BG62700B1

BG62700B1 - Молекули на рекомбинантна дезоксирибонуклеинова киселина (днк), кодиращи ензими аминопептидаза,и приложението им за получаването на ваксини против хелминтни инфекции

Info

Publication number: BG62700B1
Application number: BG99246A
Authority: BG
Inventors: Margaret Graham; Trevor Smith; Edward Munn; David Knox; Joanna Oliver; Susan Newton
Original assignee: The Biotechnology And Biological Sciences Researchcouncil
Priority date: 1992-05-08
Filing date: 1994-12-08
Publication date: 2000-05-31
Also published as: SK132394A3; WO1993023542A1; US6534638B1; AU4077593A; JPH07508879A; GB9209993D0; EP0640133A1; AU677582B2; NZ252221A; ZA933216B; CA2134326A1; EP0640133B1; US20080145379A1; PT640133E; RU2140986C1; DK0640133T3; RO117709B1; FI945221A; DE69329195T2; NO944245L

Abstract

Изобретението се отнася до молекули на нуклеиновакиселина, съдържащи нуклеотидни секвенции, кодиращи хелминтни аминопептидазни ензими, и антигенни фрагменти и функционално-еквивалентни варианти, и до тяхното приложение за получаването на ваксини против хелминтни паразити и кодирани от тях синтетични полипептиди.

Description

(54) МОЛЕКУЛИ НА РЕКОМБИНАНТНА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (ДНК), КОДИРАЩИ ЕНЗИМИ АМИНОПЕПТИДАЗА, И ПРИЛОЖЕНИЕТО ИМ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ВАКСИНИ ПРОТИВ ХЕЛМИНТНИ ИНФЕКЦИИ

Област на изобретението

Изобретението се отнася до получаване на защитни антигени чрез рДНК техника, приложими като антихелминтни средства и като защитни имуногени при контрола на заболяванията, причинени от хелминтни паразити.

Предшестващо състояние на техниката

Хелминтните паразити са причинители на широк кръг заболявания и опаразитявания на домашни животни, които водят до големи загуби на продукция от животновъдството и до висока смъртност при животните и имат голямо икономическо значение. Така например, хемотрофният глист Haemonchus инфектира покривния епител на гастроинтести-налния тракт на преживните животни, причинявайки анемия и загуба на тегло и ако последните не бъдат лекувани, често причинява смърт. Животни, заразени с близкородствения нематод Ostertaqia, който не е хемотроф, са със забавен растеж и ако не бъдат лекувани, умират. Друг род хелминти, както и метили, с икономическо значение включва Trichostronqylus и Nematodirus, които причиняват ентерити в различни животни и трематоди.

Много проблеми създават също така и нематоди като анкилостомите (напр. Necator, Ancylostoma, Uncinaria и Bunostomum Spp) и метили (напр. Fasciola, Paramphistomum и Dicrocoelium и техни родствени организми, които освен преживните и домашните животни, заразяват и човека, често с фатални последици.

Профилактиката при хелминтните паразити сега се основава на първо място на използването на антихелминтни лекарства, комбинирано със строг контрол на пасбищата. Тази схема причинява много затруднения честото даване на лекарства и контролът на пасбищата са трудно осъществими в практиката; все повече зачестява лекарствената резистентност на хелминтните колонии.

Затова в тази област има необходимост от ефективна антихелминтна ваксина. Но засега няма търговско достъпни молекулярни или субмолекулярни ваксини за повечето хелминтни видове, в частност за гостроинтестиналните нематоди на преживните животни. като Haemonchus и Ostertaqia.

Най-обещаващи резултати са получени с неизвестни до сега белтъци, изолирани от Haemonchus, които имат потенциални възможности на защитни антигени не само срещу Haemonchus, но и срещу редица други хелминти. Например протеиновият дублет H11OD, наскоро открит върху луменалната повърхност на червата на H.Contortus, е показал, че създава защитен имунитет срещу хемонкозата при овцете.

Белтъкът H11OD от H.Contortus има приблизително молекулно тегло от 110 kd при редуциращи или нередуциращи условия, кгкто е определено чрез SDS-PAGE, и описано в W088/00835 и W090/11086. Терминът H11OD, както е използван тук, се отнася до протеиновия дублет H11OD, определен в W088/00835 и W090/U086. Съответни белтъци са установени напоследък и в други хелминтни видове, напр. Necator Americus.

WO/1 1086 открива редица полипептидни или частично полипептидни секвенции, добити чрез протеолитично разграждане или химично разцепване на протеиновия дублет H11OD, както следва:

(a) метионин, глицин,тирозин, пролин, валии, валин, лизин, валин, глутаминова киселина, глутаминова киселина, фенилаланин;

(b) метионин, глицин, фенилаланин, пролин, валин, левцин, треонин, валин, глутаминова киселина, серин;

(c) метионин, глицин/фенилаланин, аспарагин, фенилаланин, лизин, изолевцин, глутаминова киселина/валин, треонин/ глутаминова киселина, аланин, глицин;

(d) метионин, лизин, пролин/ глутаминова киселина, треонин/валин, лизин, аспарагинова киселина/аланин, треонин/лизин, левцин-изолевцин, треонин;

(e) метионин, левцин, аланин, левцин, аспарагинова киселина, тирозин, хистидин серин-фенилаланин, валин;

(f) метионин, левцин, аланин, глутаминова киселина/тирозин, аспарагинова киселина, глутамин/аланин, глутаминова киселина, аспарагинова киселина, валин;

(g) метионин, глицин, фенилаланин, пролин, левцин, валин, треонин, валин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, тирозин;

(h) метионин, лизин, треонин, пролин, глутаминова киселина, фенилаланин, аланин, валин/левцин, глутамин, аланин, фенилаланин/треонин, аланин, треонин, серин/глицин, фенилаланин, пролин;

(i) ливин, хистидин/тирозин, аспарагин/валин, серин, пролин, аланин, аланин, глутаминова киселина, аспарагин/левцин, левцин, аспарагин/глицин;

(j) лизин-треонин, серин, валин, ланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагин;

(k) лизин, аланин, аланин, глутаминова киселина, валин, аланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагинова киселина-изолевцин-лизин, глицин;

(l) лизин, аланин, валин, глутаминова киселина, валин/пролин, аланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагинова киселина, аспарагинова киселина, изолевцин, треонин, тирозин-глицин, пролин, серин;

(т) лизин-глутаминова киселина, глутаминова киселина, треонин, глутаминова киселина, изолевцин, фенилаланин, аспарагин, метионин;

(п) лизин-пролин, фенилаланин, аспарагин/аспарагин, изолевцин, глутаминова киселина, аланин, левцин;

(о) аспарагинова киселина, глутамин, аланин, фениланин, серин, треонин, аспарагинова киселина, аланин, лизин;

(р) метионин,глицин,тирозин, пролин, валин, валин, лизин, велин, глутаминова киселина, глутаминова киселина, фенилаланин-аланин, треонин, аланин, левцин;

(q) метионин, глицин, фенилаланин, пролин, валин, левцин, треонин, валин, глутаминова киселина, серин-тирозинтреонин;

(г) метионин, глутаминова киселина /фенилаланин, аспарагин, фенилаланин, левцин, изолевцин, глутаминова киселина/ валин, треонин/глутаминова киселина, аланин, глицин-изолевцин, треонин;

(s) метионин, глицин, фенилаланин, левцин, валин, треонин, валин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, тирозинтреонин, серин;

(t) метионин, лизин, треонин, пролин, глутаминова киселина, фенилаланин, аланин, валин/левцин, глутамин, аланин, фенилаланин/треонин, аланин, треонин, серин/ глицин, фенилаланин, пролин;

(и) метионин, лизин, пролин/глутаминова киселина, треонин/валин, левцин, аспарагинова киселина/аланин, треонин/ лизин, левцин-изолевцин, треонин-глицин;

(v) метионин, левцин, аланин, левцин, аспарагинова киселина, тирозин, хистидин, серин-фенилаланин, валин, глицин;

(w) метионин, левцин, аланин, глутаминова киселина/тирозин, аспарагинова киселина, глутамин/аланин, глутаминова киселина, аспарагинова киселина, валин;

(x) лизин, хистидин/тирозин, аспарагин/валин, серин, пролин, аланин, аланин, глутаминова киселина, аспарагин/ левцин, левцин, аспарагин/глицин;

(y) лизин-треонин, серин, валин, аланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагин;

(z) лизин, аланин, аланин, глутаминова киселина, валин, аланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагинова киселина-изолевцин—лизин, глицин;

(аа) лизин, аланин, валин,глутаминова киселина, валин/пролин, аланин, глутаминова киселина, аланин, фенилаланин, аспарагинова киселина, аспарагинова киселина, изолевцин, треонин, тирозин—глицин, пролин, серин;

(bb) лизин—глутаминова киселина, глутамин, треонин, глутаминова киселина, изолевцин, фенилаланин, аспарагин, метионин;

(сс) лизин-пролин, фенилаланин, аспарагин/аспарагинова киселина, изолевцин, глутаминова киселина, аланин, левцин;

(dd) аспарагин, глутамин, аланин, фенилаланин, серин, треонин, аспарагинова киселина, аланин, лизин.

Известна несигурност е показана при формата фенилаланин/глицин, където кодът от първите три букви представя найвероятните коректни аминокиселини, базирани на силата на сигнала или от въпросителен знак; символът означава неизвестен остатък.

Специфичните индивидуални полипептидни секвенции, които са разкрити в WO /09/11086, са отказани като патентна претенция.

Методите за пречистване на H11OD са описани в W088/00835, което е достатъчно за характеризиране на белтъка и може да се осъществи извличане с оглед получаването му в експериментални или промишлено значими количества. Възниква необходимост от подобрения, а също и намирането на подходящ източник, за да се получават не само H11OD, но и антигенни протеини, специално за процес, основаващ се на рекомбинантна ДНК технология и експресия на белтъците в подходящи трансформирани прокариотни и еукариотни организми.

Изобретението предлага и подобрен метод за получаване. Детерминация на секвенция на клонирани ДНК (кДНК) за Hl 1OD от Haemonchus Contortus е осъществена и предсказаните аминокиселинни секвенции са проявили хомоложност по отношение на семейство от интегрални мембранни аминопептидази (системно наименование: а-аминоацилова пептидна хидролаза (микрозомна).

Интегралните мембранни аминопептидази от бозайници са локализирани в много тъкани, например върху микробиларния епител на червата и бъбреците. Тяхната функция в бъбреците е неясна, но в чревния тракт те разцепват малките пептиди, които са крайни разградни продукти на храносмилането (виж Kenny & Maroux, 1982; Kenny & Turner, 1987; Noren et al. 1986; Semenza, 1986).

Същност на изобретението

Изобретението предлага молекули на нуклеинова киселина, включваща една или повече нуклеотидни последователности, които кодират хелминтни аминопептидазни ензими или антигенни участъци, по същество кореспондиращи с всички или на част от нуклеотидните секвенции, както е показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (SEQ ID NOS: 1 до 15) или последователности, кодиращи хелминтни аминопептидазни ензими, които са по същество хомоложни с или които хибридизират с всяка от споменатите секвенции.

Нуклеинова киселина съгласно изобретението може да бъде едноверижна или с двуверижна ДНК, сДНК или РНК.

Вариациите в секвенциите, кодиращи нуклеотида на аминопептидаза, могат да се проявят през различни етапи от жизнения цикъл на хелминта (напр. между ларва и зряла фаза), между сходни колонии от различни географски райони, а също и в един и същ хе.тминт. Различните вариации са включени в обхвата на това изобретение.

“Хомолози по същество”, както се използва в заявката, включват тези секвенции, имащи секвенционна идентичност от приблизително 50% или повече, напр. 60% или повече, и също функционално-еквивалентни алелни варианти и сродни секвенции, модифицирани чрез заместване, присъединяване или делеция с единична или множествена база.

Чрез “функционален еквивалент” е обозначена секвенция на нуклеинова киселина. която кодира полипептиди, имащи аминопептидазни активности, които са със сходна нмунореактивност, т.е. които предизвикват защитни антитела в гостоприемника срещу хелминти.

Молекули на нуклеинови киселини, които хибридизират със секвенциите, показани на фиг. 2, 3 или 5 (съставени от SEQ ID NOS: 1 до 15) или някой хомолог по същество или функционално-еквивалентни секвенции, както са определени по-горе, също са включени в обхвата на изобретението.

“Хибридизация”, както е използвано тук, определя тези секвенции, свързани в състояние на спирализация (6 х SSC/50% формамид при стайна температура) и промити при условия на слабо деспирализиране (2 х SSC, стайна температура, за предпочитане 2 х SCC, 42°С) или състояние на силно деспирализиране, напр. 2 х SSC, 65°С (където SSC=O,15 М NaCl, 0.015 М натриев цитрат, pH 7,2).

Методи за продуциране на такива производно свързани секвенции, напр. чрез сайт-насочена мутагенеза, случайни мутагенеза или ензимно разграждане, и/или лигиране на нуклеинови киселини, са добре известни в науката като методи за детерминиране на така модифицираните нуклеинови киселини, имащи значима хомология спрямо субекта на секвенцията например чрез хибридизация.

Осигуряване на молекула на аминокиселина съгласно изобретението дава възможност да се получат рекомбинантни аминопептидазни ензими или имуногенни фрагменти, в количества досега недостижими, при това позволяващи получаването на антихелминтни ваксини.

В друг аспект изобретението осигурява молекули на нуклеинова киселина, включващи една или повече нуклеотидни секвенции, кодиращи един или повече полипептиди, способни да произведат защитни антитела срещу хелминтни паразити, чийто секвенции инкорпорират един или повече антигенни детерминанти - кодиращи региони от аминопептидазни кодиращи секвенции, както е показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (съставени от SEQ ID NOS: 1 до 15).

Изобретението се отнася също и до синтетични полипептиди, включващи една или повече аминокиселинни секвенции, конституирани на базата на аминопептидазен ензим или антигенен участък, кореспондиращи с всички или с част от нуклеотидните секвенции, както е показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (SEQ ID NOS: 1 до 15), или функционално-еквивалентен вариант вместо друг синтетичен полипептид, кореспондира с белтъчния дублет H11OD, или синтетичен полипептид, кореспондиращ с някои от индивидуалните полипептидни секвенции, посочени в WO/11086.

Алтернативно изобретението предлага и синтетични полипептиди, включващи аминокиселинна секвенция, определяща ензима аминопептидаза или антигенна част, кореспондиращи по същество с всички или с част от нуклеотидните секвенции, както е показано на фиг. 2, 3, 4 или 5 (SEQ ID NOS: 1 до 15), или функционално-еквивалентен вариант вместо това, по същество свободен от други компоненти на Haemonchus Contortus.

Изобретението се отнася също до състав на ваксина, стимулираща имунните отговори срещу хелминтни паразити при хора или при животни, включваща поне един синтетичен полипептид, както е определен по-горе, заедно с фармацевтично подходящ носител.

Терминът “полипептид”, както тук е използван, включва два протеина с пълна дължина и по-къси пептидни секвенции.

“Функционален еквивалент”, както е използван по-горе във връзка с полипептидната аминокиселинна секвенция, дефинира полипептиди,свързани или произлезли от посочените полипептидни секвенции, където аминокиселинната секвенция е била модифицирана чрез единично или множествено аминокиселинно заместване, прибавяне или делеция, и също секвенции, където аминокиселините са били химически модифицирани, включително чрез гликолизация или дегликолизация, но при запазена защитна антигенна (имуногенна) активност. Такива функционално-еквивалентни варианти могат да се явят като природни биологични вариации или да се получат при използване на известни техники, например функционално еквивалентни рекомбинантни полипептиди могат да се получат с добре известните техники на сайт-насочена мутагенеза, случайни мутагенеза или ензимно разграждане, и/или лигатиране на аминокиселини.

Най-общо, синтетичните полипептиди съгласно изобретението представляват защитни антигенни секвенции. Терминът “защитен антиген”, както е използван тук, определя тези способности на антигените да генерират в гостоприемника защитна (имуногенна) имунна реакция, т.е. отговор на гостоприемника, който води до генериране на имунни ефекторни молекули, антитела или клетки, които стерилизират оплодителната способност или увреждат, инхибират или убиват паразита и така предпазват гостоприемника от клинични или субклинични заболявания или загуба на продуктивност. Такъв защитен имунен отговор може обичайно да бъде манифестиран чрез продуциране на антитела, които са способни да подтискат метаболитните функции на паразита, водят до задръжка на растежа, спиране на продукцията на яйца и/или смърт.

Синтетичните полипептиди съгласно този аспект на изобретението могат да се получат чрез експресия в клетки гостоприемници, съдържащи молекула на рекомбинантна ДНк, която включва нуклеотидна последо вателност като описаното по-горе оперативно свързване към експресионна контролна секвенция, или рекомбинантен ДНК клониран носител или вектор, съдържащ такава рекомбинантна ДНК молекула. Алтернативно, полипептидите могат да се експресират чрез директно инжектиране на непокрита молекула на ДНК съгласно изобретението в клетката гостоприемник.

Синтетичният полипептид, така експресиран, може да е синтетичен полипептид, включващ част, възпроизвеждаща имуногенността на всички или на част от аминопептидазен ензим и допълнителен полипептид, кодиран за ДНК от синтетична рекомбинантна молекула. Например, може да се желае получаването на синтетичен протеин, съдържащ синтетична аминопептидаза или друг полипептид, съгласно изобретението куплиран към протеин като β-галактозидаза, фосфатаза, глутатион-Б-трансфераза, уреаза, хепатит В антиген (Framcis et al., 1989) и подобни. Повечето синтетични протеини са формирани чрез експресия на рекомбинантен ген, в който две кодиращи секвенции са били съединени чрез разчитаща структура във фаза. Алтернативно, полипептидази могат да се свържат in vitro чрез химични начини. Всички такива синтетични или хибридни деривати на кодиращи аминопептидаза молекули на нуклеинова киселина и техните респективно аминокиселинни секвенции са включени в изобретението. Такива подходящи рекомбинантни ДНК полипептидни експресионни техники са описани, напр., от Sambrook et al., 1989. Алтернативно, синтетичните полипептидази могат да се получат чрез химични начини, като добре известната твърдофазова синтезна процедура на Merrifield.

Изобретението включва и използването на молекула на нуклеинова киселина или синтетичен пептид, или полипептид, както са дефинирани по-горе, за получаване на ваксинален състав за стимулиране на имунните отговори при хора и при животни, предимно млекопитаещи, срещу инфекции от хелминтни паразити.

Алтернативно, изобретението предлага и метод за стимулиране на имунния отговор при човека или при млекопитаещи животни, срещу хелминтни паразитни инфекции, включващ прилагането на тези животни на ваксинален състав, включващ един или повече полипептиди, кодирани чрез нуклеотидната последователност като посочената по-горе.

Съставът на ваксината може да се приготви съгласно изобретението чрез методи, добре известни при производството на ваксини.Традиционните форми за прилагане на ваксината може да включват един или повече синтетични полипептиди съгласно изобретението заедно, където това е подходящо, с един или повече подобрители, напр.алуминиев хидроокис, сапонин, QuilA, или повече пречистени форми като мурамилов дипептид, минерални масла или Novasomes, в присъствието на един или повече фармацевтично приемливи носители или разтворители. Подходящите носители включват течна среда като физиологичен разтвор, подходящ за приложение като носител за вкарване на пептидите или полипептидите в тялото на пациент. Допълнителни компоненти като консерванти също могат да се включат.

Алтернативна ваксинална форма може да съдържа вирусна клетка гостоприемник, напр. микроорганизъм (Vaccinia vurus, Adenovirus, Salmonella), носещи инсертирана молекула на аминокиселина (ДНК молекула), съгласно изобретението за стимулиране на имунния отговор, насочен срещу полипептидазите, кодирани чрез инсертираната молекула нуклеинова киселина.

Прилагането на ваксиналния състав може да се осъществи чрез всеки от конвенционалните пътища, напр. орален или парентерален под формата на интрамускулна инжекция, оптималното е на интервали, напр. две инжекции на интервал от 7-28 дни.

Както е посочено по-горе, аминокиселинната транслация на нуклеотидната секвенция, изобразена на фиг. 2, 3, 4 и 5, показва секвенционна хомология с род от интегрални мембранни аминопептидазни ензими. Това е детерминирано чрез търсене на необходимите различни бази данни в Computer Group Sequence analis software packade, versiom 7.01, November 1991 (Devereux et al., 1984), прилагайки транслациите на секвенциите, показани на фиг. 2, 3, 4 или 5. Две такива сравнения са показани на фиг. 6.

Експресиране на последователностите, кодиращи аминопептидазата, съгласно изобретението може, както е посочено погоре, да се осъществи чрез прилагане на известни техники и експресионни системи, вкл. експресия в прокарциотични клетки като E.coli и еукариотни клетки като дрожди или бакуловирусни клетъчни системи от насекоми или трансформирани клетки от бозайници в трансгенни животни или растения. Отчасти благоприятстващи, нуклеотидните секвенции могат да се експресират при използване на трансгенна нематодна система, като системата за нематода Caenorhabdiis, описана напр. от Fire, 1986; Fire et al., 1989; Spieth et al., 1988; Han et al., 1990.

В друг аспект изобретението предлага метод за получаване на индентичен полипептид като описания по-горе, който включва култивирани еукариотни или прокариотни клетки, съдържащи молекула на нуклеинова киселина, като дефинираната погоре, при които условия споменатият полипептид е експресиран и се получава възстановеният вече споменат полипептид.

Други аспекти на изобретението включват клониращи и експресионни вектори, съдържащи нуклеотидни секвенции от изобретението. Такива експресионни вектори включват подходящи контролни секвенции като напр. транслационни (напр. начални и стоп кодове) и транскрипционални контролни елементи (напр. промоторни-операторни участъци, рибозомни свързващи участъци, терминационни стоп кодони), свързани в съответните четящи рамки с молекулите на нуклеиновата киселина от изобретението.

Векторите от изобретението могат да включват плазмиди и вируси (вкл. и бактериофаг и еукариотни вируси) според добре известни и документирани технологии в науката, и могат да се експресират в много варианти на различни експресионни системи, също добре известни и документирани. Подходящи вирусни вектори включват, както е посочено по-горе, бакуловирус, аденовирус и вирусите vaccinia. Много други вирусни вектори са описани от науката.

Голям брой технологии са известни и могат да се прилагат за въвеждане на такива вектори в прокариотни или еукариотни клетки за експресия, или в зародишна клетъчна линия, или соматични клетки, за да формират трансгенни животни. Подходящи трансформации или трансфекционни технологии са подробно описани в научната литература.

Трансформирани или трансфектирани еукариотични или прокариотични клетки гостоприемници, или трансгенни организми, съдържащи молекула на нуклеинова киселина съгласно изобретението, както е описано погоре, формират друг аспект на изобретението.

Еукариотичните експресионни системи Haff-общо, и нематодна експресионна система в частност, имат предимството, че посттранслационният метод и особено гликозилацията могат да се извършат в случая от трансгенната нематодна система, а гликозилация, кореспондираща с тази, намерена в природния белтък, може да се очаква. Това представлява важен аспект на изобретението, тъй като в много случаи посттранслационният метод се изисква, за да може рекомбинантният протеин да експресира оптимално биологична активност.

Експресионни системи на клетка от бозайници също имат редица предимства. Клетката гостоприемник от бозайник предлага добра репродуктивна способност на естествените форми и защитни епитопи на антигени, тъй като еукариотната експресивна система ще даде увеличаване на повече подобни гликозилационни форми, дисулфидни мостове и други посттранслационни модификации, като E.coli могат да продуцират изолиран белтък, изискващ деспирализация на веригата и имащ лоши репродуктивни възможности при природната форма. В допълнение гликозилацията при бозайници е неподходяща да индуцира имунен отговор, който се отклонява от защитния антипротеинов отговор. За предпазване на хора и домашни животни за предпочитане се използват човешки или животински фиброб.тастни или миеломни клетъчни линии, такива като HeLa-човешка клетъчна линия, ДНК-клетки от бъбрек на бебе-хамстер; VERO, клетъчна линия от бъбрек на маймуна; FR3T3 фибробласти от плъх, NIH3T3, фибробластна клетъчна линия от мишка; С1271, клетъчна линия от туморни клетки от гръдта на мишка; CV-1, фибробласти от бъбрек на африканска зелена маймуна; ЗТ6, фибробласти от миши ембрион; L клетки, миша клетъчна линия; СНО, клетъчна линия от яйчник на китайски хамстер; NSO NSI, SP2 и други клетъчни линии от миша миелома и клетъчни линии от плъша миелома, като YB2/0 и Y3. 5

Вектори, подходящи за различни класове клетъчни линии от бозайници, са добре известни в науката. Най-общо, те включват промотор и/или стимулатор, свързан с нуклеотидна секвенция, кодираща антиген или 10 фрагмент. Подходящи промотори включват SV40 ранен или късен промотор, напр. вектор Р S V L, промотор на цитомегаловирус (CMV), промотор на миши металотион I и миши туморен вирус от яйчник. Векторът за предпо- 15 читане включва подходящ маркер, като ген за дихидрофолат редуктаза или глутаминова синтетаза. Вектори от този тип са описани в W086/05807, WO87/04462, W089/01036 и W089/10404. 20

Транслокация на клетките гостоприемници може да се повлияе при използване на стандартни технологии, например чрез прилагане на калциев фосфат, DEAE декстрин, полибрен, синтетичен протопласт, липозоми, 25 директно микроинжектиране, генен канон или електропорация. В по-късните техники се предпочитат и методи за трансфекция на клетъчни линии на млекопитаеши с използване на електропорация, описани от 30 Andreason et al., 1980. Най-общо линейна ДНК е представена по-четливо от циркулярната.

В случая при протеина Н1100 е установено, че има уникален и необичаен г.тикозилационен модел, който се счита за допри- 35 насящ за имуноактивността, тъй като много моноклонални антитела, досега добити за H110D от Haemonchus, рекогнисцират въглехидратните епитопи, което може да е важно при по-нататъшното усъвършенстване на ваксината.

Подробно е показан моделът на гликоз;стация на H110D от Haemonchus:

i) около 65% от олигозахаридите с Nсвързани, останалите са О-свързани;

ii) преобладаващата част (напр. около 45%) от N-свързаните олигозахариди е от комплексния клас;

iii) по същество всички (напр. повече от 95%) от олигозахаридите са ненатоварени;

iv) относителното моларно съдържание на основните монозахариди е N-ацетилгалактозоамин 1,0, фукоза 3,6, галактоза 4,1, г.тюкоза 4,4, маноза 6,2 и N-ацетилглюкозоамин 5,2;

v) олигозахаридите (олигозахариди D) са по същество резистентни на дехидратация от широк кръг екзо-гликозидази (напр. a-Dманозидаза, β -D-манозидаза, β-О-галактозидаза, a-D-галактозидаза, β-0-ксилозидаза, β-Ο-Ν-ацетилглюкозоамилаза).

Такива олигозахариди и съдържащи ги г.тюкопротеини формират друг аспект на изобретението.

Олигозахаридът D от Haemonchus H11OD глюкопротеин е от N-свързан тип и има неизвестна досега структура, състояща се от два фукозни остатъка, прикрепени с а-1,3 връзка и а-1,2 връзка към маноза (Nацетилглюкозоамин).

Друг аспект на изобретението предлага олигозахарид със структура

Ман a 1 \

>

Ман 0-1,4

I

Глк NAc(31,4

Глк

NAc —I

Ман (Факс<1) и особено със структурата

Ман β 1----> 4 ΓΛκΝΑεβΙ —4 Глк NAc /⁶

Ман α 1 al

Щук специално, където свързан към протеин, напр. рекомбинантен протеин като хелминтен аминопептидазен пептид или антигенен фрагмент, или когато генерира антиидиотипни антигени за имунизирането специално на млади животни.

Животински глюкопротеини най-общо имат фукоза а -1,6 свързване и фукоза а1,3 свързване на олигозахариди от представяното изобретение е необикновена особеност.

Изобретението е описано по-нататък подробно, по-специално по отношение на протеин H11OD от Haemonchus Contortus. С помощта на известни техники, като хистохимия и ДНК хибридизация, еквивалентите на H11OD са наблюдавани и в други паразитни видове. Приема се, че протеинът H11OD е мултигенен комплекс и че нуклеотидната последователност, която го кодира представлява вариации на последовател ностите в различните щамове през различни 35 стадии от жизнения цикъл на хелминта. Нещо повече, може да съществуват множество ензимни форми (изоензими), които да бъдат диференциално експресирани на различни етапи, или в различни щамове. В това 40 изследване ДНК последователности и така предсказани аминокиселинни последователности са детерминирани от сДНК клонове и 15 PCR продукти, получени от тРНК, съответстваща на H11OD ген посредством рекомбинантна ДНК технология от различни източници и на различни стадии от жизнения цикъл на Haemonchus Contortus.

Съгласуването на сДНК и PCR продукти дават възможност за идентифициране на три близко родствени H11OD последователности, които са означени Н11-1, (SEQ ID NO: 19), Hl 1-2 (SEQ ID NO: 20) и Hl 1-3 (SEQ ID

NO: 21). Hl 1-1 включва три съседни и препокриващи се последователности, сДНК клон AustBl (SEQ ID N0: 6), PCR продукт A648 (SEQ ID N0:9 и в 3'kpaa-PCR продукт 014-178 (SEQ ID NO: 12); Hl 1-2 включва PCR продуктите A-650 и 2,5 kb (SEQ ID NOS: 10 и 7. респективно); Hll-3 включва PCR продуктите 3,5 kb и A-649 (SEQ ID NOS: 8 и 11 респективно). Специфичните връзки между индивидуалните съгласувани с ДНК и PCR продукти клонове и Н11-1, -2, -3 са обобщени на фиг. 1 и са показани в детайли на фиг. 3, 4 и 5.

Различията и вариациите в секвенциите, получени от сДНК клонове и PCR продукти, са наблюдавани, както е показано на фиг. 2-5. (съставено от SEQ ID NOS: 1 до 15 и 19 до 21) и както е обобщено в табл. 1.

Таблица 1.

Хомолози от извлечените аминокиселинни секвенции, получени чрез транслация на нуклеотидните секвенции, показани на фиг. 2

Н11-1:Н11-2

Н11-1:Н11-3

Η11-2.Ή11-3

Сходство, %

Идентичност, %

Разликите могат да се отдадат на различни тРНК (от мултигенно семейство). В допълнение, те се дължат, поне частично, на различните варианти на кодиращата секвенция на H11OD или на тРНК, представена на 5 различни стадии от жизнения цикъл, или на различията в щамовете.

Таблица 2 допълнително показва нивата на идентичност и сходство между кореспондиращите предсказани аминокиселинни последователности и две публикувани аминокиселинни последователности от бозайници.

Таблица 2.

Хомолози на аминокиселинните последователности на H11OD с плъша аминопептидаза В (АрМ) и миша аминопептидаза А (АрА)

Идентичност, %

Сходство, %

Н11-1:АрМ	55	32
Н11-1:АрА	55	31
Н11-2:АрМ	52	31
Н11-2:АрА	54	31
Н11-3:АрМ	53	32
Н11-3: АрА	52	30

Фигура 1 представлява карта на съгла- 25 суваните H.Contortus H11OD сДНК и PCR продукти и техните връзки и позиции по продължение на H11OD тРНК;

Фигура 2 - Hl 1OD нуклеотидните последователности, обозначени като Hll-3, (SEQ 30 ID N0:21, производна на клонирани PCR продукти SEQ ID NOS:8 и 11 и сДНК клон MIAUS, SEQ ID N0:5), Н11-2 (SEQ ID:20, производна от клонирани PCR продукти SEQ ID NOS: 7 и 10 и Н11-1 (SEQ ID N0:19, 35 производна от клонирани PCR продукти SEQ ID NOS: 9 и 12 и сДНК клон AustLl, SEQ ID NO: 6);

Фигура 3 - секвенцията Hll-3 (SEQ ID NO: 21) (показана на фиг. 2) c подреждане 40 от сДНК клонове Ml и MIAUS (SEQ ID NOS: 1 и 5);

Фигура 4 - секвенцията Н11-2 (SEQ ID N0: 20) (показана на фиг. 2) и подреждане от сДНК клон В2 (SEQ ID NOS: 4); 45

Фигура 5 - секвенцията Н11-1 (SEQ ID NO: 19) (показана на фиг. 2) и подреждане от сДНК клон В1А и Aust Bl (SEQ ID NOS: 2 и 6 респективно);

Фигура 6-а) предсказваните амино- 50 киселинни секвенции (SEQ ID NOS: 22, 23 и 24), произлезли от ДНК секвенции Н11-1,

Н11-2 и Н11-3, показани на фиг. 2; bi и bii показват предсказаната аминокиселинна секвенция на Н11-3, сравнена с публикуваните аминокиселинни секвенции на плъша микрозомална аминопептидаза М (Watt et al., 1989) и миша микрозомална аминопептидаза A (Wu et al., 1990) респективно; тъждествените са заградени в правоъгълници, защрихованите пространства показват максималното ниво на хомология между сравняваните секвенции. Използван е конденционалният еднобуквен код за аминокиселини. Хоризонталната линия над секвенцията показва позицията на трансмембранния участък и звездичките (*) показват позицията на свързания с цинк мотив. Нивата на сходност са показани в таблици 1 и 2;

Фигура 7 - подреждането на аминокиселинни секвенции (обозначени като Rep A, Rep В, Rep С, Rep D и Rep D), добити от CNBr и Lys-C фрагменти на H11OD, както вече е описано (International patent application WO/11086 и както по-рано е регистрирано, полипептидни секвенции (а), (Ь), (е), (к) и (аа), респективно) и три нови секвенции (SEQ ID NOS: 16, 17 и 18), добити от H11OD, следващо разграждане чрез еластаза или термолизин с транслокации от a) Н11-1, Ь)

Н11-2 и Hll-3.

В друг вариант изобретението предлага молекули на аминокиселини, включващи една или повече нуклеотидни последователности, които по същество кореспондират или които са по същество комплементарни с една или повече последователности, подбрани между секвенциите на клоновете Ml, BIA, В1А-3', В2, M1AUS, AustBl, 014-015 (2.5PCR), 014872 (3.5PCR клон 2), A-648 (5' край на Bl), А-650 (5' край на 2.5PCR), А-649 (5’ край на 3.5PCR), 014-178 (3' край на AustBl клонове 3 & 6), 014-872 (3.5PCR клон 10) и 014-872 (3.5PCR кюп 19), Н11-1, Н11-2иН11-3, SEQ ID NOS: 1 до 15 и от 19 до 21 респективно, както е показано на фиг. 2-5, или секвенции, които по същество са хомоложни или които хибридизират с всяка от споменатите секвенции.

Както е споменато по-горе, сравнение на секвенциите от различните клонове, споменати вече, с компютърните бази данни от известни секвенции, разкрива съществена хомология със семейство микрозомални аминопептидазни ензими (ЕС. 3.4.11.-). Изследвания за ензимологична и инхибиторна активност, извършени с протеина H11OD и субфракциите, потвърждават, че протеинът всъщност е микрозомална аминопептидаза ( α-аминоацил пептидна хидролаза (микрозомна). Такива изследвания показват по-късно, че се проявяват активностите и на А-подобната аминопептидаза, и на М-подобната аминопептидазата и че всеки от компонентите на дублета H11OD показва ензимна активност.

Изследвания с протеолитично разграждане на H11OD също са проведени. С ензимна еластаза е установено, че H11OD може да бъде частично разцепен, формирайки две фракции, детергент-разтворима фракция (която остава с мембраната) и водноразтворима фракция (която е конструирана H11S). Hl 1S се среща под формата на протеин димер, който може да се редуцира до два компонента. По интересен начин е открито, че само аминопептидазна М-подобна активност е свързана с водноразтворимата фракция Hl1S, докато аминопептидазна А-подобна активност е свързана само с детергент-разтворимата фракция.

Следващият пример дава описание на изследванията, довели до детерминирането на секвенциите, показани на фиг. 1-7 със справка към следващите допълнителни фигури. в които:

Фигура 8 показва оцветявания по Western на интегрални мембранни протеини, представени в детергентен екстракт на Haemonchus Contortus (зряла форма), сондирани с афинитетни пречистени антитела, елуирани от потенциални H11OD клонове; а) антигени в детергентен екстракт на Haemonchus, рекогнисциран чрез антисерум за екстракта; '□) антитела, елуирани от слой, както е показано в а) повторно тестване срещу блот на детергентния екстракт, потвърждаващо успеха на етапа на елуация; с) антитела както в Ь), които свързани към клонирания Ml експресиран протеин, отбелязват участъка при 110 kd (и относително отчетлива ивица от около 250 kd; d) липсват свързани антитела, когато е използван нерекомбинант, за да абсорбира серума;

Фигура 9 - оцветяване по Northern на пречистена тРНК от 11, 15 и 23 ден от жизнения цикъл на Haemonchus Contortus, сондиран с а) сДНК клон Ml (SEQ ID NO: 1): b) сДНК клон Ml AUS (SEQ ID NO: 5) c) сДНК клон BIA (SEQ ID NOS: 2 и 3); d) сДНК клон AustBl (SEQ ID NO: 6); e) клониран PCR продукт 014-015 (SEQ ID NO: 7). Цифрите 11, 15 и 23 показват възрастта на Haemonchus Contortus, от който е добита тРНК;

Фигура 10 - оцветяване по Southern на Haemonchus Contortus геномна ДНК, сондирана с сДНК клонове M1AUS (SEQ ID NO: 5), BIA (SEQ ID NOS: 2 и 3) и AustBl (SEQ ID NO: 6) и PCR продукти 014-872 (3.52. SEQ ID NO: 8) и 014-015 (SEQ ID NO: 7); блотовете се промиват при умерено строги условия; за всяка сонда, писта 1 съдържа Hind²²², разграден от ДНК като маркер или с оставена празна; писта 2 и 3 съдържат EcoRI и Hindlll, разградени респективно от геномна ДНК на Haemonchus;

Фигура 11 - оцветявания по Western на рекомбината GST-M1 и GST-B1A протеина смес, сондирана с пречистени антитела за електрофоретично пречистен H11OD H11ODE;

Фигура 12 - оцветявания по Western на ConA Hl 1OD антиген, сондирани с антисерум за ConA и за рекомбинантна GST-M1 GSTМ1 протеинна смес;

Фигура 13-а) резултатите от анализа на H11OD протеин и активности на аминопептидазен ензим във фракции, добити чрез йонообменна хроматография от ConA H11OD на ΜοηοΩ колона; b) SDS-PAGE на фракциите, показани на фиг. 13а);

Фигура 14 - а) стойностите на pH, при които са добити фракциите във фокусиращ експеримент при свободен поток на изолектричество; b) SDS-PAGE при редуцираните условия на фракциите от 14а), в които найниската ивица на дублета H11OD е намерена във фракция 6 и най-висока във фракция 16, при вариращи количества на всяка от намесените фракции; с) Western оцветявания на фракциите, показани на фиг. 14Ь), сондирани с i) моноклонални антитела TS 3/ 19.7, и И)афинитетно пречистени поликлонални анти-М1 антитела; контролните антитела не дават реакция;

Фигура 15-а) стойностите на pH. при които са добити фракциите в друг фокусиращ експеримент със свободен поток на изолектричество; b) SDS-PAGE при редуцираните условия на фракциите от 15а), използвани в ензимен анализ, при които най-ниската ивица на дублета Η11OD е намерена във фракции 4 6 и най-висока във фракции 16 - 18, при вариращи количества на всяка от намесените фракции; с) микрозомални аминопептидазни специфични активности на фракциите, показани в 15Ь);

Фигура 16 - предпазването на овца чрез ваксиниране с разделени най-висока (U), най-ниска (L), рекомбинирана (U + L) и междинна (D) ивици от H11OD; а) отложени паразитни яйца, изразено като яйца на грам фекалии, Ь) хелминти post mortem в сравнение с контроли;

Фигура 17 - предпазването на овца чрез ваксиниране с водноразтворим фрагмент (H11S), добит от H11OD чрез разграждане с еластаза и Н11А, остатъчен, детергент - разтворим H11OD; а) отложени паразитни яйца, изразено като яйца на грам фекалии, Ь) хелминти post mortem в сравнение с контроли (С);

Фигура 18 - примери за близостта между инхибиране от Ai), Bi) аминопептидаза Мподобна и Ай), Вй) аминопептидаза А-подобна активности от H11OD с нива на защита, измерени чрез Ai, ii) % на редукция на хелминти post mortem и Bi, ii) % на редукция на брой на фекални яйца; □ анти H11OD, контролен конски феритин;

Фигура 19 - хистохимичната локализация на аминопептидазни ензимни активности в зряла форма на Haemonchus Contortus графиите със светлинен микроскоп от криосекции на зрял мъжки Haemonchus Contortus показват аминопептидазна активност (червения реакционен продукт се явява като тъмна ивица, посочена в чернобелите фотоснимки), асоциирани само с микровласинките (mv) на червата (i). Никоя от другите тъкани (напр. епидермис (с), хиподерма (h), генитален тракт (gt), мускулна стена (wm) не показват активност. На а) субстратът е L-левцин 4метокси-З-нафтиламид, на Ь) субстратът е L-глутаминова киселина а-(4-метокси-р* нафтиламид);

Фигура 20 - карта на 3.5 PCR продукт (клон 2) (SEQ ID NO: 8), субклониран в baculovirus експресионен вектор pBlueBacII;

Фигура 21 - оцветяване по Western от екстракти от инфектирано с baculovirus насекомо Spodoptera fruqiperda (Sf) 9 клетки са сондирани с антиН 11ODN антитела. Два клона заразени, РЗА и Р4А експресират цялата дължина на имунопозитивен H11OD (посочен), контролите - не.

Методи

Съставяне на U.K. библиотека за XGTll Изолиране на информационна рибонуклеинова киселина (тРНК)

Зряла форма на Haemonchus Contortus (0,5 mg) с произход от U.K., едномоментно замразен в течен азот, се раздробява в течен азот с чукало и хаванче. РНК се екстрахира от смляната смес с 10 обема 4М гуанидинов хидрохлорид в 25 mM натриев цитрат, съдържащ 0,5 % тегл. обеми (w/v) саркозил и 0,7 % w/v 2-меркаптоетанол, последвано от екстракция с фенол и хлороформ, прилагайки методът на Chomczynski & Sacci (1987). От нея се изготвя информационна РНК (тРНК) чрез афинитетна хроматография върху олиго dT целулоза (двукратна), както е описано от Maniatis et al., (1982), и качеството е оценено чрез in vitro транслация, с помощта на заешки ретикулоцитен лизат в качеството на кит и 358-метионин на Amersham International pic, в съответствие с инструкцията на фирмата производетил). Открити са полипептидази до 120 kd.

Приготвяне на комплементарна ДНК

Първата верига комплементарна ДНК (кДНК) се синтезира от lpg тРНК, използвайки случайно иницииране и птича обратна транскриптаза, втората верига се синтезира с помощта на заместителна реакция с RNase Н и E.coli ДНК полимераза ², последвано от възстановяване от 3“, прилагайки Т4 полимераза, в съответствие с метода на Gubler & Hoffman (1983). Добивът на двойноверижната (ds) сДНК е приблизително 400 ng от lpg тРНК. Двойноверижната (ds) сДНК се изпитва чрез електрофореза в 1 % агарозен гел, последвано от авторадиография. Двойноверижната (ds) сДНК е с размер от 0,2 до 9,4 kb, най-много от 0,5 - 2,3 kb.

Клониране на сДНК в Xgtll

Неоразмерена подбрана сДНК се използва, за да се състави библиотека в Xgtll, като се използва Amersham cDNK клонираща система (кит No RPN 1280, Amersham Intemat. Pic) и in vitro packing exstracts (кит No N334, Amersham International pic), както е описано в съответните инструкции и EcoRI linker олигонуклеотиди (5~GGAATTCC). Получената библиотека се посява на култура от щам Y1090 на E.coli в присъствие на изопропилтио-Р-О-галактозид (IPTG) и 5-бром, 4хлор, 3-индолил P-D-галактозид (Х-гал), при които условия рекомбинанта Xgtl се явява като светли (“бели”) петна и див тип нерекомбинанта Xgtl като сини петна. Библиотеката съдържа 90 % бели петна и клониращата ефективност се изчислява на 4 х 10* 7 плаки, формиращи единици (pfu/pg ) сДНК и библиотечен титър от 2 х 10*6 pfu/ml. Анализът на ДНК от 20 рекомбинантни, подбрани случайно, разкрива среден размер на инсерция от 0,51 kb. Обаче това средно число е деформирано от един клон с инсерция от 3,5 kb. Преобладаващите инсерции са > 300 и двойки <Ьр). Тази неамплифицирана Xgtl библиотека произлиза от U.K. хелминт на тРНК, след това се подлага на имуноскриниране.

Приготвяне на сонди за антитела

Антисерум за интегрални мембранни протеини

Червата се отпрепарират от зряла форма на Haemonchus Contortus (от U.K.) и се хомогенизират в леденостуден фосфатно буферен солеви разтвор (PBS), pH 7,4, съдържащ 1 шМ етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) и 1 тМ фенилметилсулфонилов флуорид (PMSF). Хомогенатът е центрофугиран за 10 min с микрофугисна епруветка и утайката се ресуспендира в същия буфер, съдържащ 0,1 % w/v Tween 20 (Tween 20 е запазена марка). След рецентрофугиране утайката се ресуспендира в същия буфер, съдържащ 2 % w/v Triton Х-100 и се екстрахира за 2 h при 40С . Този екстракт се центрофугира както по-горе за получаване на супернатанта, съдържаща интегрални мембранни протеини (IMP).

Посредством интрамускулни инжекции от 50, 50, 120 и 130 pg от IMP, прилагани на седмици 0, 7, 11 и 15, с IMP в Freund’s Complete Adjuvant (FCA) се провежда хиперимунизация на овце. Шест седмици след последната инжекция серумът се събира и моделира серумът ЕЕ-068.

Приготвяне на интегрални мембранни протеини чрез детергентна екстракция от Haemonchus Contortus

Екстрактът се приготвя чрез хомогенизиране на хелминтите в 5 до 10 обема на PBS, съдържащи 1 mM EDTA и 1 тМ PMSF. Суспензията се центрофигура при 10 000 х g за 20 min при 40С и утайката се промива в същия буфер, съдържащ 0,1 % w/v Tween 20 и след това се екстрахира с 5 обема 2 % w/v Triton Х-100, както е описано по-горе. Супернатантата се рецентрофугира при 100 000 х g за 1 h и получената супернатанта, която е обогатена в H11OD, съдържащ друг IMP, се използва в експерименти с Western blot и за приготвяне на неденатуриран H11OD (виж по-горе).

Получаване на H11OD и афинитетно пречистен анти-HHODN

Екстрактът, пречистен за H11OD, се подлага на афинитетна хроматография на СопА-агароза, последвана от йонообменна хроматография на Mono Q (както е описано в W088/00835 и W0090/11086). Пречистеният H11D се инжектира интрамускулно в FCA на агнета. Три дози от 100 pg се поставят на интервали от три седмици. Серумът е събран от агнетата 4 седмици след последната инжекция, афинитетно пречистен чрез абсорбционна колона, съдържаща пречистен H11OD, който е куплиран с активирана с цианобромид Sepharose (Pharmacia). Куплиране на Hl 1OD, свързване на антисерум и елуиране на антиН11OD антитела се провеждат съгласно приложените от Pharmacia инструкции. Тези афинитетно пречистени антитела са моделирани антиНПООЬТ “N” различава тези антитела от тези произведени за денатурация, електрофоретично пречистени H11OD, които са моделирани антиНПООЕ.

Оцветяване по Western (Western blot)

Western blot се провежда със стандартни процедури (Johnstone et al., 1982).

Изолиране на охарактеризиране на клоновете

Имуноскрининг на U.K. библиотека от lgtll

Методът, използван за имуноскрининг на библиотеката, се провежда по начина, описан от Bowtell et al., (1986). Преди да се използва, серумът (ЕЕ-068) се извлича от анти-E.coli антитела чрез адсорбция с лизати и цели клетки от E.coli Y1090. Библиотеката се посява на клетки от E.coli Y1090 при плътност от 10*3 pfu за петри с диаметър 90 mm. Петритата са наслоени с нитроцелулозни филтри, импрегнирани с IPTG и инкубирани за една нощ. Филтрите се измиват с TBST (50 mM Tris, pH 7,4, 150 тМ NaCl, 0,05 % w/v Tween 20) и след това се блокират с 5 % w/v конски серум в TBST за 2 h. Прибавя се серум ЕЕ-068, разреден 1 към 200 в TBST, съдържащ 5 % конски серум, и филтрите се инкубират за 4 h при леко разклащане. Филтрите се промиват отново в TBST, след това се инкубират с пероксидаза от хрян (HRP) - конюгиран конски антиовчи IgG, разтворен 1 към

500 в TBST, съдържащ 5 % w/v конски серум, за 2 h. (Антисерум за овчи IgG, пречистен чрез афинитетна хроматография на овча IgG Sepharose колона и антителата, конюгирани към HRP по метода на Nakane & Kawaoi, 1974). Филтрите по-нататък се промиват в TBST и позитивни плаки са открити чрез 0,6 mg/ml 3,3-диаминобензидин (DDB) и 0,1 % w/v водороден пероксид. Двадесет и пет предполагаеми положителни култури са събрани и са рескринирани с афинитетно пречистен aHraHllODN, както е описано по-горе. Следвайки това вторично скриниране, 5 рекомбинанти са все още позитивни, с клон, моделиран като Ml, даващ най-силен сигнал.

Афинитетно пречистване от антитела на рекомбинантен фаг

Конфлуентни култури се приготвят на E.coli Y1090 култури при 10*3 pfu за всеки от антитяло-позитивните λ клонове или нерекомбинантен λ gtl 1 негативен контролен фаг. Културите са инкубирани за 4 h при 42°С, след това наслоени с филтри, импрегнирани с IPTG и отново инкубирани за една нощ при 37°С. Филтрите са отстранени от петритата и промити в TBST, преди да се блокират с 5 % w/v конски серум за 1 h. Филтрите след това се инкубират с 1 към 100 разреден антисерум ЕЕ-068 за 6 h, преди добре да се изплакнат с TBST. Свързаните антитела са елуирани от филтрите чрез две апликации от по 2 ml елуиционен буфер (5 тМ глицин, 500 тМ NaCl, 0,2 % Tween 20, pH 2,3) за 2 - 3 min всеки, неутрализирани чрез прибавяне на 200 μΐ от 1 М tris-HCl, pH 7,4, разтворен 1 към 200 и използвани, за да имуноскринира Western blot от H11ODобогатен екстракт.

ДНК секвениране от Ml клон λ ДНК е изолирана от Ml клон съгласно с методите, описани от Maniatis et al., (1982). Fragmentyt 2,38 kb KpnI-SstI, съдържащ 300 bp Ml фрагмент, е изолиран чрез гел-електрофореза, пречистен с помощта на GECLEAN кит (Stratagene) (GENECLEAN е регистрирана търговска марка на BI0101) и субклониран в pBluescriptll SK* (STRATA

GENE). Фрагментът EcoRI е пречистен със същите методи и е ресубклониран в същия вектор.

Нуклеотидната секвенция на Ml инсерцията е детерминирана с Т7 секвенционен кит (Pharmacia, U.K.), използвайки и двата М13 преден и обратен инициатори.

Приготвяне на австралийски библиотеки от ZGTll и λΖΑΡ кДНК

Изолиране на тРНК mg зряла форма на Haemonchus Contortus (Australian McMaster чувствителен щат), едномоментно замразен в течен азот, са смлени в течен азот и РНК екстрахирана чрез горещ фенол с метода на Cordinglev et al., 1983). Добивът от цялата РНК е 10,35 mg. 1,3 mg от тази РНК са използвани, за да се приготви тРНК чрез афинитетна хроматография на олиго dT целулоза (2 секвенциални пречиствания), прилагайки методът, описан от Maniatis et al., (1982). Добивът от mPHK е 21,5 μg. Качеството на тРНК е оценено чрез in vitro транслация в заешки ретикулоцитен лизат в присъствието на 358-метионин (Amersham) съгласно фирмените инструкции. Добитите транслационни продукти имат ясно обособени връзки, вкл. връзки >200 kd в размер, както е демонстрирано чрез електрофореза на SDS-полиакриламиден гел, последвана от флуорография.

Синтеза на кДНК и приготвяне на библиотека pg mPHK е използвана, за да се направи кДНК чрез иницииране с олиго dT или произволни инициатори, използвайки кДНК синтезен кит от Amersham International pic, следвайки фирмените инструкции. Добивът е 115 ng двойноверижна (ds) кДНК. Качеството на кДНК е проверено чрез електрофореза на ³²Р-маркирана ДНК на алкалинов агарозен гел, както е описано от Amersham cDNK kit инструкциите. Размерът на кДНК (чрез сравняване с λ-HindIII маркери, New England Biolabs) е от 150 bp до > 10 kb, с най-голяма продуктивност в обхвата 0,6 - 5 kb. Олиго dT-инициирана и произволно инициирана ds кДНК са обединени във фонд и лигирани към излишък EcoRI 8-мер линкер (5’ GGAATTCC3' New England Biolabs, Catalogue No 1018), който е обозначен с gamma³²Р-АТФ и Т4 полинуклеотидна киназа. Свързаната кДНК е разградена с EcoRI и излишните линкери са отстранени чрез Sepharose 4В (Pharmacia) хроматографски съгласно методите, описани от Maniatis et al., (1982). Фракциите от колоните са събрани в две партиди, една, съдържаща кДНК, по-голяма от 2 kb, и друга кДНК, по-малка от 2 kb. Всеки фонд след това е лигиран поотделно с 1 pg EcoRI cut, фосфатизирани λ ZapII клони (Stratagene) и пакетирани разделно с Gigapack Gold (Stratagene, запазена марка). Найголемият размер добита кДНК е 1,3 х 10 *5 рекомбинанта и най-малката кДНК —1,4 х 10 5 рекомбинанта. Събрани са във фонд, за да стане библиотека от 2,7 х 10*5. Библиотеката от λ Zap е усилена чрез посяването на XLl-Blue клетки (Stratagene) при 2 х 1*4 pfu на 135 mm петри. Титърът на усилената библиотека е 7 х 10*7 pfu/ml.

По-нататък 2 pg mPHK е използвана, за да направи кДНК по начина, описан погоре, но използвайки само олиго dT като инициатор. Добивът от ds кДНК е 740 ng. Тази кДНК е третирана с EcoRI метилаза, както е описано в Maniatis et al., (1982), преди да се добавят EcoRI линкери, и в този случай 12-мер линкери (5' CCGGAATTCCGG3' New England Biolabs, Catalogue No 1019) са използвани. Следва разграждане на свързаната кДНК с EcoRI, всички фракции от Sepharose 4В колона, съдържащата се кДНК е събрана във фонд и лигирана с 2 pg EcoRI cut, фосфатизирани λ gtll клони (Stratagene). Лигационната смес е разделена на две и пакетирана с две партиди Gigapack Gold (Stratagene); те са събрани във фонд, за да даде Xgtll библиотека от 7 х 10*6 pfu. Библиотеката е усилена чрез посяване на ST9 клетки при 5 х 10* 5 на 135 mm петри. Титърът на усилената Xgtll библиотека е 4,5 х 10* 11 pfu/ml.

Скрийнинг на Австралийска Xgtll библиотека с антисеруми до H11OD

Антисеруми са произведени чрез инжектиране на овца с Hl 1OD протеин (U.K. произход), който е бил електроелуиран от полиак риламид след електрофореза в SDS съгласно следния метод: ConA H11OD, получен и описан в WO 88/00835 и WO 90/11086, е електрофорезиран на SDS полиакриламиден гел (Laemli 1970), за да се получи електроелуиран 5 H11OD. След електрофореза областта на полиакриламидния гел, съдържаща H11OD, е отрязана, поставена в електроелутор (Atto) и елуирана в продължение на 3 h при 10 Wat. Електроелуираният H11OD (моделиран 10 H11ODE) е концентриран на Centriprep 10 (Amicon) и сменен буфера на PD10 колона (Pharmacia) в 50 mM амониев бикарбонат/ 0,07 % SDS, смесен с адюванти и след това инжектиран на овца. Имуноглобулините от 15 серума са преципитирани с амониев сулфат (Johnstone and Thorpe, 1982). Преципитираните антитела са ресуспендирани на 60 mg/ml във фосфатен буферен физиологичен разтвор, диализиран срещу фосфатен буферен физио- 20 логичен разтвор и разреден 1:10 в Tris буферен физиологичен разтвор (TBS), съдържащ 5 % w/v мляко на прах с ниско съдържание на мазнини. 10 mg от ConA H11OD е направен до 0,5 % SDS, загрят до 1000С за 3 min и 25 изсушен на нитроцелулозен филтърен буфер. Следва промиване с TBS, съдържащ 0,2 % v/v Tween 20 и 0,5 % Triton Х-100 (TBSTT), филтърът е инкубиран за 1 до 2 h при стайна температура с антителата до H11ODE. След 30 измиване, филтриране за 2 h с TBSTT свързаните антитела са елуирани с 3 ml от 0,1 М глицин, 0,15 М NaCl pH 2,6 за 2 min и незабавно коригиран при неутрално pH чрез прибавяне на 75 μΐ от 1,5 М Tris pH 8,0. Тези 35 афинитетно пречистени антитела, моделиран антиНПОБЕ, са използвани за скриниране 5 х 10* 5 pfu на австралийска λ gill кДНК библиотека, както е описано по-горе.

х 10*5 рекомбинанти от Zgtll библио- 40 тека, произлезли от Australian Haemonchus Contortus, са имуноскринирани и са взети три положителни култури. Следвайки по-нататъшно скриниране, два от тези рекомбинанта са вече позитивни и са моделирани В1А и В2. 45

Секвениране на В1А и В2 клони

Двата клона са разградени с EcoRI, добивайки единична прибавка от прибли- 50 зително 500 Ьр за В1А и три фрагмента, В2А (около 400 bp). В2В (около 100 Ьр) и В2С (около 100 Ьр), за Б2. Те са субклонирани в pBluescript SK* (Stratagene) и секвенирани, използвайки Sequenase 2,0 kit (United States Biochimicals).

Експресия на Ml и BIA клонове

Приставките Ml (SEQ ID NO: 1) и BIA (SEQ ID NOS: 2 и 3) са експресирани в E.coli, използвайки pGEX вектор (Smith and Johnson, 1988). Този вектор експресира протеини на С-край на глутатион-Б-трансфераза (GST) от Schistosoma Japonicum. Приставките Ml и BIA EcoRI са лигирани към EcoRI-cut, фосфатизиран pGEXl и трансформиран в E.coli щам JM101 съгласно методите, описани от Maniatis et al., 1982. Осем вторични продукта са получени от всяка трансформация и 2 ml култури са прораснали за 6 h при 37°С. IPTG е прибавен, за да индуцира сливане на белтъчен синтез и инкубацията продължава през цялата нощ. Клетките са отделени чрез центрофугиране, разцепени чрез изваряване в обикновен буфер (Laemmli, 1974) и екстрактите са анализирани чрез SDSPAGE и чрез Western blot, използвайки афинитетно пречистени овчи антитела, специфични за SDS-денатуриран H11OD дублет (антиННООЕ - виж по-горе). Свързаните антитела са доказани, с алкално фосфатазен конюгиран заешки антиовчи IgG алкално фосфатазен конюгат (Jackson Immunoresearch), последващо от цветно проявяване с 5-бром, 4-хлор, 3-индолил фосфатаза (BCIP) и нитросин тетразолон (NBT). Култури на имунопозитивни клонове са прораснати и индуцирани както по-горе и разцепени чрез ултразвук. Разделянето дава разтворими и неразтворими фракции чрез центрофугиране (Sorvall RC-2B центрофуга), HS4 ротор, 700 грт, 30 min, 4°С). Неразтворимите пелети са ресуспендирани в 8М уреа чрез ултразвуково въздействие, пробите от фракциите са проверени чрез SDS-PAGE. Слетите протеини са открити в неразтворимата фракция. Всеки от тези препарати е използван за ваксиниране на 2 овце три пъти при 150 pg протеин за доза в Freunds adjuvants. Позитивни контролни овце са имунизирани с природен Con A H11OD протеин и негативни контролни овце са имунизирани с разтворен протеин от E.coli, съдържащ pGEX вектор без прибавка (инсерт) от Haemanchus. Серуми от ваксинирани овце са анализирани чрез Western blot срещу H11OD,

Скрийнинг на Australian XZap библиотека чрез хибридизация с прибавки Ml и ΒΙΑ

Ml и ΒΙΑ празмидни ДНК (клонирани в pBluescript) са разградени с EcoRI и прибавките са изолирани чрез електрофореза в ТВЕ (tris-боратна-ЕДТА); 89 тМ tris-борат, 89 тМ борова киселина, 2 тМ EDTA pH приблизително 8,3) буфер в 1 % агарозен гел, последващо пречистване с GENECLEAN kit. Изолацията и пречистването са повторени, за да се избегне контаминация на сондата с плазмидни ДНК секвенции, които биха хибридизирани до λΖΑΡ секвенции, причинявайки неприемливи нива на фона. Пречистените прибавки ДНК са белязани с a-³²P-dCTP, използвайки Nick Translation kit на Promeda Biotech, съгласно фирмените инструкции. Маркираната ДНК е разделена от инкорпорираните маркери чрез колонна хроматография (Maniatis et al., 1982). Осем 135 mm петрита с λΖΑΡ библиотека са посадени на 10*5 pfu/петри и плаките са поставени на нитроцелулозни филтри (Maniatis et al., 1982). Следва изпичане във вакуумна пещ за 2h при 80°С, филтрите са прехибридизирани за 2 h, след това хибридизирани при 420С за една нощ (както е описано по-горе при Western blot анализа). Четири филтъра са скринирани с Ml сонда и четири с В1А сонда. Филтрите са промити двукратно в 2 х SSC, съдържащ 0,5 % SDS, еднократно в 1 х SSC, съдържащ 0,5 % SDS, и еднократно в 0,5 х SSC, съдържащ 0,5 % SDS, всички при 50°С и авторадиографирани. Потенциалните позитивни плаки са рескринирани със сонди. Високотитрови фагови стокси са приготвени от потвърдени позитивни култури (моделирани M1AUS за М1-хибридизиран клон и AustBl за В1А-хибридизиран клон) и клонове в pBLUESCRIPT съгласно фирмената инструкция за работа с λΖΑΡ (Stratagene), използвайки ВВ4 като гостоприемен щам Е.coli. Плазмидни ДНК минипрепарати от получените резултати са приготвени чрез алкално лизиране (Miniatis et al., 1982) и разградени с EcoRI. Разградените продукти са анализирани чрез електрофореза на агарозен гел.

Секвениране на прибавката M1AUS

ДНК секвениране е проведено на пречистена pBLUESCRIPT плазмидна ДНК с приложението на United States Biochemicals version 2,0 Sequenase kit съгласно фирмените инструкции. От първите секвенционни реакционни инициатори от краищата на векторната секвенция са използвани, за да се инициират реакциите. Секвенционните данни, получени от тези реакции, са използвани за конструиране на втората двойка от инициатори и от данните, генерирани с тези вторични инициатори, е конструирана третата двойка. По този начин ДНК е секвенирана чрез “walkong along” и от 5~-край и от 3~край.

Секвениране на прибавката AusBl

Този процес е извършен със Sequenase 2,0 Т7 polymeraza (USB Biochemicals), както е описана при секвенирането на прибавката M1AUS.

Полимеразни верижни реакции

Получаване на кДНК mPHK (lpg) от 11 дни след инфектирането U.K. H.contortus, получена по описания по-горе начин, са смесени с Т17 адаптор-инициатор. UmACTCOACTrCGAC^TCGArrri'rrrril'll'rrri’l 3') в диетилов пирокарбонат (DEPC) - третирана вода, след това загрята до 65°С за 5 min и незабавно поставена върху лед. Метилживачен хидроксид е прибавен към крайна концентрация на 28,6 тМ и сместа е инкубирана при стайна температура за 3 min. 2-меркаптоетанол е прибавен към крайна концентрация на 14,2 тМ и сместа е поставена върху лед. За да синтезира кДНК, RNase Guard (Pharmacia) е прибавена към 1 единица/μΙ Reverse Transcriptase buffer (Life Scienses) към едновременна концентрация, dATP, dGTP, dCTP и dTTP всеки по 1 mM AMV Reverse Transcriptase (Life Scienses) no 2 μΐ (всички давани като крайни концентрации). Реакцията е инкубирана при 41°С за 75 min, след това екстрахирана с фенол и хлороформ и пречистена чрез колонна хроматография (Maniatis et al., 1982). Пречистената реакционна смес е разредена 2,5 η и съхранявана при 4°С.

PCR (програмирани термални цикли) амплификация на кДНК с Maus-специфични инициатори

PCR реакции са проведени с използване на програмирани термални цикли (М. J. Research Inc.). Реакционната смес съдържа 1 μΐ от 250 μΐ разредена кДНК, получена съгласно изложено по-горе описание, 25 pmol от първата верига на Т17 адаптор-инициатор, 25 pmol от втората верига на амплификационен инициатор (всеки от тях базиран на позиции 865-884 (5~ ACGGGTGTTCGGGTTC CGTAT 3~) или тези, базирани на позиции 30 - 39 (5* GCTGAATCTAACTCCAATCC 3) на M1AUS секвенция (SEQ ID NO: 5)), 1 х Tag buffer (Northhumbra Biologicals Ltd) и 0,5 mM за всеки от dATP, dTTP, dGTP, и dCTP, и в 100 μΐ реакционен обем и покрити с 40 μΐ минерално масло, за да предотврати евапорация. Тази смес след това е загрята в термален циклер до 95°С за 2 min, след това се държи при 72°С. При 72°С 2 единици от Taq polymerase (Nortumbria Biologicas Ltd) са прибавени и плавно размесвани с другите реактанти. Последвалата програма е изпълнена в термалния циклер:

етап. Темпериране при 50°С за 5 min.

етап. Удължаване при 72°С за 40 min.

етап. Денатуриране при 94°С за 40 s.

етап. Темпериране при 50°С за 2 min.

етап. Удължаване при 72°С за 3 min.

етап. 29 цикъла от етапи 3 до 5.

етап. Финално удължаване при 72°С за 15 min.

Клониране на PCR продукти

PCR продуктите от описаните реакции са сепарирани чрез електрофореза в агарозен гел. Връзките от приблизително 2.5 и 3.5 kb са електроелуирани на стъклена нишка (Whatman), екстрахирана с фенол и пречистена чрез G50 хроматография (Farmacia) (Sambrool et al., 1989), Пречистената ДНК е лигирана в рТ7В1ие Т-вектор (Novagene), следвайки инструкциите за употреба.

Секвениране на 2.5 и 3.5 kb PCR продукти

ДНК секвениране е извършено със Sequenase 2.0 kit (US Biochemicals), използвайки техниката на “oligonucleotide walking”, описана в раздела за секвениране на M1AUS.

Полимеразни верижни реакции за 5~ краища

Приготвяне на първата верига кДНК ^g от тРНК от 11 дни след инфектирането H.contortus, U.K., получена по описания по-горе начин, са смесени с константен инициатор (5~ AAIGAAAGCGG ATGGCTTGAIGC 3~), построен на запазен регион в AustBl и 2.5 kb PCR и 3.5 kb PCR продукти (SEQ ID NOS: 6, 7 8 респективно). Сместа е загрята до 65°С за 5 min, поставена върху лед и метилов живачен хидроксид е добавен към крайна конецнтрация от 28.6 М. Сместа е инкубирана при стайна температура за 5 min, след това 2-меркаптоетанол е прибавен към крайна концентрация от 14.2 М и сместа поставена на лед. Първата верига ДНК е приготвена при ползване на реагенти от 5* RACE system (Gibco/BRL) при крайна концентрация от 20 mM Tris/HCl, pH 8.4, 50 тМ КС1, 2.5 тМ MgCl, 100pg/ml, BSA, 0.5 тМ οτ dATP, dCTP, dGTP, dTTP. 200 единици от Superscript Reverse Transcriptase са прибавени и реакцията е инкубирана при 42°С за 30 min и след това загрети при 55°С за 10 min, след което поставена на лед. кДНК е пречистена през Glassmax spin колона (Gibco/BRL) и съхраняване при -20°С.

Образуване на С-опашка на кДНК

1/5 от първата верига на кДНК е загрята при 70°С за 5 min, след това охладена на лед за 1 min. Реагентите от 5~ RACE system (Cibko/BRL) са прибавени към крайна концентрация от 10 М Tris/HCl pH 8.4, 25 mM КС1, 1.25 тМ MgCl, 50 g/ml BSA,. 0.2 dCTP. 500 U/ml Terminal transferase ca прибавени и реакцията е инкубирана на 37°С за 10 min, след това загрети на 70° за 15 min и съхранявани на лед.

PCR амплификация c използване на AustBl, 2.5 kbPCR и 3.5kbPCR специфични инициатори

PCR реакциите са изпълнени в програмиран Termal Cycler (M.J.Resaerch Inc.). За 3 край е използван един от 3 инициатори.

1. Инициатор, специфичен за 2.5 kb РСТ продукт, базиран на позиции 374 - 394 (5“ TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA 3~ ).

2. Инициатор, специфичен за 3.5 kb РСТ продукт, базиран на позиции 1210 - 1299 (5 CATCTTIAGTTATCTGACCAG 3~).

3. Инициатор, специфичен за кДНК клон AustBl, базиран на позиции 357-377 357377 (5‘ GACCATCGCTGATGAAGTCGG 3~).

За 5~ край на реакциите обикновен “Anchor primer”

5CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGAC Т AGTACGGGIIGGGII GGGIIG ~3) е използван. Всяка реакционна микстура съдържа 4 μΐ от 50μ1 С-опашка кДНК, 25 pMpl от подходящите два инициатори, 1 х Tag polymerase buffer (Boehringer/Mannheim) r 0.5 M всеки от dATP, dCTP, dGTP и dTT< краен обем от 100 μΐ. Тази смес е покрита с 50 μΐ от минерално масло и загрята до 95°С в циклера за 2 min. Реакционната смес се държи на 80°С, докато 0.6 единици от Tag Polymerase се прибавят и след това преминат през следната програма:

1. Темпериране при 50°С за 5 min.

2. Удължаване при 72°С за 10 min.

3. Денатуриране при 94°С за 45 S.

4. Темпериране при 50°С за 1 min.

5. Удължаване при 72°С за 2.5 min.

6. 39 цикъла от етапи 3 до 5.

7. Удължаване при 72°С за 15 min.

8. Държи се при 4°С.

Клониране на 5~ PCR продукти

PCR продуктите са сепарирани чрез електрофореза на агарозен гел и връзки на очаквания размер, около 1.3 kb, са срязани, ДНК е пречистена с използване на GENECLEAN kit и лигирани на РТ<&В1ие Т-вектор (Wovagene) съгласно фирмените инструкции.

Полимеразна верижна реакция за производство на 3“ край на AUSTB1

Първата верига на кДНК е използвана за получаването на кДНК, прилагайки от 1414 до 1435 (5' TCTTTGAAGAAATGAAAAGCTT 3') в AustBl (CEQ ID N0:6) е използван за M1AUS PCR и реакциите са извършени в термален циклер (M.J.Research Inc). Реакционната микстура се състои от 25 pMol от всеки инициатор, 2 μΐ от кДНК, 1 х Tag Polymerase buffer (Boehringer Mannhein), 0.5 mM dATP, dCTP, dGTP и dTTP в 100 μΐ. Те са покрити с 50 μΐ минерално масло и загрети до 95°С за 2 min. 0.6 1 от Tag polymerase са прибавени и същият програмен цикъл е осъществен като за 5 PCR (описан по-горе).

Клониране и секвениране на 3' продукти

Продуктите на PCR са сепарирани чрез електрофореза в агарозен гел и връзките на очакваните размери, 1.3 kb срязани, и ДНК 20 пречистена при използване на GENECLEAN kit и лигирани в PCR-Scropt (Stratagene), съгласно фирмените инструкции.

Секвениране на клонирани PCR продукти 25

ДНК от PCR клонове е секвенирана при използване на Sequenase 2.0 kit (Unated States Biochemical) съгласно фирмените инструкции. Олигонуклеотидните инициатори са прило30 жени за “walk along” на ДНК от клоновете от двата края 5“ и 3~ респективно.

Анализ на всички ДНК секвенции

Секвенциите са анализиарни с GCG (Genetics Computer Group) Sequens Analysis Software Package, Devereux et al., 1984.

Анализи Northern blot и southern blot 40

Приготвяне на Northern blots

Northern blots са приготвени във формалинови гелове, създадени по начина 45 описан от Msniatis et al. (1982). мРНК проби (от 11-, 15-, и 23-дневни зрели форми на Н.contortus) са третирани със 17.5% v/v формалдехид и 50% v/v формамид в :OPS буфер (20 тМЗ-И-морфолин) пропансулфо50 нова киселина, pH 7.0, в тМ натриев ацетат, mM EDTA) при 65°С за 15 min и охладени на лед. Теловете са електрофорезирани в

MOPS буфери и нанесени на Duralon мембрани чрез капилярен трансфер по начина, описан от Sambrook et al., (1989).

Приготвяне на Southern blots

Два зрели хелминта от Heamonculus contorus, които са били едномоментно замразени в течен азот, са стрити до получаване на фин прах в течен азот. Прахът е прибавен бавно към 25 ml лизиран буфер (0.05 М Tris-HCl, pH 8.4, 0.1М EDTA, 1% w/v Sarkosyl, 0.05 mg/ml proteinase K (Boehfinger Mannheim) и инкубиране за 2 h при 65°C. Суспензията след това е екстрахирана двукратно с един обем от фенол и хлороформ, двукратно с два обема от хлороформ и преципитирана с етанол. Преципитираната геномна ДНК е ресуспендирана в 20 ml от Tris, EDTA буфер (ТЕ, pH 8), оставена за една нощ при 40°С на люлееща се маса, след това диализирана в 1 1 ТЕ. РНК е отстранена чрез инуклиране с DNase-free RNase A Type I (Sigma) при крайна концентрация на 20 pg/ml, при 37°С 1 h , последваща една екстракция с фенолхлороформ и хлороформ и преципитация с етанол както по-горе. Преципитираният геномен ДНК пелет е промит двукратно с 70% w/v етанол и ресуспендиран в 1 1 ТЕ както по-горе. Геномна ДНК е разградена с EcoRI или Hindlll (25 μg от ДНК във всяко разграждане) за една нощ при 37°С, след това електрофорезирана при 5 pg за писта на 1% w/v агарозен гел в Tris-ацетатен буфер. Телът е анализиран по Southern blot чрез капилярен трансфер, както е описано от Msniatis et al., (1982) на Hybond-N мембрана (Amersham International). ДНК е фиксирана на мембраната с ултравиолетова светлина съгласно фирмените инструкции.

Приготвяне на сонди pBLUESCRIPT плазмиди, съдържащи M1AUS, В1А или AustBl прибавки, са разградени с EcoRI. pT7Blue плазмиди, съдържащи 3.5kbPCR продукти прибавки, са разградени с BamHl и тези съдържащи 2.5kbPCR продукт прибавки са разградени с BamHl и Xbal. Разградените продукти са електрофорезирани; прибавките са разградени и радиоактивно обозначени с a- ³²P-dCTP чрез транслация, по начина, описан по-горе при скриниране на ZAP библиотека.

Хибридизационни условия (за Southern blots)

Мембраните са отстранени и прехибридизирани в хибридизационен буфер, както е описано, за 3 h при 28°С. Геномни ДНК Southern blot ленти са хибридизирани към всяка от посочените сонди за една нощ при 42°С, в 2 х SSC, сдържащи 0,1% w/v SDS и авторадиографирани. Последва проявяване на авторадиографиите, лентите отново са промити (0.1 х SSC, 0.1% w/v SDS при 65°С) и отново авторадиографирани.

За Northern blots

За сонди Ml, M1AUS и BIA (SEQ ID NOS: 1, 5 и 2 респективно)

Notrhern blots от мРНК от 11, 15 и 23 дневни зрели форми на Heamonculus contorus са сондирани първо с Ml прибавка.

Филтърът е прехибридизиран за 2 h при 42°С в 2 х SSC (където 20 х SSC = 3 М NaCI, 0.3 М натриев цитрат, pH 7.2) съдържащ 5 х Denhardt’s (0.1% w/v Ficoll 400 ipharmacia), 0.1% поливинилпиролидон, 0.1% волски серумен албумин Фракция V |Sigma Chemical Corp), 0.5% SDS (натриев додецилсулфат), 10% декстранов сулфат, 0.1 mg/ml ДНК от тестиси на сьомга и 50% дейонизиран формамид. Хибридизацията към сондата е извършена в същия буфер за една нощ при 42°С. Филтрите са промити двукратно за 30 min в 2 х SSC съдържащ 0.5% SDS и 50% формамид, двукратно за 30 min в 2 х SSC, съдържащ 0.5% SDS и двукратно за 30 min в 2 х SSC. Първото промиване е при 42°С и всички останали промивания - при 37°С. След авторадиография болтът е отстранен чрез промиване в кипяща 0.1% SDS и реавторадиографиран до отстраняване на сондата. Същият болт след това е сондиран с M1AUS приставка, промит и авторадиографиран. Болтът отново е отделен и изпитан и след избистряне сондиран с В1А приставка. След нов стипинг болтът е сондиран, както е описано по-горе.

За сонди AustBl, 2.5kb и 3.5 kb PCR прибавка (клон 2), разделен отново, отделен и сондиран с 3.5 kb PCR (клон 2) прибавка.

Разграждане на H10D и анализи на ензимна активност

Приготвяне на H110D

Природен H110D (H110DN) е приготвен съгласно методите, описани в W088/00835 и W090/11086.

Приготвяне на еластазен фрагмент (H11S) от H110D

Зрели форми на Heamonculus contorus са хомогенизирани в 10 обема на ледено студен PBS/0.0.2% натриев азид и след това центрофугирани аз 20 min при 13000 об./min. Пелетът е ресуспендиран в 10 обема на PBS/ азид, рехомогеннизиарн и центрофугирането е повторно. Последва ресуспензия в 50 шМ MAPS буфер, pH 7.4 (обемът за суспензия е 1 ml за 30 in, пелетът е разграден с еластаза (800 μΙ/20 ml от суспензия); 1 mg/ml пресен разтвор приготвен в 1 mM НС1/2 тМ Са²⁺) за 1 h. Разграждането е преустановено чрез прибавяне на 3,4-дихлороизокумарин (300 μΐ от 10 тМ в DMSO/20 ml от разградения продукт). Сместа е центрофугирана при 13000 об./min за 20 min и пелетираният материал запазен. Супенатанътът е ултрацентрофугиран при 100000 g за 1 h и 20 min. Получената супернатантна течност е приложена към СопА колона и са получени свързани фракции. За анализ тази фракция е внесена на SDSполиакриламиден гел и електрофоретично трансферирана на поливинилиденова дифлуоридна мембрана (Immobilon-P, Millipore), оцветяване с Coomassie blue, връзката 105 kb е ексцизирана и анализирана в щазова фаза на аминокиселинен секвенатор. За изследвания на ваксинация свързваща фракции СопА са пречистени чрез концентриране и приложени на Superose 12 (Pharmacia) гел филтрационна колона и е получена колекция от тези фракции, съдържащи аминопептидазна активност.

Термолизисно разграждане на H11OD

Дублетът Н110А е пречистен чрез електроелуция от подготвена скала на 8%

SDS-полиакриламиден гел, за да даде H110DE, както е описано в WO90/11086, и чрез електроелуция на димерна форма, внасяна точно на 200 kd (който дава характеристичен дубелен на 100 kd, когато повторно се внася на SDS-PAGE), за да даде H11ODE. Разтворите на H110DE са концентрирани до 200 pl, добавен е калциев хлорид до 5 тМ и сместа е затоплена до 37°С. Прясно приготвен разтвор от 1 g/ml Thermolysin (в 1 mM НС1, 2 тМ СаС1₂) са прибавени в отношение на 0.1 pg Thermolysin на pg H110DE. Сместа е инкубирана при 37°С за 120 min и след това реакцията е спряна чрез прибавяне на 5 pg от 0.5 тМ EDTA.

Протеините фрагменти са отделени чрез електрофореза на 15% SDS-полиакриламиден гел и електрофоретично трансферирани на поливинилиденова дифлуоридна мембрана (Immobilon-P, Millipore). Следва оцветяване с Coommassie blie и най-интензивните дискретни връзки са ексцизирани и анализирани в газова фаза на аминокиселинен секвенатор.

Приготвяне на фракция H11OD (11А), обогатена за аминопептидазна А активност

Пелетният материал добит след третиране с еластаза чрез центрофугиране при 17000 g за 20 min (виж по-горе), е ресуспендиран в 1% Tween в PBS/азид и оставен (при разбъркване) за 1 h. Суспензията е центрофугирана при 17000 g за 20 min и супернатанта е отстранен. Пелетът повторно е екстрахиран с 1% Thesit в PBS/азид. Супернатантите след и ултрацентрофугирани за 1 h и 20 in при 100 000 g. Супернатантът е приложен към СопА афинитетна колона (Affigel, Biorad) и свързаният материал елуиран и след това фракциониран чрез йонообменна хроматография на MonoQ колона.

Анализи на ензимни активности

Активности на α-амино ацилпептидна хидролаза (микрозомабна) аминопептидаза в H110D препарати са характеризирани чрез анализи в разтвор с използване на -левицин, метионин, фенилаланин, а-глутаминова киселина и лизин р-нитроанилиди (pNA). Всички аминокиселинни р-нитроанилидни субстрати (с изкл. на α-глутаминова кисе лина) са получени от Sigma, Poole, Dorset, UK, α-глутаминова киселина е от Fluka, Dorset, UK. Единични хидрофобни (левцин- или фенилаланин-) и заредени а-глутаминова киселина-) аминокиселинна ,ΝΑ, известни като субстрати за аминопептидаза-М (АрМ) и -А (АрМ), респективно от бозайници, са подбрани за измерване ефективността на ензимни инхибитори и серумно инхибиране на H110D аминопептидазни активности.

(а) Анализ на микропетри

Гнезда на микро-ELISA петрита (Dynatech Immulon 1, Virginia, USA) са запълнени c 250 μΐ или от 50 mM HEPES или MOPS pH 7 и 1-10 μί от фракцията, подложена на анализ. Петритата са преинкубирани при 37°С за 10 min преди да бъдат прибавени към 10 μΐ от 25 шМ аминокиселинен р-нитроанилиден субстрат на гнездо. Наличният момент на отчитане на оптична плътност (DD) при 405 пт, е измерен с четящо устройство за ELISA петри и петритата след това са инкубирани при 37°С за 15-30 min. Финалното разчитане на OD е проведено както преди и е изчислена промяната на OD за минута за милиграм от протеин.

(Ь) Инхибитор на чувствителността

Методът, използван за ензиминя анализ, е този, описан в (а) по-горе, с изключение на това, че инхибиторите са прибавени към 250 μΐ от буфер и 10 1 от 1 g/ml ConA Н110А и преинкубирани за 10 min при 37°С, преди да се добави от субстратите левцин-pNA или а- глутаминова киселина-pNA. Процентът на инхибиране е изчислен, както следва χ - V

----- X 100 = процент на инхибиране.

х където х = deltaOD/min от ензима без прибавен инхибитор и у = deltaOD/min от ензима и прибавен инхибитор. Осем съединения от различен ензимен клас на инхибиране са тествани индивидуално: Amastatin, Bestatin (металопротеаза, аминопептидаза), 1,10 фенантролин, EDTA (металопротеаза), фосформидон (металопротеаза термолизин, колагеназа) Aprotinin (серин протеаза), Peps tarin (аспарагинова протеаза), PMSF (серин и дистеин протеаза) и Е64 (цистеин протеаза). Amastatin, bestatin, 1,10 фенантролин, PMSF и пепстатин са получени от Sigma, Dorset, UK. Всички други инхибитори са получени от Bfehringer-Mannhein. Всеки инхибитор е използван при две концентрации, равни или п-големи от максималните концентрации препоръчани от BoehringerMannheim.

<с) Анализ на антисерумна инхибиция на ензим

Анализът е като описаният в (а) погоре, с изключение на това, че две микроELISA петрита са използвани. В едното петри, 10 μΐ от ConA H11OD (1 mg/ml) и 10 μΐ от антисерум от всяка овца за гнездо, са инкубирани при 37°С за 15 min. Второто петри, с 250 μΐ от HEPES/бикарбонатен буфер и 10μ1 от етерна фенилаланин-,ΝΑ или субстрат на а -глитаминова киселина-pNA на гнездо, също е преинкубиран при 37°С за 15 min. Серумни смеси от ConA H11OD след това са прибавени към буферно-субстратните смеси във второто петри с мултипипета. deltaOD/ min беше определена. За целите на корелациите процентът на инхибиция е изчислен с формулата в (Ь) по-горе където х представлява средната deltaOD/min за гнездата, които съдържат ензим и серум от негативна контролна овца (ваксинирана с конски феритин от слезка) и у = deltaOD/min за гнездата, които съдържат ензим и серуми от индивидуални овце, ваксинирани с H11OD. За целите на корелациите (фиг. 18) процентът на протекция е изчислен с формулата в (Ь) погоре, където х представлява или средния брой на отделени фекални яйца за грам или средния товар на контролните херминти и у е или фекалния добив за грам по време на експеримента, или товарът на хелминтите от отделните овце ваксиниарни с H11OD.

Локализация на ензимна активност чрез хистохимични способи

Аминопептидазна активност е демонстрирана на 10 цт криостатин секции от зряла форма на Haemonchus contortus, с L-левицин 4-метокси β-нафтиламид и L-глутаминов а

4-метокси-3-нафтиламид като субстрати чрез методите на Nachlas et al. (1957), Nakane et al. (1964) и Lojda et al (1980).

Експресия на рекомбинантен H11OD в еукариотна клетъчна система на Baculovirus-насекомо

Конструиране на експресионни плазмиди

Фрагментите 3.5К PCR, описани погоре, са генерирани чрез амплификация на олиго dT адаптор (който съдържа Sall участък) и олиго 872, който представя база Nos 30-49 в M1AUS секвенция, и са клонирани във вектора рТ7В1ие. Клон рТ73.5-2 е ориентиран с векторен полилинкерен участък BamHl на неговия 5' край на участъците Hindlll, Xbal и Sall на 3' край. Секвенцията на 5' край е следната:

BamHl *------олиго 872---------1—3.5К----5' GG ATG CGA TTG CTG ААТ СТА ACT CCA ATC С.......3’

Лев Асп Лев Тр Про Иле.........

(*) посочва закачения 3' dt/da, използван за клониране във вектора рТ7 Blue Vektor.

3.5 PCR клон 2 е разграден с Hindlll (единичен участък във векторна полилинкерна секвенция на 3' край на 3.5К ген) и краищата попълнени с деоксинуклеотиди, използвайки ДНК полимераза I (Klenow фрагмент), според Maniatis еу al (1982). Селектиран е линкер BamHl (5' CGGATCCG 3', New England Biolads Catalog No 1021), лигиран към blunt краища и клонове с допълнителен BamHl участък, позволяващ генна секвенция с пълна дължина H11OD, да бъде ексцизирана като BamHl фрагмент. BamHl фрагмент е изолиран чрез електрофореза на 0.6% w/v агарозен гел в tris-ацетатен буфер, последващо пречистване с GENECLEAN (BI0101). Тази процедура е проведена двукратно. Пречистеният фрагмент след това е лигиран към BamHI-cut, фосфатизиран pBlueBac II (Invitrogen Corp.) и клонове носещи фрагмент в правилната ориентация (напр. с 5' край на 3.5 PCR клон 2, поставен под контрол от полохидрирания промотор на baculovirus), детремирани чрез разграждане с Nhel и Xbal. Полученият плазмид е частично разграден с BamHl и краищата попълнени както е описано вече по-горе. Добавен е Ncol линкел,, съдържащ ATG (5' CCCATGGG 3'; New England Biolabs Catalog No. 1040) и сместа е лигирана. Клонове които имат линкера лигиран на 5' край BamHl участък от 3.5 PCR клон 2, са детерминирани чрез разграждане с Ncol. Полученият плазмид моделиран рВВ3.5 2(N), е изобразен под формата на диаграма на фиг. 19. Тази конструкция завършва в инсерцията на рамка ATG на 5' край на инсертът 2.5PCR клон 2, за да започне транслация. Секвенцията, заобикаляща тази инициирана ATG, е:

BamHl—Ncol връзка-BamHl----*!-----олиго

872-----------! ' 5' GGATCCCC ATG GGG ATG CGA

TTG CTG AAA CTA AIT CCA ATC C.. Мет Гли Иле Ape Лев Лев Асп Лев Тр Про Иле..

Експресираният протеин е без аминокиселини 2 - 9 от кореспондиращата H11OD и има 3 аминокиселини от линкерна секвенция, незабавно следваща ATG.

Произвеждане на рекомбинантен baculovirus, съдържащ секвенции H11OD

Плазмидът pNN3.5-2(N) е трасфектиран в клетки на Spodoptera fruqiperda (Sf9) (доставени от Invitrogen Corp.), използвайки линеарен Autografica californica нуклеарна полихедрозна вирусна (ACNPV) ДНК и катионни липозоми (Invitrogen Corp, трансфекционен модул) съгласно фирмените инструкции. Клетките са култивирани в средата ТС-100 (Sigma), обогатена с фентален телешки серум (CSL Ltd), инактивиран при висока температура (56°С за 45 min) и антибиотици (penicillin/streptomycvin, gentamycin; SCLLTD). Проведена е също и контролна трансфекция, като се използва рВВ3.5 (N) плазмид с ATG инсертиран на 3' край на 3.5 PCR клон 2 секвенция. Селектирани са рекобинантни плаки на базата, така че pBlueBac II вектор също кодира β -галатозидава ( β-gal) на Е.coli, чрез включване на X-gal в агарозно наслояване на препоръчаното ниво. Селекцията от blue плаки е взета и подложена на два по-нататъшни етапа на пречистване на плаките след което инфектираните монослоеве не дадоха доказателства за контаминиран див тип вирус (което би било доказано чрез присъствието на дрени полихедрони). Пречисте ните вируси са обозначени като 3.5-2-Р2А, РЗА и -Р4А и са ампилифирани чрез две секвенциални инфекции от Sf9 клетки, използвани преди. Пречистената от контролните трансфекции плака е обозначена като

3.5- 2-rev.

Оценка на експресия на H11OD в клетки на насекомо, инфектирани с рекомбинантен baculovirus

Монослоеве от Sf9 клетки (1 х 10*6 клетки в 25 ст*2 флакони) са инфектирани с

3.5- 2 вируси, див (wt) вирус, с контролен вирус, експресиращ β-gal, или не са инфектирани. След 4 дневен растеж при 26°С монослоевете са отделени чрез умерено разклащане клетките са възстановени чрез центрофугирани (2000 об./min, за 10 min и клетъчните пелети са разрешени чрез 3 цикъла на размразяване. Лизатите са ресуспендирани в 500 μΐ PBS и 25 μΐ кратни са анализирани за АрМ активност чрез micro-well анализ.

15μ1 кратни (3 х 10*4 клетъчни еквиваленти) от Лизатите от по-горе са електрофорезирани на денатурирани 7.5% SDS-полиакриламидни телове. Един гел след това е оцветен с Coomassie blue, за да даде оценка на нивата на експресия. Друг гел е анализиран чрез Western blot и след това сондиран с анти H110DN (както е описано по-горе).

Резултати

Анализи на имунопозитивни клонове

Анализ на активност на антитела, пречистени на клон Ml

Афинитетно пречистени антитела, специфични за всеки от петте антитялопозитивни клонове, са приготвени и използвани за да сондират Western blot на обогатен с D11OD екстракт. Както е показано на фиг.8, всички 5 клонове явно рекогнисцират дублета H11OD. Обаче реакицята с клон Ml два найсилен сигнал (фиг.8б) в сравнение с gtll негативен контролен болт (фиг.8е). този клон следователно е изследван по-нататък.

Анализ Northern blot с клон Ml

Анализът Northern blot от Haemonchus contortus мРНК, сондирана с Ml приставка, е показан на фиг.9. Единична мРНК връзка е рекогнисцирана на приблизително 3.5 kd. Това е достатъчен размер да кодира за протеин от около 100 kd.

Секвенционен анализ на клон Ml

Анализът на рестрикционно разграждане на ДНК с EcoRI показва, че приставката Ml е приблизително 300 Ьр. Секвенцията на ДНК на фрагмент Ml е детерминирана (SEQ ID NO: и е показана на фиг.З. Фрагментът включва 295 Ьр с отворена за четене рамка, започваща с основа номер 3.

Анализ Northern blot С клон В1А

Анализът Northern blot от Haemonchus contortus мРНК, сондирана с В1А приставка е показан на фиг.9с. Както за Ml единична мРНК връзка е рекогнисцирана на приблизително 3.5 kb.

Секвениране на клонове В1А и В2

Клонове на В1А са секвенирани (SEQ ID NOS: 2 и 3) и пълната секвенция (SEQ ID NO: 2) е показана подредено по Н11-1 (SEQ ID NO: 19) и AustBl (SEQ ID NO: 6) на фиг.5. Приставката е 484 bp и има пълна OFR от първата основа. Трите фрагменти на В2, получени чрез разграждане с EcoRI, са секвенирани и пълна секвенция за В2 (SEQ ID NO: 4) е 581 bp. Това е показано подредено на фиг.4. Секвенцията има ORF от позиция 3 до 213 Ьр, спиращ кодон и ултратрансланционен регион, съответстващ на 2.5 kb PCR продукт секвениця (SEQ ID NO: 7).

Експресия на Ml и ΒΙΑ в E.coli

Когато субклонирани на GST експресионен вектор, са получени клоновете които експресират съединени протеини от 38- 40 kd, за Ml и 45 kd за ΒΙΑ. Това съответства с предсказаните размери за тези приставки, позволени за молкулното тегло на лутатионS-трансфераза. Двете съединени протеина реагират много силно на Western blots с финитетно пречистени антитела до H11ODE (Fif.ll). Съединените протеини са експесирани като неразтворими клетъчните включвания.

Реакция на антитела в овца, ваксинирана с M1-GST и B1A-GTS съединени протеини

Антисеруми от овца, инфектирана със съединени протеини, са тествани чрез Wastern biot срещу H110D препарати. И двата протеина GST-M1 и GSR-B1A предизвикат антитела които специфично рекогнисциират дублета H11OD (фиг. 12). Серуми от негативна контролна овца не рекогнисцират дублета H11OD.

Изолиране и характеризиране на клонове селектирани чрез хибридизация с Ml или В1А ДНК приставка.

Потвърдените позитивен клон, хибридизиран до Ml сонда о обозначен като M1AUS (SEQ ID NO: 5), и клонът, хибридизиран до В1А, обозначен като AustBl (SEQ ID NO: 6). Рестрикционно разграждане на пречистен плазмид DNAs с EcRI показва размер на приставка от около 900 Ьр за M1AUS и около 1.6 kb за AustBl. Както е показано на фиг.9Ь) и 9d), на Northern blots, M1AUS и AustBl хибридизират на същия размер мРНК (около 3.5 kb), както го направиха и Ml, и В1А.

Секвенционен анализ на M1AUS

Пълно секвениране на фрагмента M1AUS е проведено със синтетични олигонуклеотиди, за да “walk along” на ДНК от другия край. Анализ на получената секвенция разкри че M1AUS присталка е 948 Ьр, както е показано на фиг.З. Секвенцията (SEQ ID N0:5) започва с ATG 1 (който кодира за метионин) и има отворена четяща рамка (ORF) над цялата негова дължина. Секвенцията е с 19 основни двойки по-дълга от Ml секвенцията 5' край и с 634 Ьр по-дълга на 3' край. Секвенциите общо към двата клона (основи 20 до 314) са идентични, с изкл. на две нуклеотидни разлики на третата колонна позиция. Сравнение на всички възможни четящи рамки с различни база данни показва че четящите рамки, започващи с ATG на основа номер едно поделят хомология с членове на род от микрозомални аминопептидази.

Секвенция на AustBl

Пълно секвениране на фрагмента AustBl е извършено при използване на синтетични олигонуклеотиди за да “walk along” на ДНК от другия край. ДНК секвенцията (SEQ ID NO: 6) е показана на фиг.5. Клонът е дълъг 1689 Ьр и има ORF от остатък 2. Тази секвенция формира част от Н11-1, както е показано на фиг.1. Аминокиселинната транслация на тази секвениця показва цинков свързващ участъков мотив от аминопептидази.

PCR амплификация на нДНК от PCR на H11OD мРНК при използване на Ml AUS инициатори

С ДНК е синтезирана от МРНК на Haemonchus Contortus, използвайки като инициатор олиго-dT, съдържащ адаптерна секвениця, за да съдейства на последващо клониране и манипулация на ДНК. Тази сДНК след това е използвана за да амплифицира M1AUS секвенция чрез PCR, използвайки за 5' край инициатор, синтетичен олигонуклеотид, основан на позиции 865-885. PCR фрагмент от около 2.5 kb е амплифицирана. Това е приблизително очаквания размер на фрагмента основан на известния размер на МПНК и на аминопептидазна кДНК секвенция от бозайници.

Втора група от PCR реакции е извършена, използвайки инициатор близо до 5' край на M1AUS (основи 30-49). Четири връзки са открити на агарозен гел. Най-голямата от тях, на 3.5 kb , кореспондира с предсказания размер за PCR продукт.

Клониране и секвениране на 2.5 kb и 3.5 kb PCR продукт от M1AUS инициатори

2.5 kb и 3.5 kb PCR продукти са клонирани и обозначени като 2.5PCR (SEQ ID NO: 7) и 3.5PCR (SEQ ID NOS: 8, 14 и 15 за клони с номера 2, 10 и 19 респективно). На Northern blots 2.5PCR и 3.5PCR (клон 2, 3.5PCR-2) хибридизира с тРНК от около 3.5 kb 1фиг.9е) в същата насока (като се има предвид възрастта на използвания за получаване на мРНК Haemonchus Contortus), като Ml, BIA, M1AUS и AustBl.

Пълно секвениране на клонове е проведено чрез oligonucleotid walking. Както е показано на фиг.1, секвенцията за 2.5 kb продукт (SEQ ID N0:7) е част от Н11-2 (SEQ ID NO: 20) и секвенцията за 3.5 kb продукт (SEQ ID NO: 8) е най-голямата част от Н113 (SED ID NO :21). Аминокиселинните транслации на две от тези секвенции (показани на фиг.6) съдържат цинк свързаният мотив His Glu Хаа His Trp (HEXXHXW) характеристики на микрозомални аминопептидази.

Секвениране на 5' край PCR клонове

С ДНК е синтезирана с използване като инициатор, подходящ да запази секвенция в СДНК клон AustBl, 2.5PCR и 3.5PCR (SEQ ID NOS: 6, 7 и 8), който хибридизира с РНК за тези секвенции около 1.3 kb от 5' край. СДНК са с Т-опашка на 5' край и след проведени PCR реакции с универсален Anchor (А) фиксиращ инициатор за 5’ край и три инициатора, специфични за всеки от секвенциите AUSTB1, 2.5PCR и 3.5PCR-Clone 2 (SEQ ID NOS: 6, 7, 8) за 3' край. Всяка от реакциите даде продукт с предполагаемия размер, точно под 1.3 kb 1301 bp (SEQ ID NO: 9), 1280 bp (SEQ ID NO: 10) и 1292 bp (SEQ ID NO: 11) респективно. И трите секвенции имат нетранслиран регион на 5' край, (фиг.2). Всички започват с една и съща 22 Ьр секвенция (5' GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG 3), която е известна като снаждаща водещата секвенция - Spliced Leader Sequence 1 (SL1) и присъства в нетранслирания 5’ регион на много разновидности от нематоди, Huang et al., 1990. В SED ID NOS: 9 и 10, SL1 секвенция е непосредствено преди инициалната ATG. В SED ID NO: 11 има 13 bp между SL1 и инициалната А Т G. И трите секвенции имат пълни ORF.

Секвениране на AustBl 3' край PCR клон

Използвайки специфичен инициатор подходящ за позиции 1414-1438 в AustBl (SEQ ID NO: 6), PCR продукт даде връзка, както се предполагаше, от около 1.3 kb. Секвениране на клонираната връзка даде секвенциите SEQ ID NOS: 12 и 13. Те дадоха ORF форма от 1 - 615Ьр и съществен нетранлиран регион.

Секвенционен анализ на клонирани PCR продукти

Смеси от секвенциите, описани по-горе обозначени като Н11, Н11-2 и Н11-3, са показани на фиг.2. Аминокиселинните секвеници, предсказани от тях, са показани нз фиг.ба. Валидността на предсказаните транслации на представяните ДНК секвенгаи е по същество потвърдена чрез сходството между аминокиселинните секвенции, детерминирани чрез разграждане по (Edman от CNBr и протеолитично разцепени фрагменти (фиг.7). Така 27 остатъка от 29те остатъчни N-терминални секвенции на H11S (SEQ ID NO: 16) подхождат на Н11-2 от остатъци 61-90 (фиг.7Ь). Съответствията :-:з валин (V) на позиция 78 и глицин (G) на позиция 90 са характерни за Н11-2, тъй като Н11-3 има аспаргин (N) на позиция 90 и Н11-1 има левицин (L) на позиция 86 (която кореспондира на позиция 78 6 Н11-2). Два остатъка от H11S- N-терминус аминокиселина секвенция (SEQ ID NO: 16) не подхожда на никоя от трите H1110D секвенции, представяни в изобретението. За по-голяма прецизност трябва да се отбележи, че сходството е голямо, но отличителните секвенции Rep А и В (предварително описани 6 WO90/ 11086) с Н11-2 и Н11-1, респективно в региона на остатъците 540-555. Подобно на това, в остатъчните региони 450-470, Rep D е точно сходим за Н11-2, докато подобният, но различаващ се Rep Е е по-близо за сходимост до Н11-3.

За да илюстрира, транслираната аминокиселинна секвенция на една от секвенциите с пълна дължина (hl 1-3) е сравнена на фиг.бЬ с две секвенции за микрозомални аминопептидази от бозайници. Хомологията на H110D транслация с тези аминопептидази е показана чрез заградените идентични аминокиселини. Характеристичен мотив на микрозомални аминопептидази е аминокиселината секвенция HEXXHXW, която функционира като цинков свързан участък (Jongeneel et al., 1989; Vallee et al., 1990); това е показана със звездички (*)на фиг.6. Тази секевнция, която е показано, че присъства в транслациите на Н11-1, Н11-2 и Н11-3, е запазена във всички микрозомални аминопептидази. Други отличителни черти, общи за микрозомални аминопептидази на бозайници и Hdemonchus, са наличието на сравнително към интрацелуларен регион, единична трансмембранна секвениця, прилежаща към М-терминус и няколко потенциални гликосилационни участъка. Новата хомология (сходимост от 52-55% и идентичност от 30-35%) на Н11-1, -2 и -3 по отношение на микрозомални аминопептидази на бозайници са показани в табл.2.

Анализи Southern blot

На фиг. 10 са показани получените от Н.contortus геномни ДНК Southern blots, сондирани с различни клонове на H11OD кДНК и PCR продукти. Всички сонди показват многочислени полоси на хибридизация; това е типично за мултигенни родове.

Както се очаква, В1 и AusrBl показват подобни хибридизационни форми, като и M1AUS и 3.5кРСг. Обаче тези форми значително се различават една от друга и от тези, 5 видени със сондата 2.5kbPCR, дори при условия на умерено разпростиране (фиг. 10а), рефлектирайки на различните нива на хомологията между тези три сДНК.

Демонстрация на аминопептидазни активности, асоциирани с H110D

Установено е, че микрозомална аминопептидазна активност се асоциира с тези 15 фракции, съдържащи Hl 1OD, които са супернатантните от ултрацентрофугиране на Thesit екстракти, СопА свързвана фракция (СопА H11OD) и фракциите, съдържащи H11OD, получени чрез йонообменна хроматография 20 на MonoQ колона (табл.З). Специфичните активности с всички тествани субстрати нарастват с нарастването на чистотата на H11OD.

Таблица 3.

Ензимни активности на фракции от А типично получена H11OD

ФРАКЦИЯ	СПЕЦИФИЧНИ ЕНЗИМНИ АКТИВНОСТИ (OD/min/mg протеин)
Фенилаланин -pNA	Лебцин -pNA	Лизин -pNA	<х-Г латамин нова к-на -pNA	Метионин -pNA
Фосфатен баферен Ф р . (PBR)	О.20	0.09	0.121	0.01	0.16
Tween 17. 20/PBS 1	0.15	0.15	0.095	0.01	0.09 —

Таблица 3 (продължение)

ФРАКЦИЯ	специфични ензимни активности (OD/«min/mg протеин)
Фенилаланин -pNA	Яебцин -pNA	Яизин -pNA	α-Γ лутамин нова н-на -pNA	Метионин -pNA
Thesi t 17./PBS	1.94	1.25	Ο . 57	0.54	1.91
ConA H11OD	4. OS	3.01	1.434	Ξ . 09	3.Β4
CamCl HIK'D	6.55	5.01	З.О1	3.90	6.419

Ефекти на инхибитори на аминопептидази от бозайници върху H11OD аминопептидазни активности

Прибавяне на инхибитора bestatin (който 25 инхибира микрозомални аминопептидази от бозайници) към CinA H11OD при концентрации, препоръчани от производителя (Boehringer Mannhein) редуцира активността срещу левицин-р-нитроанилид, приблизително 70%. Се- 30 рии от експерименти са проведени за да се тества инхибиране на активността на обхват от протеазни инхибитори. Тези инхибитори които са неспецифични за металопротеази или минопептидази, нямат инхибиращи ефекти на величината на реакцията. Инхибитори, които са известни че бързодействащ на металопротеази или аминопептидази, въздействат на величината на реакцията. Най-ефективен се оказва инхибиторът 5 М фенантролин.

Таблица 4

Инхибиране на H11OD аминопептидазни активности с различни протеазни инхибитори

ИНХИБИТОР	КОНЦЕНТРАЦИЯ	ПРОЦЕНТ ΗΑ ИНХИБИРАНЕ	ПРОЦЕНТ НА ИНХИБИРАНЕ
а-глутаминоба киселина-рнитроанилиден субстрат 1)	Яебиин-рнитроанилиден субстрат 2)
Amastatin V	10 μΜ	0	61
50 μ Μ	0	ьь
Bestatin	50 μΜ	Ο·Γ	63
100 μΜ	35	68
EDTA	1 μΜ	17	8
10 μ Μ	21	16
1,10 phenanthroline	1 μΜ	78	78
10 μΜ	85	87
Phosphor—	10 μ	1	0.8
amidon	50 μΜ	1	7

А субстрат на аминопептидаза-А от бозайник

А субстрат на аминопептидаза-М от бозайник

Субфракциониране на H11OD

Разпределението на активностите асоциирани с фракции от йонообменна хроматография на CinAHllOD на MonQ, е 5 показана на фиг.13а и SDS-PAGE на фракциите на фиг.13Ь.

По-нататък ензимни активности са асоциирани със субфракции на H110D, сепарирани чрез рецикличен изоелектрично 10 фоксиран свободен поток (фиг. 14 и 15). При по-ниски стойности на pl (pH 4.5) тези субфракции съдържат само по-голямата от полосите което замества дублета H11OD, видян на SDS-PAge, а при по-високи стой- 15 ности (,К 6.5) те съдържат само по-малката от полосите, което замества дублета H11OD. Междинни фракции съдържат и двете полоси. По-малката полоса също може да се получи, като се раздели фракция чрез йонообменна 20 хроматография на MonQ, използвайки апаратът на Pharmacia SMART. Всички тези субфракции свързват овчи антитела към H11OD афинитетно пречистен на протеин експресиран чрез Agri 1 клон Ml, където 25 антителата елуират Atll, без да свързват прибавка (фиг.14с). Всички субфракции показват микрозомална аминопептидазна активност (фиг.16с), въпреки че тази активност е сравнително ниска във фракциите, 30 добити при най-високите и най-ниските стойности на pl. Тази по ниска активност може да се отдаде на понижени концентрации на протеин, ефекти от крайности на pH при субфракциониране или на по-малките полоси 35 за максимална активност.

Ваксинация с разделени компоненти на H11OD

Разделените високи и ниски полоси, получени чрез изоелектрично фокусиране на свободен поток или чрез йонообменна хроматографи, индуцират формирането на защитни антитела, когато се инжектират на 45 овца, както е илюстрирано в следващият експеримент. Тридесет овце, приблизително на шест месечна възраст, са разпределени на 5 групи по 6, така че всяка група е от сходни по тегло овце. Всяко животно е инжектирано с общо 150 pg протеин, дадени на три равни дози, както е описано от Munn е: al., (1992) и Tavernor at al. (1999а,b) за период от 54 дни. Животните от група L са инжектирани с по-ниската (по-малката) полоса на дублета H110D, тези в група и по-високата полоса, U + L с рекомбинирани по-висока и по-ниска полоси, D - с двете (неразделени) полоси, получени чрез изоелектрично фокусиране на свободен поток при средни стойности на pH и като контролна група (група С) феритин от конски далак (антигенно несвързани протеин). В овцете са въведени 10000 заразни лаври три седмици след третата инжекция и експериментът приключи 29-31 дни след инжектирането. Резултатът от експеримента е сумиран от фиг.16. Инжектиране на всеки от субфракциите редуцира отделяне на добива на паразитни яйца през времето на опита с 90% и редуцира общия брой на ферминтите с 63-84%, показвайки значителна разлика <р<0.05) в сравнение с контролите, използвайки непараметрични статистически анализи. Намалението (70-88%) на броя на женските хелминти е по-голямо в сравнение с това на мъжките, и (с изкл. намалението на броя на мъжките хелминти в овцете, инжектирани с рекомбинирани по-високи и по-ниски полоси, където р<0.07) за двата пола намалението е значително (р<0.05).

Ваксинация с H110D и Н11А

Стволова, водноразтворима форма на H110D (H11S, която запазва своята ензимна активност) може да се получи от природна молекула чрез третиране с еластаза. Установено е, че тази форма съдържа предоминантна АрМ-подобна ензимна активност и екстракт Thesit от еластазно разграден пелет (Н11А) е обогатен за АрА - подобна активност (виж таблица 5).

Таблица 5

Аминопептидаза-М (левицин-NA)	Съотношение Аминопептидаза-А ( а-глутаминова к-на-pNA)
Н110А H11S Н11А	1.44:1 26.0:1 0.48:1

Следният експеримент показва, че ваксинирането на овца с H11S или Н11А дава защита срещу въвеждане на Haemonchus или инфекция. Осемнадесет овце с приблизителна възраст осем месеца са разделени на 3 групи по 6 овце всяка, така че овцете от всяка група да са със сходно тегло. Всяко животно е инжектирано с общо 100 g протеин дадени на две равни дози, както е описано от Munn et al., (1992) и Tavernor et al. (1992 a,b) за период за 23 дни. Животните от група А са инжектирани с Н11А, тези в група S - с H11S и тези в група С - с феритин от конски далак (антигенно несвързани протеин) като негативна контролна група. В овцете са въведени 10000 заразни лаври 25 дни след втората инжекция и експериментът приключи 34-36 дни след инфектирането. Резултатът от експеримента е сумиран на фиг.17. Инжектиране на H11S редуцира отделянето на паразитни яйца през времето на опита с 89% и редуцира общия брой на хелминтите с 76%. Инжектиране на Н11А редуцира отделянето на паразитни яйца през времето на опита с 98% и редуцира общия брой на хелминтите с 85. Те показват значителна разлика (pSO.05) в сравнение с контролите, използвайки непараметрични статистически анализи.

Инхибиране на H110D аминопептидазни активност чрез антитела

Разтвори, съдържащи H110D, са инкубирани със серуми от отделни овце, инжектирана с фракции, съдържащи H110D или от контролна овца. Разтворите след това са подложени на анализа за аминопептидазни активности с фениламин и а-глутаминова киселина-Na, като субстрати. Степента на инхибиране на активност (максимално 80%) J5 корелира с нивото на защита, показани от отделните овце, от която са получени серумите (фиг.18).

Локализация на ензимна активност

Замразени секции от зряла форма на Haemonchus contrtus са изпитани за аминопептидазна активност. Както е показано на фиг.19, аминопептидазни ензимни актив25 ности са локализрани на ломена на червото. Протеин H110D също специфично е намерен на тази локализация.

Експресия на H110D (3.5 PCR клон) с 30 клетъчна

Система еукариотен Baculovirus-Насекомо

Експресиране на аминопептидазна активност в клетки от насекомо

Инфектирани клетки са взети и анализирани за аминопептидазна активност с фе-, лев-, мет-, и лиз-pNA като субстрати. Ана40 лизът е усложнен чрез откритието, че насекомните клетки имат аминопептидазна активност с маркирана преференция за лизин-свързани амидни връзки. Обаче клетъчните екстракти съдържащи експресиран H11OD, допълнител45 но разцепват лев-, мет-, и фе-PNA по този ред на преференция.

Молекулно тегло и имунореактивност на експресирания H11OD (3.5 PCR клон 2) 50 протеин

Проби от инфектирани или контролни клетъчни екстракти са електрофорезирани на 7.5% SDS-поликриламиден гел и след това са оцветени с Coomassie Blue. 3.5-2-P3A и 3.5-2Р4А инфектирани клетъчни лизати имат полоса със същия размер като на H110D, llOkd, които мигрират направо под коекспресираната β-гал., която има молекулно тегло от 120 kd. Тази 120 kd полоса не присъства в нито един от негативните контролни лизати. Полосата също отсъства при Р2А лизата, който не експресира ензимна активност.

Двоен гел е анализиран чрез Western blot и сондиран с анти-HHODN (фиг.21). Много силна, специфична позитивна имунореакция е получена на 110kd полоса експресирана чрез 3.5-2-P3A и 3.5-2-Р4А и на природния H11OD дублет в контролен тракт, съдържаща ConA H11OD - контролен тракт.

Claims

Патентни претенции

1. Молекули нуклеинови киселини, съдържащи една или повече нуклеотидни последователности, които кодират хелминтни аминопептидазни ензими, съответстващи на всички или на част от нуклеотидните последователности ,както са показани на фигури 2,3,4, или 5 (SEQID No: 6-8, 13-15 и 19-21), или последователности, кодиращи хелминтни аминопептидазни ензими, които имат секвенционна идентичност 60% или повече или които се хибридизират с която и да е от посочените последователности при условия от 2 х SSC, 65°С, (където SSC=0.15 М NaCl, 0.015М натриев цитрат, pH 7.2).
2. Молекули нуклеинови киселини съгласно претенция 1, съдържащи една или повече нуклеотидни последователности ,които кодират полипептид, способен да произвежда защитни антитела срещу хелминтни паразити.
3. Молекули нуклеинови киселини съгласно претенция 1 или 2, съдържащи една или повече нуклеотидни последователности, които съответстват на или които са комплементарни на една или повече последователности, подбрани от последователностите на SEQ ID NOS: 1 до 15 и 19 до 21 съответно, както е показано на фигури 2, 3, 4 и 5, или последователности, които имат секвенционна идентичност от 60% или повече или които се хибридизират с която и да е от посочените последователности при условия 2 х SSC, стайна температура (където SSC =0.15 М NaCl, 0.015 натриев цитрат, pH 7.2).
4. Експресионен или клониращ вектор, съдържащ молекула нуклеинова киселина както е определена в която и да е от претенции 1 до 3.
5. Прокариотична или еукариотична клетка, съдържаща молекула нуклеинова киселина както е определено в която и да е от претенции 1 до 3.
6. Метод за получаване на синтетичен полипептид, кодиран от молекула нуклеинова киселина както е определена в която и да е от претенции 1 до 3, който включва култивиране на прокариотична или еукариотична клетка, съдържаща посочената молекула нуклеинова киселина, при условия, при които посоченият полипептид се експресира, и извличане на така получения полипептид.
7. Състав на ваксина за стимулиране на имунния отговор срещу хелминтни паразити по човека или животните, включващ най-малко един вирус или клетка гостоприемник с инсертирана молекула нуклеинова киселина, както е определена в която и да е от претенции 1 до 3, за стимулиране на имунен отговор, насочен спрямо полипептиди, кодирани от инсертираната молекула нуклеинова киселина заедно с фармацевтично приемлив носител.
8. Приложение на молекула нуклеинова киселина, както е определена в която и да е от претенции 1 до 3, получаване на ваксинален състав за стимулиране на имунния отговор срещу хелминтни паразити по хора и животни.
9. Метод за стимулиране на имунен отговор срещу хелминтни паразити в хора или животни включващ прилагането на състав на ваксина, както е дефиниран в претенция 7.
10. Олигозахарид със следната структура

Ман α 1 \

Ман )

Ман В-1,4 Глк NAci31,4 Глк

L (Фнка1)

X..

NAc
11. Олигозахарид съгласно претенция

10 със следната структура

Ман a 1 \ = Ман 13 1----> /⁶ Ман a 1 al Фак

фак al

I

4 TakNAcBI —> 4 Γλκ NAc
12. Олигозахарид съгласно претенция 10 или претенция 11, свързан със синтетичен полипептид, както е дефиниран във всяка една от претенциите 6 до 8.

Приложение: 21 фигури

Литература

1. Andreason, G.L. & Evans, G.A. (1980) Biotechniques 6, 650.

2. Blin, N., & Stafford, D.W. (1976). Nucleic Acids Research 3, 2303-2308.

3. Bowtell, D.D.L., Saint, R.B., Rickard, M.D. & Mitchell, G.F. (1986). Parasitology 93, 599-610.

4. Chomcyznski, P. & Sacchi, N, (1987). Analytical Biochemistry 162, 156-159.

5. Cordingley, J.S., Taylor, D.W., Dunne, D.W.& Butterworth, A.E. (1983) Gene 26, 2539.

6. Devereux, J., Haerberli, S. & Smithies, O. (1984), Nucleic Acids Research 12, 387-395

7. Feinberg, A.P. & Vogelstein, B (1983). Analytical Biochemistry 132, 6-13.

8. Fire, A. (1986) EMBO Journal 5, 26732680.

9. Fire, A. & Waterston, R.H. (1989) EMBO Journal 8, 3419-3428.

10. Francis., M.J. & Clarke, B.E. (1989) Methods in Enzymoloqy 178, 659.

11. Frohman, M.A., Dush, M.K. amd Martin, G.R. (1988). Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington 85, 8998-9002.

12. Gubler, U. & Hoffman, B.J. (1983), Gene 25, 263-265.
13. Han, M. & Sternberg, P.W. (1990) Cell 63, 921-931.
14. Huang, X.-Y. & Hirsch, D. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences Washington 86, 8640-8644.
15. Johnstone, A. and Thorpe, R. (1982) Immunochemistry in Practice. Blackwell Scientific. London.
16. Jongeneel, C.V., Bouvier, J. & Bairoch, A. (1989), FEBS Letters 242, 211-14.
17. Kenny, A.J. & Maroux, S. (1982). Physiological Reviews, 62, 91-128.
18. Kenny, A.J. & Turner, A.J. (1987). Mammalian Ectoenzymes. Elsevier Press, Amsterdam. Volume 14 of Research Monographs in Cell and Tissue Biology, (editors J.T.Dingle & J.L.Gordon).
19. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680685.
20. Lojda, Z, & Gossrau, R. (1980) Histochemistry 67, 267-290.
21. Maniatis, Y., Fritsch, E.F. & Sambrook. 5 J. (1982). Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Publication.
22. Merrifield, R.B. (1964) Biochemistry

3, 1385-1390. 10
23. Munn, E.A., Smith T.S., Graham, M.. Greenwood, C.A., Tavernor, A.S. & Coetzee, G. (1992) Parasitology 106, 63-66.
24. Nachlas, M.M., Crawford, D.T. and Seligman, A.M. (1957). J.Histochem & Cytochem. 15 5, 264-278,
25. Nakane, P.K. & Kawoi, A.K. (1974). Journal of Histochemistry and Cytochemistry’, 22, 1084-1091.
26. Noren, C., Sjostrom, H., Danielsen. 20 E.M., Cowell, G.M. & Skovbjerg, H. (1986). The Enzymes of the Enterocyte Plasma Membrane. In Molecular and Cellular Basis of Digestion. Elsevier Press, Amsterdam, (editors P.Desnuelle.

H.Sjostrom & O.Noren). 25
27. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis.

J. (1989). Molecular Cloning, a Laboratory

Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laborayory Press.
28. Semenza, G. (1986). Annual Review of Cell Biology, 2, 255-313.
29. Smith, D.B. & Johnson, K.S. (1988) Gene 67, 31-40.
30. Spieth, J. MacMorris, M., Broverman, S.. Greenspoon, S. & Blumenthal, JT. (1988) Dev. Biol. 130, 285-293.
31. Tavernor, A.S., Smith, T.S. Langford, C.F., Graham, M. & Munn, E.A. (1999a) Parasite Immunol. 14, 671-675.
32. Tavernor, A.S., Smith, T.S., Langford, C.F., Munn, E.A. & Graham, M. (1992b) Parasite Immunol 14, 645-655.
33. Vallee, B.L. & Auld, D.S. (1990) Biochemistry 29, 5647-5659.
34. Watt, V.M. & Yip. C.C. (1989) Journal of Biological Chemistry 264, 5480-5487.
35. Wopdward, MP, Young, WW Jr and Bioodgood, RA (1985). Detection of Monoclonal Antibodies specific for carbohydrate epitopes using periodate oxodation. J. Immunol. Meth. 8. 143-153.
36. Wu, Q„ Lahti. J.M., Air, G.M., Burrows, P.D. & Cooper, M=D. (1990) Procedings of the National Academy of Sciences, Wasnington S'. 993-997.