NL9001832A - Specifieke sequenties van dna van een nematode die toegepast kunnen worden bij de diagnostiek van infektie met de nematode. - Google Patents

Description

SPECIFIEKE SEQUENTIES VAN DNA VAN EEN NEMATODE DIE TOEGEPAST KUNNEN WORDEN BIJ DE DIAGNOSTIEK VAN INFEKTIE MET DE NEMATODE.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op specifieke sequenties van DNA van een tubulinegen van Haemonchus contortus en delen ervan, op inserties van de sequenties in vectoren en microorganismen en op de toepassing van genoemde sequenties onder andere bij de diagnostiek van infektie met genoemde nematode.

Parasitaire helminthen (wormen) veroorzaken heamonchosis, een van de meest verbreide en ernstige infectieziekten bij mens en dier. Bij landbouwhuisdieren komen infecties voor op alle leeftijden en bijna in ieder bedrijf.

Het gebruik van anthelmintica is wijd verspreid in de diergeneeskunde. In Nederland werd hieraan in 1987 35 miljoen gulden uitgegeven. In 1985 werd in de hele wereld US$ 540 miljoen besteed aan anthelmintica. De totale kosten van parasitaire wormeninfecties bij runderen (anthelmintica, productieverlies etc.) worden in Nederland geschat op 100 tot 200 miljoen gulden per jaar (proefschrift H.W. Ploeger 1988, LU Wageningen).

Er is weinig bekend over de moleculaire biologie van het werkingsmechanisme van de verschillende bestrijdingsmiddelen. Er zijn drie groepen breedspectrumanthelmintica, die ieder hun eigen werkingsmechanisme hebben. Dit zijn i) de benzimidazolen, die waarschijnlijk werken via de binding aan tubuline en daardoor het transport in de cel en de celdeling remmen (Lacey. E. 1988. The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug resistance to benzimidazoles. Int. J. Parasitol. 18, 885-936).

ii) levamisole en morantel, ganglionstimulantia die leiden tot paralyse van de parasiet, en iii) de avermectines, die het remmende effect van gamma-amino-boterzuur (GABA) versterken. GABA is in nematoden de belangrijkste neurotransmitter voor remmende signalen van interneurons naar motor-neurons (Barragry, T. 1984a. Anthelmintics-A Review. N.Z. Vet. J. 32, l6l-l64; Barragry, T. 1984b. Anthelmintics-review Part II. N.Z. Vet. J. 22, 191-199).

Van deze drie worden de benzimidazolen het meest gebruikt.

Wij hebben onder toepassing van moleculair biologische technieken een van de meest schadelijke schapen maag-darm parasieten onderzocht:

Haemonchus contortus. Deze komt wereldwijd voor, veroorzaakt haemon-chosis, en zorgt voor een schade van 50 miljoen gulden per jaar bij de Nederlandse schapenhouderij.

Met het oog op een doeltreffende bestrijding van dit schadelijke organisme is een gevoelige en betrouwbare methode voor het opsporen van deze worm onontbeerlijk. De infecties met parasitaire wormen bij schapen zijn meestal menginfecties en derhalve is er een methode nodig die H. contortus van de andere aanwezige parasitaire wormen kan onderscheiden. De methoden die nu toegepast worden voor de diagnose van H. contortus zijn: 1) de waarneming van de specifieke ziekteverschijnselen bij het schaap, en 2) de differentiatie van de larvenkweek uit faeces van het schaap.

Een nadeel van 1) is gelegen in het feit dat de klinische diagnose van een infectie met parasitaire maag-darmwormen moeilijk te stellen is, omdat de ziekteverschijnselen niet altijd te onderscheiden zijn van die van andere ziekten of slechte voeding. Bij H. contortus zijn de uiterlijke ziekteverschijnselen (o.a. anemie en oedeem) pas waarneembaar bij een hoge infectiegraad, terwijl er al schade (gewichtsverlies, wolverlies, melkverlies) veroorzaakt wordt bij een infectie zonder deze uiterlijke ziekteverschijnselen.

Een nadeel van methode 2) is gelegen in het feit dat de eieren van diverse nematoden in de faeces van geïnfecteerde dieren erg op elkaar lijken, waardoor het bij eieren niet mogelijk is een diagnose op worm-soort te stellen. Hiertoe moet eerst een larvenkweek worden uitgevoerd, hetgeen ongeveer een week duurt. In de praktijk wordt deze methode weinig toegepast (Janssens, P.G., Vercruysse, J., Jansen, J. uitg.: Wormen en wormziekten bij mens en dier (1989) Samsom Stafleu, Alphen aan de Rijn/Brussel).

Er is dus een nieuwe, snelle en soortspecifieke test nodig om de diagnose van besmetting met H. contortus te kunnen stellen. Bij andere nematoden zijn er een aantal tests die worden toegepast, zoals: a) de dot-blot-assay b) de polymerasekettingreactie (PCR).

De dot-blot-assay is zeer gevoelig en levert snel resultaten, zoals bijvoorbeeld bij de diagnostiek van de humane nematode Brugia, die filariasis veroorzaakt (McReynolds, L.A., deSimone, S.M., Williams, S.A. (1986) Cloning and comparison of repeated DNA sequences from the human filarial parasite Brugia pahangi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 797-801). Bij deze test wordt totaal DNA van de eieren op een nylon membraan gebracht en wordt het gehybridiseerd met de specifieke DNA-probe.

Bij de PCR kunnen specifieke DNA-sequenties als primer worden toegepast, waardoor een gedeelte van het specifieke gen geamplificeerd wordt. Dit is zichtbaar te maken door het reactiemengsel te analyseren met behulp van een agarosegel, of door een marker (fluorescerend) aan de primer te koppelen (De Bruijn, M.H.L.,(1988) Diagnostic DNA amplification: no respite for the elusive parasite. Parasitol. Today, 4:293-295)♦ Tot dusver is er geen DNA van Haemonchus contortus bekend dat specifiek is voor de soort en derhalve zijn deze tests niet mogelijk voor de diagnose van besmetting met H. contortus. Verrassenderwijs is gevonden dat DNA coderend voor tubuline soortspecifiek is voor H. contortus.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een DNA sequentie van een tubulinegen van H. contortus of een deel daarvan. De DNA-sequen-tie van het tubulinegen of een deel daarvan omvat het alfa-tubulinegen van H. contortus of een deel daarvan of het beta-tubulinegen van H. contortus of een deel daarvan.

Een DNA-sequentie volgens de uitvinding kan als probe worden gebruikt voor het specifiek opsporen van H. contortus, met name ook in menginfecties. Probes die deze sequenties of delen daarvan omvatten reageren specifiek met H. contortus, waarbij een probe die een DNA-sequentie van een beta-tubulinegen of een deel daarvan omvat de voorkeur verdient.

De onderzochte beta-tubulineprobes reageren steeds positief op de aanwezigheid van H. contortus, ook in geval van een menginfectie. De beta-tubulineprobe van H. contortus werd ook op het DNA van andere, veel voorkomende, schapeparasieten uitgetest en het bleek dat deze reactie veel minder sterk was dan met de eigen soort. De soorten die o.a. getest werden zijn: Cooperia circumcincta, Nematodirus battus, Nippostrongylus brasiliensis, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus colubriformis, Trichostrongylus vitrinus, Trichinella spiralis en Trichinella nativa.

Door uit een DNA-sequentie volgens de uitvinding een specifieke sequentie van bijvoorbeeld tenminste 10 nucleotiden te kiezen, die alleen met H. contortus reageert, kan een test opgezet worden, waardoor het, bij een menginfectie met nematoden, mogelijk wordt op het DNA van de eieren een diagnose van besmetting met H. contortus te stellen.

Voorbeelden van tests die kunnen worden toegepast zijn die, die bij andere nematoden zijn toegepast: a) de dot-blot-assay b) de polymerasekettingreactie (PCR).

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor de diagnose van een worminfectie, waarbij men het totaal DNA van de eieren van de nematode brengt op een nylon membraan en hybridiseert met een DNA-probe, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men een diagnose van infectie met Haemonchus contortus stelt, waarbij men als DNA-probe een sequentie toepast die overeenkomt met een tubulinegen van H. contortus of een deel daarvan. Een voorkeurs werkwijze is die waarbij men specifieke stukken DNA uit het DNA van de eieren amplificeert, bijvoorbeeld door middel van PCR, en deze zichtbaar maakt. De diagnose van een infectie met H. contortus kan gesteld worden doordat de amplificatie van specifieke stukken alleen werkt wanneer er H. contortus DNA in het eieren monster aanwezig is en er primers gebruikt worden die soortspecifiek zijn voor H. contortus, zoals een primer die overeenkomt met ten minste een deel van een tubulinegen van H. contortus. De uitvinding heeft verder betrekking op een kit voor het uitvoeren van een dergelijke werkwijze, welke kit een DNA-sequentie volgens de uitvinding omvat en tevens voorzien is van andere middelen en materialen, die voor een deskundige op dit gebied duidelijk zullen zijn.

De sequenties volgens de uitvinding zijn ook bruikbaar wanneer zij in een vector zijn ingebouwd, waarbij de voorkeur uitgaat naar een expressievector. De uitvinding heeft betrekking op dergelijke vectoren alsmede op recombinant microorganismen die een DNA-sequentie volgens de uitvinding omvatten.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een peptide dat tenminste een gedeelte van de aminozuursequentie, die door een DNA-sequentie volgens de uitvinding wordt gecodeerd, omvat.

Peptiden van bijvoorbeeld tenminste 15 aminozuren zijn geschikt als antigeen, bijvoorbeeld voor het opwekken van specifiek antiserum, of monoclonale antilichamen tegen H. contortus. De uitvinding heeft betrekking op deze antistoffen. Dergelijke antistoffen kunnen eveneens worden toegepast voor het diagnostiseren van een besmetting met Haemonchus contortus. De uitvinding heeft betrekking op deze toepassing, alsmede op de toepassing van de antistoffen in een kit voor de diagnose van besmetting met H. contortus.

VOORBEELD

Constructie van de genenbanken van H. contortus en analyse van de tubu-linekloons

Genomisch DNA werd gemaakt van L3 larven volgens de methode van Coulson et al. (Coulson, A., Sulston, J., Brenner, S. en Karn, J.(1986)

Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7821-7825). De grootte van de te kloneren stukken DNA bedroeg 20 kb. Teneinde willekeurige fragmenten van deze grootte te verkrijgen werd een partiële digestie uitgevoerd met een restrictie-enzym dat vaak knipt in genomisch DNA. De concentratie van het enzym werd hiertoe gekozen zoals beschreven wordt in Maniatis et al. (Maniatis. T., Fritsch. T. en Sambrook. J. (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., USA). Deze stukken werden geïsoleerd en geligeerd in het DNA van de bacteriofaagarmen van EMBL3 volgens de methode van Frischauf et al. (Frischauf, A.M., Lehrach. H., Poustka, A., Murray, N. (1983) Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol, 170, 827-841). Dit DNA-construct werd vervolgens in bacteriofaag eiwitomhul-sel verpakt en toegepast om de bacteriestam Le 392 te infecteren. De geïnfecteerde bacteriën werden uitgeplaat met niet geïnfecteerde bacteriën en na incubatie bij 37 °C was een plaque zichtbaar op de plek waar zich geïnfecteerde bacterie bevond ( Frischauf, A.M., Lehrach, H., Poustka, A., Murray, N. (1983) Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol. 170, 827-841). Vervolgens werd de plaque gescreened volgens de methode van Maniatis et al. (Maniatis. T., Fritsch, T. en Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., USA).

Om de alfa-tubuline-DNA bevattende kloons te isoleren werden als probes voor tubuline kippen alfa-tubuline, [zoals beschreven in Valenzuela et al. (Valenzuela, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Rutter, W.J., Kirshner, M.W. en Cleveland, D.W. (1981) Nucleotide and corresponding amino acid sequences encoded by alfa and beta tubulin mRNA's. Nature 289, 650-655)] en Drosophila hydei alfa-tubuline [een gift van dr R. Brand, van de K.U.N. te Nijmegen (Michiels, F., Falkenburg, D., Muller, A.M., Hinz, U., Otto, U., Bellmann, R., Glazer, K.H., Brand, R., Bialojan, S. en Renkawitz-Pohl, R. (1987) Testis-specific beta2 tubulins are identical in Drosophila melanogaster and D. hydei beta differ from the ubiquitous betal tubulin)] gebruikt.

Om de beta-tubuline-DNA bevattende kloons te isoleren werden als probes voor beta-tubuline een beta-tubulinekloon van Caenorhabditis elegans, Ben-1 [die beschreven wordt in Driscoll et al. (Driscoll, M., Dean, E., . Reilly, E., Bergholz, E. en Chalfie, M. (1989) Genetic and molecular analysis of a Caenorhabditis elegans beta tubulin that conveys benzimidazole sensitivity. J. Cell Biol. 109, 2993-3003.)] en een beta-tubuline kloon van Drosophila hydei pTB5 [een gift van Dr. R. Brand, K.U.N.

Nijmegen (Michiels, F., Falkenburg, D., Muller, A.M., Hinz, Ü., Otto, U., Bellmann, R., Glazer, K.H., Brand, R., Bialojan, S. en Renkawitz-Pohl, R. (1987) Testis-specific beta2 tubulins are identical in Drosophila melanogaster and D. hydei beta differ from the ubiquitous betal tubulin)] gebruikt.

Van de aldus verkregen kloons werden, voor alfa-tubuline, de kloon pEMBL8cA (gedeponeerd bij het CBS te Baarn onder nr. CBS 335*90) en, voor beta-tubuline, de kloon pEMBL7aB (gedeponeerd bij het CBS te Baarn onder nr. CBS 33^.90) verder gekarakteriseerd. Subkloons hiervan, die voor eiwit coderende stukken DNA bevatten, werden in de vectoren Blue-script en M13 geconstrueerd. Het DNA van deze subkloons werd gesequenced met behulp van de dideoxymethode van Sanger et al. (Sanger, F., Nicklen, S. en Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA j4, 5463-5467) zoals gemodificeerd in de T7 sequencing kit van Pharmacia en de M13 sequencing kit van Amersham. Er werden standaard primers gebruikt, die bij de kits geleverd werden. De analyse en vergelijking van de aldus verkregen sequenties werden met computerprogramma’s Microgenie ( Beekman) en PC/Gene (Geno-fit, Geneve) uitgevoerd. De sequenties die van deze kloons bepaald zijn, worden weergegeven in respektievelijk figuren 1 en 2.

De voor H. contortus specifieke PCR.

Er werden oligonucleotiden, 20-meren gesynthetiseerd voor de DNA-volgorde van beta-tubuline van H. contortus. De betal primer is gelokaliseerd van aminozuur 223 tot aminozuur 229 en de beta2 primer, op de andere streng, is gelokaliseerd van aminozuur 420 tot aminozuur 427· De methode voor PCR werd toegepast volgens Ehrlich et al. ( Saiki, R.K.,(1989) in: PCR technology, principles and applications for DNA amplification. Erlich, H.A. (ed.), Stockton Press, New York, London, biz 7-16. De in de onderhavige uitvinding toegepaste reactieomstandigheden die gebruikt zijn om het DNA te amplificeren zijn: annealing-temperatuur van 6leC gedurende 30 seconden, elongatie bij 72°C gedurende 2 minuten en denaturatie bij 95°C gedurende 30 seconden. Deze methode amplificeert het beta-tubuline van H. contortus uit het genomisch DNA, hetgeen zichtbaar te maken is door electroforese in een agarosegel. Deze methode werkt niet bij Ostertagia, Trichstrongylus en Trichinella, hetgeen duidelijk maakt dat deze PCR-methode met de boven genoemde primers specifiek is voor Haemonchus contortus.

Claims (16)

1. DNA-sequentie van een tubulinegen van Haemonchus contortus of een deel daarvan.

2. DNA-sequentie van het beta tubuline gen van Haemonchus contortus of een deel daarvan.

3. DNA-sequentie volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat deze de nucleotidevolgorde volgens fig. 2 of een deel daarvan omvat: DNA-sequentie volgens conclusie 3» «et het kenmerk, dat deze verkrijgbaar is uit kloon pEMBL7aB (gedeponeerd bij het CBS te Baarn onder nr.CBS 33^*90).

5. DNA-sequentie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat deze de nucleotidevolgorde volgens fig. 1 of een deel daarvan omvat:

6. DNA-sequentie volgens conclusie 5* «et het kenmerk, dat deze verkrijgbaar is uit kloon pEMBL8cA (gedeponeerd bij het CBS te Baarn onder nr.CBS 335*90). 7* Werkwijze voor de diagnose van een worminfectie, waarbij men het totaal DNA van de eieren van de nematode op een (nylon) membraan brengt en hybridiseert met een DNA probe, met het kenmerk, dat men een diagnose van infectie met Haemonchus contortus stelt, waarbij men als DNA-probe een sequentie toepast die tenminste een sequentie volgens een van de voorgaande conclusies omvat.

8. Werkwijze voor de diagnose van een worminfectie, waarbij men DNA uit het totaal DNA van de eieren van de nematode amplificeert, met het kenmerk, dat men een diagnose van infectie met Haemonchus contortus stelt, waarbij men als primer een DNA-sequentie toepast die tenminste een DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 omvat.

9. Peptide dat tenminste een gedeelte van de aminozuursequentie die door een DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 gecodeerd wordt omvat.

10. Vector die tenminste een DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 omvat.

11. Vector volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat deze een ex-pressievector is die de DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 tot expressie kan brengen.

12. Recombinant microorganisme dat een DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 of een vector volgens conclusie 10 of 11 omvat.

13. Antilichaam dat is opgewekt tegen een peptide volgens conclusie 9*

14. Toepassing van een antilichaam volgens conclusie 13 voor het diagnostiseren van een besmetting met Haemonchus contortus.

15. Vaccin ter bescherming tegen of bestrijding van Haemonchus contortus, dat een peptide volgens conclusie 9 of een vector volgens conclusie 11 of een recombinant microorganisme volgens conclusie 12 omvat.

16. Vaccin ter bestrijding van Haemonchus contortus. dat een antilichaam volgens conclusie 13 omvat.

17. Kit voor het stellen van een diagnose van besmetting met Haemonchus contortus. welke een antilichaam volgens conclusie 13 omvat.

18. Kit voor het stellen van een diagnose van besmetting met Haemonchus contortus, welke een DNA-sequentie volgens een van de conclusies 1-6 omvat.