BR102012000187A2

BR102012000187A2 - Derivados n-fenilpiperazínicos antagonistas de adrenoceptores a1a, a1d e de receptores 5-ht1a no tratamento da hiperplasia prostática benigna, composições farmacêuticas contendo os mesmos

Info

Publication number: BR102012000187A2
Application number: BR102012000187-0A
Authority: BR
Inventors: Claudia Lucia Martins Da Silva; Fernanda Chagas Da Silva; Luana Chaves Barberato; Luciana De Camargo Nascente; Jessica Barbosa Do Nascimento Viana; Renata Oliveira Silva; Laís Flávia Nunes Lemes; François Germain Nöel; Luis Antônio Soares Romeiro
Original assignee: Univ Rio De Janeiro; União Brasiliense De Educação E Cultura Ubec
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2018-04-10
Also published as: KR20150013431A; US20150011566A1; WO2013102249A1; EP2810938A4; JP2015506358A; CN104321313A; EP2810938A1

Abstract

derivados n-fenílpiperazínicos antagonistas de adrenoceptores a1 a, a1d e de receptores 5-ht1a no tratamento da hiperplasia prostática benígna, composições farmacêuticas contendo os mesmos.a presente invenção proporciona derivados n-fenilpiperazínicos como ligantes e/ou antagonistas múltiplos de adrenoceptores a1a, adrenoceptores a1d e receptores serotoninérgícos 5-ht1a. tais substâncias são candidatos a protótipos para tratamento da hiperplasia prostática benigna e sintomas do trato urinário inferior, sendo úteis em composições farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Derivados iV-fenilpiperazínicos antagonistas de adrenoceptores alA,alDede receptores 5-HT1A no tratamento da Hiperplasia Prostática Benigna, Composições Farmacêuticas contendo os Mesmos.

Campo da Invenção A presente invenção é do campo técnico de produtos e processos farmacêuticos. Mais especificamente, a presente invenção proporciona derivados TV-fenilpiperazínicos como ligantes e/ou antagonistas múltiplos de adrenoceptores alA, adrenoceptores alD e receptores serotoninérgicos 5-HT1A. Tais substâncias são candidatos a protótipos para tratamento da hiperplasia prostática benigna e sintomas do trato urinário inferior, sendo úteis em composições farmacêuticas.

Antecedentes da Invenção Receptores acoplados à proteína G (GPCR) Os receptores acoplados à proteína G heterotrimérica possuem sete domínios transmembranares e são também denominados “receptores acoplados à proteína G” (GPCR) (OLDHAM & HAMM, Nature 9:60-71, 2008).

Segundo a International Union of Basic and Clinicai Pharmacology (IUPHAR) - Receptor Database, em humanos, esses receptores são distribuídos em classes, incluindo a família Rodopsina (R) (FREDRIKSSON e cols. Mol. Pharmacol. 63:1256-1272, 2003).

De acordo com OVERINGTON e colaboradores (Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12):993-996, 2006), os fármacos utilizados clinicamente que possuem como alvo farmacológico esta família de GPCR correspondem a aproximadamente 1/4 do mercado farmacêutico mundial. Isso se justifica devido ao principal papel desses receptores, que é o de reconhecer uma diversidade de ligantes extracelulares eadógenos e exógenos como hormônios, proteínas, lipídeos, neurotransmissores, entre outros (BJARNADÓTTER. e cols., Genomics 88:263-273, 2006; OLDHAM & HAMM, Nature 9:60-71, 2008), o que os envolve em diversos mecanismos fisiológicos e físiopatológicos. Como exemplo, a ativação de GPCR no sistema urogenital masculino regula desde a contração muscular até a proliferação e diferenciação celular (AVELLAR e cols., An. Acad. Bras. Cienc. 81(3):321-344, 2009). Os ligantes que agem nestes receptores mostram um notável grau de diversidade estrutural (WESS, Pharmacol. Ther. 80(3):231-264, 1998). GPCR's da família R apresentam uma grande similaridade na sequência de aminoácidos em regiões específicas destes receptores, particularmente na região transmembranar hidrofóbica de reconhecimento do ligante. Isto pode ser verificado, por exemplo, em adrenoceptores alA e receptores 5-HT1A, os quais apresentam resíduo Asp na região TM3 comprometido com a interação com grupo nitrogenado protonado do ligante, e resíduos Ser e Tyr na região TM5 importantes no reconhecimento do ligante via ligação de hidrogênio. Considerando estes dois receptores, estas regiões de reconhecimento de ligantes apresentam homologia de 45% entre si (revisto em OLDHAM & HAMM, Nature 9:60-71, 2008). Além disso, verifica-se uma relação estrutural entre os ligantes desses receptores que correspondem a moléculas com grupos nitrogenados protonáveis contendo ainda uma região aromática (FREDRIKSSON e cols. Mol. Pharmacol. 63:1256-1272, 2003).

Adrenoceptores Em humanos, os adrenoceptores alA, alB e alD são codificados por genes distintos (HIEBLE e cols. Pharmacol. Rev. 45:267-270, 1995; MICHEL e cols., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 352(1):1-10, 1995), cuja principal característica estrutural consiste no alto grau de similaridade na sequência de aminoácidos, exibindo similaridade em torno de 65-73% em seus domínios (LANGER, Eur. J. Urol. 36: 2-6, 1999; VARMA & DENG, Can. J. Physiol. Pharmacol. 78:267-292, 2000; ZHONG & MINNEMAN, Eur. J. Pharmacol. 375:261-276, 1999; HUH e cols., Genes Genet. Syst. 85(1):65-73, 2010). Os três subtipos apresentam ampla distribuição tecidual, podendo haver predominância de um determinado subtipo como mostrou o estudo de RNAm de tecidos de ratos realizados por SCOFIELD e colaboradores (J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1035-1042, 1995). Neste estudo podemos observar a predominância do subtipo (xl A na próstata e bexiga, alB no fígado, ealDna aorta de rato.

No sistema nervoso autônomo, os adrenoceptores al são responsáveis pela modulação da contração da musculatura lisa não vascular e também vascular, e por isso apresentam grande importância no controle do tônus vascular e consequentemente no controle da pressão arterial (HIEBLE, Pharm. Acta. Eíelv. 74(2-3):163-171, 2000; MICHELOTTI e cols., Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000).

Cabe ressaltar suas ações no sistema urogenital masculino. Diversos estudos têm caracterizado a presença desses receptores no trato urinário inferior, particularmente no tecido prostático humano e no músculo detrusor da bexiga (FORRAY e cols., Mol. Pharmacol. 45(4):703-708, 1994; HATANO e cols., Br. J. Pharmacol. 113(3):723-728, 1994; MARSHALL e cols., Br. J. Pharmacol. 115(5):781-786, 1995; HIEBLE & RUFFOLO, Expert Opin Investig Drugs. 6(4):367-387, 1997; MALLOY e cols., J. Urol. Sep; 160(3 Pt 1):937-943, 1998; MURAMATSU e cols., Br. J. Urol. 74(5):572-578, 1994; HIEBLE e cols., Pharmacol. Rev. 45:267-270, 1995; MICHELOTTI e cols., Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000). Neste sistema os adrenoceptores al estão envolvidos na contração da base da bexiga, principalmente via adrenoceptores alA e adrenoceptores alD, respectivamente (CHEN e cols., J. Urol. 174:370-374, 2005).

Antagonistas de adrenoceptores al têm sido amplamente utilizados para o tratamento da hiperplasia prostática benigna (HPB), condição clínica que afeta uma proporção crescente da população masculina, causando obstrução do fluxo urinário devido ao aumento do tamanho da próstata (MCNEAL, Urol. Clin. North Am., 17, 477-486, 1990). A prevalência da HPB aumenta com o envelhecimento, assim sendo, ela salta de aproximadamente 50% dos homens em torno de 60 anos de idade, atingindo 80% da população masculina aos 80 anos (COCKETT e cols., Prog. Urol. 1(6):957-72, 1991).

Foi verificado que o subtipo adrenoceptores alA é predominante na próstata humana, em nível de RNAm (PRICE e cols., Mol. Pharmacol. 46:221-226, 1994; TSENG-CRANK e cols., Br. J. Pharmacol. 115:1475-1485, 1995), e de proteína (LEPOR e cols., J. Urol. 149:640-642, 1993; MICHEL e cols., J. Auton. Pharmacol. 16:21-28, 1996). Estudos recentes mostram que o subtipo alD também está presente na próstata, numa extensão significativa (KOJIMA e cols., Prostate 66:761-767, 2006). Assim, o uso de fármacos com perfil de afinidade maior para adrenoceptores alA e adrenoceptores alD podem ser eficazes no tratamento da IIPB e mais toleráveis que antagonistas adrenoceptores al não seletivos (CHAPPLE, Br. J. Urol. 76(1):47-56, 1995), uma vez que se evita efeitos adversos.

Ligantes de adrenoceptores al Muitas classes químicas apresentam a capacidade de serem reconhecidos pelos adrenoceptores al. Dentre os fármacos com alta afinidade pelos três subtipos de receptores alA, alB e alD, temos o antagonista prazosina (SHIBATA e cols., Mol. Pharmacol., 48:250-258, 1995), derivado quinazolínico utilizada no tratamento de hipertensão arterial.

Outra classe química importante inclui derivados fenilpiperazínicos como o BMY 7378, antagonista do adrenoceptores alD com afinidade na faixa nanomolar e utilizado como ferramenta farmacológica (GOETZ e cols., Eur. J. Pharmacol. 272(2-3): R5-6, 1995). Além disso, o BMY 7378 é um agonista parcial do receptor serotoninérgico 5-HT1A (CHAPUT & MONTIGNI, J. Pharmacol. Exp. Ther. 246(1):359-370, 1988).

Receptores serotoninérgicos (5-HT) Em mamíferos, são conhecidas sete famílias de receptores 5-HT (5-HT1-7), perfazendo um total de 14 subtipos de receptores 5-HT estruturalmente e farmacologicamente distintos ((HOYER e cols., Pharmacol. Rev. 46:157-203, 1994; HOYER & MARTIN, Neuropharmacology. 36:419-428, 1997; SAXENA e cols., Trends Pharmacol. Sei. 19:311-316, 1998; VILLALÓN e cols., Drug Discov. Today 2:294-300, 1997; VILLALÓN & CENTURIÓN, Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 376(1-2):45-63, 2007). Considerando a estrutura primária, os receptores 5-HT metabotrópicos apresentam alto grau de similaridade aos receptores adrenérgicos e dopaminérgicos (FREDRIKSSON e cols., Mol. Pharmacol. 63:1256-1272, 2003).

Os subtipos metabotrópicos 5-HT1A e 5-HT2A, apresentam maior similaridade com receptores adrenoceptores al, em cerca de 45% (TRUMPP-KALLMEYER e cols. J. Med. Chem. 35(19):3448-3462, 1992), e homologia moderada (35%) entre si (BARNES & SHARP Neuropharmacology 38:1083-1152, 1999).

Receptores 5-HT1A O receptor 5-HT1A foi um dos primeiros receptores desta família a ter o gene clonado (KOBILKA e cols. Nature 329:75-79, 1987; FARGIN e cols. Nature 335(6188):358-360, 1988). Estudos de RNAm de receptores 5-HT1A mostram sua expressão no cérebro, onde estão presentes em alta densidade no córtex cerebral. Contudo, também são encontrados fora do SNC, como por exemplo, no baço, rim (no período neonatal), intestino (PUCADYIL & CHATTOPADHYAY, Progr. Lipid Res. 45:295-333, 2006), e próstata (ABDUL e cols. Anticancer Res. 14(3A):1215-1220, 1994; DIZEY1 e cols. Prostate 59(3):328-336, 2004).

Sabe-se que células ncuroendócrinas prostáticas sintetizam, armazenam e liberam fatores de crescimento, incluindo neuropeptídcos e 5-HT (ABRAHAMSSON e cols., 1986), havendo receptores específicos para a 5-HT nestes tecidos (HOOSEIN e cols., 1993). Desta forma, o potencial uso de antagonistas 5-HT1A tem recebido destaque para o tratamento da HPB, uma vez que apresentam efeito anti-proliferativo em células tumorais de próstata, sendo úteis no controle do crescimento de tumores independentes de androgênio (ABDUL e cols. Anticancer Res. 14(3A):1215-1220, 1994; DIZEYI e cols. Prostate 59(3):328-336, 2004). As estruturas químicas representadas abaixo são exemplos de algumas das classes químicas que apresentam afinidade por receptores 5-HT1A (estruturas retiradas de IUPHAR Receptor Database)'.

Modelo hipotético de reconhecimento molecular A determinação da estrutura cristalográfica dos GPCR em geral é dificultada devido à difícil reprodução, em modelos de cristalização, da conformação natural destes receptores que apresentam sete domínios transmembranares. Por exemplo, apenas recentemente foi obtida a primeira cristalografia de um GPCR, no caso o adrenoceptor β2 humano, e posteriormente do receptor de adenosina A2a (revisto em TATE e SCHERTLER, Curr. Opin. Struct. Biol. 19(4):386-395, 2009; KOBILKA e SCHERTLER, Trends Pharmacol. Sei. 29(2):79-83, 2008). Por isso, a construção de modelos preditivos e o estudo de interações com ligantes conhecidos são importantes para se obter novos conhecimentos sobre esses importantes alvos farmacológicos (THIEL, Nat. Biotechnol. 22:513-519, 2004).

Estudos de mutagênese indicaram que o nitrogênio protonado dos ligantes de adrenoceptores a, como por exemplo derivados fenilpiperazínicos, realizam interações iônicas com um resíduo de aspartato na TM3, sendo o grupo amino na forma de íon positivo considerado como principal grupo farmacofórico (PERKZ, Biochem. Pharmacol. 73(8):1051-1062, 2007). Por outro lado, os anéis aromáticos realizam interações hidrofóbicas e eletrostáticas com resíduos complementares nas TM2, 4, 6 e 7 (WAUGH e cols. J. Biol. Chem. 276(27): 25366-25371, 2001). Além destes grupamentos importantes, a presença de um anel aromático contendo grupos aceptores de ligação hidrogênio em posições meta e para são relevantes na estabilização do complexo receptor-ligante por interagirem com resíduos de Ser na TM5 (LOPEZ-RODRIGUEZ e cols. J. Med. Chem. 40, 2653-2656, 1997; PEREZ. Biochem. Pharmacol. 73(8):1051-1062, 2007).

Os adrenoceptores al e receptores 5-HT1A apresentam grande similaridade na região transmembranar de reconhecimento do ligante (TRUMPP-KALLMEYER e cols. J. Med. Chem. 35(19):3448-3462, 1992). Têm-se evidências de que um importante local para a ligação de antagonistas de adrenoceptores alA e de receptores 5-HT1A é um resíduo Asp na TM3, o qual interage com grupamento amino protonado dos ligantes (LI e cols. J. Mol. Model. 14(10):957-966, 2008; LÓPEZ-RODRIGUEZ e cols. Mol. Pharmacol. 62(1):15-21, 2002). Diversas estratégias estão disponíveis para o desenho molecular de fármacos. Dentre elas a mais importante é a abordagem fisiológica, que se baseia no mecanismo de ação farmacológico pretendido (KUBINYI. Pharmazie 50;647-662, 1995), a qual depende da eleição do alvo-terapêutico, o que por sua vez depende do conhecimento do processo fisiopatológico envolvido. Doenças crônicas podem envolver a alteração da sinalização celular de mais que um tipo de receptor, e, portanto fármacos que sejam direcionados para atuar em diferentes receptores podem ser terapeuticamente úteis (HUBER c cols. Biochemistry. 47(42):11013-11023, 2008).

Diversos estudos mostraram a presença de adrenoceptores al no trato urinário inferior, particularmente no tecido prostático humano e detrusor da bexiga, os quais têm sua expressão aumentada na HPB (FORRAY e cols. Mol. Pharmacol. 45(4):703-708, 1994; HAT ANO e Cols. Br. J. Pharmacol. 113(3):723-728, 1994; Marshall e cols. Br. J. Pharmacol. 115(5):781-786, 1995.; HIEBLE & RUFFOLO. Expert Opin Investig Drugs. 6(4):367-387, 1997; MALLOY e cols J. Urol. Sep;160(3 Pt 1):937-943, 1998; MURAMATSU e cols. Br. J. Urol. 74(5):572-578, 1994; HIEBLE c cols. Pharmacol. Rev. 45:267-270, 1995; HIEBLE. Pharm. Acta. Helv. 74(2-3):163-171, 2000; MICHELOTTI e cols. Pharmacol. Ther. 88:281-309, 2000). Além destes receptores, os receptores 5-HT1A também são expressos no tecido prostático humano onde exercem um efeito proliferativo (ABDUL e cols., Anticancer Res. 14(3A): 1215-1220, 1994; DIZEYI e cols. Prostate 59(3):328-336, 2004). Tendo isto em vista, há um grande interesse no campo de desenvolvimento de novos fármacos, por antagonistas duais para o tratamento da HPB, uma vez que se tem o interesse pelo bloqueio de receptores adrenoceptores αΙΑ/D e 5-E1T1A. A busca na literatura científica não apontou documentos relevantes para derivados JV-fenilpiperazínicos como antagonistas múltiplos de adrenoceptores alA, adrenoceptores alD e receptores serotoninérgicos 5-E1T1A como novos candidatos à protótipos para tratamento da hiperplasia prostática benigna e sintomas do trato urinário inferior descrito na presente invenção.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção São objetos da presente invenção derivados A-fenilpiperazínicos, ligantes, composições farmacêuticas contendo os mesmos.

Os derivados A-fenilpiperazínicos da invenção são particularmente úteis como ligantes para processos in vitro, sendo também particularmente úteis em composições farmacêuticas para o tratamento da hiperplasia prostática benigna e/ou sintomas do trato urinário inferior. Considerando os adrenoceptores al e receptores 5-HT1A, os derivados Ar-feni 1 piperazínicos da invenção possuem pré-requisitos estruturais necessários para a ligação a esses receptores, tais como átomo de nitrogênio básico para interação iônica com o grupo carboxilato do resíduo aspartato (Asp) na TM3 desses receptores (adrenoceptores al e receptores 5-1IT1A), além do anel aromático para interações hidrofóbicas e eletrostáticas com resíduos complementares nas TM2, 4, 6 e 7.

Um outro objeto da invenção c o processo de obtenção de derivados N-fenilpiperazínicos que possuem variação na cadeia alquílica.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 mostra curvas concentração-resposta a fenilefrina (FE) em aorta de rato na ausência (■) ou presença (□) do veículo utilizado para a diluição dos LDT's. Dados expressos como média ± EPM (n=5).

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção proporciona derivados JV-fenilpiperazínicos, ligantes, composições farmacêuticas contendo os mesmos.

Os derivados iV-fenilpiperazínicos da invenção são particularmente úteis como ligantes para processos in vitro, sendo também particularmcnte úteis cm composições farmacêuticas para o tratamento da hiperplasia prostática benigna e/ou sintomas do trato urinário inferior. Em especial, os derivados 2-alcóxifenilpiperazínicos da invenção têm alta afinidade por adrenoceptores alAealDe receptores 5-HT1A e compreendem: - um átomo de nitrogênio básico para interação iônica com o grupo carboxilato do resíduo aspartato (Asp) na TM3 desses receptores; e - ao menos um anel aromático para interações hidrofóbicas e eletrostáticas com resíduos complementares nas TM2, 4, 6 e 7; e - um grupo com densidade de carga negativa na posição 2 (orto) ao nitrogênio da subunidade iV-fenilpiperazina, aceptor de ligação de hidrogênio e.g. alcóxidos e isósteros.

Foram sintetizados vários compostos com o grupamento farmacofórico N-fenilpiperazina. As estruturas químicas dos compostos da série LDT 2-6, LDT8, LDT 62-69, LDT 39, LDT 70 e LDT 245 estão indicadas abaixo: (1 -etil-4-(2 -hidróxifeni l)piperazina) 1 (-2-etóxifenil)-4-[2-(3,4-dimetóxifenil)etil]piperazina Existem dois estudos com derivados iV-fenilpiperazínicos para adrenoceptores al e receptores 5-HT1A, um de Ratouis e colaboradores (J. Med. Chem. 8:271-273, 1965), e o outro de Leopoldo e colaboradores (J. Pharm. Pharmacol. 56(2):247-255, 2003) que estudaram, dentre outros, as fenilpiperazinas ora denominadas LDT5, no primeiro, e LDT3, LDT4 e LDT5, no segundo estudo. Além disso, também existem outras duas referências caracterizando os LDT62-68 como ligantes de receptores 5-HT1A e 5-HT2 (MOKROSZ e cols., Arch. Pharm. 328:143-148, 1995), e também uma referencia para LDT66 e LDT68 apenas como ligantes de adrenoceptores al (MOKROSZ e cols., J. Med. Chem. 39:1125-1129, 1996). Porém, em nenhuma destas referências há determinação de atividade intrínseca, e análise sistemática, em paralelo, das razões de seletividade para receptor 5-HT2A e adrenoceptores al e a2. Toda a série LDT2-6, LDT8 e LDT62-68 apresentada configura-se como uma série de candidatos potenciais no contexto da busca por antagonistas duais com afinidade para os receptores adrenoceptores al A/D e 5-HT1A.

Obtenção dos novos derivados A-fenilpipera/,ίnicos Todos os derivados, denominados na presente invenção de LDT's, foram sintetizados a partir dos respectivos haletos de alquila, comerciais ou previamente sintetizados a partir dos respectivos alcoóis primários, por meio de reação SN2 com as /V-fcnilpipcrazinas em acetonitrila, na presença dc base amínica ou carbonato, sob refluxo em aquecimento convencional ou microondas, em rendimentos que variaram de 86 a 97%, e foram disponibilizados sob forma de monocloridratos com posterior solubilização à concentração de 10 mM em água ultrapura e estoque a -20°C.

Foram registrados espectros de infra-vermelho por transformada de Fourier (FT-IR) em um espectrômetro Perkin Elmer (Spectrum BX), espectro de 1H-RMN (300 e 500 MHz CDC13) e de 13C-RMN (75 e 125 MHz, CDC13) estes registrados em mais Varian Plus (7,05 T) e espectrômetros Bruker Avance DRX500 e DRX300, e os espectros de massa foram registrados em espectrômetro Shimadzu FCMS IT-TOF. As placas de cromatografia de camada delgada (TLC) cluídas com mistura de solventes polar e apoiar (etanol/clorofórmio) evidenciaram apenas um único spot indicando a presença de apenas um composto, em cada amostra, como corroborado pela análise espectrométrica. A cada dia de experimento, foram diluídas pequenas alíquotas da solução estoque em concentrações necessárias para a realização do experimento em questão. '1’odos os experimentos utilizando as séries LDT2-6, LDT8, LDT62-68 e LDT245 foram realizados sob iluminação de lâmpada de vapor de sódio a fim de evitar possível degradação dos compostos.

Obtenção dos órgãos Todos os protocolos foram previamente aprovados pelo comitê de ética da UFRJ (CEUA; protocolo: DFBCICB011).

Ratos Wistar machos de 2,5 — 3 meses foram eutanasiados por decapitação após serem anestesiados em câmara saturada com éter. Coelhos albinos machos (2,5 — 3 kg) foram eutanasiados por exsanguinação após serem anestesiados com pentobarbital intravenoso (40 mg/kg).

Radioligantes e fármacos utilizados Os radioligantes [3H]-prazosina (atividade específica 85 Ci/mmol), [3H]-ketanserina (atividade específica 67 Ci/mmol), [3HJ-8-OFI-DPAT (atividade específica 170.2 Ci/mmol) foram adquiridos da PerkinElmer, EUA, e o [3H |RX821002 (atividade específica 60 Ci/mmol) foi adquirido da Amersham, RU. Prazosina cloridrato, adrenalina bitartrato, pargilina cloridrato, 5-hidroxitriptamina cloridrato, acetilcolina cloridrato, (R)-(-)-fenilefrina cloridrato, (±)-propranolol cloridrato, BMY7378 dihidrocloridrato e ketanserina tartarato foram adquiridos da SIGMA, EUA.

Ensaios funcionais Realizou-se ensaios de contração isométrica utilizando ratos Wistar machos, com idade de 2,5 — 3 meses eutanasiados como descrito anteriormente. A aorta torácica (tecido enriquecido em receptores alD-adrenérgicos funcionais) foi removida, livre dos tecidos conectivo e adiposo adjacentes, e cortada em segmentos de 3 mm. Em seguida, cada anel foi fixado a um transdutor de tensão (GRASS FT-03), e mergulhado em cubas contendo 9 mL de solução fisiológica (NaCl 122 mM, KC1 5 mM, CaC12 1,25 mM, MgC12 1,25 mM, KH2P04 1,25 mM, NaHC03 15 mM, Glicose 11,5 mM), mantidos a 37°C sob constante aeração com mistura carbogênica (95% de 02 e 5% de C02). Os segmentos da aorta foram então submetidos a uma pré-carga de 20 mN por 60 minutos. Após a recuperação dos tecidos, mantidos por 1 hora em repouso, foi realizada uma contração induzida por fenilefrina (FE) 1 μΜ (agonista seletivo dos receptores al-adrenérgicos). No plateau desta contração, visando promover relaxamento endotélio-dependente decorrente da ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e conseqüente liberação de óxido nítrico (NO), adicionou-se acetilcolina 1 μΜ. Os anéis que relaxaram pelo menos 80% foram considerados com endotélio intacto, sendo utilizados.

Em seguida a preparação foi lavada e mantida em repouso por 1 hora, visando a recuperação do tecido. Foram então realizadas curvas cumulativas à fenilefrina (10'9 10"5 M) na presença de propranolol 1 μΜ (bloqueador de receptores β-adrenérgicos) antes e após a incubação por 1 hora dos LDT's a 10 ou 50 nM. Paralelamente, um controle temporal foi realizado para descartar a existência de algum artefato sobre a contração medida, onde adicionou-se apenas o veículo (água ultrapura Milli Q®) no lugar da substância a ser testada. Seguindo rigorosamente o mesmo protocolo que as demais cubas que tiveram adicionadas os LDT's.

Os dados foram digitalizados no sistema MacLab 8S conectado ao transdutor de tensão isométrico Grass FT-03, que registrou a variação de tensão em milinewtons (mN) gerada ao longo da análise. Os dados digitalizados foram então analisados atravcs do programa Chart 3.4/s software (MacLab, Inc., USA). No processo de screening farmacológico, a concentração inicial utilizada dos LDT's foi de 50 nM, considerada como concentração de corte, ou seja, as substâncias que não tiveram efeito nesta concentração não seriam mais investigadas neste ensaio. Em contrapartida, as substâncias que tiveram efeito, foram depois testadas em concentração menor (10 ou 2 nM) (Tabela 2). Desta forma, através da construção de curvas concentração-resposta ao agonista FE na ausência e presença do antagonista pode-se determinar os parâmetros de efeito máximo (Fmax) e concentração que promove 50% do £max (CE50). A razão entre o valor de CE50 nestas duas condições (com e sem LDT) corresponde a um terceiro parâmetro, denominado “razão da concentração” (ou CR). Uma vez determinados estes parâmetros, foi possível calcular a afinidade aparente dos antagonistas competitivos (AB) in vitro usando-se a equação de Schild (Eq. 1) (KENAKIN, Raven Press, Nova York. Pp:278-322, 1993).

(Equação 1) log (CR-1) = log [BJ - log AB

Onde, CR=razão da concentração (CE’50/CE50); [B]= concentração do antagonista TT; AB constante de equilíbrio de dissociação do antagonista 4B\ Análise dos dados e tratamento estatístico Os dados de tensão obtidos foram analisados por regressão não-linear para se calcular os parâmetros efeito máximo (Amax) e concentração que promove 50% do fmax (CE50), utilizando o software GraphPad Prism, versão 4 (EUA). Para verificar se houve diferença significativa entre as medidas efetuadas antes e depois do tratamento com LDT's foi realizado teste ANOVA fator único seguido por teste de Newman-Keuls. considerando um risco alfa de 5% (diferenças consideradas significativas se P < 0,05).

Ensaios de ligação (Binding) Adrenoceptores alA

Preparação membranar Seguindo o protocolo previamente descrito na literatura, foram obtidas preparações membranares de homogeneizado de fígado de coelho. Tais preparações membranares são enriquecidas no subtipo alA de adrenoceptores. O tecido obtido como descrito anteriormente (~ 30 g) foi descongelado naturalmente, imerso em solução de descongelamento (sacarose 0,25 M, EGTA 1 mM e Tris 5 mM (pH 7,4)) gelada. Em seguida, o tecido foi transferido para uma placa de petri sobre gelo, contendo solução para homogeneização de fígado (EDTA 2 mM, NaCl 100 mM e Tris 50 mM (pH 7,4)) gelada. O fígado foi então cuidadosamente picotado desprezando-se a parte mais fibrosa.

Em seguida, transferiu-se o material para um bécher onde, com o auxílio do homogeneizador Ultra-Turrax (velocidade 24000 RPM), o tecido foi homogeneizado com a mesma solução tampão, na proporção de 6 partes da solução para 1 parte de material. O material foi homogeneizado por três vezes durante 20 segundos; nos intervalos a solução ficou em repouso por 1 minuto em gelo. Posteriormente o homogeneizado foi submetido a uma centrifugação de 10000 x g, por 10 minutos à 4°C, gerando um sobrenadante que foi submetido a uma ultracentrifugação de 80000 x g, por 40 minutos à 4°C, obtendo-se um pellet. Este pellet foi ressuspenso em solução tampão isenta de NaCl (EDTA 1 mM e Tris 50 mM (pH 7,4)) e submetido a mais uma ultracentrifugação nas mesmas condições anteriores. O pellet obtido nesta etapa foi ressuspenso em solução de armazenamento (sacarose 0,25 M, EGTA 1 mM e Tris 5 mM (pH 7,4)) com o auxílio de um homogeneizador manual do tipo Dounce e estocado em alíquotas de 300 pL em nitrogênio líquido. Em todos os protocolos de preparações mcmbranares a dosagem de proteína foi realizada de acordo com o método de LOWRY ecols. (J. Biol. Chem. 193(1):265-275, 1951).

Binding da [3HJ-prazosina aos adrenoceptores αΐ A A padronização deste ensaio foi feita de acordo com o descrito na literatura. Nos ensaios dc saturação foi medida a ligação da [3H]-prazosina aos adrenoceptores-alA nativos na ausência e presença de diferentes concentrações de prazosina não radioativa (10'10 - 10"7 M). Para ensaios de competição, tubos de ensaio contendo 350 pL de solução intermediária ([3H]-prazosina 0,16 nM, EDTA 1,6 mM, Tris 50 mM (pH 7,4 a 25°C)), são adicionados os 50 pL de diferentes concentrações de LDT's (concentração final IO"9 - 10'4 M), ou 50 pL de água (veículo para a diluição dos LDTN), para a determinação da ligação total, ou 50 pL de prazosina não radioativa a 10 pM (final 1 pM) para a determinação da ligação não-cspccífica, alem de 200 pg das preparações membranares de fígado de coelho (alA), contidos cm 50 μΐ de suspensão completando volume final de 500 pL. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Em ambos os ensaios as preparações membranares foram incubadas a 30°C por 45 minutos. Após o período de incubação, a reação foi parada pela adição de 4 mL dc solução de lavagem gelada (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4), seguida por filtração rápida à vácuo em filtros de fibra de vidro (GMF 3, Filtrak®). Os filtros foram lavados quatro vezes com 4 mL da mesma solução sob vácuo para remover todo radioligante livre. Em seguida os filtros foram secos c acondicionados cm vials contendo 5 mL de líquido de cintilação (PPO 4%, POPOP 0,1% p/V em tolueno). A radioatividade retida nos filtros foi então determinada em contador de cintilação líquida (Packard Tri-Carb 1600 TR). A ligação específica da [3FI]-prazosina aos adrenoceptores-αΙΛ foi definido como a diferença entre a ligação total e a ligação não-específica. Os dados obtidos pelo ensaio de saturação nos permitiram obter os parâmetros Kd (constante de dissociação), a qual representa a concentração de radioligante necessária para ocupar 50% dos sítios receptores, e Brnax, densidade máxima dos sítios de ligação, os quais foram calculados por regressão não-linear. Os valores crescentes de bound foram calculados indiretamente através do valor de bound obtido na concentração do radioligante (fmol/mg proteína) o qual foi multiplicado por um fator de diluição (FD) do radioligante (ex: |3HJ-prazosina) decorrente da adição do ligante não radioativo (ex: prazosina), em processo conhecido como diluição isotópica. Este procedimento visa obter uma curva de saturação com menor gasto de substância radioativa e de material biológico. Já ensaios de competição nos permitem construir curvas de inibição da ligação específica do radioligante. Quanto maior a concentração do agente competidor empregada, neste caso os LD'f's em estudo, maior a competição pelos receptores específicos, diminuindo a formação do complexo receptor-radioligante. Isto pode ser observado pela progressiva redução da radioatividade retida nos filtros e detectada pelo contador de cintilação líquida. A partir destas curvas de inibição foi possível calcular os valores da concentração dos LDT's que inibe em 50% a ligação do radioligante (050). Tais valores foram convertidos a valores de Κλ (constante de dissociação do competidor no equilíbrio ou constante de inibição) através da equação de Cheng-Prusoff (Eq. 2). (Equação 2 ) Onde K\ = constante de inibição; CISO = concentração que inibe em 50% a ligação do radioliganle; [L] = concentração do radioligante; Kd — constante de equilíbrio de dissociação do ligante (medido em ensaio de saturação).

Adrenoceptores alB

Preparação membranar Seguindo o protocolo previamente descrito na literatura, foram obtidas preparações membranares de homogeneizado de fígado de rato. Tais preparações membranares são enriquecidas no subtipo alB de adrenoceptores a. Os tecidos obtidos como descrito anteriormente (4 fígados de rato o que corresponde a ~ 30 g) foram descongelados, picotados e homogeneizados da mesma forma realizada para fígado de coelho. O homogeneizado obtido foi filtrado em quatro camadas de gaze e então submetido a uma centrifugação 5000 x g, por 20 minutos a 4°C, gerando um sobrenadante que posteriormente foi ultracentrifugado a 100000 x g, por 60 minutos a 4°C, obtendo-se um pellet. Este pellet foi ressuspenso em solução tampão isenta de NaCl e submetido a mais uma ultracentrifugação nas mesmas condições. O pellet obtido nesta etapa foi ressuspenso em solução de armazenamento (sacarose 0,25 M, EGTA 1 mM e Tris 5 mM (pH 7,4)) com o auxílio de um homogeneizador manual do tipo Dounce e estocado em alíquotas de 300 pL em nitrogênio líquido.

Binding da [3H]-prazosina aos adrenoceptores alB

Ensaios de ligação para adrenoceptores alB foram padronizados da mesma forma que ensaios de ligação para adrenoceptores alA, de acordo com a literatura, i.e., foram realizados ensaios de saturação e competição em preparações membranares de fígado de rato, neste caso utilizando 150 pg proteína por tubo, contidos em 50 pi de suspensão, além das diferentes concentrações de LDT's (10 9 - 10~6 M).

Adrenoceptores a2 e Receptores 5-HT2A

Preparação membranar Foram realizadas preparações membranares de córtex de rato de acordo com o descrito anteriormente na literatura. Os órgãos foram homogeneizados em Potter com o auxílio de um aparelho motorizado (Fisatom) e pistão de teflon, na proporção de 20 partes de Tris HC1 50 mM (pH 7,4 a 4°C) para 1 parte de material, por três vezes durante 30 segundos cada vez, nos intervalos a solução ficou em repouso por 1 minuto cm gelo.

Em seguida realizou-se uma centriíugação a 900 x g, por 10 minutos a 4°C, onde se obteve um pellet que foi ressuspenso em solução Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) gelado e o mesmo procedimento foi realizado mais uma vez. O sobrenadante foi então centrifugado a 48000 x g, por 10 minutos a 4°C, obtendo-se um pellet que foi ressuspenso na proporção de 20 partes de Tris HC1 50 mM (pH 7,4 a 4°C) para 1 parte dc material, e incubado a 37°C por 10 minutos, a fim de se remover os neurotransmissores endógenos. Por fim, foi realizada a centrifugação por mais duas vezes a 48000 x g, por 10 minutos a 4°C, e então o pellet final foi ressuspenso em solução de Tris-HCl 50 mM (pH 7,4).

Binding da [3íl]RX821002 aos adrenoceptores a2 Os ensaios de ligação para os receptores a2A foram realizados de acordo com o descrito anteriormente na literatura e previamente padronizados no laboratório através dc experimentos de saturação. Os valores obtidos de Ká e Umax foram 2,05 ± 0,28 nM e 124 ± 7 fmol/mg proteína (n = 1), respectivamente. Incubou-se, por 60 minutos a 30°C, 150 pg de preparação membranar de córtex de rato, contidos em 50 μΐ de suspensão em Tris-HCl 50 mM, em tubos contendo 400 pL de solução intermediária ([3HJRX821002 1,25 nM, Tris 50 mM, (pH 7,4, a 37°C) além de 50 pL de diferentes concentrações de LDT's (concentração final 10'7 — 3 x 10'5 M para LDT65-68), ou 50 pL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 à 37°C (veículo para a diluição dos LDT's), para a determinação da ligação total, ou 50 pL de bitartarato de adrenalina não radioativa a 100 pM para a determinação da ligação não-específica (volume final de 500 pL). Os ensaios foram realizados em triplicata.

Após o período de incubação, a reação foi parada pela adição de 4 mL de solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4), seguida por filtração à vácuo em filtros de fibra de vidro (GMF 3, Filtrak®) previamente umedecidos com solução de polietilenoimina 0,5%. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL da solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4) sob vácuo para remover todo radioligante livre. Em seguida os filtros foram secos e acondicionados em vials contendo 5 mL de líquido de cintilaçâo (composição: PPO 4%, POPOP 0,1% p/V em tolueno). A radioatividade retida nos filtros foi então determinada em contador de cintilaçâo líquida (Packard Tri-Carb 1600 TR). A ligação específica da [3I1JRX821002 aos receptores a2A foi definido como a diferença entre a ligação total e a ligação não-específica. Para estes receptores também foram determinados os parâmetros CI50 e Kl.

Receptores 5-HT1A Preparação membranar Foram realizadas preparações membranares de hipocampo de rato de acordo com o descrito anteriormente por HALL e cols. (1985) e PEROUTKA (1986). As etapas de homogeneização e centrifugação foram realizadas de maneira idêntica à descrita anteriormente para receptores a2A e receptores 5-HT2A.

Binding da [3IIJ-8-OII-DPAT ou da [3H]p-MPPF aos receptores 5-HT1A Os ensaios de ligação para os receptores 5-HT1A foram realizados de acordo com o descrito anteriormente na literatura e previamente padronizados no laboratório através de experimentos de saturação. Os valores obtidos de Kd e Umax foram 0,7 ±0,1 nM e 125 ± 42 fmol/mg proteína, respectivamente (NEVES e cols., Bioorg. Med. Chem. 18(5):1925-1935, 2010). Incubou-se, por 15 minutos a 37°C, 50 pg de preparação membranar de hipocampo de rato, contidos em 50 pl de suspensão em Tris-HC1 50 mM, em tubos contendo 400 pL de solução intermediária ([3H]-8-OH-DPAT 1,25 nM, CaC12 1,25 mM, MnC12 1,25 mM, pargilina 10 μΜ (visando a proteção da possível degradação do radioligante pela enzima monoaminoxidase (MAO), Tris 50 mM, (pH 7,4, a 37°C) além de 50 pL de diferentes concentrações de LDT's (concentração final IO'10 - 10‘6 M para LDT 2-6; IO'12 - IO'6 M para LDT 8; e IO'9 - 10'4 M para LDT 62-70 e LDT 39), ou 50 pL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 à 37°C (veículo para a diluição dos LDT's), para a determinação da ligação total, ou 50 pL de serotonina não radioativa a 10 pM para a determinação da ligação não-específica (volume final de 500 pL). Os ensaios foram realizados em triplicata. Altemativamente, incubou-se por 45 min. A 37°C, 50 pg de preparação membranar de hipocampo de rato, contidos em 50 pl de suspensão em Tris-HCl 50 mM, em tubos contendo 400 pL de solução intermediária ([3H]p-MPPF 0,625 nM, GTP 1,25 mM e Tris 50 mM, (pH 7,4, a 37°C) além de 50 pL de diferentes concentrações de LDT's (concentração final 10"9 3 χ 10"7 M para LDT 65-68), ou 50 pL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 à 37°C (veículo para a diluição dos LDT's), para a determinação da ligação total, ou, da mesma forma que no binding da [3H]-8-OH-DPAT, 50 pL de serotonina não radioativa a 10 μΜ para a determinação da ligação não-específlca (volume final de 500 pL). Os ensaios foram realizados em triplicata.

Após o período de incubação, a reação foi parada pela adição de 4 mL de solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4), seguida por filtração à vácuo em filtros de fibra de vidro (GMF 3, Filtrak®) previamente umedecidos com solução de polietilenoimina 0,5%. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL da solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4) sob vácuo para remover todo radioligante livre. Em seguida os filtros foram secos e acondicionados em vials contendo 5 mL de líquido de cintilação (composição: PPO 4%, POPOP 0,1% p/V em tolueno). A radioatividade retida nos filtros foi então determinada em contador de cintilação líquida (Packard Tri-Carb 1600 TR). A ligação específica da [3H]-8-OfI-DPAT aos receptores 5-HT1A foi definido como a diferença entre a ligação total e a ligação não-específica. Para estes receptores também foram determinados os parâmetros 050 e Ki.

Atividade intrínseca em receptores 5-HT1A nativos A presença de GTP desloca o GPCR para um estado de baixa afinidade (Lahti c cols, 1992). A atividade intrínseca de uma substância ao GPCR pode ser estimada utilizando o radioligante agonista ou antagonista apropriado para definir a afinidade da substância no estado de alta e baixa afinidade do receptor, respectivamente. Portanto, para se definir a atividade intrínseca dos derivados mais potentes em receptores 5-HT1A foram calculados as suas constantes de dissociação (Vi), utilizando-se como radioligante um antagonista ([3H]p-MPPF) na presença de uma alta concentração de GTP (Vi baixa), ou um agonista ([3H]-8-OH-DPAT) na ausência de GTP (Ki alta). Valores para razão de Κι (Ki Baixa/Vi Alta) consideravelmente maior do que 1 (um) indicam um agonismo, ao passo que valores próximos de I indicam antagonismo enquanto valores negativos indicam agonismo inverso.

Binding da [3H]-ketanserina aos receptores 5-HT2A

Os ensaios de ligação para os receptores 5-HT2A foram realizados de acordo com o descrito na literatura. Os valores de Vd e ümax obtidos em experimentos prévios do laboratório foram 1,77 ± 0,07 nM e 348 ±51 fmol/mg proteína, respectivamente. Incubou-se por 15 minutos a 37°C, 150 pg de preparação membranar contidos em 50 pL de suspensão de córtex de rato em tubos contendo 400 pL de solução intermediária ([3H]-ketanserina 1,25 nM, prazosina 125 nM, Tris 50 mM, HC1 IN até pH 7,4, a 37°C) além de 50 pL de diferentes concentrações de LDT's (concentração final IO-10 - 10'4 M para LDT 2-4; e 10‘8 - IO"4 M para LDT 5-8), ou 50 pL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 à 37°C (veículo para a diluição dos LDT's), para a determinação da ligação total, ou 50 pL de ketanserina não radioativa a 10 pM para a determinação da ligação não-específica (volume final de 500 pL). Os ensaios foram realizados em triplicata.

Após o período de incubação, a reação foi parada pela adição de 4 mL de solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4), seguida por filtração à vácuo em filtros de fibra de vidro (GMF 3, Filtrak®) previamente umedecidos com solução de polietilenoimina 0,5%. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL da solução gelada contendo Tris 5 mM (pH 7,4) sob vácuo para remover todo radioligante livre. Em seguida os filtros foram secos e acondicionados em vials contendo 5 mL de líquido de cintilação (PPO 4%, POPOP 0,1% p/V cm tolueno). A radioatividade retida nos filtros foi então determinada em contador de cintilação líquida (Packard Tri-Carb 1600 TR). A ligação específica da [3H]-ketanserina aos receptores 5-FIT2A foi definido como a diferença entre a ligação total e a ligação não-específica. Para estes receptores também foram determinados os parâmetros 050 e K\ .

Dosagem de proteínas A dosagem do conteúdo de proteínas nas amostras foi realizada pelo método colorimétrico proposto na literatura e modificado para microplaca (placa de 96 poços). Para a construção da curva padrão utilizou-se a proteína albumina scrica bovina (BSA) nas concentrações de 50, 100, 200, 250, 350 pg/mL. Adicionou-se 50 pL dos padrões de proteína ou 50 pL de amostras diluídas de proteína em estudo a cada poço contendo 250 pL de uma solução de carbonato dissódico 2% em NaOH 0,1N, sulfato cúprico 1% e tartarato de sódio-potássio 2%, 50 pL de água (branco). Por fim, seguiu-se a adição de 15 pL do reagente de Folin a cada poço e homogeneização com pipeta multicanal. A placa foi incubada por 45 min a temperatura ambiente a partir da homogeneização do primeiro poço. Os valores de absorbância foram obtidos em espectrofotômetro de placa em comprimento de onda igual a 700 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata e usando dois fatores de diluição diferentes. Os cálculos do conteúdo de proteínas das amostras foram realizados por interpolação utilizando os valores de absorbância da curva padrão versus concentração de proteína, os quais foram analisados por regressão linear com o uso do programa GraphPad Prism 4.0. Os valores foram expressos em mg proteína/mL de homogeneizado.

Análise dos dados e tratamento estatístico Os dados obtidos nos ensaios de ligação foram analisados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (EUA), a fim de se calcular os parâmetros da curva de competição, CISO, e da curva de saturação, tais como Kà e JSmax. Em especial, para os experimentos de saturação nos receptores alA e alB-adrenérgicos foram testados os modelos de um ou dois sítios de ligação, escolhendo-se o que melhor se aplica através do teste F (DE LEAN e cols., Mol Pharmacol. 21(1):5-16, 1982). Assim, quando a soma dos quadrados dos erros foi reduzida significativamente ao assumir o modelo de dois sítios frente ao modelo de um sítio, o primeiro modelo foi utilizado para se obter estimativas dos valores de Kà da prazosina. Por outro lado, quando não houve melhora significativa ao adicionar um segundo sítio, foi obtido um único valor de Kà. A diferença entre os grupos experimentais foi analisada por análise de variância fator único (one-way ANOVA) seguida pelo teste post hoc Newman-Keuls (mais de 2 grupos), em ambos os casos considerando P < 0,05.

Inibição da contração induzida por fenilefrina em aorta de rato De acordo com SCOFIELD e colaboradores (J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1035-1042, 1995) assim como TESTA e colaboradores (Life Sei. 57(13):P1159-63, 1995), a aorta torácica de rato corresponde a um tecido que expressa majoritariamente adrenoceptores alD além de serem enriquecidas em receptores serotoninérgicos subtipo 5-HT2A (Banes e cols., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:1179-1187, 1999). Tendo isto em vista, os ensaios funcionais de contração em modelo de órgão isolado foram realizados utilizando estes tecidos. Quando adicionados ao banho de incubação, nenhum dos LDT's (50 nM) alterou a linha basal de tensão isométrica. Desta forma, descartou-se um possível efeito agonista sobre receptores com ação vasoconstrictora, como por exemplo os adrenoceptores al ou serotoninérgicos (5-HT2A), nesta concentração. Paralelamente, visando descartar a existência de algum artefato sobre a contração medida, um controle temporal foi realizado onde adicionou-se apenas o veículo (água ultrapura Milli Q®) no lugar da substância a ser testada, seguindo rigorosamente o mesmo protocolo que as demais cubas que tiveram adicionadas os LDT's (Figura 1).

Realizamos experimentos com BMY7378 50 nM, antagonista de adrenoceptores a1D usado como controle positivo, e obtivemos um valor de KB = 2,95 nM, compatível com a literatura (CARROLL e cols., Bioorg. Med. Chem. Lett., 11:1119-1121, 2001). Dentro da série dos LDT's 2-6 e 8, todas as substâncias, exceto o LDT6, reduziram a contração induzida pela FE, além de induzirem um deslocamento das curvas concentração-resposta à FE para direita, quantificado pela razão de CE50 (CR). Assim, os dados sugerem um efeito antagonista alD adrenérgico para todos os derivados estudados, exceto LDT6. Posteriormente foi calculada a afinidade aparente dos antagonistas (Tabela 1). A segunda condição experimental (LDT's 10 nM) foi realizada apenas para LDT 5 e 8, ou ainda 2 nM (LDT 245), visando determinar a afinidade (KB) calculada através da equação de Schild. Toda a série LDT 2-8, exceto LDT6, mostrou grande afinidade pelos adrenoceptores alD. Comparando-se com ο BMY7378 (ΛΏ = 2,95 nM) a afinidade por este receptor é maior para os derivados LDT 5 e 8 (ΑΉ = 0,57 e 0,16, respectivamente, *P < 0.05).

Com relação aos demais derivados LDT's 62-70 e 39, todas as curvas concentração-resposta à fenilefrina sofreram um clássico deslocamento para direita, quantificado pela razão de CE50 (CR) (Tabela 4), na presença dos LDT's em relação a curva controle, comportando-se assim, como antagonistas competitivos. Dentre os antagonistas Λ'-fenilpiperazínicos com variação na cadeia alquílica ligada à posição RI (LDT's 63-68), e comparando-os com o derivado LDT62, houve um aumento significativo da afinidade relativa (ΑΊ3) pelos receptores alD-adrenérgicos para os derivados LDT66 e LDT67 (Tabela 2), nos quais a cadeia alquílica variou de seis a sete carbonos, respectivamente, indicando que interações hidrofóbicas são relevantes para o reconhecimento molecular por este subtipo de receptor adrenérgico, o que está de acordo com a literatura em que descreve o importante papel de forças hidrofóbicas na determinação da afinidade de /Y-fenilpiperazinas ou orm-metóxifenilpiperazinas para adrenoceptores a. O aumento da hidrofobicidade no LDT69, dado pela substituição em R2 pelo grupo etoxila, não alterou a afinidade para os receptores alD-adrenérgicos, em relação ao LDT62, no qual R2 é uma metoxila. Por outro lado, a inserção de grupo hidrofílico doador e aceptor de ligação hidrogênio, ou a ausência de substituinte em R2, observado para LDT70 e LDT39, respectivamente, diminuem a afinidade pelos receptores alD-adrenérgicos. A faixa de afinidade dos LDT's 66-68 para os adrenoceptores alD é equivalente à afinidade descrita para outros antagonistas JV-fenilpiperazínicos como o BMY7378 e o naftopidil.

Tabela 1: Afinidade dos LDT's (2-6, 8 e 245) e BMY7378 pelos adrenoceptores alD

Valores de ATI calculados individualmente e obtidos a partir dos experimentos funcionais na presença de LDT, ou BMY7378, a 50 nM, blO nM ou c2 nM; A CR (razão entre as CE50 na presença e ausência LDTs) é a média das CRs calculadas a partir CE50 obtidas na análise por regressão não linear. * Ρ < 0,05 comparado ao BMY7378 (ANOVA fator único seguido por teste de Newman-Keuls).

Tabela 2: Afinidade dos LDT's (62-70 e 39) pelos adrenoceptores alD

Valores de KB calculados individualmente e obtidos a partir dos experimentos funcionais na presença de LDT 50 nM (LDTs 62-69) ou 10 μΜ (LDTs 70 e 39); A CR (razão entre as CE50 na presença e ausência LDTs) é a média das CRs calculadas a partir CE50 obtidas na análise por regressão não linear.aP < 0,001 e bP < 0,01 comparado ao LDT62 (ANOVA fator único seguido por teste de Newman-Keuls) Ensaios de ligação (Binding) Adrenoceptores alA e alB - Porcentagem de ligação da [3El]-prazosina Primeiramente ensaios de saturação em preparação de fígado de coelho e rato foram realizados para determinar os parâmetros de ligação da [3H] -prazosina. Para adrenoceptores alA, após análise considerando a ligação do radioligante a um ou dois sítios de ligação específica, o melhor ajuste da curva foi obtido considerando-se o modelo de dois sítios. Neste caso tem-se um sítio de alta afinidade, correspondendo ao sub-tipo alA, e um segundo sítio de baixa afinidade, sub-tipo alL, cuja existência, natureza e função são discutidas na literatura. Enquanto que para adrenoceptores αΙΒ o melhor ajuste se deu em modelo de apenas um sítio de ligação. Utilizando a prazosina não radioativa como agente competidor padronizou-se a curva de competição para a ligação dc [3H]-prazosina 0,1 nM. Nestas condições, a curva de competição foi bifásica, cm preparação de fígado de coelho, com aproximadamente 2/3 dos sítios marcados pela [3H]-prazosina 0,1 nM apresentando alta afinidade pela prazosina (050 = 0,16 nM) e 1/3 dos sítios apresentando baixa afinidade (050 =19 nM).

Os valores de Kà da [3II]-prazosina para adrenoceptores αΐ A foram 0,46 nM e 56,5 nM para os sítios de alta e baixa afinidades, respectivamente (n = 3), e para adrenoceptores αΙΒ o valor de Kà foi 0,34 nM (n = 3), estando de acordo com a literatura (SHIBATA c cols., Mol. Pharmacol., 48:250-258, 1995). Com relação aos LDT's, toda a serie testada foi capaz dc inibir a ligação específica da [3H]-prazosina em ensaios de competição.

Para o cálculo de K\ dos LDT's utilizou-se a equação de Cheng-Prusoff onde utilizou-se, para a prazosina (PZS) os valores de Kà de 0,46 nM e 56,5 nM para os sítios de alta e baixa afinidade, respectivamente, para adrenoceptores alA, e utilizou-se Kà = 0,34 nM para adrenoceptores αΙΒ. Os valores de K\ obtidos seguem sumarizados nas tabelas 3 a 5 a seguir.

Tabela 3: Parâmetros farmacológicos dos LDT's (2-6 e 8) em adrenoceptores αΐ A a Valores de 050 foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM; b Valores de Al foram calculados através da equação dc Cheng-Prusoff; P < 0,05 comparado à PZS (ANOVA fator único seguido por Newman-Keuls).

Tabela 4: Parâmetros farmacológicos dos LDT's (2-6 e 8) adrenoceptores alB a Valores de 050 foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM; b Valores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff.

Tabela 5: Parâmetros farmacológicos dos I i)T's (62-70 e 39) em adrenoceptores alA e alB

Valores de CI50 foram calculados por regressão nâo-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM; a Valores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff; b P < 0,01 comparado à LDT62 (ANOVA fator único seguido por Newman-Keuls).

Toda a série LDT 2-8 apresentou, além. da capacidade de reconhecimento dos dois sítios de ligação, valores de Ki na faixa nanomolar para o componente de alta afinidade (alA), semelhante ao observado para a prazosina (Tabela 3). Houve um aumento de afinidade dos derivados LDT65 a LDT69, em relação ao LDT62 para os adrenoceptores αΐA. Os derivados LDT66, LDT68 e LDT69 (Ki igual a 43, 38 e 33 nM, respectivamente) apresentaram afinidade de seis a oito vezes maior (P < 0,01) do que o LDT62 (Al = 261 nM) (Tabela 5). Embora LDT65 e LDT67 tenham apresentado valores de Ki de três a quatro vezes menores (67 e 81 nM, respectivamente) comparado a LDT62, este aumento de afinidade não foi significativo (P = 0,06 (LDT65) e 0,1 (LDT67)). Não houve diferença de afinidade entre θ IJDT62 e os derivados LDT63, LDT64, TDT39 e LDT70. Para adrenoceptores alB, mais uma vez observou-se um perfil de menor afinidade para o LDT6, na faixa μΜ, quando comparados aos demais, com destaque para o LDT8, faixa nanomolar, porém a diferença não foi significativa. Desta forma, observamos que a substituição auxofórica observada em LDT6 não contribui para a modulação positiva da afinidade aparente pelos subtipos de adrenoceptores alB/D.

Os derivados LDTrs 62-70 e LDT39 possuem menor afinidade pelos adrenoceptores alB em relação aos receptores alA e alD. Embora nenhuma das modificações estruturais realizadas nestes I ,DT's tenha alterado a afinidade significativamente, parece haver um aumento de afinidade conforme o aumento da cadeia alquílica a partir do derivado LDT65. Além disso, também parece haver maior interação quando se tem o grupo etoxila na posição R2 da subunidade fenilpiperazina presente em LDT69 (também observado para o LDT8), em comparação com a metoxila do LDT62, seguindo o mesmo padrão de afinidade que os receptores alA, porém em um grau menor. Mokrosz e cols. (1997) apenas verificaram que os LDT's 66 e 68 são ligantes de receptores α 1-adrenérgicos no entanto, não determinaram a sua afinidade. Desta forma, nós avaliamos por quais subtipos de adrenoceptores alos LDT's se ligariam especificamente e qual seria a sua atividade intrínseca nestes subtipos. Assim como para os adrenoceptores alD, parece que interações hidrofóbicas relacionadas com tamanho ótimo da cadeia alquílica são requisitos importantes para o reconhecimento molecular dos receptores alA, pois as afinidades (Tabela 6) são significativamente maiores para os derivados LDT66 e LDT68, os quais possuem cadeia alquílica com 6 e 8 carbonos, respectivamente.

Os LDT's com aumento de tamanho da cadeia alquílica, mais especificamente os derivados LDTs 65-68, sendo os LDT 66 e 68 os mais potentes, estão dentro da faixa de afinidade apresentada pela maioria dos fármacos em uso clínico, de tal forma que se tornam assim potenciais novos antagonistas duais de adrenoceptores al (alA e alD) os quais podem ser úteis não só no alívio dos sintomas da HPB mas também para inibir a proliferação do tecido prostático via antagonismo dos adrenoceptores al A.

Receptores a2A - Porcentagem de ligação de [3H]RX821002 Previamente foram realizados, por nosso grupo, ensaios de saturação em córtex de rato, nos quais se determinou os parâmetros de ligação do [3H]RX821002 (Kâ = 2,05 ± 0,28 ηΜ e 5max = 124 ± 7 fmol/mg proteína) para receptores a2A. Este valor de Kd foi utilizado para o cálculo de Ki dos LDT s utilizando-se a equação de Cheng-Prusoff.

Em ensaios de competição, os LDT's 65-68 foram capazes de inibir a ligação específica da [3HJRX821002 aos receptores a2A-adrenérgicos, porém com afinidades mais baixas (faixa μΜ, tabela 5), assim como para os αΙΒ-adrenérgicos, em relação aos receptores alA/lD-adrenérgicos. O fato de estas substâncias apresentarem baixa afinidade por este receptor é relevante na medida em que existe grande homologia entre os subtipos de adrenoceptor a2. Assim, os LDT s testados possivelmente apresentarão pouco bloqueio deste adrenoceptor a2A que está envolvido com a regulação dos sistemas nervoso central, cardiovascular e genitourinário masculino, por inibirem a liberação de catecolaminas nestes sistemas.

Tabela 6: Parâmetros farmacológicos dos LDT's (65-68) em receptores a2A.

Valores de CI50 foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM de (n) experimentos individuais; Valores de K\ foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff.

Receptores 5-HT1A - Porcentagem de ligação de [3HJ-8-OH-DPAT

Foram realizados ensaios de saturação em hipocampo de rato, tecido enriquecido em receptores 5-HT1A, para determinação dos parâmetros de ligação do [3H]-8-OH-DPAT {Kd = 0,7 ± 0,1 nM e f?max = 125 ± 42 fmol/mg proteína, n=3), estando de acordo com a literatura (NEVES e cols., Bioorg. Med. Chem. 18(5):1925-1935, 2010). Este valor de Kd foi utilizado para o cálculo de Ki dos LDT's utilizando-se a equação de Cheng-Prusoff. Os valores de Ki obtidos seguem sumarizados nas tabelas 7 e 8. Em ensaios de competição, toda a série testada foi capaz de inibir a ligação específica do [3HJ-8-OH-DPAT. Neste receptor, o derivado de maior destaque foi o LDT8, o qual exibiu uma afinidade muito elevada (Ki = 23,7 pM). Comparado a ele, todos os demais componentes da série apresentam afinidade significativamente menor ainda que todas apresentem uma afinidade elevada, na faixa nanomolar.

Comparado ao LDT62 (Ki = 147 nM), os LDT’s 65-68 têm afinidades de 8-29 vezes maiores (Ki (nM): 18; 5; 18 e 9, respectivamente, P < 0,05). Por outro lado, os LDT63, LDT64, LDT69, LDT70 e LDT39 têm afinidades semelhantes, não havendo diferença estatisticamente significativa (P > 0,05) entre os seus valores de Ki e aquele do LDT62 (Tabela 8).

Tabela 7: Parâmetros farmacológicos dos LDT's (2-6, 8 e 245) em receptores 5-IIT1 A. a Valores de CISO foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) c expressos como média ± EPM; bValores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff; * P < 0,01 e ** P < 0,001 comparado ao LDT 8 (ANOVA fator único seguido por teste de Newman-Keuls).

Tabela 8: Parâmetros farmacológicos dos LDT s (62-70 e 39) em receptores 5-HT1A.

Valores de CI50 foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como media ± EPM;

Valores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff; a P < 0.001, b P < 0.01 e c P < 0.05 comparado ao LDT 62 (ANOVA fator único seguido por teste de Newman-Keuls).

Em outro ensaio de competição pelos receptores 5-IIT1A, os LDT 65-68 foram capazes de inibir a ligação específica do antagonista [3H]p-MPPF com afinidade na faixa nM, assim como para o agonista [3H]-8-OIl-DPAT. As razões dos valores de Ki para os estados de baixa e alta afinidade do receptor, dada pelo antagonista e agonista, respectivamente, foram próximas da unidade (Tabela 9), sugerindo que estes quatro derivados atuariam como antagonistas dos receptores 5-HT1 A, os quais podem ser úteis na inibição da proliferação do tecido prostático que ocorre na HPB.

Tabela 9. Estimativa da atividade intrínseca dos LDT 65-68 nos receptores 5-HT1 A. valores de Ai /oram calculados através de experimentos de competição com o radioligante agonista [3HJ8-OH-DPAT (Ai alta) e o radioligante antagonista [3H]p-MPPF na presença de GTP (Ai baixa) em preparações membranares de hipocampo de rato. A razão de Ai para os estados de baixa e alta afinidade do receptor é uma estimativa da atividade intrínseca.

Receptores 5-HT2A - Porcentagem de ligação de 13H"|-ketanserina Previamente foram realizados, por nosso grupo, ensaios de saturação em córtex de rato, tecido enriquecido em receptores 5-HT2A (NEVES e cols., Bioorg. Med. Chem. 18(5):1925-1935, 2010), nos quais se determinou os parâmetros de ligação do [3H]-ketanserina, (Ad = 1,77 ± 0,07 nM e firnax = 348 ± 51 fmol/mg proteína, n=2). Este valor de Kd foi utilizado para o cálculo de Ai dos LDT's utilizando-se a equação de Cheng-Prusoff (CHENG & PRUSOFF, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, 1973). Os valores de AÍ obtidos seguem sumarizados nas tabelas 10 e 11. Em ensaios de competição, toda a série testada foi capaz de inibir a ligação específica da [3H]-ketanserina.

Tabela 10: Parâmetros farmacológicos dos I,DT's (2-6 e 8) em receptores 5-HT2A. a Valores de 050 foram calculados por regressão não-lincar, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM; b Valores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff Tabela 11: Parâmetros farmacológicos dos LDTs (62-70 e 39) em receptores 5-HT2A.

Valores de 050 foram calculados por regressão não-linear, utilizando o software GraphPad Prism (USA) e expressos como média ± EPM;

Valores de Ki foram calculados através da equação de Cheng-Prusoff; a P < 0,001, b P < 0,05 comparado ao LDT 62 (ANOVA fator único seguido por Newman-Keuls).

De maneira distinta do que foi observado para os receptores 5-HT1 A, há pouca diferença de afinidade entre a maioria dos LDT's (diferença não excede 20 vezes entre os valores de K\), com exceção do LDT70 com afinidade bem menor, o qual possui afinidade 6 vezes menor que o LDT62 (P < 0,05). De maneira geral, comparado às afinidades dos LDT s 2-6 e 8, LDT’s 62-70 e LDT39 por todos os receptores estudados, as afinidades observadas para os receptores 5-HT2A são as menores, assim como ocorre para o derivado LDT65 em relação aos receptores a2A-adrenérgicos.

Derivados V-fenilpiperazínicos antagonistas de adrenoceptores alA, alD e de receptores 5-HT1A no tratamento da Hiperplasia Prostática Benigna, Composições Farmacêuticas contendo os Mesmos.

Claims

1. Derivados A-fenilpiperazínicos com alta afinidade por adrenoceptores αΙΑ/D e receptores 5-ΗΊΓ1A caracterizados por compreender: - um átomo de nitrogênio básico para interação iônica com o grupo carboxilato do resíduo aspartato (Asp) na TM3 desses receptores; e - ao menos um anel aromático para interações hidrofóbicas e eletrostáticas com resíduos complementares nas TM2, 4, 6 e 7; e - um grupo com densidade de carga negativa na posição 2 (orto) ao nitrogênio da subunidade yV-fenilpiperazina, aceptor de ligação de hidrogênio e.g. alcóxidos e isósteros.

2. Derivados /V-fenilpiperazínicos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por ser selecionados do grupo que compreende: