<Desc/Clms Page number 1>
PROCEDE D'OXYDATION DE STEROIDES ET PRODUITS PREPARABLES PAR,CE
PROCEDE.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'introduc tion d'oxygène dans une molécule de stéroïde et,dans la mesure où ils ne sont pas destinés à servir de remèdes, certains composés nouveaux, suscepti- bles d'être préparés par ce procédé.
On a déjà proposé d'introduire de l'oxygène dans la position 11 d'une molécule de stéroide mais on n'y est parvenu que par des synthèses or- ganiques d'une haute technique, impliquant un nombre important de stades.
En conséquence, le rendement global en stéroïde oxygéné en 11 a été de beau- coup inférieur à ce que l'on désirait et les frais d'une telle fabrication ont été extrêmement élevés, sinon prohibitifs. Il s'est donc présenté une barrière infranchissable devant les chimistes pharmaciens s'efforçant de met- tre certains stéroides oxygénés en 11 à la portée des personnes appartenant à la moyenne du public et souffrant de diverses maladies que l'on sait, à l'heure actuelle, n'être justiciables d'un traitement heureux que si l'on applique certains stéroïdes oxygénés en 11, car les frais de fabrication éle- vés et la fourniture insuffisante de ces remèdes importants se sont opposés à leur diffusion et à leur mise à disposition sur une grande échelle ou sur le marché général.
Parmi ces produits à structure de stéroides oxygénés en 11, on peut citer, par exemple, la corticostérone, la 11-déhydro-corticostérone, la 11-déhydro-17-hydroxy-corticostérone (composé E ou cortisone) et la 17-hy- droxy-corticostérone (composé F).
Il est, par conséquent, d'une importance considérable de trouver une manière plus satisfaisante de produire des composés stéroides oxygénés, en particulier ceux qui le sont en 11, ces corps comportant en 11 soit le groupement cétonique (oxo) = 0, étant donné que l'oxygène fixé en 11 appa- raît dans divers-représentants de ces remèdes recherchés, soit le groupement hydroxylique -OH, qui se présente lui-même dans de nombreux stéroïdes pré-
<Desc/Clms Page number 2>
cieux et est, outre cela, facile à transformer en groupement cétonique par des procédés d'oxydation connus. A ces fins, des sommes d'argent et des heu- res de travail insoupçonnées ont été dépensées sans que l'on ait enregistré jusqu'ici un progrès marqué vers le succès.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'introduc- tion d'oxygène dans une molécule'de stéroide, en particulier dans la posi- tion 11. Elle comprendun procédé de ce genre grâce auquel un 11-désoxy- stéroïde est transformé, avec de hauts rendements, en un stéroïde oxygéné en 11 par l'action d'un champignon de l'ordre des Mucorales ou d'enzymes fongiques oxydants qui en dérivent ; tout le mémoire, l'expression "11- désoxy-stéroide" désigne un stéroïde dépourvu d'oxygène dans la position 11.
L'invention englobe en outre un procédé de préparation de stéroïdes oxygénés en 11 à partir de 11-désoxy-stéroides, procédé suivant lequel la transforma- tion est effectuée par l'action d'un champignon de l'ordre des Mucorales ou d'enzymes oxydants qui en proviennent. De plus, l'invention se rapporte à un procédé d'introduction d'oxygène au moins dans la position 11 de la molé- cule d'un 11-désoxy-stéroide par l'action d'un champignon de l'ordre des Mucorales, en particulier de la famille des Mucoracées et plus spécialement du genre Rhizopus, ou par l'action des enzymes secrétés par ces champignons.
Enfin, l'invention comprend, dans la mesure où ils ne sont pas destinés à servir de remèdes, des produits industriels nouveaux qui sont préparables par le procédé objet de l'invention et d'un intérêt exceptionnel pour la fa- brication de produits précieux à base de stéroïdes oxygénés en 11, outre leur importance comme remèdes en eux-mêmes. Diverses autres particularités et avantages de l'invention ressortiront de la suite du mémoire descriptif.
La demanderesse a trouvé que les 11-désoxy-stéroides à noyaux de cyclopentano-polyhydro-phénanthrènes, surtout les 10.13-diméthyl-cyclopen- tano-polybydro-phénanthrènes, pouvaient être transformés facilement et avec des rendements élevés en les stéroïdes oxygénés correspondants si on les soumettait à l'action d'un champignon de l'ordre des Mucorales ou à celle des enzymes oxydants engendrés par de tels champignons. L'invention procure dès lors un moyen efficace, économique et industriellement satisfaisant pour introduire de l'oxygène dans la position 11 d'une molécule de 11-désoxy- stéroïde.
En conséquence, une voie nouvelle et simple est ouverte vers la production de médicaments à base de stéroïdes oxygénés en 11, ce qui, comme on l'a indiqué précédemment, offre une grande importance dans les profes- sions chimique, pharmaceutique et médicale et surtout pour les personnes du public, en général, qui souffrent de désordres physiologiques dont on sait qu'ils ne peuvent être heureusement traités que par de tels médicaments.
Sous ses formes les plus générales, l'invention consiste essen- tiellement à soumettre un 11-désoxy-stéroide à l'action d'un champignon oxydant de l'ordre des Mucorales ou à celle d'enzymes oxydants de ces cham- pignons, qui sont en mesure d'introduire un atome d'oxygène dans le noyau du stéroïde, sur l'atome de carbone 11. Pour exprimer autrement le résul- tat de la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention, on peut dire que le stéroïde se trouve "oxygéné" puisqu'un atome d'oxygène est introduit dans sa molécule. On peut aussi dire que c'est l'atome de carbone occupant la position 11 qui est oxydé.
Dans des cas isolés, la transformation sous l'ac- tion du champignon ou de ses enzymes peut porter aussi sur d'autres posi- tions de la molécule du stéroïde, mais de telles transformations ne sont pas à considérer comme dénuées d'intérêt car l'introduction d'oxygène dans d'au- tres parties de la molécule du stéroïde peut se traduire par la création de produits thérapeutiques ou d'intermédiaires précieux, par exemple ceux qui comportent un hydroxyle en 17. Lorsque de tels groupements additionnels ne sont pas jugés intéressants en eux-mêmes, on dispose de moyens pour les en- lever facilement.
Le fait important attaché à la présente invention, dans la mesure où l'on s'en tient aux résultats, est que la molécule du 11-désoxy- stéroïde se trouve oxygénée au moins dans la position 11 où, jusque là, la molécule ne possédait pas d'oxygène. Les hydroxyles qui sont eux-mêmes sus- ceptibles d'être oxydés en donnant des groupes cétoniques, lorsqu'il s'en trouve dans la molécule d'un stéroïde à oxygéner en 11, peuvent, si on le
<Desc/Clms Page number 3>
juge nécessaire, par exemple lorsqu'on recherche des rendements extrêmement élevés en hydroxy-stéroides oxygénés en 11, être protégés contre des allai- ques de diverses sortes, en particulier l'attaque par .les champignons oxy- dants ou leurs enzymes fongiques oxydants;
pour cette protection, on peut les transformer, par exemple, par estérification, éthérification, halogéna- tion ou moyen de blocage analogue, en un groupe ou atome susceptible d'être retransformé en groupe hydroxyle. Cette manière de faire n'est pas néanmoins un impératif préalable à l'introduction d'oxygène;, surtout en 11, dans la molécule d'un hydroxy-stéroide par le procédé faisant l'objet de l'inven- tion.
Les stéroides justiciables de l'application du procède objet de l'invention ne sont pas limités quant au genre ou au nombre de substituants et, pour le succès dans la mise en oeuvre du procédé, ils doivent simplement présenter une position 11 sans oxygène ou, en d'autres termes, être des 11-
EMI3.1
désoxy-stéroïdes.
De tels composés comportent le noyau connu de cyclopenta- no-phénanthrène et celui-ci peut, en outre, posséder des substituants ou com- binaisons de substituants tout autour du noyau, par exemple dans les posi- tions 1 à 17 sauf 11, principalement deux groupes méthyliques en 10 et 13, des groupes cétoniques, hydroxyliques ou acyloxyliques en 3, 7 ou 12, des chaînes latérales en 17, parmi lesquelles celles de la progestérone et de la corticostérone (cétol) méritent une mention spéciale, un groupe cétonique en 17, un hydroxyle en 17 etc., de même que des doubles liaisons en 4, 5, 6, 7, 8, 9 (11), 11 (12), 16 (17) et dans d'autres positions ou combinaisons de doubles liaisons autour du noyau, ou encore des doubles liaisons qui ont été saturées moyennant la fixation d'halogènes ou d'halogène et d'hydrogène, par addition,
sur les atomes de carbone intéressés; les composés considérés peuvent aussi comporter des radicaux, ajoutés, de diénophiles tel que l'aci- de maléique, l'anhydride maléique ou les esters maléiques dans le cas de stéroides à doubles liaisons conjuguées, par exemple en 5 et 7; ils peuvent posséder d'autres substituants et combinaisons de substituants, doubles liai- sons etc... trop nombreux pour une mention spéciale et dont beaucoup sont connus dans la chimie des stéroides.
La présence ou l'absence de double liaison en 9 (11) ou en 11 (12) n'est pas déterminante dans le procédé objet de l'invention; en effet, bien qu'il faille appliquer par préférence ce procédé à un stéroïde possédant un groupe méthylénique en 11 donc sans double liaison en 9 (11) ou en 11 (12), pour des raisons d'économie et afin d'éviter des passages inutiles de com- posés saturés à des composés non saturés, l'oxydation biochimique peut être appliquée avec une égale facilité aux composés saturés et aux composés non saturés.
Comme représentants des stéroïdes que l'on peut oxygéner par le procédé objet de l'invention, on peut citer, par exemple, la progestérone,
EMI3.2
les 9.11 et 11.12-déhydro-progestérones, la 7.9 (1l)-bis-déhydro-progestéro- ne, la 17-hydroxy-progestérone, la prégnénolone, les acyloxy-prégnénolones telles que l'acétate de prégnénolone, la 11-désoxy-corticostérone, les #
EMI3.3
-9.11 et -11.12-désoxy-corticostérones, la 11-désoxy-17-hydroxy-corticos- térone et ses dérivés acyloxyliques tels que son dérivé acétoxylique, la 21- hydroxy-prégnénolone et ses dérivés 21-acyloxyliques, par exemple 21-acétoxy- lique, la 17.21-dihydroxy-prégnénolone et les 17.21-diacyloxy par exemple
EMI3.4
17.21-diacétoxy-prégnénolones, l'androstène-dione, l'androstane-17-ol, les 9.11 et 11.12-déhydro-androstène-diones,
les 3-hydroxy- -9.11 et ±1 - 11.12-prégnène-20-ones, les 3.21-dihydroxy- A -9.-Il et -A -11.12-prégnéne- 20-ones, les 3.17.21-trihydroxy- ±-9.Il et d11.12-prégnêne-20-ones, la 5-androstène-3-ol-17-one, ses dérivés 3, acyloxyliques par exemple 3-acétoxy- lique, la 5-androstène-3-ol-17-one, ses dérivés 3-acyloxyliques9 par exemple 3-acétoxylique, l'ergostérol, le stigmastérol, le stigmastanol et leurs es- ters-3, par exemple leurs esters acétiques-3, l'ergosténone, la stigmasténo- ne, la stigmastanone, la cholesténone, l'acide cholique, l'acide désoxy-
EMI3.5
cholique, l'acide lithocholique, -1'acide cholanique, l'acide nor-cholanique, l'acide bisnor-cholanique, l'acide cholénique, l'acide nor-cholénique, l'a- cide bis-norcholénîque, les dérivés 3-hydroxyliques, 3-cétoniques, 3.
7-di-
<Desc/Clms Page number 4>
hydroxyliques, 3.7-dicétoniques, 3.7.12-trihydroxyliques et 3.7.12-tricéto- niques, les dérivés # -9.11 et # -11. 12, les esters, les'thiolesters, d'autres dérivés des acides précédents, etc...
Pour exécuter l'oxygénation biochimique par micro-organismes, on utilise un champignon oxydant qui est une espèce choisie dans un genre ap- partenant à une famille de l'ordre des Mucorales ou les enzymes oxydants qu'on peut obtenir à partir de ces champignons. Parmi les diverses familles de cet ordre, les genres de la famille des Mucoracées offrent le plus d'inté- rêt et, parmi ces genres, le Rhizopus et le Mucor se sont révélés de la plus grande valeur pour le procédé objet de l'invention.
Des espèces de ces gen- res qui sont actives ici comprennent, par exemple, les espèces microsporus, circinans, oligosporus, arrhizus, cohnii, oryzae et nigricans, en ce qui con- cerne le Rhizopus, ainsi que des espèces synonymes qui, en fait, sont iden- tiques aux précédentes tout en ayant reçu des noms différents; dans le gen- re Mucor, on peut citer, par exemple, les espèces mucedo, griseo, cyanus, hiemalis, hiemalis var. albus, rouxi, adventitius, cnristianiensis, circinel- loides, dubius, genevensis, javanicus, microsporus, parasitieus, etc...
Alors que des espèces appartenant aux genres des familles classées dans l'or- dre des micro-organismes généralement désignés sous le nom de Mucorales, sur- tout celles de la famille des Mucoracées, conviennent, dans l'ensemble, pour l'exécution du procédé objet de l'invention comme champignons oxydants, la préférence-est accordée, pour des raisons d'économie et de productivité, aux espèces du genre Rhizopus et, dans celui-ci, l'espèce arrhizus, souvent dé- signée ici par RH-176, est utilisée de préférence pour la production, avec les rendements les meilleurs, des stéroïdes désirés qui sont oxygénés en 11; néanmoins, dans certains cas et dans des circonstances particulières, on peut employer avec le plus d'avantages les autres genres et les autres es- pèces.
Cependant, les espèces des genres mentionnés font, en particulier, preuve d'une activité enzymatique exubérante, grâce à quoi elles sont en me- sure, dans le procédé objet de l'invention, quand elles ont été cultivées convenablement et mises en contact avec un 11-désoxy-stéroide, de provoquer l'oxygénation en 11 à une échelle importante du point de vue industriel.
Bien que, pour la production la plus abondante de stéroïdes oxy- génés en 11, la préférence soit accordée à des espèces choisies dans cer- tains genres des champignons considérés, le genre Rhizopus en particulier et le genre Mucor, tous deux de la famille des Mucoracées, et bien que des considérations économiques puissent même conduire à se limiter, dans la pra- tique, à certaines espèces et souches possédant une spécificité physiologi- que distinctive, des espèces appartenant à d'autres familles et genres de l'ordre des Mucorales conviennent aussi pour la transformation de 11-déso- xy-stéroïdes en stéroïdes oxygénés en 11 et cela en quantités significati- ves du point de vue de l'industrie.
Par exemple, d'autres genres représentatifs de la famille des Mu- coracées et des espèces également représentatives dans ces genres, comme on en relève dans l'ouvrage de H. Zycha "Kryptogamenflora der Mark Brandenburg", volume VIa, 1-264 (1934), comprennent les Parasitella (P. simplex), Zygor- hynchus (Z. heterogamus), Circinella (C.spinosa)., Actinomucor (A.repens), Pirella (P.circinans).. Absidia (A. reflexa), Spinellus (S. sphaerosporus), Phycomyces (Ph. Blakesleeanus), Sporidinia (Sp. grandis), Pilaira (P.anomala), Pilobolus (P. crystallinus) et Dococcum (D.asperum).
D'autres familles de Mu- corales avec leurs genres et leurs espèces représentatives comprennent les Thamnidiacées, Thamnidium (Th. elegans), Dicranophora (D.fulva), Chaetosty- lum (C. Fresenii), Helicostylum (H..piriforme) et Chaetocladium (Ch. Brefel- dii), les Choanéphoracées, Blakeslea (B. trispora), Choanephora (Ch. cucurbi- tarum), Rhopalomyces (Rh. elegans), Cunninghamella (C.elegans) et Thamnoco- phalis (Th. quadrupedata), les Cépalidacées, Piptocephalis (P.Preseniana), Syncephalis (S. reflexa), Spinalia (Sp. radians), Syncephalastrum (S. racemo- sum), Dispira (D.cornuta), Coomansia.(C. pectinata) et Kiokxella (K. alabas- trina), les Mortierellacées, Mortierella (M. pusilla), Haplosporangium (H. bisporale) et Dissophora (D.
decumbens) et les Endogonacées, Endogone (E.re- niformis), Sclerocystis S.coromiodes) et Glaziella (G. vesiculosa).
<Desc/Clms Page number 5>
Dans le genre Rhizopus, dont les espèces, comme on l'a dit plus haut, sont choisies de préférence pour l'exécution du procédé objet de loin- vention, beaucoup d'espèces communément connues sont synonymes, selon H. Zy- cha, "Krypt. der Mark Brandenburg", Volume VIa, 110-120 (1935). Ainsi, le Rhizopus microsporus peut être connu sous les noms de Rh. minimus Mucor spe- ciosus, Rh. speciosus et Rh. equinus, le Rhizopus circinans sous le nom de Rh. reflexus, le Rhizopus oligosporus sous les noms de Rh. Delmar ou Rh.
Tamari, le Rhizopus arrhizus sous les noms de Rh. nodosus, Rh. ramozus, Rh. maydis, Mucor arrhizus, Mucor Norvegicus, Rh. pusillus, Rh. bovinus, Rh. Cam- bodja, Rh. chinensis et Rh. tritici, le Rhizopus Cohnii sous le nom de Rh. suinus, le Rhizopus oryzae sous les noms de Rh. japonicus ou Rh. tonkinensis, le Rhizopus nigricans sous les noms de Mucor stolonifer, Rh. niger, Rh. arto- carpi, Mucor niger, Rh. nigricans var. minor ou Rh. nigricans var. luxurians; le Rhizopus echinatus est, en lui-même, une espèce douteuse qui peut être synonyme de Rh. nigricans.
On peut se procurer ces organismes fongiques à diverses sources, en particulier aux Northern Regional Research Laboratories Peoria, Illinois (E.U.A), à l'American Type Culture Collection, Washington, D.C. (E.U.A.) ou au Centraalbureau voor Schimmelcultuur Baarn (Hollande). On peut aussi exploi- ter des sources naturelles connues des biologistes.
Pour isoler les champignons de leurs sources naturelles, on appli- que la technique usuelle des microbiologistes. On prépare des milieux stéri- les à partir de diverses sources d'hydrates de carbone et d'azote et on les solidifie en un gel par addition de 2 % d'agar-agar. La source d'azote peut varier largement et elle peut comprendre, par exemple, des azotates minéraux, des sels d'ammonium ou des produits de digestion de protéines. Les milieux de culture peuvent être stérilisés par de la vapeur sous pression ou par passage à l'autoclave dans des flacons ou tubes bouchés par du coton puis être utilisés aseptiquement pour remplir des boites de Pétri. Dans celles- ci,on peut faire des cultures en strie avec des solutions de stérordes con- taminées par les champignons ou bien on peut les exposer à la poussière ou à l'air extérieur.
Sur ces plaques, il se développe des pousses de champi- gnons, parmi lesquelles des colonies de Muoorales, surtout les espèces Mu- cor et Rhizopus du genre des Mucoracées, peuvent être reconnues par un mi- crobiologiste exercé; on recueille ensuite les micro-organismes et on les repique soit sur le même milieu dans des tubes à essais, soit sur un autre milieu convenant à la prolifération des organismes fongiques. Une aération énergique conduit à une pousse abondante des organismes, quel que soit le milieu employé. Aux fins de mise en oeuvre de l'invention, la culture est transplantée soit de sa source naturelle soit de sa source industrielle sur certains milieux bactériologiques favorables au développement des champi- gnons.
Le milieu de Peterson et Murray pour champignons peut être utilisé à cet effet avec des résultats satisfaisants et, par la suite, dans la descrip- tion et les exemples, sauf mention contraire, le milieu de cultre est celui de Peterson et Murray qui contient, par litre d'eau du robinet, employée pour l'apport de traces d'éléments et de sels minéraux: 5 cm3 de liqueur de trempage de mais, 20 g de produit commercial de digestion de lactalbumine ("Edamine") et 50 mg de dextrose commercial ("Cerelose"). On règle d'ordi- naire le pH de ce milieu ou d'autres milieux utilisables à une valeur com- prise entre environ 5,5 et 5,9 avant l'ensemencement avec l'organisme fon- gique.
Un passage à l'autoclave, par exemple sous une pression de 6,7 kg par cm2 pendant 30 minutes, pour assurer l'aseptie, provoque un abaissement du pH d'environ 6,5 à environ 5,5 à 5,9 et il y a lieu de tenir compte de cette réduction de pH lorsqu'avant le passage à l'autoclave on règle le milieu en vue des conditions optima de croissance une fois ce traitement achevé. Au bout de 24 heures de culture des champignons sur ce milieu, on constate que le pH s'est abaissé notablement, d'ordinaire jusqu'à environ 3,5 à 4,2.
C'est aux environs de ce stade de la prolifération qu'il est préférable d'ajouter le stéroïde à oxyder ou de séparer de la culture la liqueur de fer- mentation fongique à utiliser pour l'oxydation enzymatique de stéroïdes.
Pour ensemencer le milieu servant de substratum de culture avec
<Desc/Clms Page number 6>
le champignon choisi dans l'ordre des Mucorales, on peut opérer de toute manière convenable comme en microbiologie. Par exemple, cet ensemencement s'effectue le plus commodément avec des spores de l'organisme mais un ense- mencement au moyen de mycélium végétatif est également efficace, On stimule facilement la prolifération du champignon en maintenant des températures d'incubation de l'ordre de celle du local, par exemple de 20 à 25 , mais une gamme relativement étendue de températures convient ; exemple, on a constaté qu'une gamme allant d'environ 15 à environ 45 était satisfaisan- te pour la croissance des organismes fongiques.
Il ne semble Das que la durée de prolifération requise avant l'ex- position du stéroïde à oxygéner à l'action des champignons ou à celle des enzymes fongiques soit un facteur décisif. Par exemple, on peut ajouter le stéroïde à oxygéner dans la position 11, soit au moment de l'ensemencement du milieu avec l'espèce de Mucorales choisie, soit ultérieurement, par exem- ple 24 heures après. En pratique, on a trouvé qu'il était possible d'ajou- ter le stéroïde à oxygéner au milieu de culture aussi tard que 5 jours après l'ensemencement avec l'espèce de Mucorales choisie, sans qu'on puisse déceler un retentissement sur l'effet engendré.
L'addition d'un 11-désoxy-stéroides à la liqueur en fermentation après une période de croissance de 16 à 24 heu- res est la manière d'opérer adoptée de préférence car, à ce stade de la pro- lifération,le mécanisme enzymatique oxydant parait s'être pleinement déve- loppé. De même, si l'on désire effectuer l'oxygénation en utilisant seule la liqueur de fermentation qui contient l'enzyme oxydant, c'est au moins après ce stade que l'on a coutume et qu'il est préférable de séparer cette liqueur.
La façon d'ajouter le stéroïde à oxygéner au champignon oxydant, au milieu fongique ou à la liqueur de fermentation ne semble pas non plus d'une importance décisive. On peut effectuer l'addition de toute manière con- venable favorisant un contact intime entre le stéroïde et le champignon et/ ou les enzymes, par exemple en effectuant une pousse de micro-organisme en présence de cristaux finement broyés du stéroïde ou en dispersant le stéroi- de dans toute l'étendue du milieu fongique ou en opérant d'une façon simi- laire. A cette fin,on peut, si on le désire, utiliser des agents tensio- actifs, des dispersifs ou des agents de suspension tels que les produits commerciaux dénommés Spans, Tweens, Aerosol, Nacconals etc...
Toutefois, on préfère ajouter le stéroïde au champignon, au milieu ou à la liqueur sous la forme d'une solution dans un solvant organique miscible à l'eau, par exem- ple une solution dans de l'acétone, des alcools ou même de l'éther qui n'est que peu miscible à l'eau, et ensuite mélanger parfaitement le milieu et le stéroïde afin de former une suspension ou dispersion de fines particules de stéroïde et de favoriser le contact le plus étendu entre le stéroïde à oxy- der et le champignon ou les enzymes fongigues oxydants. On peut, avec faci- lité, travailler en culture submergée ou en culture de surface, bien qu'il faille préférer la culture submergée.
A titre de variante, on peut séparer la liqueur de fermentation à la suite d'une pousse de champignon, la mélan- ger avec le stéroïde ou avec une solution de celui-ci et soumettre le tout à des conditions aérobies pour effectuer l'oxydation du stéroïde.
La température maintenue au cours de la période d'oxydation fon- gique du-stéroïde n'a pas besoin de différer de la température qui est ap- pliquée en l'absence de celui-ci; en d'autres termes, elle doit simplement être maintenue entre les limites qui correspondent à l'entretien en vie ou à l'état de prolifération active de l'organisme fongique. La température d'incubation au cours de l'oxydation du stéroïde peut être ainsi comprise, par exemple, entre environ 15 et environ 45 ; la température du local, par exemple 20 à 25 , est adoptée de préférence pour l'action optimum de l'or- ganisme fongique ou de ses enzymes.
Les conditions de pousse de l'organisme fongique sont des condi- tions aérobies et le degré de prolifération semble en relation avec l'in- tensité de l'aération. Par conséquent, alors que toute forme d'incubation aérobie est satisfaisante, une aération énergique, par exemple par agitation et/ou par insufflation d'air à travers le milieu'de culture, est appliquée
<Desc/Clms Page number 7>
d'ordinaire pour assurer la croissance optimum de l'organisme fongique, qui, à son tour, parait réduire le temps requis pour la transformation du déso- xy-stéroïde en stéroïde oxygéné en 11.
Le taux de transformation du désoxy- stéroïde en stéroïde oxygéné en 11 semble donc lié soit au taux d'aération soit au degré de croissance du champignon au moment de l'addition de sté- roide; on a constaté que les transformations utilisant soit le champignon, soit le milieu de fermentation seul, étaient plus rapides quand le degré d'aération était plus grand et aussi quand le champignon était laissé en pro- lifération de 16 à 24 heures avant l'addition du stéroïde à oxyder.
Cela in- diquerait que le mécanisme enzymatique oxydant s'est pleinement développé au bout de 16 à 24 heures de croissance et que l'aération ou bien stimule les transformations et leur vitesse par accroissement du taux de proliféra- tion de l'organisme fongique, avec augmentation correspondante du taux de développement du mécanisme enzymatique oxygénant, ou bien se borne à aider l'oxygénation par augmentation de la fourniture d'oxygène disponible.
L'ex- plication théorique qui précède doit être regardée comme simplement illustra- tive et comme n'imposant aucune limitation à l'invention car la culture en surface sans agitation ou sans autre moyen d'aération est opérante sans ap- port d'air additionnel et aussi le stéroïde peut être ajouté au milieu de culture au moment de l'ensemencement avec l'organisme fongique sans que le procédé cesse pour cela d'être opérant.
Le temps requis pour l'oxygénation biochimique du désoxy-stéroide par les organismes fongiques oxygérants ou par leurs enzymes oxygénants ne peut pas être fixé avec précision car divers facteurs doivent entrer en li- gne de compte. Des durées allant d'environ 1 heure à environ 72 heures se sont révélées satisfaisantes pour des transformations de désoxy-stéroide oxy- géné en 11 par l'action des champignons oxydants ou de leurs enzymes oxydants.
Cependant, des indications se présentent dans le sens suivant: l'oxygénation du stéroïde commence à peu près immédiatement dès la mise en contact avec la liqueur de fermentation d'un champignon oxydant ayant atteint la pleine croissance ou d'enzymes oxydants de ce champignon, une croissance étant re- gardée comme étant arrivée au stade en question en 4 à 24 heures; cette du- rée dépend, dans une certaine mesure, de l'ampleur de l'aération.
Quand on ajoute le stéroïde au milieu de fermentation en même temps qu'on ensemence celui-ci avec l'organisme fongique, de plus longues durées sont indiquées pour un coefficient élevé de transformation du désoxy-stéroide et, comme on l'a indiqué précédemment, on croit y voir pour motif le fait que le mécanis- me d'oxydation enzymatique n'est pleinement développé qu'après un certain temps de prolifération fongique. En conséquence, lorsqu'on ajoute la stéroî- de à l'époque de l'ensemencement du milieu, on applique d'ordinaire des du- rées de 8 à 72 heures, le temps variant en raison inverse du taux d'aération utilisé.
D'autre part,lorsque le stéroïde est ajouté au champignon, au mi- lieu fongique ou aux enzymes dans la liqueur de fermentation après une pous- se appréciable d'organismes fongiques, par exemple au bout de 16 à 24 heu- res sans aération notable ou de 2 à 4 heures avec aération énergique, la trans- formation du désoxy-stéroïde oxygéné en 11 commence immédiatement et l'on ob- tient des rendements élevés en des temps de 1 à 72 heures ou même en des temps plus courts ou plus longs, là encore suivant le degré d'aération ap- pliqué. On peut signaler qu'en exposant le désoxy-stéroide plus longtemps à l'action du champignon oxydant ou de ses enzymes, on obtient une transfor- mation un peu plus grande en dérivés poly-oxygénés mais, de toute façon, une oxydation du stéroïde se produit dans la position 11.
Après achèvement de la réaction d'oxygénation par fermentation, on retire le stéroïde oxygéné en 11 du mélange réactionnel en opérant de toute manière convenable. Un mode de récupération particulièrement avanta- geux comprend une extraction portant sur le mélange réactionnel, en parti- culier sur la liqueur de fermentation et les mycelia lorsque le stéroïde a été ajouté directement à la culture, cette extraction étant effectuée au moyen d'un solvant organique non miscible à l'eau tel qu'un hydrocarbure ha- logéné, par exemple du chlorure de méthylène, du chlorure d'éthylène ou du chloroforme, des éthers et des substances analogues.
On peut ensuite laver les extraits successivement avec du bicarbonate de sodium et de l'eau dis-
<Desc/Clms Page number 8>
tillée, les réunir, les amener à siccité avec un oourant d'air, dans le vi- de ou d'une façon semblable et reprendre les matières solides dans un solvant organique frais, par exemple du chlorure de méthylène ou les autres corps mentionnés précédemment, afin de les faire recristalliser ou de les purifier.
Si on le désire, on peut effectuer une recristallisation supplémentaire dans des solvants organiques, par exemple dans du méthanol. La matière cristalli- ne peut être identifiée par des procédés connus, par exemple par des analy- ses élémentaires et par recherche du point du fusion, comportement aux ra- yons infra-rouges, diffraction de rayons X, comportement en lumière ultra violette, micro-combustion et autres déterminations. A titre de variante, la matière cristalline ou les extraits de matière non cristalline, produits par l'oxydation biochimique, peuvent être identifiés ou caractérisés suivant le système de chromatogrammes sur papier de Zaffaroni, décrit en détail ci- après.
Une opération particulièrement utile dans la séparation des pro- duits d'oxydation engendrés selon la présente invention est la chromatogra- phie d'extraits ou de matières solides, celles-ci étant obtenues par l'éva- poration du solvant et par une cristallisation ultérieure si on le désire, sur une colonne d'alumine (Al2O3) ou d'un autre adsorbant, avec utilisation, par exemple, de benzène comme solvant et aussi de divers solvants et mélan- ges de solvants pour le développement de la colonne comme il est indiqué dans les Tables de Chromatographie des Exemples. Ce moyen est spécialement utile pour identifier les composés produits par l'oxygénation car chaque frac- tion issue de la colonne peut être soumise, si on le désire, à un essai par le procédé de Zaffaroni.
Une quantité aussi faible que 10 à 40 microgrammes de la matière peut être essayée par le système de chromatogramme sur papier de Zaffaroni; on peut identifier les individus chimiques, combiner les frac- tions qui les contiennent et faire cristalliser le composé à partir des fractions combinées.
La technique de Zaffaroni, mentionnée dans tout le mémoire notam- ment les exemples, est un procédé relativement nouveau mais déjà bien implan- té pour l'identification de certains composés organiques, en l'espèce les composés apparentés aux hormones cortico-surrénales, ce procédé étant fondé, pour partie, sur la polarité du composé essayé. Des références bibliogra- phiques à ce procédé d'analyse sont les suivantes: Burton, Zaffaroni et Keutmann" A new analytical method for adrenal cortical hormones", Science, 110, 442 (1949) et Zaffaroni, Burton et Keutmann, Science, 111, 6 (1950).
Etant donné que la polarité des composés organiques varie avec les change- ments dans la molécule, y compris la présence ou l'absence de certains grou- pements (chacun de ceux-ci introduisant une certaine influence définie sur la polarité de la molécule considérée globalement) et y compris les change- ments de position d'un groupement donné dans une molécule donnée, il est possible, par la technique de Zaffaroni, d'identifier à coup sûr de mini- mes quantités d'un composé organique de la série des stéroïdes du cortex surrénal ou de stéroïdes apparentés, grâce à leur polarité.
Le fait que des composés différents font preuve de polarités différentes est connu depuis longtemps mais la technique de Zaffaroni est, à l'heure actuelle, le seul procédé pratique mettant à profit des différences de polarité pour l'iden- tification de stéroïdes-en quantités minimes. Ce procédé, cité dans toute la description et ses exemples, a été un auxiliaire extrêmement précieux dans l'étude de l'oxydation de stéroïdes, par la voie biochimique avec emploi d'organismes fongiques oxydants ou de leurs enzymes oxydants, ainsi que dans l'identification de divers stéroïdes oxygénés inconnus jusqu'ici, de même que de stéroïdes oxygénés connus.
Le procédé de Zaffaroni et autres est un genre de chromatographie connue sur bande de papier et il emploie les mêmes principes que la chroma- tographie ordinaire avec colonne d'alumine ou autre.
Ce procédé est, dans son essence, le suivante
En premier lieu, on plie à environ 7,5 cm d'une extrémité un pa- pier filtre de qualité convenable ayant environ 7,5 à 10 cm de largeur et approximativement 55 cm de longueur. A environ 3,7 cm au-dessous du pli,
<Desc/Clms Page number 9>
on tire une ligne en travers du papier, pour marquer le point d'application du stéroïde sur ce papier. On découpe alors le papier dans le sens longitu- dinal en bandes d'environ 1 cm de largeur en commençant par le bout opposé à celui auquel doit être appliqué le stéroïde à essayer. On obtient ainsi plusieurs rubans ou lanières restant attachés à une queue commune. Chacun de ces rubans donne une piste distincte pour chaque tache du composé essayé, comme on le verra mieux par ce qui suit.
Au lieu de procéder ainsi, on peut également s'abstenir de diviser le papier en pistes distinctes et n'en uti- liser qu'une. Dans ce dernier cas, néanmoins, il faut veiller à ne pas pla- cer les divers composés à essayer trop près les uns des autres, par exemple à moins d'environ 2,5 cm sur la bande unique.
On choisit ensuite un système de solvants composé d'un solvant non polaire pour la phase mobile et d'un solvant polaire pour la phase fi- xe. Le benzène (non polaire) et la formiamide (polaire) constituent un sys- tème de solvants, le toluène (non polaire) et le propylène-glycol (polaire) un autre; les deux ont été employés avec succès mais, à certaines fins, le système comprenant de l'éther mono-éthylique du diéthylène-glycol (Carbitol) comme phase polaire fixe et du méthyl-cyclohexane comme phase non polaire mobile s'est révélé tout à fait satisfaisant.
On sature ensuite le papier filtre du solvant polaire, par exem- ple de propylène-glycol et l'on en élimine tout l'excès qu'il peut y avoir au moyen d'autres morceaux de papier filtre, d'une raclette, d'une essoreu- se à linge ou de tout autre dispositif convenable. On sature ensuite le sol- vant non polaire de la phase mobile (également dénommé solvant de dévelop- pement), dans ce cas du toluène, avec le solvant polaire et les divers élé- ments sont prêts pour être réunis.
Un bac de pile d'une dimension convenable, par exemple de 30 cm sur 45 cm, contenant 100 cm3 du solvant non polaire est tapissé d'une gran- de feuille de papier filtre trempée dans le solvant de la phase fixe à uti- liser, par exemple du propylène-glycol. Un support annulaire placé à l'in- térieur de la chambre soutient une cuvette à instruments contenant 350 cm3 du solvant de la phase mobile ou solvant de développement, par exemple du to- luène, qui, comme on l'a indiqué précédemment, est saturé du solvant de la phase fixe, par exemple de propylène-glycol. On introduit le pli de courte longueur ou queue du papier dans la réserve du solvant de développement, par exemple le toluène (solvant non polaire de la phase mobile), qui a été sa- turé de propylène-glycol.
Le stéroïde à essayer, placé dans du méthanol ou du chloroforme, est mis au point d'application, situé à environ 3,7 cm au-dessous du pli, au moyen d'une micropipette, en une quantité d'environ 10 à 300 microgram- mes, après découpage de la bande et saturation de celle-ci avec la phase fixe, par exemple du propylène-glycol, mais avant l'introduction de la queue dans la réserve de solvant de développement. On ferme ensuite la chambre avec le couvercle de verre et on scelle avec une colle d'amidon et de glycé- rine que l'on a préparée en chauffant 9 g d'amidon soluble et 30 g de glycé- rine à 1400 jusqu'à consistance claire.
Le liquide de la phase mobile s'écoule alors par adsorption sur le papier filtre suspendu vers le bas et provoque ainsi le développement des bandes. Ce développement est effectué en 4 à 72 heures ou plus, suivant le système de solvants et le stéroïde particulier en jeu. Après le développe- ment approprié, qui est déterminé par les mobilités des composés, on sèche les bandes de papier à la température du local au moyen d'un ventilateur puis on les traite avec 10 cm3 d'une solution décinormale d'azotate d'argent (Ag-N03) à laquelle ont été ajoutés 10 gouttes d'ammoniaque concentrée et 5 cm3 de soude caustique à 5 %. La plage de la bande de papier qui contient le stéroïde se développe en donnant une couleur brune à noire.
Un lavage du papier avec une solution de thiosulfate de sodium (Na2S203) à 10 % met fin à l'action de l'azotate d'argent et dissout l'oxyde d'argent (Ag20), ce qui se traduit par un contraste de couleurs franc entre la tache de stéroïde et le fond de papier. Le développement à l'azotate d'argent est applicable à
<Desc/Clms Page number 10>
l'identification de stéroïdes contenant des groupes réducteurs tels que la chaîne latérale de cétol, comme il en figure dans les hormones cortico-sur- rénales. A titre de variante, on peut rendre visibles certaines des taches du stéroïde en mettant à profit leur aptitude à absorber la lumière ultra- violette, suivant les indications de Haines et Drake, Fed. Proc. Soc Biol Chem. p9, 180 (mars 1950).
Ce développement est applicable dans le cas de stéroïdes à doubles liaisons conjuguées, par exemple la progestérone.
On constate que la tache de stéroïde, figurant à l'origine au point d'application, s'est déplacée, avec la phase mobile, d'une distance qui est inversement proportionnelle à son attraction vers la phase fixe et qui dépend aussi de son coefficient de répartition entre les deux solvants ainsi que du coefficient adsorption-élution existant entre le papier filtre et le système de solvants. L'affinité pour la phase fixe, par exemple pour le propylène-glycol, est d'autant plus grande, en ce qui concerne les compo- sés de stéroïdes, que le nombre d'hydroxyles dans ceux-ci est plus élevé et, par conséquent, ces composés s'éloignent du point d'application plus lente- ment que les stéroïdes à moindre nombre d'hydroxyles.
La désoxy-corti-costé- rone à trois atomes d'oxygène se déplace le plus vite parmi les cortico- stéroïdes connus, tandis que les cortico-stéroides à 4 atomes d'oxygène se meuvent plus lentement et que ceux qui en ont 5 se déplacent le moins vite.
Le tableau 1, donné ci-après, indique la répartition de certains des corti-
EMI10.1
co-stéroides connus suivant le nombre d'atomes d'oxygène et leurs mobilités ; T A B L E A U 1
EMI10.2
<tb> Désignation
<tb>
<tb> O2 <SEP> Progestérone
<tb>
<tb> 03 <SEP> 11-désoxy-corticostérone
<tb>
EMI10.3
17-hydroxy-progestérone 04 11-déhydro-corticostérone
EMI10.4
<tb> 17-hydroxy-11-désoxy-
<tb>
<tb>
<tb> corticostérone <SEP> (S)
<tb>
<tb> Corticostérone
<tb>
EMI10.5
05 i7-hydroxy 11-d.éhydxo-
EMI10.6
<tb> corticostérone <SEP> (E)
<tb>
<tb> 17-hydroxy-corticostérone <SEP> (F).
<tb>
Une comparaison de certains des systèmes de solvants dans leur rapport avec l'identification de certains des composés de stéroides types comportant des nombres variés d'atomes d'oxygène est donnée dans le tableau 2 ; on y verra que le système comprenant l'éther mono-éthylique du diéthylène- glycol comme phase fixe et le méthyl-cyclohexane comme phase mobile se prête à la différenciation et à l'identification des stéroïdes moins polaires que la corticostérone donc à déplacement plus rapide alors que le système pro- pylène-glycol-toluène est moins efficace à cet égard.
<Desc/Clms Page number 11>
T A B L E A U 2 Mobilités relatives de divers stéroides dans les études par chromatogram- mes sur papier.
Ordre de mobilité décroissant
EMI11.1
(Ordre de mobilité HO 'j esters> cétones quelle que soit leur position dans n'importe quels composés).
EMI11.2
<tb>
Système <SEP> Système
<tb> propylène-glycol-toluène <SEP> carbitol-méthyl-cyclohexane
<tb>
<tb>
<tb> Progestérone
<tb> androstène-dione
<tb> Testostérone
<tb>
EMI11.3
ll-désoxy-corticostérone 11-désoiW-corticostérone 17 "dydroxy-progestérone 17-hydroxy-progestérone 11 (00-hydroxy-progestérone (U-III) 20(C).21-dih,ydroxy-/-prégnéne- 3-one 3± Corticostérone 20.2l-dihydroXY-4-prégnène- 3-one 17-hydroxy-11-désoxycorticostêrone (S) 11 (0)-hydroxy-progestérone (U-III) 20(},21-dihydro-4-prêgnène-3-one 17-hydroxy-11-désoxycortiaosté- rone (S) m 20V9).21-dihydroxy-4-prégnène-3-one 17-hydroxy-11-déhydro-corticostérone (E) Dihydroxy-progestérone (U-I) 17-hydroxy-corti-costérone (F)
EMI11.4
<tb> (les <SEP> stéroïdes <SEP> se <SEP> meuvent <SEP> plus <SEP> (les <SEP> stéroïdes <SEP> se <SEP> meuvent <SEP> plus
<tb>
<tb> vite <SEP> vers <SEP> le <SEP> haut <SEP> de <SEP> ce <SEP> tableau) <SEP> vite <SEP> que <SEP> dans <SEP> la <SEP> colonne <SEP> de
<tb>
<tb> gauche <SEP> et <SEP> les <SEP> mobilités <SEP> crois-
<tb>
<tb> sent <SEP> vers <SEP> le <SEP> haut <SEP> du <SEP> tableau)
<tb>
<tb> x <SEP> ne <SEP> se <SEP> distingue <SEP> pas <SEP> dans <SEP> ce <SEP> système <SEP> x <SEP> se <SEP> distingue <SEP> dans <SEP> ce <SEP> système.
<tb>
On se référera maintenant aux dessins annexés, qui sont des re- productions photographiques de certains résultats analytiques obtenus con- formément au procédé objet de l'invention ou intéressant l'invention.
La figure 1 est une photographie comparative de modèles d'analyse en infra-rouge de 11-cétoprogestérone authentique et du compose U-VI, iden- tifié par la désignation 319 DHP 108. Une référence à cette figure se trou- ve dans l'exemple 1.
La figure 2 est une photographie comparative de modèles de dif-
EMI11.5
fraction des rayons X par de la 11-cétôprogeatérone authentique et par le composé U-VI, identifié par la désignation 319 DHP 108,2. Une référence à cette figure se trouve dans l'exemple 1.
La figure-3 est une photographie comparative de modèles d'analyse en infra-rouge des divers composés stéroïdes mentionnés dans l'exemple 1.
<Desc/Clms Page number 12>
La figure 4 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de 11-cétoprogestérone et du produit d'oxydation par Cr203 de U- III, produit désigné par U-VI, la photographie montrant leur identité.
Les figures 5 et 6 sont des photographies de chromatogrammes sur bandes de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-17-hydroxy- corticostérone (composé S). Ces chromatogrammes sont désignés par 349 SHE 32 dans les exemples E et 14 (2).
Les figures 7 à 9 sont des photographies de chromatogrammes sur bandes de papier de produits de bio-oxydation de la 17 ( )-hydroxy-proges- térone; ils sont désignés par 349 SHE 36,37 et 38 dans les exemples 5 et 14 (1).
La figure 10 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la projestérone; ils sont désignés par 349 SHE 40 P4 dans l'exemple 7.
La figurell est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone ; sont désignés par 363 MIU 21 dans l'exemple 8.
La figure 12 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone; ils sont désignés par 349 SHE 44 P dans l'exemple 10.
Cette figure 12, de plus, est une photographie d'un chromatogram- me sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone; ils sont désignés par 349 SHE 44 P2 dans l'exemple 11.
La figure 13 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-corticostérone; ils sont désignés par 363 MIU 22 dans l'exemple 12.
La figure 14 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 17 ( )-hydroxy-progestérone; ils sont désignés par 349 SHE 22 dans l'exemple 14 (3).
La figure 15 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de l'acétate de 11-désoxy-17-hydroxy- corticostérone (acétate du composé S); ils sont désignés par 349 SHE 31 dans l'exemple 14 (5).
La figure 16 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de l'acétate de 11-désoxy-corticosté- rone et de la ll-désoxy-corticostérone; ils sont désignés par 349 SHE 21 dans l'exemple 14 (7) et l'exemple 14 (8).
La figure 17 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-17-hydroxy-corti- costérone (composé S); ils sont désignés par 349 SHE 25 dans l'exemple 14 (9).
La figure 18 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-17-hydroxy-corticos- térone (composé S) et de l'acétate de ce corps (acétate de S); ils sont dé- signés par 349 SHE 26 dans l'exemple 14 (10) et l'exemple 14 (11).
La figure 19 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-17-hydroxy-corticos- térone ( composés) ;ils sont désignés par 349 SHE 48 dans l'exemple 14 (12).
Les figures 20 et 21 sont des photographies de chromatogrammes sur bande de papier de produits de bio-oxydation de l'androstène-dione; ils sont désignés par 349 SHE 70-3 dans l'exemple 15 (1).
La figure 22 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la cholesténone; ils sont désignés par 349 SHE 70-2 dans l'exemple 15 (2).
<Desc/Clms Page number 13>
La figure 23 est une photographie d'un'chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de l'ergostérone; ils sont désignés par 349 SHE 70-1 dans l'exemple 15 (3).
La figure 24 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de l'ergostérol; ils sont désignés par 349 SHE 70-4 dans l'exemple 15 (4).
La figure 25 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone; ils sont dési- gnés par 349 SHE 53 dans l'exemple 16.
La figure 26 est une photographie d'un chromatogramme sur ban- de de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone ; sont dé- signés par 349 SHE 47 dans les exemples 17 (1), 17 (4) et 17 (5).
La figure 27 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone; ils sont désignés par 349 SHE 40 dans les exemples 17 (2), 17 (3) et 17 (6).
La figure 28 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone ; sont désignés par 349 SHE 47 dans les exemples 17 (7) et 17 (8).
La figure 29 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone; ils sont désignés par 349 SHE 47 dans les exemples 17 (9), 17 (10) et 17 (14).
La figure 30 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone ; sont désignés par 349 SHE 40 dans les exemples 17 (11) et 17 (12).
La figure 31 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone ; ils sont désignés par 349 SHE 50 dans les exemples 17 (13), 17 (15) et 17 (16).
Les figures 32, 33 et 34 sont des photographies de chromatogram- mes sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11-désoxy-corti- costérone ; ils sont désignés par 349 SHE 50 dans les exemples 17 (17), 17 (18) et 17 (19).
La figure 35 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la progestérone par du filtrat de liqueur de fermentation; ils sont désignés par 349 SHE 41 dans l'exemple 18.
La figure 36 est une photographie d'un chromatogramme sur bande de papier de produits de bio-oxydation de la 11 ([alpha])-hydroxy-progestérone (U-III); ils sont désignés par 349 SHE 72 dans l'exemple 19.
Les facteurs entrant en jeu dans la technique de Zaffaroni et autres sont essentiellement les suivants: (a) L'affinité des composés stéroïdes de polarités différentes pour le plus polaire de deux solvants. Ainsi les composés les plus polaires tels que ceux qui comportent un ou plusieurs hydroxyles ont une plus grande attraction pour le solvant polaire que les composés qui le sont le moins, par exemple.les composés dépourvus d'hydroxyles, qui, pour partie, déter- minent la phase dans laquelle se trouvera le stéroïde et à quelle rapidité la tache se déplacera.
(b) Le coefficient de répartition du stéroïde soumis aux essais entre deux solvants non miscibles qui détermineront, dans une certaine me- sure, la phase où se trouvera le stéroide, par exemple parmi les deux phases engendrées par le mélange de deux solvants non miscibles, et la rapidité à laquelle la tache se déplacera.
(c) Le coefficient d'absorption-élution du stéroïde en cours d'essai qui est placé dans une bande de papier filtre préalablement traitée et est mis en contact avec un mélange de deux solvants non miscibles, ceux-
<Desc/Clms Page number 14>
ci, là encore, déterminant, dans une certaine mesure, la phase dans laquel- le le stéroïde se trouvera et la rapidité à laquelle la tache se déplacera.
La combinaison de ces trois facteurs détermine le point de la bande de papier qui sera atteint par la tache de stéroïde, par rapport à une tache d'un composé connu. Dès lors, le temps accordé pour le développe- ment de la bande au moyen de la phase mobile est sans importance car c'est la position relative de la tache par rapport à un témoin connu qui identi- fie le composé essayé suivant ce procédé. On s'en rendra compte aisément en examinant avec soin les photographies de chromatogrammes sur papier qui ac- compagnent les exemples donnés ci-après et y sont identifiées.
Il faut com- prendre que chaque tache sur le chromatogramme identifie un composé de sté- roide individuel, les composés moins polaires, qui se déplacent le plus vi- te, atteignant une position plus éloignée de l'origine que les stéroïdes plus polaires, plus riches en oxygène, qui sont essayés dans la même expé- rience. Non seulement peut-on ainsi identifier qualitativement le composé de stéroïde essayé mais l'on peut en outre, par comparaison avec un témoin approprié, en quantité connue, déterminer la quantité approximative de ce composé particulier.
Il est possible, par conséquent, de déterminer la trans- formation approximative, par bio-oxydation, d'un stéroide de départ en di- vers dérivés plus riches en oxygène puisque, connaissant la quantité de sté- roide appliqué initialement sur la bande, il suffit d'une observation du nombre des taches de différents composés stérol:des plus riches en oxygène et d'une comparaison de la brillance ou de la densité relatives pour arri- ver à une estimation approchée de la transformation et du rendement en un produit particulier de transformation du stéroïde par bio-oxydation ou au- trement.
Les exemples suivants, non limitatifs, feront bien comprendre la manière d'exécuter l'invention.
EXEMPLE 1-.
Oxydation de la progestérone (266 HCM 179, 319 DHP 95-108).
A 4 litres d'une pousse de 32 à 48 heures de .culture de RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus), on ajoute 1 g de progestérone dans 50 cm3 d'acétone, ce qui donne une suspension du stéroïde dans l'eau de la culture.
On faitensuite incuber la culture pendant 48 heures à la température du lo- cal. Au bout de ce temps, le pH de la culture est de 3,5; on soumet la li- queur de fermentation et le mycélium à des extractions, successivement avec 3 portions d'un litre, une portion de 2 litres et une portion d'un litre de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on lave le tout avec deux portions, de 400 cm3 chacune, d'une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium et 3 portions, de 500 cm3 chacune, d'eau distillée. On évapore l'extrait à siccité dans le vide et l'on reprend le résidu solide dans 50 cm3 de chlorure de méthylène. On met la solution dans un bécher de 100 cm3 et on l'évapore avec un courant d'air: On dissout les matières solides, pesant 1,585 g, dans 5 cm3 de méthanol chaud et on laisse refroidir lentement à la température du local.
Il se sépare 75 mg de cristaux, fondant à 245-249 .
Ces cristaux seront désignés par U-1.
On dissout les cristaux dans 5 cm3 de méthanol et on introduit la solution, en filtrant, dans un tube de centrifugation, la solution donnant, au refroidissement, 23 mg de cristaux U-I qui fondent à 246-248 . Lorsqu'on applique le procédé de chromatographie sur papier de Zaffaroni, comme il a été décrit ci-dessus, en utilisant de l'éther mono-éthylique du diéthylène- glycol comme phase fixe et du méthyl-cyclohexane comme phase mobile, ces cristaux donnent une tache unique, qui est celle d'un composé plus polaire que la progestérone. Des micro-combustionsrévèlent l'addition de deux atomes d'oxygène à la molécule de progestérone, comme on le voit ci-dessous.
EMI14.1
<tb>
Calc. <SEP> pour <SEP> la <SEP> progestérone <SEP> C <SEP> 80,23 <SEP> H <SEP> 9,55
<tb>
<tb> Il <SEP> Il <SEP> " <SEP> dihydroxy-progestérone <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,7
<tb>
<tb> Trouvé <SEP> pour <SEP> U-I <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,6
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
Le composé U-I, lors de l'analyse en rayons infra-rouge, se ré- vèle comme ayant plus d'un hydroxyle mais, autrement, comme ayant conservé le groupe basique cétonique en 3, la double liaison en 4 et le groupe céto- nique en 20 de la progestérone.
L'acétylation du composé U-I, avec 0,3 cm3de pyridine et 0,3 cm3 d'anhydride acétique pour 9,0 mg de U-I, puis un repos du mélange à la tem- pérature du local pendant 16 heures, l'addition de 12,5 cm3 d'eau et, après une heure à la température du local, un refroidissement pour l'obtention de cristaux conduisent à 6,7 mg de di-acétate cristallin (U-II) fondant à 154- 155 . Des études de ce composé en infra-rouge révèlent.': l'absence du grou- pe hydroxylique et la présence de groupes acétoxyliques nouveaux.
Par aération, on débarrasse de solvant les'liqueurs mères du pre- mier composé cristallin U-I, qui pèsent 1,5 g ; les dissout dans 50 cm3 de benzène et on les soumet à une chromatographie sur de l'alumine (A1203) comme l'indique le tableau 3. On utilise comme adsorbant 50 g d'alumine la- vée à l'acide et séchéeà 45 et on emploie des portions de solvants de 100 cm3 pour développer la colonne (tableau 3). En prenant pour base les étu- des de chromatogrammes sur papier de Zaffaroni, on constate que la fraction A ne comporte qu'une tache et se révèle plus polaire que la progestérone mais moins qu'un second composé U-I, décrit ci-dessus et se présentant dans des fractions 21-33.
TABLEAU 3.
----------------
Chromatographie sur Al2O3de progestérone transformée par voie biologique.
Utilisation du micro-organisme RH 176 (Rhizopus arrhizus)
EMI15.1
<tb> Fraction <SEP> N <SEP> Solvant <SEP> Poids <SEP> du <SEP> résidu <SEP> Etudes <SEP> de <SEP> chro-
<tb>
<tb>
<tb> en <SEP> mg <SEP> matogrammes <SEP> sur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> papier
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> benzène <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> " <SEP> 182,2 <SEP> pas <SEP> de <SEP> taches
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> benzène <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> éther <SEP> 123,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> benzène <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> éther <SEP> 246,6 <SEP> pas <SEP> de <SEP> taches
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> " <SEP> 10 <SEP> % <SEP> " <SEP> 162,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 18,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> Il,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> " <SEP> 50 <SEP> % <SEP> " <SEP> 128,
2 <SEP> pas <SEP> de <SEP> taches
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> " <SEP> " <SEP> 33,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> éther <SEP> 16,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11 <SEP> éther <SEP> 15,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> " <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> CHC13 <SEP> 3,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 2,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14 <SEP> " <SEP> 10 <SEP> % <SEP> " <SEP> 3,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 3,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16 <SEP> " <SEP> 50 <SEP> % <SEP> " <SEP> 3,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 2,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 18 <SEP> CHC13 <SEP> 2,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> CHC13 <SEP> 222,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> " <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> acétone <SEP> 222,
6 <SEP> fine <SEP> seule <SEP> tache
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> plus <SEP> polaire <SEP> que
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> " <SEP> " <SEP> 23,5 <SEP> la <SEP> progestérone.
<tb>
<tb>
<tb>
Mélange <SEP> de <SEP> deux
<tb>
<tb>
<tb> taches, <SEP> une <SEP> si-
<tb>
<tb>
<tb> milaire <SEP> à <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> fraction <SEP> 20,1'au-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tre <SEP> plus <SEP> polaire
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> que <SEP> la <SEP> fraction <SEP> 20.
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
T A B L E A U 3 (suite).
EMI16.1
<tb> Fraction <SEP> N <SEP> Solvant <SEP> Poids <SEP> du <SEP> résidu <SEP> Etudes <SEP> de <SEP> chro-
<tb>
<tb> en <SEP> mg. <SEP> matogrammes
<tb> sur <SEP> papier
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 22 <SEP> CHG13 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> % <SEP> acétone <SEP> 17,3
<tb>
EMI16.2
23 Il if ¯ Il 8,7
EMI16.3
<tb> 24 <SEP> " <SEP> 50 <SEP> % <SEP> " <SEP> 30,9 <SEP> Seulement <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> tache <SEP> à <SEP> dépla-
<tb>
<tb>
<tb> cement <SEP> le <SEP> plus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lento
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> CHC13 <SEP> + <SEP> 50 <SEP> % <SEP> acétone <SEP> 6,1 <SEP> lent.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
26 <SEP> acétone <SEP> 13,0 <SEP> Seulement <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> tache.à <SEP> dépla-
<tb>
<tb>
<tb> cement <SEP> le <SEP> plus
<tb>
<tb>
<tb> lent.
<tb>
<tb>
<tb>
27 <SEP> " <SEP> 8,4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28 <SEP> acétone <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> CH30H <SEP> 25,0
<tb>
EMI16.4
29 if il 11 4,6
EMI16.5
<tb> 30 <SEP> n <SEP> + <SEP> 10 <SEP> % <SEP> " <SEP> 7,4
<tb>
EMI16.6
31 Il Il et 1,4
EMI16.7
<tb> 32 <SEP> " <SEP> + <SEP> 50 <SEP> % <SEP> " <SEP> 8,1
<tb> 33 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
On dissout la fraction A dans 2 cm3 de méthanol chaud et l'on fil- tre. Après réfrigération pendant toute la nuit, on recueille 171 mg de cris- taux d'un composé désigné par U-III et fondant à 166-167 . Une recristallisa- tion dans 3 cm3 de méthanol donne 98,7 mg de U-III fondant à 166-167 et pré- sentant un pouvoir rotatoire [[alpha]] 20/D = + 175 .(C = 1,0127 dans du chlorofor- me).
Des micro-combustions indiquent l'addition d'un atome d'oxygène à la progestérone
Analyse : Cale. pour la monohydroxy- progestérone C 76,4 H 9,10
Trouvé pour U-III C 76,66 H 8,92
Des études de U-III en infra-rouge décèlent la présence d'un hydro- xyle et de la molécule basique de la progestérone.
On établit que la position de l'hydroxyle dans U-III est la posi- tion 11 en oxydant 30 mg de U-III dans 0,5 cm3 d'acide acétique glacial au moyen d'un cm3 d'acide acétique glacial contenant 5 mgd'oxyde chromique et 5 mm3 d'eau et en laissant le mélange au repos à la température du local pendant 1 heure. On ajoute ensuite quelques gouttes de méthanol et, au bout de 10 mi- nutes, on dilue la solution avec de l'eau jusqu'à 45 cm3, on soumet la solu- tion à des extractions avec 3 portions de chlorure de méthylène de 15 cm3 chacune, puis l'on évapore le chlorure de méthylène.
On fait cristalliser le résidu dans 0,5 cm3 de méthanol, ce qui donne 19 mg d'une tricétone U-VI, présentant un point de fusion de 172-175 et un pouvoir rotatoire [[alpha]] 25/D = + 227 dans le chloroforme, la structure tricétonique étant indi- quée par les études en infra-rouge. D'autres études en infra-rouge montrent que le nouveau groupe cétonique ne peut être présent que dans les positions 1,7, 11 ou 12. On ne connaît aucun stéroïde naturel ou synthétique à groupe cétonique en 1. Les constantes physique de l'hydroxy-progestérone U-II ne
EMI16.8
concordent pas avec celles de la 12 (p )-hydroxy-progestérone:
<Desc/Clms Page number 17>
point de fusion 200-203 [[alpha]] 17/D = + 205 (C = 1,0 dans 1'acétone)
Wettstein, Helv. Chim.
Acta 31, .1963 (1945) ou avec celles de la 12 (ss )-hydroxy-progestérone: point de fusion 164=167 et, après refroidissement, nouveau point de fusion 195-198 ; [[alpha]] 15/D = + 205 (C = 0,502 dans l'acétone)
Reichstein, C.A. 36, 2261, (1942).
Il ne reste donc que les positions 7 et 11 pour le nouveau groupe cétonique du composé U-VI.
Une comparaison des constantes physiques indique que la tricétone (composé U-VI) est de la 11-céto-progestérone: point de fusion 172-175 [[alpha]] 25/D = + 238 + 8 (C = 0,9 dans l'acétone)
Reichstein, Helv. Chim. Acta 23, 684, (1940) et 26, 721, (1942).
Lorsqu'on le compare à de l'authentique 11-céto-progestérone par analyse à l'aide de rayons infra-rouge (fig. 1), par diffraction de rayons X (fig. 11), par chromatographie sur papier (technique de Zaffaroni) et par étude des points de fusion, le composé U-VI se révèle identique à elle (voir figure 4).
Les constantes physiques du composé U-III ne concordent pas avec celles de la 11( /3)-hydroxy-progestérone: point de fusion 187-188
17 [[alpha]] D = + 222 - 225 (C = 1,75 dans l'acétone)
Shoppee et Reichstein, C.A. 36, 2261, (1942).
En conséquence, puisque U-VI montre que l'oxygène introduit est fixé dans la position 11, UIII doit être la 11 ([alpha])-hydroxy-progestérone.
On acétyle 20 mg du composé U-III au moyen de 0,6 cm3 de pyridine et 0,6 cm3 d'anhydride acétique. Au bout de 16 heures à la température du local, on ajoute 25 cm3 d'eau. Une heure après, on soumet la préparation à une réfrigération pour provoquer une cristallisation. On lave à l'eau les cristaux qui se forment et on les sèche; on recueille 16,1 mg d'un mono- acétate U-V présentant un point de fusion de 175-177 . Une analyse par in- fra-rouge indique l'absence d'hydroxyle et la présence d'un groupe acétoxy- lique nouveau.
EMI17.1
<tb>
Micro-analyse <SEP> élémentaire <SEP> : <SEP> C <SEP> H
<tb>
<tb> Cala. <SEP> pour <SEP> la <SEP> mono-acétoxy- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> progestérone <SEP> 74,0 <SEP> 8,85
<tb>
<tb>
<tb> Trouvé <SEP> 74,33 <SEP> 8,78
<tb>
La figure 3 est une photographie donnant une comparaison des cour- bes en infra-rouge relatives à quelques uns des composés mentionnés ci-dessus.
<Desc/Clms Page number 18>
EXEMPLE 2:
Oxygénation de la progestérone (226 HCH 206 PB, 190 GBS 244).
A une pousse de 24 heures d'organisme RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus) dans 4,0 litres de milieu de culture, on ajoute 1 g de progesté- rone dans 50 cm3 d'acétone. Après avoir fait incuber et secoué en présence d'air pendant 24 heures, on soumet la liqueur de fermentation à des extrac- tions comme il est décrit dans l'exemple 1. On lave les extraits de chloru- re de méthylène, deux fois avec 300 cm3 d'une solution aqueuse à 2 % de bi- carbonate de sodium et deux fois avec 500 cm3 d'eau distillée, on réunit les extraits, on les sèche avec un minimum de sulfate de sodium anhydre et l'on utilise 6 cm3 de cette solution, ce qui correspond à 2 mg de la pro- gestérone primitive, pour des études de chromatogrammes sur papier de Zaffa- roni, en se servant des solvants employés selon l'exemple 1.
Ces études in- diquent une transformation importante en 11 ([alpha])-hydroxy-progestérone. On évapore à siccité, avec un courant d'air,l'extrait de chlorure de méthylène qui reste.On dissout les matières solides (1,584 g) dans 100 cm3 de benzène et, par filtration, on enlève 145 mg d'une fraction insoluble (190 GBS 244-2).
Le point du fusion de ce composé est'de 190-230 . On recueille au total,-sous la forme de cristaux, 90 mg de composé U-I, fondant à 230-240 , en dissolvant la fraction insoluble (145 mg) dans 20 cm3 d'acétone à chaud, en concentrant la solution jusqu'à 10 cm3 et en refroidissant. D'après un chromatogramme sur papier de Zaffaroni et d'après le point de fusion, les cristaux sont ceux du composé dihydroxylé, le composé U-I. On soumet le fil- trat, contenant 1,439 g de matières solides, à une chromatographie sur une colonne d'alumine A1203 (tableau IV) suivant la technique décrite dans l'exem- ple 1, en utilisant des portions de 100 cm3 de solvants pour développer la colonne.
Dans 20 cm3 de méthanol, on dissout la fraction B provenant de la séparation chromatographique (tableau IV) et contenant 571 mg de la 11 ([alpha] ) - hydroxy-progestérone (composé U-III), on ajoute 20 cm3 d'eau à la solution, on la chauffe, puis on la refroidit dans un réfrigérateur. On ajoute à nou- veau 20 cm3 d'eau et l'on poursuit le refroidissement. Une cristallisation se produit et l'on recueille 300 mg de cristaux secs de 11 ([alpha])-hydroxy- progestérone (composé U-III) fondant à 165-166 .
Un résumé d'un certain nombre de bio-oxydations est présenté dans le tableau V.
TABLEAU IV
Chromatographie sur Al2O3 de progestérone transformée biologiquement.
Utilisation de l'organisme RH 176 (Rhizopus arrhizus)
EMI18.1
<tb> Fraction <SEP> Poids <SEP> du <SEP> Etudes <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> n <SEP> Solvant <SEP> résidu <SEP> en <SEP> chromatogrammes <SEP> sur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mg <SEP> papier
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> benzène <SEP> 208
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> " <SEP> 12
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> " <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> éther <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> " <SEP> + <SEP> 10% <SEP> " <SEP> 37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> " <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> éther <SEP> 7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> éther <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> éther
<SEP> 16
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11 <SEP> " <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> CHCl3 <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13 <SEP> " <SEP> + <SEP> 10 <SEP> % <SEP> CHCl3 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
TABLEAU IV (suite)
EMI19.1
Fraction Poids du Etudes de n Solvant résidu en chromatogrammes sur mg papier 15 éther + 50 % CHC13 16 éther + 50 % CHC13 2 17 CHC13 11 18 cHcl3 265 19 CHC13 + 5 % acétone 235 Fraction B 20 Il " Il 6o Tache unique de 11 21 + 10 % bzz 16 (0()-hydroxy-proges- térone U-III, plus traces de trois autres constituants à mouve- ment plus lent.
22 CHC13 + 10 % acétone 22 Mélange de dihydroxy- progestérone U.D. et 23 " + 50 % " 27 de deux constituants plus polaires.
24 37 Même fraction que 22, mais moins' de deux des taches de 22 et plus d'une troisième et d'une quatrième.
25 acétone 29 26 Il 43 Composé moins polaire que pour les deux ta- 27 " + 5 % CH30H 16 ches de 22, mais plus polaire que la 11- (0() -hydroxy-proges- térone U-III.
28 acétone + 5 OH30H 24 29 1/ + 10 % fi 4 30 Il " 1/ 0 31 il + 50 % OH30H 1 32 Il CH30H 23 33 CH30H 9 TABLEAU 5
EMI19.2
<tb> Fermentation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Désignation <SEP> : <SEP> Progestérone <SEP> : <SEP> Volume <SEP> du <SEP> : <SEP> Durée <SEP> d'incu- <SEP> : <SEP> Progestérone
<tb>
<tb> : <SEP> ajoutée <SEP> : <SEP> milieu <SEP> en <SEP> : <SEP> bation <SEP> en <SEP> : <SEP> en <SEP> mg
<tb>
<tb> mg <SEP> litres <SEP> heures
<tb>
EMI19.3
266 HCM 179 : 1000 : , : l : 0
EMI19.4
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 195 <SEP> : <SEP> 1200 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 67 <SEP> : <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 206 <SEP> PA <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 24 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 206 <SEP> PB <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 212 <SEP> : <SEP> 3000 <SEP> :
<SEP> 10 <SEP> 24
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
TABLEAU 5 (suite)
EMI20.1
<tb> Fractions <SEP> récupérées <SEP> sur <SEP> colonne <SEP> Al2O3
<tb>
EMI20.2
Désignation : 11()--hydroxy- :Dihydroxy- : Autres pro- : Référence : progestérone PPogest]gne,-- jiuifs ,de, ,, g :> 1 ;
EMI20.3
<tb> : <SEP> U-III <SEP> en <SEP> mg <SEP> :U-I <SEP> en <SEP> mg <SEP> : <SEP> transforma- <SEP>
<tb> : <SEP> : <SEP> : <SEP> tion <SEP> :
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 179 <SEP> 391 <SEP> 142 <SEP> 18 <SEP> : <SEP> 319 <SEP> DHP <SEP> 95
<tb>
EMI20.4
266 HOM 195 507 2e2 95 2 299 BJM 195 266 HCM 206 PA 571 225 94 z 329 RBo 60 266 HCM 206 PB z.71 265 120 z 190 GBS 244
EMI20.5
<tb> 266 <SEP> HCM <SEP> 212 <SEP> 1520 <SEP> 1260 <SEP> 76 <SEP> : <SEP> 329 <SEP> RBO <SEP> 63
<tb>
EXEMPLE 3:
Oxydation de progestérone (266 HGM 218, 358 VRS 5).
On utilise 1 cm3 d'une suspension stérile, dans du sérum physiolo- gique, des spores (conidia) tirées d'un substratum solide à base d'Edamine et d'agar-agar malté, ayant un volume de 10 cm3 et agé de 5 jours ; s'en sert pour ensemencer 150 cm3 d'un milieu stérile composé de 2 % d'Edamine, 5 % de dextrose, 0,5 % de liqueur de trempage de mais et d'eau du robinet.
On agite cette culture de 150 cm3 et on l'aère tout en la secouant pendant 24 heures afin de provoquer une forte croissance végétative. On transvase 100 cm3 de cette culture dans 4 litres de milieu stérile que l'on aère et que l'on agite par secouage pendant 24 heures, on y ajoute ensuite 4 g de pro- gestérone dans 40 cm3 de méthanol et l'on poursuit l'aération. Au bout de 24 heures et 45 minutes, on retire le milieu de culture pour l'extraction au chlorure de méthylène comme il est décrit dans l'exemple 1; on utilise au total 4 litres de solvant. On effectue le traitement de la solution dans le chlorure de méthylène et on la concentre, ce qui donne 4,38 g de résidu.
On soumet celui-ci à une chromatographie comme il est décrit dans l'exemple 1, ce qui produit les fractions suivantes (358 VRS 5) s
EMI20.6
<tb> Fractions <SEP> Composition <SEP> Poids <SEP> (g)
<tb>
EMI20.7
Insoluble dans Dihydrozy-prôgesté- 0,635
EMI20.8
<tb> le <SEP> benzène <SEP> rone <SEP> (U-I)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14-16 <SEP> Progestérone <SEP> 0,694
<tb>
EMI20.9
20-22 11 ( ) -hY'ox3''-pro- 1,994
EMI20.10
<tb> gestérone <SEP> (U-III)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 23-25 <SEP> Queues <SEP> (composés <SEP> mono- <SEP> 0,437
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> dihydroxylés)
<tb>
EMI20.11
On dissout la fraction de 11 (o()-hydroxy-progestérone (U-III) dans 15 cm3 de méthanol chaud, on y ajoute 2 cm3 d'eau et l'on filtre la solution.
Après refroidissement pendant toute la nuit, on récupère 1,15 g d'un produit cristallin fondant à 163-166 . Le rendement en 11 ()-hydro- xy-progestérone (U-III) est de 29 % (279 BJM 205). On obtient en outre une petite récolte supplémentaire de cristaux.
EXEMPLE 4:
EMI20.12
Oxygénation en 11 de la 1l-désoxy-17-hydroxy-corticostérone (S).
Utilisant une pousse de 16 heures de culture de RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus), on fait incuber 1,0 g du composé S dans 50 cm3 de méthanol pendant 4 heures à la température du local (266 HCM 213) en présence d'air.
On soumet le milieu de fermentation, ayant un pH de 3,8, à des
<Desc/Clms Page number 21>
extractions avec une portion de 2 litres puis, successivement, avec trois portions d'un litre de chlorure de méthylène. On rassemble les extraits et on les lave deux fois, avec 500 cm3, à chaque fois, d'une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium. On lave ensuite deux fois les extraits com- binés, en opérant, à chaque fois, avec 500 cm3 d'eau distillée. On déshydra- te ensuite, avec un minimum de sulfate de sodium anhydre, les extraits com- binés et lavés, puis on les débarrasse de chlorure de méthylène par un cou- rant d'air. On soumet une petite portion du produit à des études, chromato- graphiques sur papier, avec ce résultat qu'une nouvelle tache à déplacement lent apparait avec une autre (349 SHE 32).
On dissout la totalité des matiè- res solides, soit 1,5286 g, dans du benzène et l'on effectue un chromatogra- phie sur de l'alumine comme il est indiqué dans le tableau VI. L'une des taches à déplacement lent se manifeste dans la fraction C du chromatogramme et on l'utilise pour la séparation par cristallisation, d'un constituant différant de la matière première, c'est-à-dire du composé S. On dissout la fraction C, qui pèse 376,5 mg, dans 2 cm3 de méthanol chaud et l'on filtre.
En utilisant un courant d'azote, on réduit le volume à 1,5 cm3, à la suite de quoi des cristaux se forment. Ils pèsent 152 mg et présentent un point de fusion de 198 à 210 . Une recristallisation dans 1 cm3 de méthanol chaud donne 35,6 mg de produit fondant à 223-226 . En faisant recristalliser ce produit, on obtient des cristaux purs, fondant à 222-225 (319 DHP 111). Ce composé est oxygéné dans la position 11 du noyau de stéroide.
C H Analyse : Calc. pour la 17-hydroxy- corticostérone 69,5 8,28 319 DHP 114,5 trouvé: 69,66 8,20
TABLEAU 6
Chromatographie sur Al2O3de 11-désoxy-17-hydroxy-corticostérone (S) transformée biologiquement au moyen de l'organisme RH 176 (sou- che de Rhizopus arrhizus)
EMI21.1
Fraction N Solvant Poids du Etudes de résidu (mg) chromatogram- mes sur papier 1 Benzène 21., 5 2 tt bzz 3 " + 5% éther éthylique 78,4 4 il 58,5 5 Benzène + 10% éther éthylique 12,0 il il Il 0,8 7 il it Il 23 8 Il + 50± rr Il 4 2 9 Il Il Il 5 6 10 Ether 'ï, 0 il '1 12 Ether + 5 % CHC13 21 Pas de taches 13 fi It 39,9 tt A 14 Il + 10% n 32,51 " " " 15.,7 15 "If" 15,7) Il 16 Ether + 50% CHC13 7,9
<Desc/Clms Page number 22>
TABLEAU 6 ( suite)
EMI22.1
Fraction N Solvant Poids du Etudes de résidu (mg)
chromatogrammes sur papier 17 Ether + 50 % CHC13 15,2 18 CHC13 ?6,2 Pas de taches 19 Il 53, 3 B u il 20 " + 5 % acétone 20,1 " " " 21 " + 5 % acétone z 22 11 + 10% n 3,6 23 " + 10% 1t 2,2 24 " + 50% " 7,5 25 il Il t1 9,0 26 Acétone 22,5 27 fi igel 28 " + 5 % méthanol 62,9 Tache à déplacement lent 29 11"" it ,3, 30 " + 10% fui 46,1 Tache à déplacement lent 31 "II tt Il 27,8 32 " + 50 % " 44,4 ,Tache à déplacement lent 33 n n il 14,1 EXEMPLE 5:
Oxygénation en 11 de la 17 (o()-hydroxy-progestérone.
Utilisant une pousse de 24 heures d'une culture de RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus), on fait incuber 1,0 g de 17 (o()-hydroxy-progestérone dans 50 cm3 de méthanol pendant 48 heures à la température du local en présen- ce d'air (266 HCM 214).
On soumet le milieu de fermentation, qui a un pH de 3,6, à des ex- tractions avec une portion de deux litres, de chlorure de. méthylène puis, suc- cessivement, avec 3 portions d'un litre du même solvant. On réunit les ex- traits et on les lave deux fois avec 500 cm3 d'une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium. On combine les extraits et on les lave deux fois, à chaque fois avec deux portions de 500 cm3 d'eau distillée. On déshydrate ensuite avec un minimum de sulfate de sodium anhydre les extraits réunis et lavés,puis on en chasse le chlorure de méthylène par distillation dans le vide. Une petite portion du produit donne trois taches différentes de celles de la 17(c)-hydroxy-progestérone lors d'une chromatographie sur bande de pa- pier (349 SHE 36-38).
On dissout la totalité des matières solides, soit 1,8849 g, dans du benzène et l'on effectue une chromatographie sur A1203 comme il est indi- qué dans le tableau 7. L'une des taches se manifeste dans la fraction B et l'on fait cristalliser les matières solides, soit 307 mg, dans 1 cm3 de mé- thanol chaud. Au refroidissement, on obtient 61 mg de cristaux fondant à 178-210 . Une recristallisation dans 0,5 cm3 de méthanol donne 25 mg de cristaux fondant à 219-222 . Une nouvelle recristallisation fournit des cristaux purs, fondant à 220-223 (319 DHP 111). Ce composé est oxygéné dans la position 11 du noyau de stéroïde.
EMI22.2
<tb>
C <SEP> H
<tb>
<tb> Analyse: <SEP> Cale. <SEP> pour <SEP> la <SEP> 11.17-
<tb>
<tb> dihydroxy-progestérone <SEP> 72,8 <SEP> 8,60
<tb>
<tb> 319 <SEP> DHP <SEP> 112,3 <SEP> - <SEP> Trouvé <SEP> : <SEP> 73,01" <SEP> 8, <SEP> 65 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 23>
TABLEAU 7 Chromatographie sur Al203 de 17 ([alpha])-hydroxy-progestérone transformée biologiquement au moyen de l'organisme RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus). '
EMI23.1
Fraction N Solvant Poids de résidu Etudes de chro- en mg matogrammes sur papier.
1 Benzène 357,8 Pas de tache 2 " 46 3 " + 5 $ d'éther 4 " + 5 % d'éther 14 5 " +10% 11 19 If u it i 7 If If If 12,2 S "+50% " 41,4 9 " n tt 5 $, 7 A 17(0() -hydroxy- progestérone 10 Ether 72,3 11 If n2 12 If + 5 % CHC13 z7, 9 13 n tt " 2S,2 14 Il + 10 % " 13,5 15 rr n " 10,5 16 If +50% " S,6 17 11 11 " 12, 18 CHCl3 54,2 19 " 144, il Une tache et une tra- 20 " + 5 % acétone 87,9 B ce de 17 (Dl) -hydroxy- 21 11 Il If 20, progestérone 22 If + 10% acétone 32, 23 11 If" tt 162 4 Il + 50% " 54, 0 25 If If" it 45,0 26 Acétone 126,1 27 " 61.,9 Comporte deux taches 28 " + 5 % méthanol 61,2 29 n tt If 27, S 30 " + 10 % méthanol il, 3 31 "" tt If 10,9 32 " + z " 25, .
33 If If " 6, ce EXEMPLE 6:
Oxygénation de la 11-désoxy-corticostérone
Utilisant une pousse de 64 heures d'une culture de RH 176 (sou- che de Rhizopus arrhizus), on fait incuber 1,0 g de 11-désoxy-corticosté- rone dans 4,0 litres de milieu à la température du local pendant 54 heu- res (266 HCH 186). On soumet la liqueur de fermentation et les mycelia à des extractions, successivement avec une portion de deux litres et trois portions de 1 litre de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les lave avec deux portions, de 500 cm3 chacune, d'une solution aqueuse à 2 % de carbonate de sodium et finalement avec deux portions, de 500 cm3 chacune, d'eau distillée. On concentre les extraits jusqu'à siccité au moyen d'un courant .d'air et l'on reprend le'résidu solide dans 50 cm3 de chlorure de méthylène.
On transvase la solution dans un bécher de 100 cm3 et on l'évapore à l'aide d'un courant d'air. On dissout dans du benzène les matières solides qui pèsent 1,4218 g et on les chromatographie sur de
<Desc/Clms Page number 24>
l'alumine (Al2O3) comme l'indique le tableau 7A. La fraction B accuse la formation de trois constituants à mouvement lent, une tache étant prédomi- nante.
Une portion de cette fraction fait preuve d'activité biologique; on y décèle une transformation d'approximativement 5 % exprimables en termes de corticostérone d'après le test du glycogène hépatique du rat selon Pabst et autres, Endocrinology 41, 55, (1947). On fait cristalliser le res- te, soit 200 mg, dans 1 cm3 de méthanol, ce qui donne 26 mg de cristaux fondant à 180-189 . En faisant recristalliser deux fois cette substance, on obtient 8 mg de cristaux fondant à 190-192 . Des études en infra-rouge indiquent l'addition d'un hydroxyle à la 11-désoxy-corticostérone sous l'ac- tion de l'organisme RH 176 (319 DHP 106, 326 MIU 61 et 78, 365 DAL 2,4).
La 11-désoxy-corticostérone a été oxygénée en 11 sous l'influence de l'or- ganisme RH 176.
TABLEAU 7A
Chromatographie sur Al2O3 de 11-désoxy-corticostérone transformée biolo- giquement sous l'effet de l'organisme RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus).
EMI24.1
Fraction ? Solvant Poids du résidu Etudes de chroma- en mg togrammes sur pa- pier.
1 Ether 230,3 2 " 155,0 3 15,8 4 " + 10 % CHC13 8,0 5 """ rr 2 9 5 u rt fi 1,5 7 + 50% 2,1 8 rr n 2,8 rt tr 3, 9 10 CHC13 '5t8 il 228, 6 12 114,2 13 + 5% acétone .4.2, 7 14 Il " 17,9 15 tr 14, 6 16 " +10%" 10,8 17 " 7,4 18 n n il 5,9J 19 " + 50% " 15, 20 " rt fi 8,7 21 tr il fi 24,5 22 Acétone 32,1 23 " 14,4 B Trois constituants à mouvement lent 24 9,9 25 " + 5% méthanol 34,0 26 " rr 22,3 27 ri " 13,8 28 Méthanol 73,8 29 25, 6 30 " 15, 6 EXEMPLE 7:
Oxygénation de la progestérone (266 HCM 199/150 T).
On ajoute 150 mg de progestérone dans environ 3 cm3 d'acétone à 150 cm3 du milieu décrit ci-dessus et contenant 60 mg de Tween 40 au moment de l'ensemencement par des spores de RH 176. En 72 heures, la
<Desc/Clms Page number 25>
transformation est achevée et il se produit une conversion à environ 30 % en 11 (o)-hydroxy-progestérone (composé U-III), ainsi qu'on le voit d'a- près un chromatogramme sur papier (349 40 P4) en utilisant du carbitol et du méthyl-cyclohexane comme système de solvant pour la recherche de la con- sommation de progestérone et du toluène associé à du propylène-glycol pour l'étude du degré et du type de la transformation.
EXEMPLE 8:
Oxygénation de la progestérone (266 HCM 199 OCI).
On fait incuber une pousse de RH 176 ayant subi 5 jours d'aéra- tion dans 150 cm3 de milieu, après l'addition de 150 mg de progestérone dans 3 cm3 d'acétone, la concentration étant d'un mg par cm3. Au bout de 32 heures, il ne reste pas de progestérone et la transformation en compo- sés U-I et U-III est complète; la conversion en U-III, c'est-à-dire en 11 ([alpha])-hydroxy-progestérone, est d'environ 50 %, comme l'indique un chroma- togramme sur papier 363 MIU 21, obtenu avec utilisation de carbitol asso- cié à du méthyl-cyclohexane comme système de solvant pour la recherche de la consommation de progestérone et de propylène glycol associé à du toluène pour l'étude du degré et du type de la transformation.
EXEMPLE 9:
Oxydation de la progestérone (266 HGM 206 PB, 279 BJM 198, 329 RBO 60).
De la même façon, partant d'une pousse de 41 heures de RH 176 et y ayant ajouté 1 g de progestérone dans 40 cm3 d'acétone, on l'aère pendant 30 heures et l'on obtient, avec un rendement de 47 %, de la 11([alpha])-hydroxy- progestérone (composé U-III) en soumettant à des extractions la liqueur de fermentation et les mycélia. Le rendement en composé dihydroxylé (U-I) est d'environ 26,5 %, les rendements étant déterminés après séparation par chro- matographie sur une colonne d'alumine et avant recristallisation. On fait recristalliser ces produits en opérant conformément à l'exemple 1 pour re- cueillir les deux composés avec des rendements élevés.
EXEMPLE 10.
Oxygénation de la progestérone (266 HCM 212/300 B).
On ajoute 300 mg de progestérone dans environ 3 cm d'acétone à 150 cm3 d'une culture de 24 heures de RH-176 et l'on aère la culture pen- dant 24 autres heures. La transformation de progestérone en 11 ([alpha])-hydroxy- progestérone (composé U-III) est d'environ 60 %, correction faite pour te- nir compte de la progestérone non consommée et le rendement global est d'en- viron 37 %; le chromatogramme sur papier (349 SHE 44 Pl) est obtenu avec utilisation de carbitol associé à du méthyl-cyclohexane pour la détection de la progestérone et de toluène associé à du propylène-glycol pour diffé- rencier les produits de la transformation.
EXEMPLE 11 :
Oxygénation de la progestérone (266 HCM 199/300 T).
On répète'l'exemple précédent en utilisant 150 cm3 de milieu, en ensemençant avec du RH-176 et en ajoutant 300 mg de progestérone dans 3 cm3 d'acétone. La concentration est de 2 g par litre. On ne constate pas d'inhi- bition dans l'utilisation de la progestérone au bout de 72 heures, d'après un chromatogramme sur papier (349 SHE 44 P2) et en observant la croissance de la culture, mais les rendements en U-III et U-I sont plus faibles que d'ha- bitude.
De même, l'addition de progestérone au milieu de culture, (a) au mo- ment de l'ensemencement primitif du milieu avec le RH-176, (b) 24 heures après l'ensemencement et (c) cinq jours après l'ensemencement, ne produit aucun changement appréciable du type des composés engendrés, en l'espèce la dihydroxy-progestérone U-I et la 11 [alpha]-hydroxy-progestérone U-III.
<Desc/Clms Page number 26>
EXEMPLE 12:
Oxygénation de la 11$-désoxy-corticostérone (266 HCM 204 DR).
On procède comme il est décrit dans l'exemple 1 avec une cultu- re de 24 heures de RH-176 et l'on forme ainsi divers nouveaux-composés oxy- génés en 11, comme l'indique le chromatogramme sur papier de Zaffaroni, de l'éther mono-éthylique de diéthylène-glycol étant utilisé comme phase fixé et du méthyl-cyclohexane comme phase mobile (363 MIU 22).
EXEMPLE 13:
Oxygénation en 11 de la 3-hydroxy-prégnane-20-one.
De la manière décrite ci-dessus pour l'oxygénation de la 17([alpha])- hydroxy-progestérone dans la position 11 du noyau,de stéroide, on soumet de la 3-hydroxy-prégnane-20-one à une oxygénation dans la même position du noyau par l'action d'une culture de RH-176,' c'est-à-dire d'une souche de Rhizopus arrhizus. - ..
EXEMPLE 14:
Oxygénation de stéroïdes en 11.
De la manière décrite dans les exemples précédents, on oxygène les stéroïdes suivants dans la position 11, les données précises étant in- diquées dans le tableau présenté ci-après.
Désignation: (1) 266 HCM 214 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 24 Stéroïde: 17-hydroxy-progestérone Quantité de stéroïde: 1 g dans 60 cm3 d'acétone Quantité de milieu: 4 litres, pH 5,9 après stérilisation
3,9 après réaction Réaction : 24 heures avec aération Résultats chromatographiques: Trois constituants principaux, deux à dépla- cements plus rapides que U-I, un coincidant peut.être avec U-I; les trois en quantités à peu près égales. Un quatrième constituant se- condaire, au-dessus de U-I. Tous les constituants sont similaires à ceux qui proviennent de la progestérone. Il ne reste pas de 17-hydro- xy-progestérone .
Solvants: propylène-glycol + toluène (349 SHE 36)-;tache de 300 .
Un chromatogramme sur papier d'une tache de 160 [gamma]d'une fraction de
Al2O3 donne concordance avec l'extrait, brut en montrant trois con- stituants principaux, un dans la position de U-I, deux à mouvement plus rapide que U-I et un quatrième, secondaire, se déplaçant plus lentement que U-I. Une séparation partielle de ces matières se ré- . vèle dans la colonne d'Al2O3.
Désignation: (2) 266 HCM 213 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 24 Stéroide: 17-hydroxy-11-désoxy-corticostérone (S) Quantité de stéroïde: 1 g dans 60 cm3 d'acétone Quantité de milieu: 4 litres Réaction: 28 heures avec aération Résultats chromatographiques: Tout S consommé en 28 heures.
Au bout de 16 heures, il reste environ 1/3 S. Environ 25 % de trans- formation vers la région de F et certains des constituants plus près de l'origine que F. Solvants: propylène-glycol + toluène. Chro- matogramme sur papier d'une tache de 160 [gamma] de la fraction de A1203 concorde avec le chromatogramme de. 1.'extrait brut.en montrant que le constituant,principal,, autre que S, est une substance qui se meut plus lentement que F (349 SHE 32).
Désignation: (3) 266 HCM 198 HP 2 @ @ Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus @
<Desc/Clms Page number 27>
Durée de pousse en heures: 48 Stéroïdes 17-hydroxy-progestérone Quantité de stéroïdes 2 mg dans 0,1 cm3 d'acétone Quantité de milieu: 0,01 litre pH 4,05 après réaction Réaction : 44 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène.
Cinq constituants, 3 principaux, 2 secondaires. Une petite quanti- té de substance se meut plus lentement que la dihydroxy-progesté- rone (U-I). Quantité modérée d'un constituant semblant être U-I.
Grande quantité de deux substances se déplaçant un peu plus vite que U-I.
Ce chromatogramme corrobore 266 HCM 214, ci-dessus (349 SHE 22).
Désignation (4) 266 HCM 187 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 27 Stéroïdes Androstène-dione Quantité de stéroïdes 1 g dans 60 cm3 d'acétone Quantité de milieux 4 litres Réaction: 64 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène. Toute l'an- drostène-dione transformée en 3 substances (326 MIU 62), toutes plus polaires que la progestérone. Le chromatogramme 10 sur A103 (326 MIU 79) montre la présence de 3 fractions. La fraction D don- ne des cristaux fondant à 205-208 et conservent les groupes dié- nique et cétoniques, comme l'indiquent des analyses en ultra-vio- let.
Désignation: (5) 266 HCM 209 SA Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 46
EMI27.1
Stéroïde: Acétate de 11-désoaEy-17-hydrocy-corticostérone (acétate de S) Quantité de stéroïde: 1 g dans 60 cm3 d'acétone Quantité de milieu: 4 litres, pH final 3,85 Réaction: 49 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène. Une sub- stance se déplaçant un plus lentement que la 17-hydroxy-corticos- térone. Un peu également dans la région de la 11-désoxy-corticos- térone (349 SHE 31).
Désignation (6) 266 HCM 178 E .Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 24 Stéroïde: Ergostérol Quantité de stéroïdes 210 mg dans 25 cm3 d'acétone Quantité de milieu: 1050 cm3 Réaction: 52 heures avec aération Résultats chromatographiques: 300 mg de matière solide extraite de la liqueur de fermentation. Plus soluble que'l'ergostérol dans le méthanol.
Désignation: (7) 266 HCM 198 DA 2 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 48
EMI27.2
Stéroïde: Acétate de 11-désoxy-eorticostérone Quantité de stéroïdes 2 mg Quantité de milieu: 10 cm3 Réactions 44 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène; 6 con- stituants, 12,5 % au-dessus de la position de F (plus près de l'origine), 1,5 % dans la position de F, 6 % au-dessous, 2,5 % dans la position de E, 37,5 % au-dessous de E et 40,5 % au-des- sous de E mais au-dessus de S. Transformation à 100 %. Toute la 11-désoxy-corticostérone consommée,-d'après chromatogramme avec carbitol + méthyl-cyclohexane (349 SHE 21).
Désignation (8) 266 HCM 198 D 2 Organisme: RH 176 Rhizopus ,arrhizus Durée de pousse en heures: 48 Stéroïde: 11-désoxy-corticostérone
<Desc/Clms Page number 28>
Quantité de stéroïde: 2 mg Quantité de milieu10 cm3 Réaction: 44 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants : propylène-glycol + toluène. Environ
76 % de transformation. Six constituants. 10 % d'un constituant se déplaçant plus lentement que F, 1,5 % dans la position de F, 0,5 % un peu au-dessus, 2,5 % dans la position de E, 30 % au- dessous et 31 % encore plus bas mais au-dessus de S (266 SHE 21).
Désignation : (9) 266 HCM 198 S2 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 48
EMI28.1
Stéroïde: 11-désoxy-17-hydroxy-corticostérone (S) Quantité de stéroïde: 2 mg Quantité de milieu: 10 cm3 Réaction: 44 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène. 5 consti- tuants, 13 % de transformation.
Environ 13 % au-dessus de F,
1,5 % en F, 2,5 % en E et une trace au-dessous de E (349 SHE 25) Désignation (10) 266 HCM 198 S4 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 48
EMI28.2
Stéroïde: 11-désoxy-17-hydroxy-corticostérone (S) Quantité de stéroïde; 2 mg Quantité de milieu: 10 cm3 + 10 mg de Tween 40 dans 0,1 cm3 d'éthanol Réaction: 44 heures avec aération Résultatschromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène. Environ
13 % de transformation et de rendement. 10 % au-dessus de F, 1,6% en F, environ 1,6 % en E et une trace au-dessous de E (349 SHE 26).
Désignation (11) 266 HCM 198 SA 4 Organisme: RH 176 Rhizopus arrhizus Durée de pousse en heures: 48 Stéroïde: Acétate de ll-désoxy-17-bydroxy-corticostérone (acétate de S) Quantité de stéroïde: 2 mg Quantité de milieu: 10 cm3 + 10 mg de Tween 40 dans 0,1 cm3 d'éthanol Réaction: 44 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants : propylène-glycol + toluène. 10 % de transformation. Environ 7 % au-dessus de F, 1,3 % en F, environ 0,4 % en È et 0,4 % au-dessous de E (349 SHE 26).
Désignation (12) 266 HCM 217 Mu S Organisme: Mucor Muoedo 24 (Type américain de culture N 9836) Durée de pousse en heures: 24 Stéroïde.- ll-désoxy-17-bydroxy-corticostérone (S) Quantité de stéroïde-. 50 mg Quantité de milieu: 150 cm3 Réaction: 20 heures avec aération Résultats chromatographiques: Solvants: propylène-glycol + toluène. Avec cor- rection pour environ 33 % de S n'ayant pas réagi. 23 % d'un compo= sé se déplaçant un peu plus vite que E, environ 26 % d'un composé se déplaçant plus lentement que F et environ 5 % dans la position de F (349 SHE 48).
EXEMPLE 15:
Oxydation de stéroïdes en 11 (266 HCM 219).
--On ensemence avec des spores de l'organisme RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus) 300 cm3 de la liqueur usuelle de trempage de mais contenant 2 % d'Edamine et 5 % de dextrose, cette liqueur ayant un pH de 6,5; on l'agite pendant 24 heures en maintenant des conditions aérobies. On tire de ce milieu des échantillons de 20 cm3 que l'on met dans des flacons stériles de 100 cm3 et, à chacun, d'eux, on ajoute environ 6 mg de stéroïdes désignés ciaprès, ceux-ci étant dissous dans un maximum de 0,3 cm3 d'acétone pour former une fine suspension. Au bout de 24 heures, on soumet le contenu de chaque flacon à des extractions pour en étudier les modifications d'après un chro matogramme sur papier. Le tableau suivant indique les stéroïdes traités et la référence aux chromatogrammes des dessins annexés.
<Desc/Clms Page number 29>
TABLEAU 8
EMI29.1
<tb> Stéroïde <SEP> Echantillon <SEP> pH <SEP> final <SEP> Chromatogramme
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (juste <SEP> avant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> l'extraction)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (1) <SEP> Androstène-dione <SEP> AR <SEP> 3,75 <SEP> 349 <SEP> SHE <SEP> 70-3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (2) <SEP> Cholesténone <SEP> CR <SEP> 4,12 <SEP> 349 <SEP> SHE <SEP> 70-2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (3) <SEP> Ergostérone <SEP> OR <SEP> 3,9 <SEP> 349 <SEP> SHE <SEP> 70-1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (4) <SEP> Ergostérol <SEP> ER <SEP> 3,6 <SEP> 349 <SEP> SEE <SEP> 70-4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (5) <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> 21-acétoxy-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> prégnénolône <SEP> APA <SEP> 3,75
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (6) <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> prégnénolone <SEP> PA <SEP> ' <SEP> 3,
9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (7) <SEP> Stigmastadiénone <SEP> S <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (8) <SEP> Produit <SEP> d'addition
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'anhydride <SEP> maléique <SEP> au <SEP> bio-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> xyde <SEP> de <SEP> déhydro-ergostéryle <SEP> AP <SEP> 3,85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (9) <SEP> Produit <SEP> d'addition
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> l'anhydride <SEP> maléique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> a <SEP> la <SEP> 3-acétoxy-5.7.9.(11)-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> prégnatriène-20-one <SEP> 20 <SEP> L <SEP> 3,8
<tb>
Ces composés sont tous oxygénés dans la position 11 du noyau de stéroïde sous l'action du RH 176.
EXEMPLE 16:
Oxydation en 11 de la progestérone (266 HCM 220 V).
On utilise 1 cm3 d'une suspension saline (10 am3) de spores prove- nant d'une culture en tube couché de RH 176 (souche de Rhizopus arrhizus) pour ensemencer 150 cm3 du milieu stérile usuel à base d'Edamine, de glucose, de liqueur de trempage de mars et d'eau du robinet.
Après 24 heures d'agitation, on emploie 5 cm3 de la culture pour ensemencer 150 cm3 d'un milieu stérile ayant la composition suivante:
EMI29.2
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> primaire <SEP> KH2PO4 <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Azotate <SEP> d'ammonium <SEP> (NH4N03) <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> hapta-hydraté
<tb>
<tb> MgS04, <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb>
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
Après stérilisation à une température de 120 , le pH du milieu est de 4,3.
Au bout de 24 heures d'aération, conduisant à une prolifération intense, on ajoute à la culture 60 mg de progestérone en utilisant 3 cm3 de méthanol pour dissoudre le stéroide. On aère encore 24 heures puis on soumet la liqueur de fermentation à une extraction au chlorure de méthylène. Comme l'indique la chromatographie.,,'; sur bande de papier (349 SHE 53), la trans- formation en 11 ([alpha])-hydroxy-progestérone (U-III) et en dérivés oxygénés davantage est importante. La matière extraite (U-III) est de nature cristal- line et est moins colorée que dans le cas de l'emploi d'un milieu plus com- plexe.
EXEMPLE 17: Oxygénation de stéroides en 11.
On cultive les organismes employés dans un milieu contenant 20 g d'Edamine, 5 cm3 de liqueur de trempage de mais, 50 g de dextrose et le com- plément à un litre en eau du robinet, on règle le pH à 6,5 puis on stérilise le milieu à 120 pendant environ 20 minutes.
On ensemence avec des cultures effectuées en tubes couchés, dans des milieux nutritifs contenant 10 % d'extrait sec de malt et 2 % d'agar-
<Desc/Clms Page number 30>
agar, ces cultures étant chargées de spores de conidia. Les flacons contien- nent en moyenne 30 cm3 de milieu chacun.
On secoue les flacons dans des conditions aérobies pendant 24 heures à la température du local. On ajoute ensuite une certaine quantité de stéroïde en solution acétoniqueà 2 % en poids par volume et l'on secoue le
EMI30.1
flacon à la température du local pendant encore 24 heures. 0'n'üti's 6''mg de stéroïde pour 30 cm3 de milieu..
Le mélange de fermentation composé de milieu de culture, de sté- roide et de micro-organismes est soumis à trois extractions avec du chlorure de méthylène, le volume de solvant mis en oeuvre étant égal au volume-de pha- se aqueuse.. On isole l'extrait de la phase aqueuse dans un entonnoir sépa- rateur, on le lave avec une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium et avec de l'eau distillée. On évapore la couche de solvant à siccité et l'on soumet le résidu à des essais par chromatographie sur bande de papier.
Les stéroïdes utilisés se trouvent tous oxydés dans la position 11 sous l'ac- tion des micro-organismes mis en jeu.
Le tableau 9 indique l'organisme essayé, le stéroïde utilisé et la référence au chromatogramme sur bande de papier dans les dessins annexés.
TABLEAU 9
Stéroïde: progestérone
EMI30.2
<tb> Organisme <SEP> Culture <SEP> de <SEP> Echantillon <SEP> Chromatogramme
<tb> type <SEP> américain <SEP> n
<tb> n
<tb> (1) <SEP> Mucor <SEP> rouxii <SEP> 4857 <SEP> M1/P6 <SEP> $349 <SEP> SHE <SEP> 47
<tb>
EMI30.3
(2) " griseo cyanus (+) 1207 a M2 / 6 349 SITE 40
EMI30.4
<tb> (3) <SEP> " <SEP> griseo <SEP> cyanus <SEP> (-) <SEP> 1207 <SEP> b <SEP> M3/P6 <SEP> 349 <SEP> SHE <SEP> 40
<tb>
<tb> (4) <SEP> " <SEP> hiemalis <SEP> var.albus.
<SEP> 6800 <SEP> M4/P6 <SEP> " <SEP> " <SEP> 47
<tb>
EMI30.5
(5) tt hiemalis 8690 M5/p6 # fi Il (6) " mucedo 9836 M6/P 6 Il If 40 (7) " il 9635 MiP6 "if " 47 (8) If t! 7941 Mg/P 6 Il il Il (9) Rhizopus nigricans 10404 RJP 6 il il (10) u 7577 R/P " Il fui (11) Il (+) 6227 a R 3 /p 6 Il If 40 (12) Il " (-) 6227 b R 1+ /p 6 Il " Il (13) " chinensis (-) 1227 b R5/P6 !! " 50 (14) Il japonicus 8446 R6/P6 n " 47 (15) " oryzae 10260 Rip 6 Il Il 50 (16) !! il 9363 R 8 Ip 6 fui " "
EMI30.6
Stéroïde:
ll-désoxy-oorticostérone
EMI30.7
<tb> (17) <SEP> Mucor <SEP> rouxii <SEP> 4857 <SEP> M1/DOC <SEP> 349 <SEP> SHE <SEP> 50
<tb>
EMI30.8
(18) il griseo cyanus (+) 1207 a . i /Dc6 If" il (19) il ' Il (-) - 1207 b "3 /DOC 6 n il il
Les chromatogrammes sur papier montrent que la 11-désoxy-corti- costérone est transformée en composés E et F par les organismes numérotés 17 et 18.
<Desc/Clms Page number 31>
Des essais effectués avec les organismes indiqués ci-dessus sur
EMI31.1
la 11-désoxy-corticostérone, la 17-hydroxy-progestérone et la 11-désoy-17- hydroxy-corticotérone conduisent à des résultats similaires, en l'espèce à l'oxygénation.dans la position 11 du noyau de stéroide.
On obtient également le même résultat dans les essais de l'effet des organismes énumérés ci-après sur la progestérone, la 11-désoxy-corticos-
EMI31.2
térone, la 11-désoxy-17-hydroxy-corticostérone et la 17-hydroxy-progestérone: les mucors genevensia, plum beus, parasiticus, dubius, javanicus, adventi- tius microsporus, rouxianus, et racemosus, les Rhizopus reflexus, schangaien-
EMI31.3
sis, tritici, cohnii, delemar, tonkinensis et kazanensis, les Phyaomyees bla- kesleeanus et theobromatus, l'Absidia glauaa, les Zygorhynchus moelleri et heterogamus et le syncephalus nodosa.
EXEMPLE 18:
Oxydation de la progestérone avec utilisation de filtrat de fermen- tation de RH-176 (349 SHE 41).
On filtre une culture de 72 heures de RH-176 pour obtenir 160 cm3 d'un filtrat ayant un pH de 4,1. On hache le mycélium dans un mélangeur Waring avec une solution à0,9 % de sel pendant 15 minutes et l'on centrifuge pour obtenir 100 cm3 de fluide surnageant, que l'on divise en deux portions égales.
On laisse l'une à un pH de 4,65 et on règle celui de l'autre à 6,76 avec du PO4HNa2 demi-molaire. On place le résidu mycélial additionné d'eau salée dans un flacon à part. On ajoute, comme il est indiqué ci-après, de la progestéro- ne (30 mg dans lcm3 d'acétone) dans chaque flacon.
EMI31.4
<tb>
Fraction <SEP> Progestérone <SEP> ajoutée
<tb>
<tb> SI <SEP> = <SEP> couche <SEP> surnageante, <SEP> pH <SEP> 6,76 <SEP> 30 <SEP> mg
<tb>
EMI31.5
SII= Il n if 4,65 " "
EMI31.6
<tb> R <SEP> = <SEP> résidu <SEP> mycélial <SEP> 60 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> BF <SEP> = <SEP> filtrat <SEP> de <SEP> liqueur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non <SEP> dilué, <SEP> pH <SEP> 4,1 <SEP> 30 <SEP> "
<tb>
On secoue les flacons bouchés avec du coton pendant 17 heures à la température du local et on en soumet le contenu à des extractions au chlo- rure de méthylène comme il est indiqué dans l'exemple 1.
Des chromatogrammes sur papier de fractions représentant 320 Y de stéroïde, avec utilisation du système de solvant carbitol + méthyl-cyclohexane montrent que SI accus très peu de transformation en composés plus oxygénés, SII en accuse une notable et BF une encore meilleure, le résidu mycélial accusant une transformation com- plète.
*EXEMPLE 19:
EMI31.7
Oxydation de la il (01) -hydroxy-progestérone (266 HCM 229).
On ajoute 20 mg de 11(o)-hydrocy-progestérone (U-III) (ego GBS 244 B ] à 150 cm3 d'une culture de 48 heures de RH-176 (souche de Rhizopus arrhizus) dans le milieu usuel à base de dextrose, d'Edamine et de liqueur de trempage de mais et l'on poursuit l'aération pendant 22 heures. On soumet les matières à des extractions avec du chlorure de méthylène de la façon in- diquée dans l'exemple 1.
Une chromatographie - sur papier (349 SHE 72) indi- que que la transformation s'oriente vers le composé dihydroxylé (U-I) et vers un second composé qui se produit aussi lors de la transformation de la progestérone elle-même et qui est apparemment un autre dérivé oxygéné de la
EMI31.8
11(-hydroxy-progestérone, La 11(Cé)-bdroxy-progestérone (U-III) et la dihydroxy-progesté- rone (U-I) peuvent être transformées en les dérivés mono- et di-acyloxyliques correspondants, comme il est indiqué dans'l'exemple 1, par application de pro- cédés d'acylation connus, par exemple par réaction avec un anhydride ou un
EMI31.9
chlorure d'acide appropriés, dans un solvant organique tel que la pyridine ou corps analogue.
Comme esters appropriés de la 11-( -hydroxy-progestérone
<Desc/Clms Page number 32>
(U-III) on peut citer les esters formique, acétique, propionique, butyrique,
EMI32.1
valérique, hexanoique, heptanoique, ootanorque, benzoïque, toluique, naphtol- que, ayalopentanoique et cyclohexanoique, les produits de la mono-estérifioa- tion, sur l'hydroxyle 11, par les acides malonique, succinique, glutarique et adipique etc... On peut préparer les mêmes diesters ou des diesters similaires
EMI32.2
à partir de la dihydroxy-progestérone (U-I) ainsi que des esters cycliques ré- sultant de l'estérification des deux hydroxyles par les acides dicarboxyli- ques mentionnés.
Les groupes acyliques peuvent également comporter des substi- tuants ne participant pas à. la réaction, par exemple des atomes d'halogène ou des groupes OH, OCH3 etc... si on le désire.
D'autres micro-organismes se sont révélés intéressants pour l'oxy- génation des stéroïdes, y compris les ll-désoxy-stéroides, sans conduire né- cessairement au même résultat que les champignons de l'ordre des Macorales; ils comprennent diverses souches de Penicillium, par exemple P-100, Aspergil- li, par exemple Aspergillus niger, Neuraspora sitophila, Neuraspora crassa, Oospora Lactis, Polyoporus abietinus et espèces semblables des genres mention- nés.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux détails opératoi- res exacts ou aux composés précis indiqués et décrits et il va de soi que l'on peut apporter divers changements aux modes d'exécution exposés ci-des- sus sans'pour cela sortir du cadre de l'invention.
Légende des dessins.
Figure 1: en ordonnées: pourcentage de transmission. en abscisses: fréquences en cm-1.
A : 319 - DHP - 108,2
B : 11 - céto-progestérone.
Figure 2 : dito, Figure 3 : en ordonnées: transmission. -1 en abscisses : fréquence en cm-1.
EMI32.3
A : s 11(o()-hydroxy-progestérone. B : 11()-acétoxy-progestérone.
C : 11 céto-progestérone.
D dihydroxy-progestérone.
E diacétoxy-progestérone.
Figure 4: 11 - céto-progestérone (identification).
Les traits de référence en haut à partir de la gauche désignent: témoin; DHP - 108,3; témoin + DHP- 108,3.
319 - DHP - 108,3.
326 - MIU - 126.
DHP - 108,3 = Cr203, oxydation.
Composé U = III(80 3'
Témoin: échantillon authentique de 11 - céto-progestérone (80 Y ) Figure 5? Composé S - transformation bio-chimique par RH 176.
Les traits de référence en haut à partir de la gauche désignent:
S 48, S 48 + témoin, témoin.
266 - HCM - 213 # 349 - SHE - 32.
Propylène glycol-toluène.
S 48 = 48 heures de fermentation du composé S (300 [gamma])
S 48 + témoins témoins: composé F (16 [gamma]) composé E (16 [gamma]) composé S (32 [gamma]).
Figure 6: Composé S - transformation bio-chimique par RH 176. Les traits de référence supérieurs, en partant de la gauche, désignent : S 16 heures; S 28 heures; témoins; S 40 heures ; S 48 heures.
266 - HCM - 213 # 349 - SHE - 32
EMI32.4
P""'r\T\u16,,",0 n'1-(Tnr\1 #4'1-tQ
<Desc/Clms Page number 33>
S = composé S de fermentation (320 [gamma])
Indice = Durée de fermentation en heures
Témoins: Composé F (16 [gamma])
Composé E (16 [gamma]) Composé S (32 [gamma]) Corticostérone (32 [gamma]).
Figure 7: Transformation de 17 - [alpha] -hydroxy-progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gau- che s HOP - 16; HOP - 24; témoins, ou témoins + HOP - 16; témoins + HOP - 24.
166 - HCM - 214 # 349 - SHE - 36 et Seq.
Propylène glycol-toluèneo
HOP - 16 = 17 - [alpha] -hydroxy-progestérone (300 [gamma])
16 heures de fermentation.
HOP - 24 = dito, 24 heures de fermentation.
Témoins: 11 - [alpha]-hydroxy-progestérone (ca.240 [gamma])
Dihydroxy-progestérone, DHP - 95,4 (60 [gamma]).
Figure 8: Chromatogramme 22 avec Al2O3 (HOP- 24).
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: fractions 17 et 19; témoin ; fractions 22 et 24; F.
319 - DHP - 111
349 - SHE - 37,38
Toutes les fractions appliquées à la dose de 160 [gamma].
Témoin mélangé- composé E (16 [gamma]) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 [gamma])
F = composé F Témoin (16 [gamma]) Chromatogramme avec Al2O3 de 266 - HCM - 214 (17 - [alpha]-HO, progestérone) Figure 9% Chromatogramme 22 avec Al2O3 (HOP - 24)
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche : fractions 26 et 28; témoins ; fractions 30 et 32; F.
319 - DHP - 111
349 - SHE - 37,38
Toutes les fractions appliquées à la dose de 160
Témoin mélangé: Composé E (16 [gamma]) dihydroxy-progestérone (DHP 954)(30 [gamma])
F = composé F Témoin (16 [gamma])
Chromatogramme avec Al2O3 de 266 - HCM - 214 (17 - [alpha] -HO, progestérone) Figure 10: Transformation biochimique de progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: Pl, P2, témoins, P3, P4.
266 - HCM - 199/150 T
349 - SHE - 40 (P4) Propylène glycol-Toluène P4 - progestérone de fermentation (300 [gamma])
Témoins: dihydroxy - progestérone (DHP 95,4) (60 [gamma]) Il - 0/.. -HO, progestérone (environ 240 [gamma]) Figure 11: Transformation biochimique de progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche-. OC1, OC2, Prog.
266 - HCM - 199 - OC1 et OC2
<Desc/Clms Page number 34>
363 - MIU - 21 Carbitol-méthylcyclohexane
OC1/OC2 progestérone de fermentation (500 #)
Prog = progestérone témoin (80 [gamma]) Figure 12 Transformation biochimique de progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la
EMI34.1
gauche.- Témoin, Pl, P2, Témoins J* 266 - HCM - 212/300 B 199/300 T 349 - SHE - 44 Pl 44 P2 Propylène glycol-toluène Pl - progestérone de fermentation (HCM - 212/300 B) (300 [gamma]) P2 = progestérone de fermentation (HCM - 199/300 T) (300[gamma] Témoins:
EMI34.2
=11 - -H0, progestérone (30 a ) (30 = dihydroxy#progestérone (DHP 95,4) (30 y) Figure 13: DOC, transformation de progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauches 204 DR, DOC, Cort, 205 PP, Prog.
266 - HCM - 204 DR et 205 PP
363 - MIU - 22
EMI34.3
Carbitol-méthylcyclohexane
204 DR = 11 -désoxy-corticostérone de fermenta ion (320 [gamma]) DOC = 11 - désoxy-corticostérone, contrôle (64 [gamma]) Cort = corticostérone témoin 64 [gamma])
Prog = progestérone témoin (80 )
205 PP = progestérone de fermentation 320 [gamma]) Figure 14: Transformation biochimique de 17 - [alpha] -HO, progestérone.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: HP2, témoin + HP2, témoin.
266 - HCM - 198 HP2
349 - SHE - 22
Propylène glyool-toluène
EMI34.4
HP2 = 17 - dL -HO, progestérone de fermentation (320 Y) Témoins dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (6o 1) corticostérone (64 [gamma]) Figure 15: Transformation biochimique de composé acétate de S.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: 209 - SA, témoin + 209 - SA, témoin.
EMI34.5
266 - .HCM - 208 SA c3 349 - SHE - 31 Propylène glycol-toluène 209 - SA =acétate S de fermentation (320 [gamma])
Témoin composé F (16 [gamma]) composé E (16 [gamma]) composé S (64 ) Figure 16: DOC, DOCA transformation biochimique.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: D2, DA2, témoin + D2, témoin + DA2, témoin.
266 - HCM - 198 - D2 + DA2
349 - SHE - 21
Propylène glycol-toluène D2 = 11 - désoxy- corticostérone (320 [gamma]) [alpha] DA2 = acétate de 11-désoxy-corticostérone (320 [gamma])
Témoin + D2
Témoin + DA2
<Desc/Clms Page number 35>
Témoin: composé F (16 [gamma]) composé E (16 [gamma]) composes (64 r) corticostérone (64 [gamma]).
Figure 17: Transformation biochimique de composé S par RH 176.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la ' ' gauche: SA2, S2, témoin + SA2, témoin + S2, témoin.
266 - HCM - 198 S2 et SA2 349 - SHE - 25 Propylène glycol-toluène S2 = composé S de fermentation (320 [gamma]) SA2 =acétate de S - Fermentation (320 [gamma]) Témoin: composé F (16 ) composé E (161) composé S (64 [gamma]) Figure 18.- Transformation biochimique d'acétate de S.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche.- SA4, S4, témoin + S4, témoin + SA4, témoin.
EMI35.1
266 - HCM - 198 - S4 et SA4
349 - SHE - 26
Propylène glycol-toluène S4 = composé de S - Fermentation (320 [gamma]) SA4 = composé d'acétate de S - Fermentation (320 [gamma])
Témoin : composé F (16 [gamma]) composé E (16 ) composé S (64[gamma]) Figure 19: Transformation biochimique de composé de S par M.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: 1, témoin.
EMI35.2
266 - HCM - 217 MaS 349 - SHE - 48 Propylène glycol-toluène 1 = composé S de fermentation (320 [gamma]) Témoin : composé F (16 ) composé E (16 ) composé S (32 ) Figure 20: Transformation biochimique d' androstènedione.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: And. AR, DOC, Prog, S.
266 - HCM - 219 AR # 349 -SHE - 70,3
Propylène glycol-toluène And = androstènedione témoin (80 [gamma]) AR = androstènedione de fermentation (500 [gamma])
DOC = 11 -désoxy-corticostérone témoin (64[gamma])
Prog = progestérone témoin (80 [gamma])
S = composé S témoin (32 [gamma]) Figure 21: Transformation biochimique d'androstènedione.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: And. AR, DOC, Prog, S.
EMI35.3
266 - HCM - 219 AR 349 - SHE -70,3 Carbitol méthylcyclohexane = androstènedione témoin (80 )
AR = androstènedione de fermentation (500 [gamma])
DOC = 11 - désoxy-corticostérone témoin (64 [gamma])
Prog = progestérone témoin (80)
S = composé S témoin (32 [gamma]) Figure 22: Transformation biochimique de cholesténone par RH 176
Les traits de'référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: Chol, CR, DOC, Prog.
EMI35.4
266-HCM - 219 CR rw 349 - sie -70,2 Carbitol-méthylcyclohexane
<Desc/Clms Page number 36>
Chol = cholesténone témoin (80 [gamma]) CR = cholesténone de fermentation (500 [gamma])
EMI36.1
DOC = Il -désoxy-cortico!3térone ,témoin (64 )
Prog = progestérone témoin (64 [gamma]) Figure 23 Transformation biochimique d'ergostérone par RH 176.
. Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: Erg, OR, DOC, Prog.
266 - HCM - 219 - OR # 349 - SHE - 70,1
EMI36.2
Carbitol-méthy1cyclohexane
OR = ergostérone de fermentation (500 [gamma]) Erg = ergostérone témoin (80 [gamma]) DOC = Il -désoxy-corticostérone témoin (64 [gamma])
Prog = progestérone témoin (64 [gamma]) Figure 24: Transformation biochimique d'ergostérol.
Les traits de référence supérieursdésignent, à partir de la gauches ER, témoin + ER, témoin.
EMI36.3
266 - HCM - 219 ER e.r 349 - SHE - 70,4 Propylène glycol-toluène ER = ergostérol de fermentation (500 [gamma])
Témoin: ,Il - désoxy-corticostérone (64 [gamma]) ergostérol (26 [gamma]) composé S (32 [gamma]) Figure 25 :Transformation deprogestérone, ensemencement végétatif, milieu simple.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: vég. témoin + vég, témoin.
266 - HCM - 220 v # 349 - SHE - 53,2
Propylène glycol-toluène Veg = Progestérone de fermentation # Témoin: 11 - [alpha]- HO, progestérone (60 [gamma]) dihydroxy-progestérone (30) Figure 26: Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent,à partir de la gauche Ml, M4, M5, témoin.
EMI36.4
314A-64-'n.r'349-sHE-47 Propylène glycol-toluène
EMI36.5
Ml = Ml/P6 progestérone de fermentation (3z0
M4 = M4/P6 progestérone de fermentation (320 )
M5 = M5/P6 progestérone de fermentation (320 [gamma]) Témoin: 11 [alpha]-HO, progestérone (301fi) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 [gamma]) Figure 27: Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche-. M2, M3, M6, témoin a, témoin b.
EMI36.6
314 - AW - 64 - 71 e-J 349 - SHE - 40 Propylène glycol-toluène M2 = M2/P6 de fermentation (240 [gamma]) - M3 = M3/P6 de fermentation (240 [gamma])
M6 = M6/P6 de fermentation (240 [gamma])
Témoin :
EMI36.7
( 110< -HO, progestérone (30 1) a ( dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 1) b 11OC. =H0, progestérone (60 4 ) Figure 28 : Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche.,, M7, M8, témoin. '
<Desc/Clms Page number 37>
EMI37.1
314 - AW - 64 - 71 - 349 - SRE - 47 Propylène glycol-toluène M7 = M7/P6 de fermentation (320 [gamma]) M8 = M8/P6 de fermentation (320 [gamma]) Témoin :
EMI37.2
11 - c/ -HO, progestérone (30é') dihydroxy-progestérone (30 r) Figure 29 Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche.- Rl, R2, R6, témoin.
EMI37.3
314-AW -64 -71349 -SHE-47 Propylène glyool-toluène Rl = RljP6.de fermentation (320Ùfl)
R2 = R2/P6 de fermentation (320 [gamma])
R6 = R6/P6 de fermentation (320 [gamma]) Témoin: 11 [alpha]-HO, Progestérone (30 0) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 [gamma]) Figure 30: Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: R3, R4 témoin a, témoin?.
314 - AW - 64 - 71- 349 - SHE - 40
Propylène glycol-toluène
R3 = R3/P6 de fermentation (240 [gamma])
R4 = R4/P6 de fermentation (240 [gamma]) Témoin: a = 11 - [alpha]-HO, progestérone (30 [gamma]) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 [gamma])
EMI37.4
B = 11 - o -HO, progestérone (60 ) Figure 31 : Transformation biochimique de progestérone par mucorales.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche: R5, R7, R8, témoin.
EMI37.5
314 - AW - 64 - 71 - 349 - SHE - 50 Propylène glycol-toluène R5 = R5/P6 de fermentation (320 [gamma]) R7 = R7/R6 de fermentation (320 [gamma]) R8 = R8/P6 de fermentation (320 [gamma]) Témoin: V
EMI37.6
Il - ;; -Ho, progestérone (64 j); (30 0 ) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4 Figure 32 : DOC, transformation biochimique par mucorales.
Les traits de référence supérieure désignent, à partir de la gauche: M1, M2, M3, témoin.
EMI37.7
314 - AW - 64 - 71 c-..J 349 - SIIE - 50 Propylène glycol-toluène Ml = M1/DOC6 de fermentation (320 [gamma]) M2 = M2/DOC6 de fermentation (320, [gamma]) M3 = M3/DOC6 de fermentation (320 [gamma])
EMI37.8
Témoin-. composé F (16 ) composé E (16) corticostérone (64 [gamma]) Figure 33: DOC, transformation biochimique par mucorales M2 (ATCC 1207A )
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauches M2, témoin + M2, témoin.
314 - AU-64-71 # 349 - SHE - 50 Propylène glycol-toluène M2 = M2/DOC6 de fermentation (320 [gamma])
EMI37.9
Témoins composé F' (16 composé (16
<Desc/Clms Page number 38>
composé E (16 [gamma]) corticostérone (64 [gamma]) Figure 34: DOC, transformation biochimique par mucorales'
M1 (ATCC 4857)
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauches M1, témoin + El, témoin.
314 - AW - 64 - 71 # 349 - SHE - 50 Propylène glycol-toluène M1 = M1/DOC6 de fermentation (320 [gamma]) Témoin: composé F (16 composé E [gamma]) (16 corticostérone [gamma]) Figure 35 : Transformation de progestérone par filtrat.
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche : SI, SII, témoin, R, BF.
349 - SHE - 41 Témoin'= progestérone (64 [gamma])
SI = filtrat de fermentation pH6,76
SII = SI (64 [gamma]) 65
R = mycelium de fermentation
BF = filtrat de fermentation pH4,l Carbitol-méthylcyclohexane Figure pH4, Transformation de 11 - 36: progestérone par RH 176
Les traits de référence supérieurs désignent, à partir de la gauche : 72, témoin, + 72, témoin.
266 - [alpha]-HO, HCM - SHE 229# 349 - Propylène glycol-toluène 72 = - 72 progestérone de fermentation (320 [gamma]) Témoin: (320 [gamma]) progestérone (60 [gamma]) dihydroxy-progestérone (DHP 95,4) (30 [gamma])
REVENDICATIONS.
---------------------------
1. Procédé de production d'un stéroïde porteur d'oxygène au moins dans la position 11 du noyau, suivant lequel on soumet un stéroïde, dépourvu d'oxygène dans cette position 11, à l'action d'enzymes oxydant en- gendrés par une culture d'une espèce de champignon de l'ordre des [gamma])
2. Procédé de production d'un stéroïde oxygéné en 11 du noyau, sui- vant lequel on soumet un stéroide contenant un groupe méthylénique en 11 à l'action d'enzymes oxydants engendrés par une culture d'une espèce oxydante de champignon de l'ordre des Mucorales.
3. Procédé de production d'un stéroïde oxygéné en 11, suivant lequel on soumet un stéroïde contenant un groupe méthylénique en Mucorales. 11, à l'ac- tion d'enzymes oxydants engendrés par une culture d'une espèce oxydante de champignon de la famille des Mucoracées.
4. Procédé de production d'un stéroïde oxygéné en 11, suivant le- quel on soumet un stéroïde contenant un groupe méthylénique en 11, à l'ac- tion d'enzymes oxydants produits par une culture d'une espèce oxydante de champignon du genre des Rhizopus.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.