se que no cálculo de homologia de sequência percentual global os resíduos de FR1, FR2 e FR3 são avaliados usando sequência de correspondência mais próxima da família de linhagem germinal humana com a combinação idêntica de dobras canônicas. Somente resíduos diferentes dos de correspondência mais próxima . ou outros membros da mesma família com a mesma combinação de dobras canônicas são classificados (NB - excluindo quaisquer diferenças codificadas pelo iniciador) .' Contudo, para fins de humanização, resíduos em regiões de arcabouço idênticos aos membros de outras famílias de linhagem germinal humana, que não tem a mesma combinação de dobras canônicas, podem ser considerados para humanização, apesar do fato de que estes são classificados "negativos" de acordo com as condições estringentes descritas acima. Esta consideração é com base em abordagem de "mix e match" para humanização, em que cada um de FR1, FR2, FR3 e FR4 é separadamente comparado à sua sequência de linhagem germinal humana correspondente mais próxima e a molécula humanizada assim contém uma combinação de diferentes FRs como foi feito por Qu e colaboradores (Qu et al., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) e Ono e colaboradores (Ono et al., Mol. Imunol. 36:387-395 (1999)).

Anticorpos de competição cruzada

Anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que "competem de modo cruzado" com as moléculas descritas aqui são os que ligam CD7 0 humano em sítio (s) que são idênticos a, ou se sobrepondo com, o(s) sítio(s) em que os presentes anticorpos para CD70 se ligam. Os anticorpos monoclonais competindo ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser identificados, por exemplo, via um teste de competição de anticorpo. Por exemplo, uma amostra de CD70 humano purificado ou parcialmente purificado pode ser ligada a um suporte sólido. Então, um composto de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção e um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que, como se suspeita, sejam capazes de competir com este composto de anticorpo da invenção são adicionados. Uma das duas moléculas é rotulada. Se o composto rotulado e o não rotulado ligam a sítios separados e discretos em CD70, o composto rotulado irá ligar no mesmo nível caso o composto competidor suspeito esteja ou não presente. Contudo, se os sítios de interação são idênticos ou de sobreposição, o composto não rotulado irá competir e a quantidade de composto rotulado ligado ao antígeno será diminuída. Se o composto não rotulado está presente em excesso, muito pouco, se algum, composto rotulado irá se ligar. Para os fins da presente invenção, anticorpos monoclonais competindo ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são os que diminuem a ligação dos presentes compostos de anticorpo para CD70 por cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99%. Detalhes de procedimentos para realizar estes testes de competição são bem conhecidos na arte e podem ser encontrados em, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pags. 567- 569, ISBN 0-87969-314-2. Estes ensaios podem ser tornados quantitativos usando anticorpos purificados. Uma curva padrão é estabelecida por titulação de um anticorpo contra si mesmo, isto é, o mesmo anticorpo é usado tanto para o rótulo como para o competidor. A capacidade de um anticorpo monoclonal competidor não rotulado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para inibir a ligação da molécula rotulada para a placa é titulada. Os resultados são traçados em gráfico e as concentrações necessárias para alcançar o grau desejado de inibição de ligação são comparadas. Formas de realização preferidas são anticorpos que competem cruzados para ligar a CD70 humano com anticorpos compreendendo a Fab derivado de lhama 27B3, e suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12 (ARGX-110) e que exibem a mesma combinação de características de ligação, isto é: cynomolgus) ; (c) ligação a CD70 humano recombinante nativo e desnaturado por calor.

Polinucleotídeos codificando anticorpos para CD70

A invenção também provê moléculas de polinucleotídeo codificando os anticorpos para CD70 da invenção, também vetores de expressão contendo sequências de nucleotídeo que codificam os anticorpos para CD70 da invenção operativamente ligados às sequências regulatórias que permitem expressão do polipeptídeo de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou sistema de expressão livre de célula, e uma célula hospedeira ou sistema de expressão livre de célula contendo esse vetor de expressão. Moléculas de polinucleotídeo codificando os anticorpos para CD70 da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA recombinante. Os termos "ácido nucléico", "polinucleotídeo" ou uma "molécula de polinucleotídeo" como usados aqui de modo interpermutável e referem-se a qualquer molécula de DNA ou RNA, quer de filamento único ou duplo e, se de filamento único, a molécula de sua sequência complementar. Na discussão das moléculas de ácido nucléico, uma sequência ou estrutura de uma molécula particular de ácido nucléico pode ser descrita aqui de acordo com a convenção normal de prover a sequência na direção de 5' a 3 '. Em algumas formas de realização da invenção, ácidos nucléicos ou polinucleotídeos são "isolados". Esse termo, quando aplicado a uma molécula de ácido nucléico, refere-se a uma molécula de ácido nucléico que é separada de sequências com que é imediatamente contígua no genoma ocorrendo naturalmente do organismo em que ela se originou. Por exemplo, um "ácido nucléico isolado" pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou de vírus, ou integrada no DNA genômico de uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo hospedeiro não humano. Quando aplicado a RNA, o termo "polinucleotídeo isolado" refere-se primariamente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada como definido acima. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que foi purificada/separada de outros ácidos nucléicos com que seria associada em seu estado natural (isto é, em células ou tecidos). Um polinucleotídeo isolado (quer DNA ou RNA) pode ainda representar uma molécula produzida diretamente por meios biológicos ou sintéticos e separados de outros componentes presentes durante a sua produção.

Em uma forma de realização, a invenção provê sequências de nucleotídeo que codificam o domínio VH e domínio VL do Fab derivado de lhama germinalizado denotado aqui 41D12, em que o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 223 e o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:241. Em uma forma de realização preferida a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:223 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:344, e a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:241 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:345.

Em uma forma de realização, a invenção provê sequências de nucleotídeo que codificam o domínio VH e domínio VL do Fab derivado de lhama germinalizado denotado aqui 57B6, em que o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO-.274 e o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:276. Em uma forma de realização preferida a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:274 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:346, e a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:276 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:347.

Em uma forma de realização, a invenção provê sequências de nucleotídeo que codificam o domínio VH e domínio VL do Fab derivado de lhama germinalizado denotado aqui 59D10, em que o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 275 e o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:277. Em uma forma de realização preferida a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:275 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:348, e a sequência de nucleotídeo codificando o domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:277 compreende a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO:349. Para a produção recombinante de um anticorpo para CD70 de acordo com a invenção, um polinucleotídeo recombinante codificando isto pode ser preparado (usando técnicas de biologia molecular padrão) e inserido em um vetor replicável para expressão em uma célula hospedeira escolhida, ou um sistema de expressão livre de célula. As células hospedeiras apropriadas podem ser procariótas, levedura, ou células eucariotas superiores, especificamente células de mamífero. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são: linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento de cultura em suspensão, Graham et al. , J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) ); células de mieloma de camundongo SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) ou NSO (Coleções de cultura HPA no. 85110503) ; células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ; células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587); célula de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmão humano (W13 8, ATCC CCL 75) ; células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2) , bem como linhagem celular PERC-6 de DSM. Vetores de expressão adequados para uso em cada uma dessas células hospedeiras são também geralmente conhecidos na técnica.

Deve ser notado que o termo "célula hospedeira" geralmente refere-se a uma linhagem de célula cultivada. Seres humanos totais em que um vetor de expressão codificando um polipeptídeo de ligação ao antígeno de acordo com a invenção foi introduzido são explicitamente excluídos da definição de uma "célula hospedeira".

Produção de anticorpos

Em um importante aspecto, a invenção também provê um método de produzir um anticorpo para CD70 da invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira (ou sistema de expressão livre de célula) contendo polinucleotídeo (por exemplo, um vetor de expressão) codificando o anticorpo para CD70 sob condições que permitem expressão do anticorpo para CD70, e recuperando o anticorpo para CD70 expressado. Esse processo de expressão recombinante pode ser usado para produção em grande escala de anticorpos para CD70 de acordo com a invenção, incluindo anticorpos monoclonais pretendidos para uso terapêutico humano. Vetores, linhagens de células e processos de produção adequados para a fabricação em larga escala de anticorpos recombinantes adequados para uso terapêutico in vivo são geralmente adequados na técnica e serão bem conhecidos da pessoa versada. Como já foi salientado, os anticorpos para CD70 providos aqui, incluindo em particular anticorpos baseados no Fab 27B3 e suas variantes germinalizadas tais como 41D12 (ARGX-110) exibem características que são particularmente benéficas para fabricação comercial de grande escala. Especificamente, o rendimento de produção extremamente elevado (>4g/L) alcançável em um sistema de expressão recombinante de escala comercial reduzirá dramaticamente os custos de produção. Formas de realização preferidas também exibem estabilidade térmica quando testadas a 37°C e também sobre vários ciclos de congelamento-descongelamento, que é novamente extremamente benéfico para fabricação comercial e armazenamento de um produto clínico. Surpreendentemente, várias das variantes humanas germinalizadas de Fab 27B3, incluindo 41D12 e 40F1, exibem estabilidade térmica melhorada comparada a 27B3 por si só. Consequentemente, em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a CD70 humano, referido anticorpo ou fragmento compreendendo um domínio variável de cadeia pesada correspondendo a uma sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 178, desde que, pelo menos, um aminoácido em uma posição Kabat selecionada do grupo consistindo de H6, H18, H24, H31, H56, H74, H74, H77, H79, H83, H84, H89, H93, H94, H108, H110, e H112 seja substituído com outro aminoácido.

Esse anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode exibir maior estabilidade térmica que um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:178.

Em outra forma de realização provê-se um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve correspondendo a uma sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:201, desde que, pelo menos, um aminoácido em uma posição Kabat selecionada do grupo consistindo de L2, Lil, L12, L25, L26, L30, L46, L53, L60, L61, L67, L68, L76, L80, L81, L85, e L87 é substituído com outro aminoácido.

Esse anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode exibir maior estabilidade térmica que um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:201.

Em uma forma de realização particular, o anticorpo para CD70, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:178 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições de Kabat selecionados do grupo consistindo de H6, H18, H24, H31, H56, H74, H74, H77, H79, H83, H84, H89, H93, H94, H108, H110, e H112; e b) um domínio variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:201 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições de Kabat selecionada do grupo consistindo de L2, Lil, L12, L25, L26, L30, L46, L53, L60, L61, L67, L68, L76, L80, L81, L85, e L87 .

Esse anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de reivindicação 24, pode exibir maior estabilidade térmica que um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 178 e um domínio variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:201.

Utilidade terapêutica de anticorpos para CD70

Os anticorpos para CD70, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, providos aqui podem ser usados para inibir o crescimento de células de tumor cancerígeno in vivo e são, portanto úteis no tratamento de cânceres de expressão de CD70. Consequentemente, outros aspectos da invenção referem- se a métodos de inibir o crescimento de células de tumor em um paciente humano, e também métodos de tratar ou prevenir câncer, que compreendem administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo para CD7 0 ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito aqui.

Outro aspecto da invenção provê um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito aqui para uso inibindo o crescimento de células de tumor expressando CD70 em um paciente humano.

Ainda outro aspecto da invenção provê um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito aqui para uso no tratamento ou prevenção câncer em um paciente humano. Cânceres preferidos dos quais o crescimento pode ser inibido usando os anticorpos para CD70 descritos aqui incluem câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula renal), câncer de mama, tumores de cérebro, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não de Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primário, linfoma de célula T) , carcinomas de nasofaringe, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metástico), câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tiróide, câncer da glândula paratiróide, câncer da glande adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos de infância, câncer do bexiga, câncer do rim ou uretra, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), angiogênese de tumor, tumor de eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, carcinoma epidermóide, câncer de células escamosas, mesotelioma. Os anticorpos para CD70 descritos aqui podem também ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico caracterizado pela presença de células de tumor expressando CD70 incluindo, por exemplo, carcinomas de célula renal (RCC), tais como RCC de célula clara, glioblastoma, câncer de mama, tumores de cérebro, carcinomas nasofarangeais, linfoma não de Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de Burkitt, linfornas de grandes células anaplásicos (ALCL), mieloma múltiplo, linfomas cutâneos de células T, linfornas de células pequenas clivadas nodulares, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfomas de célula T (ATLL), leucemia de células T de adulto (T-ALL), cânceres de linfomas foliculares entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas difusos de células grandes de linhagem B, linfadenopatia angioimunoblástico (AILD) como linfoma de célula T, linfomas baseados em cavidade corporal associada a HIV, carcinomas embrionários, carcinomas não diferenciados do rino-faringe (por exemplo, tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de célula de manto e outros linfomas de células B. Formas de realização específicas referem-se a tratamento de qualquer um dos cânceres listados acima com um anticorpo compreendendo o Fab derivado de lhama 27B3, ou uma de suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12 (ARGX-110). Em particular, qualquer um dos cânceres listados acima podem ser tratados usando um anticorpo compreendendo as regiões Fab de 41D12 (variante germinalizada de 27B3) fusionadas às regiões constantes de IgGl humana. Na última forma de realização, a região constante de IgGl humana pode ser ainda engenheirada a fim de maximizar funções efetoras de anticorpo (por exemplo, por adição de mutações de ponto) , ou o anticorpo de IgGl de 41D12 pode ser não fucosilado, novamente para aumentar função efetora de anticorpo. Como já salientado, os anticorpos para CD70 descritos aqui, particularmente 27B3 e suas variantes germinalizadas, exibem particularmente forte ligação a linhagens de células de câncer humano que expressam CD70 de superfície celular em baixo número de cópias, tais como, por exemplo, a linhagem celular SU-DHL-6 de linfoma de célula B grande, uma linhagem celular JVM-2 de leucemia linfocítica crônica, a linhagem celular HH de linfoma de célula T cutâneo, a linhagem celular MKN-45 de carcinoma gástrico, as linhagens de células A549 e EBC-1 de carcinoma de pulmão, as linhagens de células WM852 e WM793 de melanoma, a linhagem celular GaMG de glioblastoma e as linhagens de células OAW-42, SKOv3 e OVCAR3 de carcinoma ovariano. De fato, a afinidade de 41D12 (ARGX-110) para essas linhagens de células de câncer de número de cópias baixo é significantemente maior que anticorpos comparadores de técnica anterior, tal como SGN70 e MDX1411.

A afinidade "melhorada" para linhagens de células de câncer de número de cópias baixo é de relevância direta para tratamento clínico dos cânceres correspondentes, como demonstrado pelos experimentos celulares nos exemplos acompanhantes. Quando células de um linhagem celular de número de* cópias baixo (por exemplo, a linhagem celular SU- DHL-6 de linfoma difuso de célula B grande) são salpicadas em PBMCs. recentemente isolados de doadores saudáveis, células da linhagem celular de câncer são preferencialmente depletadas pelo anticorpo para CD70 ARGX-110 de exemplo. Consequentemente, outro aspecto da invenção refere-se a um método de tratar ou prevenir câncer, que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito aqui, em que o câncer é um câncer que exibe expressão de número de cópia baixo de CD70.

A invenção também provê um anticorpo para CD70 ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito aqui para uso no tratamento ou prevenção câncer em um paciente humano, em que o câncer é um câncer que exibe expressão de número de cópia baixo de CD70.

Em cada desses aspectos o câncer de número de cópias baixo é preferivelmente selecionada do grupo consistindo de: linfoma de célula B grande, leucemia linfocítica crônica, linfoma de célula T cutâneo, câncer gástrico, câncer de pulmão, melanoma, glioblastoma e câncer ovariano. Formas específicas de realização referem-se a tratamento de cânceres de número de cópias baixo com um anticorpo compreendendo o Fab derivado de lhama 27B3, ou uma de suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12 (ARGX-110). Em particular, qualquer um dos cânceres de número de cópias baixo listados acima podem ser tratados usando um anticorpo compreendendo as regiões Fab de 41D12 (variante germinalizada de 27B3) fusionado às regiões constantes de IgGl humana. Os anticorpos para CD70 descritos aqui são também úteis para o tratamento de distúrbios imunológicos caracterizados por expressão de CD70. Exemplos específicos de tais distúrbios imunológicos incluem os seguintes: artrite reumatóide, doenças desmielinizantes auto-imunes (por exemplo, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica), 14 5 oftalmopatia endócrina, uveoretinite, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia gravis, doença de Grave, glomerulonefrite, distúrbio hepatológico auto-imune, doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa, doença celíaca), anafilaxia, reação alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes melito tipo I, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, fibromialgia, polimiosite, dermatomiosite, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, uveíte auto-imune, doença de Addison, adrenalite, tiroidite, tireoidite de Hashimoto, doença autoimune da tiróide, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatite crônica, hepatite lúpica, aterosclerose, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressier, trombocitopenia auto-imune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, dermatite herpetiforme, alopecia areata, penfigóide, esclerodermia, esclerose sistêmica progressiva, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade auto-imune masculina e feminina, espondilite anquilosante, colite ulcerosa, doença mista do tecido conjuntivo, poliartrite nodosa, vasculite necrosante sistêmica, dermatite atópica, rinite atópica, Síndroma de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, síndrome antifosfolípide, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Gushing, hepatite crônica ativa auto-imune, pulmão de criadores de pássaros, necrólise epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reação transfusional, arterite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomose, arterite de células gigantes, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatóide, doença de Behçet, síndrome de Caplan, Doença de Kawasaki, dengue, encefalomielite, endocardite, endomiocardiofibrose, endoftalmite, eritema tipo elevatum e diutinum, psoríase, eritroblastose fetal, fasceíte eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariase, ciclite, ciclite crônica, ciclita heterocrônica, ciclite de Fuch, nefropatia por IgA, púrpura Henoch- Schonlein, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplantes, cardiomiopatia, síndrome de Eaton-Lambert, policondrite recidivante, crioglobulinemia, síndrome de Evan, e falha gonadal auto-imune, distúrbios de linfócitos B (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatóide, e diabetes tipo I) , Linfócitos Thl (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, tuberculose, ou doença do enxerto versus hospedeiro), ou linfócitos Th2 (por exemplo, dermatite atópica, lúpus eritematoso sistêmico, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistêmica, ou crônica do enxerto versus hospedeiro), síndrome de Strauss Churg, - poliangite microscópica e arterite de Takayasu.

Formas específicas de realização referem-se a tratamento de qualquer um dos distúrbios imunológicos listados acima com um anticorpo compreendendo o Fab derivado de lhama 27B3, ou uma de suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12 (ARGX-110). Em particular, qualquer um dos cânceres listados acima podem ser tratados usando um anticorpo compreendendo as regiões Fab de 41D12 (variante germinalizada de 27B3) fusionadas às regiões constantes de IgGl humana. Na última forma de realização, a região constante de IgGl humana pode ser ainda engenheirada a fim de maximizar funções efetoras de anticorpo (por exemplo, por adição de mutações de ponto), ou o anticorpo de IgGl de 41D12 pode ser não fucosilado, novamente para melhorar função efetora de anticorpo. Como usado aqui, o termo "tratar" ou "tratamento" significa diminuir, interromper, prender, controlar, melhorar, parar, reduzir severidade de um sintoma, doença, condição ou doença, mas não necessariamente envolve uma eliminação total de todos os sintomas relacionados com a doença, condições ou distúrbios. Para uso terapêutico humano os anticorpos para CD70 descritos aqui podem ser administrados a um indivíduo humano em necessidade de tratamento em uma "quantidade efetiva". O termo "quantidade efetiva" refere-se à quantidade ou dose de um anticorpo para CD70 que, em administração de dose simples ou múltipla a um paciente humano, provê eficácia terapêutica no tratamento de doença. Quantidades terapeuticamente efetivas do anticorpo para CD70 podem compreender uma quantidade na faixa a partir de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por dose simples. Uma quantidade terapêutica efetiva para qualquer paciente individual pode ser determinado pelo profissional de saúde monitorando o efeito do anticorpo para CD70 em um biomarcador, tal como superfície celular CD70 em tecidos de tumor, ou um sintoma tal como regressão de tumor, etc. A quantidade de anticorpo administrado em qualquer dado ponto de tempo pode ser variado de modo que quantidades ótimas de anticorpo para CD70, se empregado sozinho ou em combinação com qualquer outro agente terapêutico, são administrados durante o curso de tratamento. É também contemplado administrar os anticorpos para CD70 descritos aqui, ou composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos, em combinação com qualquer outro tratamento de câncer, como uma terapia de combinação.

Uso de anticorpos que são pobremente internalizados para depletar células expressando CD70

Uma descoberta surpreendente descrita aqui é que anticorpos para CD70 ligados a CD70 expressados sobre a superfície de linhagens de células de câncer são pobremente internalizados. Isso é um resultado surpreendente, uma vez que a técnica anterior previamente descreveu CD70 como um "alvo internalizante". Embora exista variação entre diferentes tipos de célula de câncer no grau preciso de internalização de anticorpos para CD70 ligados, nenhum tipo de célula de câncer é observado para "completamente internalizar" o anticorpo para CD70 ligado. Por exemplo, linhagens de células de câncer renal previamente descritas como rapidamente internalizando de fato são mostradas para internalizar um máximo de cerca de 70% de anticorpo ligado ARGX-110. Muitas outras linhagens de células de câncer internalizam menos que 30%, menos que 20% ou ainda menos que 10% de ARGX-110 ligado.

A variação em grau de internalização entre diferentes linhagens de células de câncer é amplamente dependente de indicação de doença, com resultados similares sendo observados usando diferentes anticorpos para CD70. Entretanto, a pobre internalização em certas linhagens de células é particularmente aparente quando usando o anticorpo ARGX-110. O grau baixo observado de internalização em muitas células de câncer provê uma análise racional para uso de anticorpos para CD70 com forte função efetora a fim de depletar (por exemplo, matar ou inibir o crescimento de) células de câncer in vivo. Uma vez que anticorpos ligados de CD70 são relativamente pobremente internalizados em muitas células de câncer, o anticorpo permanecerá ligado à superfície celular e pode, portanto, disparar funções efetoras (ADCC, CDC, ADCP) por interações com o sistema imune de um paciente humano. Consequentemente, outro aspecto importante da invenção refere-se a um método de depletar célula expressando CD70 em um paciente humano, compreendendo administrar ao referido paciente uma quantidade efetiva de um anticorpo que se liga a CD70 humano, em que referida célula expressando CD70 exibem 3 0% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos internalização de referido anticorpo após um período de 6 horas, e em que referido anticorpo exibe pelo menos um função efetora selecionada do grupo consistindo de ADCC, CDC e ADCP.

Nesse método, o anticorpo para CD70 (com funções efetoras ativas) é usado para depletar células expressando CD70. Essa depleção de célula expressando CD70 pode formar a base de tratamento terapêutico ou profilático, por exemplo, para tratamento de prevenção de cânceres de expressão de CD70, ou para tratamento de prevenção de distúrbios imunológicos associados a CD70. 0 mecanismo preciso por que anticorpos expressando CD70 são depletadas pode depender do tipo de funções efetoras exibidas pelo anticorpo para CD70, mas será dependente em forte (elevada afinidade) ligação do anticorpo para CD70 a CD70 de superfície celular, acoplada com pobre internalização do anticorpo ligado.

Em certas formas de realização as células expressando CD70 são células de câncer expressando CD70. Em particular, as células de câncer expressando CD70 podem ser de um tipo de câncer selecionado do grupo consistindo de: linfoma de Burkitt, linfoma de célula B grande, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, linfoma de célula de manto, leucemia linfocítica crônica, carcinoma pancreático, carcinoma gástrico, glioblastoma e carcinoma de pulmão. Linhagens de células derivadas de cada um desses cânceres foram demonstradas para internalizar 30% ou menos de anticorpo para CD70 ligado sobre um período de 6 horas. Em outra forma de realização células de câncer expressando CD70 podem ser de um tipo de câncer selecionado do grupo consistindo de: linfoma Burkitt, linfoma de célula B grande, linfoma de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, linfoma de célula de manto, leucemia linfocítica crônica, carcinoma gástrico, glioblastoma e carcinoma de pulmão. Linhagens de células derivadas de cada desses cânceres foram demonstradas para internalizar 20% ou menos de anticorpo para CD70 ligado durante um período de 6 horas. Em outra forma de realização células de câncer expressando CD70 podem ser de um tipo de câncer selecionado do grupo consistindo de: linfoma Burkitt, linfoma de célula B grande, linfoma de célula de manto, leucemia linfocítica crônica, carcinoma gástrico e carcinoma de pulmão. Linhagens de células derivadas de cada um desses cânceres foram demonstradas para internalizar 10% ou menos de anticorpo para CD70 ligado durante um período de 6 horas.

Em outras formas de realização as células expressando CD70 podem ser células T ativadas expressando CD70, que não exibem qualquer internalização de anticorpo adequada ligados de CD70 (especificamente nenhuma internalização de ARGX-110 é observada durante um período de 6 horas. Essa observação que anticorpos para CD70 ligados não são internalizados por células T ativadas de CD70+ é fortemente sustentadora do uso de anticorpos para CD70 com forte função efetora (ADCC, CDC ou ADCP), incluindo mas não limitado a ARGX-110, no tratamento de doenças imunológicas mediadas por células T ativadas de CD70+, incluindo doenças autoimunes tal como, por exemplo, artrite reumatóide, psoríase, SLE, etc.

As formas de realização listadas acima podem utilizar essencialmente qualquer anticorpo para CD70. Em formas específicas de realização o anticorpo pode ser qualquer anticorpo para CD70 que foi mostrado experimentalmente para exibir 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos internalização após um período de 6 horas em uma linhagem celular de câncer expressando CD70 selecionada do grupo consistindo de Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Mecl, JVM-2, MKN-45, A549, U87MG, PANC-1, PANC-89, L428, Granta 519, Rec-1 e EBC-1. Em efeito, o ensaio de internalização de linhagem celular descrito nos exemplos acompanhantes pode ser usado como uma triagem, ambos para determinar se indicações de doença particulares devem ser objetivas com anticorpos para CD70 tendo forte função efetora, ou com conjugados de anticorpo CD - fármaco (discutidos abaixo), e também para identificar anticorpos para CD70 adequados para uso em tratamento de indicações de doença particulares. Consequentemente, a invenção também provê um método de depletar células de câncer expressando CD70 em um paciente humano, compreendendo administrar para referido paciente uma quantidade efetiva de um anticorpo que se liga a CD7 0 humano, em que referido anticorpo exibe 30% ou menos internalização após um período de 6 horas em uma linhagem celular de câncer expressando CD70 selecionada do grupo consistindo de Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Mecl, JVM-2, MKN-45, A549, U87MG, PANC-1, PANC-89, L428, Granta 519, Rec- 1 e EBC-1, e em que referido anticorpo exibe pelo menos um função efetora selecionada do grupo consistindo de ADCC, CDC e ADCP. Em uma forma de realização o anticorpo a ser usado para depletar células de câncer expressando CD70 em um paciente humano pode ser um anticorpo que exibe 10% ou menos internalização durante um período de 6 horas em uma linhagem celular de câncer expressando CD70 selecionada do grupo consistindo de Raji, SU-DHL-6, Granta 519, Rec-1, Mecl, JVM- 2, MKN-45, A549 e EBC-1, e também exibe pelo menos um função efetora selecionada do grupo consistindo de ADCC, CDC e ADCP. Formas específicas de realização desse aspecto da invenção podem utilizar qualquer um dos anticorpos para CD70 descritos aqui, que ligam CD70 humano com afinidade extremamente elevada. Formas de realização preferidas podem utilizar um anticorpo compreendendo o Fab derivado de lhama 27B3, ou uma de suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12 (ARGX-110). As formas de realização particularmente preferidas utilizam um anticorpo compreendendo as regiões Fab de 41D12 (variante germinalizada de 27B3) fusionadas às regiões constantes de IgGl humana. Na última forma de realização, a região constante de IgGl humana pode ser ainda engenheirada a fim de maximizar funções efetoras do anticorpo (por exemplo, por adição de mutações de ponto) , ou o anticorpo IgGl - 41D12 pode ser não fucosilado, novamente para acentuar a função efetora de anticorpo.

Uma vez que a análise racional atrás do uso de anticorpos para CD70 pobremente internalizantes para depletar células expressando CD70 se baseia em funções efetoras de anticorpo, é preferido que os anticorpos usados nesse aspecto da invenção não sejam imunoconjugados em que o anticorpo para CD70 é ligado a um agente farmacêutico, agente citotóxico, agente citostático, porção de fármaco, etc. De fato, uma vantagem particular desse aspecto da invenção é evitar a necessidade de usar conjugados de anticorpo - fármaco, que é desejável tanto de uma perspectiva de segurança de paciente (evita administração de agentes potencialmente tóxicos) como de uma perspectiva econômica (evita síntese cara de conjugados de anticorpo - fármaco). üso de conjugados anticorpo - fármaco para matar células com anticorpos para CD7 0 com significante internalização É demonstrado nos presentes exemplos que existem significantes diferenças célula a célula no grau de internalização de anticorpos para CD70, e que essas diferenças são amplamente dependentes do tipo celular, ao invés da natureza do anticorpo para CD70 (embora diferenças sejam particularmente marcadas quando usando o anticorpo ARGX-110). Para aqueles tipos de células que exibem um grau significante de internalização de anticorpo para CD70 ligado, isto é 30% ou mais, preferivelmente 40% ou mais, mais preferivelmente 50% ou mais, ou ainda 60% ou mais internalização após 6 horas, uma estratégia terapêutica alternativa pode ser baseada no uso de conjugados anticorpo para CD70 - fármacos. Consequentemente, outro aspecto importante da invenção refere-se a um método de depletar células expressando CD70 em um paciente humano, compreendendo administrar ao referido paciente uma quantidade efetiva de um conjugado anticorpo - fármaco compreendendo um anticorpo que se liga a CD70 humano e uma porção de fármaco citotóxico ou citoestático, em que referida célula expressando CD70 exibe 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, ou 60% ou mais internalização de referido anticorpo que se liga a CD70 humano após um período de 6 horas.

Em formas específicas de realização as células de expressão de CD70 podem internalizar entre 40% e 70%, preferivelmente entre 50% e 70% do anticorpo para CD70 que forma a base do conjugado anticorpo - fármaco dentro de um período de 6 horas. Nesse método, o conjugado anticorpo para CD70 fármaco é usado para depletar células de expressão de CD70. Essa depleção de célula expressando CD70 pode formar a base de tratamento terapêutico ou profilático, por exemplo, para tratamento de prevenção de cânceres de expressão de CD70, ou para tratamento de prevenção de distúrbios imunológicos associados a CD70. O mecanismo preciso por que anticorpos expressando CD70 são depletados pode depender na natureza do conjugado anticorpo - fármaco, isto é se a porção de "fármaco" é citotóxica ou citoestática, mas será dependente em forte ligação (elevada afinidade) do anticorpo para CD70 para CD70 de superfície celular, acoplada com significante internalização do anticorpo ligado.

Em certas formas de realização as células expressando CD70 são células de câncer expressando CD70. Em particular, as células de câncer expressando CD70 podem ser de um tipo de câncer selecionado do grupo consistindo de: linfoma de célula T cutâneo, mieloma múltiplo, carcinoma de célula renal, astroeitoma, melanoma e carcinoma ovariano. Linhagens de células derivadas de cada um desses cânceres foram demonstradas para internalizar mais do que 30% de anticorpo para CD70 ligado durante um período de 6 horas. Em outra forma de realização, as células de câncer expressando CD70 podem ser de um tipo de câncer selecionado do grupo consistindo de: carcinoma de célula renal, astrocitoma, melanoma e carcinoma ovariano. Linhagens de células derivadas de cada um desses cânceres foram demonstradas para internalizar mais do que 50% de anticorpo para CD70 ligado durante um período de 6 horas.

Em formas específicas de realização desse aspecto da invenção, o conjugado anticorpo - fármaco pode ser baseado em qualquer um dos anticorpos para CD70 descritos aqui, que ligam CD70 humano com afinidade extremamente elevada. Em formas de realização preferidas o conjugado anticorpo fármaco pode ser baseado em um anticorpo compreendendo o Fab derivado de lhama 27B3, ou uma de suas variantes germinalizadas, incluindo em particular 41D12. Os aspectos de conjugados de anticorpo - fármaco pretendidos para uso terapêutico humano são geralmente conhecidos na técnica, particularmente com respeito à natureza da porção de "fármaco", por exemplo, um agente citotóxico ou citoestático, e meios de conjugação da porção de fármaco à porção de anticorpo para CD70. Exemplos de fármacos de CD70 de conjugado de anticorpo são dados, por exemplo, em WO 2004/073656.

Composições farmacêuticas

O escopo da invenção inclui composições farmacêuticas, contendo um ou uma combinação de anticorpos para CD70 da invenção, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, formulados com um ou mais dentre veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos para CD70.

Técnicas para formular anticorpos para uso terapêutico humano são bem conhecidas na técnica e são revistas, por exemplo, em Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, ppl-26, 2007.

Incorporação por Referência

Várias publicações são citadas na descrição antecedente e do início ao fim dos seguintes exemplos, sendo cada incorporado por referência aqui em sua totalidade.

Exemplos

A invenção será ainda entendida com referência aos seguintes exemplos experimentais não limitantes.

Exemplo 1: Imunização de lhamas

Imunizações de lhamas e coleta de linfócitos de sangue periférico (PBLs) bem como a subsequente extração de RNA e amplificação de fragmentos de anticorpo foram efetuadas como descrito por De Haard e colaboradores (De Haard H, et al., J. Bact. 187:4531-4541, 2005). Dois lhamas foram imunizados com células expressando CD70 786-0 (ATCC-CRL-1932) e dois lhamas com células expressando CD70 Raj i (ATCC-CCL-86) . Células foram preparadas recentemente para cada imunização e foram verificadas para expressão de CD70 por análise de FACS. Os lhamas foram imunizados com aproximadamente 107 células vivas injetadas intramuscularmente no pescoço, uma vez por semana por seis semanas. Ajudante incompleto de Freund foi injetado nos músculos de pescoço poucos centímetros afastados do sítio de imunização celular.

Amostras de sangue de 10 ml foram coletadas pré- e pós imunização para investigar a resposta imune. Os soros dos lhamas foram testados para a presença de anticorpos contra CD70 recombinante (Flag-TNC-CD70) por ELISA antes de (dia 0) e após (dia 55 ou 69) imunização. Deve ser notado que como anticorpo de detecção o IgGl/2 anti-lhama de cabra (Bethyl, A160-100P) foi usado que não discrimina entre anticorpos de cadeia convencional e pesada, significando que a resposta de CD70 medida é do IgG total. Os resultados são mostrados em Figura 1. Três a quatro dias após a última imunização, 4 00 ml sangue foram coletados para extração de RNA total dos PBLs usando um Gradiente Ficoll-Paque para isolar PBLs e o método descrito por Chomczynski P, et al., Anal. Biochem. 162: 156- 159, 1987 para preparar o RNA. Em média, rendimentos de RNA de 450 μg foram conseguidos, dos quais uma alíquota de 80 μg foi usada para síntese aleatória de cDNA e subsequente amplificação de segmentos de gene de VHCH1, VÜCOe VÜCÜ.

Exemplo 2: Construção de biblioteca

Independentes bibliotecas VÀCÀ e VKCK foram construídas usando um PCR de duas etapas, em que 25 ciclos com iniciadores não etiquetados foram feitos seguido por 10 ciclos usando versão etiquetada desses iniciadores (De Haard H, et al., Biol. Chem. 274, 1999). As bibliotecas VHCH1 foram construídas em paralelo usando a mesma abordagem. Os tamanhos das bibliotecas individuais estavam entre 107 e 1010 cfu. Em seguida, a cadeia leve das bibliotecas VÀCÀ e VKCK foram re-clonadas separadamente no vetor de expressão de VHCH1 para criar a biblioteca de Fab de lhama "Lambda" e "Kappa" respectivamente. Alternativamente os amplicons de VHCH1 digeridos foram diretamente clonados nas bibliotecas VQCD e VÜCÜ evitando a construção de uma biblioteca de VHCH1 separada. 0 embaralhamento da cadeia leve geralmente fornece melhores variantes de afinidade do que ocorre com o embaralhamento de cadeia pesada, os requerentes escolheram gerar bibliotecas de cadeia leve pré-clonadas e diretamente clonar os amplicons de cadeia pesado nesses repertórios primários.

As bibliotecas de exibição de fagos final estavam entre 5xl08 e 2xl09 cfu.zControle de qualidade das bibliotecas por análise de porcentagem de Fab de comprimento completo contendo clones foi rotineiramente efetuado usando PCR.

Exemplo 3: Seleções e triagem

Duas a três seções de seleções de fago foram feitas em que CD70 recombinante capturado (Flag-TNC-CD70) ou em CD70 diretamente revestido usando protocolos padrão. Eluição de fago ligado foi feita com tripsina.

A partir de fago selecionado transfectado em TG1, colônias individuais foram escolhidas aleatoriamente para crescimento em placas de 96 cavidades. Após indução de IPTG de acordo com protocolos padrões, frações periplásmicas (peris) contendo Fabs foram preparadas. Em todas as seleções e para todos os quatro lhamas, vários clones foram encontrados que foram aptos a expressar Fabs capazes de inibir a interação entre CD27 e CD70 como determinado pelo ELISA DE INIBIÇÃO (Figura 2 e 3) . Nesse teste, Flag-TNC-CD70 é capturado por um mAb de anti-Flag e ligação de CD27-Fc é detectada através de mAb de anti-CD27 biotinilado e strep- HRP na ausência ou presença de Fabs de CD70 (Figura 2 e 3) ou mAbs para CD70 (Figura 4) . Em Figura 2B pode ser visto que 27B3, que tem um VH idêntico como 9D1, mas contém uma cadeia leve de alguma forma diferente, parece bloquear a ligação de CD27 a CD70 mais eficientemente, que estava em linha com a melhor taxa de dissociação desse Fab como medido em Biacore (dados não mostrados). Tabela 3 indica a potência de bloqueio (expressada como IC50) para os vários mAbs quiméricos de lhama-humano testados em ELISA DE INIBIÇÃO de CD70. Fab 27B3 tem um IC50 de cerca de 0,4 nM, que ainda parece melhorar em formatar em um rendimento de IgGl humana- Ihama quimérica com IC 50 de 0,25nM, considerando que mAb 9D1 com a outra cadeia leve é 3 vezes menos potente (0,73 nM). Figura 3 é um compósito de um experimento testando Fabs de CD70 de lhama para bloquear a atividade (ELISA DE INIBIÇÃO, ver barras brancas) e para ligação de CD7 0 (ELISA DE LIGAÇÃO, barras pretas). Para ELISA DE LIGAÇÃO, Flag-TNC- CD70 é capturado por um mAb de anti-Flag e ligação dos Fabs é detectada usando um mAb de anti-myc-HRP, que reconhece a etiqueta MYC fusionada a C-término do fragmento de Fd. Para propósitos de comparação, anticorpos monoclonais conhecidos para CD70 (SGN70 descrito em US 2010/0129362 Al, clone 1F6; e MDX69A7 descrito em W02008/074004 Figura 5A e 5B) foram testados em paralelo. Muitos Fabs derivados de clones de lhama foram identificados que demonstram ligação pura em ELISA e são não bloqueantes (ver Figura 3- por exemplo, clones de Fab 45H8, 45C4, 46A2, 46G7, 46E4, 46F12 e 46G12). De interesse é o clone 59D10 que, como Fab, não tem atividade de bloqueio, mas quando convertido em uma IgG quimérico foi antagonístico (ver Tabela 3) . Sequências de aminoácidos dos domínios de VH e VL de ligação e Fab de bloqueio derivado de clones de lhama são mostrados em outra parte aqui (Tabelas 6 - 9) . Tabela 3: Potência de bloqueio expressada como IC50 (ng/ml) para anticorpos SIMPLE individuais (mAbs) e marcas de referência SGN70 e MDX69A7 como medido em ELISA DE INIBIÇÃO de CD70 usando CD70 humano recombinante.

mAbs 27B3 e 57B6 foram também testados para sua capacidade para inibir a interação entre CD70 de reso recombinante (FLAG-TNC-CD70 de reso) e CD27. O valor de IC50 5 determinado por ELISA de inibição descrita acima foi 150 e 135 ng/ml, respectivamente.

Exemplo 4: Afinidade para CD70 humano e de reso

Taxas de dissociação dos Fabs de bloqueio anti-CD70 derivados de lhama purificados foram determinadas usando o 10 Biacore. CD70 humano recombinante foi imobilizado em um chip CM5 Biacore. A imobilização foi efetuada de acordo com um método fornecido por Biacore e usando o kit NHS/EDC (Biacore AB) : após ativação do chip, uma solução de 50 μg/ml de CD70 recombinante em lOmM tampão de acetato com pH de 5 foi 15 preparada e 1 μl dessa solução (50ng) foi injetado resultando em uma densidade de superfície de aproximadamente 1000 RU. Fabs para os mAbs para CD70 ARGX-110, MDX2H5 e SGN70 foram preparados por digestão de tripsina (SGN70 e MDX69A7 são descritos em algum local aqui, MDX2H5, também referido como MDX1411, é descrito em W02008/074004 Figura IA e 1B) . Fabs, em uma concentração de aproximadamente 100-400μg/ml, foram diluídos 6 vezes em solução salina tamponada de hepes (0,1M Hepes, 1,5M NaCl, 3 0mM EDTA, 0,5% em volume de sobrenadante P20) . Eles foram injetados (3 0μl) e passados através das células de fluxo em uma taxa de fluxo de 3 0μl/min. Após ligação do Fab a CD70, a taxa de dissociação foi monitorada por um período de 10 minutos. Após a dissociação, as superfícies celulares de fluxo foram regeneradas injetando 5μl de lOmM NaOH. Algumas vezes múltiplas injeções de NaOH foram necessárias para regenerar as superfícies dependendo na afinidade dos Fabs. Análise de taxa de dissociação foi feita aplicando o software BIAevaluation. Primeiro, o sensograma dos ciclos em branco foi subtraído desses obtidos com a célula de fluxo revestida. Então a taxa de dissociação foi determinada para uma faixa de tempo de 10 minutos usando a aplicação de cinética de ajuste e o valor de Ka foi calculado. Ademais, a taxa de dissociação de CD27 para CD70 foi também determinada. As taxas de dissociação são resumidas em Tabela 4 .

Todos os Fabs derivados de lhama testados ligam com taxas de dissociação aparentes muito baixas (isto é, elevada afinidade) a CD70 recombinante humano e a CD70 de reso recombinante baseado em taxas de dissociação Biacore na faixa de 0,4-4,8 x IO'4 s'1. As taxas de dissociação do Fab 5 derivado de lhamas para CD70 humano são muito melhores que para a Fabs derivados de mAb de referência (7-30 x 10-4 s-1) . Os Fabs derivados de lhama com as melhores taxas de dissociação foram mostrados para ter taxas de dissociação comparáveis às de CD27 para sua interação com CD70 (0,8 x 10 10'4 s'1) . Deve ser notado que o menor limite para medição de taxas de dissociação usando Biacore é em torno de 0,4 x 10*4 s'1. Por isso os Fabs derivados de lhama com taxas de dissociação caindo próximas a esse limite como avaliado por Biacore podem, de fato, exibir ainda uma maior afinidade 15 para CD70. Tabela 4: Taxas de dissociação de Fabs derivados de lhama e Fabs de referência para CD70 humano ou de reso

Exemplo 5: Ligação de mAbs CD70 lhama-humano quimérico para células positivas para CD70 Os VH e VL de clones de Fab derivados de lhama de 5 interesse foram fusionados a regiões constantes de IgGl humana e a Cü humano (todas regiões de cadeia leve variável são de origem de lambda) e produzidos como anticorpos quiméricos monoclonais bivalentes no sistema descrito em pedido de patente WO 2009/145606. Os mAbs de lhama-humano 10 quimérico foram purificados em proteína A seguido por filtração em gel. Células 786-0 foram incubadas com uma série de diluição 1/5 de CD70 de lhama quimérico inibindo mAbs (20 μg/ml - 0,25 ng/ml) e ligação dos mAbs às células foi detectada usando um anticorpo Fc-FITC anti-humano (conjugado AF006 diluído 1/500 a partir do fornecedor Binding Site). Fluorescência de 10.000 células/condição foi medida usando um citômetro de fluxo e a fluorescência mediana foi traçada em gráfico. Os resultados são mostrados em Figura 5. Maioria dos mAbs liga com elevada afinidade a células 786-0. Anticorpo 1C2 SIMPLE, que como Fab mostrou ter a melhor taxa de dissociação e potência de bloqueio, não foi apto para reconhecer CD70 expressado de superfície celular (dados não mostrados) e portanto não foi além disso estudado. Anticorpo 27B3 SIMPLE tem a melhor afinidade para receptor ligado de célula com um EC50 de 0,24 nM.

Em outro experimento, células MHH-PREB-1 derivadas de NHL (105 células) foram incubadas com um gradiente de concentração de CD70 de lhama quimérico inibindo mAbs (20 μg/ml- 0,25 ng/ml) e ligação dos mAbs às células foi detectada usando anticorpo IgG-FITC anti-humano. Os resultados são mostrados em Figura 5B. Os valores de EC50 para 57B6 e 59D10 foram 83 e 74 ng/ml, respectivamente.

Exemplo 6: Inibição em experimentos de co-cultura por mAbs para CD70 lhama-humano quimérico

A fim de determinar a potência de bloqueio em um teste baseado em células, o sistema descrito por Wyzgol e colegas foi usado (J Immunol (2009) 183: 1851 - 1861). Linhagem celular HT1080 de fibrosarcoma transfectada com CD27 humano secreta IL-8 em ligação com CD70 recombinante trimérico e o bloqueio dessa interação com urn mAb neutralizante pode ser medido por níveis de citocina reduzidos. Uma versão modificada do teste foi aplicada em que a linhagem celular de linfoma Raji de célula B serviu como fonte de CD70, embora a molécula seja expressada na superfície celular e, portanto, mais relevante que CD70 solúvel. Células Raji foram cultivadas e verificadas para expressão de CD70 por análise de FACS. Células foram então misturadas em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades (50.000 células/cavidade) com os mAbs anti-CD70 e incubadas a RT durante 1 hora. Células HI1090-CD27 foram adicionadas (10.000 células/cavidade) e completamente misturadas. Co- culturas foram transferidas para a incubadora e cultivadas durante a noite a 37 °C. Sobrenadantes foram coletados e analisados para seu teor de IL-8 por ELISA. Os resultados para os anticorpos SIMPLE são mostrados em Figura 6 e são comparados a mAbs para CD7 0 de referência. Valores de IC50 para mAbs para CD70 lhama-humano quimérico estão entre 3 e 517 ng/ml como comparado a 4 2 ng/ml para SGN7 0 e 14 3 ng/ml para MDX69A7 (ver Tabela 5). Anticorpos 27B3 SIMPLE (IC50 de 33 pM) e 9G2 (IC50 de 20 pM) são 10 a 20 vezes mais potentes que marca de referência SGN70 (IC50 de 370 pM) que novamente é 3 vezes mais potente que marca de referência MDX69A7 (1 nM) . Pode, portanto, ser concluído que mAbs de lhama-humano quimérico são extremamente potentes em bloquear a interação entre CD27 e CD70 e apresentam um desempenho maior do que os anticorpos de marca de referência nesse bioteste altamente 5 relevante. Tabela 5: Neutralização da potência expressada como valor de IC50 (ng/ml) de mAbs para CD70 lhama-humano quimérico e mAbs de referência testados em ensaio de co- cultura baseado em Raji

Exemplo 7; Atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo

Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) foi medida usando o teste de liberação de Cr51 padrão, que foi descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192) . Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram purificadas de sangue total heparizinado por separação em ficoll padrão e foram usadas como fonte de células NK (isto é células efetoras). Sangue de vários doadores independentes foi usado. As células foram colocadas em suspensão a 2xl06 /ml em meios contendo 200 U/ml de IL humano -2 (para estímulo de células NK) e incubadas durante a noite a 37°C. O dia seguinte, células aderentes e não aderentes foram coletadas e lavadas uma vez em meios de cultura. As células alvos foram células 786-0 (RCC) e foram rotuladas com Cr51. Alvo para razão de célula efetora foi 1:20 e a incubação foi efetuada por 2 horas com o anticorpo presente em diferentes concentrações no meio de cultura. MAbs de lhama-humano quimérico bem como os anticorpos de marca foram testados para atividade de ADCC em células 786-0 em diferentes concentrações.

A lise percentual foi determinada pela equação: % Lise= (CPM de amostra~CPM de liberação espontânea) / (CPM de liberação máxima- CPM de liberação espontânea)xl00.

Os resultados demonstram que todos mAbs de lhama-humano quimérico induzem lise de células alvos através de atividade de ADCC (Figura 7) . mAb 27B3 SIMPLE tem uma potência de cerca de 1 μg/ml e portanto é 10 vezes mais potente que a variante 9D1 de afinidade que tem um IC5 0 comparável como marca de referência SGN70, que novamente é 2,5 vezes mais potente em ADCC que marca de referência MDX69A7. Anticorpo 27B3 SIMPLE combina melhor em potência de bloqueio de receptor de classe - ligando com superior potência de ADCC e, portanto, tem um perfil terapêutico favorável.

Exemplo 8: Potência de citotoxicidade dependente de complemento de mABs específicos para CD70

Propriedades de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) dos anticorpos foram determinadas no teste padrão descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192) . Em um primeiro experimento de controle, células U266 (MM) e MHH-PREB1 (NHL) foram testadas para a presença de antígeno de CD70 por análise de FACS. Em um experimento seguinte, mAb de CD70 de lhama quimérico foi testada para atividade de CDC em ambas linhagens de células em 3 diferentes concentrações e na presença de 3, 6 ou 9% soro humano (como uma fonte de complemento de humano) . Foi concluído que as células U266 deram a melhor razão de sinal/ruído na presença de soro a 9%.

Em um experimento seguinte, células U266 foram misturadas com mAbs de lhama-humano quimérico (Figura 8, painel superior) ou mAbs para CD70 de referência (Figura 8, painel inferior) em 0,001-20 μg/ml na ausência ou presença de 9% soro humano e incubadas durante 2h a 37°C. Células foram centrifugadas e iodeto de propídio foi adicionado para determinar o número de células mortas. Lise celular foi medida em FACS. Atividade de CDC foi demonstrada para todos os mAbs de lhama-humano quimérico em células U266 na presença de 9% soro humano. Anticorpo 27B3 SIMPLE tem IC50 similar como marca de referência SGN70, enquanto novamente MDX69A7 é 10 vezes menos potente.

Exemplo 9: Potência de fagocitose celular dependente de anticorpo

Para analisar propriedades de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) dos mAbs SIMPLE o teste descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192) foi implementado. Nesse teste, células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram purificadas de sangue total heparizinado por separação ficoll padrão. Sangues de diferentes doadores foram usados. Células foram incubadas em RPMI contendo 10% FCS em frasco de cultura de tecido durante a noite a 37°C. Células não aderentes foram removidas e células aderentes foram cultivadas para 15 dias em 75ml de meio X-VIVO 15 contendo 500 U/ml de rhGM-CSF (7,5 μg/ 75ml). Após 15 dias, células aderentes foram coletadas (macrófagos de derivados de monócitos (MDM). 8,0 x 104 Células alvos (células de 786-0) carregadas com corante vermelho PKH26 foram incubadas com mAb por 30 minutos em gelo em uma placa de 96 cavidades de fundo em V. Em seguida, 2,0 xlO4 células MDM foram adicionadas (alvo

para razão de efetora (786-0 a MDM) de 4:1) e após 1 hora de incubação a 37 °C, as células foram centrifugadas, recolocadas em suspensão em 100μl PBS 1% BSA e transferidas para uma placa de 96 cavidades de fundo em V. Anticorpo monoclonal Anti-CDllb (FITC conjugado) para coloração de macrófagos foi adicionado por 30 min enquanto mantendo as placas em gelo, células foram então lavadas dois tempos com PBS e fixadas com 1% paraformaldeído (em PBS) . Amostras foram analisadas por FACS, onde fagocitose foi pontuada em células coloridas duplas. Os resultados são mostrados em Figura 9 e esses demonstram que todos os mAbs de lhama- humano quimérico testados são potentes em induzir ADCP. Anticorpo 27B3 SIMPLE induz fagocitose de até 50% das células de tumor rotuladas por macrófagos em concentrações de 1 μg/ml com um IC50 de cerca de 100 ng/ml (0,4 nM).

Exemplo 10: Internalização de mAbs anti-CD70 em linhagem celular de tumor 786-0

Foi demonstrado que ligação de anticorpos para CD70 para a linhagem celular derivada de carcinoma renal 786- O resulta na rápida internalização (dentro de 1 hora) do complexo anticorpo-receptor (Adam et al., Br J Cancer (2006) 95:298 - 306). A fim de testar para internalização de anticorpos SIMPLE e mAbs de marca de referência dirigidos contra CD70, células 786-0 foram cultivadas em uma placa de microtitulação de 96 cavidades e incubadas durante a noite a 37 °C. 2,5 μg/ml mAb foi adicionado e incubado com as células por 0-24 horas a 37 °C. Placas foram lavadas 3 vezes 5' com tampão de extração (150mM NaCl, lOOmM Glicina, pH=2,5; codificado "IN" representando a quantidade de mAb internalizado através de CD70) ou PBS (codificado "OUT" e representando a quantidade de mAb ligado ao receptor no exterior da célula). Subsequentemente, células foram fixadas com 4% paraformaldeído para 30' em RT, lavadas com PBS, e incubadas 5' com 0,2% Triton-X-100 ("IN") ou PBS ("OUT"). Em seguida, células foram lavadas duas vezes e incubadas a RT por 10' com lOOmM glicina seguido por uma incubação de 30' com PBS+1%BSA. Finalmente células foram coloridas com Fc anti-humano de cabra (Jackson immunoresearch 109-005-098) e IRDYE800 anti-cabra (Li-cor 926-32214) antes de análise com o escâner infravermelho Li-Cor Odyssey. O anticorpo permanecendo no exterior da célula, isto é, não internalizado, é pontuado como MFI OUT médio em Figura 10. Os resultados demonstram que vários mAbs permanecem mais longos na superfície das células que os outros mAbs (sinal mais elevado). Entretanto, nenhum dos mAbs internaliza completamente: inicialmente (entre 0 e 2 horas), internalização mAb vai muito rápida, mas então parece que um estado estacionário é alcançado onde 30-40% do mAb permanecem no exterior da célula, mesmo após 24 horas de incubação a 37°C. Anticorpo 27B3 SIMPLE internaliza tão rapidamente quanto anticorpos de marcas de referência SGN70 e MDX69A7. É interessante observar que anticorpos SIMPLE 9E1 e 19G10, mas também outros, permanecem em níveis elevados no exterior das células, mesmo após 24 horas de incubação (painel inferior de Figura 10) . A fim de efetivamente induzir efeitos de ADCC, CDC e ADCP é importante que níveis elevados de anticorpos específicos de CD70 permaneçam no exterior das células de câncer alvo-marcadas a fim de recrutar as células efetoras imunes que são responsáveis por morte celular. Por outro lado rapidamente internalizando anticorpos têm potencial como conjugados anticorpo - fármaco (ADC).

Exemplo 11: Eficácia in vivo de mAbs de lhama-humano quimérico em um modelo de xenoenxerto de tumor

Para estabelecer doença disseminada, 106 células Raj i em 0,2 mL PBS foram injetadas na veia de cauda lateral de camundongos com imunodeficiência combinada severa C.B.-17 (SCID) (Harlan, Indianapolis, IN) . Após injeção, todos os camundongos foram agrupados e então alocados aleatoriamente nos vários grupos de tratamento, com 9 camundongos por grupo. Anticorpos foram administrados em 0,5 ml em dia 1, 4, 8, 11, 15 após implante de célula por injeção intraperitoneal. Camundongos foram monitorados pelo menos duas vezes por semana e foram sacrificados quando eles exibiram sinais de doença, incluindo perda de peso de 15% a 20%, postura arqueada, letargia, inchaço craniano, ou desidratação. Os camundongos receberam tratamento com mAb de 41D12 em uma resposta de dose. Adicionalmente, uma versão de Fc =morto de 41D12 foi testada a 10 mg/kg. Essa versão de Fc morto foi descrita antes na literatura e não tem ADCC e atividade de CDC e muito menor atividade de ADCP (McEarchern et al., Clin Cancer Res (2008) 14 (23) : 7763-72) . Resultados são mostrados como curvas de sobrevivência em Figura 11. Esses dados mostram que o tempo de sobrevivência mediano para os camundongos de controle é 27 dias. Tempo de sobrevivência mediano foi prolongado a pelo menos 67 dias quando doses iguais a ou maiores que 0,1 mg/kg de 41D12 foram administradas. A dose de 0,01 mg/kg é ainda eficaz. A versão de Fc morta de 41D12 não tem potência in vivo, ilustrando a importância de ADCC, CDC e ADCP nesse modelo.

Exemplo 12: Expressão de mAbs não fucosilados

Anticorpos com quantidades reduzidas de resíduos de fucosila foram demonstrados para aumentar ADCC por 10-1000 vezes (lida et al. , Clin câncer Res. (2006) 12 (9): 2879 - 2887) . A linhagem celular MS704-PF e MS705 de CHO, em que falta o gene de fucosiltransferase (FUT8, BioWa, Inc.) foi eletroporada com um vetor de expressão eucariótico codificando a cadeia pesada e leve dos mAbs para CD70 lhama- humano quimérico. Clones resistentes a fármaco foram selecionados por crescimento em meio de CHO Excell 325-PF. Clones foram triados para produção de IgG por um ELISA de ligação de CD70 padrão. Tabela 6; Sequência de VH derivado de lhama específico 5 para CD70

Exemplo 13: Linhagem germinal de mAb 27B3 anti-CD70

Segmentos de genes de linhagem germinal humana com a mesma estrutura de dobra canônica e a maior identidade de 5 sequência de aminoácidos às regiões de VH e VL de mAb 27B3 foram identificados por comparação com sequências conhecidas de gene de linhagem germinal humana. As mais próximas regiões de VH e VL humano a mAb 27B3 foram VH3-48 humano (89,7% identidade de FR) e VL8-61 humano (86,1% identidade 10 de FR), respectivamente. As mais próximas sequências de segmento de gene de linhagem germinal humana JH e linhagem germinal humana JL foram JH5 e JL7, respectivamente. Alinhamentos de sequência das regiões de VH e VL de mAb 27B3 com as mais próximas sequências de linhagem germinal humana VH e VL são estabelecidos em Figura 12. Comparação das regiões V de Anticorpo 27B3 SIMPLE e sequências de linhagem germinal humana identificaram 12 mutações humanizantes de candidato na região de VH e 13 na região de VL (2 em CDR1 e 5 1 em CDR2). Uma visão geral das mutações humanizantes nas sequências de VH e VL do 27B3, junto com os tamanhos de biblioteca necessários para cobrir a diversidade introduzida, é estabelecida em Tabelas 10 e 11. Tabela 10: Mutações alvo-marcadas na sequência de 10 aminoácidos de VH 27B3. K denota o tamanho de biblioteca necessário para cobrir todos os mutantes potenciais.

Tabela 11: Mutações alvo-marcadas na sequência de aminoácidos de VL 27B3. H denota o tamanho de biblioteca necessário para cobrir todos os mutantes potenciais. * denota mutações em regiões CDR1 ou CDR2.

5 Bibliotecas germinalizadas de VH_27B3 e VL_27B3 englobando todas as combinações de mutações humanizantes foram criadas por montagem baseada em PCR (ver por exemplo, Stemmer et al., Gene (1995) 164: 49 - 53). Sobrepor oligonucleotídeos com mutações específicas em certas 10 posições foram montadas por PCR. A biblioteca continha ambos os aminoácidos de humano e lhama em cada posição mudada para prevenir perda completa de ligação no evento que o resíduo de lhama de tipo selvagem foi crítico para elevada afinidade de ligação (ver, por exemplo, Baca et al. , J. Biol. Chem. (1997) 272: 10678 - 10684; Tsurushita et al., J. Immunol. Methods (2004) 295: 9 - 19). A biblioteca de VH continha cerca de 1 x 1010 clones e a biblioteca de VL cerca de 8 x 109 clones. As bibliotecas de VH e VL foram combinadas e reformatadas em uma biblioteca de Fab única com um tamanho de 1 x 1010 clones (91% com inserção de Fab de comprimento completo) adequado para triagem de exibição de fago. Para diversidade requerida para cobrir todas as mutações possíveis como mencionado em Tabelas 10 e 11 foi excedida nas bibliotecas de cadeia pesada e leve primária, mas também a biblioteca de Fab combinada foi grande o suficiente para cobrir todas permutações possíveis (1,89 x 107) .

Exemplo 14: Seleção de Fabs 27B3 germinalizados com elevada identidade de FR humano

Exibição de fago foi usado para selecionar Fabs 27B3 germinalizados com ambas elevada afinidade para CD70 e elevada identidade de FR humano. Especificamente, Flag-TNC- CD70 foi biotinilado e foi incubado em várias concentrações com diferentes quantidades de Fab expressando fago. Complexos de fago e Flag-TNC-CD70 foram então capturados em uma placa de microtitulação revestida de estreptavidina e lavadas com Flag-TNC-CD70 não biotiniladas a 37°C. Fago foram eluídos com Tripsina e usados para infecção de células TG1. Cinco ciclos de seleção foram efetuadas, com a estringência de lavagem aumentada em cada ciclo. Detalhes das condições usadas para cada ciclo de seleção são 5 estabelecidos em Tabela 12. Tabela 12: Condições para seleção de Fabs de 27B3 germinalizados

Fagos eluídos de ciclos 3, 4 e 5 de seleção foram transfectados em TG1 e colocados clonalmente em placas; clones individuais foram escolhidos aleatoriamente para outra análise. Frações periplásmicas contendo Fabs foram preparadas de culturas de pequenas induzidas de IPTG e a taxa de dissociação de cada Fab foi determinada usando um chip CM5 revestido com CD70 em um teste de ligação Biacore. Clones com Fab tendo taxas de dissociação similares àquelas de 27B3 foram sequenciados. Taxas de dissociação para clones com uma identidade de sequência de FR humano total acima 94% são estabelecidas em Tabela 13, juntamente com a porcentagem de identidade de FR humano do clone individual (VH, VL e total).

As sequências de aminoácidos completas dos clones de Fab sequenciados são estabelecidas em tabelas 14 e 15 e as sequências de CDR de variantes de aminoácidos de 27B3 são 5 estabelecidas em Tabela 16. Inspeção dessas sequências revela que o arcabouço 1 de cadeia leve frequentemente tem mutações extra (não humanas) na região de iniciador em aminoácido 2 (A ao invés de T) . Variantes de clones 35G3, 40F1 e 39C3 (clones 53C1, 53B1 e 53E1, respectivamente) foram feitos tendo o correspondente aminoácido humano em posição 2. Ademais, clone 41D12 foi ainda germinalizado combinando a cadeia pesada de 41D12 com a cadeia leve de 40F1 (53A2) ou com a cadeia leve de 53B1 (53H1). Tabela 13: Taxa de dissociação de clones de Fab 27B3 15 germinalizados com mais do que 94% de identidade de FR humano total.

Tabela 14A: Sequências de aminoácidos de VH de clones 27B3 germinalizados com mais do que 94% de identidade humana total, com identificadores de sequência rompidos por FR e 5 CDR. Mutações humanizantes estão sombreadas e mutações introduzidas de iniciador estão em negrito.

Tabela 14B: Sequências de aminoácidos de VH de clones 27B3 germinalizados com mais do que 94% identidade humana total, com identificadores de sequência para a sequência de 5 aminoácido VH completa.

Tabela 15A: Sequências de aminoácidos de VL de clones 5 27B3 germinalizados com mais do que 94% identidade humana total, com identificadores de sequência rompidas por FR e CDR. Mutações humanizantes estão sombreadas e mutações introduzidas de iniciador estão em negrito.

Tabela 15B: Sequências de aminoácidos de VL de clones 27B3 germinalizados com mais do que 94% identidade humana total, com identificadores de sequência para a sequência de VL 5 completa. Mutações humanizantes estão sombreadas e mutações introduzidas de iniciador estão em negrito.

Exemplo 15: Estabilidade em temperatura de mAbs 27B3 germinalizados.

Várias variantes de mAb 27B3 germinalizado foram expressadas em células HEK293 como moléculas de IgGl humano de comprimento completo. Após purificação de Proteína A, a estabilidade de temperatura dos clones de mAb 27B3 germinalizados foi avaliada. Especificamente, cada mAb foi incubado em várias temperaturas (2 ou 5 °C em intervalos separados) durante 1 hora em uma concentração de 100 μg/ml em tampão de PBS. A temperatura dos mAbs foi então diminuída em uma maneira controlada (redução para 25 °C durante 2 horas, seguido por incubação durante a noite a 4°C) e centrifugação foi usada para remover agregados. A quantidade de mAb ativo (como porcentagem da concentração de mAb total) no sobrenadante foi medida por Biacore.

Os resultados (estabelecidos em Tabela 17) demonstram que maioria de clones tem uma temperatura de fusão similar (Tm) como 27B3 o tipo1 selvagem tem. Surpreendentemente, clones 41D12 e 35G2 mostram ter uma termoestabilidade aumentada como comparado a 27B3. Tabela 17: Estabilidade de temperatura de mAbs de 27B3 Germinalizado

A estabilidade de temperatura de mAbs de 27B3 germinalizado: 41D12, 35G2 e 40F1 foi ainda estudada usando uma variedade de técnicas. Alíquotas (1 ml) dos mAbs de teste em uma concentração de 100 μg/ml foram preparadas em PBS de Delbucco contendo 0,02% Tween. Uma alíquota de controle negativo consistindo de tampão apenas (PBS de Delbucco contendo 0,02% Tween) e uma alíquota de controle positivo consistindo de mAb em PBS de Delbucco contendo 0,02% Tween foram também preparadas. Para cada preparação de mAb, alíquotas foram armazenadas a4 °C, aRTea37 °C por um período de 0-8 semanas. 50 μl amostras foram removidas das alíquotas em dias 1, 7, 14, 21, 28, 35, 56 e 92 para análise. A amostra foi armazenada a -20 °C e usada como referência.

15.1 Análise de filtração em gel de amostras

Amostras tomadas em cada ponto de tempo foram também Superdex200 10/300 GL. A amostra de teste de 50 μl foi adicionada a 200 μl PBS + 0,02% Tween-20. A amostra (125 μl) foi tomada para análise de filtração em gel. Amostras foram centrifugadas antes de análise para remover agregados 5 maiores. A % de pico monomérico e área de pico monomérico foram medidas, bem como o volume de retenção. Os resultados são mostrados em Tabelas 19, 20 e 21. Tabela 19: Resultados de estudo de estabilidade de PBS - % pico monomérico

10 Tabela 20: Resultados de estudo de estabilidade de PBS área sob curva do pico monomérico (mAU*ml)

5 Tabela 21: Resultados de estudo de estabilidade de PBS volume de retenção (ml)

Os resultados de análise de filtração de gel de 35G2, 40F1 e 41D12 amostras tomadas após 5 semanas de incubação a 37 °C são mostrados em Figura 13. Dois picos menores são 5 visíveis em um maior tempo de retenção (indicando a presença de alguns agregados) e tempo de retenção inferior (indicando a presença de algum produto de degradação). Os resultados demonstram que a maioria da proteína é intacta e não agrega.

Analise de amostras por BIACORE

Amostras tomadas em certos pontos de tempo foram testadas para potência em ligação de CD70 usando Biacore. A amostra de 50 μl foi adicionada a 200 μl PBS + 0,02% Tween, e diluída 1/400 como a seguir: 5 μl de amostra (1 mg/ml) + 195 μl HBS-EP+ (Tampão Biacore), ainda diluído 10 μl + 90 μl HVS-EP+ = 2,5 μg/ml. Análise Biacore foi efetuada usando um chip CM5 revestido altamente de CD70 (4000 RU) . Os resultados para mAbs 40F1, 35G2 e 41D12 são mostrados em Figura 16. A amostra de referência é a amostra de 100%.

Os resultados demonstram que os mAbs perdem alguma potência (afinidade para o antígeno CD70) sobre o passar do tempo quando incubados a 37°C. Para 41D12, tanto o declive como o sinal máximo (RO) são traçados em gráfico (ver Figura 16C e D).

A seguir, a estabilidade ao congelamento- descongelamento de mAbs de 27B3 germinalizado: 41D12, 35G2 e 40F1 foi estudada. Portanto, uma alíquota de 0,7 ml de mAbs (a 5 mg/ml) foi congelada durante pelo menos 6 horas a -20°C e descongelada durante 1 hora a RT. Este ciclo foi repetido 9x (assim, 10 ciclos de congelamento-descongelamento em total) e amostras foram analisadas por filtração em gel como acima. Os resultados demonstram que mAbs são estáveis mediante congelamento-descongelamento durante 10 ciclos: não foram observados produtos de degradação ou agregados na filtração em gel. Tabela 22: Resultados de estudos de estabilidade de filtração em gel PBS (esquerda = valor após 10 F/T ciclos, direita é o valor para a amostra de referência)

As amostras foram também testadas for potência em Biacore como descrito acima. Os resultados demonstram que após 10 ciclos de congelamento-descongelamento o mAb ainda tem 97% de sua potência (para todos os três mAbs testados. Tabela 23: Potência em Biacore quando de 10 ciclos de congelamento-descongelamento (%)

Exemplo 16: Potência de ADCC de mAbs 27B3 germinalizados

Várias variantes de 27B3 germinalizadas foram expressadas em células HEK293 como moléculas de IgGl humano de comprimento completo. Após purificação de Proteína A, a potência de ADCC dos mAbs de 27B3 germinalizados foi avaliada. ADCC foi medido como descrito acima em Exemplo 7.

Os IC50's relativos aos 27B3 mAbs germinalizados comparados ao 2 7B3 parental são dados em Tabela 18 para ambos potência de ADCC e potência de bloqueio de CD70/CD27 no teste de Raji de co-cultura (como descrito em Exemplo 6). A Figura de < 1,0 denota IC50 melhorado para variante germinalizada relativa a 27B3 parental. A partir destes dados, pode ser concluído que variante germinalizada 41D12 manteve a potência de ADCC bem como a potência de bloqueio de CD70/CD27 combinada com a melhor Tm. Tabela 18: IC50's relativos de variantes de 27B3 germinalizadas no ensaio de ADCC com base em 786-0 e neutralização em bioteste com base em Raji comparado com o do clone de mAb parental

Exemplo 17 Construção e seleção de linhagens de células expressando o mAb de CD70 não fucosilado, ARGX-110

Um vetor de gene duplo codificando as sequências de aminoácidos VH e VL de clone 27B3 germinalizado 41D12 foi produzido (alótipo za). Sequências de nucleotídeo codificando a cadeia pesada (SEQ ID NO:344) e cadeia leve (SEQ ID NO:345) de 41D12 são dadas em Tabela 30 abaixo.

Células Potelligent® CHOK1SV foram estavelmente transfectadas com o vetor de gene duplo por eletroporação. Seis ciclos de transfecção foram efetuados. Em cada ciclo, as células de cada eletroporação foram adicionadas a 200 mL de meio CM63 livre de componente animal definido quimicamente (CDACDF) e colocadas sobre quarenta placas de 96 cavidades a 50 μL por cavidade. 0 dia após transfecção, 150 μL do meio CM63 contendo a sulfoximina de L-metionina (MSX) de agente seletivo foram adicionados para cada cavidade para dar uma concentração final de MSX de 50 μM. Após aproximadamente 3, 4 e 5 semanas de incubação as placas foram triadas para a presença de colônias usando um espelho de clonagem. Quaisquer colônias identificadas foram examinadas ainda usando um microscópio para avaliar se a colônia surgiu de células simples ou múltiplas.

Duzentos e quarenta e cinco colônias foram identificadas e triadas para produção anticorpo usando um método baseado em Octet. Concentrações de anticorpo variaram de 0 a 172 μg/mL. Das 245 linhagens de células triadas, 214 foram positivas para produção de anticorpo. As linhagens de células foram classificadas baseado em produtividade e as 70 linhagens de células de topo foram selecionadas. Culturas dessas 70 linhagens de células foram inicialmente expandidas em cultura estática e subsequentemente em cultura em suspensão. Trinta linhagens de células que exibiram crescimento aceitável foram selecionadas e avaliadas ainda em uma triagem de produtividade de cultura de frasco de agitação de lote. Culturas foram gaseificadas em dias 4, 6, 8 e 10 e coletadas em dia 12. A concentração de anticorpo nas amostras de sobrenadante coletadas foi determinada em HPLC usando Proteína A contendo coluna. As concentrações de anticorpo nas amostras das 30 linhagens de células variaram de 109 a 877 mg/L. Os resultados da avaliação de frasco de agitação de lote foram usadas para ranquear as linhagens de células, baseada em produtividade. As 20 linhagens de células de topo foram selecionadas para posterior avaliação.

O crescimento e dados de produtividade para essas 20 linhagens de células selecionadas expressando o anticorpo ARGX-110 foram estudados em culturas de frasco de agitação de lote de alimentação usando meio de CDACF e os resultados são mostrados em Tabela 24. Concentrações de anticorpo em coleta variaram de 857 a 3922 mg/L, como determinado em uma coluna de HPLC Proteína A. Linhagem celular F13 foi selecionada para inocular um biorreator de bolsa de célula de 10L disponível. Uma concentração de anticorpo de coleta de 4327 mg/L foi conseguida. Essa linhagem celular alcançou uma concentração de anticorpo em coleta de 2711 mg/L em cultura de frasco de agitação de lote de alimentação e teve a segunda maior taxa de produção específica (2,22 pg/célula/h) de todas 6 linhagens de células avaliadas (Bl, D4, D5, Fl, F13 e F18) . Essa linhagem celular também exibiu características de crescimento aceitável. Tabela 24: Sumário de crescimento e dados de produtividade para 20 linhagens de células selecionadas, expressando o anticorpo ARGX-110, cresceu em culturas de CDACF de frasco de agitação de lote de alimentação.

Tempo integral de concentração de células viáveis em coleta (2) Determinado por Proteína A HPLC, <3) Calculado por análise de regressão linear da concentração do anticorpo contra o tempo integral de concentração de células viáveis

Exemplo 18 Afinidade de mAbs CD70 18.1 Afinidade para linhagens de células de câncer expressando CD70

Várias linhagens de células de câncer foram testadas por análise de FACS para ligação de ARGX-110 e SGN70 (descritas em US2010/0129362) em saturação de concentrações de mAb (pelo menos 2 μg/ml) . Isso foi quer feito a 4°C (1 hora incubação de células com mAbs) ou a 37°C (15 minutos de incubação de células com mAbs). Ligação foi detectada usando anti-hlgGl-Fc-FITC (AF006, Sítio de ligação) ou anticorpo de anti-hlgGl-Fc-PE (eBioscience, 12-4998).

Fluorescência foi medida usando um citômetro de fluxo. Os resultados são resumidos em Tabela 25. A terceira coluna da Tabela mostra se ARGX-110 liga com afinidade baixa (+), média (++) ou elevada (+++) às várias linhagens de células testadas. Na coluna do lado direito, o sinal FACS (MFI) para ARGX-110 é dividido pelo sinal FACS (MFI) para SGN70 para o experimento efetuado a 37°C. Estes resultados demonstram que ARGX-110 liga com maior afinidade às células que SGN70, particularmente para linhagens de células de menor número de cópias onde pode ser esperado que elevada afinidade ligação de um anticorpo pode ser selecionada mais facilmente. Tabela 25: Ligação de mAbs para CD70 ARGX-110 e SGN70 para linhagens de células de câncer

Em outro experimento, a aparente afinidade de ligação de mAbs CD70, ARGX-110, SGN70 e MDX1411 [ver acima], através de uma faixa de concentrações foi determinada para diferentes linhagens de células. Células foram incubadas durante 1 hora a 4°C com uma série de diluição de ligação de mABS de CD70 e ligação foi detectada usando anti-hlgGl-Fc- FITC ou anticorpo anti-hlgG-Fc-PE. Fluorescência foi medida usando um citômetro de fluxo e a fluorescência mediana foi traçada em gráfico. Os resultados são mostrados em Figura 15.

Os resultados demonstram que a afinidade dos três diferentes mAbs para CD70 em células é comparável, mas para algumas linhagens de células, SU-DHL-6, A549 e MKN45, ligação de ARGX-110 é superior como comparado a MDX1411 e SGN7 0. A EC50 para ligar a SU-DHL-6, A54 9 e MKN4 5 é muito maior para todos os mAbs como comparado a EC50 nas outras linhagens de células como U266 e muitas outras, que provavelmente indica que o mAb é ligado apenas com um braço (Fab), não mais permitindo avidez e, assim, resultando em menores afinidades. De fato, quando testada em Biacore, a afinidade do Fab de ARGX-110 versus SGN70 e MDX1411 é muito maior (ver abaixo).

18.2 Afinidade para células expressando CD70 de paciente

Células primárias tomadas de pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL) (2 pacientes de risco elevado, 1 paciente de risco baixo) foram colocados em placas a 250.000 células/cavidade em placas de fundo redondo de 96 cavidades em RPMI 1640 + 10% FBS e mAbs em uma concentração de 5 μg/ml em RPMI + 10% FBS foram adicionados. Após incubação por até 5 horas a 37°C, células foram lavadas duas vezes com PBS de gelo seco. IgG anti-humano de cabra rotulado com Alexa Fluor 647 (Invitrogen Cat# 21445) foi diluído 1/500 em PBS/1%BSA e incubado durante 20 minutos a 4 °C. A placa foi lavada duas vezes com PBS de gelo seco e 4% paraformaldeído foi adicionado por 15 minutos em temperatura ambiente para consertar as células. Sinais foram medidos por FACS. Os resultados são mostrados em Figura 16. Os resultados demonstram que ARGX-110 liga bem às células dos pacientes de CLL considerando que SGN70 quase não deu sinais de ligação.

18.3 Afinidade de Fabs de CD70 para CD70 recombinante em Biacore

CD70 humano recombinante foi imobilizado em um chip CM5 Biacore. A imobilização foi efetuada de acordo com um método provido por Biacore e usando o kit NHS/EDC (Biacore AB) : após ativação do chip, uma solução de 50 μg/ml de CD70 recombinante em lOmM de tampão de acetato com pH de 5 foi preparada e Iμl dessa solução (50ng) foi injetado resultando em uma densidade de superfície de aproximadamente 1000 RU.

Fabs foram preparados para os mAbs para CD70 ARGX-110, MDX1411 e SGN70 por digestão com papaína. Esses Fabs, em uma concentração de aproximadamente 100-400μg/ml, foram diluídos 6 vezes em solução salina tamponada de hepes (0,lM HEPES, 1,5M NaCl, 30mM EDTA, 0,5% em volume de tensoativo P20) . Eles foram injetados (30μl) e passados através das células de fluxo em uma taxa de fluxo de 30μl/min. Após ligação do Fab a CD7 0, a taxa de dissociação foi monitorada por um período de 10 minutos. Após dissociação, as superfícies celulares de fluxo foram regeneradas injetando 5μl de lOmM NaOH. Algumas vezes múltiplas injeções de NaOH foram necessárias para regenerar as superfícies dependendo da afinidade dos Fabs. A análise da taxa de dissociação foi feita aplicando o software BIAevaluation. Primeiro, o sensograma dos ciclos em branco foram subtraídos daqueles obtidos com a célula de fluxo revestida. Então a taxa de dissociação foi determinada para uma faixa de tempo de 10 minutos usando a aplicação de cinética de ajuste e o valor de Kd foi calculado. As taxas de dissociação são resumidas em Tabela 26. Tabela 26: "Taxa de dissociação" de Fabs para ligar a CD70 humano

18.4 Experimentos de salpico para avaliar a lise de células SU-DHL ligadas por mAbs CD70

Células SU-DHL-6 (um linfoma difuso de linhagem de células de célula B grande) foram pipetadas em cavidades a 50.000 células/cavidade que foram salpicadas então em 300.000 PBMCs recentemente isolados/cavidade de doadores saudáveis e mAbs foram adicionados em diferentes concentrações. As amostras foram incubadas durante 2 dias e analisadas por FACS para a depleção da linhagem celular (como medido com CD19 APC anti-humano (eBioscience 17-0199- 42) ) . A melhor potência em morte celular foi obtida com ARGX-110, que também concede a maior % de lise. Os resultados são mostrados em Figura 17.

Exemplo 19: Atividade de CD27-CD70 de bloqueio de mAbs CD70

A interação entre CD70 e CD27 pode contribuir para a sobrevivência, proliferação e/ou supressão imune de células de tumor dentro do microambiente de tumor. A capacidade de mAbs para CD7 0 para bloquear a interação entre CD7 0 e CD27 foi portanto avaliada por ELISA.

Neste teste, a placa de microtitulação (Nunc Maxisorb) foi primeiro revestida com 100 μl de anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich, F3165) a diluição em 1250 vezes em PBS (para obter uma concentração final de aproximadamente 3,5 μg/ml) durante a noite a 4°C. A placa foi lavada uma vez com PBS-Tween e incubada a RT por 2 horas com 300 μl PBS-1% caseína. A placa foi lavada ainda três vezes com PBS-Tween. 100 μl de 5 ng/ml (80 pM) Flag-TNC-CD70 (The Journal of Immunology, 2009, 183: 1851-1861) diluído em PBS-0,1% caseína foi adicionado à placa e incubada a RT durante 1 hora enquanto agitando. A placa foi lavada cinco vezes com PBS-Tween. O mAb de CD70 a ser testado foi adicionado à placa; várias concentrações foram conseguidas diluindo a solução de anticorpo de estoque em PBS-0,1% caseína. Imediatamente em seguida, 50 μl de 1 μg/ml (concentração final 6,5 nM) de quimera Fc humano CD27 recombinante (R&D Systems 382-CD, MW =46,5 kDa) foi adicionado, e incubado a RT durante 1 hora enquanto agitando. A placa foi lavada cinco vezes com PBS Tween. 100 μl de anti-CD27 biotinilado (eBioscience 13-0271), diluído 500 vezes em PBS-0,1% caseína, foi adicionado, e a placa incubada a RT por mais uma hora, enquanto agitando. A placa foi lavada cinco vezes com PBS Tween. 100 μl de Strep-HRP (Jackson Immunoresearch 016-030-084) diluído 5000 vezes em PBS-0,1% caseína foi adicionada, e a placa incubada a RT por mais uma hora, enquanto agitando. A placa foi lavada cinco vezes com PBS- Tween. 100 μl TMB foram adicionados à placa e o OD a 620 nm foi medido.

Usando esse teste, a potência de bloqueio de ARGX-110 foi comparada à potência de SGN70 e MDX1411. Como mostrado em Figura 18, ARGX-110 é muito mais potente (cerca de 100 vezes) em bloquear a interação entre CD70 e CD27 que os dois mAbs de marca (IC50 ARGX-110= 67 ng/ml, MDX1411= 5500 ng/ml e SGN70= 4972 ng/ml).

Exemplo 20; Propriedades de ligação de mAbs CD70 20.1 Reatividade cruzada com CD70 de espécie não humana Determinar a reatividade cruzada de mAbs de animal para CD70 é útil para os propósitos de avaliar que modelos de animal podem ser usados para prova in vivo de estudos de conceito, e que espécies são mais adequadas para estudos de toxicologia. CD70 de macaco reso é 94% idêntico a CD70 humano e macaco cinomolgo CD70 é 95% idêntico a CD70 humano. Um alinhamento das sequências das diferentes espécies é mostrado em Figura 19. As sequências CD70 de camundongo e de rato são também incluídas de modo a destacar as diferenças como comparado com a sequência de humano. mAbs de CD70 ARGX-110, SGN70 e MDX1411 foram testados para ligação a U266 (uma linhagem celular de mieloma múltiplo humano), células LCL8664 (linhagem celular de linfoma de célula B de reso, ATCC-CRL-1805) e a células HSC- F (linhagem de célula T de macaco cinomolgo, linfócitos derivados de baço fetal, células de uma fundação de ciência de saúde no Japão) em uma série de diluição iniciando em uma concentração de 10-20 μg/ml.

Detecção foi efetuada usando FITC de IgGl humano anti cabra. Amostras foram analisadas por FACS. Os resultados são mostrados em Figura 20. O número de cópias de CD70 em ambas as linhagens de células de macaco é muito baixo (sinais baixos em FACS). Entretanto, ARGX-110 tem uma elevada afinidade para CD70 de cinomolgo e reso como comparado à afinidade de SGN70 e MDX1411 para CD70 dessas espécies.

20.2 Potência de bloqueio de mAbs CD70

A capacidade de mAbs para CD70 (ARGX-110, SGN70 e MDX1411) para bloquear a interação entre CD70 e CD27 foi testada usando a ELISA de bloqueio descrita em Exemplo 19 acima. O teste foi adaptado de modo a medir a potência de bloqueio de cada anticorpo para humano, macaco reso e cinomolgo Flag-TNC-CD70 (Wyzgol, et al. , J. Immunol., 2009, 183: 1851-1861). No ELISA, exatamente as mesmas condições foram usadas para CD70 das diferentes espécies de modo que os valores de IC50 entre as diferentes espécies poderiam ser comparadas diretamente. Os resultados são mostrados em Figura 21 e suportam os resultados vistos usando células de humanos, macacos resos e macacos cinomolgos. ARGX-110 tem uma potência inalterada e, portanto, uma afinidade inalterada para CD70 de macacos como comparado a humano, considerando que SGN70 e especialmente MDX1411 tem uma menor afinidade para macaco que para CD70 humano. Valores de IC50 são resumidos em Tabela 27. Tabela 27: IC50 para bloqueio da interação CD27-CD70 em ELISA para CD70 a partir de diferentes espécies

20.3 Ligação a CD70 desnaturado

A ligação de mAbs para CD70 a CD70 desnaturado recombinante foi avaliado por ELISA. CD70 recombinante foi desnaturado aquecendo por 5 minutos a 95 °C, seguido por resfriamento imediato em gelo por 5 minutos. A placa de microtitulação foi revestida com 5 μg/ml CD70 com ou sem desnaturação. A placa foi bloqueada e os mAbs para CD70 para testar foram aplicados a 10 μg/ml. Após lavagem, ligação dos mAbs foi detectada usando anti-humano IgG-HRP. Como um controle positivo para o revestimento, ao invés de usar os mAbs CD70, um mAb derivado de camundongo anti-Flag foi aplicado e detecção foi com anti-camundongo-HRP. TMB foi usado como um substrato e OD a 620nm foi medido. Os resultados deste ELISA são mostrados em Figura 22. Os resultados demonstram que ARGX-110 liga a um diferente epítopo que SGN70, MDX1411 (MDX2H5) e MDX69A7 como ARGX-110 ainda liga a CD70 desnaturado considerando que os outros mAbs não. Dentre os outros mAbs, alguns são também ligados a CD70 desnaturado (fe 5F4, 9G2, 57B6).

20.4 Mapeamento de epítopos usando quimeras de camundongo-humano

Proteínas de fusão de ECD de CD7 0 de humano-camundongo foram construídas trocando domínios de CD70 humano e camundongo a fim de mapear o reconhecimento de domínio dos mAbs. A construção foi feita usando metodologias de DNA e PCR recombinante padrão. As quimeras de camundongo e humano foram clonadas em um vetor de expressão de eucariota com uma etiqueta de Flag para capturar em ELISA e um TNC para trimerização da proteína (Flag-TNC-CD70). Proteínas foram expressadas como proteínas solúveis em células HEK293. A sequência das diferentes quimeras é mostrada em Figura 23.

Uma placa de microtitulação Maxisorb (Nunc) foi revestida com 3,5 μg/ml camundongo M2 mAb de anti-Flag (Sigma Aldrich, F3165) e as diferentes quimeras foram capturadas. Uma série de diluição dos mAbs para CD70 a ser testadas foi aplicada iniciando em uma concentração de 10 μg/ml e fazendo diluições 3 vezes. Após 2 horas, ligação foi detectada usando Fc-HRP anti-humano a uma diluição de 16000 vezes. Coloração foi feita com ABTS e OD a 405nm foi medida. Como um controle positivo, CD27-FC foi aplicado que é apto a ligar a ambos, CD70 humano e camundongo, com boa afinidade bem como às variantes quiméricas de CD70 de humano- camundongo. Os valores de EC50 para ligação são resumidos em Tabela 28. 5 Tabela 28: Ligação de ARGX-110 a quimeras CD70 humano- camundongo mostradas em Figura 23.

NB= sem ligação

Os resultados demonstram que ARGX-110 pode ligar a 10 Flag-TNC-CD70 humano e a quimeras 1; 2,1; 2,2; 2,3 e 2,4 mas não liga a quimeras 2, 3 e 4 e Flag-TNC-CD70 de camundongo. Isto indica que o epítopo para ARGX-110 está dentro das seguintes sequências de aminoácidos: HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342).

Exemplo 21 : Internalização de CD70 de linhagens de células de tumor diferentes e células de tumor primário Foi demonstrado que ligação de anticorpos para CD70 para as linhagens de células 786-0 e A498 derivadas de carcinoma renal resulta na internalização rápida (dentro de 1 hora) do complexo anticorpo-receptor (Adam et al., Br. J. Cancer (2006) 95: 298 - 306). A fim de testar a internalização de mAbs ARGX-110, SGN70 e MDX1411, células 786-0 foram cultivadas em uma placa de microtitulação de 96 cavidades e incubadas durante a noite a 37°C. 2,5 μg/ml mAb foram adicionados e incubados com as células durante 0-24 horas a 37 °C. Placas foram lavadas 3 vezes 5' com tampão de extração (150mM NaCl, lOOmM Glicina, pH=2,5; codificado "IN" representando a quantidade de mAb internalizado via CD70) ou PBS (codificado "OUT" e representando a quantidade de mAb ligado ao receptor no exterior da célula). Subsequentemente, células foram fixadas com 4% paraformaldeído durante 30' a RT, lavadas com PBS, e incubadas 5' com 0,2% Triton-X-100 ("IN") ou PBS ("OUT"). A seguir, células foram lavadas duas vezes e incubadas a RT durante 10' com 100 mM glicina seguido por 30 min de incubação com PBS+1%BSA. Finalmente células foram coloridas com Fc anti-humano de cabra (Jackson immunoresearch 109-005-098) e IRDYE800 anti-cabra (Li-cor 926-32214) antes da analise no escâner de infravermelho Li- Cor Odyssey. A % de mAb OUT como uma função de tempo é mostrada em Figura 24.

Os resultados demonstram que a internalização para todos os mAbs é comparável e que nenhum dos mAbs internaliza completamente. Inicialmente, entre 0 e 2 horas, a internalização de mAb vai muito rápido, mas então parece que um estado estacionário é alcançado onde cerca de 30% do mAb permanece no exterior da célula, mesmo após 24 horas de incubação a 37 °C.

A internalização de mAbs de ligação de CD70 foi também avaliada usando outras linhagens de células. Nesses experimentos, apenas o sinal do mAb fora da célula foi medido como uma função de tempo usando análise de FACS de acordo com o protocolo descrito abaixo. Esse protocolo alternativo foi determinado para ser uma leitura confiável como comparada com o método descrito acima (ver Figura 24, painel direito).

Para células de suspensão, células foram centrifugadas, contadas e os grânulos re-colocados em suspensão em meio para uma densidade de 5 x 105 células/ml, e 100 μl dessa suspensão foram adicionados por cavidade de uma placa de fundo em V de 96 cavidades. Para células aderentes, células foram semeadas em uma placa de 96 cavidades e cultivadas ON a 37°C, 5%CO2 até células foram completamente anexadas. Células foram colocadas em placas a uma densidade que permitiu crescimento celular linear para um período adicional de 48h.

Os mAbs para teste foram diluídos e incubados com as células a 37°C, 5% CO2 para períodos de tempo variantes: 24h, 8h, 6h, 4h, 2h, Ih, 30min, 15min, 5min, Omin (=sem mAb) . Seguindo incubação, as placas foram lavadas em gelo com tampão FACS frio para parar a reação de internalização. Nesse estágio, células aderentes foram destacadas da placa usando solução de dissociação celular (Sigma) e transferidas para uma placa de 96 cavidades de fundo em V. Em seguidas, células foram centrifugadas a 4°C. 0 tensoativo foi removido gentilmente invertendo a placa. As células foram lavadas duas vezes gentilmente colocando em suspensão novamente o grânulo de célula em 100 μl tampão FACS gelado. Após a lavagem, o grânulo de célula foi re-colocado em suspensão em 100 μl anti-hu IgG-FITC, diluído 1/500 em tampão FACS. A placa foi incubada durante 3 0 min a 4°C, enquanto agitando, e as células foram lavadas por ainda três vezes com tampão FACS frio. As células foram re-colocadas em suspensão em 100 μl tampão FACS, e fluorescência foi medida imediatamente. A intensidade de fluorescência média mediana (MFI) foi traçada em gráfico versus tempo.

Vários dos experimentos foram repetidos duas ou mais vezes. Resultados de dois experimentos foram muito comparáveis. Em alguns experimentos, usando células U266, SU-DHL-6 e Raji, a faixa de concentração (20 ng/ml - 5 μg/ml) foi usada para ver se houve um efeito de concentração mAb em taxa de internalização. Nenhum efeito foi observado (dados não mostrados).

Os resultados para diferentes linhagens de células testadas são mostrados em Tabela 29 e demonstram que a internalização não é um fenômeno comum, na verdade ela é um evento bastante raro. Tabela 29 resume a porcentagem de 5 internalização após 6 horas para as diferentes linhagens de células. Estes resultados mostram que a maior parte de ARGX- 110 permanece ligada ao exterior das células tornando as células mais suscetíveis a ADCC, CDC e ADCP. Tabela 29: % de internalização de mAbs CD70 em 10 linhagens de células diferentes após 6 horas.

Tabela 30: Sequências de nucleotídeo codificando anticorpos selecionados para CD70

Claims

1. Anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CD70 humano, o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada variável, uma CDR2 de cadeia pesada variável e uma CDR1 de cadeia pesada variável e pelo menos um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma CDR3 de cadeia leve variável, uma CDR2 de cadeia leve variável e uma CDR1 de cadeia leve variável, caracterizado pelo fato de que: 1. CDR3 de cadeia pesada variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS); a CDR2 de cadeia pesada variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG); a CDR1 de cadeia pesada variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 11 (VYYMN); a CDR3 de cadeia leve variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE); a CDR2 de cadeia leve variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS); e a CDR1 de cadeia leve variável compreende ou consiste na SEQ ID NO: 250 (GLKSGSVTSDNFPT)

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende ou consiste da sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 241.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico lhama-humano, no qual os domínios VH e VL são derivados de lhama, e um ou mais dos domínios constantes são derivados de uma imunoglobulina humana, e que opcionalmente abrange a região de dobradiça, o domínio CH2 e o domínio CH3 de uma IgG humana, de preferência uma IgG1 humana.

4. Anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que exibe uma ou mais funções efetoras selecionadas de citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por células (ADCC), em que os anticorpos ou seu fragmento de ligação ao antígeno apresentam, opcionalmente, função ADCC melhorada em comparação com um anticorpo equivalente contendo um domínio humano nativo Fc, citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e fagocitose dependente de anticorpo mediada por células (ADCP) contra células expressando o CD70 humano na superfície da célula, tais como as células cancerosas que expressam CD70.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é uma IgG não fucosilada, de preferência uma IgG1 humana não fucosilada.

6. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 344 e a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:345, ou sequências degeneradas das mesmas, que codificam um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido na reivindicação 2.

7. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 6, ligado operacionalmente a sequências de regulação que permitem a expressão do polipeptídeo de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou sistema de expressão isento de células.

8. Método de produção de um anticorpo recombinante ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedeira ou sistema de expressão isento de células que contém o vetor de expressão conforme definidos na reivindicação 7, sob condições que permitem a expressão do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e a recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno expressos.

9. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e pelo menos um veículo ou um excipiente farmacêuticamente aceitável.

10. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para: (a) inibir o crescimento de células tumorais que expressam CD70 em um paciente humano; ou (b) tratar ou prevenir o câncer em um paciente humano, em que o referido câncer é um câncer que, opcionalmente, apresenta uma expressão baixa do número de cópias de CD70.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir o câncer em um paciente humano, o referido câncer sendo selecionado a partir do grupo que consiste em: linfoma de células B grandes, leucemia linfocítica crônica, Linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de células do manto, carcinoma pancreático, linfoma cutâneo de células T, câncer do estômago, câncer do pulmão, melanoma, glioblastoma e câncer do ovário.