"PROCEDE DE CRISTALLISATION DE CEPHALEXINE ET PRODUITS OBTENUS".
La présente invention concerne un procédé pour la
production de cristaux prismatiques de monohydrate de céphalexine
à partir d'une solution aqueuse contenant de la céphalexine obtenue
par réaction d'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique avec
de la D-phénylglycine ou des dérivés de celle-ci à l'aide d'un
système enzymatique microbien. L'invention concerne également
les cristaux prismatiques de monohydrate de céphalexine obtenus
<EMI ID=1.1> La céphalexine est un terme générique pour un composé
<EMI ID=2.1>
céphèm-4-carboxylique :
<EMI ID=3.1>
Ce composé constitue l'un des antibiotiques du groupe de la céphalosporine et a été jusqu'à présent produit par voie semisynthétique.
En fait, le groupe 7-amino de l'acide 7-aminocéphalosporànique (7-ACA) qui est obtenu par un procédé microbiologique, est acylé avec une forme d'anhydride mixte de D-phénylglycine dans laquelle le groupe amino libre a été protégé par un groupe protecteur convenable, pour former l'acide 7-(D-a-(amino bloqué)phénylacétamido)-céphalosporanique et en hydrogénolysant ce dernier composé pour le transformer en céphalexine ou en
<EMI ID=4.1>
demande de brevet japonais mise à l'inspection publique 18892/<1>972).
On a développé récemment un procédé pour produire
de la céphalexine à partir de D-phénylglycine ou d'un ester de celle-ci et d'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique à l'aide
<EMI ID=5.1>
<EMI ID=6.1>
25388/1972, brevet belge 781552). Comparée à la méthode de synthèse chimique, la méthode microbiologique présenterait l'avantage que la réaction se produit avec une sélectivité accrue et des rendements améliorés. Cependant, dans cette dernière méthode, du fait que la réaction se produit exclusivement dans la phase aqueuse, il est essentiel d'effectuer l'évaporation de
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
admissibles.
Pour récupérer la céphalexine obtenue par la méthode de synthèse chimique, certaines procédures ont été décrites y compris celles.exposées dans le brevet américain 2.531.481
<EMI ID=9.1>
le chlorhydrate, est maintenu dans un milieu aqueux à une tempéra-
<EMI ID=10.1>
convenable telle que l'hydroxyde d'ammonium pour produire des cristaux de céphalexine en forme de plaque . Il est par conséquent connu qu'à des températures inférieures à 58[deg.]C, il se forme exclusivement des aiguilles non stables encombrantes du .dihydrate mais lorsque la température de maintien est accrue, la décomposition de céphalexine est accélérée pour produire des cristaux bruns sales. ' De plus, la demande de brevet japonais mise à l'inspection publique prémentionnée 18892/1972 décrit qu'un complexe de N,N-diméthylformamide ou de N,N-diméthyl-acétamide et de
céphalexine obtenu par la méthode de synthèse chimique est dissous
<EMI ID=11.1>
chauffée à une température de 40 à 70[deg.]C pour décomposer le complexe et le pH est ajusté par une base à environ 4,5 à 5,0 de façon à provoquer la précipitation du Zwitter-ion brut de monohydrate de céphalexine.
Par conséquent, on a admis comme une pratique établie que la cristallisation de la céphalexine à partir d'une solution de céphalexine qui est obtenue chimiquement, doit s'effectuer
<EMI ID=12.1>
On a cependant découvert que lorsqu'une solution aqueuse de céphalexine obtenue à l'aide d'un système enzymatique microbiel est amené à cristallisé à une température qui n'est pas inférieure à 40[deg.]C par le mode opératoire précité, la décomposition de la céphalexine est tellement importante et la décoloration des cristaux est tellement grande que la production d'un monohydrate ne peut pas se faire de manière satisfaisante.
Dans ces circonstances, la demanderesse s'est attachée à empêcher une telle décomposition et décoloration des cristaux et de cette manière d'obtenir des cristaux qui, de plus, sont stables. Il est apparu que par la procédure de concentration d'une telle solution aqueuse contaminée de céphalexine obtenue en utilisant un système enzymatique microbien et en maintenant
<EMI ID=13.1>
du point isoélectrique, l'on peut provoquer la croissance et la séparation de cristaux prismatique de dihydrate de céphalexine, et par un séchage ultérieur du dihydrate ainsi obtenu pour le transformer en monohydrate, il est possible de récupérer des cristaux de monohydrate avec facilité à partir d'une solution contaminée.
La présente invention repose sur ces éléments. L'invention concerne par conséquent un procédé pour la production d'un produit antibiotique caractérisé en ce qu'une solution aqueuse contenant de la céphalexine que l'on peut obtenir en faisant réagir de l'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique
avec de la D-phénylglycine ou un dérivé réactif de D-phénylglycine à l'aide d'un système enzymatique microbien, est concentrée et est ensuite maintenue à proximité du point isoélectrique de la céphalexine et entre environ 25 et 35[deg.]C pour provoquer la séparation du dihydrate de céphalexine sous forme de prismes,
<EMI ID=14.1>
Selon la présente invention, on emploie une solution aqueuse contenant de la céphalexine que l'on peut obtenir à
l'aide d'un système enzymatique microbien. Par système enzymatique microbien, il faut entendre des cellules microbiennes obtenues
par culture d'un microorganisme qui est capable de synthétiser
la céphalexine en catalysant la réaction d'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique avec la D-phénylglycine ou un dérivé réactif de D-phénylglycine, ledit organisme étant choisi parmi les nombreux microorganismes mentionnés dans ladite demande de brevet japonaise mise à l'inspection publique 25388/1972, c'est-à-dire appartenant au genre Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Xanthomonas, Pseudomonas, Aeromonas, Escherichia, Staphylococcus, Arthrobacter, Proteus, Corynebacterium, Flavobacterium, Clostridium, Spirillum et Bacillus, et les matières traitées dérivées de telles cellules microbienn es qui sont obtenues en traitant les cellules pour autant
".
cependant qu'il ne soit pas porté atteinte à leur activité enzymatique.
Les procédés pour la culture de tels microorganismes peuvent être une quelconque culture agitée aérée, une culture
à secousses ou une culture stationnaire, bien que la culture aérobique soit généralement préférée. Pour ce qui concerne des facteurs tels que la composition du milieu de culture, la température d'incubation, le pH de culture, les conditions décrites dans ladite demande de brevet mise à l'inspection publique peuvent être utilisés.
Bien que la durée de culture dépend de facteurs
tels que la race microbienne individuelle, il est avantageux de suspendre la culture au moment où l'activité de synthèse de céphalexine a atteint un niveau de sommet qui est approximativement entre la seconde moitié de la phase de croissance logarithmique
et la première moitié de la phase stationnaire des microorganismes. Généralement, une durée de 8 à 30 heures est convenable.
Pour récupérer les cellules microbiennes du bouillon de culture, des procédures classiques telles que la centrifugation, la filtration etc. peuvent être utilisées. Le dérivé réactif
de D-phénylglycine qui est l'un des composés de départ est un dérivé qui est capable de réagir avec l'acide 7-aminodésacéto�céphalosporanique pour donner de la céphalexine sous l'influence dudit système enzymatique microbiel, des dérivés donnés à titre d'exemple étant les alkyles, par exemple méthyle, éthyle etc.,
les esters, les esters avec las thiols comme par exemple l'acide thioglycolique et les amides de D-phénylglycine.
Bien que la solution aqueuse contenant la céphalexine qui est obtenue de cette manière puisse être directement soumise aux étapes de concentration et de cristallisation ultérieures, il est souhaitable généralement d'appliquer certains-traitements de purification simples à la solution avant qu'elle soit soumise à l'étape ultérieure. Ainsi, du fait que la solution aqueuse
de céphalexine contient, en plus des cellules microbiennes, de
<EMI ID=15.1>
de l'acide 7-aminocéphalosporanique etc., il est conseillable
de retirer les cellules microbiennes du système réactionnel en premier lieu, de soumettre ensuite le filtrat ou le liquide surnageant à une chromatographie d'adsorption, par exemple sur
du charbon actif ou une résine pour garder la fraction céphalexine adsorbée sur l'adsorbant et l'éluer avec un solvant tel qu'un
mélange d'eau et d'alcool.
Ensuite, la solution aqueuse de déphalexine est
soumise au traitement de concentration et de cristallisation.
Cette concentration est prévue pour faciliter la cristallisation subséquente du dihydrate. Il est, par conséquent, nécessaire de s'assurer qu'il ne se formera pas de cristaux pendant ce traitement.. Un exemple de corrélation de pH, de solubilité et de stabilité
de la céphalexine est représenté dans l'essai n[deg.] 1. Ainsi, du fait que la céphalexine ne se dissout pas facilement à proximité de son point isoélectrique, il y a lieu d'effectuer la concentration à un pH qui ne soit pas à proximité dudit point isoélectrique. Cependant, de manière que la céphalexine ne se décompose pas autant que possible et pour obtenir un produit aussi concentré que possible, il est préférable, en tenant compte de la solubilité et de lastabilité de la céphalexine, d'effectuer la réaction du côté acide du point isoélectrique, c'est-à-dire approximativement à un pH d'environ 1,0 à 3,0.
La solution concentrée est maintenue à proximité
du point isoélectrique et à environ 25 à 35[deg.]C, ce qui provoque
la séparation du dihydrate de céphalexine sous forme de prismes.
La proximité du point isoélectrique est de préférence dans le domaine de pH d'environ 3,5 à 4,8, le point isoélectrique de la céphalexine étant 4,3.
Les domaines optimaux de pH et de température pour l'apparition du dihydrate sont indiqués dans l'essai n[deg.] 2.
Lorsque la température est en-dessous du domaine indiqué, par exemple 20[deg.]C, le produit est amorphe ou, lorsqu'il
est cristallin, il donne des aiguilles qui sont très difficiles
à séparer des eaux-mères et qui, par suite de leur hygroscopicité, ne conviennent pas pour être transformées en des produits pharmaceutiques: Lorsque la cristallisation est.effectuée à une température de 40[deg.]C ou plus, les cristaux, pour autant qu'ils
soient obtenus, sont fortement colorés et par conséquent, de telles conditions ne sont pas utilisables en pratique. De plus, la cristallisation est très difficile lorsque le pH s'éloigne de la proximité du point isoélectrique soit du côté acide, soit du
côté alcalin.
A cet égard, même si un échantillon de céphalexine obtenu par la méthode de synthèse chimique classique est maintenu dans les conditions optimales pour l'apparition de prismes de dihydrate selon la présente invention (pH 3,5-4,8, température
25-35[deg.]C), on obtient seulement des aiguilles qui sont hygroscopiqueset instables (voir essai n[deg.] 3 et figure 1) et lion-n'obtient pas
de prismes de dihydrate. Bien que la raison-n'en soit pas encore élucidée, il semble y avoir une influence fortuite des impuretés concomitamment présentes dans le concentrat contenant la céphalexine obtenue à l'aide du système enzymatique microbien
qui provoque, l'apparition de prismes même à une température
aussi basse que 25 à 35[deg.]C. Par conséquent, l'invention concerne
un procédé qui est spécifiquement applicable aux concentrats contenant de la céphalexine obtenus par l'utilisation de systèmes enzymatiques microbiens.
Les prismes de dihydrate de céphalexine dont on a provoqué l'apparition sont transformés en monohydrate par séchage.
A l'égard de cette opération de séchage, le même monohydrate
est obtenu que les prismes soient séchés à basse température inférieure à 5[deg.]C ou qu'ils soient séchés à une température supérieure. Cependant, les deux types de cristaux présentent
des spectres de diffraction aux rayons X différents, bien qu'ils
ne soient pas différenciables dans toutes les autres propriétés physiques et chimiques.
Le monohydrate obtenu par séchage des prismes à
une température qui n'est pas supérieure à 5[deg.]C sera désigné
comme le type a tandis que le monohydrate obtenu par séchage des prismes à une température supérieure constituera les cristaux
<EMI ID=16.1>
prismes de dihydrate à une température qui n'est pas supérieure à 5[deg.]C, d'effectuer le séchage sur un agent de séchage tel que l'anhydride phosphorique ou le chlorure de calcium. Bien que
les cristaux du type p sont obtenus par séchage de prismes de dihydrate à une température supérieure à 5[deg.]C, le séchage à une température qui n'est pas de beaucoup supérieure à 5[deg.]C, par exemple
<EMI ID=17.1>
de monohydrate résultant tendent à être contaminés par des cristaux du type a. Par conséquent, il est préférable pour obtenir des cristaux du type de sécher dans le voisinage de la température ordinaire, et de préférence à une température de 20 à 30[deg.]C et
il est recommandable pour obtenir des cristaux du type 13 d'effectuer le séchage sous pression réduite. Les spectres de diffraction aux rayons X de chacun de ces types de cristaux sont repris dans le tableau 1.
Dans la pratique de l'invention, n'importe lequel
de ces monohydrates peut être obtenu, chacun d'eux étant des prismes qui sont stables et faciles à manipuler et convenant
pour être incorporés dans des produits pharmaceutiques.
TABLEAU 1
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1>
Essai n[deg.]
Solubilité et stabilité de la céphalexine. Modes opératoires
Les solubilités ont été déterminées comme suit.
Des parties aliquotes de solution de céphalexine concentrée de l'exemple 1 sont réglées à différents pH à l'aide
<EMI ID=20.1>
16 heures. Ensuite, la teneur en céphalexine de chaque fluide surnageant a été mesurée.
Les stabilités ont été établies comme suit. Des parties aliquotes des mêmes concentrats que l'exemple 1 sont amenées à différentes valeurs de pH à l'aide de NaOH et de HC1 et diluées pour obtenir une concentration en
<EMI ID=21.1>
au repos à 35[deg.]C pendant 24 heures, après quoi la teneur résiduelle en céphalexine a été mesurée et représentée en pourcentage par rapport à la teneur initiale. Résultats
<EMI ID=22.1>
Essai n[deg.] 2
pH et température pour la préparation des cristaux de dihydrate de céphalexine.
Modes opératoires
Des parties aliquotes du concentrat obtenu dans l'exemple 1 (contenant 10 % (Poids/Volume) de céphalexine) sont maintenues à différentes températures et valeurs de pH reprises dans le tableau qui suit et l'apparition ou la non-apparition de prismes de dihydrate a été déterminée.
Résultats
<EMI ID=23.1>
Essai n[deg.] 3
Comparaison des conditions de cristallisation d'échantillon de céphalexine selon la méthode de synthèse chimique (demande de brevet japonais mise à l'inspection publique N[deg.] 18892/1973) par comparaison à l'échantillon obtenu en utilisant un système enzymatique microbien. Conditions de cristallisation pour la production de dihydrate
Chacun des échantillons est ajusté à pH 1,0 et
<EMI ID=24.1>
<EMI ID=25.1>
et est ensuite laissé au repos à 30[deg.]C.
Résultats
Lorsque l'échantillon obtenu par la méthode de synthèse chimique est cristallisé, on obtient des aiguilles comme l'indique la photographie de la figure 1 (agrandissement 200 fois). D'autre part, avec l'échantillon obtenu à l'aide d'un système enzymatique microbien, on obtient des prismes comme ceux représentés dans la photographie de la figure 2 (agrandissement 200 fois).
Exemple 1
Une mesure d'Acetobacter turbidans IFO-3225 provenant d'une culture penchée de 3 jours est utilisée pour inoculer
100 ml d'un milieu (pH 7,0) formé par 1,0 % de polypeptone, 1,0 % d'éxtrait de viande et 0,5 % de chlorure de sodium, et on effectue
<EMI ID=26.1>
est ensuite inoculée dans 5 litres d'un milieu (pH 7,0) formé par 3,0 % de dextrine, 2,5 % d'une liqueur de macération de mais, 0,2 % de P04H2K , 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,001 % de sulfate ferreux, 0,001 % de sulfate de manganèse, 0,2 % de chlorure de sodium et une petite quantité d'un agent antimoussant, le milieu inoculé étant incubé à 28[deg.]C sous agitation pendant 24 heures. Les cellules sont recueillies par centrifugation et mises en suspension dans un litre d'eau. A cette suspension, on ajoute
4 litres d'une solution aqueuse à pH 6,0 (réglée par NaOH 2N) contenant 50 g d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique et
125 g du chlorhydrate de l'ester méthylique de D-phénylglycine, en permettant à la réaction de s'effectuer à 30[deg.]C et à pH 6,0 en agitant pendant 2 heures. Un test biologique du mélange réactionnel indique que 65 g de céphalexine s'étaient formés.
<EMI ID=27.1>
immédiatement centrifugé pour éliminer les cellules. Le liquide surnageant passe dans deux colonnes disposées en série, l'une d'elles ayant reçu 850 ml d'une résine échangeuse d'ions cationiques fortement acides du type sulfonate (Amberlite IR-120B (forme Na, Rohm & Haas Co., U.S.A.)), et l'autre colonne ayant reçu 2,8 litres de carbone activé de pureté chromatographique (Takeda Chemical Industries, Ltd. Japon). Les colonnes sont ensuite rincées en
série par 14 litres d'eau pure et la colonne ayant reçu le charbon actif chromatographique est éluée par 14 litres d'une solution aqueuse à 7 % de n-butanol à SV = 1,0 (le débit par heure qui est équivalent au volume du carbone activé compressé). L'analyse
du produit élué indique qu'il contient en plus de 61 g de céphalexine, de petites quantités de D-phénylglycine, d'acide
<EMI ID=28.1>
<1> 14 litres de cette solution contenant la céphalexine contaminée
<EMI ID=29.1>
obtenir 300 ml.
Ensuite, en agitant à une température constante de
35[deg.]C, le concentrat est neutralisé à pH 4,5 (point isoélectrique de la céphalexine) avec NaOH 1N, ce qui permet d'obtenir une boue de cristaux de céphalexine prismatique blancs. Les cristaux sont séparés par centrifugation et lavés par de l'eau. Le mode opéra- toire permet d'obtenir des prismes de dihydrate de céphalexine présentant une teneur en eau de 9,6 % (2 moles) déterminée par
la méthode de titration Karl Fischer. Le dihydrate prismatique
est divisé en deux parties égales et une de ces parties est séchée
à vide à 20[deg.]C pendant 10 heures, ce qui permet d'obtenir 26 g de cristaux de céphalexine qui présentent une densité élevée, ne
sont que faiblement hygroscopiques et qui sont stables. La teneur
en eau selon Karl Fischer de ces cristaux était de 4,8 % (1 mole)
et leur spectre de diffraction aux rayons X était en accord avec celui du monohydrate de céphalexine type 0 représenté dans la <EMI ID=30.1>
Le spectre de résonance magnétique nucléaire (NMR) de ces cristaux indique qu'ils sont de très grande pureté..L'autre moitié des prismes de dihydrate est séchée sur de l'anhydride phosphorique dans un réfrigérateur à 5[deg.]C pendant 16 heures. Dans ce cas, on obtient 25,5 g de prisme de monohydrate. La teneur en eau de ces cristaux selon Karl Fischer était de 4,5 % et leur spectre de diffraction aux rayons X est en accord complet avec les cristaux
du type a du tableau 1.
Toutes les autres propriétés physiques et chimiques sont en accord complet avec celles des cristaux séchés sous vide. On n'observe pas de différence significative en ce qui concerne
la densité et les valeurs de l'essai d'absorption-désorption d'humidité.
Exemple 2-
Un mélange réactionnel contenant 65 g de céphalexine qui a été obtenu dans les mêmes conditions réactionnelles que celles décrites dans l'exemple 1, est amené à pH 4,5 avec de
l'HCl 2N et subit une filtration par aspiration en utilisant un filtre-presse préenrobé avec de la terre de diatomée pour éliminer les cellules microbiennes. Le filtrat passe par une série de deux colonnes, l'une ayant été remplie avec un litre d'une résine échangeuse d'ions cationiques fortement acides du type sulfonate
(Amberlite IR-120b (forme Na, Rohm & Haas Co.)) et l'autre colonne ayant reçu 17 litres d'un adsorbant synthétique non-ionique
(XAD-II (Rohm & Haas Co.)). Les séries de colonnes sont ensuite rincées par 17 litres d'eau pure. Dans les lavages aqueux on a
mis en évidence de la D-phénylglycine et une petite quantité d'acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique. Ensuite les colonnes sont séparées l'une de l'autre et la colonne d'adsorbant synthétique non-ionique qui a essentiellement adsorbé la céphalexine est éluée successivement à SV=1,0 par 17 litres de méthanol à 20 % et
34 litres de méthanol à 50 %.
Les fractions contenant la céphalexine sont rassemblées, amenées à pH 2,0 par HC1 2N et concentrées sous vide pour obtenir
<EMI ID=31.1>
Tandis que la solution concentrée est maintenue à
<EMI ID=32.1>
30 minutes et jusqu'à ce que le pH soit de 4,5, ce qui provoque
la séparation du dihydrate de céphalexine. La boue résultante est centrifugée et les cristaux sont lavés par de l'eau et ensuite ' par du méthanol à 50 %. Le dihydrate prismatique est divisé en
deux parties égales et une de ces parties est séchée sous vide
à 20[deg.]C pendant 16 heures. On obtient ainsi 24 g de cristaux de céphalexine prismatiques qui:.présentent une forte densité et qui
ne sont que légèrement hygroscopiques. Ces cristaux présentent
une teneur en eau selon Karl Fischer de 4,75 % (1 mole) et leur spectre de diffraction aux rayons X est en accord avec celui
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
sur du pentoxyde de phosphore'dans un congélateur à -5[deg.]C pendant
24 heures ce qui permet d'obtenir 24 g de monohydrate prismatique.
La teneur en eau selon Karl Fischer de ces cristaux était de
4,7 % (1 mole) et leur spectre de diffraction aux rayons X était
en accord avec celui indiqué pour les cristaux du type a prémentionné. Leur densité, l'hygroscopicité et autres propriétés physiques sont essentiellement identiques à celles des cristaux prémentionnés séchés à vide, la seule différence étant uniquement trouvée dans le spectre de diffraction aux rayons X.
Exemple 3
Dans 2 litres d'eau pure on met en suspension 1 kg de cellules qui sont obtenues par culture de Acetobacter turbidans IFO-3225 dans les mêmes conditions que celles indiquées dans
<EMI ID=35.1>
le système est amené dans un désintégrateur de cellules où les cellules sont brisées à 15.000 libres/pouce;carré. Au lysate
<EMI ID=36.1>
après quoi il se forme un gel de calcium. Le précipité est éliminé par centrifugation à 10.000 tpm. A 2,1 1 du liquide surnageant que l'on obtient, on ajoute du sulfate d'ammonium à une saturation
<EMI ID=37.1>
fractionné par le sel est centrifugé à 10.000 tpm et le sédiment est dissous dans une petite quantité d'eau, amené dans un sac de dialyse et dialysé dans un courant d'eau. Le produit obtenu est soumis à une chromatographie sur colonne (équilibré par un tampon de phosphate de potassium 0,01 M à pH 6,0, et l'élution est réalisée avec le même tampon plus 0,2 M NaCl) par la carboxyméthylcellulose
(Selva, RFA) et la fraction active est concentrée dans un réservoir de collodion. Le concentrat est ensuite soumis à une chromatographie sur colonne sur un milieu de filtration par gel (Sephadex G-100
<EMI ID=38.1> comme révélateur. La fraction active est lyophilisée pour récupérer 6 g d'une poudre d'enzyme brute. L'activité enzymatique de cette poudre était 20 fois supérieure à celle des cellules lavées.
En utilisant la poudre d'enzyme brute ainsi obtenue, on a effectué la réaction suivante :
Avec un pH contrôlé à 6,0, 7,0 g d'acide 7-aminodésa-
<EMI ID=39.1>
glycine sont préparés pour obtenir une solution aqueuse de 700 ml et ensuite 2,82 g de la poudre d'enzyme brute prémentionnée y son ajoutés. On permet la réaction du système à 30[deg.]C pendant 3 heures.
La réaction enzymatique se poursuit à un pH constant de 6,0.
Le produit de réaction était à 92 % et la production de céphalexine
<EMI ID=40.1>
et concentré sous pression réduite à 18[deg.]C jusqu'à obtenir 50 ml.
Ce concentrat est décoloré avec une petite quantité de poudre de charbon actif et filtré. A une température réglée de 30[deg.]C, la solution est réglée à pH 3 par une addition goutte à goutte de
NaOH 1N pendant environ 1 heure ce qui provoque la séparation de céphalexine sous forme de prismes. Dès que le pH de 3,5 est atteint, la poudre est filtrée et les cristaux obtenus sont lavés avec une petite quantité d'eau. Du fait que les cristaux recueillis contiennent, à l'état adsorbé, de petites quantités de D-phényl-
<EMI ID=41.1>
du NaOH 1N est ajouté à 30[deg.]C en 1 heure pour amener le pH une seconde fois à 4,5 ce qui provoque la séparation de céphalexine
à l'état de prismes. Après que l'addition goutte à goutte est terminée, la boue est immédiatement filtrée et les cristaux sont <EMI ID=42.1> lavés par une petite quantité d'eau. Immédiatement ensuite, on effectue un spectre de diffraction aux rayons X. Le spectre était en accord avec celui du dihydrate de céphalexine. Ces cristaux
sont séchés sous pression réduite (10 mm Hg) à la température ordinaire pendant 16 heures ce qui permet d'obtenir 4,3 g de prismes. La teneur en eau des prismes déterminée par la méthode
de Karl Fischer était de 4,8 % (1 mole) et le spectre de diffraction aux rayons X était en accord avec celui du monohydrate type
<EMI ID=43.1>
détectables par spectroscopie NMR.
Exemple 4
Un mélange réactionnel de céphalexine (9,2 g sous forme de céphalexine) obtenu dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3, passe à travers une colonne de 2,0 1 d'un adsorbant synthétique non-ionique (XAD-II (Rohm & Haas Co.)) ce qui provoque l'adsorption de céphalexine. Après que la colonne ait été lavée avec une petite quantité d'eau, la céphalexine était éluée par
<EMI ID=44.1>
amené à pH 2,0 avec de l'acide chlorhydrique et est concentré sous pression réduite à 18[deg.]C jusqu'à 50 ml. Tandis que le produit concentré est maintenu à une température de 30[deg.]C, on ajoute progressivement goutte à goutte NaOH 1N jusqu'à ce que le pH soit égal à 4,0, ce qui provoque la séparation de céphalexine sous forme de prismes. Après que l'addition goutte à goutte est terminée, les cristaux sont rapidement récupérés par filtration et lavés par une petite quantité d'eau. Les cristaux présentent, une teneur en eau selon Karl Fischer de 9,7 % (2 moles) et leur spectre de diffraction aux rayons X présente les caractéristiques spécifiques du dihydrate de céphalexine. Ce dihydratre prismatique
a été divisé en deux parties égales et l'une de ces parties a été
<EMI ID=45.1>
cristaux restent prismatiques, en ce qui concerne leur apparence extérieure, la teneur en eau mesurée par la méthode de Karl Fischer était de 4,6 % (1 mole). Le spectre de diffraction aux rayons X
était en accord avec le type P du monohydrate de céphalexine.
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
<EMI ID=48.1>
Une mesure d'une culture de trois'jours de Xanthomonas oryzae IFO-3995 est utilisée pour inoculer 100 ml d'un milieu
<EMI ID=49.1> et 0,5 % de chlorure de sodium et une culture à secousses est effectuée à 28[deg.]C pendant 8 heures. Cette culture d'ensemencement était ensuite inoculée dans 5 1 d'un milieu (pH 7,0) composé
de 3,0 % de dextrine, 2,5 % de liqueur de macération de mais, 0,2 % de P04H2K, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,001 % de sulfate ferreux, 0,001 % de sulfate de manganèse, 0,2 % de chlorure de sodium et 0,005 % d'un agent de démoussage (Anti-Froth
(Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co.Ltd. Japon)) et une culture à secousses est effectuée à 28[deg.]C pendant 24 heures. Les cellules résultantes sont recueillies par centrifugation et mises en suspension dans
1 1 d'eau. A la suspension, on ajoute 4 1 d'une solution. aqueuse
(pH 6,0, réglé par NaOH 2N) de 50 g d'acide 7-amino-3-désacétoxycéphalosporanique et 125 g du chlorhydrate de l'ester méthylique
<EMI ID=50.1>
à pH 6,0 (réglé par NaOH 2N)pendant 2 heures, tout en agitant constamment. Des essais biologiques confirment qu'à la fin de ladite période, 69 g de céphalexine se sont accumulés dans le système réactionnel. Le milieu réactionnel est ajusté à pH 4,5
<EMI ID=51.1>
éliminer les cellules. Le liquide surnageant résultant passe
en série dana deux colonnes dont l'une a été remplie par 850 ml d'une résine échangeuse cationique fortement acide du type sulfate
(Amberlite IR-120B (forme Na, Rohm & Haas CO.)), l'autre colonne ayant reçu 2,8 1 de charbon activé de type chromatographique
(Takeda Chemical Industries, Ltd.). Les colonnes sont lavées en série par 15 1 d'eau pure et ensuite la colonne contenant le charbon activé chromatographique est éluée par 14 1 d'une solution aqueuse à 7 % de n-butanol à SV de 1,0 (débit par heure équivalent à la charge de carbone activé). L'analyse du produit élue indique la présence de 62 g de céphalexine et de petites quantités de
<EMI ID=52.1>
en céphalexine et comportant de telles impuretés est amené à
pH 7,0 par NaOH et concentré sous vide à une température interne
<EMI ID=53.1>
et en agitant, la solution concentrée est neutralisée par HC1 1N
<EMI ID=54.1>
provoque la séparation de cristaux blancs de céphalexine. Les cristaux sont récupérés par centrifugation et lavés par
de l'eau. La diffraction aux rayons X s'effectue immédiatement après l'étape de lavage et indique le spectre correspondant du dihydrate de céphalexine. Le. dihydrate prismatique est divisé
en deux parties égales et l'une d'elles est séchée sous pression réduite à 25[deg.]C pendant 10 heures. De cette manière oh obtient
25,5 g de cristaux de céphalexine prismatiques qui sont apparus stables et seulement faiblement hygroscopiques. La teneur en eau des cristaux recueillis, mesurée par la méthode de Karl Fischer, était de 4,8 % (1 mole), le spectre de diffraction aux rayons X était en accord avec celui du type p du monohydrate de déphalexine.
<EMI ID=55.1>
NMR était typique du compose pur ne comportant pas d'impuretés détectables.
La moitié restante dudit dihydrate prismatique est
<EMI ID=56.1>
pendant environ 10 heures. On obtient également 26,0 g de prismes de monohydrate. La teneur en eau de ces cristaux, mesurée par
la méthode de Karl Fischer, était de 4,8 % (1 mole) et le spectre de diffraction aux rayons X était_en accord complet avec celui
<EMI ID=57.1>
du produit obtenu est en accord complet avec celui du monohydrate type a.
Exemple 6
En utilisant des cellules microbiennes obtenues par culture d'Acétobacter pasteurianum IFO-3223 dans les mêmes conditions que celles indiquées dans l'exemple 1, la réaction synthétisée de la céphalexine est effectuée et le milieu réactionnel est filtré pour éliminer les cellules. On fait passer le filtrat résultant dans une colonne de charbon activé, ce qui provoque l'adsorption de la céphalexine. La colonne est éluée par du méthanol à 7 % et le produit de l'élution est concentré pour obtenir un produit concentré à pH 1,0 qui contient 10 % de
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
céphalexine. Le dihydrate de céphalexine prismatique ainsi formé est séparé des eaux-mètes par centrifugation et lavé avec une petite quantité d'eau. Le produit cristallin est divisé en
deux parties égales et l'une d'elles est séchée sous pression réduite à 20[deg.]C pendant environ 10 heures. De cette manière, on
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
de prismes de monohydrate du type a.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour la production de cristaux prismatiques de monohydrate de céphalexine, caractérisé par les étapes opératoires suivantes :
(1)- concentration d'une solution aqueuse contenant de la
céphalexine que l'on peut obtenir en faisant réagir de l'acide
<EMI ID=62.1>
ou un.dérivé réactif de D-phénylglycine à l'aide d'un système
enzymatique microbien,
(2)- maintien du concentrat à proximité du point isoélectrique de
la céphalexine et entre environ 25 et 35[deg.]C pour provoquer la cristallisation du dihydrate de céphalexine sous forme de cristaux prismatiques,
(3)- séparation des cristaux prismatiques de dihydrate de
céphalexine du milieu aqueux,
(4)- séchage des cristaux prismatiques pour les transformer en
- cristaux prismatiques de monohydrate de céphalexine.