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Procédé d'obtention de la psilocybine et de la psilocine.
La présente invention concerne un procédé d'obtention de composés doués de propriétés psychotropes, jusqu'alors inconnus, la psilocybine et la psilocine, à partir de champignons. La demanderes- se a trouvé un procédé d'obtention de ces composés, procédé selon lequel on extrait, par des méthodes connues, les corps actifs du
Psilocybe mexicana Heim ou de matières cryptogamiques artificielle- ment développées, obtenues à partir de cultures ou de variants ou de mutants biologiques de ce champignon par ensemencement de milieux nutritifs naturels ou artificiels et incubation de ces cultures à la lumière du jour ou à l'obsurité, à une température constante com- prise entre 18 et 27 , on purifie ces corps actifs, on les sépare l'un de l'autre et éventuellement onéLimine l'halogène.
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La demanderesse a de plus trouvé qu'en partant de matières cryptogamiques d'origine naturelle des espèces Psilocybe, Stropharia, Conocybe, Panaeolus. Amanita ou Russula ou de matières cryptogamiques artificiellement développées, obtenues à partir de cultures de ces sortes de champignons ou à partir de leurs variants ou mutants biologiques, on obtenait la psilocybine et la psilocine, selon le mode opératoire indiqué ci-dessus, à l'état pur.
On savait déjà (R. Heim, C.r.hebd. Séances Acad. Sci.
242, 965 (1956) que certaines espèces de champignons naturels du Mexique, de la Sibérie Orientale, du Kamtschatka et d'autres régions d'Asie et d'Amérique, étaient utilisées par les aborigènes à des fins rituelles ou comme stimulants ou stupéfiants, car l'absorption de ces champignons produit sur le corps et surtout sur l'esprit de l'homme des effets très particuliers. Ces champignons, dits champig- nons hallucinogènes, comprennent les espèces suivantes : Psilocybe, Stropharia, Panaoelus, Conocybe, Amanita, Russula.
Mais on n'avait pas réussi jusqu'à présent à isoler les corps actifs des échantillons de champignons d'origine naturelle ou de matières cryptogamiques artificiellement cultivées, et l'on n'avait pas réussi non plus, en partant de champignons naturels, à cultiver au laboratoire les espèces douées de propriétés hallucinogènes, dans des conditions telles que la matière de départ active se torse en quantités suffisantes pour permettre l'extraction technique des corps actifs.
La demanderesse a trouvé un procédé selon lequel on ob- tient à l'état pur, par des méthodes connues, les corps actifs jusqu' alors inconnus des espèces de champignons hallucinogènes, de préfé- rence du Psilocybe mexicana Heim, du Psilocybe caerulescens Nurrill var. Mazatecorum Heim, du Psilocybe caerulescens Myrrill var.
nigripes Heim, du Psilocybe Zapotecorum Heim, du Psilocybe semperviva Heim et Cailleux, du Psilocybe Aztecorum Heim, du Stropharia cubensis Earle, soit directement à partir de matières cryptogamiques d'origine naturelle, soit à partir de matières cryptogamiques cultivées prove-
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nant de cultures faites sur des substrats naturels ou artificiels selon les méthodes de cultures qui permettent d'obtenir des quantités de matière de départ actives suffisantes pour l'extraction indus- trielle des corps actifs.
On effectue le procédé de préférence de la manière sui- vante : pour la culture sur substrat naturel, on prépare un compost constitué de paille de froment fermentée, d'un mélange de feuilles et de tiges de mais ou de brins d'herbes sauvages, on le lave abon- damment à l'eau courante, on le répartit dans des capsules de terre et on stérilise à l'autoclave. On ensemence le compost avec du mycélium de cultures primaires, on l'incube à 24-27 pendant environ 2 semaines, on recouvre les cultures avec du sable stérile et on les abandonne à elles-mêmes dans des boîtes en verre à la lumière du jour, à une température de 18 à 27 , en maintenant constante la te- neur en humidité.
Les corps fructifères apparaissent au bout de 4 à 5 semaines; on effectue la récolte de temps en teps pendant 1 à 2 mois, lorsque commence la formation des spores.
Comme il est toutefois assez compliqué d'obtenir, par cette méthode, d'assez grandes quantités de matières de départ, d'autres méthodes de cultures furent mises au point. La demanderesse a ainsi trouvé qu'en opérant in vitro sur des substrats riches en matières nutritives, les champignons formaient, au lieu de mycélium avec corps fructifères, presque exclusivement du mycélium actif et partiellement des sclérotes, mais formaient par contre, sur des substrats pauvres en matières nutritives, les corps fructifères con- nus.
Par exemple, sur une gélose nutritive (contenant 1,5% d'agar- agar), la fructification optimum se produit- pour une concentration en substance sèche d'extrait de malt de 0,2 à 0,7%; par contre la formation optimum de mycélium et de sclérotes a lieu à des concentra- tions de 4 à 10% suivant l'espèce de champignon.
Alors que la lumière du jour est indispensable pour la formation de corps fructifères, la demanderesse a trouvé que par contre la formation de sclérotes ou de mycélium était plus abondante
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lors de l'incubation des cultures à l'obscurité. On obtient les meilleurs rendements en matières cryptogamiques actives (mycélium et sclérotes) en réalisant des cultures de surfaces avec des solutions nutritives à l'extrait de malt (moût de bière ou préparation commer- ciale d'extrait de malt) d'une teneur en extrait sec de 4 à 10% et en incubant ces cultures à l'obscurité à une température constante comprise entre 22 et 26 .
Pour obtenir une bonne croissance on doit ajouter à la solution nutritive 0,2% d'agar-agar : dans ce milieu encore presque liquide le champignon trouve un soutien juste suffi- sant pour former rapidement une couche de mycélium bien fermée.
Il est nécessaire d'ajouter des sels de fer divalent; il est en outre très avantageux d'ajouter des sels de zinc de potassium, de calcium et de magnésium., des ions nitriques, phosphoriques et sulfuriques ainsi que de l'extrait de levure ou des "Cornsteep Solids" (concentré de bain aqueux de macération de mais).
Ce procédé de culture représente un grand progrès techni- que car il permet d'obtenir, plus rapidement et avec un travail moindre, un rendement en matière première active plus que décuplé, en comparaison de la culture sur substrat naturel.
On sèche avec précaution la matière cryptogamique active (corps fructifères, sclérotes ou mycélium) à 20-40 , dans un courant d'air ou sous pression réduite, on la broie très finement et on l'extrait à la température ambiante jusqu'à épuisement avec de l'eau, un alcool aliphatique inférieur ou un mélange d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau. On évapore les extraits sous pression réduite à basse température, on dégraisse le résidu avec de l'éther de pétrole et, pour en éliminer les impuretés inactives, on extrait avec de l'acétone ou avec un mélange de chloroforme et d'alcool. On élimine les autres charges inertes par dissolution du résidu dans le minimum d'eau et précipitations répétées avec de l'éthanol absolu ou de l'acétone; on évapore le filtrat à basse température sous pression réduite.
On poursuit la purification par chromatographie de passage sur poudre de cellulose ; onélue avec du butanol saturé d'eau ou
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avec 'un autre alcool non miscible à l'eau. Dans les fractions re- cueillies on décèle la présence de corps actifs avec le réactif de Keller (acide acétique glacial renfermant du chlorure ferrique et acide sulfurique concentré). On réunit les fractions donnant une réaction colorée positive et, si besoin est, on les soumet de nouveau à une séparation chromatographique sur une colonne de poudre de cellulose.
Du chromatogramme on élue une zone migrant plus rapidement qui donne un corps actif, nommé psilocine, caractérisé par une réaction colorée bleu pur au réactif de Keller, tandis qu'une zone à déplacement plus lent fournit un deuxième corps actif, quantitati- vement prédominant, la psilocybine qui donne une réaction colorée violette.
Les corps actifs obtenus dans un état assez pur après la chromatographie renferment de l'halogène et, dans cet état, ils ne cristallisent pas : ce n'est que par un traitement chimique que l'on peut éliminer l'halogène et obtenir des composés cristallisés. A cet- te fin, on traite une solution aqueuse des corps actifs par du car- bonate d'argent, on élimine du filtrat l'excès d'ions argent à l'aide d'acide sulfhydrique et on concentre à basse température sous pression réduite : les substances cristallisent alors dans la solu- tion concentrée.
Pour l'analyse on recristallise encore une fois la psilo- cybine dans le méthanol ou dans l'eau. Après recristallisation dans l'eau elle se présente sous forme de fines aiguilles d'un blanc de neige, après recristallisation dans le méthanol on l'obtient sous forme de plaques ou de prismes hexagonaux incolores renfermant du méthanol. Ces cristaux fondent à 195-200 avec décomposition. Le composé se dissout dans 120 parties de méthanol bouillant ou dans 20 parties d'eau bouillante; dans des alcools supérieurs ou dans d'autres solvants organiques il est très difficilement soluble ou in- soluble.
Pour l'analyse on le sèche à 1000 sous vide poussé, ce qui produit une diminution de poids de 10,4%. Les résultats de l'analyse
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élémentaire correspondent à la formule brute C12H17O4N2P (pids moléculaire : 284.2). La psilocybine est un composé amphotère opti- quement inactif qui se dissout facilement en donnant des sels, dans les acides minéraux aqueux diluas et dans les alcalis aqueux diluas.
La solution de psilocybine dans l'éthanol aqueux à 80% a une réactior faiblement acide (PH 5,2). En solution méthanolique elle donne un spectre ultraviolet présentant des maxima à 222, 267 et 290 m .
Pour l'analyse on purifie la psilocine par une nouvelle chromatographie sur une colonne de poudre de cellulose avec du butanol saturé d'eau, ou par traitement avec du bicarbonate de sodium en solution aqueuse et extraction avec de l'éther ou un solvant or- ganique. Les résultats de l'analyse élémentaire correspondent à la formule brute C12H16NO2. La psilocine cristallise dans le méthanol ou l'acétone; c'est un composé modérément soluble dans l'eau, facile- ment soluble dans l'acide dilué. Son point de fusion est de 173-176 (avec décomposition).
La psilocine est caractérisée d'une part par son spectre ultraviolet (en solution méthanolique) qui présente des maxima à 222, 260. 267, 283 et 293 m/u et d'autre part par la couleur bleue pure qu'elle donne avec le réactif de Keller, contrairement à la psilocybine.
Lorsqu'on en injecte par voie sous-cutanée ou qu'on en administre par voie buccale 2 à 8 mg, la psilocybine provoque chez l'homme un état d'euphorie prononcé qui est suivi d'atonie et d'une sensation d'apathie..9des doses supérieures, surviennent, en plus de phénomènes végétatifs, certaines altérations de la perception. Ces composés doivent être utilisés pour l'étude des maladies mentales et des psychoses de différentes origines et ils peuvent être appliqués à des psychopathes comme auxiliaires utiles dans le traitement psychothérapeutique.
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée.
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EXEMPLE 1.-
Extraction de la psilocybine et de la psilocine du Psilocybe mexicana Heim d'origine naturelle.
Dans le but d'effectuer la culture sur un substrat natu- rel,on prépare au compost de paille de froment fermentée, on le lave abondamment à l'eau courante, on le répartit dans des capsules de terre et on stérilise à l'autoclave. On ensemence le compost avec du mycélium de cultures primaires, on l'incube à 24-27 pendant environ 2 semaines, on recouvre les cultures avec du sable stérile et on les abandonne à elles-mêmes dans des boîtes en verre à la lumière du jour, à une température de 21-22 . Au bout de 4 à 5 semaines ap- paraissent les corps fructifères ; lorsquecommence la formation de spores on effectue la récolte de temps en temps pendant 1 à 2 mois.
Ensuite, dans un courant d'air à 30 , on sèche avec précaution les corps fructifères mûrs du Psilocybe mexicana Heim. On broie très fine- ment 54 g des champignons séchés et on les secoue une fois avec 600 cm3 et 3 fais avec 300 cm3de méthanol pendant une demi-heure à chaque fois. On réunit les extraits et on les évapore à siccité sous pression réduite. On obtient alors un résidu de 12 g.
Afin de le dégraisser, on malaxe ce résidu 4 fois avec 250 cm3 d'éther de pétrole, puis encore 3 fois avec 100 cm3 de chloroforme additionné de 10% d'alcool. On dissout dans 10 cm3 d'eau le résidu encore non dissous (environ 10 g) et on ajoute lentement 100 cm3d'alcool absolu, ce qui produit un enrichissement de la solu- tion en substance active. On répète encore 2 à 3 fois cette opération.
On concentre à siccité, sous pression réduite, les solutions décan- tées, on dissout de nouveau le résidu dans du méthanol et on ajoute 20 g de poudre de cellulose additionnée de 5% d'eau. On évapore le méthanol sous pression réduite et on introduit la poudre de cellulose retenant la substance active sur une colonne de 100 g de poudre de cellulose +5% d'eau (préalablement on a lavé la colonne avec du butanol saturé d'eau). On élue avec du butanol saturé d'eau et l'on recueille des fractions de 20 cm'. On soumet les résidus d'évapora- tion des diverses fractions à la réaction colorée de Keller pour
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déceler la présence de corps actifs. A cette fin, on ajoute 2 cm3 de réactif de Keller à des prises d'essais de 0,25 --ce de résidu d'évaporation.
On réunit les fractions donnant une réaction positive.
On dissout la poudre amorphe dans 20 cm3 d'eau et on secoue avec 0,5g de carbonate d'argent. Après filtration, on élimine les ions argent de la solution à l'aide diacide sulfhydrique, puis on concen- tre avec précaution. Dans la solution concentrée, la psilocybine cristallise en fines aiguilles incolores (quantité obtenue : 200 mg).
A partir des corps fructifères, on n'obtient que des tra- ces de psilocine.
Par une nouvelle recristallisation dans le méthanol ou dans l'eau, on obtient la psilocybine à l'état analytiquement pur.
Elle se dissout dans 120 parties de méthanol bouillant ou dans 20 parties d'eau bouillante. A partir de la solution méthanolique, on obtient des prismes incolores fondant à 195-220 avec décomposition.
Les résultats de l'analyse correspondent à la formule brute C12 H17O4N2P. Le spectre ultraviolet, pris dans le méthanol, montre les maxima suivants : 222 m/u,267 m/u et 290 m/u.
Le nouveau corps actif a un caractère amphotère. Il se dissout avec formation de sels aussi bien dans les alcalis aqueux dilués que dans les acides aqueux. La solution de psilocybine dans l'alcool aqueux à 80% a une réaction acide (pH 5,2).
EXEMPLE 2 . -
Extraction de la psilocybine et de la psilocine du Stropharia cubensis Earle d'origine naturelle.
Avec précaution, on sèche à l'air, à l'ombre et à la tempé- rature ambiante, les appareils sporifères du Stropharia cubensis Earle recueillis au Mexique. On broie très finement 24,2 g d'appa- reils sporifères séchés et, à la température ambiante, on les secoue une fois avec 300 cm3et 3 fois avec à chaque fois 150 cm3de- métha- nol, pendant une demi-heure à chaque fois. On rassemble les extraits et on évapore à siccité sous pression réduite. Pour le dégraisser,
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on malaxe le résidu (6 g) 4 fois avec à chaque fois 125 cm3 d'éther de pétrole et encore 3 fois avec à chaque fois 5C cm3 de chloroforme contenant 10% d'éthanol.
On dissout dans 5 cm d'eau le résidu non encore dissous (environ 5 g) et, en ajoutant lentement à cette solution 50 cm3 d'éthanol, on précipite d'autres impuretés, ce qui produit un enrichissement de la solution en corps actifs. On répète la purification encore 2 à 3 fois de la même façon. On réunit les solutions décantées et on concentre à siccité sous pression réduite.
On reprend le résidu dans du méthanol et on ajoute 10 g de poudre de cellulose additionnée de 5% d'eau. On évapore le méthanol sous pres- sion réduite et on introduit la poudre de cellulose, sur laquelle adhère la substance active, sur une colonne de 50 g de poudre de cellulose additionnée de 5% d'eau ; au préalable, on a lavé la colonne avec du butanol saturé d'eau. On élue avec du butanol saturé d'eau et on recueille des fractions de 10 cm3. On évapore sous vide poussé, les fractions isolées à une température de bain d'au plus 50 , et on examine la présence de corps actifs avec de l'acide acétique glacial renfermant du chlorure ferrique et de l'acide sul- furique concentré. A cette fin, on ajoute 2 cm3 de réactif de Keller à des échantillons de 0,25 mg de résidu.
Les fractions actives sont caractérisées par l'apparition d'une couleur violette (psilocybine) ou d'une couleur bleu pur (psilocine).
On rassemble les fractions donnant une réaction, colorée positive de la même nuance. On dissout la poudre amorphe .les résidus d'évaporation précédents dans 2 cm3 d'eau et on secoue avec 0,25 g de carbonate d'argent. Après filtration, on élimine l'excès d'ions argent au moyen d'acide sulfhydrique. Dans la solution, après qu'on l'ait concentrée avec précaution, la psilocybine cristallise en fines aiguilles incolores. On obtient 58 mg de psilocybine cristal- lisée, soit un rendement de 0,24%, par rapport aux corps fructifères séchés, et une trace de psilocine.
EXEMPLE 3.-
Extraction de la psilocybine et de la psilocine de cul- tures pures de Psilocybe semperviva Heim et Cailleux.
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a) Préparation du corps d'ensemencement :
On dépose sur un milieu de ment àe bière et d'agar-agar des cultures pures de basidiospores du champignon mexicain Psilocybe semperviva Heim et Cailleux. Dans ce but, on recueille sur un suppor: stérile les spores tombant des lamelles d'un corps fructifère mûr, on dépose ces spores sur un milieu de moût de bière et d'agar-agar et on incube. Avec les cultures primaires ainsi obtenues on prépare la matière d'ensemencement en quantité suffisante de la façon suivante :
Sous eau de ville stérile on racle le mycélium avec une spatule rugueuse de manière à obtenir une suspension de fins flocons de mycélium.
Avec cette suspension on ensemence des flacons d'Erlen- meyer contenant une solution nutritive et des corps de remplissage en porcelaine en forme de selles, tels que ceux que l'on utilise ordinairement pour emplir les colonnes de distillation. On obtient les meilleurs résultats avec des Erlenmeyers de 300 cm renfermant 50 g de corps de remplissage en forme de selles (dimension : 1 cm ; poids : environ 0,9 g) et 80 cm3 de solution nutritive constituée de moût de bière à 4% environ d'extrait sec et 0,2% d'agar-agar.
On incube la culture à une température de 24 ; au bout de deux semaines il s'est formé superficiellement une couche compacte de mycélium. On secoue toute la culture pendant 30 minutes sur la machine à secousses rotative. Avec leurs arêtes vives les corps de remplissage broient le mycélium : il en résulte une suspension fine de flocons de mycélium. Le corps d'ensemencement ainsi obtenu suffit pour ensemencer 50 litres de solution nutritive. b) Préparation de la culture.
On dilue du moût de bière frais et clair, non additionné de houblon, avec de l'eau de ville pour porter à 8% la teneur en ex- trait sec. A chaque litre de cette solution on ajoute :
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0,00417 g de FeSO4.7H20 0,00172 g de Znso4.7H20
1,0 g de Ca(NO3)2 0,0624 g de KH2PO4
0,0624 g de MgSO4.7H20 0,0312 g de KC1
2.0 g d'agar-agar
On introduit cette solution nutritive, par portions d'un litre à chaque fois, dans des flacons de taille convenable, eu genre des flacons de pénicilline, et on stérilise à l'autoclave à 108 pendant 25 minutes. Après refroidissement on ensemence les flacons avec à chaque fois 2 cm3 d'une suspension de Psilocybe semperviva Heim et Cailleux.
Les cultures obtenues sont incubées à 24-26 à l'obscurité. Il se forme la couche de mycélium décrite à l'exemple 3 sous a). c) Isolement de la matière cryptogamique.
Au bout de six semaines on filtre la culture mûre à tra- vers une gaze, on presse la matière cryptogamique et on la sèche à 30 sous pression réduite. Avec 100 flacons de penicilline contenant 100 litres de solution nutritive, on obtient, en faisant la récolte au bout de 49 jours, 2540 g de matière sèche, c'est-à-dire 25,4 g par litre de solution nutritive mise en jeu. On traite le filtrat de culture, qui renferme aussi certaines quantités de corps actifs, par le même procédé que celui qui est décrit dans le paragraphe suivant pour la matière cryptogamique. d) Extraction des corps actifs.
On pulvérise très finement 306 g de matière cryptogamique séchée, on la secoue 3 fois avec à chaque fois 500 cm3 de chloroforme et encore 3 fois avec à chaque fois 500 cm3 de chloroforme renfer- mant 10% d'éthanol. 2,8 g d'impuretés inactives passent ainsi en solu- tion. On épuise la matière cryptogamique préalablement extraite, une fois avec 3 litres et 3 fois avec à chaque fois 1,5 litre de méthanol.
On réunit les extraits et on évapore à siccité sous pression réduite.
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On obtient ainsi un résidu brun clair de 17,5 G. Pour éliminer les impuretés lipoïdes on reprend ce résidu dans 17,5 cm3 d'eau et on secoue la suspension une fois avec 500 cm3 et 2 fois avec à chaque fois 250 cm3 d'éther de pétrole. La solution dans l'éther de pétrole renferme 0,75 g d'impuretés inactives. On concentre la solution aqueuse restante sous pression réduite jusqu'à environ 25 cm3 et, en agitant vigoureusement, on ajoute lentement goutte à goutte 250 cm3 d'éthanol absolu. Du précipité collant qui se forme, on sépa- re par décantation la solution renfermant les corps actifs. On dis- sout encore 1 fois le précipité dans un peu d'eau et on traite avec une quantité décuple d'éthanol absolu. Avec le résidu, on répète en- core 2 fois cette purification par précipitation.
On réunit les solu- tions et on évapore à siccité sous pression réduite. On obtient un résidu solide de 11,7 g qui contient la totalité des corps actifs. rour la chromatographie sur la colonne de cellulose on dissout le résidu dans le minimum de méthanol à 50%, on mélange bien la solution avec 40 g de poudre de cellulose et on sèche la matière sous pression réduite. La poudre de cellulose ainsi chargée avec la substance est introduite sur une colonne de cellulose préparée par mise en suspension de 350 g de poudre de cellulose dans du butanol saturé d'eau. On développe par le procédé de passage avec du butanol saturé d'eau: on sépare ainsi des fractions de 100 cm3chacune que l'on évapore sous vide poussé à une température de bain ne dépassant pas 50 .
Les fractions moyennes (3,35 g) donnent une réaction de Keller positive. Pour parfaire la purification on les chromatographie encore une fois par le même procédé sur poudre de cellulose.
Par développement avec du butanol saturé d'eau on obtient des fractions de 50 cm3 chacune que l'on évapore sous vide poussé à une température de bain de 50 au plus, et que l'on examine ensuite par la réaction colorée de Keller. On obtient la distribution sui- vante :
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EMI13.1
<tb> Fraction <SEP> Résidu <SEP> en <SEP> Réaction <SEP> colorée <SEP> de
<tb>
<tb> N <SEP> mg <SEP> Keller.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
1 <SEP> - <SEP> 7 <SEP> 1270 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> - <SEP> 16 <SEP> 87 <SEP> bleu <SEP> pur
<tb>
<tb> 17 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 79 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21- <SEP> 30 <SEP> 1053 <SEP> violette
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> - <SEP> 43 <SEP> 758 <SEP> négative
<tb>
Après le traitement avec du carbonate d'argent effectué comme décrit à l'exemple 2, le résidu des fractions 8 à 16 (87 mg) donne 45 mg de psilocine pure. Les fractions 21 à 30 (1053 mg) four- nissent, après le traitement avec du carbonate d'argent, 765 mg de psilocybine pure.
Du filtrat de culture on extrait les corps actifs selon le même procédé. A cette fin, en concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'à environ 1/10 de son volume. On précipite avec un volume décuple de méthanol, on élimine par filtration les impuretés qui ont précipité, on évapore la solution à siccité sous pression réduite et on extrait le résidu à trois reprises avec une quantité décuple de méthanol. On poursuit le traitement du résidu d'évapora- tion des extraits méthanoliques de la manière indiquée ci-dessus.
A partir de 12 litres de filtrat de culture on obtient 80 mg de psilocybine et 6 mg de psilocine. Quantités totales obtenues 845 mg de psilocybine et 51 mg de psilocine, soit respectivement des teneurs de 0,28% et de 0,17% par rapport à la matière cryptogami- que séchée.
EXEMPLE 4.-
Extraction de la psilocybine et de la psilocine de cul- tures pures de Psilocybe mexicana Heim.
Dans cet exemple on trouvera une description exacte, d'une part, de la culture du champignon Psilocybe mexicana Heim in vitro en vue de la production de mycélium et de sclérotes, d'autre part, de l'isolement des corps actifs purs.
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On dilue avec de l'eau de ville du moût de bière frais et clair, non additionné de houblon, jusqu'à ce que la meneur en extrait sec soit de 4,0-4,5%. A chaque litre de cette solution on ajoute :
0,00417 g de FeSO4.7H2O
0,00172 g de ZnSO4.7H2O
2,0 g d'agar-agar
Dans des flacons de Fernbach d'une capacité de 1,6 litrt chacun on introduit cette solution nutritive à raison de 500 cm3 par flacon et on stérilise à l'autoclave à 108 pendant 25 minutes.
Après refroidissement on ensemence les flacons avec à chaque fois 2 cm3 d'une suspension du champignon Psilocybe mexicana Heim. On prépare le corps d'ensemencement en déposant des cultures pures de basidiospores du champignon mentionné sur un milieu de moût de bière et d'agar-agar. On recueille sur un support stérile les spores qui tombent des lamelles d'un corps fructifère mûr, on les dépose sur agar-agar-moût de bière et on incube. À partir des cultures pri- maires qui se forment de cette manière, on peut préparer le corps d'ensemencement de la façon suivante : sous eau de ville stérile on râcle le mycélium avec une spatule rugueuse de manière à obtenir une suspension de fins flocons de mycélium.
Avec cette suspension on ensemence des flacons d'Erlenmeyer qui renferment une solution nutri- tive et des corps de remplissage en porcelaine en forme ce selles.
On obtient les meilleurs résultats avec des Erlenmeyers de 300 cm3 renfermant 50 g de corps de remplissage en forme de selles (dimen- sion : 1 cm; poids = environ 0,9 g) et 80 cm3 de solution nutritive constituée de moût de bière à environ 4% d'extrait sec et de 0,2% d'agar-agar. Par incubation à 24 , il se forme au bout de deux semai- nes une couche superficielle compacte de mycélium. On agite toute la culture pendant 30 minutes sur une machine à secousses rotative. Les corps de remplissage en forme de selles broient alors le mycélium, si bien qu'il en résulte une fine suspension de flocons de mycélium.
Le corps d'ensemencement ainsi obtenu suffit pour ensemencer 25 li- tres de solution nutritive.
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On incube à 24-26 , à l'obscurité, les cultures ensemen- cées. Il se forme la couche de mycélium déjà décrite avec de tres nombreux sclérotes atteignant en général une dimension pouvant aller jusqu'à 1 cm environ (quelques-uns peuvent devenir bien plus grands, Pour séparer le mycélium et les sclérotes on filtre les cultures mûres à travers une gaze, on presse et on sèche à 35-40 à l'étuve.
Si l'on est parti de 134 flacons de Fernbach renfermant 67 litres de solution nutritive, on obtient, en faisant la recolte au bout de 62 jours, 1149 g de matière sèche (sclérotes et mycélium) c'est-à- dire 17,14 g par litre de solution nutritive mise en jeu.
Pour isoler les corps actifs on pulvérise très finement par exemple 612 g de sclérotes et de mycélium séchés, on extrait préalablement à 3 reprises avec à chaque fois 1 litre de chloroforme. puis encore à 3 reprises avec à chaque fois 1 litre de chloroforme additionné de 10 d'éthanol. 5,6 g d'impuretés inactives passent alors dans l'extrait préliminaire. On épuise ensuite la matière cryp- togamique préalablement extraite, 1 fois avec 6 litres, puis encore 3 fois avec à chaque fois 3 litres de méthanol. On rassemble les extraits méthanoliques, on évapore à siccité sous pression réduite e' on obtient ainsi 35 g d'un résidu brun clair. Pour en éliminer les impuretés lipoïdes, on met ce résidu en suspension dans 35 cm3 d'eau et on secoue 1 fois avec 1 litre et 2fois avec a chaque fois 0,5 litre d'éther de pétrole.
L'éther de pétrole renferme 1,5 g d'im- puretés inactives. Jn concentre d'abord la solution aqueuse restante, sous pression réduite, jusqu'à environ 50 cm3, apres quoi on ajoute 500 cm3d'éthanol en agitant vigoureusement. Du précipite collant qui se forme alors on sépare, par décantation, la solution renfermant les corps actifs. On dissout de nouveau le précipité dans un peu d'eau et on traite avec une quantité décuple d'alcool absolu. On ré- pète encore 2 fois cette operation de précipitation avec le résidu.
On réunit les solutions et on concentre à siccité sous pression ré- duite. On obtient un résidu solide de 23,4 g qui renferme la totali- té des corps actifs.
<Desc/Clms Page number 16>
Pour la chromatographie sur colonne de cellulose on dissout le résidu dans le minimum de méthanol à 50%, on mélange bien la solution avec 80 g de poudre de cellulose et on sèche la matière sous pression réduite. La poudre de cellulose ainsi chargée de la substance est introduite sur une colonne de cellulose que l'or, a préparée en mettant en suspension 700 g de poudre de cellulose dans du butanol saturé d'eau. On développe avec du butanol saturé d'eau par la méthode de passage et l'on sépare des fractions de 200 cm3 chacune. On les concentre sous vide poussé à une tempé- rature de bain n'excédant pas 50 . On obtient alors la distribution suivante : TABLEAU 1.
EMI16.1
<tb>
Fraction <SEP> hésidu <SEP> en <SEP> g <SEP> réaction <SEP> colorée <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> n <SEP> Keller.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
1 <SEP> - <SEP> 14 <SEP> 2,170 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> - <SEP> 34 <SEP> 6,660 <SEP> positive
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 35 <SEP> - <SEP> 40 <SEP> 3,540 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12,370
<tb>
le rester soit environ il g, est retenu dans la colonne.
Les fractions 15 à 34, qui fournissent un résidu de 6,660 g au total, referment -La totallté des corps actifs. Pour par- faire la purification on les chromatographie à nouveau de la maniè- re décrite ci-après. On dissout le résidu de 6,66 g dans le minimum de méthanol et avec la solution on imprègne 20 g de poudre de cellu- lose. Après séchage on introduit cette poudre sur une colonne de 600 g de poudre de cellulose préalablement traitée comme indiqué ci- dessus. En développant avec du butanol saturé d'eau on recueille des fractions de 100 cm3 chacune. Après les avoir évaporées sous vide poussé, on les soumet à la réaction colorée.
On obtient alors la distribution suivante :
<Desc/Clms Page number 17>
TABLEAU 2.
EMI17.1
<tb> Fraction <SEP> résidu <SEP> en <SEP> traction <SEP> colorée <SEP> de
<tb>
<tb> n <SEP> mg <SEP> Keller.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
1 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> 2.950 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> - <SEP> 17 <SEP> 180 <SEP> bleu <SEP> pur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 18 <SEP> - <SEP> 21 <SEP> 155 <SEP> négative
<tb>
<tb>
<tb> 22 <SEP> - <SEP> 31 <SEP> 912 <SEP> violette'
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 32 <SEP> - <SEP> 45 <SEP> 1.510 <SEP> négative
<tb>
Après traitement avec du carbonate d'argent de la manière décrite à 1-'exemple, le résidu des fractions 9 à 17 (180 mg) fournit 90 mg de psilocine pure.
Après le traitement au carbonate d'argent tel qu'il est décrit à l'exemple 1, les fractions 22 à 31 (tableau 2) donnent 619 mg de psilocybine pure ayant les propriétés décrites à l'exemple 1. On extrait les corps actifs du filtrat de culture par le même procédé que celui qui a été précédemment décrit pour le sclérotes.
A cette fin on concentre le filtrat de culture sous pression ré- duite jusqu'à environ 1/10 de son volume. On précipite avec un volume décuple de méthanol, on filtre et on extrait le résidu à 3 reprises avec à chaque fois une quantité décuple de méthanol. un poursuit le traitement du résidu d'évaporation des extraits méthano- liques de la manière précédemment décrite. A partir de 10 litres de filtrat de culture on obtient par exemple 220 mg de psilocybine et 12 mg de psilocine.
EXEMPLE 5.-
Extraction de la psilocybine et de la psilocine de cul- tures pures de Stropharia cubensis Earle.
On prépare une solution nutritive de la façon suivante : on dilue du moût de bière frais et clair, non additionné de houblon, avec de l'eau de ville jusqu'à une teneur en extrait sec de 6%. A chaque litre de cette solution on ajoute :
<Desc/Clms Page number 18>
0,0021 g de FeSO4.7H2O 0,0009 g de ZnSO4.7H2O
EMI18.1
1,0 g de Ca (PF03 ) 2 0,0624 g de KR2P04 0,0621 g de MgS04.rIHZO
0,0312 g de KC1
2,0 g d'agar-agar
On stérilise cette solution nutritive comme à l'exemple 3 et on l'ensemence en ajoutant, par litre, 2 cm3d'une suspension du champignon Stropharia cubensis arle du Cambodge. On prépare cette suspension d'ensemencement comme il a été indiqué à l'exemple 3 sous a).
Au bout de 52 jours d'incubation à l'obscurite à 24 , on obtient,
EMI18.2
si l'on est parti de 20 litres, 452 s de matière cryto,a:i;ue séchée, c'est-à-âire 226, g par litre. On isole les corps actifs de la matière cryptogique en procédant comme il a été indiqué à l'exemple 3. Quantités obtenues = 1.033 mg de psilocybine cristal-
EMI18.3
lisée pure et 45 ..:l6 de psilocine, soit J,2,, et O,010/ respective- ment, par rapport à la aatîére cryptog;ique SCÏ1( e.
EXEiPLw- 6.- Lxtraczion de la psilocybine et de la psilocine du PSilocybe se#ervib2 Reia et Cailleux d'origine naturelle.
On sèche avec précaution à 30 , par un courant d'air, les corps fructifères mûrs du Psilocybe semperviva Hein et Cailleux obtenus par culture artificielle sur des milieux nutritifs naturels (compost). On broie très finement 32 g de corps fructifères séchés et on secoue à la température ambiante une fois avec 300 cm3et trois fois avec à chaque fois 150 cm3de méthanol, à chaque fois pen- dant 1/2 heure. On rassemble des extraits et on les évapore à siccité sous pression réduite. Pour le dégraisser, on malaxe le résidu (3,3 g)
EMI18.4
quatre fois avec à chaque fois 125 en c.L'eïlC1 de pétrole et trois fois avec à chaque fois 50 cm3 de chloroforme renfermant 10;ô d'êtha- nol. On obtient un résidu de 6,5 g.
On dissout ce résidu dans 6 cm3 d'eau et, à la solution, on ajoute lentement 60 cm3 d'éthanol absolu
<Desc/Clms Page number 19>
pour précipiter d'autres impuretés et enrichir ainsi la solution en corps actifs. On répète encore deux fois la purification de la même manière. On décante les solutions, on les rassemble et on les évapore à siccité sous pression réduite. On reprend le résidu dans du métha-
EMI19.1
non et on le chromatographie sue poudre de cellulose COûD1e décrit à l'exemple 2. Par traitement avec du carbonate d'argent on élimine l'halogène des corps actifs ainsi obtenus. Après recristallisation on
EMI19.2
obtient '1 Lf c4c-- s 0 h cristllisc et 32 s de ilccie soit une teneur de 0, 5J et de 01/j drespectivement par rapport à la matière cryptogamique séchée.
EXEMPLE 7.-
Extraction de la psilocybine du Psilocybe caerulescens
EMI19.3
¯Iurrill var. Mazatecorusi Sein d'origine naturelle.
On sèche avec précaution des corps fructifères mûrs du Psilocvbe caerule:cens Aurrill var. azatecorus ei obtenu par cul- ture artificielle sur milieux nutritifs naturels (compost), après quoi on broie très finement la matière cryptogamique séchée (7,3 g)
EMI19.4
et on l'épuise aved du méthanol ainsi cu-lil a été décrit à 1-lexein-ile 2. On réunit les extraits et on évapore à siccité sous pression réduite. On poursuit le traitement du résidu conL'je indiqué à z exemple 2 tour arriver aux corps actifs. On obtient 14,6 m± de psilocybine pure soit une teneur de 02% de psilocybine ();:;I' r,nwprt à lz 7!1;,d::i.ère cryptogamique séchée). A partir de l'échantillon de champignon traité on n'obtient pas de psilocine.
EXEMPLE 8 . -
Extraction de la psilocybine de cultures pures de Psilo-
EMI19.5
cybe caerulescens 1>Iurrill var. î-lazatecorusi Heils.
On prépare le milieu de culture en diluant du moût de bière clair et frais, non additionné de houblon, avec de l'eau de ville pour porter à 4,0% la teneur en extrait sec. ± chaque litre de cette solution'on ajoute :
<Desc/Clms Page number 20>
10,il g de nCornsteep Solids" 0,00834 de ReSO4.7H2O 0,20 g de Ca(OH)2,
0,20 g de KH2PO4 0,25 g de NH4OH
2,0 g d'agar-agar pH de la solution :
5,4
On stérilise cette solution nutritive comme à l'exemple 3, on l'ensenece avec la suspension de mycélium d'une culture pure de Psilocybe caerulescens urrill var. Mazatecorum Heim du -'.lexique et on incube les cultures obtenues à 26 à 3'obscurité. Au bout de 48 jours, on récolte, par litre de solution, 20,4 g de matière crypto- gamique séchée. L'isolement et la purification des corps actifs à partir de cette matière s'effectuent selon les indications données à l'exemple 3. A partir de 10 litres de solution nutritive, on obtient: 449 mg de psilocybine, soit une teneur de 0,22% par rapport à la matière cryptogamique séchée. On ne trouve pas de psilocine dans la matière traitée.
EXEMPLE 9 . -
Extraction de la psilocybine du Psilocybe Zapotecorum Heim d'origine naturelle.
Un sèche avec précaution (résidu 42,4 g) les corps fructi- fères mûrs de Psilocybe Zapotecorum Heim que l'on a recueillis et triés en pays Chatino (Mexique), on les broie très finement et on les secoue avec du méthanol comme indique à 'L'exemple 2. On rassemble les extraits méthanoliques et on évapore à siccité sous pression ré- duite. On poursuit le traitement du résida comme indiqué à l'exemple 2. On obtient 212 mg de psilocybine pure, soit une teneur de 0,5% A partir de la matière cryptogamique traitée on n'obtient pas de psilocine.
EXEMPLE 10. -
Extraction de la psilocybine de cultures pures de Psilocybe Zapotecorum Hein.
<Desc/Clms Page number 21>
On dilue du moût de bière clair et frais, non additionné de houblon, avec de l'eau de ville, pour porter la teneur en extrait sec à 4,5%.A chaque litre de cette solution, on ajoute :
0,00834 g de FeSO4
10,0 g de "Cornsteep Solids" 0,30 g de NH4OH
0,30 g de KH2PO4
2,0 g d'agar-agar pH de la solution : 5,5.
On stérilise ce milieu de culture comme décrit à l'exemple 3 et on l'enseence avec la suspension du -mycélium d'une culture pure que l'on a obtenue à partir de spores de corps fructifères mûrs de Psilocybe Zapotecorum Heim du pays Chatino du Mexique. Au bout de 57 jours d'incubation à l'obscurité à 24 on obtient, à partir de 25 litres, 430 g de matière cryptogamique séchée, c'est-à-dire 17,2 g par litre. Pour isoler les corps actifs de cette matière, on procède selon les indications données à l'exemple 3. Quantité obtenue : 903 mg de psilocybine pure, soit une teneur de 0,21% par rapport à la matière cryptogamique séchée. Pas de Psilocine.
EXEMPLE 11. -
Extraction de la psilocybine et de la psilocine du Psilocybe Aztecorum Heim d'origine naturelle.
On sèche avec précaution les corps fructifères mûrs du Psilocybe Aztecorum Heim recueillis au Mexicue dans la région des Aztèques (sur le Popocatépelt à une altitude de 3. 300 à 3.500 m au- dessus du niveau de la mer). On les broie très finement et on les extrait à fond avec du éthanol comme décrit à 1''exemple 2. On ras- semble les extraits et on concentre à siccité sous pression réduite.
On poursuit le traitement du résidu comme indiqué à l'exemple 2 pour obtenir les corps actifs. On obtient 570 mg de psilocybine pure et 47 mg de psilocine, soit des teneurs de 0.2,; et de 0,017% respec- tivement par rapport à la matière cryptogamique séchée (285 g).
<Desc/Clms Page number 22>
EXEMPLE 12. -
Extraction de la psilocybine et de la psilocine . partir de cultures pures de Psilocybe Aztecorum Heim.
On prépare la solution nutritive de la façon suivante :
100 g d'extrait de malt 0,00417 g de FeSO4.7H20
0,00172 g de ZnSO4,7H20
1,0 g de Ca(NO3)2
0,25 g de 0,25 g MgSO4.7H20 de cm3
0,125 g de KCl 210 g d'agar-agar et on étend le tout avec de l'eau de robinet jusqu'à 1000 cm3.
On stérilise la solution nutritive à l'autoclave à 108 pendant 25 minutes. On ensemence 1 litre de cette solution nutritive avec 2 24 d'une suspension du champignon Psilocybe Aztecorum Heim.
On prépare cette suspension d'ensemencement selon les indications données à l'exemple 3 sous a). On incube les cultures à l'obscurité pendant 45 jours à 24 et on effectue la récolte comme décrit à l'exemple 3 sous c). Quantité obtenue à partir de 10 litres de so- lution nutritive : 86,5 g de mycélium séché. On secoue le mycélium très finement broyé avec 1 litre d'éthanol aqueux à 80% pendant 1/2 heure, à la température ambiante. hprès séparation du résidu par filtration, on extrait ce résidu encore trois fois de la même façon. On rassemble les extraits et on évapore.
Pour éliminer du résidu d'évaporation (8.9 g) les impuretés lipoïdes et les charges inertes, on extrait successivement à deux reprises avec 100 cm3 d'éther de pétrole, à deux reprises avec 80 cm3 de chloroforme et à deux reprises avec 50 cm3 d'acétone. Il reste 5,6 g d'une poudre soluble dans l'eau que l'on dissout dans 6 cm3 d'eau. En agitant bien on ajoute lentement à la solution 60 cm3 d'acétone, on sépare le précipité formé, on le redissout dans un peu d'eau et on précipite encore une fois avec une quantité décuple d'acétone.
On répète encore
<Desc/Clms Page number 23>
deux fois cette purification par précipitation sur la partie insolu- ble dans l'acétone, après quoi la totalité des corps actifs est passée dans les extraits aqueux-acétoniques. On évapore les ex- traits sous pression réduite et on parfait la purification du résidu.
(2,8 g) par chromatographie sur une colonne de poudre de cellulose comme il a été indiqué à l'exemple 3.
Après deux chromatographies on obtient 225 mg de psilocy- bine cristallisée et 15 mg de psilocine, soit des rendements de 0,26% et de 0,017,b, par rapport à la matière cryptogamique séchee.
EXEMPLE 13.-
Préparation d'une culture.
On prépare une solution nutritive de la façon suivante :
On dilue du moût de bière frais (clair et exempt de houblon) avec de l'eau de ville pour porter la teneur en extrait sec à 4,0 - 4,5% A chaque litre de cette solution, on ajoute : 0,00209 g de FeSO4.7H20 0,00086 g de ZnSO4.7H20
0,25 g de Ca(NO3)2 0,0625 g de KH2PO4
0,0625 g de MgSO4 0,31 g de KC1
2,0 g d'agar-agar
On stérilise cette solution nutritive comme à l'exeple 4 et on 1'ensemence Au bout de 48 jours d'incubation à 24 , on obtient, à partir de 55 litres, 924 g de sclerotes et de mycélium (extrait sec), c'est-à-dire 16,6 g par litre.
On peut effectuer l'isolement du corps actif comme décrit à l'exemple 4. rendements : psilocine 0,018 et psilocybine 0,12 par rapport à la matière cryptogamique séchée.
EXEMPLE 14- réparation d'une culture.
On prépare une solution nutritive de la façon suivante :
On dilue du moût de bière frais (clair et exempt de hou- blon) avec de l'eau de ville pour porter la teneur en extrait
<Desc/Clms Page number 24>
sec à 4,0 - 4,5% A chaque litre de cette solution on ajoute :
EMI24.1
0,00209 g de 'eSO. T3z0
0,00086 g de ZnSO4 7H20
1,0 g de Ca(N03)2-
2,0 g à'àgar-agar
On stérilise la solution nutritive comme à l'exemple 4, on l'ensemence, puis on l'incube. Au bout de 48 jours on récolte, par litre de solution nutritive, 20,5 g de sclérotes et de mycélium séchés à partir desquels on isole les corps actifs comme à l'exemple 4. Quantités obtenues : psilocine 0,011% et psilocybine par rapport à la matière cryptogamique séchée.
EMI24.2
MM, *eLZ-25, -
Préparation d'une culture :
On prépare une solution nutritive de la façon suivante :
On dilue du moût de bière frais (clair et exempt de hou- blon) avec de l'eau de ville pour porter la teneur en extrait sec à 4,0 - 4,5% A chaque litre de cette solution on ajoute :
0,00209 g de FeSO4.7H20
0,00086 g de ZnSO47H20
EMI24.3
OY25 g de KH2P0,
2,0 g d'agar-agar
On poursuit le traitement comme décrit à l' exemple 4. Au bout de 48 jours la production, par litre de solution nutritive, de sclérotes et de mycélium séchés est de 15,9 g. Pour isoler les corps actifs on procède comme à l'exemple 4. Rendements : psilocine 0,02% et psilocybine 0,11% de la matière cryptogamique séchée.
EXEMPLE 16.-
Préparation d'une culture.
On prépare une solution nutritive de la façon suivante:
On dilue du moût de bière frais 'clair et exempt de houblon) avec de l'eau de ville pour porter la teneur en extrait sec à 4,0 - 4,5 A chaque litre de cette solution on ajoute :
<Desc/Clms Page number 25>
0,00209 g de FeSO4.7H20 0,00036 g de ZnS04.7H20
20,0 g de Cornsteep Solids
2,0 g d'agar-agar.
On poursuit le traitement comme indiqué à l'exemple 4.
Au bout de 48 jours, on obtient, par litre de solution nutritive, 29,8 g de mycélium et de sclérotes séchés.
On isole les corps actifs comme indiqué à l'exemple 4.
Rendements : psilocine 0,012; et psilocybine 0,22% de la matière cryptogamique séchée.
EXEMPLE 17.-
Préparation d'une culture.
On prépare une solution nutritive de la façon suivante :
45 g d'extraits de malt
0,00417 g de FeSO4.7H20
0,00172 g de ZnSO4.7H20
1000 Cm3 d'eau de ville.
On stérilise la solution nutritive à l'autoclave à 108 pendant 25 minutes. On ensemence 1 litre de cette solution avec 10 cm3 d'une suspension du champignon Psilocybe mexicana. La prépa- ration de cette suspension d'ensemencement s'effectue selon les in- dications données à l'exemple 4. Après ensemencement, on cultive le champignon dans cette solution nutritive, par le procédé d'immersion mobile, à 24 . Il se forme des sphères de mvcélium analogues à du tapioca, comme cela est connu dans la culture immergée de champignons inférieurs. Au bout de 30 jours, on sépare le mycélium par filtra- tion et on obtient 7,0 g de mycélium séché par litre de solution nutritive.
On secoue pendant une demi-heure à la température ambian- te 430 g de mycélium sèche finement broyé avec 4,5litres d'étanel aqueux à 80%. Après séparation du résidu par filtration on extrait ce résidu encore 3 fois de la même façon. On réunit les extraits, puis on évapore. Pour éliminer les charges inertes du résidu (41 g), on extrait successivement avec 2 fois 500 cm3 d'éther de pétrole,
<Desc/Clms Page number 26>
2 fois 400 cm3de chloroforme et 2 fois 200 cm3 d'acétone. Il reste 25 g d'une poudre soluble dans l'eau que l'on dissout dans 25 cm3 d'eau.
En agitant bien, on ajoute lentement 250 cm3 d'acétone, puis on sépare liquide et précipité et on redissout ce dernier dans un peu d'eau. Après quoi, on précipite à nouveau avec une quantité dé- cuple d'acétone. On répète encore 2 fois cette opération sur la partie insoluble dans l'acétone : ce traitement a pour effet de faire passer la totalité des corps actifs dans les extraits aqueux- acétoniques. On évapore ces extraits sous bonne agitation et on chromatographie le résidu (9,8 g) sur une colonne de cellulose, corme indiqué à l' exemple 4.
Après une nouvelle chromatographie on obtient 32 mg de psilocine cristallisée et 225 mg de psilocybine, soit des rendements respectifs de 0,007 et de 0,05% par rapport au mycélium sec.