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La demanderesse a trouvé qu'une souche convenable d'ergot (Cla- viceps purpurea Fr. Tul.) pouvait être cultivée in vitro, sur un milieu nutritif approprié et dans des conditions déterminées, de telle façon qu'el- le produise de l'ergotamine, de l'ergotaminine et de l'ergobasine en quan- tités propres â être isolées à l'état pur et cristallin à l'échelle de la- boratoire. Cette invention est d'importance essentielle, car elle est apte à rendre la production de ces alcaloïdes, si importants pour la médecine, indépendante dé la provenance naturelle de l'ergot et de son obtention arti- ficielle en agriculture.
On a relevé à maintes reprises, dans la littérature, des mémoires sur la culture saprophytique de l'ergot, selon lesquels la présence d'alca- loïdes de l'ergot a été prouvée aussi bien dans le mycélium que dans le mi- lieu de culture. Cette preuve a été apportée par des réactions de colora- tion, parmi lesquelles c'est principalement la réaction à la p-diméthyla- mino-benzaldéhyde selon van Urk (Pharm. Weekblad 66,437, 1929) qui a été employée. Toutefois cette réaction'n'est pas spécifique, car l'indole et nombre de ses dérivés donnent aussi avec ce réactif une coloration rouge violet (Ehrlich, Pharm. Zentralhalle 1918 , 114) qui peut faire croire à tort à la présence d'alcaloïdes de l'ergot.
On sait que de nombreux micro- organismes sont capables de produire de l'indole ou des composés indoliques dans un milieu nutritif. C'est pourquoi un test de van Urk positif , donné par des extraits totaux, ne permet pas de conclusions formelles quant à la présence d'alcaloïdes de l'ergot.
Très souvent cependant, la présence d'alcaloïdes de l'ergot dans les cultures saprophytiques décrites dans la littérature a été étudiée non seulement au moyen des réactions coloration mais aussi par des tests physiologiques (par exemple, l'action sur l'utérus). Néanmoins, cette épreu- ve effectuée avec une substance complexe, telle que des extraits de culture ou de mycélium, n'est pas spécifique, elle non plus, car d'autres substances, par exemple l'histamine, provoquent aussi une coontraction utérine plus ou moins forte.
Les tentatives décrites dans la littérature et visant â cultiver l'ergot in nitro de telle sorte qu'il produise des alcaloïdes en quantités propres à une exploitation au laboratoire ont, jusqu'à présent, échoué ; preuve certaine en est que l'ergot dont on extrait les substances actives provient jusqu'ici uniquement de la production artificielle en agriculture ou de la cueillette, là où il se rencontre à l'état sauvage.
Due brève étude donne le tableau suivant des essais décrits dans la littérature ;
A.McCrean (Am.J.of Botany 18, 50,1931; USP 2, 056,360) déclare être parvenu pour la première fois â produire de l'ergotoxine, de l'histamine et de la tyramine par culture saprophytique de l'ergot. Cette affirmation s'appuie sur le résultat de tests physiologiques ("cock'a comb test",, "ocytocic test" et "bloodpressor test"), sans que les substances mentionnées aient été isolées.
R. Jaretsky (Arch.Pharm. 273, 348, 1935) signale une culture sa- prophytique d'ergot sur un milieu nutritifs convenable, qui a donné un résultat positif â l'épreuve de la cornutine (p-diméthylamino-benzaldéhyde) ainsi qu'au test biologique selon Broom et Clark; J. de Tempe (Diss, Amsterdam 1945) décrit une formation d'alcaloïdes par le Claviceps purpurea en cultu- re saprophytique ; toutefois,là encore, la conclusion se fonde uniquement sur la coloration rouge obtenue dans la réaction de van Urk.
E. Burlet, J. Meyer et M. Chaduc (Thérapie Fr.7 144, 1952 relatent des essais de culture saprophytique de l'ergot sur un milieu nutritif
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artificiel particulier dont la composition n'est pas indiquée. Se basant sur un résultat positif obtenu dans la réaction de coloration selon Freudweiler, avec la vanilline et l'acide sulfurique (A. Goris, a. Liot, M.M Janot. An. Goris, Pharmacie Galénique, Paris, 2. 1231, 1949, et sur le résultat positif du test biologique effectué sur l'utérus de cobaye, les auteurs considèrent la présence d'alcaloïdes comme établie. S. K.Sim et H.W. Youghen (J.Am.Pharm. Ass. 40. 434, 1951) indiquent qu'ils ont pu prouver la présence d'alcaloïdes de l'ergot en traces dans le mycélium de Claviceps cultivé in vitro.
La preuve a été faite par la réaction de van Urk. L'épreuve ayant été jugée positive par suite''de l'apparition d'une couleur rouge pourpre, on doit admettre avec certitude que les composés qui ont provoqué cette coloration n'étaient pas des alcaloïdes de l'ergot car ceux-ci donnent avec le réactif de van Urk une coloration bleue. Les auteurs eux-mêmes décrivent la réaction comme suit : "Tous les extraits provenant des matières à base de tissu mycélial soumises aux essais ont donné une couleur pourpre qui indiquait la présence d'alcaloïdes de 1-'ergot ou de composés similaires possédant un moyen d'indole".
L'essai selon van Urk a été complété par des tests biologiques dont les indications cependant n'autorisent pas non plus des conclusions certaines. Des auteurs japonais ont découvert un procédé grâce auquel ils ont réussi à produire des alcaloïdes in vitro au moyen d'une- souche déterminée de Claviceps (Claviceps purpurea parriesta katagiril) qui ne provient pas du seigle, mais d'autres graminées. Il semble en effet qu'on soit parvenu pour la première fois, au cours de ce travail, à isoler des cultures de ce champignon un alcaloïde cristallisé en quantités de laboratoire. Cet alcaloïde inconnu jusqu'iéi à reçu lw nom d'agroclavine. Dans une publication récente (J.of the-Agricultural Chem. Soc. of Japan 25. 458, 1952), les auteurs japonais M. Abe, T. Yamano, Y. Kozu et M.
Kusumoto relatent qu'ils ont créé un milieu nutritif artificiel contenant de la mannite comme source de carbone et du succinate d'ammonium comme source d'azote, et l'on ensemencé avec une souche de Claviceps qui croît à l'état naturel au Japon, en parasite de la graminée Elymus Mollis Tri.; ils ont pur isoler, comme alcaloïdes, de l'ergocryptinine, de l'agroclavine, des traces d'argocryptine et d'ergobasine ainsi qu'un alcaloïde nouveau, soluble dans l'eau et qu'ils ont appelé élymoclavine.
Il ressort de ces publications que, mis à part les deux travaux mentionnés en dernier lieu; jamais on n'a pu obtenir des substances cristallisées à partir de cultures saprophytiques de l'ergot. Les deux derniers mémoires décrivent uniquement la séparation d'ergocryptine et d'ergocryptinine, à côté d'autres alcaloïdes inconnus jusqu'ici.
En revanche, jamais encore, jusqu'à ce jour, on n'était parvenu à obtenir. à partir de cultures d'ergot in rvitro, l'ergotamine, cet alcaloïde si important pour l'obstétrique, la gynécologie et la médecine interne.
Comme il apparaîtra dans la suite, la demanderesse a trouvé qu'il était possible, avec une couche appropriée de Claviceps purpurea, de cultiver le champignon in vitro, sur un milieu nutritif convenable et en maintenant des conditions déterminées, de telle manière qu'il produise l'ergotamine et d'autres alcaloïdes de l'ergot, comme, par exemple, l'ergotaminine et l'ergobasine, en quantités propres à être isolées au laboratoire à l'état pur et cristallisé.
Des recherches approfondies ont montré que le poids de mycélium des cultures ainsi que la teneur en alcaloïdes du mycélium formé dépendaient de la concentration des ions de zinc et de fer dans la solution
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nutritive. Toutes les cultures sans fer et toutes les cultures sans zinc présentent un faible poids de mycélium et ne donnent pas d'alcaloïdes.
Pour une teneur constante de la solution nutritive en fer, le poids de mycélium augmente, pour des valeurs croissantes de la teneur en zinc, jusqu'à la valeur de 12.10-6 molécule-gramme de ZnS04, 7 H20 par litre ; de cette valeur il n'y a plus d'augmentation de poids. Pour une teneur en zinc qui va en croissant jusqu'à la même concentration, la teneur du mycélium en alcaloïdes décroît. Entre les concentrations extrêmes de 0,75.
10-5 et 12.10-5 molécule-gramme de FeS04, 7 H20 par litre, l'élévation de la concentration en fer, pour une concentration constante en zinc. ne se traduit par une- croissance ni du poids du mycélium, ni de la teneur en alcaloïdes, sauf si la teneur en zinc est inférieure à 12.10-6 molécule-gramme de ZnS04, 7 H20 par litre. Si la concentration en FeS04, 7 H20 est portée à 48.10-5 molécule-gramme par litre, un léger arrêt de croissance est décelable tandis que la teneur en alcaloïdes ne diminue pas. Les tableaux 1 et 2 illustrent ces relations. Le poids de mycélium y est indiqué en mg et la teneur en alcaloïdes en pourcents de mycélium sec tel qu'on en obtient dans des charges de 10 cm3 chacune après une durée d'expérience de 21 jours.
TABLEAU I.
Poids de mycélium en mg
En haut de chaque colonne est indiquée la concentration en zinc, exprimée en millionièmes de molécule-gramme de ZnS04, 7 H20, tandis que le nombre inscrit au début de chaque ligne indique la concentration en fer exprimée en cent-millièmes de molécule-gramme de FeSO, 7 H20.
EMI4.1
0 1.5 6 12 2± ±l 96 192
EMI4.2
<tb>
<tb> 0 <SEP> 66 <SEP> 71 <SEP> 70 <SEP> 73 <SEP> 69 <SEP> 85 <SEP> 74 <SEP> 89
<tb> 0,75 <SEP> 68 <SEP> 101 <SEP> 221 <SEP> 238 <SEP> 260 <SEP> 280 <SEP> 279 <SEP> 288
<tb> 3 <SEP> 79 <SEP> 118 <SEP> 265 <SEP> 252 <SEP> 220 <SEP> 276 <SEP> 240 <SEP> 251
<tb> 12 <SEP> 72 <SEP> 161 <SEP> 263 <SEP> 252 <SEP> 249 <SEP> 289 <SEP> 278 <SEP> 297
<tb> 48 <SEP> 62 <SEP> 135 <SEP> 156 <SEP> 199 <SEP> 215 <SEP> 221 <SEP> 189 <SEP> 206
<tb>
TABLEAU 2.
Teneur en alcaloïdes du mycélium sec en pourcents.
Les nombres indiqués en tête des lignes et des colonnes ont la même signification que dans le tableau 1.
EMI4.3
<tb>
<tb>
0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI4.4
0 , 75 0 0 0,04 o,17 0.18 0,13 0,13 0,11
EMI4.5
<tb>
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,09 <SEP> 0,18 <SEP> 0,19 <SEP> 0,11 <SEP> 0,20 <SEP> 0.17
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP> (suite)
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 0,15 <SEP> 0,16 <SEP> 0,20 <SEP> 0,17 <SEP> 0,17 <SEP> 0,22 <SEP> 0,17
<tb> 48 <SEP> 0 <SEP> 0,05 <SEP> 0 <SEP> 0,20 <SEP> 0,19 <SEP> 0,19 <SEP> 0,23 <SEP> 0,16
<tb>
Il ressort de ces tableaux que la concentration optimum en fer se place entre 0.75.10-5 et 12.10-5 molécule-gramme de FeS04, 7 H2o et la concentration optimum en zinc entre 1,2.
10-5 et 19,2,10-5 molécule-gramme de ZnS04, 7 H2O par litre de solution nutritive.
En pratique, le procédé s'exécute, par exemple, de la façon suivante :
Le milieu nutritif, dont la composition exacte est indiquée plus bas, est stérilisé puis ensemencé avec des spores de Claviceps purpurea Fr.
Tul. et mis à l'incubation. Le voile de mycélium qui s'est formé au bout de quelque temps présente, en règle générale, une couleur brun violet foncé ; on le recueille, on le sèche et on le traite pour en extraire les alcaloïdes. On soumet aussi à l'extraction le filtrat du liquide de culture, qui donne également de l'ergotamine pure et de petites quantités d'ergotaminine et d'ergobasine. L'extraction des alcaloïdes, tant du mycélium que du liquide nutratif, peut être conduite, par exemple, comme suit : on enlève tout d'abord les constituants gras au moyen d'un solvant organique qui ne dissout pas les alcaloïdes puis on met en pâte la substance qui les contient avec:une solution de carbonate de sodium, ce qui a pour effet de mettre en liberté les alcaloïdes deleurs composés salins.
Après extraction par un solvant organique tel que l'éther, par exemple, on retire les bases de leur solution dans l'éther au moyen d'un acide, par exemple l'acide tartrique, on purifie l'extrait aqueux en l'agitant avec un solvant organique, on rend alcaline toute la solution aqueuse en la traitant par du bicarbonate de sodium, par exemple, et on reprend les alcaloïdes par un solvant organique non miscible à l'eau. La séparation et la purification des bases ainsi obtenues à l'état brut peut être effectuée, par exemple, par chromatographie sur de l'alumine. Les alcaloïdes de l'ergot qu'on a obtenus par ce procédé, l'ergotamine, l'ergotaminine et l'ergobasine, correspondent par toutes leurs propriétés aux substances isolées de l'ergot de provenance na- turelle.
Exemple 1.
L'exemple suivant décrit la culture in vitro de l'ergot et la séparation de ses substances actives. Pour préparer le milieu nutritif, on dissout d'abord
EMI5.2
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgSO4,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KHPO,
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCL.
<tb>
100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> â
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée,
<tb>
et on ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une liqueur ayant la composition suivante :
EMI6.2
<tb>
<tb> 42,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> FeSO4, <SEP> 7H2O,
<tb> 2,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiC12, <SEP> 6H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> Coc12, <SEP> 6H2o,
<tb> 0,20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2So3. <SEP> 5H20,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CusO4,5H2o,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(NO3)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3BO3,
<tb> 1,00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2S04 <SEP> concentré, <SEP> le <SEP> tout <SEP> complété <SEP> à
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> distillée.
<tb>
Le milieu nutritif prêt à l'emploi a un pH de 4,6; on le stérilise en autoclave à une température de 107 durant 20 minutes. En ensemence 10 cm3 de la solution nutritive ainsi préparée avec deux gouttes d'une suspension de conidies de la souche voulue de Claviceps purpurea et on laisse reposer la culture dans un endroit sombre, à température et humidité constantes, par exemple à 24 et à une humidité de 60 à 65%. Après 26 jours il s'est formé un voile compact de mycélium, de couleur violet foncé, et la solution nutritive montre un pH de 4,8 et une faible coloration rouge brun.
Après récolte et dessiccation, le mycélium pèse 250 mg. La présence des alcaloïdes se prouve comme suit ; on rend alcalins le liquide de culture et le mycélium séché, on extrait les bases à l'éther et on agite l'extrait éthéré avec une solution d'acide tartrique à 1%. On traite la solution aqueuse des tartrates par le réactif de van Urk (p-diméthyl-amino-benzaldéhy- de en solution sulfurique) et on fait apparaître la coloration par irradiation à la lampe de quartz (M.j. Smith, U.S. public Health Reports 45, 1466, 1930 ;voir essai F. Schlemmer, F.H.A. Wirth et H. Peters, Arch. Pharm. 274, 16, 1936. L'intensité de la coloration bleue correspond à une teneur en alcaloïdes de 0,1% dàns le mycélium sec et 0,0076 mg par cm3 de la solution de culture (calcul basé sur un poids moléculaire de 600).
Pour isoler les substances actives d'une plus grande quantité de mycélium et du liquide de culture correspondant, on procède par exemple de la façon suivante :
On agite durant une demi-heure 260 g de mycélium séché avec 2,6 litres d'éther de pétrole, pour éliminer les matières grasses ; esso- re et on agite encore à deux reprises avec 1,3 litre d'éther de pétrole.
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La matière dégraissée est ensuite mise en pâte avec 260 cm3 d'une solution à 5% de carbonate de sodium et traitée sur la machine à agiter du- rant une demi-heure chaque fois, d'abord par 2,6 1, puis, à deux reprises. encore par 1,3 1 d'éther. On réunit les extraits ainsi obtenue et on leur enlève les alcaloïdes en les traitant par 1,3 1 puis quatre fois encore par 0,65 1 d'une solution aqueuse d'acide tartrique à 1%. On réunit les solutions tartriques et on les agite à trois reprises avec 300 cm3 d'éther pour enle- ver des impuretés à réaction neutre ou acide.
Chaque solution éthérée est ensuite lavée deux fois avec 100 cm3 d'une solution d'acide tartrique à 1% et l'on ajoute ces eaux de lavage à la solution principale des tartrates, On rend alcaline cette solution par du bicarbonate de sodium et on extrait les alcaloïdes insolubles dans l'eau en agitant la solution alcaline avec- 500 cm3 puis trois fois avec- 250 êm3 d'éther. Les solutions éthérées sont réunies, séchées sur du sulfate de sodium et évaporées à siccité sous pres- sion réduite. ii reete un résidu constitué par 0,31 g d'alcaloïdes bruts.
Pour purifier ce résidu, on le dissout dans du chloroforme conte- nant 1% d'alcool et on filtre la solution à travers une colonne de 31 g d'a- lumine préparée selon Brockmann. Les fractions qui présentent une fluores- cence bleue à la lumière ultra-violette contiennent les alcaloïdes: on les recueille isolément et on évapore le dissolvant. Le résidu de la zone bleue à progression rapide pèse 0,039 g. On le reprend par 0,5 cm3 de méthanol, dans lequel l'alcaloïde cristallise aussitôt. On recueille 0,030 g d'ergota- minine.
Une seconde cristallisation dans le méthanol, où le composé est très peu soluble, donne des plaquettes cristallines triangulaires, qui fon- dentà 240 avec décomposition et accusentun pouvoir rotatoire spécifique Ó = + 367 (+ 3 ) (c = 0,5 dans le chloroforme), Pour l'analyse élémentaire, on sèche la substance à 100 sous un vide poussé. Les résultats de l'analyse sont les suivants :
EMI7.1
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculé <SEP> C <SEP> 68,12 <SEP> H <SEP> 6,07 <SEP> N <SEP> 12.05%
<tb> trouvé <SEP> 68,07 <SEP> 6,12 <SEP> Il,94%
<tb>
Le résidu d'évaporation de la zone à progression lente pèse 0,137 g.
Quand on le reprend par 0,5 cm3 d'acétone à 90%; l'alcaloïde cristallise en prismes polyédriques à forte réfraction, coupés droit et fondant à 1800 avec décomposition ; sont caractéristiques de l'ergota- mine. On recueille ainsi 0,133 g d'ergotamine. A la dessiccation à 80 sous un vide poussé, les cristaux subissent une perte de poids de 20%, qui correspond à une teneur en solvant de cristallisation de 2 molécules d'acétone et 2 molécules d'eau, suivant la formule C33H3505N5,2 CH3COCH3, 2 H20.
La substance séchée comme ci-dessus a un pouvoir rotatoire spécifique Ó 20 = - 160 (C = 0,6 dans le chloroforme). Pour l'analyse, on sèche
D le produit à 100 sous un vide poussé et en éliminant l'humidité Les résultats de l'analyse sont les suivants
EMI7.2
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculé <SEP> C <SEP> 6812, <SEP> H <SEP> 6,07 <SEP> N <SEP> 12,05 <SEP> % <SEP>
<tb> trouvé <SEP> 68,27 <SEP> 6,08 <SEP> Il,97%
<tb>
L'alcaloïde correspond aussi d'une façon parfaite à l'ergotamine authentique par toutes ses autres propriétés, par exemple par sa solubilité dans divers solvants organiques, la coloration bleue dans la réaction de Keller, etc...
Pour obtenir la fraction des alcaloïdes solubles dans l'eau, on sature par du chlorure de sodium solide la solution aqueuse de bicarbonate, dont on a auparavant extrait les alcaloïdes insolubles dans l'eau, c'est-à-dire l'ergotamine et l'ergotaminine, on rend la solution alcaline
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avec 10 g de soude caustique et on la traite par 2 1 puis à deux reprises en- core par 11 d'ther. on sèche les extraits éthérés sur du sulfate de sodium et on évapore le dissolvant, ce qui laisse un résidu de 90 mg, avec une te- neur en alcaloïdes de 29 mg d'après la détermination colorimétrique (cal- cul basé sur un poids moléculaire de 600). On reprend le résidu par peu de méthanol et on essore 50 mg d'impuretés grasses non dissoutes et qui ne sont pas des alcaloïdes.
On évapore le filtrat à siccité, on dissout le ré- sidu dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on purifie la solution par chromatographie sur une petite colonne d'alumine. Après élution et évapora- tion, on reprend le résidu par 0,2 cm3 de chloroforme, dans lequel cristal- lise un composé d'addition peu soluble de chloroforme et d'ergobasine. on recueille 6 mg d'ergobasine. Par recristallisation dans le benzène, on ob- tient des aiguilles blanches fondant é 159-162 . La substance correspond également à l'ergobasine authentique par toutes ses autres propriétés.
Après essorage du mycélium, dans l'essai décrit ci-dessus, il reste 7 1 de filtrat de la culture, de pH 4,8; on amène cette solution au pH 8,0 en la traitant par une solution 2 normale de bicarbonate de sodium et on 1'.agite deux fois avec 1,4 1 d'éther. On réunit les liqueurs éthérées et on leur enlève les alcaloïdes en agitant à deux reprises avec 400 cm3 d'une solution aqueuse à 1% d'acide tartrique, on rend alcalin l'extrait aqueux au moyen de carbonate'de sodium et on le traite par 250 cm3 puis à trois reprises par 100 cm3 de chloroforme. Après séchage sur du sulfate de sodium, la solution, chloroformique laisse un résidu d'évaporation de 60 mg.
La détermination colorimétrique des alcaloïdes selon la méthode de van UrkSmith indique une teneur de 56 mg (calcul basé sur un poids moléculaire de 600).
Pour séparer et purifier les alcaloïdes contenus dans ce mélange, on dissout le résidu dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on u chromatographie la solution sur de l'alumine. Il se forme--deux couches distinctes, présentant une fluorescence bleue à la lumière ultra-violette.
La résidu d'évaporation de la zone à progression rapide pèse 32 mg. Quand on le reprend par 0.4 cm3 de méthanol, il se dépose 20 mg d'un alcaloïde très peu soluble. Le point de fusion, 235-240 avea décomposition ainsi que le pouvoir rotatoire spécifique de + 365 (3 dans le chloroforme montrent qu'il s'agit d'ergotaminine. L'alcaloïde correspond également à l'ergotamine authentique par toutes ses autres propriétés.
Après élution de la zone à progression lente, on évapore le dissolvant :le résidu pèse 13 mg. Quand on le reprend par 0,1 cm3 d'acétone à 90% les prismes polyédriques coupés droit et caractéristiques de l'ergotamine cristallisent. On en recueille 10 mg. Le point de fusion de 1800 avec décomposition, le pouvoir rotatoire spécifique de -160 dans le chloroforme, ainsi que toutes les autres propriétés, correspondent à celles de l'ergotamine authentique.
Pour isoler les alcaloïdes solubles dans l'eau, on sature de chlorure de sodium l'eau-mère carbonatée, on la rend alcaline avec 10 g de soude caustique et on l'agite d'abord avec 500 cm3, puis encore trois fois avec 100 cm3 d'un mélange 3 : 1 de chloroforme et d'alcool isopropylique Après séchage sur du sulfate de sodium. le résidu d'évaporation p se 6 mg. On le dissout dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on purifie la solution par chromatographie sur de l'alumine. On obtient ainsi 1 mg d'alcaloïde peu soluble dans le chloroforme ; comportement à la chromatographie et à la cristallisation prouve qu'il s'agit d'ergobasine.
EXEMPLE 2. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord :
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgSO.
<tb>
EMI9.2
0,25 ci de KH2P 0',
EMI9.3
<tb>
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCl,
<tb>
EMI9.4
0,03336 g de Fe50';
7 H20,
EMI9.5
<tb>
<tb> 0,003444 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H2O,
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI9.6
<tb>
<tb> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI,
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2, <SEP> 6 <SEP> H20,
<tb>
EMI9.7
0,05 g de ÉiOCl2ob H20.
0,20 g de 3T102503.5 H20, 0.05 g de CUS04, 5 H0,
EMI9.8
<tb>
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> BeN03)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2SO4 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi a un pH de 5,0. On l'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 25,2 g et contient 0,504 g d'alcaloïdes (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
EXEMPLE 3. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord
EMI9.9
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ga(N03)
<tb>
EMI9.10
0, 25 g de MgSO4@
EMI9.11
<tb>
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KH2P04,
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCl,
<tb>
EMI10.2
0,13344 g de FeS04q 7 H20,
EMI10.3
<tb>
<tb> 0,013776 <SEP> g <SEP> de- <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI10.4
<tb>
<tb> 2,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnSO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2,6 <SEP> H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CoC12.6 <SEP> H20.
<tb>
0. <SEP> 20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2SO3,5 <SEP> H2O.
<tb>
0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CuSO4.5 <SEP> H20.
<tb>
0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(N03)2.
<tb>
0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2S04 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi à un pH de 4.9. On 1'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 22. 1 g et contient 0,la.20 g d'alcaloides (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
EXEMPLE 4. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord
EMI10.5
<tb>
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgS04,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KH2PO4
<tb> 0. <SEP> 125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCL
<tb> 0,03336 <SEP> g <SEP> de <SEP> FESO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0,027552 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnSO4.7 <SEP> H2O,
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI11.2
2, 00 g de InSO, ? H20,
EMI11.3
<tb>
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> kl,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2,6 <SEP> H20,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CoCl2.6 <SEP> H2O,
<tb> 0,20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2SO3.5 <SEP> H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CuS04,5 <SEP> H20,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(N03)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2SO4 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi a un pH de 5,0. On l'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 27,8 g et contient 0,612 g d'alcaloïdes (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
RESUME.
La présente invention comprend notamment :
1. - Un procédé permettant de produire de l'ergotamine, de l'ergotaminine et de l'ergobasine par culture saprophytique in vitro de l'ergot (Clavicep purpurea) et séparation des alcaloïdes formés, procédé qui consiste à ensemencer un milieu nutritif convenahle avec des spores d'une souche appropriée de Claviceps purpurea et mettre la culture à l'incubation, à séparer du liquide de culture le mycélium ainsi formé et débarrasser l'un et l'autre des matières grasses par un solvant organique convenable, à rendre alcaline la matière contenant les alcaloïdes et extraire ceux-ci.au moyen d'un solvant organique approprié,non miscible à l'eau, à enlever ensuite les bases de l'extrait au moyen d'un acide convenable, par exemple l'acide tartrique, après quoi on effectue une nouvelle purification,
on rend alcaline la solution aqueuse, on en extrait les bases par un solvant organique non miscible à l'eau, on évapore le solvant, on sépare les alcaloïdes en individus distincts par des méthodes appropriées, par exemple, par chro- matographie,. et on fait cristalliser les alcaloïdes dans des solvants convenables.
<Desc/Clms Page number 12>
2. - Un mode d'exécution du procédé spécifié sous 1 , suivant lequel on utilise un milieu nutritif contenant entre 3,444 et 55,1 mg de ZnS04,7 H20 et entre 2,085 et 133,44 mg de FeSO4,7 H20 par litre.