BG67190B1 - Анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гама интерферон - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гама- интерферон (hIFN-у), приложим при заболявания, свързани с повишена продукция на ендогенен hIFN-у. По своята същност представлява неактивен аналог на hlFN-у със запазен афинитет към рецептора на hlFN-у, където последните 5 аминокиселинни остатъка от C- края на интерфероновата молекула са отстранени и аминокиселината в позиция 88 е заменена с глутамин (Q), като допълнително аминокиселината в позиция 27 е заменена с тирозин (Y) или аминокиселината в позиция 41 е заменена с аспарагин (N).

Description

(54) АНТИ-ГАМА МУТАНТЕН ПРОТЕИН СРЕЩУ ЕНДОГЕННИЯ ЧОВЕШКИ ГАМАИНТЕРФЕРОН

Област на техниката

Изобретението се отнася до анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гамаинтерферон (hlFN-γ), приложим като средство за лечение на заболявания, свързани с повишена продукция на ендогенен hlFN-γ.

Предшестващо състояние на техниката

Автоимунни болести се развиват тогава, когато имунната система започне да произвежда антитела (автоимунни антитела) срещу даден собствен протеин и чрез тях атакува тъканта (респективно органа), в която той е локализиран. Засега са известни повече от 80 различни автоимунни заболявания, засягащи около 2% от населението на Земята. Те водят до продължителни страдания, инвалидизация и ранна смърт. Към тях спадат такива популярни и широкоразпространени заболявания като ревматоиден артрит, тиреоидит на Хашимото, лупус еритематозус (червена вълчанка), множествена склероза, невродегенеративни болести, някои видове безплодие при мъжа и жената и др. Поради тази причина търсенето на средства за специфично потискане на автоимунитета е една от приоритетните задачи на съвременната медицина и фармация.

Редица изследвания показват, че автоимунните заболявания са съпроводени с повишени нива на провъзпалителните цитокини и в частност на човешкия гама-интерферон (hlFN-γ), за който се знае, че е утежняващ фактор за протичането на тези болести. Автоимунната атака на прицелната тъкан води до възпалителна реакция, която от своя страна е съпроводена с обилна инфилтрация на Т-лимфоцити и макрофаги от CD4⁺ субтип, а те от своя страна произвеждат проинфламаторните Thl цитокини интерлевкин-2 (IL-2) и hlFN-γ. Последните пък стимулират мононуклеарните клетки да произвеждат някои деструктивни субстанции като лимфотоксини (LT) и туморнекрозиращ алфа-фактор (TNF-a). Категорично е установено, че ключова роля в патогенезата на тези заболявания има абнормената продукция на hlFN-γ [1-3].

За инхибиране секрецията на hIFN-γ при лечение на множествена склероза в клиничната практика се прилага hIFN-β. На тази база са разработени и патентите US082138, WO9530435, СА2361081. В други патенти (RU2073522, RU2187332, RU02166959) за лечение на тази болест пък се използва смес от трите интерферона hIFN-a, hIFN-β и hlFN-γ. Има съобщения, че високите дневни дози hIFN-β (от порядъка на 8 000 000 IU) водят до неблагоприятни ефекти като: блокиране пролиферацията на Т-клетките [4]; неутрализация на IL-12, с което пък се подсилва ефекта на hlFN-γ [5]; понижаване на общото ниво на CD4+ (Thl, Th2) и CD8+ (Tel) клетките без да се повлиява съотношението Thl/Th2 [6]; понижаване на нивото както на проинфламаторните, така и на антиинфламаторните цитокини [7] и др.

В периодичната [8, 9] и патентната (WO0145747) литература съществува информация за неутрализиране активността на hIFN-γ чрез използването на анти-hlFN-y антитела. Резултатите обаче показват, че продължителното прилагане на анти-hlFN-Y терапия влошава състоянието на пациентите, тъй като лишава организма от жизнено важния за имунната система hIFN-γ, поради което този подход е изоставен.

BG 67190 Bl

В търсене на нови подходи за неутрализиране на абнормената продукция и действие на hlFN-γ, съгласно патенти US0086534 и СА2299361, са предложени аналози на интерферони от тип 1, т. нар. консенсусни интерферони (hlFN-coni, hlFN-con2 и hlFN-сопз), принадлежащи към групата на hIFN-α и hIFN-β, както и hlFN-τ. Данните от изследванията показват наличие на странични ефекти, в това число и токсичност на препаратите, изготвени на тяхна основа.

Известни са опити за използване на аналози на hIFN-γ, притежаващи частична аминокиселинна последователност на hIFN-γ, но в качеството им на антивирусни, антитуморни, антинеопластични или имуномодулиращи средства (US4832959, WO02081507, АТ393690). Твърденията са само декларативни и не са подкрепени с конкретни данни в описанието и примерните изпълнения.

Обект на патент WO2006/099701А1 е друг подход за инхибиране на активността на hIFN-γ посредством неактивни аналози на hIFN-γ със запазен афинитет към гама-интерфероновия рецептор. Описани са три различни метода за получаване на такива аналози чрез: 1) Елиминиране на С-крайната част от молекулата на hIFN-γ; 2) Замяна на С-крайната част с друга полипептидна последователност от човешки произход и 3) Инактивиране на hIFN-γ с физически методи (УВ светлина). Получените по този начин протеини имат запазен афинитет към гама-интерфероновия рецептор, но са неспособни да активират предаването на сигнала от рецептора към ядрото (сигналната трансдукция), поради което се явяват неактивни конкуренти на ендогенния hIFN-γ.

Съгласно заявка за патент WO2009/124362A1, със същата цел генът на hIFN-γ е мутиран в областта на аминокиселините в позиции № 86, 87 и 88. Тази област е отговорна за сигналната трансдукция вътре в клетката. Тези мутации не влияят на структурата на участъците, които са необходими за свързването на hIFN-γ с рецептора и те остават интактни. Така са създадени два генно-модифицирани варианта на hIFN-γ, в единия от които лизин (К) в позиция 88 е заменен с глутамин (Q), а в другия, заедно с тази замяна е отстранена и част или цялата неструктурирана С-крайна част от молекулата на hIFN-γ. Молекулният размер на двата генно-модифицирани варианта на hIFN-γ е съответно 143 аминокиселини за първия и 122 аминокиселини за втория, като се претендира, че са потенциални средства за лечение на автоимунни заболявания като Multiple sclerosis, Alopecia areata u Myastenia gravis.

Техническа същност на изобретението

По своята същност, анти-гама мутантният протеин, съгласно изобретението, се основава на неактивни структурни аналози на hIFN-γ със запазен афинитет към рецептора на hlFN-γ, но неспособни да задействат специфичния за hIFN-γ път на сигнална трансдукция. По-специално, анти-гама мутантният протеин, съгласно изобретението, представлява структура, в която последните 5 аминокиселинни остатъка от С-края на интерфероновата молекула са отстранени, аминокиселината (ак) в позиция 88 е заменена с глутамин (Q) и е въведена втора мутация, състояща се в замяна на аминокиселината в позиция 27 с тирозин (Y) или замяна на аминокиселината в позиция 41 с аспарагин (N).

И двата варианта на анти-гама мутантния протеин, обозначени съответно като мутантен протеин K88Q T27Y (SEQ ID NO:1) и мутантен протеин K88Q D41N (SEQ ID NO:2), са съставени от 138 ак. Избраната дължина се основава на факта, че в кръвния ток hIFN-γ претърпява процесиране, в резултат

BG 67190 Bl на което се генерира скъсен и по-стабилен вариант на интерфероновата молекула, който има по-дълъг полу-живот в кръвния ток [10].

Конкуренцията между активните (hIFN-γ) и неактивните молекули (анти-гама мутантните протеини) за рецептора на hIFN-γ наподобява конкурентното инхибиране на ензимната активност в кръвния поток, при което резултатът се определя от относителните концентрации на двата конкурента. По този начин анти- гама мутантните протеини, съгласно изобретението, играят роля на инхибитори на ендогенния човешки гама-интерферон и представляват ефективно средство за лечение на автоимунни заболявания.

Анти-гама мутантните протеини, съгласно изобретението, са конструирани въз основа на пространствената структура на hIFN-γ самостоятелно [11] и в комплекс с неговия рецептор [12], както и на базата на собствен компютърен модел на взаимодействието между двете молекули [13]. Първичната структура на анти-гама мутантните протеини, с изключение на посочените модификации, съвпада с тази на природния hIFN-γ [11].

Кодон оптимизираните гени за бактериална експресия, кодиращи анти-гама мутантните протеини, са синтезирани от фирма Life Technologies и са конструирани така, че да кодират белтъците с аминокиселинна последователност, посочена в Секвенционния листинг (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2). Всички използвани праймери са произведени от Eurofins Genomics. Синтетичните гени са клонирани в експресионен вектор рЕТ28а така, че да са експресират под формата на „слят” протеин притежаващ Nкрайна HIS-SUMO „опашка”, която се състои от шест хистидинови остатъка и SUMO протеин (Фиг. 1). Прилагането на този подход позволява да се повиши разтворимостта и добива на целевия протеин без да се променя неговата аминокиселинна последователност, тъй като SUMO „опашката” асистира при неговото правилно нагъване в клетката-продуцент, а процедурата по пречистване включва отстраняване на тази опашка чрез специфична SUMO протеаза. След проведен секвенционен анализ на получената след протеолиза аминокиселинна последователност е показано, че N-крайният метионин от слетия протеин се отстранява заедно с HIS-SUMO „опашката” чрез SUMO протеазата. Това е важна характеристика на анти-гама мутантните протеини като терапевтични средства, тъй като по литературни данни [14] N-крайният метионин води до имуногенност на рекомбинантните белтъци.

Стъпките по клониране на трите синтетични гена и въвеждането им в експресионния вектор рЕТ28а са описани подробно в [15].

Конструираните гени са експресирани в бактериалния щам Е. coli BL21(DE3)/pG-KJE8, който е подходящ за производство на рекомбинантни протеини в разтворима форма. Това се дължи на факта, че в този щам рекомбинантният протеин се ко-експресира с двете шаперонови системи - DnaK-DnaJ-GrpE и GroEL-GroES, които подпомагат процеса на правилно нагъване и възпрепятстват агрегацията. По тази причина целевият протеин се натрупва в клетката предимно в разтворима форма.

Получените по този начин рекомбинантни протеини се изолират и пречистват съгласно процедурите описани в [15]. Накратко, процедурата по пречистване включва две хроматографски стъпки - афинитетна и йонообменна хроматография, с междинна стъпка на отстраняване на HIS-SUMO „опашката”. Двата анти-гама мутантни протеини се изследват за остатъчна биологична активност (изразена в международни единици, IU) определена по тяхната цитостатична активност (кинуренинов метод [16]). Като контроли се използват: 1) референтен hlFN-γ (стандарт); 2) референтен hlFN-γ, скъсен с 5 ак от С-края на интерфероновата молекула и 3) мутантен протеин, обозначен като K88Q, който също е скъсен с 5 ак от С-края на молекулата, но аминокиселината в позиция 88 е заменена с глутамин (Q). Резултатите са представени на Таблица 1.

Таблица 1. Биологична (цитостатична) активност на анти-гама мутантните белтъци

Рекомбинантен протеин	Специфична активност, IU/mg
K88Q_T27Y (138 ак)	4 4х 10
K88Q_D41N (138 ак)	3 4х 10
Контрола 1: Стандарт hlFN-y (143 ак)	2-5 х 107
Контрола 2: Скъсен hlFN-y (138 ак)	Зх 107
Контрола 3: K88Q (138 ак)	Зх 105

BG 67190 Bl

Както е видно от таблицата, остатъчната цитостатична активност на двата анти-гама мутантни протеина варира от 4 х 10³ Ш/mg (за K88Q D41N) до 4 х 10⁴ Ш/mg (за K88Q T27Y), т. е. от 7500 до 750 пъти по-ниска от тази на стандартния hlFN-γ. Анти-гама мутантен протеин K88QD41N е практически неактивен. И двата анти-гама мутантни протеина, K88Q T27Y и K88Q D41N, имат значително по-ниска остатъчна активност спрямо контролния точков мутант K88Q.

Афинитетът на пречистените анти-гама мутантни протеини към гама-интерфероновия рецептор е изследван директно по два начина: а) чрез изотермична титрационна калориметрия (iTC) и б) чрез повърхностен плазмонен резонанс (SPR). И в двата случая е използван рекомбинантен рецептор на hlFNγ (извънклетъчната част на рецептора IFNGR1) експресиран в животински клетки, който при първия метод (iTC) се намира в разтвор, а при втория (SPR) се имобилизира върху сензорен микрочип.

iTC е най-прецизният метод за изследване на енергетиката на взаимодействие между биомолекули и единственият метод, който дава цялостен термодинамичен профил (афинитет на свързване Кд, стехиометрия на свързване п, енталпия АН°, ентропия AS⁰ и свободна енергия на Гибс AG ) на изследваното взаимодействие. При този метод рекомбинантният рецептор IFNGR1 намиращ се в разтвор се титрува с пречистен анти-гама мутантен протеин или референтен hlFN-γ. Определят се афинитетът на свързване и стабилността на образувания комплекс между референтния hlFN-γ и IFNGR1, както и между анти-гама мутантния протеин и IFNGR1, и се сравняват термодинамичните характеристики за отделните лиганд-рецепторни комплекси.

Методът SPR позволява също да се определят част от параметрите на образуване на комплекса hlFN-y-IFNGRl и анти-гама мутантен протеин-IFNGRl. Тези параметри включват скоростните константи на асоциация (К_оп) и дисоциация (К_од), афинитетната константа (Кд) и константата на дисоциация (K_D). При този метод рекомбинантният рецептор IFNGR1 се имобилизира върху повърхността на сензорен чип, а изследваните анти-гама мутантни протеини и hlFN-γ се пропускат по повърхността на чипа чрез постоянен поток.

Резултатите от проведените експерименти са представени в Таблица 2.

Таблица 2. Термодинамични параметри на комплексите на IFNGR1 с hlFN-y или анти-гама мутантен протеин.

Рекомбинантен протеин	KD> (пМ) измерено чрез iTC	Ка. (пМ) измерено чрез SPR
K88Q_T27Y	28.2 ± 7.9	142
K88Q_D41N*	•	78.7
Контрола 1: hlFN-y	136 ±23.0	30.8
Контрола 2: K88Q	18.9 + 2.8	30.6

BG 67190 Bl * Анти-гама мутантният протеин K88QD41N е изследван само чрез метода SPR

Както се вижда от таблицата, измерената чрез метода SPR афинитетна константа (Ка) на мутантен протеин K88Q (контрола 2) е съизмерима с тази на hIFN-γ (контрола 1), докато стойностите за К_А на анти-гама мутантните протеини, K88QT27Y и K88Q D41N, са дори 2-3 пъти по-високи от Кд на hlFNγ и K88Q съответно. Тези резултати показват по-силния афинитет на анти-гама мутантните протеини K88Q T27Y и K88Q D41N към гама-интерфероновия рецептор в сравнение с референтния hIFN-γ и точковия мутант K88Q. Съгласно метода iTC, отчетените константи на дисоциация (K_D) на изследваните протеини K88Q и K88Q T27Y са 4-6 пъти по-ниски от K_D на референтния hIFN-γ. Получените по двата метода (iTC и SPR) данни са в съгласие и доказват, че анти-гама мутантните белтъци K88QT27Y и K88Q D41N се свързват по-здраво от hIFN-γ с неговия рецептор. Този доказано по-висок афинитет към гама-интерфероновия рецептор в сравнение с ендогенния hIFN-γ и съответно, по-ефективното блокиране на гама-интерфероновите рецептори чрез анти-гама протеина, съгласно изобретението, е основание за неговото приложение за изготвяне на медикамент за лечение на заболявания, свързани с повишена продукция на ендогенен hIFN-γ.

Конкурентоспособността на получените пречистени анти-гама мутантни протеини K88Q T27Y и K88Q D41N спрямо референтния hIFN-γ е изследвана върху човешки амниотични клетки WISH чрез кинуренинов тест [16]. WISH клетките са изключително богати на hIFN-у-рецептори и поради тяхната висока чувствителност към hIFN-γ са приети като стандарт за определяне на гама-интерферонова активност. В проведеният експеримент референтен hIFN-γ с постоянна концентрация се смесва с изследваните анти-гама мутантни протеини в нарастващи концентрации, а конкурентоспособността на K88Q (използван като контрола), K88QT27Y и K88Q D41N се оценява по понижаването на активността на референтния hlFN-y.

Резултатите от проведеното изследване са представени в Таблица 3.

Таблица 3. Конкурентоспособност на анти-гама мутантните белтъци K88Q T27Y, K88Q D41N и K88Q (контрола 1), изследвана чрез кинуренинов метод върху WISH клетъчна линия

Анти-гама мутантен протеин	Конкурентоспособност %
K88Q_T27Y	35
K88Q_D41N	30
Контрола 1: K88Q	25

BG 67190 Bl

Ha Таблица 3 се вижда, че и трите изследвани анти-гама мутантни протеина конкурират ефективно референтния hIFN-γ за свързването му към неговия рецептор в реална биологична система. Съгласно получените резултати, по своята конкурентоспособност те се подреждат в следния ред: K88QT27Y > K88Q D41N > K88Q, което е изцяло в съгласие с идеята за техния дизайн като анти-гама мутантни протеини. Най-силно изразената конкурентоспособност на K88Q T27Y може да се обясни с допълнителната мутация в N-края на молекулата (в позиция № 27), която е въведена с цел по-ефективно и стабилно свързване на анти-гама мутантния протеин с гама-интерфероновия рецептор. K88Q D41N носи аминокиселинна замяна в позиция № 41 с цел стабилизиране на неговата димерна форма, когато е в комплекс с рецептора на hIFN-γ Както се вижда от Таблица 3, експерименталните данни потвърждават, че по конкурентни качества мутантният протеин K88Q D41N се подрежда между K88Q T27Y и K88Q.

Предимствата на анти-гама мутантният протеин, съгласно изобретението се изразяват в това, че не притежава N-краен метионин, за който е известно, че води до имуногенност на рекомбинантните белтъци [14]; по съдържание на ендотоксини отговаря изцяло на изискванията на Агенцията за контрол на храните и лекарствата на САЩ (FDA) за безопасност и разпространение на лекарствени средства, което е условие за липсата на токсичност, когато се прилага като терапевтичен препарат; и двата варианта на анти-гама мутантният протеин се характеризират със запазена структура и дори по-голям афинитет към рецептора на hlFN-y в сравнение с природния hlFN-y в сравнение с вече известните мутанти, което означава, че те по-ефективно блокират гама-интерфероновите рецептори; анти-гама мутантният протеин конкурира най-ефективно hlFN-y при съотношения на анти-гама мутантен протеин спрямо референтен hlFN-y от 0.1:1 до 0.5:1, което е категорично предимство, тъй като при тези ниски концентрации рекомбинантните анти-гама препарати няма да натоварват допълнително организма; от друга страна, установената доза-зависимост позволява да се определи оптималната за конкретния пациент концентрация на прилагания медикамент; и двата варианта на анти-гама мутантният протеин, K88Q T27Y и K88Q D41N, притежават по-ниска остатъчна интерферонова активност и значително подобри конкурентни качества спрямо референтен hlFN-y в сравнение с точковия мутант K88Q, поради което имат всички необходими качества да послужат като средство за производство на медикаменти за терапия на заболявания, съпроводени с повишена продукция на ендогенен hlFN-y, като автоимунните заболявания и възпалителни състояния. Те могат да включват например множествена склероза, алопеция ареата, миястения гравис, ревматоиден артрит, системен лупус еритематозус, гломерулонефритис, болест на Адисон, болест на Грейвс, болест на Хашимото, синдром на Гилейн-Бар, трансплантна атеросклероза, водеща до отхвърляне на присадения орган, болест на Алцхаймер, стерилитет, астма, възпалително заболяване на червата, болест на Крон, синдром на Бехтер и други.

BG 67190 Bl

Пояснение на приложената фигура

Фигура 1 представя структурата на експресионния вектор рЕТ28а съдържащ HIS-SUMO-hlFNγ/мутант, където:

рЕТ28а - вектор за индуцируема експресия;

Neo I - каталитичен домен на рестрикционната ендонуклеаза Neo I;

HIS, SUMO - кодиращи секвенции за HIS-SUMO „опашка”;

SUMO cleavage site - каталитичен домен за действие на SUMO-протеазата;

hlFN-у/мутант - кодираща секвенция за целеви протеин;

Xho I - каталитичен домен на рестрикционната ендонуклеаза Xho I.

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се пояснява със следните примери, без да ограничават неговия обхват:

Пример 1. Структура на анти-гама мутантни протеини K88QT27Y и K88Q_D41N

Първичната структура на анти-гама мутантните протеини е показана в Секвенционния листинг (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2). Двата анти-гама мутантни протеина представляват скъсени модифицирани варианти на природния hlFN-γ и на точков мутант K88Q. K88Q носи мутация, състояща се в замяна на аминокиселината лизин (К) в позиция 88 с глутамин (Q). Целта на въведената мутация е да се наруши целостта на вътрешната NLS сигнална последователност, а с това да се причини загуба на интерферонова активност на съответния протеин. Двата анти-гама мутантни протеина K88Q T27Y и K88Q D41N са съставени от 138 ак, като са отстранени последните 5 ак откъм С-края и са въведени мутации в конкретни области от интерфероновата молекула. Избраната дължина е с цел по-голяма стабилност и по-дълъг полуживот на анти-гама мутантните протеини в кръвния ток [10]. Анти-гама мутантен протеин, означен като K88Q T27Y, носи освен посочената мутация в позиция 88 и втора, при която треонин (Т) в позиция 27 е заменена с тирозин (Y) (SEQ ID NO: 1). С оглед на това, че местата за свързване на hlFN-γ с рецептора са локализирани в N-крайните участъци на молекулата, целта на втората мутация в K88QT27Y е да се благоприятства взаимодействието на този анти-гама мутантен протеин с гама-интерфероновия рецептор. При втория анти-гама мутантен протеин, означен като K88Q D41N, освен посочената мутация в позиция 88, е внесена допълнителна мутация в позиция 41, където аспартовата киселина (D) е заменена с аспарагин (N) (SEQ ID NO:2). Целта на тази мутация в анти-гама мутантен протеин K88Q D41N е да се стабилизира неговата димерна структура, когато е в комплекс с гама-интерфероновия рецептор.

И двата варианта на анти-гама мутантния протеин, съгласно изобретението, носят само по две променени аминокиселини, а в останалата си част са идентични на природния hlFN-γ. Това е предпоставка за липсата на имуногенност, когато се прилагат като терапевтични препарати.

Пример 2. Получаване и пречистване на анти-гама мутантните протеини Кодон оптимизираният ген за бактериална експресия, кодиращ анти-гама мутантен протеин K88Q T27Y, е синтезиран от фирма Life Technologies. Чрез 2-стьпален PCR е създаден хибриден генен конструкт, кодиращ слят протеин с N-крайна 6-хистидинова опашка (HIS), SUMO протеин (SUMO) и анти-гама мутантен протеин K88Q T27Y. Хибридният ген е клониран по две рестриктазни места (Neo 1 и Xho I) с цел въвеждане в експресионен вектор pET28a, като по този начин се генерира ДНК-последователност кодираща „слят протеин (Фиг.1). Получената ДНК последователност е секвенирана с цел да бъде потвърдена нейната структура. Всички стъпки по клонирането на K88QT27Y, както и въвеждането на хибридния ген в експресионен вектор рЕТ28а са описани в [15]. С така създадения експресионен вектор са трансформирани клетки на бактериалния щам Е. coli BL21(DE3)/pG-KJE8. Приложената процедура по експресия на анти-гама мутантния протеин е описана подробно в [15].

Анти-гама мутантен протеин K88QD41N е клониран и експресиран по аналогичен начин на K88Q T27Y съгласно [15].

След експресия анти-гама мутантните протеини се подлагат на двустъпално хроматографско препаративно пречистване. Първата стъпка представлява афинитетно пречистване на клетъчната супернатанта, в която се съдържа разтворимата протеинова фракция.

Частично пречистените HIS-SUMO-анти-гама мутантни протеини се подлагат на протеолиза с SUMO-протеаза, която протича в условия на диализа. Целта е да се възпрепятства процеса на агрегация при отстраняването на HIS-SUMO „опашката”.

С цел пречистване на целевите протеини от отстранената HIS-SUMO „опашка”, SUMO протеазата и други бактериални онечиствания, се прилага йонообменна хроматография. В резултат се получават стабилни рекомбинантни протеини, съставени от 138 аминокиселини с доказана аминокиселинна последователност и нативен N-край, потвърдени със секвенционен анализ (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO:2).

Разработената процедура по пречистване на анти-гама мутантните протеини се характеризира с ниска себестойност и висока възпроизводимост и е описана подробно в [15].

Обобщените резултати от пречистването са представени на Таблица 4. Получените анти-гама мутантни белтъци са тествани за съдържание на ендотоксини и по този параметър рекомбинантните продукти отговарят изцяло на изискванията на FDA за безопасност и разпространение на лекарства.

Таблица 4. Добив и степен на чистота на пречистените анти-гама мутантни протеини K88Q T27Y и K88Q D41N

Анти-гама мутантен протеин	Добив а, mg/g влажна биомаса	Чистота ь, %
K88Q_T27Y	5	>98
K88Q_D41N	3	>98

³ Протеиновата концентрация е определена по метода на Бредфорд ^а Протеиновата чистота е изчислена денситометрично

BG 67190 Bl

Пример 3. Изпитване на инхибиращото действие на неактивни или с понижена активност антигама мутантни протеини върху биологичното действие на активния hIFN-γ.

Съгласно изобретението, ефектът на пречистените анти-гама мутантни протеини върху биологичното действие на активния hIFN-γ се изследва върху богатата на рецептори амниотична клетъчна линия WISH. За тази цел се провежда конкурентен тест, при който клетките се инкубират в присъствие на различни моларни съотношения на анти-гама мутантни протеини и референтен hIFN-γ (стандарт), след което се провежда кинуренинов тест [16].

BG 67190 Bl

За провеждане на конкурентния тест пречистените анти-гама мутантни протеини се подлагат на серийни разреждания чрез разреждане с MEM Eagle среда. По 50 μΐ пречистен hIFN-γ в постоянна концентрация (използван като стандарт) и 50 μΐ от изследвания пречистен анти-гама мутантен протеин се накапват в различни съотношения в 96-ямкови поливинилхлоридни плаки. Към тях се добавят по 50 μΐ/ямка WISH клетки в среда MEM Eagle (с HEPES, L-глутамин и 2% BFS) и по 50 μΐ/ямка L-триптофан (100pig/ml) и се провежда стандартен кинуренинов тест. Контрола представляват нетретирани с интерферон WISH клетки, както и WISH клетки, третирани само с референтен hIFN-γ в избраната постоянна концентрация.

Конкурентноспособността на анти-гама мутантните протеини спрямо референтния hIFN-γ се оценява по намаляването на биологичната активност на стандарта hIFN-γ и се изчислява като процентно инхибиране. За целта осреднената стойност на отчетената OD490 за дадена проба се съотнася с тази на клетките, третирани само с референтен hIFN-γ (стандарт).

Резултатите представени на Таблица 3 и проведеният статистически анализ показват, че се получават възпроизводими резултати и двата изследвани анти-гама мутантни протеини K88QT27Y и K88Q D41N конкурират природния hIFN-γ при свързването му с неговия рецептор, при това в по-голяма степен в сравнение с точков мутант K88Q. Двата анти-гама мутантни протеина са най-ефективни при съотношения от 0.1:1 до 0.5:1 (анти-гама мутантен протеин спрямо референтен hlFN-γ). Установените съотношения са предимство на разработените анти-гама мутантни протеини, тъй като при тези ниски концентрации рекомбинантните анти-гама препарати няма да натоварват допълнително организма. Установената доза-зависимост позволява да се определи оптималната за конкретния пациент концентрация.

Пример 4: Измерване на афинитета на анти-гама мутантните протеини към гама-интерфероновия рецептор чрез изотермична титрационна калориметрия (iTC)

Измерванията, проведени чрез метода на изотермична титрационна калориметрия, се извършват на апарат MicroCai Auto-iTC200. Преди титруване с рецептора интерфероновите протеини се подлагат на диализа. Афинитетът на свързване на референтния hlFN-γ и анти-гама мутантните протеини с извънклетъчната част на 1FNGR1 рецептора (в еднакъв буфер със състав - 20 тМ HEPES pH 8.0, 0.15 М NaCI буфер) се определят директно и се сравняват съответните термодинамични характеристики за отделните лиганд-рецепторни комплекси. Използваният рекомбинантен рецептор на hlFN-γ е експресиран и пречистен от животински клетки. За целите на експеримента IFNGR1 се намира в разтвор (5-15 μΜ) в калориметричната клетка и се титрува с референтния hlFN-γ или анти-гама мутантните протеини (40-150 μΜ) чрез последователни инжекции с обем от 2 μΕ. Измерванията се провеждат на 20°С, при постоянно разбъркване със скорост 750 об/мин.

Резултатите, получени след обработка със софтуера MicroCai Origin (Таблица 2) показват, че процесът на образуване на всички изследвани лиганд-рецепторни комплекси е екзотермичен. Резултатите, представени на Таблица 2 са указание, че афинитетът на анти-гама мутантните протеини към интерфероновия рецептор (K_d ⁼ 19-28 пМ) е не само запазен, но дори по-голям (до 5 пъти) в сравнение с този на референтния hlFN-γ (K_d = 136 пМ). Тези резултати определят изследваните чрез

BG 67190 Bl изотермична титрационна калориметрия анти-гама мутантни протеини K88QT27Y и K88Q като много ефективни конкуренти на природния hlFN-γ за свързването с неговия рецептор.

Пример 5: Изследване на афинитета на анти-гама мутантните протеини към гама-интерфероновия рецептор чрез повърхностен плазмонен резонанс (SPR).

Като втори метод за охарактеризиране на афинитета на анти-гама мутантните протеини към гамаинтерфероновия рецептор се използва апарат Biacore™ 3000, който измерва повърхностния плазмонен резонанс (SPR). За целта биотинилиран интерферонов рецептор (представляващ извънклетъчната част на IFNGR1 рецептора, предварително експресиран и пречистен от животински клетки) с концентрация 20 μΜ се имобилизира върху повърхността на стрептавидинов CM4-Biacore™ сензорен микрочип. С цел изследване на лиганд-рецепторното свързване, референтният hlFN-γ и изследваните анти-гама мутантни протеини се разреждат в буфер със състав 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 тМ NaCI, 0.005% (v/v) surfactant Р20, до необходимите концентрации и се инжектират върху повърхността на активирания сензорен чип, където се намира имобилизираният рецептор. Тестват се различни концентрации на референтен hlFN-γ и анти-гама мутантни протеини - 0.9, 1.8, 3.6, 7.2 и 15 пМ. Свързването (изразено в RU) се записва като функция от времето. Съгласно резултатите, представени на Таблица 2, афинитетът на точков мутант K88Q към IFNGR1 е съизмерим с този на референтния hlFN-γ, докато стойностите за К_А на K88Q T27Y и K88Q D41N показват по-висок афинитет на анти-гама мутантните протеини към гама-интерфероновия рецептор в сравнение с контролата hlFN-γ и точковия мутант K88Q.

Получените резултати са в съгласие с резултатите от изотермичната титрационна калориметрия и потвърждават качествата на анти-гама мутантните протеини K88Q T27Y и K88Q D41N като много ефективни конкуренти на природния hlFN-γ за свързването му с гама-интерефероновия рецептор.

Claims (4)

1. Патентни претенции

   1. Анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гама-интерферон (hIFN-γ), представляващ неактивен hlFN-γ структурен аналог със запазен афинитет към рецептора на hIFN-γ, в който последните пет аминокиселинни остатъка от С-края на интерфероновата молекула са отстранени и аминокиселината в позиция 88 е заменена с глутамин (Q), характеризиращ се с това, че представлява производно на hIFN-γ, в което аминокиселината в позиция 27 е заменена с тирозин (Y) или аминокиселината в позиция 41 е заменена с аспарагин (N).
2. 2. Анти-гама мутантен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява производно на hIFN-γ, в което аминокиселините в позиции 88 и 27 са заменени съответно с глутамин (Q) и тирозин (Y).
3. 3. Анти-гама мутантен протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява производно на hIFN-γ, в което аминокиселините в позиции 88 и 41 са заменени съответно с глутамин (Q) и аспарагин (N).
4. 4. Анти-гама мутантен протеин съгласно претенции 1-3, приложим за лечение на заболявания, свързани с повишена продукция на ендогенен hIFN-γ.