<Desc/Clms Page number 1>
L'invention a trait à de nouveaux composes antibio- tiques utiles et aux procédés Dour leur pfabrication. Plus particulièrement, elle a trait à de nouveaux antibiotiques sous des formes variées, et aux procédés pour les fabriquer par fermentation aussi bien que pour les concentrer, pour les purifier et pour les isoler, ainsi que pour fabriquer leurs sels. Sous sa forme libre, l'un des deux nouveaux antibioti- ques qui ont été isolés est appelé Amphotericyne A, et l'au- tre antibiotique est appelé Amphotericyne B ; et le terme non modifié Amphotericyne est utilisé pour.désigner de façon gé- nérique ces deux antibiotiques et leur mélange.
Les antibiotiques suivant l'invention sont préparés par la culture, dans des conditions contrôlées, d'une espèce, non découverte jusqu'ici de Streptomyces.
Le microorganisme.-
Le microorganisme utile pour la préparation d'Am- photericyne est une espèce découverte récemment de Strepto- myces isolé d'un échantillon obtenu à Tembladora sur la ri- vière Orinoco en Amérique du Sud. Une culture de l'organisme vivant a,été déposée et constitue une partie de la collec- tion de cultures mères du Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey), où elle est disponible ; elle a reçu le numéro 3694 dans la collection Wakaman et est dé- signée ci-aprèssous le nom de Streptomyces sp. 3694.
Il est bien entendu que l'invention n'est pas li- mitée à l'utilisation de l'organisme particulier décrit ici, mais comprend,'entre autres, des variantes fabriquées à par- tir de l'organisme- décrit par des agenrs déterminant un chan- gement, tels que des rayons X, des radiations ultra-violettes
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et des moutardes de nitrogène.
Pour isoler et caractériser le microorganisme, une partie de l'échantillon prélevé dans le sol est agitée dans de l'eau distillée stérile et est appliquée sur un milieu agar-agar Henrici. Ce milieu contient :
EMI2.1
<tb> Caseinate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ou <SEP> cas <SEP> N-Z <SEP> 5 <SEP> gm.
<tb>
EMI2.2
f> :-3 ¯ - ,:i" ...
EMI2.3
<tb> Glycerol <SEP> 5 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
K2HP0 <SEP> 2 <SEP> gm.
<tb>
EMI2.4
-MgSO .7H 2 gm FeSO 7Ii 0 Trace'
EMI2.5
<tb> Agar-agar <SEP> 15 <SEP> gm.
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
. Ce milieu est réglé à pH 7.0 et est stérilisé dans un autoclave à 121 C pendant 20 minutes. Après 7 à 10 jours d'incubation à 25 C, des colonies de Streptomyces sp. 3694 sont isolées du sol sur lequel elles sont appliquées. Ces colonies isolées sont alors cultivées sur un milieu d'agar- agar qui contient :
EMI2.6
<tb> Bacto-tryptone <SEP> 5 <SEP> gm.
<tb>
<tb>
Extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 3 <SEP> gm.
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 10 <SEP> gm.
<tb>
<tb>
Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 3 <SEP> gm.
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> jusqu'à <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
L'agar-agar est chauffé dans un autoclave à 121 C pendant 15 minutes.
Le microorganisme, lorsqu'il est essayé par lé pro- cédé d'application par bande sur l'agar-agar de levure de bière pour une activité antibiotique vis-à-vis à la fois des bactéries et des champignons, ne détruit aucune des bac- téries d'essai, mais détruit les champignons d'essai Saccha- romyces cerevisiae, Rhodotorula glutinis, Candida albicans
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et Aspergillus niger.
Ci-après, est donnée une description des colonies
EMI3.1
du. microorganisme soumises à une incubation pendant deaa 13 1'6- iodes différentes et sur des milieux différents : Plant de pommesde terre :
Au bout de 15 jours, la culture s'étend, três lour- de, humide, durcie, avec sensiblement la môme couleur que les pommes de terre, des spores blancs couvrant la partie de la culture sur la portion inclinée.
'Lait de tournesol :
En 7 jours, le noyau de la culture à la surface est incolore. Le lait tourne au bleu-pourpre, s'éclaircissant progressivement du sommet vers le fond et indiquant une protéolyse sans coagulation.
Agar-agar Czapek-Dox :
EMI3.2
ZuaN03' 3 gaz KH2PO,+, 1 gm.; KC1, 0,5 gm.; Mus04' 7H0 0, 5 gm.; FeSO. 7H0' 0 01 gm. - glucose, 40 gzn. ; acar- ' ' ' 4 f 2 , 0,01 gm.; glacose, gm.; agar- agar, 15 gm.; eau distillée jusqu'à 1,000 ml.
Aucune croissance en 15 jours en dépit de deux ino- culations ou ensemencements.
Plant d' agar-agar pourpre au glucose-milieu nutritif-brome cresol :
Extrait de boeuf, 3 gm. ; peptone de protéine, 10 gm.
EMI3.3
glucose, 10 gm. ; NaCl, 5 gm.; agar-agar, ,.20 gm. ; pourpre de brome cresol, 0,15 gm.; eau distillée jusqu'à 1,000 ml. pH 7,0.
Croissance modérément lourde en 51 jours, ridée brillante, asporogène. Le ridage sur tout les agar-agars est très caractéristique. Les rides sont parallèles, avec des dentelures en lignes droites dans la culture à angles droits les unes par rapport aux autres, dosant un aspect dé "murde
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m@qonnerieë avec des rectangles de différentes dimensions.
Flant d'agar-agar Sabouraud :
Glucose, 40 gm.; néopeptone, 1C gm. ; agar-agar, 15 gm. ; eau distillée 1.000 ml.
Au bout de 4 jours, la culture est jaune, tournant au brun au bout de 7 jours et toute brune au bout de 15 jours Là culture est lourde, d'abord brillante, puis tournant au mat, ridée avec un pigment brun diffusible visible au bout de 3 à 4 j ours.
Plant d'agar-agar glucose-asparagine :
Glucose,10 gm. ; K2HPO4, 0. 5 gm. ; asparagine 0, 5 gm.;agar-agar, 15 gm.; eau distillée, 1. 000 ml.
Au bout de 7 at 15 jours, la culture est modérément lourds, non ridée, incolore, avec des spores blancs tournant au gris, et un pigment jaune diffusible tournant au brun. En plus, une matière insoluble dans l'eau et d'un jaune foncé est déposé sur les bords du plant d'agar-agar à la base du plant. Cette matière est soluble dans le méthanol, le propa- nol et la formamide de diméthyle.
Le microorganisme est caractérisé en outre par le fait que du sulfure d'hydrogène n'est pas produit, comme le montre l'essai avec du papier à l'acétate de plomb dans un milieu contenant peptone de protéose, 20 gm.; glucose, 1 gm.; Na2HPO4, 2 gm.; et eau distillée jusqu'à 1 litre. La culture se développe sous forme d'une pellicule blanche as- porogène. De plus, de la gélatine Difco est liquéfiée. La Culture se développe sous forme d'un noyau légèrement brun et asporogène à la surface. De plus, dans un bouillon de n@ Çrate Difco, la culture se développe sous forme d'une pelli- cule légèrement brune et asporogène. Le bouillon s'assombrit avec un pigment brun de diffusion. Le nitrate est fortement
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réduit en nitrite.
De plus, de l'amidon est hydrolyse par la culture lorsque celle-ci se développe dans un milieu conte- nant de l'amidon.
Pour déterminer la teneur en carbone et en hydro- gène de- Streptomyces sp. 3694, des essais ont été effectués comme suit :quatre séries de tubes d'agar-agar avec des sels minéraux sont prép@rées avec 1 mg. par ml. de ces quatre sour- ces de nitrogène respectivement : (NHSO, NaNO3, aspara- gine et hydrolysat de caséine. Dans chaque série, chaque tu- be est renforcé avec 10 mg par ml. de l'une des seize sour- ces possibles de carbone et d'énergie. Celles-ci sont l'ami-. don, l'inuline, la dextrine,- le raffinose, le maltose, le lactose, le sucrose, le sorbose, le glucose, le dulcitol, l'inositol, le sorbitol, le mannitol, le xylose, l'arabinose et le glycérol.
L'agar-agar dans les tubes (10 ml.) est enfermé et les plants sont traités avec une suspension de spores le Streptomyces sp. 3694 dans de l'eau distillée. Au bout de 9 jours d'incubation, la culture a été examinée et est décrite sur le tableau I ci-annexé.
Les résultats indiquent que le microorganisme est susceptible d'assimiler du carbone à partir de l'amidon, de la dextrine, du maltose, du glucose et du mannitol, quelle que soit la source de l'hydrogène. Avec les sources organi. ques de nitrogène, le lactose, le sucrose, l'inositol et le glycérol peuvent également être utilisés, bien que une cul- ture avec ces sources de carbone puisse être plus légère qu'avec le glucose et ses polymères. Des nitrates ne servent pas de sources de nitrogène avec aucune des sources de carbo.. ne et d'énergie, tandis que l'asparagine et l'hydrolysat de caséine peuvent servir de seules sources de carbone, de nitre gène et d'énergie.
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EMI6.1
Les antibioti9ue8.
Le Streptomyces sp. 3694 produit un mélange d'anti- biotiques. Le mélange lui-même, aussi bien que les antibio- tiques spécifiques isolés de ce même mélange, présentent un spectre fongicide large, mais pas de propriétés bactéricides significatives.
Dans le but de fabriquer l'Amphotéricyne, le Strep- tomyces sp. 3694 est développé à une-température appropriée
EMI6.2
de 23 C, à 300CI de préférence à environ 25C, dans des con- ditions aérobies immergées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'hydrate de carbone assimilable et fermentable et une source de nitrogène assimilable.
Des sources appropriées d'hydrate de carbone, com- me indiquées ci-dessus, comprennent : l'amidon, la dextrine, les sucres tels que maltose, lactose et glucose, le glycérol, etc... Des sources appropriées de nitrogène comprennent l'as- paragine, l'hydrolysat de caséine, la farine de soja, de l'extr.ait de boeuf, de l'extrait de levure, etc... La fermen- tation est mise en oeuvre pendant environ 24 à 150 heures.
A la fin de cette période de temps, une quantité substantiel- le d'Amphotéricyne a été préparée (comme montré par des es- sais biologiques), comme cela sera décrit plus en détail dans les exemples.
Lorsque le développement de la culture a été com- plété, l'Amphotéricyne est séparée de la culture par l'un des trois procédés alternatifs suivants : (à) Le mycélium est séparé de tout le bouillon par filtration 'ou centrifugation, et l'Amphotéricyne est extraite du mycé- lium après avoir abaissé le pH du mycélium d'environ 2 à 3 par traitement avec un acide. L'extraction est effectuée avec un solvant approprié, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple l'isopropanol, le n-propanol ou le n-butanol). L'évaporation de 1'alcanol provoque la précipitation de l'Amphotéricyne
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brute.
(2) Tout le bouillon est alcalinisé à un pH d'environ 11, et de préférence à un pH d'environ 12, au moyen d'une base telle que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. Le bouillon est ensuite agité et filtré, et le filtrat est neu- tralisé à un pH d'environ 7 au moyen d'un acide tel qu'un acide minéral (par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou.l'acide phosphorique) pour précipiter l'Ampho- téricyne brute.
(3) Le pH de tout le bouillon est réglé soit à une valeur d'environ 2 à 3 (par traitement avec un acide), soit à une valeur de 10 à Il (par traitement avec une base), puisque l'Amphotéricyne est plus soluble à ces gammes de pH. Le bouillon est ensuite extrait avec un agent approprié d'ex- traction, tel que les alcanols mentionnés précédemment, puis est filtré et les phases sont séparées (si du n-butanol est utilisé). L'Amphotéricyne brute est ensuite précipitée direc- tement du filtrat par neutralisation un pH d'environ 7 et par enlèvement d'une partie de l'agent d'extraction par dis- tillation dans le vide.
Une purification ultérieure de l'Amphotéricyne brut* isolée par l'un ou l'autre de ces procédés résulte dans son fractionnement dans ses deux constituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne B. Ce fractionnement est mis en oeuvre par l'un ou l'autre des procédés ci-aprs : (1) Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouillie dans un alcool, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple le méthanol, le n-propanol, l'isopropanol et le butanol) à un pH bas (obtenu en traitant la bouillie avec un acide tel qu' un acide minéral) , et est filtré.
La matière insoluble'con- siste principalement en Amphotéricyne B brute; Le filtrat est
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neutralisé avec une base, telle que l'hydroxyde de sodium, pour provoquer la formation d'un précipité d'une matière cristallisée purifiée représentant principalement l'Ampho- téricyne A.
(2) Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouil- lie dans un solvant, tel qu'une amide d'acide alcanoique di- inférieur (alcoyle inférieur) (par exemple la formamide di- méthylique, l'acétamide diméthylique ou la formaide diéthy- lique), et est filtré . La matière insoluble consiste prin- cipalement en Amphotéricyne B brute. En traitant la solu- tion d'amide avec un mélange d'eau et d'un solvant polaire organique, tel qu'un alcool aqueux (par exemple une solution de méthanol et d'eau) ou une cétone aqueuse (par exemple une solution d'acétone et d'eau), on obtient un précipité cristallisé comprenant principalement l'Amohotéricyne A.
Les Amphotéricynes A et B sont des substances amphotériques qui forment aisément des sels avec à la fois des bases et des acides . Ainsi en traitant l'Amphotéricyne avec une base inorganique, telle qu'une base d'un métal alcalin (par exemple l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium) ou une base dun métal alcalino-terreux, le sel du métal correspondant est formé. En traitant l'Ampho- téricyne avec un sel d'un métal alcalino-terreux (par exem- ple le chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium) dan;. un alcool tel que le méthanol, des complexes sont fermés.
En faisant réagir l'Amphotéricyne avec un hydroxyde d'ammo- .nium ou une base de nitrogène organique, le sel correspon- dant d'ammonium ou d'aminé est formé.
Chacune des Amphotéricynes réagit de plus avec des acides à la fois minéraux et organiques pour former le sel de 1' acide correspondant. Ainsi l'Amphotéricyne peut être traitée par des acides minéraux, tels que l'acide chlorhy-
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drique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, pour for- mer le sel correspondant d'hydrochlorure, de sulfate ou de phosphate; ou encore elle peut être traitée par des acides organiques, tels que l'acide acétique, l'acide citrioue ou l'acide tartrique, pour former les sels des acides correspon- dants.
Les exemples ci-après illustrent, sans les limiter, des procédés appropriés pour préparer, purifier et fractionner l'Amphotéricyne.
Exemple 1.- Fermentation dans un récipient du Streptomyces sp. 3694.-
Une charge de 3600 litres de Streptomyces sp. 3694 est mise à fermenter avec le milieu d'ensemencement, pendant une durée et dans des conditions indiquées ci-après : Préparation d'ensemencement A.- Première phase
Source d'ensemencement - culture de Streptomyces sp, 3694, développée sur des plants d'agar-agar Gould.
Milieu-3% d'agent nutritif de Staley 4 S
2% de glucose
EMI9.1
ÔJ0005% C CiZ.6HZ0
0,1% CaCO3 pH réglé à 7,0 -7,2 Stérilisation pendant 30 minutes à 121 C Volume-100 ml. dans un ballon de 500 ml.
EMI9.2
Température=25 C
Ensemencement-72 heure sur un agitateur alternatif (170 cycles par minutes).
B. - Seconde phase
Source 'd'incubation ou d'ensemencement -10% de la premiè- re phase.
Milieu-le même que dans la première phase.
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Stérilisation -40 minutes à 121 C.
Volume-480 ml. dans un ballon de 2.000 ml.
EMI10.1
Température-25 C
Ensemencement-48 heures sur un agitateur alternatif (120 cycles par minute) Conditions de fermentation Milieu-3% d'agent nutritif de Staley 4S
2% de glucose
0,25% de CaC03
0,1% NaCl
0,0005% CoCl2
Stérilisation-15 minutes à 121 C de pleine dilution.
Température-25 C
Agitation-.2 Hp/454 1.
Aération-60 cm/min. de vitesse d'air superficielle
Cycle de fermentation -144 heures
Anti-mousse-huile de combustion de première qualité (environ 0.5% de la charge)
Importance de l'ensemencement -480 ml. de la seconde phas du ballon (4%)
Volume -12,000 ml.
Les résultats de la fermentation sont donnés dans le ta- bleau ci-après (eu égard à deux charges ):
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EMI11.1
<tb> Charge <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Durée <SEP> de <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S. <SEP> Cerevisae <SEP> pH <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisae
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fermentation, <SEP> Unités <SEP> de <SEP> dilution <SEP> Unités <SEP> de <SEP> dilu-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> heures <SEP> Extrait <SEP> 36 <SEP> Bouillon <SEP> (*) <SEP> tion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> heure <SEP> Extrait <SEP> Bouillon <SEP> pH
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> ' <SEP> @ <SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,6 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,2 <SEP> 640 <SEP> 120 <SEP> 7,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 49 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,0 <SEP> 120 <SEP> 120 <SEP> 7,
1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 73 <SEP> 8000 <SEP> 180 <SEP> 7,1 <SEP> 12000 <SEP> 80 <SEP> 7,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 97 <SEP> 4000 <SEP> 80 <SEP> 7,0 <SEP> 3000 <SEP> 120 <SEP> 7,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 121 <SEP> 3000 <SEP> 40 <SEP> 6,9 <SEP> 4000 <SEP> 120 <SEP> 7,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 144 <SEP> 9706 <SEP> 2560 <SEP> 7,2 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 8,1
<tb>
(@) Des échantillons ont été centrifugés (les es- sais sur le milieu surnageant étant reportés comme bouillon et le centrifugat extrait avec un volume de butanol égal 4 l'échantillon original (les essais sur cet extrait étant re- portés comme extrait).
Exemple 2. - Fermentation dans un ballon agité, de Streptomyces sp.3694
Un ensemencement approprié, prépaie suivant la ma- nière décrite dans l'exemple 1, est introduit dans un milieu de fermentation contenant :
EMI11.2
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> pulvérisées <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dextrose <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CoCl2.6H2O <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> d'une <SEP> solution
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO <SEP> 1 <SEP> gm <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> 1 <SEP> litre <SEP>
<tb>
Le milieu est stérilisé dans un autoclave à 121 C pendant 20 minutes préalablement à l'introduction dans l'en- semencement,
Au bout de quatre jours, des essais ont été ef- fectués vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae avec une partie
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du bouillon qui a été lyophilisée et reconstituée avec de' l'eau jusqu'à environ 2 fois 1/3 de la concentration origina- le (sur à la fois le bouillon clair qui surnage et sur l'ex- trait à l'alcool butylique des cellules lavées, reconstituées jusqu'au volume de l'échantillon original) donnant les résul- tats ci-après :
Essai S.cerevisiae
Unités de dilution/ml.
Fluide surnageant du bouillon 5000 Extraits des cellules 5000 Comme résultat de ces essais, la fermentation est mise en oeuvre pendant 5 jours et, à la fin de cette période, un es- sai du bouillon sur son activité montre qu'il est actif vis.- à-vis du Candida albicans dans un essai sur une rondelle.
L'Amphotéricyne peut être extraite de tout le bouil- lon suivant la manière illustrée par les exemples ei-après :
Exemple 3 Extraction à l'isopropanol de tout le bouillon
L'extraction de l'Amphotéricyne préparée dans l'exem' ple 1 à partir de tout le bouillon est mise en oeuvre en ajou- tant 80 à 170% du volume du bouillon en isopropanol et en ré- glant à un pH de 2,0 avec de l'acide sulfurique. Après agi- tation pendant environ 1/2 heure, le mélange est filtré, de préférence en utilisant l'aide d'un filtre. Le pH du. filtrat est réajusté à environ 7 avec de l'hydroxyde de sodium et l'i- sopropanol est éliminé par distillation dans le vide à une température non supérieure à 35 C.
Le mélange est ensuite lais..., se dans une chambre froide pendant la nuit, le précipité qui se forme est éliminé par filtration, lavé avec de l'acétone et séché dans le vide. Un mélange d'Amphotéticyne A et d'Am- photérycyne B est obtenu avec un rendement d'environ 40,..Les essais sur le mélange ont été effectués à environ 150U-2500
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du/mg (Saccharomyces cerevisiae).
EMI13.1
E1#l.l.PJ..D 4. - Extraction au butanol de tout le bouillon.-
A 9,4 litres de tout le bouillon, essai 3.000 du/ml on ajoute un quart de son volume de butanol. Le pH estabai- sé à 2,0 avec de l'acide sulfurique et le mélange est bien agité pendant 1/2 heure. Le produit Hyflo (5% w/v) ou tout autre aide filtrant est alors ajouté et le mélange est fil- tré. Le filtrat est placé dans un entonnoir de séparation et la couche de butanol est séparée et retenue. La solution de butanol est alors distillée jusqu'à 1/3 de son volume ori- ginal sous vide à une température non supérieure à 35 C. Il se forme un précipité qui est éliminé par filtration, qui est bien lavé avec de l'acétone et qui est séché dans le vide.
Le produit, qui est obtenu avec un rendement d'environ 22%,
EMI13.2
est un mélange df Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B et des esssais sont effectués avec environ 1600 du/mg vis-à-vis du Saccharomyces cervisiae et avec environ 960 du/mg vis-à-vis du Candida albicans.
EXEMPLE 5.-
EMI13.3
Extraction d t Amphotéricyne du mycélium -
1 litre de tout le bouillon contenant de l'Amphoté- ricyne est centrifugé pour séparer le filtrat .et le mycélium.
Le gâteau humide de mycélium est agité avec 200 ml de' n-pro- panol, est réglé à un pH de 2,0 à 3,0 avec de l'acide sulfuri- Que et est laissé dans une chambre froide pendant la nuit. Le propanol est séparé par centrifugation et le gâteau mycélial est'extrait trois nouvelles fois avec 100 ml de portions de n-propanol. Les extraits combinés de propanol sont concentrés
EMI13.4
dans le vide sous un faible volume d'environ 130 mol. , volume ,'pour lequel se forme un précipité. Ce'précipité est éliminé
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par centrifugation et est séché dans le vide.
On récupère en- viron 1,114 gm, avec une puissance d'environ 1176 du/mg vis- à-vis du Candida. 820 mg de ce produit solide est finement pulvérisé et est dissous par chauffage dans un mélange de
80 ml de n-butanol et 16 ml de méthanol, alors oue 80 ml d'eau sont ajoutés progressivement. Acette solution, sont a- joutés 48 ml d'hexane , et le mélange est agité, puis est laissé reposer à la température ambiante pendant la nuit. Une = fraction de cristaux jaunes pâles d'Amphotéricyne est formée; elle est filtrée et séchée dans un dessicateur. D'autres frac- tions d'une matière moins pure peuvent êtreobtenues par con- centration des liqueurs mères dans le vide.
EXEMPLE 6. -
Extraction de tout le bouillon basique.-
A un échantillon de 500 ml de tout le bouillon con- tenant de l'Amphotéricyne et donnant un essai de 11.000 du/ ml,vis-à-vis du Saccharomyces cerevisiae, est ajouté un volu- me égal d'alcool isopropylique. Le pH de ce mélange est alors élevé à 10,5 en utilisant de l'hydroxyde de sodium à 20%.
Ce mélange est ensuite agité pendant 1/2 heure., on ajoute 2% de Hyflo (w/v), et le mélange est filtré. Le pH du filtrat est abaissé à 7 en utilisant 20% d'acide sulfurique et l'al- cool isorpopylique est éliminé dans le vide à une température non supérieure à 25 C. Après avoir laisse reposer -pendant une nuit, le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'eau puis à l'acétone et est séché dans le vide. Le rende- .ment s t élèce à environ 1,22 g (77) d'un mélange d'Amphoré- ricyne A et d'Amphotéricyne B, dont l'essai donne environ
3400 du/mg (Saccharomyces cerevisiae).
Les mélanges d'Amphotéricyne peuvent être fraction- nés en leurs constituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne 6
<Desc/Clms Page number 15>
par les procédés illustrés dans les exemples ci-après : EXEMPLE 7. -
Cristaillisation utilisant de l'alcool.- L'Amphotéricyne obtenue dans .1' exemple 1) est placée dans une bouillie de 70% d'alcool isopropylique et de 30% d'eau à une concentration de 32.000-35.000 u/ml. de Candida albicans, tout en agitant; le pH est abaissé à 2 avec de l'a cide chlorhydrique.
La matière insoluble (Amnhotéricyne
5 brute) est éliminée par filtration et le pH du filtrat est ,'levé à environ 7,5' Après avoir laissé reposer pendant une nuit,le précipité cristallisé, consistant principalement en Amphotéricyne A purifiée, est éliminé par filtration, est :lavé à l'acétone et séché dans le vide.
Le rendement d'Ampno- téricyne A est d'environ 50% sur une base d'activité biologi- que
EXEMPLE 8. - Cristaillisation utilisant la formamide diméthylique.-
L'Amphotéricyne obtenue dans l'exemple 5 est traitée en bouillie dans la formamide diméthylique (lg/20 ml). Tout en agitant, le pH est abaissé à 7, en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré. Après agitation pendant 1/2 heure, le produit Hyflo (1% w/v) est ajouté et le mélange est filtré.
Au filtrat, est ajouté un volume de méthanol, suivi par la len te addition d'un volume d'eau. (Bien qu'une solution de métha- nol et d'eau soit préférée, l'éthanol, l'acétone ou le dioxane dans l'eau exercent également une action effective).On laisse .alors le mélange reposer pendant la nuit avec le pH résultant de 4,5. Le précipité ainsi formé est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché. Il est composé de 85-90% d'Amphotéricyne B,de 5-10% d'Amphotéricyne A et d'une faible quantité d'autres impuretés.
Le pH de la liqueur mère résultanne d'où l'Amphoté-
<Desc/Clms Page number 16>
@ B a été isolée est ensuite élevé à 8 par addition d'hy- droxyde de sodium, et on ajoute encore 3 volumes d'eau. Après avoir laissé reposer pendant la nuit, le précipité est élimi- né par filtration, est lavé à l'acétone et est séché. Ce pré- cipité est composé de 80-85% d'Amphotéricyne A, de 5-10% d'Am- photéricyne B et d'une faible quantité d'autres impuretés.
La récupération da toute l'activité s'élève à 90- 95%.
La fraction contenant par prédominance l'Amphotéri- cyne B peut être encore purifiée en la traitant en bouillie dans 70% d'isopropanol aqueux, à une concentration de 1 g par 100 ml à un pH 2 pendant 1/2 heure. Le mélange est ensui- te filtré, le filtrat.est chauffé à 45 C et le pH est élevé lentement à 5 avec de l'hydroxyde de sodium. On laisse ensuite le mélange refroidir lentement à la température ambiante et reposer pendant la nuit. Le produit cristallisé (rendement d'environ 50%) est ensuite éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché. Il représente essentiellement l'Am- photéricyne B pure.
La fraction contenant par prédominance l'Amphotéri-. cyne A peut être à nouveau purifiée en la traitant en bouillie dans la formamide diméthylique à une conceration de 1 g par 20 ml, en agitant pendant 1 heure, én éliminant par filtra- tion les matières insolubles et en ajoutant le filtrat lente- ment à un volume égal de méthanol aqueux à 50%. Le précipité cristallisé est éliminé par filtration après avoir reposé pen- dant la nuit, est lavé à l'acétone et est séché. L'Amphotéri- cyne A sensiblement pure est obtenue ainsi avec un rendement de 70-0% approximativement.
Le fractionnement et la cristallisation des produits obtenus dans les exemples 1 à 5 peuvent également être mis en oeuvre par les procédés soit de l'exemple 7, soit de l'exemple
<Desc/Clms Page number 17>
8, ce dernier étant cependant préféré à raison des rendements plus élevés de la fraction pure obtenue.
Des sels et des complexes d'Amphotéricyne peuvent être préparés suivant les procédés indiqués dans les exemples ci-après.
EXEMPLE 9. - Préparation de sels.de métaux alcalins d'Amphotéricyne.-
L'Amphotéricyne, soit en un mélange brut, soit sous
EMI17.1
la forme de cristaux purifiés dtArtiphatéricyne A ou B, forme aisément des sels et le procédé suivant est également efficac pour former soit le sel de sodium ou de potassium du mélange, soit les constituants purifiés A ou B.
L'Amphotéricyne A cristallisée est mise en suspen- sion dans une quantité de.méthanol telle que la concentration de l'antibiotique soit d'environ 250.000 u/ml (Saccharomyces cerevisiae). 2 équivalents d'hydroxyde de sodium méthanolique 1 N sont ajoutés et le mélange est agité pendant 15 minutes pour assurer une solution complète de l'antibiotique. La solu tion est filtrée et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au fil-
EMI17.2
trat. Un précipité de seul de sodium est ainsi formé, est ,éli- miné par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans un dessicateur. Le rendement du sel de sodium est d'environ 90% de l'Amphotéricyne originale basée sur son activité biolo. gique.(in vitro).
EMI17.3
Le sel q.!¯'c?d2-.um'jO)IJ.ésel1te dans l'eau une solubili- t' .. :.:r.zao JP..9::Z20t'E1,.:::lfl:::9Y' ::k'pht;>4ticyn,E: lez cr.istalli- sée orio;i!1IEi'.; f:tli"'pJ,"'r.$t é4lc?m&.nt.iunë"Ibo'niie ! Solubilibé danf. le :i'GlcrIlCl .Tu?1:c'';CY.r?Tl&I??3..dQ."(J''..1.,'itCa:I'j..:fIJ.2, 1-1 est eue loue De Li soluble (:81113 l'éth::"1tlol pt l-'isoprooanol, mais insolublf dans ? r: tYr l'acétone, le bvtD1J01, le chlorofo:r'J'18', le benzène, l'hexf'lnc eut le dioxane.
<Desc/Clms Page number 18>
EXEMPLE 10.- Préparation du complexe de chlorure de calcium.. -
Un complexe de chlorure de calcium d'Amphotéricyne peut être préparé en dissolvant l'Amphotéricyne cristallisée soit A, soit B (ou un mélange des deux) dans 1% de chlorure de calcium méthanolique (1 gm/20 ml.), en éliminant par filtra. tion toute matière insoluble et en ajoutant 5 volumes d'acé- tone au filtrat. Le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans le vide. La solubilité du complexe de chlorure de calcium dans des solvants organiques est analogue à celle des sels acides. Cependant, dans l'eau, le complexe s'hydrolyse et sa solubilité est celle de l'Am- photéricyne orginale.
EXEMPLE 11.- Préparation d'un sel acide.-
L'Amphotéricyne A ou B cristallisée (ou un mélange des deux) est dissoute dans la formamide diméthylique (lg/ 25 ml) , et un équivalent d'acide chlorhydrique concentré y est ajouté. Le mélange est filtré et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au filtrat neutre. Le précipité ainsi formé est éli- miné par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans' un dessicateur dans le vide. Le produit qui est obtenu avec un rendement d'environ 90%, contient un équivalent d'acide et présente in vitro une activité biologique équivalente à celle de l'Amphotéricyne cristallisée. Il est quelque peu plus solu. ble dans l'eau et bien plus solub-le dans le méthanol, l'étha- nol, l'isopropanol et le butanol que ne l'est l'Amphotéricyne cristallisée.
Cependant, le sel acide est insoluble dans l'a- cétone, le chloroforme, l'éther, le benzène, l'acétate d'éthy le et l'hexane.
Le sulfate a été préparé de- la même manière en sub- stituant un équivalent d'acide sulfurique à l'acide chlorhy-
<Desc/Clms Page number 19>
drique. Il présente des propriété analogues à celles de l'hydrochlorure.
EMI19.1
Propriétés chimiques et nhysiques de l' i\.mphotéri9l.!.18.-
L'Amphotéricyne A cristallisée présente les carac- téristiques physiques et chimiques suivantes : Point de fusion :
EMI19.2
Ponce à 1$U-lt's5 C, brunit et se contracte à la$-z0U C fond avec décomposition à environ 210 C.
Analyse élémentaire : C - 59,28% H - 8,43% N - 1,81% 0 - 30,48% (par différence) Aucun autre élément présent.
Pas de groupes méthoxy ou acétyle.
Pouvoir rotatoire spécifique :
EMI19.3
La 4 C + 1630 (pyridine); +931 (acide acétique); +136 (formamide diméthylique); +28 (O,1N HCl dans le méthanol).
Solubilité : Bonne solubilité dans l'acide acétique glacial et la formamide dimëthylique. Soluble jusqu'à la proportion d'environ 1 mg/ml dans le méthanol, l'alcool isoppopylique aqueux et le butanol humide, bien plus soluble dans ces solvants lorsqu'il est aci- difié ou fortement alcalinisé (par exemple dans une solution
EMI19.4
d'alcool isopropylique à 50%, la solubilité de l'Amphotéricynes A est, comme indiqué, approximativement 1 mg/ml à un pH entre 3 et 8; à un pH de 2,9 et 10, cependant, la solubilité est 3 mg/ml, alors qu'à un pH 11, la solubilité est augmentée jusqu'à 8-10 mg/ml).
L'antibiotique est insoluble dans l'eau à un pH neu- tre ou acide dans les conditions ordinaires, mais est soluble à un pH 10 et au-dessus. Cependant, dans des solutions diluées,
<Desc/Clms Page number 20>
l'antiobotique peut être dissous dans une solution aqueuse neutre en augmentant le pH d'une suspension de la matière à 11, comme, par exemple, avec de l'hydroxyde de sodium. La so- lution ainsi formée peut être neutralisée avec un acide sans que se produise une précipitation quelconque.
EMI20.1
L'Amphotéricyne A est insoluble dans l'éther, le dioxane, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, le chlorofor- me, le benzène, l'acétone, l'hexane, l'éthanol absolu , l'iso' propanol ou le butanol.
Spectre d'ultra-violet :
EMI20.2
Les maxima d'absorption dans l'ultra-violet et l'Amphotér1cyne A cristallisée dans le méthanol sont :
EMI20.3
1 ,t Max. (m ) F, 1% ff l jf 1
EMI20.4
<tb> 228 <SEP> 280
<tb>
<tb>
<tb> 280 <SEP> 262
<tb>
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<tb> 291 <SEP> 520 <SEP> . <SEP>
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<tb>
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304 <SEP> 780
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<tb> 318 <SEP> 715
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<tb> 343 <SEP> 24
<tb>
<tb>
<tb> 362 <SEP> 34
<tb>
<tb>
<tb> 381 <SEP> 55
<tb>
<tb> 405 <SEP> . <SEP> 66
<tb>
Certains maxima d'absorption dans la région 362-
EMI20.5
405 peuvent lêtre dis à la présence d'un peu d'Amphotéricyne B Spe ctre dtinra-,i,ouge .1 t',- Le spectre d'1 absorption dans l'infra-rouge de L'Amphotéricyne A en suspension 'dans le milieu Nujol montre oies pointes (et des paliers indiqués par "sh") pour les fréquences et lon- gueurs d'ondes suivantes :
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
<tb> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb>
EMI21.2
(am-1) '¯¯¯¯¯¯
EMI21.3
<tb> 3333 <SEP> 3. <SEP> 00 <SEP> , <SEP> 1129 <SEP> 8.86
<tb>
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<tb> 1695 <SEP> 5.90 <SEP> 1105 <SEP> 9. <SEP> 05
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<tb> 1656 <SEP> 6.04 <SEP> 1066 <SEP> 9.38
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<tb> 1623 <SEP> 6. <SEP> 16 <SEP> sh <SEP> 1035 <SEP> 9.66
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<tb> 1567 <SEP> 6.38 <SEP> sh <SEP> 1008 <SEP> 9.92
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<tb>
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<tb> 1546 <SEP> 6.47 <SEP> 992 <SEP> 10.08
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<tb> 1425 <SEP> 7.02 <SEP> sh <SEP> 977 <SEP> 10.24 <SEP> sh
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<tb> 1403 <SEP> 7.
<SEP> 13 <SEP> 940 <SEP> 10.54
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<tb> 1374 <SEP> 7.28 <SEP> sh <SEP> 912 <SEP> 10. <SEP> 96
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<tb> 1323 <SEP> 7.56 <SEP> 893 <SEP> 11.20
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<tb> 1276 <SEP> 7.84 <SEP> sh <SEP> 877 <SEP> 11.40
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<tb> 1232 <SEP> - <SEP> 8.12 <SEP> 850 <SEP> 11.76
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<tb> 1201 <SEP> 8.32 <SEP> sh <SEP> 836 <SEP> 11. <SEP> 96
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<tb> 1183 <SEP> 8.45 <SEP> 810 <SEP> 12.34
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<tb> 1159 <SEP> 8.63 <SEP> 794 <SEP> 12.60
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<tb>
<tb>
<tb> 760 <SEP> 13.16
<tb>
Equivalent neutre de l'Ampbotéricyne A cristallisée :
929 en titrant comme une base
989 en titrant comme un acide
Stabilité du pH : . Stable pour tous les pH entre 3 et 11 pour au moins une durée allant jusqu'à 24 heures. A un pH aussi bas que 2, l'Amphoté- ricyne A est stable pour une durée de 3 heures avec seulement une faible quantité de décomposition qui se produit .
Stabilité thermique :
EMI21.4
Stable jusqu'à environ 70 0 dans une solution neutre d t 3.sopr6. panol à 50%.
Essais chimiques : Fournit une couleur jaune avec du chlorure ferrique. l'Amphotéricyne'B cristallisée présente les caractéristiques physiques et chimiques suivantes :
<Desc/Clms Page number 22>
Point de fusion : Aucun point de fusion distinct; fonce et carbonise.
Analyse élémentaire :
C . 56,70% H = 7,72%
N = 1,87% 0 - 33,71%
Aucun autre élément présent.
Ni groupes méthoxy ni groupes acétyle Pouvoir rotatoire spécifique : [- [alpha] ]D24 C + 238 (formamide diméthylique); -52,2 (0,1 N HC1 dans le méthanol).
Solubilité : Bonne solubilité dans la formamide diméthylique et dans l'a- cide acétique glacial. Soluble jusqu'à la proportion.de 0,5 mg/1 dans le méthanol, l'alcoll isopropylique aqueux et le butanol humide, et beaucoup plus soluble dans ces solvants lorsqu'elle est acidifiée- ou fortement alcalinisée.
Spectre d'ultra- violet : lies maxima d'absorption dans l'ultra-violet de l'Amphotéricyne B cristallisée dans le méthanol sont :
EMI22.1
<tb> # <SEP> Max. <SEP> (Mu) <SEP> E11% <SEP> cm
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<tb>
<tb>
<tb> 225 <SEP> 230
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 263 <SEP> sh <SEP> 42,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 273 <SEP> 60,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 283 <SEP> 76,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> 345 <SEP> 390
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 362- <SEP> 830
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 382 <SEP> 1380
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 405 <SEP> 1540
<tb>
<Desc/Clms Page number 23>
Spectre d'infra-rouge :
Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge de l'Amphotéricyne B en suspension dans le milieu Nujol montre des pointes (et des paliers indiqués par "sh") pour les fréquences et Ion-' gueurs d'ondes suivantes :
EMI23.1
<tb> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> , <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> (cm-1) <SEP> ( ) <SEP> (cm-1) <SEP> ( )
<tb>
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<tb> 3333 <SEP> 3.00 <SEP> 1042 <SEP> 9.
<SEP> 60 <SEP>
<tb>
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<tb> 1709 <SEP> 5.85 <SEP> 1008 <SEP> 9.92
<tb>
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<tb> 1577 <SEP> 6.34 <SEP> 981 <SEP> 10.19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb> 1401 <SEP> 7.14- <SEP> 965 <SEP> 10.36 <SEP> sh
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1374 <SEP> 7.28 <SEP> ' <SEP> 903 <SEP> 11.08
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1323 <SEP> 7.56 <SEP> sh <SEP> 886 <SEP> 11.29
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1266 <SEP> 7. <SEP> 90 <SEP> 852 <SEP> 11.74
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1232 <SEP> 8.12 <SEP> 812 <SEP> 12K32 <SEP> sh
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1192 <SEP> 8.39 <SEP> 794 <SEP> 12.60
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1174 <SEP> 8.52 <SEP> 758 <SEP> 13.
<SEP> 20 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1134 <SEP> 8.82
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1106 <SEP> 9.04
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1068 <SEP> 9. <SEP> 36
<tb>
Equivalent neutre de l'Amphotéricyne B cristallisée : en 760/titrant comme une base La stabilité du pH et la stabilité thermique de l'Amphotéricy ne B sont analogues aux stabilités correspondantes de l'Am- photéricyne A.
Propriétés biologiques des Amphotéricynes.- l'Amphotéricyne, considérée comme le mélange et connut me l'Amphotéricyne A et l'Amphotéricyne B purifiées, présente un large spectre fongicide, comme indiqué par le tableau sui- vant :
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
<tb> Amphotéricynes <SEP> Amphotéricyne <SEP> A <SEP> Amphotéricyne <SEP> B
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mélangées
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MIC <SEP> dans <SEP> /ml <SEP> MIC <SEP> dans <SEP> /ml <SEP> MIC <SEP> dans <SEP> #/ml
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Saccharomyces <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cerevisiae <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP> 25-
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Aspergillus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fumigatus <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Aspergillus <SEP> niger <SEP> 3.
<SEP> 1 <SEP> 3.1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Pénicillium <SEP> notatum <SEP> 3.1 <SEP> 3. <SEP> 1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Ceratostomella <SEP> Ulmi <SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 3.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Candida <SEP> albicans <SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 6. <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Tiichophyton
<tb>
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<tb>
<tb> mentagrophytes <SEP> 9533 <SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 12.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Microsporum <SEP> audouii <SEP> 12.5 <SEP> 3. <SEP> 1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Microsporum <SEP> canis <SEP> 3. <SEP> 1 <SEP> 3.1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Botrytis <SEP> tulipae <SEP> 6.3 <SEP> 6.
<SEP> 3 <SEP> 100
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Rhodotorula <SEP> glutinis <SEP> 3. <SEP> 1 <SEP> 3. <SEP> 1 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> -Fusarium <SEP> bulbigenium <SEP> 6. <SEP> 3 <SEP> 6. <SEP> 3 <SEP> 100
<tb>
Le tableau ci-dessus ne représente pas une indica- -tion exacte de l'activité de l'Amphotéricyne B, puisque cet antibiotique est extrêmement insoluble et que, par suite,son efficience dans le milieu agar-agar utilisé pour déterminer le spectre fongicide ci-dessus est grandement diminuée.
Ainsi, dans les essais de tubes dans le bouillon, lorsque l'Amphoré- ricyne B est comparée aux Amphotéricynes mélangées en ce qui concerne l'efficience vis-à-vis de Candida albicans et Sachha- romyces cerevisiae, il a été détermuné que l'Amphotéricyne B était respectivement 8,10 et 6,17 fois plus efficace que ne le sont les Amphotéricynes mélangées.
D'autres essais ont été effectués sur des oeufs et- sur des souris pour déterminer 1'efficience de l'Amphotéricy- ne sous forme de mélange et sous forme d'Amphétéricyne A pu- re et d'Amphotéricyne B pure vis-à-vis de Candida albicans.
Les conditions et les résultats des essais représentatifs a-
<Desc/Clms Page number 25>
vec des oeufs (voir tableau Il) et avec dos souris (voir ta- bleau III) sont les suivants :
Dans les deux essais, les antibiotiques utilisés é- taient :
(1) un mélange d'Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B dissous dans l'acétamide diméthylique puis dilué dans l'eau de façon que le rapport final entre les antibiotiques et le solvant soit de 1 à 10 (désigné ci-après sous le nom de "base"), (2) un mélange de sels de sodium d'Amphotéricyne A et d'Ampho- téricyne B dissous dans l'acétamide diméthylique puis dilué dans l'eau de façon que le rapport final entre les antibioti- ques et le solvant soit de 1 à 10 (désigné ci-après sous le nom de "sel Na"), (3) Un mélange des hydrochlorures de l'Amphotéricyne A et de l'Amphotéricyne B dissous dans l'acétamide diméthylique puis dilué dans l'eau de façon que le rapport final entre les an- tibiotiques et le solvant soit de 1 à 10 (désigné ci-après sous le nom de "sel HCl").
La toxicité .de l'Amphotéricyne est présentée sur le: tableau IV, sur lequel l'Amphotéricyne a été utilisée sous forme du mélange dans le but de procéder aux essais.
L'Amphotéricyne soit en mélange, soit individuelle- ment, est utile pour combattre les champignons pathogènes qui provoquent la dermatomycose et des mycoses généralisées.
Spécifiquement, elle est efficiente dans le traitement du "pied d'athlète", de la ooccidioidomycose, des moniliases, de la' blastomycose, etc.... Ainsi, pour la prophylaxie et la thérapeutique dans une infection moniliale et d'autres champi- gnons, l'Amphotéricyne peut être administrée à des personnes humaines par voie buccale sous forme de tablettes contenant 1/2 à 1 gm de l'antibiotique;
et elle peut être ainsi utilisée en combinaison avec'des antibiotiques bactéricides à large
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spectre, tels que l'oxytétracycline, la chlorotétracycline ou la tétracycline, à la place de la nystatine pour surmonter le développement des champignons résultant.
Comparaison de l'Amphotéricyne avec d'autres antibiotiques.-
Puisque l'Amphotéricyne, à la fois sous forme de mélange et individuellement, manifeste certaines caractéristi ques analogues à celles d'autres antibiotiques, des essais physiques et biologiques comparatifs ont été effectués pour établir qu'il s'agit de nouveaux antibiotiques, non préparés ni décrits précédemment.
L'Amphotéricyne présente une gamme élevée d'activi té si on la compare à la' nystatine et à la Rimocidine. Une comparaison d'un mélange purifié d'Amphotéricynes A et B avec une charge purifiée de nystatine vis-à-vis de deux or- ganismes-témoins donaa le résultat suivant :
EMI26.1
<tb> Organisme-témoin <SEP> Rapport <SEP> d'activité
<tb> Amphotéricyne/ <SEP> nystatine <SEP> '
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 2,86
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 5,62
<tb>
Connue la Rimocidine présente un spectre fongicide analogue à celui de la nystatine et de lf Amphotéricyne, elle a été essayée sous la forme de son sulfate à côte de l'Am- photéricyne et de la nustatine vis-à-vis de S. Cerevisiae.
Elle est moins active que la nystatine ou l'Amphotéricyne sur la base du poids, comme l'indique le tableau suivant.;
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EMI27.1
<tb> MIE <SEP> vis-à-vis <SEP> de <SEP> S. <SEP> cerevisia <SEP>
<tb> u./ml..
<tb>
<tb>
Nystatine <SEP> 0,512 <SEP> (8 <SEP> essais)
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> Rimocidine <SEP> 0,915 <SEP> (9 <SEP> essais)
<tb>
<tb> Amphotéricyne <SEP> 0,160 <SEP> (10 <SEP> essais)
<tb>
Ces résultats montrent les propriétés supérieures de l'Amphotéricyne par comparaison avec la nystatine et la Rimocidine vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans.
Une autre comparaison entre l'Amphotéricyne et la nystatine est effectuée en comparant leur efficience vis-à- vis de Candida albicans sur des souris. Un mélange d'Ampho- téricyne A et dtAmphotéricyne B est dissous dans l'acétami- de diméthylique pure,. La solution est ensuite diluée avec de l'eau distillée. Pour ltessai , des souris mâles pesant 19-23 grammes sont inoculées par voie infra-veineuse avec Candida albicans, chaque souris recevant 2 x 106 cellules comme déterminé par des lectures dans un colorimètre. Ces souris sont ensuite traitées, soit par voie sous-cutanée (s.c.) soit par os (p.o.) deux fois chaque jour pendant deux jours avec le médicament indiqué sur le tableau V ci-annexé.
Les souris sont mises en observation pendant 10 jours (240 heures) et chacun des animaux ayant survécu au bout des 240 heures se voit attribuer une valeur 240 heures pour le but de calculer la durée moyenne de survivance*
Les résultats sont représentés sur le tableau V.
En dehors des différences biologiques précitées,. l'Amphotéricyne diffère physiquement de la nystatine, de la Rimocidine et de l'Asconsin comme indiqué par les comparai- sons suivantes du pouvoir rotatoire spécifique et du spectre d'absorption dans l'ultra-violet :
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EMI28.1
Pouvoir rotatoire spécifique de 1* Amphotéricyne A, de 1* Am- photéricyne B, de lanystatine, de la Rimocidine et de 1 ASCOnSiTU C -7 1)
EMI28.2
<tb> Solvant <SEP> 0,1 <SEP> N <SEP> HCl
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Antibiotique <SEP> Pyridine <SEP> Acide <SEP> Formamide <SEP> dans <SEP> le
<tb>
EMI28.3
]¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯ acétique diméthylique méthanol Amphotéricyne A + 163" 93<> +136 28"
EMI28.4
<tb> Amphotéricyne <SEP> B <SEP> +238 <SEP> 52,2
<tb>
EMI28.5
Nystatine + 11" 7 + ,
5 - 3250
EMI28.6
<tb> Sulfate <SEP> de
<tb> Rimocidine <SEP> + <SEP> 102 <SEP> + <SEP> 67
<tb>
<tb> Ascosin
<tb>
EMI28.7
o;o Tr/w NaHCO3) +12,2 - 13
Les données sur ce tableau sont considérées en comparaison avec les données connues d'absorption dans l'ul- tra-violet pour les deux Amphotéricynes; il est évident que l'Amphotéricyne A, bien qu'elle ait un spectre d'ultra- violet qui est analogue à celui rapporté pour la nysta- tine et la Rimocidine, s'en différencie par les pouvoirs rotatoires spécifiques respectifs; et, de même, bien que l'Amphotéricyne B ait un spectre d'ultra-violet qui est très semblable à celui de l'Asconsin, les deux produits se dis- tinguent par les différences dans leurs pouvoirs rotatoires spécifiques respectifs.
La conclusion à tirer de ces comparaisons réside dcnc dans le fait que l'Amphotéricyne diffère de la nysta- tine, de la Rimocidine ou de l'Asconsin à la fois dans ses effets biologiques et dans ses caractéristiques physiques.
Le procédé suivant l'invention peut être mis en oeuvre avec des variantes sans sortir du cadre de l'inven- tion.
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