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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES POUR RECUPERER ET POUR PURIFIER
LA VITAMINE B 12.
L'invention est relative à des procédés pour récupérer et pour pu- rifier la vitamine B12; et elle concerne plus spécialement la récupération.de vitamines de grande valeur à partir de solutions aqueuses obtenues à partir des bouillons de fermentation de micro-organismes dans lesquels la vitamine B12 est formée.
Excepté quand on le spécifie autrement, les expressions "espè- ces de vitamine Bl2" et "vitamine B12" sont utilisées dans les présentes de la manière usuelle pour désigner.la vitamine B12 elle-même, ses varian- tes obtenues naturellement telles que la vitamine Bl2b, les variantes déri- vées de celles-ci par'des réactions simples telles que l'hydrogénation, par exemple la vitamine B12a et d'autres vitamines du type B12. La forme la plus désirable pour la vitamine, -pour le commerce et la thérapie, est la vitamine B12 pure mais on a constaté qu'il est toujours très difficile de récupérer les espèces de vitamine B12 à partir des extraits,de foie qui ne sont.pas purs ou de milieux de culture bactérienne et de séparer la forme pure d'avec les autres composés et dérivés B12.
L'invention a pour objet un procédé qui écarte ces difficultés et d'autres et qui permet d'isoler et de purifier aisément la vitamine Bl2 provenant de sources impures. D'une manière générale, l'invention consis- te à traiter une solution aqueuse impure contenant des espèces de vitamine B12 par un cyanure et à extraire ensuite la vitamine dans un solvant alcoo- lique hors duquel elle est extraire à nouveau par l'eau et ensuite par un acide monocarboxylique aliphatique et normalement liquide qui contient, en substance, entre L et 14 atomes de carbone.
Suivant une variante on extrait directement la solution aqueuse impure .et traitée au cyanure, qui peut être . un bouillon de fermentation ou un concentrat brut obtenu par des procédés connus à partir de ce bouillon, par un acide monocarboxylique et par une so- lution d'un tel a cide dans un solvant alcoolique non-miscible à l'eau, -On a trouvé que le traitement par le cyanure de solutions brutes de vitamines B12, telles que des bouillons de fermentation du des produits de fermenta- tion partiellement purifiés, a un effet très avantageux. Ce traitement sert non seulement à convertir certains composés qui sont en relation avec la vi- tamine B12 elle-même, mais il parait dégager la vitamine d'une ou de plusieurs
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formes complexes dans lesquelles elle existe dans ces sources brutes.
En dé- gageant ainsi la vitamine on lui donne une forme sous laquelle son extrac- tion devient particulièrement aisée et sous laquelle elle peut être extraite à l'état particulièrement pur si l'on considère la proportion importante d'im- puretés qui se trouvent dans ces matières. Cette extraction plus aisée dans l'acide monocarboxylique se fait aussi bien quand la matière est extraite directement avec l'acide ou après une extraction préliminaire avec un solvant alcoolique non miscible à l'eau.
En pratique, une solution aqueuse, provenant d'un bouillon de fermentation d'un micro-organisme et contenant des espèces de vitamines B12, est traitée par un cyanure soluble dans l'eau, tel qu'un cyanure de métal alcalin, à un pH quelque peu basique. Le pH est ensuite abaissé et le cya- nure en excès est enlevé par concentration de la solution jusqu'à un cer- tain degré, .de préférence sous vide. La solution-est ensuite traitée avec un alcool en présence d'un sulfate inorganique. La solution alcoolique ob- tenue est extraite par l'eau et l'extrait aqueux est traité avec l'acide monocarboxylique dissous dans un alcool non miscible à l'eau.
Suivant une variante, un acide mono carboxylique aliphatique et normalement liquide, con- tenant en substancè entre 4 et 14 atomes de carbone, peut être utilisé à lui seul ou en solution dans un alcool non-miscible à l'eau comme agent d'extrac- tion direct ou pour la solution aqueuse débarrassée du cyanure.
On décrit maintenant le nouveau procédé avec plus de détails et suivant ses modes de réalisation préférés. On filtre un bouillon de fermentation de micro-organismes et on le traite à un pH basique avec un excès d'ions de cyanure, par exemple de sodium ou de potassium. Le cyanu- re réagit apparemment avec les espèces de vitamine B12 pour les convertir en B12 lui-meme ou pour dégager la vitamine hors des complexes hors desquels elle ne peut être extraite qu'à un degré réduit. Après avoir débarrassé la solution de l'excès de cyanure, qui constitue un danger bien défini pour les opérateurs, le produit est séparé 'de plusieurs des impuretés du bouillon de fermentation par extraction, en présence de sulfate de sodium ou d'ammo- nium, dans du butanol ou tout autre alcool analogue.
La solution alcooli- que est ensuite extraite dans de l'eau. Les espèces de vitamines sont fina- lement extraites hors du concentrât ou de la-solution, de préférence après addition d'un sel organique neutre, à l'aide d'un des acides monocarboxyliques aliphatique s. La vitamine peut être récupérée hors de cet extrait par des moyens connus quelconques, par exemple par addition d'hexane, de chloroforme ou d'autres liquides appropriés dans lesquels la vitamine B12 ne se dissout pas après quoi on extrait à nouveau par l'eau. Les solutions ainsi obtenues ont une couleur rose pale et ont généralement une activité, en B12, à sec, de 25.000 mcg/g ou davantage.
Les acides monocarboxyliques formant des agents d'extraction, qui conviennent tout particulièrement à l'objet de l'invention, ont une structure aliphatique; ils sont normalement liquides à la température am- biante et contiennent environ 4 à environ 14 atomes de carbone. La chai- ne aliphatique peut être rectiligne ou avec branches et une partie peut avoir la forme d'un noyau,c'est-à-dire former un composé cyclo-alcoyle comme l'acide cyclohexylacétique. Parmi les composés convenables on peut citer l'acide n-caproique, l'acide 2-éthylhexoique, 2-éthylbutyrique, capri- que, cyclohexylacétique., cyclohexylbutyrique, n-caprylique ou laurique.
Par- mi ceux-ci les composés caprique, 2-éthylbutyrique et cyclohexylacétique sont particulièrement avantageux. D'autres acides analogues qui satisfont aux exigences physiques et chimiques sont également satisfaisants. Pour le nouveau procédé, il est préférable d'utiliser un volume de l'acide orga- nique qui équivaut à 1/5 à environ 1/2 du volu de la phase aqueuse à extraire. Le rendement du procédé peut être angmenté quelque peu en sub- divisant ce volume de l'acide organique en plusieurs portions plus petites pour des traitements successifs. L'extraction peut se faire d'une manière discontinue ou par charges ou bien dans un extracteur continu et en contre- courant. L'appareil, connu sous le nom d'extracteur centrifuge Podbielniak, est particulièrement efficace.
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Non seulement les acides organiques sont utiles,par eux-mêmes comme agents d'extraction mais ils peuvent également et'de préférence être dissous ou dilués auparavant dans certains solvants, plus spécialement'des solvants tels que des alcools non-miscibles dans -l'eau ou - dans une solution saline aqueuse. Particulièrement intéressants sont des solvants tels que les butanols, les pentanols, l'alcool benzylique, des mélanges de ces al- cools, etc... Un mélange qui a été trouvé comme étant très efficace ést l'acide caprique dans du butanol, une concentration de 10 % en poids pour l'acide donnant généralement satisfaction.
Quand on utilise des acides car- boxyliques seuls pour l'extraction, le coefficient de répartition s'améliore quand le nombre d'atomes de carbone dans l'acide carboxylique diminué.
L'extraction la plus favorable pour ce procédé semble être obtenue quand on utilise un acide contenant environ 6 atomes de carbone. Quand on se sert'' d'une solution d'acide carboxylique dans le butanol, l'alcool benzylique ou d'autres alcools, l'extraction maximum.paraît être obtenue avec un acide al.iphatique ayant environ 10 atomes de carbone, par exemple l'acide capri- que. Les meilleurs résultats, avec ce dernier genre de traitement, semblent être obtenus avec les acides C-6 à C-14. Il est à noter que les coeffi- cients de répartition pour l'extraction sont quelque peu sensibles aux va- riations du pH et de la concentration saline. Un pH un peu plus élevé de la phase aqueuse peut être adopté quand on se sert d'une solution d'un acide carboxylique organique dans un dès alcools susdits à la place d'un acide non-dilué.
La valeur optimum du pH pour l'extraction par un acide carboxy- lique non dilué semble être d'environ 4 alors qu'avec les combinaisons aci- de carboxyliques-alcool l'extraction s'améliore avec des pH plus elevés. Le maximum est généralement au-dessus d'environ 6,5 et même pour des pH allant jusqu'à 10 l'extraction peut être très bonne. L'usage de ces solutions aci- des permet également de réduire la quantité de l'acide utilisé car celui-ci est souvent plus coûteux que les solvants ordinaires.
Pour la mise en oeuvre du procédé, il est préférable de se ser- vir, de solutions qui contiennent au moins environ 5 mcg d'espèces de vita- mines B12 par ml de la solution. Les teneurs en vitamine odes solutions ou produits purifiés peuvent être déterminées par une des méthodes normalisées d'essais microbiologiques ou, quand il s'agit d'un composé suffisamment pur, par le spectre d'absorption. Les solutions initiales préférées sont celles qui contiennent environ 50 mcg ou davantage en espèces de vitamines par gramme de matières solides. Bien que l'on puisse utiliser une matière ayant une activité moindre, le degré de purification obtenu est réduit quelque peu.
Les nouveaux agents d'extraction acides ont un pouvoir sélectif remarquable pour enlever les espèces de la vitamine sans agir notablement sur diverses impuretés organiques et inorganiques également en présence dans la solution brute. Pour cette extraction il est désirable de régler le pH de la solution aqueuse à une valeur de 5.0 ou moins alors qu'un pH, compris entre environ 3,0 et environ 4,5, convient tout particulièrement pour obtenir un pouvoir d'extraction et une sélectivité maxima. L'efficacité des acides d'extraction peut également être améliorée par la présence d'un sel neutre organique, comme indiqué plus haut. Il vaut mieux ne pas utiliser une concentration saline trop élevée.
Par conséquent, on préfère généralement ne pas adopter une concentration supérieure à environ 35 % d'un sulfate inorganique neutre dans la phase aqueuse soumise à l'extraction. Une concentration de 15 à 25% du sel convient particulièrement bien.
Un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention consiste à appliquer la combinaison traitement au cyanure-extraction à l'a- cide carboxylique de pair avec certains autres traitements de purification et en un point spécial de ceux-ci. Un accroissement particulièrement élevé en pureté et un rendement très bon sont ainsi obtenus. Ce procédé préfère consiste a faire agir sur un bouillon de fermentation de micro-organismes contenant la vitamine B12 du charbon activé pour adsorber les espèces de vi- tamine. L'adsorbat au carbone est dilué avec un mélange d'eau et d'un al- cool tel que le butanol. Le. liquide obtenu est ensuite concentré, par exem- ple sous vide, jusqu'à ce qu'il contienne environ 30 à environ 50 mcg de vi- tamine par ml mais cette opération n'est pas essentielle.
Le produit dilué
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ou le concentrât est traité avec des ions du cyanure, par exemple du cyanure de sodium, pour convertir le mélange des variantes de la -vitamine B12 en cet- te vitamine elle-même tout en dégageant cette vitamine hors des divers com- plexes qui se prêtent moins à l'extraction et qui sont contenus dans ce pro- duit ou concentrat. Ce traitement se fait entre un état neutre et un pH al- calin, de préférence à un pH-9. Les ions sulfate, par exemple le sulfate ' d'ammonium ou de sodium sont ajoutés, généralement à une concentration d'en- viron 20 à 35%.,--et la vitamine convertie est traitée avec un solvant alcoo= lique tel que l'alcool bezylique.
La vitamine est'ensuite extraité avec de l'acide dilué, par exemple de l'eau dont le pH est réglé à 2 ave c un acide, le cas échéant avec addition de chloroforme à la phase d'alcool benzylique.
Il vaut alors mieux augmenter le pH de l'extrait aqueux jusqu'à environ à 5,5 et concentrer la.solution dans le vide pour enlever le butanol et diminuer le volume jusqu'à un certain degré. ' Il est également utile d'ajouter plus d'ions sulfate, par exemple environ 15 % de sulfate d'ammonium. Toutefois, ces opérations ne sont pas essentielles. La phase aqueuse de vitamine est finalement extraite'dans un acide monocarboxylique.aliphatique et liquide à 0-4 jusqu'à C-14, de préférence à un pH d'environ 3, 0 à 4,5. Par addi- tion d'hexane ou d'un autre solvant approprié à l'extrait acide, la vitami- ne peut être extraite à nouveau dans l'eau. Toute autre méthode de récupé- ration peut être utilisée comme variante.
Les extraits ainsi obtenus ont une couleur rose pâle et conviennent très bien à un usage en thérapie, sous forme de solutions ,à l'état sec ou après incorporation dans d'autres sub- stances. L'activité de ces matières, à sec, est généralement comprise en- tre 50.000 mcg ou davantage par gramme de matière solide et, dans certains cas, elle peut atteindre 250. 000 mcg par gramme. Ceci dépend quelque peu de l'activité du bouillon utilisé comme matière initiale et'du soin mis à effec- tuer les séparations aux différents étages. Un rendement de 40% et davanta- ge de la teneur en vitamine du bouillon de fermentation initial est ainsi obtenu. On peut convertir aisément ces produits en vitamine B12 cristalli- sée.
Les acides carboxyliques, ou leurs mélanges avec des solvants du type alcool, ont des propriétés uniques comme agents d'extraction pour les espèces de vitamine B12, extraites au cyanure. Cette efficacité ne pouvait certainement pas être prédite à l'avance en se basant sur les propriétés con- nues de ces solvants ou acides. De même on ne pouvait pas prévoir le succès de la combinaison conversion au cyanure-extraction par l'acide carboxylique en se basant sur le caractère connu du traitement au cyanure à lui seul.
Des coefficients de répartition particulièrement élevés entre les solutions dans l'eau ou les solutions salines aqueuses de la matière vitamineuse et les mélanges solvant-acide se présentent pour le procédé. La raison de cet- te efficacité inattendue du procédé en question est inconnue. Dans un sens, l'extraction acide agit avec une aisance particulière sur la vitamine B12 li- bérés de la matière brute par le cyanure. La séquence particulière des opé- rations procure un accroissement favorable et inattendu de la pureté et des rendements excellents en vitamine B12 ayant une activité élevée. De plus le procédé se prête, de lui-même, aisément à un traitement continu tout au moins depuis l'étage où l'adsorbat au carbone est dilué jusqu'au moment où la vitamine cristallisée et pure est formée.
Entre ces étages seuls des ex- tractions liquide-liquide interviennent et celles-ci se font beaucoup plus aisément sur une grande échelle et d'une manière continue que les traitements de solides, elles nécessitent l'intervention d'un travail peu important et réduisent au minimum les pertes dues aux manipulations. En particulier, le procédé élimine'l'intervention des opérations de purification chromatogra- phique qui sont compliquées, longues et coûteuses, et supprime l'interven- tion d'une précipitation de matières solides par l'addition de non-solvants aux solutions de vitamine B12; il ne procure pas de produits qui sont hy- groscopiques, trop finement divisés et difficiles à filtrer et à manipuler.
L'extraction de matières solides par des solvants n'est pas nécessaire, c'est-à-dire un traitement qui est peu efficace et lent.
Les exemples ci-dessous, donnés à titre illustratif et qui ne sont nullement restrictifs ou limitatifs, doivent être considérés comme indiquant
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seulement¯quelques modes de réalisation possibles de l'invention.
Exemple 1. - Un bouillon de fermentation clarifié de Streptomy- ces griseus, ayant en tout une activité de 127,5 g en vitamine (déterminée par une méthode microbiologique normalisée) est mise en contact avec 982 kg de charbon activé. La bouillie obtenue est agitée pendant 1/2 heure et est filtrée. Le gâteau au carbone est lavé avec une petite quantité- d'eau et. la matière, contenant la vitamine B12 peut être séparée au charbon en agi,- @ tant l'adsorbat dans 12.500 litres d'un mélange butanol-eau contenant en- viron 30 % de butanol. Le liquide est séparé du charbon et-est évaporé par- tiellement sous vide et à une température légèrement élevée pour séparer le butanol et obtenir un concentrat de vitamines convenable avec une .activité, à sec, de 420 mcg par gramme.
Du cyanure de sodium est ajouté à ce concen- trat aqueux dans une proportion de 30 g/litre, le pH est réglé à 9. On- lais- se la solution au repos pendant environ quatre heures et on la concentre - sous vide à une température pour la liqueur qui ne dépasse pas 40 et à-un pH de 5-6 pour réduire son volume à peu près aux deux tiers. Du sulfate de sodium est ajouté à la solutionjusqu'à ce qu'on obtienne une concentration d'environ 20 %. La solution est extraite deux fois dans un extracteur cen- trifuge de Podbielniak d'abord en se servant d'un demi volume d'alcool ben- zylique et ensuite d'un tiers de volume de cet alcool. Les deux extraits sont clarifiés par filtration à l'aide d'une substance facilitant celle-ci et ils ont, au total, une teneur de 87,2 g en vitamine B12.
Les extraits ,sont mélangés et dilués avec un tiers en volume de chloroforme.
La solution obtenue est extraite avec un demi volume d'eau dont le pH est réglé à 2 avec de l'acide sulfurique. La phase aqueuse est séparée, lavée' cinq fois avec un cinquième en volume de butanol, neutrali- sée et concentrée sous vide jusqu'à contenir environ 200 mcg de vitamine B12 par ml, la température de la solution étant maintenue à environ 40 .
L'extrait aqueux concentré a une teneur de 77.0g en vitamine B12. Cet ex- trait est traité par 15 % en poids de sulfate d'ammonium et est extrait en- suite cinq fois en se servant chaque fois d'un cinquième en volume d'acide 2-éthylbutyrique. Les extraits. sont mélangés, clarifiés par filtrationà l'aide d'une substance de filtration et sont dilués avec un quart en volume de hexane. La vitamine est extraite à nouveau, dans quatre portions d'eau utilisées successivement, chaque portion correspondant à un quart de volu- me de la solution acide carboxylique-hexane.
La solution aqueuse finale, ainsi obtenue, contient 66,1 g de vitamine B12 avec une activité de 30.000 mcg de vitamine par gramme de ma- tières solides, ce qui représente un rendement total de 44 % à partir du bouillon de fermentation, ce qui est un résultat bien meilleur que celui ob- tenu avec des matières de ce genre.
Quand on répète ce traitement avec d'au- tres bouillons-de fermentation,-on obtient des activités de 27.000 mcg/g jus- qu'au delà de 100.000 mcg/g, les différences étant dues à la nature du bouil- lon de fermentation, à des variations dans la facilité de séparation pendant les extractions, etc... , -
Exemple II.- Une partie du produits-final de l'exemple I, ayant une activié de- 30.000 mcg/g en vitamine B12 est traitée avec 15 % en poids de sulfate d'ammonium. Cette solution aqueuse est extraite à nouveau avec de l'acide 2-éthyl-butyrique, la phase organique séparée est traitée avec de l'hexane et la vitamine est extraite à nouveau avec de -l'eau. L'extrait a- queux est concentré sous vide jusqu'à avoir une -activité de 8.000 mcg/ml.
Une quantité suffisante d'acétone est ensuite-ajoutée-pour que la solution contienne 80 % d'acétone. De la vitamine B12 cristallisée est aisément' séparée. Elle est cristallisée à nouveau hors d'un mélange d'acétone et d'eau pour obtenir une matière ayant une pureté normalisée. Un rendement total.de 29,1 % en matière cristallisée est obtenu à partir du bouillon de fermentation initial. Ce rendement peut être .augmenté considérablement par récupération hors des diverses liqueurs-mères intermédiaires.
Exemple III. - Un concentrat aqueux en vitamine B12 est obtenu à partir d'un bouillon de fermentation et-est traité avec du cyanure de potassium par le procédé selon l'exemple I. Le produit qui à sec a une ac-
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tivité de 66.000 mcg/g est traité par 15 % en poids de sulfate d'ammonium' et est extrait, dans un extracteur centrifuge Podbielniak, avéc de l'acide 2-éthylbutyrique en utilisant un tiers en volume de la solution aqueuse.
Les extraits acides combinés sont traités comme à l'ordinaire pour extrai- re à nouveau les espèces de vitamine B12 dans l'eau. Le concentrat aqueux, obtenu finalement avec un rendement élevé, présente, à sec, une activité de 200.000 mcg/g avec une pureté plus de trois fois plus-grande par de simples extractions et re-extractions liquide dans liquide.
Exemple IV. - Un extrait concentré de vitamine B12, conver- tie par le cyanure, est préparé comme pour l'exemple I et a une activité totale en vitamine de 97.300 meg/g. Le concentrat aqueux est traité avec 20 g de sulfate d'ammonium par 100 ml de solution, son pH est réglé à 7 et il est extrait avec un volume égal d'une solution à 10% en poids d'acide caprique dans du butanol. La couche de butanol obtenue est extraite avec un tiers en volume d'eau dont le pH est réglé à 2 avec de l'acide sulfuri- que. Le solvant séparé est utilisé pour extraire à nouveau le concentrat aqueux converti en cyanure avec un pH = 7.. Hors de cet extrait la vitamine est extraite à nouveau dans de l'eau avec pH = 2 et ce processsus est répé- té une nouvelle fois.
Les trois extraits aqueux acides ainsi obtenus sont mélangés et pour chaque fraction de-100 ml on ajoute 15 g de sulfate d'am- monium. La solution saline aqueuse est lavée avec un cinquième en volume d'hexane, pour enlever tout butanol résiduel, et est extraite ensuite avec deux cinquièmes en volwne d'acide 2-éthylbutyrique. Ces extraits organi- ques sont mélangés, dilués avec un quart en volume de hexane et sont extraits à nouveau dans de l'eau'acidulée. La solution aqueuse finale ainsi obtenue est un liquide limpide, d'un rose pâle et a une teneur'de 71;000 mcg en vi- tamine B12 avec une activité de 47.500 mcg/g, déterminée par un essai spec- tro-photométrique.
Ceci correspond.à un rendement de 73 % et représente environ un rendement de 60 % à partir du bouillon de fermentation initial.
Il est à noter que pour cet exemple on a recours à deux varian- tes pour l'extraction par un acide carboxylique, la première se sert d'une solution alcoolique d'un acide aliphatique et la seconde d'un acide alipha- tique.
Exemple V. - On traite quatre litres d'un extrait concentré, . converti au cyanure, de vitamine B12, analogue à celui de l'exemple IV et contenant 3,08 g de vitamine B12, avec une activité de 30.000 mcg/g, avec 400 g de sultate d'ammonium. Le pH est réglé à 8 et la solution vi- taminifère est extraite avec quatre portions d'une solution à 10% en poids d'acide caprique dans l'alcool benzylique; chaque portion correspondant à un dixième en volume de la solution. Avant l'usage, le mélange acide-ca.pri-. que-alcool benzylique est lavé avec une solution à 10 % de sulfate d'ammo- nium avec un pH d'équilibre égal à 8.
Les quatre extraits dans le système acide-solvant ne sont pas mélangés mais sont lavés chacun avec une portion d'un quart de volume de sulfate d'ammonium à 10 % avec pH = 2 afin de convertir tout caprate de sodium en présence en acide caprique pour éviter-son extraction ultérieure dans la phase aqueuse de vitamine. Chacun des extraits lavés est filtré à l'aide d'une substance facilitant la filtration et est dilué avec un quart en volume d'hexane. Un quart en volume d'eau est alors utilisé pour extrai- re d'abord le premier extrait organique et ensuite successivement les trais autres. Ce traitement est répété jusqu'à ce que la phase aqueuse ne pré- sente plus aucune teinte rose et à cet effet on doit utiliser quatre portions d'eau.
Les extraits aqueux obtenus sont mélangés et lavés une fois avec un tiers en volume d'hexane et une fois avec un tiers en volume de chloroforme pour enlever les traces de solvant. Le produit obtenu contient 2,64 g de vi- tamine B12 ayant, à sec, une activité de 116.000 meg/g ce qui représente un rendement de 85,7% et, un-accroissement quatre fois plus grand de l'activité.
Exemple VI, - Un échantillon de matières solides roses (un produit de vitamine B12 partiellement raffiné), donne à l'essai et à sec une activité de 24.500 msg/g. Il a une teneur totale de .2000 mcg. Il est dissous dans 75 ml d'eau et du sulfate d'ammonium solidé est ajouté à la solution avec
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une concentration de 15%-en poids. La solution de vitamine est extraite dans une ampoule à décanter avec 15 ml d'acide cyclohexylacétique. La couche d'acide cyclohexylacétique est séparée, est diluéé avec 15 ml d'hexa- ne et la vitamine est extraite à nouveau avec 40 ml d'eau. La phase aqueu- se est séparée et séchée. Le produit sec donne à l'essai 57.000 mcg/g.
Ceci représente plus d'une purification deux fois plus grande et 89% de l'activité sont récupérés dans le produit purifié,
REVENDICATIONS.
1. - Procédé pour récupérer les espèces'de vitamine B12 hors d'une solution aqueuse impure en contenant, ledit procédé consistant à traiter la solution aqueuse à un pH au moins égal à 7 avec un cyanure;à acidifier la solution à enlever le cyanure en excès, à traiter la solution aqueuse en présence d'un sel inorganique neutre par un solvant alcoolique à extraire la solution dans un solvant organique avec de l'eau, à traiter l'extrait avec un acide monocarboxylique aliphatique normalement liquide qui contient, en substance, de 4 à 14 atomes de carbone.