BR112019022015A2 - Inibidores de moléculas pequenas de fosforilação de promotor de morte associado a bcl-2 (bad) - Google Patents

Inibidores de moléculas pequenas de fosforilação de promotor de morte associado a bcl-2 (bad) Download PDF

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heteroaryl
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Edward Lobie Peter
Kumar Pandey Vijay
Kanchugarakoppal Subbegowda Rangappa
Salundi Bassappa
Chakrabhavi Dhananjaya Mohan
Rangappa Shobith
Venkatachalaiah Srinivasa
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University Of Mysore
Bangalore University
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Abstract

a invenção refere-se a compostos de fórmula geral (i): em que r1, n, r2a, r2b e r3 são como aqui definidos. os compostos são inibidores de fosforilação de promotor de morte associado a bcl-2 (bad) e têm atividade antiapoptótica e são úteis no tratamento de câncer, particularmente câncer de mama, câncer endometrial, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer de próstata ou câncer de pâncreas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: INIBIDORES DE MOLÉCULAS PEQUENAS DE FOSFORILAÇÃO DE PROMOTOR DE MORTE ASSOCIADO A BCL-2 (BAD)
[001] A presente invenção refere-se a novos compostos, e em particular a compostos que são inibidores do promotor de morte associado a Bcl-2 (BAD) em células cancerígenas,
aos compostos para uso no tratamento ou na prevenção de
câncer e a composições farmacêuticas compreendendo os
compostos.
[002] A apoptose ou morte celular programada é um
mecanismo regulador totalmente envolvido na eliminação de células imunes autorreativas, células envelhecidas e células com danos irreparáveis a DNA [1]. A apoptose é executada por dois mecanismos distintos nos vertebrados - a via extrínseca e a intrínseca [2]. A via intrínseca é ativada em condições hipóxicas, após danos genômicos graves, estresse oxidativo ou após a depleção do fator de crescimento [3]. As proteínas da família BCL-2 têm um papel central na regulação da via apoptótica intrínseca [4] . Mais de 20 membros da família BCL-2 foram identificados e classificados amplamente em proteínas antiapoptóticas, pró-apoptóticas e BH3-apenas. BCL-2, BCL-xL e BCL-w são antiapoptóticas; BAK e BAX são pró-apoptóticas; e BAD, BIM, PUMA, NOXA são as proteínas BH3-apenas pro-apoptóticas predominantes [5-7]. Portanto, os membros da família BCL-2 desempenham funções pró e
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2/76 antiapoptóticas com um equilíbrio mantido entre os mesmos, e as proteínas BH3-apenas pró-apoptóticas são normalmente reprimidas para garantir a homeostase [8].
[003] A supressão da apoptose contribui para a sobrevivência celular inadequada e o (a) desenvolvimento e/ou progressão do câncer [9-11]. Na maioria das neoplasias malignas, a expressão de proteínas antiapoptóticas é aumentada, levando ao desenvolvimento de resistência à apoptose. O promotor de morte associado a Bcl-2 (BAD) desempenha um papel crítico na regulação da apoptose, interagindo com Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w [12]. A BAD humana é fosforilada em Ser75 (resíduo murino equivalente é Serll2) por p44/42 MAP quinase e Ser99 (resíduo murino equivalente é Serl36) por AKT/p70S6K [13]. Ambos os resíduos de serina também são fosforilados pelas quinases da família Pim para evitar a apoptose [14]. A fosforilação de BAD em um desses resíduos resulta na perda da capacidade de hBAD de heterodimerizar com BCL-xL ou BCL-2 [15] . A proteína BAD fosforilada é heterodimerizada com a proteína 14-3-3 e sequestrada no citoplasma [16]. Após o início da apoptose, a BAD sofre desfosforilação e heterodimeriza com BCL-2, BCLxL ou BCL-w, o que permite BAK e BAX a promoverem a liberação do citocromo C no citoplasma, com subsequente promoção da via apoptótica intrínseca [17] . Também foi relatado que a BAD possui outras interações proteicas e funcionais dentro
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3/76 da célula. Por exemplo, a expressão de BAD é regulada por complexos p53 e BAD com p53 para promover a apoptose [18]. Bad é regulado positivamente de forma transcricional por p53 e forma um complexo Bad/p53 nas mitocôndrias para induzir apoptose [18] . Clinicamente, a alta expressão de BAD está associada a altos escores de Gleason no câncer de próstata [15] e a fosforilação de BAD tem sido relatada para prever uma sobrevida global ruim no câncer de ovário [19] e para ser associada à resistência à cisplatina [19]. Além disso, a BAD fosforilada é observada em mais de 80% da população de células-tronco cancerígenas positivas para CD44 (CSC) no câncer de mama e a fosforilação da BAD tem sido relatada como essencial para a sobrevivência das CSC [20].
[004] Inúmeros moduladores de moléculas pequenas de morte celular programada foram desenvolvidos, visando proteínas da família BCL-2 para uso terapêutico contra várias neoplasias malignas humanas [21-23]. Até o momento, não foram relatados moduladores de moléculas pequenas de proteínas BH3-apenas, tal como BAD. Assim, há uma necessidade de desenvolver compostos/terapias melhores e eficientes para controlar o câncer, inibindo a fosforilação de BAD sem afetar os eventos a montante.
[005] Na presente invenção, é provido um composto da fórmula geral (I):
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4/76
Figure BR112019022015A2_D0001
0) em que:
cada R1 é independentemente halo, OH, ciano, nitro, NR10R11, 0(0) R10, 0(0) OR10, Ο(Ο)ΝΗ10Η1]-, -S (0) qNR10R11, alquila Ci-6, haloalquila Ci-s, -0 (alquila Ci-s) , -0 (haloalquila Ci-s) , arila, heteroarila, -0-arila ou -O-heteroarila, em que cada um de R10 e R11 é independentemente selecionado de H ou alquila Ci-s opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de OH, halo, ciano, NH2, arila ou heteroarila;
grupos alquila e haloalquila R1 são opcionalmente substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de OH, ciano, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, arila, heteroarila, 0-arila ou -O-heteroaril-O (alquila Ci-s) opcionalmente substituído com arila ou -0 (haloalquila Ci-s) ;
os grupos arila ou heteroarila R1 são opcionalmente substituídos com um ou mais substituinte (s) selecionado(s) de halo, OH, ciano, nitro, -NR4R5, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, 0(0) R4, -0(0) OR4 ou -alquila Ci-s ou -0 (alquila Ci-s) , qualquer
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5/76 um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituinte (s) selecionado (s) de OH, halo, arila, heteroarila, -0 (alquila Ci-s) , 0 (haloalquila Ci-s) , -0-arila ou -O-heteroarila);
p é 1 ou 2;
cada um de R4 e R5 é selecionado independentemente de H ou alquila C1-4 ou R4 e R5, juntamente com um átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterocíclico de 3 ou 8 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0 , N e S;
néO, 1, 2, 3 4 ou 5;
cada um de R2a e R2b é independentemente alquila Ci-s opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, arila ou heteroarila; ou
R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocí clico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N ou S e opcionalmente substituído(s) com um ou mais substituintes R6;
cada R6 é selecionado independentemente de arila, heteroarila, -0-arila, -O-heteroarila, carbociclila, heterociclila, -O-carbociclila, -O-heterociclila, R12, OR12, 0(0) R12, 0(0) OR11, Ο(Ο)ΝΗ41Η12, ON, OH, cada um de R11 e R12 é independentemente H ou alquila Ci_
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4, ou que pode ser substituído com um ou mais grupos arila ou heteroarila, em que grupos arila e heteroarila são substituídos com um ou mais substituinte (s) selecionado (s) de halo, OH, ciano, nitro, -NR4R5, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, C(O)R4, -C(O)OR4 ou -alquila Ci-s ou -0 (alquila Ci-s) , ou um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais
substituinte(s) selecionado( (s) de OH, halo, arila,
heteroarila, -0 (alquila Ci-s) , 0( haloalquila Ci-e), -0 -arila
ou -O-heteroarila);
em que R4 e R5 são como definidos acima; ou R11 e R12
podem combinar com um átomo de nitrogênio ao qual estão
ligados para formar um anel heterocíclico de 3 a 8 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de N, 0 e S e opcionalmente substituídos com alquila Ci-4, haloalquila C1-4 ou halo;
R3 é arila, heteroarila, carbociclila ou heterociclila, qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes R7 selecionado (s) de halo, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -0 (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, 0 (haloalquila C1-4) ou -C(O)NR8R9;
cada R8 e R9 é selecionado independentemente de H, alquila C1-4 ou cicloalquila C3-6 ou R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente
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7/76 um ou mais heteroátomo(s) adicional (ais) selecionado (s) de 0, N e S;
ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma variante deuterada ou tritiada do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros.
[006] Os compostos de fórmula geral (I) inibem a fosforilação de BAD específica do local sem afetar sua quinase a montante e, portanto, são úteis na promoção da apoptose em múltiplas células derivadas de câncer.
[007] No presente relatório descritivo, exceto quando o contexto exigir de outra forma devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra compreende, ou variações como compreendem ou compreendendo é usada em um sentido inclusivo, ou seja, para especificar a presença das características declaradas, mas não para impedir a presença ou adição de outras características em várias formas de realização da invenção.
[008] No presente relatório descritivo, o termo alquila Ci-s refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada totalmente saturada tendo de 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, t-butila, n-hexila.
[009] O termo alquila C1-4 tem um significado semelhante, mas refere-se a grupos alguila com entre 1 e 4 átomos de carbono.
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[010] O termo haloalquila Ci-s refere-se a um grupo alquila Ci-s como definido acima, no qual um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por átomos de halo. Os grupos haloalquila podem ter qualquer número de substituintes halo de 1 a per-halossubstituídos. Exemplos incluem clorometila, trifluorometila, 1-bromoetila, 1,1,2,2-tetrafluoroetila etc.
[011] O termo carbociclila refere-se a um anel de hidrocarboneto não aromático tendo de 3 a 7 átomos de carbono e, opcionalmente, contendo uma ou mais de ligação dupla carbono-carbono. Exemplos incluem grupos cicloalquila C3-7, tais como, grupos cidopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e ciclo-heptila e cicloalquenila, tal como ciclo-hexenila.
[012] O termo heterociclila refere-se a um anel não aromático tendo 5 a 7 átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo do anel selecionado de N, O e S. Os exemplos incluem piperazinila, piperidinila, morfolinila, pirrolidinila e imidazolinila.
[013] No presente relatório descritivo, halo referese a flúor, cloro, bromo ou iodo.
[014] O termo arila no contexto do presente relatório descritivo refere-se a um sistema de anéis com caráter aromático tendo de 5 a 14 átomos de carbono no anel, a menos que especificado de outra forma, e contendo até três
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9/76 anéis. Quando um grupo arila contém mais de um anel, nem todos os anéis devem ter um caráter totalmente aromático. Exemplos de porções aromáticas são benzeno, naftaleno, indano e indeno.
[015] O termo heteroarila no contexto do relatório descritivo refere-se a um sistema de anéis com caráter aromático tendo de 5 a 14 átomos no anel (a menos que especificado de outra forma), pelo menos um dos quais é um heteroátomo selecionado de N, O e S, e contendo até três anéis. Onde um grupo heteroarila contém mais de um anel, nem todos os anéis devem ter um caráter totalmente aromático. Exemplos de grupos heteroarila incluem piridina, pirimidina, indol, isoindol, benzofurano, benzimidazol, benzoxazol, benzisoxazol e indoleno.
[016] Nos compostos de fórmula geral (I), n é adequadamente 2 ou 3, por exemplo 2. Pelo menos um grupo R1 pode ser OH. Nesse caso, o grupo OH está adequadamente na posição adjacente ao grupo -CH (R3) NR2aR2b.
[017] Adequadamente, o composto da fórmula geral (I) é um composto da fórmula geral da fórmula geral (IA) :
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10/76
Figure BR112019022015A2_D0002
(ΙΑ) em que R1, R2a, R2b e R3 são como definidos acima e m é 0, 1, 2, 3 ou 4.
[018] Adequadamente, no composto de fórmulas gerais (D e (IA) :
cada R1 é independentemente halo, alquila Ci-s, haloalquila Ci-s, arila ou heteroarila, em que grupos arila ou heteroarila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituinte (s) selecionado(s) de halo, OH, ciano, nitro, S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, -alquila Ci-s opcionalmente substituído com arila, -haloalquila Ci-s, -O (alquila Ci-s) opcionalmente substituído com arila ou -O (haloalquila Ci-s) ;
p é 0, 1 ou 2;
cada um de R4 e R5 é selecionado independentemente de H ou alquila C1-4 ou R4 e R5, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de O, N e S;
cada um de R2a e R2b é independentemente alquila Ci-s
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11/76 opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, arila ou heteroarila; ou
R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocí clico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N ou S e opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes R6;
cada R6 é selecionado independentemente de arila, heteroarila, -0-arila, -O-heteroarila ou alquila C1-4 substituído com um ou mais grupos arila ou heteroarila, em que grupos arila e heteroarila são substituídos com um ou mais substituinte (s) selecionado (s) de halo, alquila C1-4, haloalquila C1-4, -0 (alquila C1-4) ou -0 (haloalquila C1-4) ;
R3 é arila, heteroarila, carbociclila ou heterociclila, qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes R7 selecionado (s) de halo, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -0 (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, 0 (haloalquila C1-4) ou -C(O)NR8R9;
cada R8 e R9 é selecionado independentemente de H, alquila C1-4 ou cicloalquila C3-6 ou R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N e S;
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12/76 ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma variante deuterada ou tritiada do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros.
[019] Em alguns compostos adequados de fórmula geral (IA), m é 0, de modo que o grupo R1 não esteja presente.
[020] Em outros compostos adequados, m é 1 ou 2, mas mais usualmente 1.
[021] Nesses casos, R1 é adequadamente halo, particularmente cloro ou flúor; ou alternativamente R1 é um grupo arila ou heteroarila opcionalmente substituído como descrito acima. Mais usualmente, R1 é cloro, flúor ou arila opcionalmente substituído como descrito acima.
[022] Quando R1 é um grupo arila ou heteroarila, está adequadamente na posição 4 do anel fenila (onde o carbono substituído com o grupo OH é designado como posição 1).
[023] Substituintes adequados para grupos arila ou heteroarila R1 incluem halo, OH, ciano, nitro, -SO2NH2, C(O)NR4R5, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, -O (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila ou -O (haloalquila C1-4) , em que R4 e R5 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um anel de piperidina ou pirrolidina.
[024] Substituintes mais adequados para grupos arila ou heteroarila R1 incluem cloro, fluoro, metila, etila, trifluorometila, benzila, metoxi, etoxi, benziloxi,
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13/76 trifluorometoxi e piperidina-l-carbonila.
[025] Em alguns compostos adequados da invenção, R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de O, N ou S e opcionalmente substituído(s) com um ou mais substituintes R6, em que R6 é como definido acima.
[026] Mais adequadamente, R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico de 6 membros opcionalmente substituído com um ou mais substituintes R6.
[027] Ainda mais adequadamente, o anel de 6 membros formado por R2a e R2b é um anel de piperidina ou piperazina, mais adequadamente um anel de piperazina. Quando R2a e R2b formam um anel de piperazina, ele pode opcionalmente ser substituído com um ou mais substituintes R6 como definido acima, mas é adequadamente substituído com um único substituinte R6 na posição 4 da piperazina, de modo que o composto da fórmula geral (I) seja um composto de fórmula geral (IB) :
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Figure BR112019022015A2_D0003
em que R1, n, R3 e R6 são como definidos para as fórmulas gerais (I) e (ΙΑ) .
[028] Substituintes R6 particularmente adequados incluem arila, heteroarila, -O-arila, -O-heteroarila ou metila substituído com um ou dois grupos arila ou heteroarila; em que grupos arila e heteroarila são substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado (s) de halo, metila, etila, trifluorometila, metoxi, etoxi ou trifluorometoxi.
[029] Substituintes R6 ainda mais adequados incluem fenila, heteroarila, -O-fenila, -O-heteroarila, benzila, CH(fenila)2, -CíR-heteroarila e -CH(heteroarila)2, em que o grupo heteroarila é selecionado de piridinila, indolila, isoindolila, benzoxazolila e benzisoxazolila, e em que qualquer um dos grupos R6 acima pode ser substituído como
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15/76 descrito acima, mas mais adequadamente com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, metila etila e trifluorometila.
[030] Em compostos mais adequados da fórmula geral (I) e (IA), R3 é arila ou heteroarila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes R7, como descrito acima.
[031] Mais adequadamente, R3 é fenila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes R7, de modo que o composto da fórmula geral (I) seja um composto da fórmula geral (IC):
Figure BR112019022015A2_D0004
(IC) em que R1, n, R2a, R2b e R7 são como definidos para a fórmula geral (I) ou (IA) e z é de 0 a 5.
[032] Mais adequadamente, z é 0, 1, 2 ou 3, mais adequadamente 0, 1 ou 2.
[033] R7 é como definido acima, mas em alguns compostos adequados R7 não está presente (isto é, z é 0), ou R7 é halo, alquila C1-4, benzila, -O (Ci-4alquil) benziloxi, -haloalquila Ci-4, -O (haloalquila C1-4) ou -C(O)NR8R9, em que R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados,
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16/76 formam um anel piperidinila ou em que R8 é H e R9 é cicloalquila C3-7.
[034] Mais adequadamente, R7 não está presente ou cada R7 é independentemente halo, especialmente cloro ou flúor, metila, etila, benzila, metoxi, etoxi, benziloxi, -C(O)piperidinila ou -C (O) NH-cicloalquila C3-7.
[035] Alguns compostos particularmente adequados da invenção são compostos de fórmula geral (ID):
Figure BR112019022015A2_D0005
(ID) em que R1, n, R6, R7 e z são como definidos acima para as fórmulas gerais (I), (IA), (IB) e (IC).
[036] Exemplos de compostos de fórmula geral (I) incluem:
2-((2-clorofenil)(4-(4-metoxifenil)piperazin-1il)metil)fenol (Composto 1);
2-( (4-clorofenil) (4-(4-metoxifenil)piperazin-1il)metil)fenol (Composto 2);
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17/76
2- ( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4- (4- metoxifenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 3);
(4-((2-hidroxifenil) (4-(4metoxifenil)piperazinil)metil)fenil)(piperidin-1il)metanona (Composto 4);
3- ( (5-cloro-2-hidroxifenil) (4- (4- metoxifenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 5);
2- ( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4- (4metoxifenil)piperazin-l-il)metil) -4-clorofenol (Composto
6) ;
2-( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4-(6fluorobenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-l-il)metil)fenol (Composto 7);
2-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(otolil)metil)fenol (Composto 8);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (2-hidroxifenil)metil)benzamida (Composto 9, NPB);
2-( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4 - (2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 10);
2- ( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-lil) (fenil)metil)fenol (Composto 11);
2-( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (ptolil)metil)fenol (Composto 12);
2- ( (4-clorofenil) (4-( (4Petição 870190135554, de 18/12/2019, pág. 25/112
18/76 clorofenil)(fenil)metil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 13);
2- ( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (4etilfenil)metil)fenol (Composto 14);
(4-( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)fenil) (piperidin-l-il) metanona (Composto
15) ;
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto
16) ;
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-2’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 17);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-3’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 18);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-4’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 19) ;
3- ( (2'-cloro-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 20) ;
3-((3'-cloro-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)(4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 21);
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19/76
3- ( (4' -cloro-4-hidroxi- [l,l'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-1-11)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 22);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4’-etil-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil) benzamida (Composto 23);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-4’-(piperidina-l-carbonil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 24);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4-hidroxi-4’-metoxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil)benzamida (Composto 25);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(2’-etil-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 26);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(2’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil)benzamida (Composto 27);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(3’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil)benzamida (Composto 28);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil)benzamida (Composto 29) ;
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1
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20/76 il) (4-hidróxi-3'-nitro-[1,1'-bitenil]-3-il)metil) benzamida (Composto 30);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4-hidroxi-3'-sulfamoil-[1,1'-bifenil]-3il) metil)benzamida (Composto 31)
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-2'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 32);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-3'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 33);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-4'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 34);
3-((2'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il)(4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 35) ;
3-( (3'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 36)
3- ( (4'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 37);
3-( (2'-cloro-4-hidróxi-4'- (trifluorometil) -[1,1'bifenil]-3-il)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N
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21/76 ciclopentilbenzamida (Composto 38);
N-ciclopentil-3-((2’, 4’-dicloro-4-hidroxi-[1,1'bifenil]-3-11)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-111)metila)benzamida (Composto 39);
3- ( (4'-cloro-2',4-di-hidroxi-[l/l'-bifenilJ-S-il) (4(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-Nciclopentilbenzamida (Composto 40);
3- ( (4- (4-clorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 41,
NCK1) ;
2-((4-clorofenil)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil)metil)fenol (Composto 42, NCK2);
2-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (3metoxifenil)metil)fenol (Composto 43, NCK3);
1- (5- ( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (2- hidroxifenil)metil)tiofen-2-il)etanona (Composto 44, NCK4);
2- ((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(naftalen-1il)metil)fenol (Composto 45, NCK5);
5-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)furan-2-carbaldeído (Composto 46, NCK6);
2-((4-(5,6-diclorociclohexa-l,5-dien-l-il)piperazin-lil) (2-fluoro-3-metilpiridin-4-il)metil)fenol (Composto 47, NCK7 ) ;
2-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (4(trifluorometil)fenil)metil)fenol (Composto 48, NCK8);
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22/76
2-((6-cloro-5-metilpiridin-3-il) (4 - (2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 49, NCK9);
2- ((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(piridin-3- il)metil)fenol (Composto 50, NCK10);
1- (5- ( (4- (4-clorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)tiofen-2-il)etanona (Composto 51, NCK14);
3- ((4-(4-clorofenil)piperazin-l-il)(4-(diet!lamino)-2hidroxifenil)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 52, NCK16);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (4-(diet!lamino)-2-hidroxifenil)metil)benzamida (Composto 53, NCK18);
N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)metil)benzamida (Composto 54, NCK19);
2- ((4-clorofenil)(4-(4-clorofenil)piperazin-l- il ) metil ) f enol (Composto 55, NCK20);
2-((4-(4-clorofenil)piperazin-l-il)(6-metilpiridin-3il)metil)fenol (Composto 56, NCK21);
2- (o-tolil(4-(p-tolil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 57, SGI);
2- ( (4- (p-tolil)piperazin-l-il) (4(trifluorometil)fenil)metil)fenol (Composto 58, SG2);
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23/76
N-ciclopentil-4-((2-hidroxifenil)(4-(ptolil)piperazin-l-il)metil)benzamida (Composto 59, SG3);
2- ( (4-clorofenil) (4- (p-tolil)piperazin-lil) metil) f enol (Composto 60, SG4);
2-((3-metoxifenil)(4-(p-tolil)piperazin-lil ) metil ) f enol (Composto 61, SG5);
5-((2-hidroxifenil)(4-(p-tolil)piperazin-lil ) metil ) furan-2-carbaldeído (Composto 62, SG6); e
2-((6-metilpiridin-3-il)(4-(p-tolil)piperazin-lil ) metil ) f enol (Composto 63, SG7).
[037] Os compostos de fórmula geral (I) podem ser preparados por reação de um aldeído de fórmula geral (II):
em que
R1
Figure BR112019022015A2_D0006
e n são como definidos para a fórmula geral com um em que composto de fórmula geral R2a θ R2b são como definidos para a fórmula geral
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24/76
Figure BR112019022015A2_D0007
e um ácido borônico de fórmula geral (IV):
R3 (IV) em que R3 é como definido para a fórmula geral (I).
[038] A reação é uma reação de Petasis, que é uma reação do tipo mannich borônica de 3 componentes que usa ácidos borônicos da fórmula geral (IV) como uma espécie nucleofilica potencial para reagir com o derivado salicilaldeido da fórmula geral (II) e a amina de fórmula geral (III) para formar uma nova ligação carbono-carbono. A reação de Petasis ocorre através da formação de uma espécie de iminio, que reage com o ácido borônico para produzir aminas terciárias.
[039] Solventes de reação adequados incluem solventes orgânicos, por exemplo éteres cíclicos, tal como dioxano.
[040] Adequadamente, o processo compreende:
i. reagir o composto da fórmula geral (II) com o composto da fórmula geral (III) para formar uma mistura compreendendo espécies intermediárias de iminio;
ii. reagir o produto da etapa (i) com o composto da fórmula geral (IV).
[041] Adequadamente, a etapa (ii) é realizada a temperatura elevada, por exemplo 50 a 100°C, por exemplo, na
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25/76 temperatura de refluxo do solvente. Quando o solvente é dioxano, isso é cerca de 85 a 95°C, normalmente cerca de 90°C.
[042] O produto pode ser extraído para um segundo solvente, tal como acetato de etila, seco e purificado usando métodos padrão, como descrito abaixo nos exemplos.
[043] Os compostos de fórmulas gerais (II), (III) e (IV) são conhecidos e são comercialmente disponíveis ou podem ser preparados usando métodos conhecidos.
[044] Os compostos de fórmula geral (I) também podem ser preparados a partir de outros compostos de fórmula geral (I) . Por exemplo, um composto de fórmula geral (I), em que R1 é arila ou heteroarila opcionalmente substituído pode ser preparado a partir de compostos de fórmula geral (I), em que R1 é halo por reação com um composto de fórmula geral (V):
HO*
OH ©’ia (V) em que Rla é arila ou heteroarila opcionalmente substituído como definido para a fórmula geral (I).
[045] A reação pode ser realizada usando uma reação de acoplamento Suzuki sobre um catalisador de paládio.
[046] Os compostos de fórmula geral (V) são conhecidos e são comercialmente disponíveis ou podem ser preparados
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26/76 usando métodos conhecidos.
[047] Os métodos para a preparação de compostos de fórmula geral (I) representam um aspecto adicional da presente invenção.
[048] Os compostos de fórmula geral (I) são capazes de inibir/regular/suprimir a proteína promotora de morte associada a Bcl-2 (BAD), particularmente inibir/regular/suprimir a fosforilação da proteína promotora de morte associada a Bcl-2 (BAD) em uma célula cancerígena. A inibição/regulação negativa/supressão de BAD ocorre sem afetar a Ser/Thr quinase a montante chamada Akt/proteína quinase B (PKB). Portanto, os compostos de fórmula geral (I) inibem/regulam/suprimem preferencialmente a fosforilação de BAD.
[049] A inibição/regulação negativa de BAD é realizada pelo composto de fórmula geral (I) que ocupa o sulco hidrofóbico dentro da interface proteína-proteína de Bcl2/BAD. Adicionalmente, o composto de fórmula geral (I) ocupa uma cavidade lateral hidrofóbica adicional dentro da interface formada pelas cadeias laterais de Leu-97, Trp-144 e Phe-198 da proteína humana com uma porção diclorofenila.
[050] Os compostos de fórmula (I) são potentes inibidores/reguladores negativos de BAD em células cancerígenas, particularmente câncer de mama, câncer endometrial, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de
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27/76 cólon, câncer de próstata e células de câncer de pâncreas e induzem apoptose devido à regulação negativa/inibição de fosforilação de BAD. Os referidos compostos intensificam a citotoxicidade das células cancerígenas e realizam regulação negativa/inibição específica alvo da fosforilação de BAD sem afetar as quinases a montante.
[051] Os compostos de fórmula geral (I) foram triados quanto à sua atividade anticâncer contra células MCF7 e NPB (Composto 9) foi considerado o composto mais potente. O NPB foi posteriormente avaliado contra células epiteliais mamárias imortalizadas normais (MCF10A e MCF12A), hepatócitos normais (LO2), carcinoma mamário (BT549, MDA-MB231, MCF7, T47D, BT474), câncer endometrial (Ishikawa, Eccl, RL95 -2, AN3), câncer de ovário (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY C2, Ovca433), câncer de fígado (Hep3B, H2P, H2M), câncer de cólon (HCT116, DLD-1, Caco- 2), células de câncer de próstata (PC3, LNCaP, DU145) e de câncer de pâncreas (AsPC1, BxPC-3). O NPB intensificou significativamente a apoptose em todas as linhagens celulares de câncer testadas e o NPB não exibiu atividade substancial contra hepatócitos normais e células epiteliais mamárias imortalizadas. Usando um classificador Naive Bayes modificado pelo Laplaciano, o NPB é submetido a análises in silico que antecipam o alvo humano do NPB como proteína BAD.
[052] Verificou-se que o NPB induz a morte celular
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28/76 apoptótica em várias células de carcinoma, mas não tem efeito citotóxico em células epiteliais normais (imortalizadas) .
[053] As características marcantes das células submetidas à apoptose são a externalização da fosfatidilserina, a ativação da caspase e a fragmentação do DNA genômico. Em uma forma de realização, ο NPB exibe apoptose contra células MCF7 usando coloração com FITCanexina-V e iodeto de propídio. A coloração com FITC-anexinaV confirma a perda da integridade da membrana e a coloração com PI confirma os eventos apoptóticos tardios e esses resultados são correlacionados com a atividade da caspase 3/7 .
[054] Portanto, em um aspecto adicional da invenção, é provido um composto de fórmula geral (I) para uso em medicina.
[055] Os compostos de fórmula geral (I) são de uso particular no tratamento de câncer, adequadamente, um câncer no qual há fosforilação de BAD.
[056] Em um aspecto adicional, portanto, é provido um composto de fórmula geral (I) para uso no tratamento de câncer.
[057] Além disso, é provido o uso de um composto de fórmula geral (I) na preparação de um agente para o tratamento de câncer.
[058] Também é provido um método para o tratamento de
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29/76 câncer, o método compreendendo a administração a um paciente em necessidade de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral (I) .
[059] Os compostos são particularmente úteis para o tratamento de câncer em que há fosforilação de BAD e, por exemplo, o câncer pode ser câncer de mama, câncer endometrial, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer de próstata ou câncer de pâncreas ou outros cânceres derivados de epitélio, nos quais BAD é fosforilado.
[060] Os compostos de fórmula geral (I) são adequadamente administrados em uma composição farmacêutica e, portanto, em um aspecto adicional da invenção é provida uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula geral (I) e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[061] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um adjuvante, diluente, carreador, agente de granulação, agente de ligação, agente lubrificante, agente de desintegração, agente adoçante, agente de deslizamento, antiaderente, agente antiestático, tensoativo, antioxidante, goma, agente de revestimento, agente colorante, agente aromatizante, agente de revestimento, plastificante, conservante, agente de suspensão, agente emulsificante, material celulósico vegetal, agente de esferonização, outro excipiente farmaceuticamente aceitável convencionalmente
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30/76 conhecido ou qualquer combinação de excipiente do mesmo.
[062] Em uma outra forma de realização, a composição farmacêutica da presente invenção é formulada para administração intraperitoneal, administração hepatoportal, administração intravenosa, administração intra-articular, administração da artéria duodenal pancreática ou administração intramuscular, ou qualquer combinação das mesmas.
[063] A invenção será agora descrita em mais detalhes com referência aos exemplos e desenhos nos quais:
[064]
As Figuras 1(a) e 1(b) representam os espectros de RMN 4Η e
RMN 13C do Composto 1.
[065]
A Figura 2 representa os espectros de
RMN 13C do composto 2 .
de
RMN 4Η e
[067] de
RMN 4Η e de
RMN 4Η e
[069]
As Figuras 3(a) e 3(b)
RMN 13C do Composto 3.
As Figuras 4(a) e 4(b)
RMN 13C do Composto 4.
As Figuras 5(a) e 5(b)
RMN 13C do Composto 5.
A Figura 6 representa representam representam representam os espectros os os os de espectros espectros espectros
RMN 4Η do composto 6.
[070]
As Figuras 7(a) e 7(b) representam os espectros de RMN 4Η e
RMN 13C do Composto 7.
[071]
A Figura 8 representa os espectros de
RMN 13C do
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Composto 8 .
[072] As Figuras 9(a) e 9(b) representam os espectros de RMN e LCMS do Composto 9.
[073] A Figura 10 representa os espectros de RMN 1H do composto 10.
[074] Figura 11: Valores de IC50 de NPB em uma variedade de linhagens celulares de carcinoma.
[075] Figura 12: NPB suprime a viabilidade celular e promove apoptose em linhagens celulares de carcinoma.
[076] Efeito de NPB (5 μΜ) na viabilidade celular de carcinoma, incluindo linhagens celulares de carcinoma mamário, endometrial, ovário, fígado, cólon, próstata e carcinoma pancreático. (A) Viabilidade celular (B) atividades de caspase 3/7 e (C) a citotoxicidade foram avaliadas usando o Kit de Teste ApoTox-Glo™ Triplex, como descrito na metodologia. A significância estatística foi avaliada por um teste t de Student de duas variâncias não pareado, usando o GraphPad Prism5. A coluna representa a média de determinações em triplicata; barras, + DP. < 0,001, ★P < 0,05. Observação: RFU, unidade de fluorescência relativa; URL, unidade de luminescência relativa, #; células epiteliais imortalizadas não transformadas; MB-231, MDA-MB231.
[077] Figura 13: NPB estimula a morte celular
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32/76 apoptótica em células MCF7.
[078] (A) Morte celular apoptótica de células MCF7 medida após tratamento com NPB 10 μΜ usando análise por citometria de fluxo. A coloração com Anexina V-FITC é indicada no eixo X e a coloração com PI no eixo Y. O quadrante inferior esquerdo representa células vivas, o quadrante inferior direito representa células apoptóticas precoces, o quadrante superior esquerdo representa células necróticas, e o quadrante superior direito exibem células apoptóticas tardias. A aquisição dos dados da Anexina V e PI foi representada como uma porcentagem (%) em cada quadrante. (B) Análise do ciclo celular de células MCF7 medida após tratamento com NPB 10 μΜ usando análise por citometria de fluxo. (C) Viabilidade celular de colônias realizadas geradas pela célula MCF7 após exposição a NPB ou DMSO cultivadas 14 dias em Matrigel 3D usando o teste de viabilidade AlamarBlue®. Visualização microscópica (abaixo) de colônias coradas com Calceina AM geradas por células MCF7 após exposição a NPB ou DMSO cultivadas em Matrigel 3D. (D) Viabilidade celular em colônias geradas pela célula MCF7 após exposição a NPB ou DMSO cultivadas em ágar-ágar usando o teste de viabilidade AlamarBlue®. (E) Coloração com violeta cristal de colônias de focos geradas por células MCF7 após exposição a NPB ou DMSO. Todos os testes foram realizados
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33/76 como descrito na metodologia. A significância estatística foi avaliada por um teste t de Student de duas variâncias não pareado, usando o GraphPad Prism5. A coluna representa
a média de determinações em triplicate; barras, ±DP. **P <
0,001, *P < 0,05.
[079] Figura 14: A análise quiminformática e
ressonância plasmônica de superfície (SPR) prevê uma
interação do composto NPB com a proteína BAD.
[080] (A) Sensogramas obtidos por análise por SPR de NPB com a subunidade da proteína BAD. A subunidade da proteína BAD foi imobilizada na superfície de um chip sensor CM5. Uma solução de NPB em concentrações variáveis (20-100 μΜ) foi injetada para gerar respostas de ligação ao resultado (RU) registradas em função do tempo (s). Os resultados foram analisados usando a avaliação BIA 3.1. (B) A análise por Western blot (WB) foi usada para avaliar o nível de fosforilação Ser99 de BAD em células MCF7 após o tratamento com NPB. (Abaixo) IC50 calculado de NPB a partir da resposta à dose para fosforilação de BAD (Ser99) , BAD e β-ACTINA, como mostrado acima, pelo uso do software ImageJ de NIH, EUA (http://imagej.nih.gov/ij/). (C) A análise por WB foi usada para avaliar o nível de múltiplas proteínas envolvidas a montante de BAD em células MCF7 após o tratamento com NPB.
(D) A análise por WB foi usada para avaliar o nível de uma proteína múltipla envolvida na sobrevivência e proliferação
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34/76 celular em células MCF7 após o tratamento com NPB. Para análise por WB, extratos solúveis de células inteiras foram executados em um SDS-PAGE e submetidos a imunoblotting como descrito na metodologia. Foi usado β-ACTINA (ACTB) como controle de entrada para o lisado celular. Os tamanhos das bandas de proteínas detectadas em kDa são mostrados no lado esquerdo.
[081] Figura 15: NPB inibe especificamente a fosforilação de BAD (em Ser99) em linhagens celulares de carcinoma independentes da sinalização de AKT
[082] (A) A análise por WB foi usada para avaliar os níveis de BAD fosforilada humana (em Ser75 e Ser99) e da proteína BAD na faixa de linhagens celulares de carcinoma, incluindo câncer de mama, ovário, pâncreas, endométrio, hepatocelular, de cólon e de próstata após tratamento com NPB (5 μΜ) . A BAD total foi usada como controle de entrada para o lisado celular. (B) A análise por WB foi usada para avaliar os níveis de pBAD (Ser99) e pAKT (Ser473), AKT e BAD nas células MCF7, Caov-3, Ishikawa e AsPC-1. 5 μΜ de cada inibidor de AKT (IV) e NPB foram usados para tratar células. A depleção da expressão de AKT foi alcançada usando a transfecção transitória de (sh)RNA tipo grampo de cabelo curto (1&2) direcionado ao transcrito de AKT, como descrito na metodologia. A β-ACTINA foi usada como controle de entrada
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35/76 para o lisado celular. Para análise por WB, extratos solúveis de células inteiras foram submetidos a um SDS-PAGE e submetidos a imunoblotting como descrito na metodologia de materiais. Os tamanhos das bandas de proteínas detectadas em kDa são mostrados no lado esquerdo. Observação: #; linhagem celular imortalizada não transformada.
[083] Figura 16: Depleção de expressão de BAD mediada por siRNA impede o efeito de NPB em linhagens celulares de carcinoma.
[084] (A) A análise por WB foi usada para avaliar os níveis de atividade de pBAD (Ser99) e proteína BAD nas células MCF7, BT474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 e DLD-1 após o tratamento com NPB 5μΜ. A depleção da expressão de BAD foi alcançada usando a transfecção transitória de pequeno (si)RNA interferente direcionado ao transcrito de BAD. Os extratos solúveis de células inteiras foram submetidos a um SDS-PAGE e submetidos a imunoblotting como descrito em materiais e métodos. A β-ACTINA foi usada como controle de entrada. Efeitos do NPB (5 μΜ) nas células MCF7, BT474, Caov3, Ishikawa, AsPC-1 e DLD-1. (B) A viabilidade celular e (C) as atividades da caspase 3/7 foram avaliadas usando o Kit de Teste ApoTox-Glo™ Triplex. Todos os testes foram realizados como descrito na metodologia. A significância estatística foi avaliada por um teste t de Student de duas variâncias
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36/76 não pareado (P<0,05 foi considerado significativo) usando o GraphPad Prism5. A coluna representa a média de determinações em triplicata; barras, + DP. < 0,001, *P < 0,05. Observação: RFU, unidade de fluorescência relativa; RLU, unidade de luminescência relativa.
[085] Figura 17: NPB inibe a fosforilação de BAD em Ser99 no carcinoma mamário e inibe o crescimento de tumor
[086] (A) Medição do volume do tumor em camundongos fêmeas BALB/c-nu como descrito em materiais e métodos. Os animais (n = 5 cada grupo) foram tratados com veiculo, 5 mg/kg de NPB ou 20 mg/kg de NPB, e a carga tumoral relativa foi registrada. O peso do animal foi medido diariamente durante a duração do experimento. (B) Os tumores foram excisados após o regime de tratamento com NPB e pesados. Os tumores retirados representativos são mostrados no lado direito. (C) WB de tecido tumoral para determinar os níveis de p-BAD (Ser99) e BAD. Extratos solúveis de células inteiras foram submetidos a SDS-PAGE e submetidos a imunoblotting como descrito na metodologia. A β-ΑΟΤΙΝΑ foi usada como controle de entrada. Os tamanhos das bandas de proteínas detectadas em kDa são mostrados no lado esquerdo. (D) Análises histológicas da coloração com fosfo-BAD, BAD, KÍ67 e TUNEL. As seções de tecido tumoral foram imunizadas com anticorpo policlonal de cabra anti-pBAD (Ser 136) (Santa Cruz Biotechnology), camundongo anti-BAD monoclonal (Santa
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Cruz Biotechnology) e anticorpo anti-K167 (Abeam, abl5580) e coradas com hematoxilina. A fragmentação de DNA apoptótico foi detectada usando o Kit de Detecção de Apoptose TUNEL (Gen Script EUA Inc.) como descrito na metodologia. A significância estatística foi avaliada por um teste t de Student de duas variâncias não pareado (P<0,05 foi considerado significativo) usando o GraphPad Prism5. 0 ponto representa a média dos experimentos em triplicata; barras, + DP. **P < 0,001, *P < 0,05.
[087] Figura 18:
[088] (A) A análise por Western blot foi usada para avaliar o nível de fosforilação de BAD em Ser99 de pBAD, BAD, pAKT e AKT em células MCF7 após um período crescente de tratamento com NPB (ΙΟμΜ). Extratos solúveis de células inteiras foram submetidos a SDS-PAGE e submetidos a imunoblotting como descrito na metodologia. Os tamanhos das bandas de proteínas detectadas em kDa são mostrados no lado esquerdo. (B) Quinases e substratos fosforilados foram detectados usando uma matriz de Western Blot (Kit de Matriz FosfoQuinase Humana do Perfilador de Proteoma. Células MCF7 tratadas com NPB (ΙΟμΜ) ou DMSO por 12h a 37°C antes da preparação do lisado celular. A densidade média de pixels foi analisada usando software ImageJ e está representada abaixo.
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[089 ] A Figura 19 representa os espectros de RMN 1H do
composto NCK5 •
[090 ] A Figura 20 representa os espectros de RMN 1H do
composto NCK16.
[091 ] A Figura 21 representa os espectros de RMN 1H do
composto NCK18.
[092] As Figuras 22A, 22B, 22C, 22D e 22E: valores de IC50 de análogos baseados na estrutura de NPB em linhagens celulares de carcinoma.
Observação: NV, sem valor
Materiais empregados para chegar aos Exemplos da presente divulgação
Cultura de células e reagentes [093] As linhagens celulares epiteliais mamárias imortalizadas humanas, MCF10A e MCF12A; e a linhagem celular epitelial hepatocelular imortalizada, LO2, foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e foram cultivadas de acordo com as instruções de propagação da ATCC. Linhagens de células MC, MCF7, T47D, BT474, BT549 e MDA-MB-231 (indicadas como MB-231); linhagens celulares de carcinoma endometrial, Ishikawa, ECC1, RL95-2 e AN3; linhagens celulares de carcinoma hepatocelular, Hep3B, H2P e H2M; linhagens celulares de carcinoma do cólon, HCT116, DLD-1 e Caco-2; e linhagens celulares de carcinoma da próstata, PC3, LNCaP, DU145 foram obtidas da American Type
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Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). As linhagens celulares de carcinoma ovariano, SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY C2 e Ovca433 foram obtidas no laboratório do Dr. Ruby Huang no Instituto de Ciência do Câncer de Cingapura, Universidade Nacional de Cingapura (NUS). As linhagens celulares de carcinoma do pâncreas foram obtidas no laboratório do Prof. H. Phillip Koeffler no Instituto de Ciência do Câncer de Cingapura, Universidade Nacional de Cingapura (NUS). Todas as linhagens celulares de carcinoma foram cultivadas de acordo com as instruções de propagação de ATCC. 0 inibidor de AKT IV foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). A reserva direcionada a BAD (sh)-RNABAD (shRNA-BADl, 5'-GCUCCGCACCAUGAGUGACGAGUUU-3' e shRNABAD2, 5'AAACUCGUCACUCAUCCUCCGGAGC3') foi adquirida da Life Technologies (Singapura). 0 shRNA direcionado a AKT (shRNAAKT1, 5'CCGGCGCGTGACCATGAACGAGTTTCTCGAGAAACTCGTTCATGGTCACGCGTTTTTG
3' e o shRNA2-AKT, 5'CCGGGGACTACCTGCACTCGGAGAACTCGAGTTCTCCGAGTGCAGGTAG
TCCTTTTTG-3') foi adquirido da Life Technologies (Cingapura), e clonado para o vetor PLKO.l (Sigma, Cingapura). As células foram transfectadas transitoriamente com shRNA 2 0nM (AKT ou BAD) ou controle negativo universal (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) usando FuGENE HD (Promega) por 24h e outros testes realizados. Os kits comerciais de
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40/76 alanina transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), lactate desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK) , nitrogênio ureico do sangue (BUN) foram adquiridos na AGAPPE Diagnostics Ltd, Kerala, índia.
Exemplo 1
Síntese e caracterização de compostos de fórmula I
Síntese Geral do Composto de Fórmula I
[094] Piperazinas (0,8 mmol) e salicilaldeído (0,8 mmol) são coletados em um RBF e agitados por cerca de 10 minutos usando Dioxano como solvente. Após cerca de 10 minutos, o ácido aril borônico (0,8 mmol) é adicionado à mistura e refluxado com agitação contínua por cerca de 8 horas usando Dioxano como solvente em uma placa quente mantida a cerca de 90°C. Após cerca de 8 horas, são adicionados acetato de etila e água à mistura reacional e a camada de acetato de etila é separada usando funil de separação e seca sobre sulfato de sódio anidro. O acetato de etila é evaporado para obter o produto. O produto composto fenólico desejado é obtido por separação usando cromatografia em coluna.
[095] Os reagentes específicos usados para obter os compostos 1 a 15 e 41 a 63 são providos na Tabela 1 abaixo.
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Tabela 1
No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
1 H-nQhQhO7 HO.d,OH D r~\ /—X Z555^ / C#~ot
2 ^^CHO Π T Η-φ^ο' HO. -OH €# ΛΑ /“Λ /=\ / m JW Ca cr
3 ^^CHO Π T ΙΙ-Γν^ο' hod.oh oA Q /=^./ HO >S >0 n 0...... M F
4 ^^CHO Π T h-n^n^ho7 hob oh O^N^j /A F\ i—\ /srv / H& /lí H-5á #0 r-Λ V X ÍN~^ V...../ -g
5 ci^^^cho Η-Ν^Ν^Ο7 H0x ^OH B óç NH / M Z-S / RT ---χ >=0 CJhb
6 Cl^x^^CHO h-n^n^Q-o7 HO b.0H oA / \ GV. / HC )~S fi—4 A~Ü V./ V/ V_8- F
7 ^^CHO Π — OH ir\ Oi/f H HO θ.ΟΗ A V^o Q ΓΆ-Ο · Y vT ’Ύ)
8 ^^CHO CtM Cl Cl HO.g.OH HO y—# C! C!
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No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
9 ^^CHO Q JL hnCDn-^^ Cl Cl HO^OH óu ^χΝΗ /K Z-A /7^. HO /^X / A \\ $ 01 uí >0 U/-HH
10 ^^CHO Q 33L hO-Q Cl Cl HO β.0Η /==\ ΗΟ^/™Η Η-/) / q η λ ^-o' F
11 ^^CHO Π T H—n( \l— Cl ΗΟΧβΧΟΗ O o HO O v y Q Cl
12 ^^CHO Π T H—n( \l— Cl HO.-.OH D ra. W v/ ncTjh-N N\ S C!
13 ^^CHO Π T H—n( \l— Cl HCL ,OH B Φ Cl O _ O HQ z~N N™\ \__. D O Cf Cí
14 ^^CHO Q JL H—n( \l— Cl ho. ,oh LD jfsMAM-V K U P HO J— N Np ZA ZA
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No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
15 CHO Q JL H—n( \l— Cl ΗΟΧβΧΟΗ G 0 HO Vn N-Z /a j-% \ \_/ O=( Cl N~-\ O
41 CHO G h N\ /n~C~-^~ci 0 Γ~\ Ar li j H ho'boh A.. LArA m%X KJ P<k» jsísI-kuísí:
42 CHO (X Cl Cl HN\ ^N— Cl Φ HO' ΌΗ Cí a*xsA jT j Γ N AA^-nA H u Peso molecular: 447.7846
43 CHO U Cl Cl Hh/ ^^T>CH3 M ho'b'oh Cí <XH.:; Cíy^ Peso moléculas: 443.3Ó56
44 CHO cX Cl Cl Hl·/ \l— OH £Vb HsO^/^S OH 0 Ci Gi? x, irV k ύ J °’ A u
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No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
45 CHO cir Cl Cl h/ ^N— qq hoboh Y» Peso molecular: 463.3983
46 CHO cY Cl Cl Hh/ \l—XX OH XYb' OHC^0 0H 51 •Ί.. Y Jk, X Fes» KislKalsT: 421.311S
47 CHO cY Cl Cl h/ ^N— ho'bY>h 4......V 0 Pose molecular: 448.3606
48 CHO cY Cl Cl HN\ \l— cf3 Φ HO'BxOH ÇÈ c. Ύ il sGYX yJ Peso molecular: 481.338
49 CHO (Y Cl Cl HN\ ^N— Cl HO'BX)H 01 ϊι Ί Ϊ HCL Jx u Peso molecular: 462.7993
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No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
50 CHO cir Cl Cl h/ ^N— O ho'boh Cl CA X A a, X UçO Peso molecular: 414.327 S
51 CHO cir HN\ \l—Cl OH £Υβ HsO^/^S OH 0 YA|zC* ^VTl ÍYW X) Fés» íis.oleciilsi 42t<,9Sfiõ
52 CHO Χ^,ΟΗ n HN\ /N—Cl 0 ΓΛ li j H HO OH <Xc ^xr Cuj A X X) A CHj CMj Peso molecular: 561.16
53 CHO Χ^,ΟΗ n Cl Cl Hh/ A— 0 X\ [1 Ί h ho'boh ° 5 n» Ó AS C:-<> GH-i. Pes-e nseleciiil&r;
54 CHO X^O í T HaCO^^^O Cl Cl /—\ )=( HN^__/N—β 0 X\ Π H ho'b'oh H Ci-\Á O I X. (XCj ΗΟγγ^<'Ά3Η.5 íAs-y Peso molecular: 5S4.5?
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No Salicilaldeido Piperazina Ácido aril borônico Produto
55 CHO ά° Hl/ \l—<H>—Cl Cl Φ HO' ΌΗ XT1 UlJU Peso molecular: 413.34
56 CHO (ir Hl/ ^N—Cl Ψ ΗΟ'ΌΗ HaC^ Μ
58 CHO ér hi/ — CF, Φ HO'BxOH rV^tr-CX li T Γ i? u i FSC Peso molecular: 426.4740
57 CHO A^oh U hi/ <H>— çx ho'b'oh LX Peso mofecalar: 372.5026
59 CHO (Yn hi/ — Cl Y^OH ho'Bxoh Ψ Õ N OH
61 CHO á° hi/ — ^^.OCH3 ci ho'boh fVV'H'O Ci OCH.3 Peso ínateciílar: 388.5020
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No Salicilaldeído Piperazina Ácido aril borônico Produto
60 CHO ór HNd/N^CD>— Cl Φ HO' ΌΗ ^oh rr Φ 01 Peso molecular: 392.9211
62 CHO Â.OH Hl/ — -x OH íVk OHC'0 0H ry0Hr-NXX 0 QHC Peso molecuku364.4S04S
63 CHO ór Hl/ /1--- Ψ ho'Bxoh ô rn® Peso molecular; 373.4997
[096] Os compostos mostrados na Tabela 2 foram obtidos por reação do brometo de NPB (ver coluna 1 da Tabela 2) com um ácido borônico usando uma reação de acoplamento Suzuki catalisada por paládio, como mostrado no Esquema 1.
Esquema 1
Figure BR112019022015A2_D0008
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Tabela 2
NPB-Br Ácido borônico Produto
16 HO' Γ Br ΗΟ.βΧΟΗ 1
c 'N ^Νχ HO'· Y
cr ΐ NH 5 cr Cl O' NH Cl
Cl
17 HO' Γ Br hc.d,oh B Ί
c cr NH 'N ^Nx cr ΗΟ'^γ^ 3 N
/ Ã Cl
J 1 J
O*' NH Cl
Ci
18 HO' Γ Br ΗΟ%βΧΟΗ ΓΥ 1
c 'N *z***^^s
(Τ' NH cr U k
s Cl cr Ϊ V
Cl
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19 r^rBr ho. ,oh D Ψ HO^''Y^Z
HcrV CT NH ó 'N^|
cr Cl
V 1 cr''NH Jí J cs'^r Ϊ Cl
20 ^Br HOX XOH B
'N^| ΗΟ'Αχί· ei
*XxNx 1^1 XMZ >
Cr^NH cr k^zx I í
ò Cl Cr'NH T s .X. J Ci^y
Cl
21 r HO^j* ^rBr ho,b.oh ^i^ci
íl 'N^ HCrV
1 1 'Ν'''··!
Cr-NH cr
ó Cl ó Cl
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Figure BR112019022015A2_D0009
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25 Br HO. ,OH B
Λ
li ‘N Ψ Γ
^Νχ Οχ HO^S
CT NH cr Tn'^
ó Cl O O ' NH
Cl
26 Br HOS XOH B o
Hoy
li 'N hoA
S^NX
rv2
CT NH ô cr Cl M í r,Xj
cr y ΓΜ
VI
27 Br HO^ XOH ι^Ίι
B
hcAv
Yj
'N |QT fT'’ h
SZNX
I i N'^
οτνη cr k^N _
ò Cl crW X i J
o Cl
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Figure BR112019022015A2_D0013
Caracterização do Composto 1:
[097] RMN (CDCÍ3, 400 MHz) δ: 3.691(s, 3H) , 5.303(s, 1H,C-H), 1.184-3.691(m, 8H-prótons de pierazina), 7.5977.615(d, 1H, J=7.2 Hz), 7.341-7.323(d,1H, J=7.2 Hz), 7.0607.189(m, 4H-ArH), 6.555-6.815(m,5H-ArH), 6.956-6.974, (d,1H, J=7.2Hz) 11.85 (s, 1H-OH pico largo); RMN 13C (400 MHz,
CDC13)ô: 50.854, 55.521, 69.50, 114.45, 117.17, 118.44,
119.547, 122.05, 127.78, 128.83, 129.01, 129.19, 129.84,
129.93, 133.89, 145.11, 156.60; Ponto de Fusão 120-124°C.
(FIGURA 1)
Caracterização do Composto 2:
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[098] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ : 2.539-3.065 (m, 8H) ,
3.674(s, 3H) , 4.359(3, 1H) , 6.651(m, 1H) , 6.740-6.804(m,
5H) , 6.855-6.872(d, 1H, J=6.8Hz), 7.086(m, 1H) , 7.165(m,
2H) , 7.280(m, 1H) , 7.361(m, 1H) ; RMN 13C (400 MHz, CDC13)ô: 50.74, 51.76, 55.52, 75.86, 114.49, 117.24, 118.43, 119.62, 124.41, 126.58, 128.28, 128.54, 128.92, 129.20, 130.28,
134.66, 141.63, 145.07, 154, 156.18; Ponto de Fusão 85-89°C.
(FIGURA 2)
Caracterização do Composto 3:
[099] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.194-3.079 (m, 8H) , 3.689(3, 3H) , 4.336(s, 1H) , 5.041(s, 2H) , 6.672-6.702(m,
1H), 6.781-6.819(m, 5H), 6.863-6.867(m, 2H), 7.026-7.082(m, 2H) , 7.196(m, 1H) , 7.279-7.348 (m, 5H) ; RMN 13C (400 MHz, CDC13)ô: 50.770, 55.52, 71.26, 75.36, 114.46, 115.46,
117.16, 118.42, 119.54, 124.82, 127.34, 128.14, 128.62,
128.76, 129.14, 145.04, 156.14; Ponto de Fusão 72-76°C.
(FIGURA 3)
Caracterização do Composto 4:
[100] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.183-2.469(m, 10H), 2.557-3.684 (m, 8H) , 3.684(s, 3H) , 4.412(s, 1H) , 6.631(m,
2H), 6.745-6.813(m, 4H), 7.059-7.095(m, 1H), 7.191-7.216(m, 1H) , 7.261-7.269 (m, 2H) , 7.351-7.409 (m, 2H) ; RMN 13C (400 MHz, CDC13)ô: 24.51, 26.525, 29.68, 43.60, 48.73, 50.71, 51.80, 55.51, 76.04, 114.45, 117.134, 118.366, 119.198,
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119.52, 124.75, 126.74, 127.50, 128.04, 128.50, 128.79,
129.29, 136.18, 141.02, 145, 154, 156.2, 169.79(C=O); Ponto de Fusão 78-82°C. (FIGURA 4)
Caracterização do Composto 5:
[101] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.18 6-1.650 (m, 8H) ,
1.978-3.633(m, 8H) , 3.689(s, 3H) , 4.298-4.345(m, 1H) , 4.421(3, 1H) , 5.979-5.992(3, 1H) 6.736-6.803 (m, 5H) ,
6.860(m, 1H) , 7.192(s, 1H) , 7.737(s, 1H) , 7.304-7.339 (m,
1H) , 7.540-7.557 (m, 2H) ; RMN 13C (400 MHz, CDC13)ô: 23.79, 33.18, 50.67, 51.83, 55.51, 67.06, 75.06, 114.46, 118.45, 118.58, 124.02, 126.11, 126.42, 128.72, 128.87, 129.39,
139.39, 144.89, 154.19, 154.95, 166.68; Ponto de Fusão 102106°C. (FIGURA 5)
Caracterização do Composto 6:
[102] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ : 1.17 9-3.62 0 (m, 8H) ,
3.676(3, 3H) , 4.261(s, 1H) , 5.029(s, 2H) , 6.716-6.791(m,
5H) , 6.823(m, 1H) , 6.862-6.882(m, 1H), 6.973-7.015(m, 2H) , 7.110-7.139(m, 1H), 7.243-7.258(m, 2H), 7.280-7.317(m, 1H), 7.331-7.350(m, 2H); RMN13C (400 MHz, CDC13)ô: 50.70, 51.59,
55.52, 71.27, 74.93, 114.48, 115.52, 118.58, 123.97, 124.39, 126.3, 127.3, 128.2, 128.8, 132.1, 136.27, 144.96, 146.74, 154.19, 154.93; Ponto de Fusão 60-64°C. (FIGURA 6) Caracterização do Composto 7:
[103] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ: 2.648-3.820 (m, 8H)
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4.245(3, 1H) , 5.009(s, 1H) , 5.651(s, 2H) , 7.276(s, 1H) ,
7.436-7.485(m, 3H) , 7.606-7.682(m, 3H), 7.797(m, 2H) , 7.8767.954(m, 5H), 8.185(s, 1H); RMN 13C (400 MHz, CDC13)ô: 30.972, 50.76, 67.60, 71.79, 75.85, 98.16, 100.9, 104.9, 113.16, 115.97, 117.65, 119.96, 122.84, 125.4, 127.8, 128.6, 129.1, 129.6, 133.2, 136.8, 157.06, 160.87, 164.51, 165.86; Ponto de Fusão 58-62°C. (FIGURA 7)
Caracterização do Composto 8:
[104] RMN1H (CDCI3, 400 MHz) δ: 2.479(s, 3H) , 4.927(s,
1H), 2.260-3.063(m, 8H), 6.533-6.551(d, 1H, J=7.2Hz), 6.6316.692(m, 2H), 6.739-6.758(d, 1H, J=7.6Hz), 6.789-6.809(d, 1H ,J=8Hz), 6.864(m, 3H) , 7.092-7.183(m, 1H) , 7.281-7.297(m,
1H) , 7.537-7.552 (d, 1H, J=6Hz); RMN 13C (400 MHz, CDC13) δ: 20.92, 51.16, 51.42, 73.44, 116.07, 116.96, 117.14, 118.716, 119.27, 119.83, 124.965, 125.24, 126.445, 127.12, 127.545, 128.266, 128.729, 129.260, 130.869, 134.072, 138.171,
150.600, 156.443 Ponto de Fusão 108-112°C. (FIGURA 8) Caracterização do Composto 9 (NPB):
[105] RMN (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.183-1.647 (m, 8H) ,
2.019-3.067 (m, 8H) , 4.509(s, 1H) , 4.312-4.327 (m, 1H, NH) , 5.965(3, 1H), 6.668(m, 1H), 6.801-6.896(m, 3H), 7.0737.190(m, 3H) , 7.305(m, 1H) , 7.527-7.542 (m, 2H) , 7.770(s,
1H) ; RMN 13C (400MHz, CDC13)ô: 23.78, 33.18, 51.22, 51.78, 76.10, 117.14, 118.59, 119.67, 124.69, 124.98, 126.22,
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127.53, 128.85, 129.29, 131.08, 134.08, 135.53, 140.28,
150.5, 156.1, 166.73;m/z (M+, 526.2,527.2) Ponto de Fusão
174-178°C. (FIGURA 9)
Caracterização do Composto 10 :
[ 106] RMN 4H (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.183- -3.074 (m, 8H) ,
4.361 ( s, 1H) , 5.034(s, 2H) , 6.658-6.694(t, 1H, J =7,2Hz),
6.768 ( m, 1H), 6.856-6.873 (m, 3H), 7.023(m, 1H) , 7.055-
7.094 ( m, 3H), 7.164(m, 1H ), 7.231(m, 1H) , 7.266( A, 1H),
7.304 ( m, 1H), 7 .322-7.355 (m , 2H) ; RMN 13C (400 MHz, CDC13)δ:
51.264 :, 71.260, 75.434, 117 .15, 118.6, 119.6, 124.8 , 124.9,
127.3, 127.5, 128.1, 128.6 , 128.8, 129.18, 150.5, 156.09;
Ponto de Fusão 75-80°C. (FIGURA 10)
Exemplo 2 Composto de fórmula I diminui a viabilidade celular de uma faixa de células de carcinoma
Teste de Oncogenicidade
[107] Inicialmente, foi investigado o efeito de novos compostos de moléculas pequenas sintetizadas contra células MCF7 (células ER + MC) usando um teste de viabilidade celular AlamarBlue®. Entre a série de novos compostos de moléculas pequenas, o NPB foi identificado como um composto eficaz de moléculas pequenas que reduz a viabilidade das células MCF7 em comparação com as células tratadas com veiculo (DMSO). Entre os compostos, o Composto 9 N-ciclopentil-3-((4-(2,3
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60/76 diclorofenil)piperazin-l-il)(2-hidroxifenil)metil)benzamida (NPB) é identificado como o composto antiproliferativo mais potente com o IC50 de 6,5 μΜ. Em seguida, foi determinada a concentração inibitória de 50% (IC50) de NPB em uma ampla faixa de linhagens celulares de carcinoma, incluindo aquelas derivadas de carcinoma mamário ER- (BT549, MDA-MB-231), mamário ER+ (MCF7, T47D e BT474), endometrial (Ishikawa, ECC-1, RL95-2 e AN3), de ovário (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY C2 e OVCA433), hepatocelular (Hep3B, H2P e H2M) , de cólon (HCT116, DLD-1 e Caco-2), de próstata (PC3, LNCaP e DU145) e pancreático (AsPC-1, BxPC-3) . Como controles de células normais, também incluímos células epiteliais mamárias imortalizadas (MCF10A e MCF12A) e hepatócitos imortalizados (LO2) no painel das linhagens celulares. Os valores de IC50 para NPB nas linhagens celulares de carcinoma estão tabulados na Figura 11.
Exemplo 3
NPB induz a morte celular apoptótica em várias linhagens celulares de carcinoma
[108] Além disso, o NPB é avaliado em relação a várias linhagens celulares derivadas de câncer para determinar o efeito na viabilidade celular total, apoptose e citotoxicidade usando o Kit de teste Triplex ApoTox-Glo™, Promega (Cingapura) de acordo com as instruções do fabricante
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61/76 (Figura 12) . Em resumo, as células são semeadas em placas opacas de 96 poços pretas (Corning®, Cingapura). Após uma incubação durante a noite das células, o meio é alterado para a concentração de NPB indicada. Após cerca de 48 horas de incubação, o reagente de viabilidade/citotoxicidade contendo o substrato GF-AFC e o substrato bis-AAF-R110 é adicionado às células, conforme sugerido pelo fornecedor. Após cerca de 45 minutos de incubação a cerca de 37°C, a fluorescência é registrada com excitação de 400 nm/emissão de 505 nm para viabilidade e excitação de 485 nm/emissão de 520 nm para citotoxicidade usando um leitor de microplacas Tecan para fluorescência (Tecan, Cingapura). O reagente Caspase-Glo 3/7 é adicionalmente adicionado às células e após cerca de 25 minutos de incubação em temperatura ambiente, a luminescência é registrada usando o leitor de microplacas Tecan. O número de células viáveis, citotóxicas e apoptóticas é medido em triplicata.
Teste de apoptose com anexina V e iodeto de propidio (Anexina V-PI)
[109] A exposição à fosfatidilserina e morte celular são avaliadas por análise por FACS usando o Kit de Coloração com Anexina-V-FLUOS (Life Technologies, Singapura) e células coradas com PI. Resumidamente, 1 χ 105 células de MCF/poço (190 μΕ/ροςο) são semeadas em placas de 6 poços e incubadas
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62/76 com diferentes concentrações de NPB por cerca de 24 horas e as amostras tratadas com DMSO são usadas como controle. As células são então lavadas com tampão de ligação à Anexina V (HEPES/NaOH 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) , coradas com Anexina V FITC por cerca de 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, depois lavadas novamente e recolocadas em suspensão em tampão de ligação a Anexina V contendo PI. As amostras são analisadas imediatamente em um classificador de células BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA).
[110] A perda da integridade da membrana e a translocação da fosfatidilserina para o folheto externo da membrana plasmática são os primeiros eventos de apoptose que podem ser detectados usando a coloração com iodeto de propídio e anexina-V conjugada com FITC. Observa-se que o NPB induz apoptose em células MCF7 usando FITC-anexina V e iodeto de propídio. No tratamento com NPB, é observado um aumento nas células apoptóticas precoces (negativas para PI, positivas para FITC-anexina V) e tardias (positivas para IP, positivas para FITC-anexina V) de uma maneira dependente da dose, como mostrado na Figura 13A.
Exemplo 4
Interação molecular de NPB com proteína BAD recombinante
[111] Para prover interação molecular do candidato mais promissor, a afinidade de ligação do NPB ao BAD, foram realizadas medições de ressonância plasmônica de superfície
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63/76 (SPR) com subunidade de BAD imobilizada usando o NPB como analito. Sabemos que o BAD pode se ligar à subunidade BAD ín vitro. Por isso, foi analisada a interação usando o sistema BIAcore. A BAD recombinante foi imobilizada no chip sensor CM5. Para determinar as curvas de associação e dissociação, várias concentrações de NPB foram injetadas individualmente na superfície de um chip sensor revestido com BAD. Os sensogramas sobrepostos mostrados na Figura 14 foram analisados coletivamente. A ligação direta de BAD ao NPB foi demonstrada (Figura 14A). 0 cálculo dos parâmetros cinéticos para a interação do NPB com o BAD revelou a constante da taxa de associação de (1.4±.4)xl03 e a constante da taxa de dissociação (5.4±0.38)xlO3 S_1 de afinidade de ligação, que produziu constantes de equilíbrio de dissociação (Kd) de 37,12 μΜ. Esses parâmetros cinéticos mostram suporte de afinidade para a interação do BAD com a estrutura do NPB.
Análise de ressonância plasmônica de superfície
[112] As interações moleculares foram analisadas com
base na ressonância plasmônica de superfície usando um
sistema BIAcore-2000 (BIAcore AB, Uppsala, Suécia). A
proteína BAD recombinante humana (N° de catálogo MBS143012,
MyBiosource, EUA) foi imobilizada em um chip sensor como descrito pelo protocolo do fabricante. Para examinar a
Petição 870190135554, de 18/12/2019, pág. 71/112 interação do BAD com NPB, várias concentrações de NPB (20 a 100 μΜ) no tampão de corrida (HBS-EP, pH 7,4, BIAcore AB) foram injetadas na superfície do chip sensor imobilizado com BAD com uma vazão de 15 μΙ/min de acordo com as instruções do fabricante. Foi permitido ao NPB interagir com a subunidade BAD por 2 minutos para associação e dissociação, respectivamente, após o que o chip sensor foi regenerado injetando NaCl 1 M por 2 minutos antes da injeção seguinte. Usando o software de avaliação BIA 4.1 (BIAcore AB) , os parâmetros cinéticos foram, tais como, constantes de taxa de associação e dissociação (ka e kd) , constantes de equilíbrio de dissociação (Kd) usando um modelo de ligação 1:1 com transferência de massa. Os sensogramas obtidos foram sobrepostos usando o software de avaliação BIA.
Exemplo 5
Efeito de NPB na fosforilação de BAD é especifico para Ser99 (humano)
[113] A fosforilação do hBAD nos resíduos Ser-75 (resíduo de serina BAD de camundongo 112) e Ser-99 (resíduo de serina BAD de camundongo 136) é crucial na regulação da atividade da família BCL-2 de proteínas antiapoptóticas [15] . A fosforilação de hBAD em Ser-75 ou Ser99 (ou os resíduos correspondentes em camundongos defeituosos) resulta na perda da capacidade do hBAD de heterodimerizar com BCL
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65/76 xL ou BCL-2 [15] . Para adicionalmente validar mais o alvo previsto, analisamos primeiro o efeito do NPB na fosforilação do hBAD no Ser99 por análise por western blot. 0 tratamento de células MCF7 com NPB produziu uma diminuição dependente da dose na fosforilação de hBAD em Ser99 sem uma mudança significativa na proteína hBAD total (Figura 14B) . A ECso calculada para a inibição da fosforilação de BAD em Ser99 por NPB foi de 0,41 + 0,21 μΜ.
[114] Em seguida, foi analisado o efeito de NPB na fosforilação de hBAD em Ser75 e Ser99 por análise por western blot em 25 linhagens celulares de carcinoma derivadas de sete tipos diferentes de câncer. Observou-se que NPB inibe amplamente a fosforilação da BAD no local Ser99 em todas as linhagens celulares de carcinoma testadas; no entanto, NPB não demonstrou efeito na fosforilação de hBAD no local Ser75 nas mesmas células, indicando que NPB inibiu especificamente a fosforilação em Ser99 de hBAD (Figura 15).
A depleção mediada por siRNA da expressão BAD reverte o efeito de NPB em linhagens celulares de carcinoma.
[115] Para confirmar a especificidade funcional de NPB direcionado à proteína BAD, foi examinado adicionalmente o efeito da exposição a NPB após a depleção mediada por siRNA da expressão de BAD em 6 linhagens celulares de carcinoma (MCF7, BT474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 e DLD-1). A transfecção transitória das diferentes células de carcinoma
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66/76 com siRNA direcionado para o transcrito de BAD diminuiu a expressão de BAD, e também diminuiu os niveis de BAD em Ser99-fósforo em comparação com suas células de controle (transfectadas com oligo embaralhado) , como observado pela análise por western blot (Figura 16A) . A viabilidade celular ou a apoptose foram alteradas significativamente com a depleção de BAD mediada por siRNA, como relatado anteriormente [26] . Como descrito acima, o tratamento com NPB das linhagens celulares de carcinoma transfectadas de controle diminuiu a fosforilação de BAD (Ser99) em comparação com as células tratadas com veiculo. Concomitantemente, a exposição das mesmas linhagens celulares de carcinoma ao NPB diminuiu a viabilidade celular e aumentou a atividade de caspase 3/7 em comparação com as células expostas ao veiculo. Em contraste, NPB não afetou a viabilidade celular nem a atividade da caspase3/7 em linhagens celulares de carcinoma com expressão esgotada de BAD (Figura 16B&C).
Exemplo 6
NPB inibe a fosforilação de BAD independente da sinalização de AKT em linhagens celulares de carcinoma
[116] A AKT Ser/Thr quinase a montante regula a fosforilação de hBAD em Ser99 [13] . Portanto, foi determinado se NPB inibe a fosforilação do hBAD (Ser99) através da modulação da atividade do AKT (como indicado por fosforilação e Ser473) usando a análise por western blot. Não foi
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67/76 observada nenhuma mudança nos níveis de pAKT ou nos níveis de proteína AKT total após a exposição de quatro linhagens celulares de carcinoma diferentes (MCF7, Caov-3, Ishikawa e AsPC-1) para 10 μΜ de NPB. No entanto, todas as linhagens celulares de carcinoma tratadas com NPB (MCF7, Caov-3, Ishikawa e AsPC-1) exibiram inibição da fosforilação de BAD no local Ser99 e sem alteração no nível da proteína BAD total (Figura 15B) . Adicionalmente, examinamos a fosforilação de BAD após a depleção de AKT usando dois shRNA independentes visando a expressão de AKT ou inibição da atividade de AKT com o inibidor de AKT IV como um controle positivo nas diferentes linhagens celulares de carcinoma. Foi observado que a expressão esgotada de AKT nas linhagens celulares de carcinoma estava associada a uma diminuição concomitante dos níveis de pAKT (Ser474) e pBAD (Ser99) em comparação com as células de controle; indicativo de que a fosforilação de BAD em Ser99 é dependente de AKT em todas as linhagens celulares derivadas de câncer testadas e como publicado anteriormente por outras [13, 15, 27-29] . Portanto, NPB inibe especificamente a fosforilação de BAD em Ser99 sem afetar a atividade da quinase a montante (AKT) [29]. Estes resultados são concordantes com a previsão alvo ín sílíco e a ligação de NPB a BAD observada pelo SPR. Por isso, o NPB inibe especificamente a fosforilação de BAD em Ser99 independente da quinase a montante (AKT).
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68/76
Exemplo 7:
[117] Camundongos fêmeas BALB/c-nu de 5 a 6 semanas de idade foram implantados subcutaneamente com grânulos de 17βestradiol (Innovative Research of America) a 0,72mg/grânulo, com uma liberação de 60 dias na nuca após três dias foram injetados em camundongos por via subcutânea com 100 μΐ de suspensão de células (IxlO7 células) em flancos direitos. O crescimento do tumor foi monitorado medindo o tamanho do tumor usando pinças. Cerca de 12 dias após o implante, os camundongos foram randomizados e divididos em três grupos (cada grupo, n=8), de acordo com os tratamentos administrados a 200μΒ de NPB (dissolvido em DMSO a 5%, PEG400 a 50% e água a 45% a pH 5,0) por injeção intraperitoneal todos os dias por sete dias. O primeiro grupo de camundongos foi tratado com veiculo, o segundo com dose de 5 mg/kg de NPB e o terceiro com dose de 20 mg/kg de NPB. O peso do animal e os volumes tumorais foram medidos diariamente. Após a conclusão, os tumores foram excisados, fotografados, pesados e fixados ou armazenados em nitrogênio liquido para análise posterior. A análise histológica foi realizada como descrito anteriormente (30-32).
[118] Foi examinada a eficácia ín vivo de NPB em um xenoenxerto (MCF7) de MC. Camundongos aleatoriamente agrupados com tumores pré-formados (volume ~150 cm3) foram
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69/76 injetados intraperitonealmente com veículo ou NPB a 5 mg/kg ou 20 mg/kg. Uma redução significativa no volume do tumor foi observada em camundongos tratados com NPB em comparação com os seus homólogos tratados com veículo (Figura 17A) . Durante esse período, o peso do animal não foi significativamente diferente entre os grupos (Figura 17A, abaixo) . No entanto, o peso do tumor de animais tratados com NPB foi reduzido em comparação com camundongos tratados com veículo e de maneira dependente da dose (Figura 17B) . Foi adicionalmente analisado o efeito do NPB nos níveis de fosforilação de hBAD em Ser99 no tecido tumoral usando a análise por WB (Figura 17C) . O tratamento com NPB inibiu significativamente a fosforilação de BAD (em Ser99) em um tumor em comparação com as amostras de controle. Não foi observada alteração nos níveis totais de proteína BAD entre os tumores tratados com NPB e os tumores tratados com controle.
[119] As análises histológicas das amostras de tumor retiradas dos animais tratados com NPB mostraram p-BAD significativamente reduzido (Ser99) em comparação com os tumores tratados com veículo (Figura 17D), enquanto a proteína BAD não foi significativamente diferente entre os grupos. Os animais tratados com NPB exibiram uma porcentagem significativamente reduzida de células positivas para Ki67 em tumores e uma positividade TUNEL significativamente
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70/76 aumentada em comparação com os tratados com veiculo (Figura 17D) .
Exemplo 8:
[120] Para elucidar a possibilidade de o NPB ter diminuído a fosforilação de hBAD em Ser99 por modulação da atividade de quinase, foram avaliados os efeitos do NPB em várias quinases usando o Kit de Matriz de Anticorpo de FosfoQuinase Humana da R&D Systems. Não foram observadas alterações significativas na atividade de quinase ou substratos fosforilados em células MCF7 expostas a NPB em comparação com células expostas a DMSO, apesar da inibição por NPB da fosforilação de hBAD em Ser99 no mesmo extrato (Figura 18).
Exemplo 9:
[121] Também foram gerados outros análogos do NPB (Figuras 19,20,21) de acordo com o molde químico reivindicado e que podem exibir melhores perfis farmacocinéticos que o NPB. Sua estrutura e eficácia in vitro, como determinado por ICso, são mostradas na Figura 22.
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Claims (21)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto caracterizado pelo fato de que é de fórmula geral (I):
    Figure BR112019022015A2_C0001
    (1) em que:
    cada R1 é independentemente halo, OH, ciano, nitro, NR10R11, 0(0) R10, 0(0) OR10, C(O)NR10R11, -S (0) qNR10R11, alquila Οι-s, haloalquila Ci-s, -0 (alquila Ci-s) , -0 (haloalquila Ci-s) , arila, heteroarila, -0-arila ou -O-heteroarila, em que cada R10 e R11 é independentemente selecionado de H ou alquila Ci-s opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de OH, halo, ciano, NH2, arila ou heteroarila;
    grupos alquila e haloalquila R1 são opcionalmente substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de OH, ciano, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, arila, heteroarila, 0-arila ou -O-heteroaril-O (alquila Ci-s) opcionalmente substituído com arila ou -0 (haloalquila Ci-s) ;
    os grupos arila ou heteroarila R1 são opcionalmente
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  2. 2/19 substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, ciano, nitro, -NR4R5, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, C(O)R4, -C(O)OR4 ou -alquila Ci-s ou -0 (alquila Ci-s) , qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de OH, halo, arila, heteroarila, -0 (alquila Ci-s) , 0 (haloalquila Ci-s) , -0-arila ou -O-heteroarila);
    p é 1 ou 2;
    cada um de R4 e R5 é selecionado independentemente de H ou alquila C1-4 ou R4 e R5, juntamente com um átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, pode formar um anel heterocíclico de 3 ou 8 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N e S;
    néO, 1, 2, 3, 4 ou 5;
    cada um de R2a e R2b é independentemente alquila Ci-s opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, arila ou heteroarila; ou
    R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual são ligados, formam um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N ou S e opcionalmente substituído(s) com um ou mais substituinte(s) R6;
    cada R6 é selecionado independentemente de arila, heteroarila, -0-arila, -O-heteroarila, carbociclila,
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  3. 3/19 heterociclila, -O-carbociclila, -O-heterociclila, R12, OR12, C(O)R12, C(O)ORn, C(O)NR11R12, CN, OH, cada R11 e R12 é independentemente H ou alquila C1-4, ou que pode ser substituído com um ou mais grupos arila ou heteroarila, em que grupos arila e heteroarila são substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado (s) de halo, OH, ciano, nitro, -NR4R5, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, 0(0) R4, -0(0) OR4 ou -alquila Ci-s ou -0 (alquila Ci-s) , ou urn dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituinte (s) selecionado (s) de OH, halo, arila, heteroarila, -0 (alquila Ci-s) , 0 (haloalquila Ci-s) , -0-arila ou -O-heteroarila);
    em que R4 e R5 são como definidos acima; ou R11 e R12 podem combinar com um átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um anel heterocíclico de 3 a 8 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de N, 0 e S e opcionalmente substituído (s) com alquila C1-4, haloalquila C1-4 ou halo;
    R3 é arila, heteroarila, carbociclila ou heterociclila, qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituinte (s) R7 selecionado (s) de halo, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -0 (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, -0 (haloalquila Ci_ 4) ou -C(O)NR8R9;
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  4. 4/19 cada um de R8 e R9 é selecionado independentemente de H, alquila C1-4 ou cicloalquila C3-6 ou R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterociclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, Ne S;
    ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma variante deuterada ou tritiada do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros.
    2. Composto caracterizado pelo fato de que é de fórmula geral (IA):
    Figure BR112019022015A2_C0002
    em que:
    cada R1 é independentemente halo, alquila Ci-s, haloalquila Ci-s, arila ou heteroarila, em que grupos arila ou heteroarila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, ciano, nitro, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, -S(O)PNR4R5, -C(O)NR4R5, alquila Ci-s opcionalmente substituído com arila,
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  5. 5/19 haloalquila Ci-s, -0 (alquila Ci-s) opcionalmente substituído com arila ou -0 (haloalquila Ci-s) ;
    p é 0, 1 ou 2;
    cada um de R4 e R5 é selecionado independentemente de H ou alquila Ci-4 ou R4 e R5, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, pode formar um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N e S;
    m é 0, 1, 2, 3 ou 4;
    cada um de R2a e R2b é independentemente alquila Ci-s opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) selecionado(s) de halo, OH, arila ou heteroarila; ou
    R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocí clico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, N ou S e opcionalmente substituído(s) com um ou mais substituinte(s) R6;
    cada R6 é selecionado independentemente de arila, heteroarila, -0-arila, -O-heteroarila ou alquila C1-4 substituído com um ou mais grupos arila ou heteroarila, em que grupos arila e heteroarila são substituídos com um ou mais substituinte (s) selecionado (s) de halo, alquila C1-4, haloalquila C1-4, -0 (alquila C1-4) ou -0 (haloalquila C1-4) ;
    R3 é arila, heteroarila, carbociclila ou
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  6. 6/19 heterociclila, qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais substituinte (s) R7 selecionado (s) de halo, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -0 (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, -0 (haloalquila Ci_ 4) ou -C(O)NR8R9;
    cada um de R8 e R9 é selecionado independentemente de H, alquila C1-4 ou cicloalquila C3-6 ou R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar um anel heterocí clico de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomo(s) adicional(ais) selecionado(s) de 0, Ne S;
    ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma variante deuterada ou tritiada do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros.
    3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que n é 1 ( du 2 e pelo menos um grupo R1 é OH; ou um composto, de acordo com a reivindicação 2, em que m é 0 ou 1. 4. Composto, de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que m é diferente de 0 e R1 é halo ou um grupo arila ou heteroarila opcionalmente substituído como definido na reivindicação 2 . 5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fate d de que R1 é um grupo arila ou
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 21/37
  7. 7/19 heteroarila opcionalmente substituído com halo, OH, ciano, nitro, -SO2NH2, -C(O)NR4R5, -alquila C1-4 opcionalmente substituído com arila, -haloalquila C1-4, -0 (alquila C1-4) opcionalmente substituído com arila ou -0 (haloalquila C1-4) , em que R4 e R5, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel de piperidina ou pirrolidina.
    6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que R1 é um grupo arila ou heteroarila opcionalmente substituído com cloro, flúor, metila, etila, trifluorometila, benzila, metoxi, etoxi, benziloxi, trifluorometoxi e piperidina-l-carbonila.
    7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico de 6 membros opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) R6.
  8. 8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que R2a e R2b, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel de piperazina substituído com um único substituinte R6 na posição 4 da piperazina, de modo que o composto da fórmula geral (I) seja um composto de fórmula geral (IB):
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 22/37
    8/19
    N em que R1
    Figure BR112019022015A2_C0003
    OH são como definidos na reivindicação 2 .
    Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
    8, caracterizado pelo fato de que
    R6 é fenila, heteroarila, -O-fenila, -O-heteroarila, benzila
    CH(fenila)2, -CH2-heteroarila e -CH(heteroarila)2, em que o grupo heteroarila é selecionado de piridinila, indolila isoindolila benzoxazolila e benzisoxazolila, e em que qualquer um dos grupos R6 acima pode ser substituído como definido na reivindicação 1.
    10 .
    Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizado pelo fato de que
    R3 é fenila opcionalmente substituído com um ou mais substituinte(s) R7, de modo que o composto da fórmula geral (I) seja um composto da fórmula geral (IC):
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 23/37
  9. 9/19 em fórmula
    11.
    Figure BR112019022015A2_C0004
    que R1
    R2a
    R2b e R7 são como definidos para a geral (I) e
    Composto caracterizado pelo presente (ou seja de fato de 0 a 5.
    acordo de que ou com a reivindicação
    R7 é
    1 ou 2, R7 não halo, -alquila está benzila, -O (alquila C1-4) benziloxi, -haloalquila C1-4,
    O (haloalquila C1-4) ou -C(O)NR8R9, em que R8 e R9, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um anel piperidinila ou em que R8 é H e R9 é cicloalquila C3-7.
    11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é um composto de fórmula geral (ID):
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 24/37
  10. 10/19
    R6
    Figure BR112019022015A2_C0005
    em que R1, n, R6, R7 e z são como definidos acima.
    12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado de:
    2-( (2-clorofenil) (4-(4-metoxifenil)piperazin-1il)metil)fenol (Composto 1);
    2-( (4-clorofenil) (4-(4-metoxifenil)piperazin-1il)metil)fenol (Composto 2);
    2- ( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4- (4- metoxifenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 3);
    (4-( (2-hidroxifenil) (4-(4metoxifenil)piperazinil)metil)fenil)(piperidin-1il)metanona (Composto 4);
    3- ( (5-cloro-2-hidroxifenil) (4- (4- metoxifenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 5);
    2- ( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4- (4metoxifenil)piperazin-l-il)metil)-4-clorofenol (Composto
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 25/37
  11. 11/19
    6) ;
    2-( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4-(6fluorobenzo[d]isoxazol-3-il)piper!din-1-11)metil)fenol (Composto 7);
    2-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(otolil)metil)fenol (Composto 8);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (2-hidroxifenil)metil)benzamida (Composto 9, NPB);
    2-( (4-(benziloxi)-3-fluorofenil) (4 - (2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 10);
    2- ( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-lil) (fenil)metil)fenol (Composto 11);
    2-( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (ptolil)metil)fenol (Composto 12);
    2- ( (4-clorofenil) (4-( (4clorofenil)(fenil)metil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 13);
    2-( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (4etilfenil)metil)fenol (Composto 14);
    (4-( (4-( (4-clorofenil) (fenil)metil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)fenil) (piperidin-l-il) metanona (Composto
    15) ;
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil) (4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto
    16) ;
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 26/37
  12. 12/19
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4-hidroxi-2’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 17);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4-hidroxi-3’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 18);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4-hidroxi-4’-metil-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 19) ;
    3-((2’-cloro-4-hidroxi-[l,l'-bifenil]-3-il)(4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 20) ;
    3-((3’-cloro-4-hidroxi-[l,l'-bifenil]-3-il)(4-(2,3- diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 21);
    3-((4’-cloro-4-hidroxi-[l,l'-bifenil]-3-il)(4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 22);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il)(4’-etil-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil)benzamida (Composto 23);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-4'-(piperidina-l-carbonil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 24);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 27/37
  13. 13/19
    11) (4-hidroxi-4'-metoxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil) benzamida (Composto 25);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (2’-etil-4-hidroxi-[1,1'-bifenil]-3-il)metil) benzamida (Composto 2 6) ;
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (2’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil) benzamida (Composto 27);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (3’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil) benzamida (Composto 28);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4’-fluoro-4-hidroxi-[1,I'-bifenilJ-S-il)metil) benzamida (Composto 29);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-3’-nitro-[1,1'-bifenil]-3-il)metil) benzamida (Composto 30);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-3'-sulfamoil-[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 31);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-2'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 32);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil ) (4-hidroxi-3'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 28/37
  14. 14/19 il)metil)benzamida (Composto 33);
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1il) (4-hidroxi-4'- (trifluorometil) -[1,1'-bifenil]-3il)metil)benzamida (Composto 34);
    3- ( (2'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 35) ;
    3-((3'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il)(4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 36)
    3-( (4'-ciano-4-hidróxi-[l,l'-bifenil]-3-il) (4-(2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 37 ) ;
    3-( (2'-cloro-4-hidróxi-4'- (trifluorometil) -[1,1' bifenil]-3-il)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-N ciclopentilbenzamida (Composto 38);
    N-ciclopentil-3-((2’,4’-dicloro-4-hidroxi-[1,1'bifenil]-3-il)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-lil)metil)benzamida (Composto 39);
    3- ( (4'-cloro-2',4-di-hidroxi-[l,l'-bifenil]-3-il) (4(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)metil)-Nciclopentilbenzamida (Composto 40);
    3- ( (4- (4-clorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 41
    NCK1)
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 29/37
  15. 15/19
    2-((4-clorofenil)(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l11)metil)fenol (Composto 42, NCK2)
    2-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (3metoxifenil)metil)fenol (Composto 43, NCK3)
    1- (5- ( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)tiofen-2-il)etanona (Composto 44, NCK4)
    2- ((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(naftalen-1il)metil)fenol (Composto 45, NCK5)
    5-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)furan-2-carbaldeído (Composto 46, NCK6)
    2-((4-(5,6-diclorociclohexa-l,5-dien-l-il)piperazin-lil) (2-fluoro-3-metilpiridin-4-il)metil)fenol (Composto 47, NCK7)
    2-( (4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il) (4(trifluorometil)fenil)metil)fenol (Composto 48, NCK8)
    2-((6-cloro-5-metilpiridin-3-il) (4 - (2,3diclorofenil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 49, NCK9)
    2- ((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-l-il)(piridin-3- il)metil)fenol (Composto 50, NCK10)
    1- (5- ( (4-(4-clorofenil)piperazin-l-il) (2hidroxifenil)metil)tiofen-2-il)etanona (Composto 51, NCK14)
    3- ((4-(4-clorofenil)piperazin-l-il)(4-(diet!lamino)-2hidroxifenil)metil)-N-ciclopentilbenzamida (Composto 52, NCK16)
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 30/37
  16. 16/19
    11)(4-(dietilamino)-2-hidroxifenil)metil)benzamida (Composto 53, NCK18)
    N-ciclopentil-3-((4-(2,3-diclorofenil)piperazin-111)(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)metil)benzamida (Composto
    54, NCK19)
    2-( (4-clorofenil) (4- (4-clorofenil)piperazin-111)metil)fenol (Composto 55, NCK20)
    2-((4-(4-clorofenil)piperazin-l-il)(6-metilpiridin-311)metil)fenol (Composto 56, NCK21)
    2- (o-tolil(4-(p-tolil)piperazin-l-il)metil)fenol (Composto 57, SGI)
    2- ( (4-(p-tolil)piperazin-l-il) (4(trifluorometil)fenil)metil)fenol (Composto 58, SG2) N-ciclopentil-4-((2-hidroxifenil)(4-(ptolil)piperazin-l-il)metil)benzamida (Composto 59, SG3)
    2- ( (4-clorofenil) (4- (p-tolil)piperazin-lil) metil) fenol (Composto 60, SG4)
    2-( (3-metoxifenil) (4- (p-tolil)piperazin-lil) metil) fenol (Composto 61, SG5)
    5-((2-hidroxifenil)(4-(p-tolil)piperazin-lil ) metil ) furan-2-carbaldeído (Composto 62, SG6)
    2-((6-metilpiridin-3-il)(4-(p-tolil)piperazin-lil ) metil ) fenol (Composto 63, SG7);
    ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma variante deuterada ou tritiada do
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 31/37
  17. 17/19 mesmo, incluindo todos os estereoisômeros.
    14. Processo para a preparação de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a caracterizado pelo fato de que compreende:
    reagir um aldeído de fórmula geral (II): em que com um em que
    Figure BR112019022015A2_C0006
    R1 e n são como definidos na reivindicação 1;
    composto de fórmula geral R2a θ R2b são como definidos na reivindicação
    1;
    e um ácido borônico de fórmula geral (IV):
    (IV) em que R3 é como definido na reivindicação 1; ou reagir um composto da fórmula geral (I) no qual
    R1 é halo com um composto da fórmula geral (V) :
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 32/37
  18. 18/19
    Figure BR112019022015A2_C0007
    fV8 (V) em que Rla é arila ou heteroarila opcionalmente substituído como definido para R1 na reivindicação 1;
    via uma reação de acoplamento Suzuki na presença de um catalisador de paládio para obter um composto de fórmula geral (I) em que R1 é Rla.
    15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso em medicamento.
    16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
    17. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizado pelo fato de que é na preparação de um agente para o tratamento de câncer.
    18. Método para o tratamento de câncer, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessidade de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
    Petição 870190105977, de 19/10/2019, pág. 33/37
  19. 19/19
    19. Composto para uso, uso ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer no qual existe fosforilação de BAD, por exemplo, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer de próstata, ou câncer de pâncreas, ou qualquer outro câncer de origem epitelial, em que BAD seja fosforilado.
  20. 20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  21. 21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração intraperitoneal, administração porta hepática, administração intravenosa, administração intra-articular, administração da artéria duodenal pancreática ou administração intramuscular, ou qualquer combinação das mesmas.
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