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La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de 1' antibiotique nommé tétracycline par fermentation. Elle se rapporte particulièrement à la production de cet intéressant antibiotique par culture de microorganismes dans des solutions nutritives et dans des cond- tions aérobies.
La tétracycline est un antibiotique à spectre étendu dont la structure a été indiquée pour la première fois dans une communication au Journal of the Amerio:an Chemical Society, Vol. 74, p.4976(1952), La pré- paration de cet antibiotique par réduction catalytique de la'chlortétra- cycline a également été signalée ( Journal of the American Chemical So- ciety, Vol. 74,p. 4621-23 (1953).
L'antibiotique tétracycline a donc été obtenu par un procédé chimique à partir de chlortétracycline, un produit de fermentation, mais des avantages certains s'attachent à la production directe de tétracycline par un procédé de fermentation. Ce procédé élimine évidemment le besoin appareils de traitement chimique pour l' hydrogénation de la chlortétra- cycline. En outre, il supprime le catalyseurd' hydrogénation très couteux et les dangers inhérents aux procédés d' hydrogénation.
On a trouvé que des souches de microorganismes du genre Strep- tomyces ; cultivées en milieu nutritif dans des conditions aérobies donnent l' antibiotique nommé tétracycline. Pour que les nouvelles souches de Strep- tomyces ( dont 1-' espèce n' a pas encore été déterminée) puissent servir de comparaison, on en a déposé des cultures à l' American Type Culture Collection, 2029 M Street, N.W.Washington D.C. et on les a ajoutées à la collection de microorganismes sous les numéros ATCC 1652, 11653 et 11654. Dans la collec- tion de cultures de Chas. Ptizer & Co. Inc., ces organismes sont identifiés par les numéros J-9618 ,K-6030-1 et K-6030-4 respectivement.
Les caractéristiques de culture de ces microorganismes sont indiquées dans les tableaux ci-dessous. Ls couleurs lorsqu'elles sont suivies d'un R sont celles de l'ouvrage de Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
TABLEAU 1.
ATCC 11652. CaractéristiQues de culture.
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<tb> Agar <SEP> lation <SEP> nulle <SEP> sporulations; <SEP> mycélium <SEP> végé-
<tb> à <SEP> blanc <SEP> à <SEP> tatif <SEP> chamois, <SEP> à <SEP> cannellegris <SEP> brunâ- <SEP> chamois <SEP> à <SEP> cannelle-rosé
<tb> tre <SEP> à <SEP> gris <SEP> (Chamois <SEP> clair <SEP> (R) <SEP> à <SEP> Cannellesouris <SEP> (Blanc <SEP> chamois <SEP> (R), <SEP> à <SEP> Saumon <SEP> ocré
<tb> à <SEP> cannelle- <SEP> clair <SEP> (R);
<SEP> sur <SEP> les <SEP> colonies
<tb> brun <SEP> clair <SEP> sporulées <SEP> gouttelettes <SEP> limpi-
<tb> (R) <SEP> à <SEP> Gris <SEP> des, <SEP> incolores <SEP> et <SEP> surface <SEP> présouris <SEP> (R); <SEP> sentant <SEP> de <SEP> petites <SEP> dépressions
<tb> sur <SEP> verre <SEP> à <SEP> dues <SEP> au <SEP> séchage <SEP> des <SEP> gouttevitre <SEP> sporu- <SEP> lettes, <SEP> envers <SEP> chamois <SEP> clair
<tb> lation <SEP> humi- <SEP> ou <SEP> saumon <SEP> orangé <SEP> à <SEP> brun <SEP> gride <SEP> noire) <SEP> sâtre <SEP> ou <SEP> fauve <SEP> Chamois <SEP> clair
<tb> (R) <SEP> ou <SEP> presque <SEP> Cannelle <SEP> brun
<tb> (R)) <SEP> ; <SEP> spores <SEP> en <SEP> spirales <SEP> peu
<tb> serrées, <SEP> courteset <SEP> cylindriques, <SEP> 0,99-1,32 <SEP> x <SEP> 0,66 <SEP> .
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EMI2.1
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<tb> cannelle-chamois, <SEP> envers
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<tb> Agar <SEP> Gris <SEP> souris
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<Desc/Clms Page number 5>
TABLEAU II
EMI5.1
ATCC 11653 , arac,éristictues de culture,
EMI5.2
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
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<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
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<tb> Dresde <SEP> (R) <SEP> , <SEP> envers <SEP> jaune
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<tb> orange <SEP> avec <SEP> une <SEP> légère <SEP> ombre
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<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> dévelop- <SEP> sporulapement <SEP> tion.
<tb>
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Agar <SEP> Faible <SEP> Aucun <SEP> Jaune <SEP> Surface <SEP> lisse <SEP> et <SEP> cireuse
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EMI6.2
convnlutions radiales
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<tb> Agar <SEP> modéré <SEP> Dans <SEP> diffé- <SEP> Jaune <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> brun
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<tb> Mor- <SEP> Modéré <SEP> Aucun <SEP> Rose <SEP> Surface <SEP> brillante, <SEP> avec <SEP> con-
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<tb> ceaux <SEP> pourpre <SEP> volutions <SEP> en <SEP> labyrinthe <SEP> très
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<tb> de <SEP> pâle <SEP> petites <SEP> à <SEP> petites;
<SEP> mycélium
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<tb> de <SEP> Brun <SEP> jaune <SEP> crème <SEP> à <SEP> jaune <SEP> moutarde
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<tb> terre <SEP> Sorgho <SEP> (Blanc <SEP> Crème <SEP> à <SEP> presque
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(R)) Chamois " Colonialtt(R) à
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<tb> Jaune <SEP> Miel <SEP> (R) <SEP> ) <SEP>
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<tb> Plaques <SEP> Modéré <SEP> Mycélium <SEP> Aucun <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> blanc <SEP> à
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<SEP> envers <SEP> blanc
<tb> rulation <SEP> sur <SEP> les <SEP> bords, <SEP> verdâtre
<tb> gris <SEP> souris <SEP> gris <SEP> au <SEP> centre <SEP> ( <SEP> presque <SEP> Gris
<tb> clair <SEP> à <SEP> Verdâtre <SEP> terne <SEP> (R); <SEP> zone <SEP> de
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<tb> à <SEP> presque <SEP> rose);
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EMI6.6
noir) petites dépressions prove-
EMI6.7
<tb> nant <SEP> de <SEP> gouttes <SEP> -de <SEP> liquide
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
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<tb> rulation <SEP> différen- <SEP> relief;
<SEP> mycélium <SEP> végétatif
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<tb> Bouillon <SEP> gris <SEP> souris <SEP> Ocré <SEP> (R) <SEP> à <SEP> presque <SEP> Brun
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<tb> (entre <SEP> Gris <SEP> de <SEP> Prout <SEP> (R))
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<tb> Souris <SEP> clair
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<tb> d' <SEP> brun <SEP> clair <SEP> (entre <SEP> jaunâtre <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> gri-
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<tb> Emerson <SEP> puis <SEP> brun <SEP> gri- <SEP> Terre <SEP> de <SEP> sâtre(Brun <SEP> Buckthorn <SEP> (R)
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<tb> Sépia <SEP> Chaud <SEP> tique <SEP> (R) <SEP> ) <SEP> à <SEP> brun <SEP> grisâtre <SEP> (Bronze <SEP>
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<tb> (R) <SEP> à <SEP> Brun <SEP> Médaille <SEP> (R) <SEP> et <SEP> Orange <SEP> de
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<tb> Benzo <SEP> (R)) <SEP> Zinc <SEP> (R) <SEP> à <SEP> erre <SEP> d'Ombre
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<tb> crue <SEP> (R)
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<tb> Aspara- <SEP> Bon <SEP> Sporulation <SEP> Brun <SEP> ver- <SEP> Envers <SEP> presque <SEP> Brun
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<tb> gine <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune <SEP> dâtre <SEP> et <SEP> Buckthorn <SEP> (R)
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<tb> Extrait <SEP> pâle <SEP> à <SEP> gris <SEP> jaunâtre
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<tb> de <SEP> à;
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<tb> Dextrose <SEP> Jaune <SEP> Paille <SEP> (R) <SEP> et <SEP> cou-
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TABLEAU III ATCC 11654, Caractéristiques de culture.
EMI7.2
<tb>
Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques.
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> dévelop- <SEP> aporul@pement <SEP> tion
<tb>
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<tb> Glucose <SEP> bon <SEP> Aucun <SEP> Brun <SEP> grisâ- <SEP> Surface <SEP> cireuse, <SEP> modérétré <SEP> à <SEP> oli- <SEP> ment <SEP> à <SEP> fortement <SEP> méruve <SEP> brunâ- <SEP> liolde <SEP> dans <SEP> différents
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
<tb>
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<tb> pement <SEP> tion
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<tb> tre <SEP> dans <SEP> dif- <SEP> tubes;
<SEP> mycélium <SEP> végéta-
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EMI9.1
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<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigmept <SEP> Remarques
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<tb> Sur <SEP> les <SEP> plaques <SEP> de <SEP> dilu-
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<tb> sans <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> ou
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<tb> avec <SEP> de <SEP> petites <SEP> zones <SEP> dis-
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<tb> lium <SEP> aérien <SEP> ni <SEP> sporula-
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<tb> tions <SEP> radiales <SEP> devenant
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<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
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<tb> pement <SEP> tion
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méruUo5:
des aux bords,
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<tb> un <SEP> mycélium <SEP> végétatif
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<tb> et <SEP> un <SEP> envers <SEP> presque
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<tb> incolore <SEP> à <SEP> chamois <SEP> clair
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<tb> ou <SEP> chamois <SEP> rosé; <SEP> plu-
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<tb> sieurs <SEP> colonies <SEP> à <SEP> mycélium
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<tb> végétatif <SEP> orange <SEP> et <SEP> en-
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<tb> vers <SEP> brun <SEP> orange, <SEP> surface
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<tb> cireuse <SEP> et <SEP> lisse <SEP> ou <SEP> bords
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<tb> Lait <SEP> Faible <SEP> Anneau <SEP> blanc <SEP> Jaune <SEP> Le <SEP> lait <SEP> coagule;
<SEP> peptonisa-
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<tb> écrémé <SEP> à <SEP> crémeux <SEP> à <SEP> grisa- <SEP> tion <SEP> nulle <SEP> à <SEP> très <SEP> faible
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<tb> modéré <SEP> jaune <SEP> terne <SEP> tre <SEP> dans <SEP> différents <SEP> tubes;pH
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<tb> clair <SEP> jaune <SEP> terne <SEP> passe <SEP> de <SEP> 6,3, <SEP> à <SEP> 6,8.
<SEP> Faible
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<tb> bords <SEP> supé-
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<tb> presque <SEP> Jaune
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<tb> (R), <SEP> bords
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<tb> Brun <SEP> Cannelle
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<tb> (R));
<SEP> ni <SEP> mycé-
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<tb> lium <SEP> aérien,
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<tb> ni <SEP> sporula-
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<tb> menta- <SEP> glucose;
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On notera que la présente invention s' étend non seulement à 1' emploi d' organismes répondant aux descriptions données ci-dessus à
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titre d' exemple, mais également à 1' emploi de produits de mutatioir obtenus à partir des organismes décrits par différents moyens , par exem- ple les rayons X, les- rayons ultraviolets,, les gaz azotés,etc..
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Les souches de Streptomyces produisant la tétracycline peuvent être conservées sur des supports d' agar d' Emerson ou sur d' autres milieux appropriés, ou bien les organismes peuvent être séchés à partir de la forme congélée pour être ranimés ultérieurement.
Des cultures sur supports ou des préparations séchées par congélation peuvent être ajoutées à des milieux nutritifs stériles en petits flacons pour la préparation de petites quanti- tés de l' antibiotique ou pour préparer assez des microorganismes pour ensemencer des quantités plus importantes de milieux nutritifs. En général le milieu de fermentation doit contenir une source d' hydrate de carbone et une -source d' azote, de préférence sous forme organique. Divers sels
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métalliques cnt-également une certaine valeur, parce qu'ils stipulent la production de l' antibiotique, mais l' emploi d' eau de ville fournit souvent assez de ces métaux pour obtenir un développement approprié: Par- mi les sources d' hydrate de carbone utiles on peut compter la mélasse, le glucose, les amidons; le glycérol, etc..
Les sources d' azote organique comprennent la farine de soya, le gluten de blé, la farine d' arachide, les produits d' hydrolyse de la caséine et d' autre s protéine s etc... Cer- .taines matières brutes contiennent des substances stimulant le développe- ment qui sont intéressantes pour obtenir des rendements maximum en anti- biotique. Ce sont notamment la liqueur de fermentation du blé, les produits solubles de distillation, l' extrait de levure, etc.. Les sels tels que le chlorure de sodium, le nitrate de sodium, le phosphate de potassium et le sulfate de magnésium ont également une certaine valeur.
Bienque les orga-
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nismes n' aient pas tendance à changer appréclablement le PH du milieu pendant leur développement, 1' emploi d'un agent tampon comme le carbonate de calcium a une certaine valeur;Si le milieu a tendance à mousser pendant le développement des organismes en conditions aérobies submergées, l' addition d' huiles comme l' huile de saindoux, l' huile de soya, etc... peut etre recommandable.
Gomme on l' a indiqué plus haut, la culture aérobie submergée des
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souches choisies de S treptowaes est surtout utile dans la production à gran- de échelle de l' antibiotique nonne tétracyaline. Pour effectuer cette pré- paration, il est nécessaire d' aérer le mélange de fermentation au mayen ' air stérile à raison d' au moins 1/2 volume d'air par volume de milieu par minute. Des quantités plus élevées sont parfois plus satisfaisantes. Ces conditions et d' autres varient dans une certaine mesure suivant la sou-
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che d' organisl#.S utilisée, le type de récipient de réaction, le type d' agitateur et ainsi de suite. Il est recommandable d' utiliser n agitateur dans le récipient de fermentation pour favoriser un bon contact entre l' air et le milieu.
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La culture des souches de S treptomyce s produisant la tétracycline prend de 2 à 6 jours lorsqu'elle s' effectue en flacons. Toutefois, le temps
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moyen nécessaire pour atteindre la, puissance maximum est apgréciablement plus court lorsque on utilisé une fermentation.aérobie- agitée e-t submergée.
Des quantités appréciables d' antibiotique, sont souvent formées en l' es- pace d'un jour et dans de nombreux case la production maximum; d' antibioti- que s' obtient en deux jours environ. Il est évidemment essentiel que le milieu utilisé et tous les appareils soient soigneusement stérelisés avant
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1' ensemencement-avec la souche choisie de microorganisme.. Pendant toute la durée de la fernentation ; les précautions connues doivent être- prises pour que des microorganismes contami.nants ne puissent troubler la fermentation.
Le présent procédé de- fermentation peut être effectué à une tem-
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pérature d' environ 25 à environ 30 C. La température apti=ia semble être environ 28 C. Pour amorcer une fermentation à grande échelle, il est re- commandable d' inoculer les mLlieux de fermentation stérilisés-préparés
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au moyen d' environ 1 à 10 % en volume d'une culture d'une souche de Strep- tomyces produisant la tétracycline fraîchement préparée.
L'activité antibiotique des produits obtenus à;partir des sou- ches de Streptomyces décritesci-dessus peut êtredéterminée par desmétho- des d' essai microbiologiques standard pour antibiotiques avec divers mi- croorgani sme s . Diversesmesures physiquespeuvent être également utilisées pour déterminer la teneur en antibiotique d'un échantillon donné, par exemple l'absorption de rayons ultraviolets à certaines longueurs d'onde ou l'absorption de rayons infra-rouges. La tétracycline amphotère anhydre pure cristallisée est prise comme standard de comparaison avec une puissance de 1.000 mcg/ mg; La chromatographie sur papier est particulièrement utile pour déceler et déterminer la teneur en tétracycline de matièresbrutes et de produits plus purs.
Bienque -le bouillon de fermentation brut formé par culture dans des milieux nutritifs en conditions aérobies des nouvelles souches de Streptomyces produisant de la tétracycline ait une valeur appréciable par lui-même, par exemple à titre d' addition aux aliments pour animaux ou pour stimuler la croissance des plantes, il est souvent plus intéres- sant de séparer l' antibiotique sous forme de matière sèche soit à l'état brut soit à l'état purifié. Diverses méthodes peuvent être utilisées à cette fin. Par exemple le bouillon tout entier, avant ou après filtrage du mycélium peut être séché à partir de l'état congelé pour fournir un produit brut contenant des quantités appréciables d' antibiotique.
Il est conseillé d' effectuer cette opération de sèchage à un pH qui n' est ni trop acide ni trop basique, parce que l' antibiotique peut être dégradé par ce traitement.
L'antibiotique nommé tétracycline peut être séparé du bouillon de fermentation par différents procédés. Il est recommandable, avant d' appliquer ces.procédés de séparer le mycélium, de l' ensemble du bouil- lon par filtration. La quantité maximum d' antibiotique est obtenue dans le filtrat aqueux si le mélange est réglé à un pH d' environ 2 à 3 par un acide fort-(acide chlorhydrique, acide sulfurique,acide phosphorique,etc..) -avant la filtration. Bien qu'une élévation modérée de le température puisse faciliter la coagulation d'une partie des impuretés finement divi- sées et donner ainsi un filtrat plus propre , leshautes températures doi- vent être évitées.
Il ;peut avoir une certaine destruction de l' activité antibiotique à ce pH (2 à 3) si la solution est chauffée' à plus de 40 C environ ou si la solution est maintenue à ce pH pendant un temps. considérable.
Pour séparer le mycélium du bouillon de fermentation par filtra- tion,on peut utiliser différents auxiliaires de filtration et particuliè- rement ceux qui contiennent de la terre d' infusoires. Le filtrat peut être ensuite séché ou soumis à de nouveaux procédés de séparation pour le puri- fier. Un procédé utile pour la séparation de la tétracycline des bouillons de fermentation consiste à ajouter certai@s ions métalliquespolyvalents, de préfé- rence sous la forme de sels solubles dans l'eau de ces métaux.
Bien qu' une certaine proportion desmétaux puisse être présente dans le bouillon de fermentation, particulièrement du calcium lorsqu'on utilise du carbonate de calcium comme agent tamponµ cette quantité est souventin suffisante pour précipiter des proportions importantes d'antibiotique lorsque le bouillon est rendu basique.
La précipitation, est obtenue après addition des sels métalliques nécessaires par réglage du pH à une valeur légèrement alcaline En général, un pH.de 7,5 à 9 environ convient le'mieux. L'emploi de plus d'un agent de précipitation métallique polyvalent est recommandable, parce que les produits complexes formés dans le bouillon de fermentation avec une combinaison de cesmétaux sont souvent beaucoup moins solublesque dans le cas d'un seul ion métallique polyvalent. Parmi les métaux les plus utiles pour précipiter l'antibiotique on compte le baryum, le calcium, le magnési- um, le strontium, le béryllium, le mercure, le cadmium et d' autres ions métalliquespolyvalents; particulièrement ceux du. groupe 2 du Tableau Périodique des Eléments.
Comme on l' a indiqué plus haut, une combinaison
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de deux ou de plusieurs de ces métaux est souvent plus efficace qu'un seul métal.
Le précipité complexe d' antibiotique et d'ions métalliques avec d'autres éléments du bouillon de fermentation peut être séparé de la solution restante par filtration, par centrifugation ou par d'autres procédés approprié s. Le produit peut être ensuite lavé avec un petit volume d' eau pour éliminer la li@ueur de fermentation résiduelle qui contient peu d' antibiotique et le produit brut peut être alors séché et utilisé à certaines fins si les ions polyvalents utilisés sont relativement non toxiques, comme le calcium et la magnésium par exemple. En variante, le produit brut, sous forme humide ou sèche, se laisse transformer en une fonne purifiée d'antibiotique amphotère par traitement du produit précipité par un agent précipitant sélectivement les ions métalliques utilisés.
C' est ainsi que 1' on utilise le calcium et le baryum comme métaux, le produit peut ;être traité par une solution diluée d' acide sufurique pour obtenir un précipité de sulfates de calcium et de baryum et une solution aqueuse de l' antibiotique. Par filtrage de la matière solide précipitée, on sépare la solution d' antibiotique Apres réglage du pH pour éviter la décomposi- tion de l'antibiotique, on peut utiliser la solution concentrée telle quel- le dans diverses applications ou la faire sécher. En rendant le pH légèrement alcalin, on peut séparer une forme plus pure de tétracycline amphotère de la solution aqueuse concentrée obtenue de cette manière.
Ce produit a gé- néralement une pureté suffisante pour qu'on puisse le cristallier par des procédés qui ont été décrits dans certaines des publications antérieures mentionnées plus haut.
Un second pocédé qu'on peut utiliser pour séparer la tétra- cycline du bouillon fermentation comprend l'extraction de l' antibiotique à un pH fortement acide ou légèrement alcalin dans certains solvants organi- ques immiscibles à 1' eau. En général, cette extraction peut être effectuée à un pH d'environ 1 à 2,5, ou à,un pH d' environ 7,5 à10. Plusieurs sol- vants organiques polaires, immiscibles à l'eau peuvent être utilisés à cette fin. Ce sont notamment des solvants alcooliques comme les butanols, les pentanols, etc.., ainsi que des alcools substitués comme 1' alcool benzylique, 1' alcool phényléthylique et certains éthers de glycols comme le phénylcellosolve; des cétones immiscibles à l'eau comme laméthyl-isobutyl- cétone,dès esters comme l'acétate d' amyle, l'acétate de propyle, le propionate d' éthyle, etc..
On a trouvé utile d' ajouter au bouillon de fermentation filtré avant l' extraction et particulièrement aux pH alcalins, un agent de séquestration des ions métalliques polyvalents . Ces agents comprennent les polyphosphates, divers hydroxy-acides comme l'acide gluco- nique; l'acide citrique,,!' acide tartrique, etc.. et des amino-acides comme l'acide éthylène-diamine-tétraacétique. On évite ainsi l'extraction des ions métalliques polyvalents sous forme de complexes avec la tétracycline et d autres éléments du bouillon de fermentation.
L'extraction peut être effectuée par des procédés statiques ou par extraction continue à contrecourant. Un procédé particulièrement utile pour l'extraction comprend 1' emploi de 1' appareil connu dans 1' indus- trie sous le,nom d' extracteur de Podbielniak. En général, un volume de - solvant d'au moins environ 1/10 du volume de la solution aqueuse de l' anti- biotique est utilisé. Des rapports de solvant appréciablement plus élevés peuvent être nécessaires si le solvant choisi n' a pas l' efficacité maxi- mum ou si l'appareil utilisé n'arrive pas rapidement à 1' équilibre de ré- partition.
Lorsque 1' extraction est achevée les phases de solvant peuvent etre combinées à l'antibiotique peut être séparé soit par l' évaporation complète du solvant ou par évaporation partielle du solvant et extraction de l'antibiotique dans un petit volume d'un acide en solution aqueuse diluée de préférence un acide Binerai. Le concentré ainsi obtenu peut être utilisé pour diverses applications. Le produit peut être précipité par règlage du pH du concentré aqueux à une valeur faiblement alcaline, par exemple envi- roi) 7,5. La tétracycline ainsi obtenue peut être employée dans certaines
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applications thérapeutiques ou peut être cristallisée.
Un autre procédé de séparation de la tétracycline du bouillon de fermentation préparé comme décrit ci-dessus comprend l' emploi de cer- taines bases organiques comme agent de précipitation. Les bases organi- ; ques à poids moléculaire élevé ayant une faible solubilité dans l' eau sont particulièrement utiles.
En particulier les substances telles qu'un sel d' ammonium quaternaire à poids moléculaire élevé, par exemple des halogénuresd' alkyl-triméthyl- ammonium en 08 à C18; des halogénuresd' alkyl-diméthyl-benzyl-ammonium en 08 à 018;des imidazolines substituées @ par une chaîne alkyli que longue , desalkyl-amines à chaîne longue, primai- res secondaires ou tertiaires, et plusieurs autres substances basiques or- ganiques.Ces agents de précipitation semblent former des complexes conte- nant non seulement l' antibiotique, mais également certains autres éléments normalement présents dans les sels préparés. Ces éléments peuvent compren- dre de petites quantités de métaux polyvalents et de substances organi- ques.
Après addition de la matière de base organique au bouillon de fer- mentation de tétracycline filtré, on règle le pH du mélange de préférence par un alcali soluble eomme l' hydroxyde de sodium, à une valeur légèrement basique , c' e st-à-dire 8 à 9,5 environ.Le produit qui précipite peut être séparé par filtration, de préférence après une courte période d' agitation. On obtient un produit un peu plus pur si le bouillon de tétra- cycline filtré et acidifié est traité par un agent de séquestration par exemple un des agents énumérés plus haut, avait d' ajouter le précipitant basique organique.
Le produit obtenu par précipitationpar une base organiqueà poids moléculaire élevé comme récrit plus haut peut être transformé en un pro- duit contenant des sels de tétracycline, ou en tétracycline amphotère.
On y arrive le plus simplement en dissolvant le précipité dans un solvant organique polaire à bas poids moléculaire comme le méthanol.L' addition d'une solution concentrée d'un acide minéral, par exemple de l'acide chlo- rhydrique concentré donne du clorhydrate de trétracycline qui peut cristal- liser ou précipiter si l' on a utilisé une solution suffisamment concentrée
Les complexes basiques organiques de tétracycline ont également une valeur appréciable, par exemple comme agents anti-bastériens industrielso
Un autre procédé pour séparer l'antibiotique consiste à mettre en contact le bouillon de'fermentation acidifié après filtration du mycéli- um avec certains colorants acide aryl-azo-sulfoniques.
On obtient ainsi la précipitation .d'un complexe du colorant dont on peut séparer l' anti- biotique par des procédés analogies à certains procédés décrits plus haut.
Par exemple, le mélange peut être dissous dans un solvant organique polaire à poids moléculaire peu élevéo Le règlage du pH à une valeur légèrement alcaline provoque la précipitation de la tétracycline amphotère si l'on utilise une solution suffisamment concentrée.
En plus des procédés de séparation décrits ci-dessus, l' anti- biotique peut etre obtenu sous-une forme partiellement purifiée en mettant en contact le bouillon de fermentation avec un adsorbant comme le charbon activé, les terres actives et d' autres matières de cette nature. L' ad- sorption peut être effectuée à un pH d'environ 3 à environ 8 et l' anti- biotique adsorbé peut être utilisé tel quel pour enrichir des aliments pour les animaux ou pour d'autres applications analogueso En variante, la té- tracycline peut être séparée de l' adsorbant par élution, par exemple par un acide en solution aqueuse diluée ou par une solution diluée d ' un a- cide fort dans un solvant polaireo Ainsi obtenue , on peut 1' utiliser sans autre transformation ou la purifier davantage, par exemple par les procédés qu ' on a énumérés plus haut.
L ' antibiotique peut être adsorbé à partir du bouillon de fermentation sur certains types de résines d' échange d' ions,particulièrement les résines fortement acides comme les résines d' échange d'ions à le acide aulfonique, par exemple le Dowex 1.
L' adsorption s 'effectue le mieux à un pH de 3 à 8 environ
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et le produit peut être utilisé tel quel dans certaines applications ou bien là tétracycline peut être séparée par élution, par exemple au. moyen d'un alcali dilué.
Dans tous ces.procédés de séparation;on peut obtenir de la manière suivante la séparation de la tétracycline de sous-produits antibio- tiques de la fermentation: On forme d' abord une préparation aqueuse de la tétracycline brute obtenue par l' un ou l'autre des différents procédés de séparation décrits plus haut.Cette.solution est ensuite acidifiée et soumise à l'extraction par un solvant organique immiscible à 1 ' eau, particulièrement des alcools inférieurs comme le butanol, l' isobutanol, les pentanols, les hexanols etc..
l' extraction étant achevée, les extraits par le solvant organique sont réglés à un pH pratiquement neutre et la tétracycline libre peut être alors précipitée sous forme de base en agitant le mélange ou en le laissant reposer pendant plusieurs heures La tétracy- cline ainsi précipitée peut être séparée par filtration et soumse à une nouvelle purification par recristallisation.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre d' illustration Et ne sont pas les seules formes d'exécution de l' invention.
EXEMPLE 1.-
On rince à l'eau stérile une culture de Streptomyces n ATCC 11652 sur support d' agar d' Emerson dans un flacon contenant 100 cm3 de milieu nutritif stérile de la composition suivante:'
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<tb> Matière <SEP> Grammes
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> 4,0
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,3
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> de <SEP> ville
<tb>
On remplit une série de flacons de ce milieu, on les stérilise on les inocule et ons les incube à 28 C. en les agitant continuellement Après 6 jours on utilise un de ces flacons pour inoculer 2 litres du même milieu dans un -récipient métallique de 3 litres équipé pour la fermenta- tion aérobie submergée dans des conditions stériles.
Le mélange est agité et aéré à raison d' environ 1 volume d'air par volume de milieu par minute à une température de 28 C pendant 3 jours. On réunit les mélanges de fermentation de 10 de ces fermentations et on règle le pH 2,5 par de l'acide chlorhydrique à;la température ordinaire. Le mycélium est filtré avec addition d'un auxiliaire de filtration à bae de terre d' infusoires.
Le filtrat est réglé au pH 7,5 et extrait deux fois par 1/4 de volume de butanol. Les phases de butanol sont combinées et concentrées dans le vi- ' de à un volume de 1500 cm3.Le concentré de butanol est alors extrait par approximativement 200 cm3 d'eau réglée au pH 1,9 par de l'acide chlorhy- drique. Cette extraction est répétée avec le même volume d'eau acidifiée.
Les extraits aqueux combinés sont réglés au pH 7,5 par de l' hydroxyde de sodium dilue et le produit brut contenant de la tétracycline amphotère est séparé par filtration avec addition d'un auxiliaire de filtration à base de terre d'infusoires. La matière est soumise à une nouvelle purifi- cation pour obtenir 'de la tétracycline amphotère cristallisée. t EXEMPLE 11.-
On lave à l' eau stérile 'une culture de Streptomyces n ATCC 11653 sur un support d' agar d' Emerson dans 100 cm3 d'un milieu préparé à partir des matières suivantes: farine de soya, produit d' hydrolyse de la caséine, mélasse de betteraves, liqueur de macération du blé,et eau de ville. Le milieu inoculé est agité dans un agitateur à 28 C pendant 5 jours.
La culture obtenue de cette manière est utilisée pour inoçuler 2 litres d'un milieu stérile ayant la même composition que dans l' exemple ci-dessus.Le mélange est aéré et agité à 28 C pendant 3 jours. L' anti- biotique' brut est séparé après filtration par addition de chlorures de baryum et de magnésium et règlage du pH à 9 environ. Le produit précipité
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est filtré, lavé dans un petit volume d'eau et transformé en un concentré aqueux par traitement par de l'acide sulfurique dilué et filtration. Le -règlage du filtrat au pH 8,0 par de l' hydroxyde de sodium dilué provoque la séparation d'un produit antibiotique plus,pur qui ,après une nouvelle purification , donne la tétracycline amphotère cristallisée.
EXEMPLE 111.-
On rince à l'eau stérile une culture de Streptomyces n ATCC 11654 sur support d' agar d' Emerson dans un flacon contenant 100 cm3 de milieu nutritif stérile de la composition suivante;
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<tb> Matière <SEP> Grammes
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> : <SEP> 4,0
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,3
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> de <SEP> ville
<tb>
On remplit une série de flacons de ce milieu, on les stérilise on les inocule et on les incube à 28 C en les agitant continuellement.
Après 6 jours, on utilise un de ces flacons pour inoculer 2 litres du même milieu dans un récipient métallique de 3 litres équipé pour la fermentation aérobie submergée dans des conditions stérileso Le mélange est agité et aéré à raison d'environ1 volume d' air par volume de milieu par minute à une tempé- rature de 28 C pendant 3 jours. Le milieu de fermentation de 10 de ces fermentations est réuni et réglé au pH 2,5par de l'acide chlorhydrique à la température ordinaire. Le mycélium est filtré avec 1' aide d'un auxiliaire de filtration à base de terre d'infusoires. Le filtrat est réglé au pH 7,5 et extrait deux fois par 1/4 de volume de butanol.
Les phases de butanol sont combinéeset concentréessous vide à un volume de 1500 cm3? Le concentré de butanol est alors extrait par approximativement 200cm3 d' eau réglée au pH 1,9 par de l'acide chlorhydrique. Cette extraction est répétée avec le mené volume d' eau acidifiée. Les extraits aqueux combinés sont réglés au pH 7,5 par de 1' hydroxyde de sodium dilué et le produit brut contenant de la tétracycline amphotère est filtré avec addition d'un- auxiliaire à base de terred'infusoires. La matière est soumise à une nou- velle purification pour obtenir la tétracycline amphotère cristallisée.