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La présente invention a pour objet un procédé de préparation des sels de tétracycline pure et de la tétracycline pure à partir d'une matière contenant de la tétracycline, particulièrement d'une matière qui contient aussi de la chlorotétracycline.
La tétracycline est un antibiotique amphotère qui forme des sels avec les acides et les bases. Son nom
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chimique complet est 4-diméthylamino-l,4, 4a,5,5a, 6, 11, a.2a-octahydro-3,6,10,12,12awpentakiydroxy-6-.méthyl-., llwdioxo-2-naphtacène.carbbxamide. On a imaginé plusieurs méthodes pour purifier la tétracycline impure en la préci- pitant sous forme de sel d'acide, de sel de base, ou de tétracycline libre, à partir de solutions aqueuses et de solutions dans des solvants organiques. Elles n'étaient pas entièrement satisfaisantes pour une raison ou pour une autre.
Par exemple, quand on désire un chlorhydrate de tétracycline de très grande pureté, on peut le précipi- ter à partir du butanol ou d'autres alcanols, mais le ren- dement nYest pas aussi élevé qu'il est désirable ; pen- dant la longue période de temps nécessaire pour le dépôt des cristaux à partir de la solution, il se produit une certaine déshydratation de la tétracycline en raison de la présence d'acide chlorhydrique en excès. En outre, la tétracycline telle qu'on l'obtient par les différents pro- cédés dont on. dispose actuellement, est habituellement associée à des quantités appréciables de chlorotétracy- cline qu'il faut séparer de la tétracycline lorsqu'on dé- sire avoir un produit pur.
Quand on prépare la tétracycline par réduction catalytique de la chlorotétracycline, par exemple par le procédé décrit dans le brevet américain n 2,699.054 du 11 janvier 1955, il reste plus ou moins de chlorotétra-
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cycline, qu'il n'est pas facile de séparer complètement du produit par recristallisation. Quand on prépare la tétracycline par fermentation de microorganismes, par exem- ple par le procédé du brevet américain n 2.734.018 du 7 février 1956, il peut se former concurremment des quanti- tés appréciables de chlorotétracycline au cours du proces- sus de fermentation si l'on ne procède pas soigneusement à la limitation des ions chlorures, de sorte que le pro- duit brut contient habituellement plus de chlorotétracy- cline qu'il n'est désirable.
Les procédés dont on dispo- se actuellement pour séparer les petites quantités de chlorotétracycline contenues dans la tétracycline ne sont pas considérés comme satisfaisants et on a besoin de pro- cédés meilleurs. !
La présente invention est basée sur la découver- te d'après laquelle certains acides dicarboxyliques, tels que les acides oxalique et succinique, peuvent former des sels de tétracycline qui sont beaucoup plus insolubles que les sels correspondants de chlorotétracycline ; peut donc précipiter ces sels insolubles à partir de leur solu- tion et les débarrasser de la quasi-totalité de la choro- tétracycline et de la majeure partie des impuretés asso- ciées au produit ainsi traité.
Suivant l'invention, on fournit un procédé de préparation de sels de tétracycline pure et de tétracycli- ne pure, à partir d'une matière contenant de la tétracy- cline, particulièrement à partir d'une matière contenant aussi de la chlorotétracycline, procédé qui consiste à ajuster le pH de la solution de matière contenant la té- tracycline entre 1 et 5 environ, à ajouter de l'acide oxa- lique ou succinique, à¯récupérer le sol de l'acide et de la tétracycline ainsi précipité, et, si/on le désire, à neutraliser celui-ci pour obtenir la base libre.
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Par solution-contenant de la tétracycline, on entend, dans la présente invention, une solution qui con- tient de la tétracycline à l'état dissous en même temps que des impuretés, et qui peut être soit une solution aqueuse soit une solution dans un solvant organique. Par exemple, elle peut être une solution aqueuse brute que l'on obtient en éliminant dans une certaine'mesure les impure- tés d'une liqueur de fermentation de tétracycline, et qui contient des impuretés de fermentation et de la chloroté- tracycline, ou bien une solution que l'on a préparée en dissolvant de la tétracycline brute dans de l'eau acidulée ou dans tout autre solvant organique. La tétracycline contenue dans le solvant peut être sous forme de n'importe quel sel acide, sel basique ou sous forme de base libre.
Pour résumer, le procédé de la présente invention peut s'appliquer à tous les cas où il s'agit d'obtenir de la tétracycline sous forme de cristaux à partir d'une solu- tion dans laquelle la tétracycline se trouve dissoute, - comme indiqué plus haut.
De façon générale, le procédé comporte une étape préliminaire qui consiste à former une solution de tétra- cycline qui peut être associée à des impuretés de fermen- tation ou autres et/ou à de la chlorotétracycline. Cette solution doit être aussi concentrée en tétracycline qu'il est praticable dans les conditions envisagées. Le sel de tétracycline et d'acide oxalique, que ,1'on obtient dans la forme de réalisation préférentielle de la présente in- vention, a une solubilité dans l'eau de l'ordre de 1 à 3 % à la température ambiante; évidemment, la solution à par- tir de laquelle il s'agit de récupérer la tétracycline doit contenir plus que cette quantité minimum de tétracy- cline. Le pH de la solution peut varier de 1 à 5 environ.
Les pH inférieurs à 1 sont indésirables étant donné la
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tendance de l'antibiotique à se dégrader dans les solu- tions fortement acides. A mesure que le pH de la solution augmente jusqu'aux environs du point neutre, la tétracy- cline devient tout à fait insoluble et on ne peut pas con- duire le procédé avantageusement quand la concentration de tétracycline est faible. Les gammes de pH de 1,5 à 3 en- viron sont préférables. Bien que l'acide sulfurique soit préférable pour ajuster le pH, on peut utiliser d'autres acides tels que les acides chlorhydrique, phosphorique, formique, ou tout autre acide qui ne forme pas, avec la tétracycline, de sels plus insolubles que l'oxalate de tétracycline, mais qui ramène le pH au bas niveau désiré.
La solution ainsi préparée doit être clarifiée par filtration ou autrement pour éliminer les particules insolubles après quoi on ajoute l'acide dicarboxylique en quantités suffisantes pour former un sel avec la tétra- cycline. Un excès d'acide n'est pas particulièrement nuisible, et on peut ajouter, à la solution, des quantités - d'acide variant de 1 à 10 moles environ pour chaque mole de tétracycline qu'elle contient. De façon générale, un petit excès de l'acide précipitant est préférable, afin de permettre une récupération complète de la tétracycline.
On considère que l'optimum est d'environ 2 moles d'acide oxalique pour chaque mole de tétracycline. Les mêmes con- sidérations s'appliquent lorsqu'on utilise l'acide succi- nique dans le procédé. Etant donné que la solution à traie ter est à un pH acide, il importe peu que l'acide dicarbo- xilique soit ajouté sous forme d'acide ou sous forme de sel.
La purification préliminaire de la matière brute est généralement considérée comme désirable, bien qu'elle puisse ne pas l'être lorsque le procédé a simplement pour but de séparer la tétracycline d'avec la chlorotétracycli- ne. Ces opérations préliminaires peuvent consister à
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filtrer la liqueur de fermentation pour en éliminer le mycélium et les autres matières insolubles, et si on le désire on pourra précipiter les antibiotiques ensemble, ou bien on pourra les extraire de solutions aqueuses ou de solutions dans un solvant organique, dans lesquelles on peut les dissoudre pour les débarrasser partiellement des impuretés associées. Plusieurs de ces méthodes sont con- nues des experts en la matière et sont illustrées ci-après dans les exemples précis.
Bien que l'eau soit le solvant préférentiel pour préparer les solutions à partir desquelles on précipite l'oxalate de tétracycline, on peut utiliser un certain nombre de solvants organiques et de solvant et/ou d'eau.
Ces solvants ne doivent pas avoir un pouvoir solvant excessif vis-à-vis de l'oxalate de tétracycline, mais doivent, bien entendu, être susceptibles de dissoudre de grandes quantités de tétracycline. Parmi les solvants qui peuvent être utilisés à la place de l'eau figurent l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, et les alcanols ayant de trois à cinq atomes de carbone. La solubilité relative de l'oxalate de tétracycline dans un certain nombre de systèmes solvants est indiquée dans le tableau suivant, que l'on peut considérer comme un guide pour le choix de solvants appropriés. Bien entendu le pH du système, l'excès d'ion oxalate et d'autres facteurs modi- fient considérablement ces valeurs.
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Solvant Tempéra- Temps né- Activite ture C cessaire /u gjcm3 à l'ex- traction, minutes
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<tb> Ethanol <SEP> 32 <SEP> 30 <SEP> 50000-60000
<tb>
<tb> alcool <SEP> propylique <SEP> normal <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 10000-17000
<tb>
<tb> alcool <SEP> isopropylique <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 500- <SEP> 800
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal <SEP> 31 <SEP> 30 <SEP> 4000- <SEP> 7500
<tb>
<tb> mélange <SEP> alcool <SEP> isopropylique
<tb> -eau <SEP> (50/50) <SEP> .
<SEP> 21 <SEP> 30 <SEP> 25.800
<tb>
<tb> eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> butanol <SEP> 21 <SEP> 30 <SEP> 45,800
<tb>
<tb> " <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 4 <SEP> 30 <SEP> 23.500
<tb>
<tb> butanol <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> 21 <SEP> 30 <SEP> 6.420
<tb>
<tb> alcool <SEP> amylique <SEP> normal <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 1600- <SEP> 2200
<tb>
<tb> alcool <SEP> isoamylique <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 850
<tb>
<tb> eau <SEP> saturée <SEP> d'alcool <SEP> isoamylique <SEP> 21 <SEP> 30 <SEP> 35.500
<tb>
<tb> alcool <SEP> isoamylique <SEP> saturé
<tb> d'eau <SEP> 21 <SEP> 30 <SEP> 910
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> butyle <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 400
<tb>
<tb> acétone <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 4.000
<tb>
<tb> eau <SEP> 31 <SEP> 30 <SEP> 32.500
<tb>
<tb> " <SEP> 4 <SEP> 30 <SEP> 10.000
<tb>
Outre les propriétés ci-dessus,
l'oxalate de tétracycline a un point de fusion accompagnée de décompo- sition qui varie de 140 à 210 C environ. La microanalyse d'un échantillon des cristaux obtenus par l'un des pro- cédés suivants indique : carbone 50,9 ; hydrogène4,6; et azote 4,5. L'analyse calculée pour les cristaux d'oxalate de tétracycline contenant une molécule d'eau C22H24N2O3.C2H2O4.H2O donne : carbone 52,2; hydrogène 5,1 ; et azote 5,1. Le coefficient d'extinction dans-l'a- cide sulfurique O,IN est : E1%1cm 116 à 355 m . Le produit présente une DM50 de 243 mg/kg pour la souris.
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EXEMPLE i 1
On prend un précipité contenant de la tétracy- eline, obtenu lorsqu'on ajuste à pH 8,5 un filtrat de fer- mentation de tétracycline; on l'éxtrait au méthanol, on l'acidifie à l'acide sulfurique (pH 1,5) , on le décolore sur du charbon actif, on ajuste le pH à 3, on filtre, on condense sous pression réduite pour obtenir une teneur en tétracycline d'environ 20 %, et on chasse le 'méthanol par distillation..A la solution aqueuse ainsi obtenue, on ajoute de l'acide oxalique en quantité égale à environ la moitié de celle de la tétracycline. Quand on agite.. la solution, l'oxalate de tétracycline se dépose facile- ment sous forme de cristaux. On filtre donc les cristaux, on les lave à l'eau et on les sèche.
Par un test biolo- gique, on trouve que les cristaux sont d'une pureté d'en- viron 800 microgrammes par mg. A la suite d'une chromato- graphie sur papier, on ne trouve aucune--zone inhibitrice de chlorotétracycline. La valeur du coefficient d'ex- tinction dans l'ultra-violet coincide avec celle de la tétracycline pure. Le rendement est d'environ 70 %.
EXEMPLE II
On prend de la tétracycline sous forme de base - libre obtenue par exemple en déchlorurant la chlorotétra- cycline par l'hydrogène au moyen d'un catalyseur au pal- ladium sur charbon, suivant une méthode connue, et on la dissout dans de l'eau acidulée à 1''acide sulfurique (pH 1,5) à une concentration d'environ 30 %. Quand on ajoute, à la solution ci-dessus, de l'acide oxalique, ou de l'acide succinique ou leur sel alcalin, à raison de 2 moles par mole de tétracycline, des cristaux se déposent en peu de temps. A la suite d'un test biologique, on trouve que ces cristaux sont d'une pureté de 800 micro-
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grammes par mg. A la suite d'une chromatographie sur papier, on trouve aucune zone inhibitrice de chlorotétra- cycline.
La solution mère à partir de laquelle on a sé- paré les cristaux par filtration présente une zone inhi- bitrice de chlorotétracycline dans la chromatographie sur papier.
L'oxalate ou le succinate obtenu comme ci-des- sus, peut être converti en tétracycline libre ou en sel d'acide comme suit. On met en suspension ce sel dans l'eau, on y ajoute une solution aqueuse de soude causti- que et on ajuste le pH à 5. Quand on agite la solution, on obtient une base libre de tétracycline. Quand on met en suspension cette base libre dans le butanol, le pro- panol ou l'éthanol, et qu'on y ajoute environ 2 moles d'acide chlorhydrique concentré, la base libre commence par se dissoudre complètement, mais quand on agite la solution, le chlorhydrate de tétracycline se dépose assez facilement sous forme de cristaux.
EXEMPLE III
On prend 2,5 g d'une base libre de tétracycline obtenue par déchloruration catalytique de la chlorotétra- cycline par un procédé connu, et on la met en suspension dans-10 cm3 d'eau, et on y ajoute 0,75 cm3 d'acide sulfu- rique à 505; le pH passe à 2, et la base libre tétracy- cline se dissout complètement. On filtre la solution une fois. Aussitôt qu'on ajoute au filtrat lg d'acide oxali- que (contenant 2 molécules d'eau de cristallisation), et que celui-ci s'est dissous, des cristaux se déposent, On obtient ainsi 2,8 g d'oxalate de tétracycline. L'acti- vité est de 780 micrograwnes par mg.
A la suite d'une chromatographie sur papier, les cristaux ne présentent aucune zone inhibitrice due à
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la chlorotétracycline, mais la solution mère des cris- taux présente des zones inhibitrices de chlorotétracycli- ne et de tétracycline.
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1J 6 J,L 4 .L.LIJ J.
Quand on met en suspension 2 g diune base libre de tétracycline de l'exemple III dans 7 cm3 d'eau et quon y ajoute 0,5 cm3 d'acide'sulfurique à 50 %, la base libre tétracycline se dissout complètement., Quand on ajoute à cette solution 600 mg d'acide succinique, des cristaux se déposent. On filtre les cristaux, on les la- ve à 1?eau et on les sèche, et on obtient 1,5 g de succi- nate de tétracycline. L'activité est de 800 microgram- mes par mg. La solution mère révèle 1:- présence de chlo-
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ro'cëtracycline comme dans l'exemple III.
EXEMPLE V
On acidifie à l'acide sulfurique une liqueur de fermentation de tétracycline et on filtre. On y ajoute
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un tcnsio-actif, le chlorure de lauryldiméthylbenzylarrumo- nium, puison porte le pH à 8,5 On sèche et on broie J.e précipité ainsi obtenu. On extrait à trois reprises 60 g de ce précipité (contenant environ 17 g de tétracy- cline dans laquelle se trouvent 5 à 10 % de chlorotétracy- cline), avec environ 300 cm3 de méthanol ajusté à pH 2 par addition diacide oxalique. On réunit les extraits, on traite par le charbon actif,puis on filtre. On ob- tient ainsi un litre de filtrat. Environ 12 g de tétra- cycline se trouvent en solution dans le filtrat.
Quand on évapore cette solution jusqu'à siccité, en dessous de 30 O, sous pression réduite, et qu'on y ajoute 15 cm3 d'eau (ou si l'on veut de l'acétate d'éthyle ou de l'al- cool amylique), il se dépose de l'oxalate de tétracycli- ne. On le filtre, on le lave à l'eau et on le sèche. On obtient ainsi 11,95 g de cristaux. L'activité est de
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710 microgrammes par mg.. La solution mère contient de la chlorotétracycline.
EXEMPLE VI
On prend 50 g du précipité séché (contenant en- viron 20 g de tétracycline), traité de la même façon que dans l'exemple V, et on ajuste à pH 1,5 par addition d'acide sulfurique concentré tout en agitant avec 500 cm3 de méthanol. Après avoir agité pendant 1 - 1/2 heure, on filtre la solution. On agite encore le résidu pendant une heure, en ajoutant 250 cm3 de méthanol et 1 cm3 d'aci- de sulfurique, puis on filtre. On réunit les deux ex- traits. A l'extrait obtenu, on ajoute 20 g de charbon actif, et on agite pendant une heure, puis on filtre.
On obtient alors 870 cm3 de filtrat. Le pourcentage d'extraction est de 100 %.
On ajuste le pH de cette solution de méthanol à 2,5 -3 en ajoutant une solution aqueuse de soude caus- tique à 10% On concentre la solution sous pression ré- duite jusqu'à un volume de 50 cm3. On ajuste le pH de la solution à 3 et on ajoute 25 cm3 d'eau. On concentre encore la solution. Après avoir chassé le méthanol par distillation, on ajoute à la solution 3,5 g d'acide oxa- lique. Quand on agite la solution, des cristaux se dépo- sent directement. Après une nuit de repos, on filtre les cristaux, on lave à l'eau et on sèche. On obtient ainsi 14,4 g d'oxalate de tétracycline. L'activité est
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de 8ÓO' microgrammes par mg.
EXEMPLE VII
Quand on met en suspension dans 8 cm3 d'eau 3,6 g d'un mélange à parties égales d'une base libre de chlorotétracycline brute et d'une base libre de tétracy- cline brute, et qu'on y ajoute 0,6 cm3 d'acide sulfurique à 50 %, le pH devient 2 à 3, et le mélange se dissout à
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peu près complètement., On filtre la solution. Quand on agite le filtrat en ajoutant 1,7 g diacide oxalique (con- tenant 2 molécules d'eaux de cristallisation),les cristaux se déposent. Au bout de deux heures, on filtre l'oxalate de tétracycline et on obtient 1,4 g de cristaux.
Quand on agite le filtrat en ajoutant 0,5 cm3 d'acide chlorhydri- que concentré,le chlorhydrate de chlorotétracycline cristallise graduellement., On refroidit les cristaux, on les laisse reposer.puis on filtre, on lave à l'eau et on sèche;, et on obtient 1,6 g de chlorhydrate de chlorotétra- cycline.
EXEMPLE VIII
On sèche le gâteau-filtre que 1 on a tiré du filtrat acide de la liqueur de fermentation de tétracycli- ne par ajustement du pH à 8,5. On extrait 50 g de gâ- teau-filtre séché, d'abord avec 500 cm3 de méthanol con- tenant 5 g de chlorure de calcium, puis avec 250 cm3 de méthanol contenant 2 g de chlorure de calcium.
On réunit les liqueurs d'extraction, et on traite par 15 g de char- bon décolorant "DARCO G-60", et on filtre..On concentre ce filtrat jusque 50 cm3 à 35 C sous vide. Puis, on verse cette liqueur concentrée dans 200 cm3 d'eau, qui contient en solution 0,5 cm3 de chlorure de lauryldimé- thylbenzylammonium (solution à 50 %),et on filtre le pré- cipité formé avec l'aide de 1,5 g de "DICALITE" et on lave à ].'eau. On met en suspension le gâteau-filtre dans 30 cm3 d'acide sulfurique dilué, et après agitation, on filtre la solution, on la lave à l'acide sulfurique dilué. cette solution globale (96 cm3) on ajoute 4 g d'acide oxalique en agitant, de sorte que l'oxalate de tétracy- cline se cristallise;
on le filtre, on le lave à l'eau pour obtenir 7,4 g d'oxalate. Le rendement est de 84 %.
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EXEMPLE IX
On prend 200 g de gâteau-filtre humide (équiva- lent, suivant titrage biologique, à environ 7,9 g de base libre de tétracycline), on l'extrait à trois reprises avec de l'eau acidifiée à l'acide sulfurique à 50 %. On réunit les solutions aqueuses d'extraction (605 cm3, 17200 microgrammes par cm3, total 10,3 g de base libre), et on traite par 14 g de charbon décolorant "DARCO G-60" pendant 2 heures, puis on filtre. A ce filtrat, on ajou- te 40 g de MgC12.4H2O et 2 cm3 de chlorure de lauryldimé- thylbenzylammonium (solution à 50 %), et on porte le pH à 6,8. On filtre le précipité ainsi formé et on le dis- sout en l'agitant dans 20 cm3 d'eau et 12 em3 d'acide sulfurique à 50 %.
On lave complètement le gâteau-filtre avec de l'eau acidulée, et à cette solution aqueuse glo- bale on ajoute 6 g d'acide oxalique. On filtre l'oxalate formé, on le lave à l'eau et on sèche. On obtient 12,6 g d'oxalate de tétracycline, titrant 680 microgrammes par mg.
EXEMPLE X
On fait des mélanges de base de tétracycline, 849 microgrammes par mg, et de base de chlorotétracycline 924 microgrammes par mg, contenant 5 %. 10 % et 20 % du deuxième corps. On met en suspension un échantillon de 5 g de chaque mélange dans 20 cm3 d'eau et on ajoute de l'acide sulfurique à 50 % pour dissoudre les solides. Le pH à ce moment est de 1,8 - 2,0. Aux solutions, on ajou- te 2.0 g d'acide oxalique dihydraté solide, et l'acide se dissout. Au bout de quelques minutes, l'oxalate commen- ce à précipiter. On agite les mélanges pendant 15 minu- tes et on laisse reposer quatre heures. Puis, on filtre, on lave avec une petite quantité d'eau froide et on sèche- à l'air.
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Les rendements sont les suivants :
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<tb> % <SEP> de <SEP> chlore- <SEP> Titrage <SEP> de <SEP> Titrage <SEP> de <SEP> chlo- <SEP> % <SEP> de <SEP> récupé-
<tb>
<tb> tétracycline <SEP> tétracy- <SEP> rotétracycline <SEP> ration.
<tb>
<tb> dans <SEP> l'échan- <SEP> cline <SEP> résiduelle <SEP> /u <SEP> g/mg
<tb>
<tb> tillon <SEP> ini- <SEP> /u <SEP> g/mg
<tb>
<tb> tial
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> 700 <SEP> 20 <SEP> 82,5
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 750 <SEP> < <SEP> 20 <SEP> 85,0
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> 700 <SEP> < <SEP> 20 <SEP> 85,0
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