<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne un nouvel antibiotique et des pro- cédés de préparation de ce produit. Plus particulièrement, elle a pour ob- jet une substance antibiotique produite par des souches de microorganismes appartenant à une espèce de Streptomyces non décrite antérieurement, cet antibiotique et ses sels étant efficaces vis-à-vis des trypanosomes, des amibes, et des bactéries positives et négatives au test de Gram.
L'antibiotique nouveau, sous sa forme purifiée, est une matière cristalline blanche douée de propriétés faiblement basiques. Un échantil- lon analytique préparé comme décrit ci-après donne, à l'analyse élémentai- re, les résultats suivants : Carbone 34,03 - hydrogène 4,05 - azote 21,60 - soufre 8,30 - oxygène 32,02 par différence. Le composé a un poids moléculaire relativement faible.
Sa formule empirique basée sur l'analyse ci-dessus correspond de très près à C11H15-16N6O8S.
L'antibiotique nouveau est presque complètement stable dans l'eau à la température ambiante pendant 24 heures, à pH 3, 7 et 9. A températu- re élevée, il présente une certaine instabilité, particulièrement à 100 C et au-dessus.
Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge de l'antibiotique est représenté par la figure 1. Cette courbe est déterminée sur un échantil- lon de la matière, mélangé à des cristaux de KBr, et comprimé suivant un disque. Le spectre d'absorption dans l'ultra-violet à pH 7,0 est repré- senté par la figure 2.
La rotation optique d'un échantillon purifié de l'antibiotique est [a]D24,5 = 33,3 (1052 g dans 100 cm3 d'un mélange à 50% d'éthanol et 50% d'acide chlorhydrique 0,1N. Rotation observée corrigée = -0,35 dans un tube de Idem).
L'antibiotique nouveau est soluble dans les solvants suivants à la température ambiante suivant les valeurs approximatives indiquées, qui sont exprimées en mg/cm3 de solvant :
EMI1.1
<tb> eau, <SEP> pH <SEP> 3,5 <SEP> 5,8 <SEP> (x)
<tb>
<tb> eau, <SEP> pH <SEP> 6,5 <SEP> 1,9 <SEP> (x)
<tb>
<tb> eau, <SEP> pH <SEP> 9, <SEP> 25 <SEP> 26,8 <SEP> (x)
<tb>
<tb> méthanol <SEP> 14,2 <SEP> (x)
<tb>
<tb> acétone <SEP> 4,8
<tb>
<tb> n-butanol <SEP> 0,25
<tb> acétate <SEP> d'éthyle <SEP> 0,36
<tb>
<tb> benzène <SEP> 0,137
<tb>
<tb> éther <SEP> 0,031
<tb>
(x) : chiffres obtenus par voie gravimétrique.-
L'antibiotique nouveau préparé par le procédé de la présente inven- tion s'adsorbe fortement sur du charbon de bois dans une large gamme de pH, qui va de moins de 3 à plus de 9.
Il s'adsorbe faiblement sur des adsor- bants courants tels que le silicate de magnésium activé, l'alumine, la cel- lulose d'alfa et la terre à foulons, en milieu à pH acide, neutre et al- calin. Il peut s'adsorber sur des résines échangeuses cationiques à par-
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tir de solutions neutres ou légèrement alcalines, et on peut l'éluer de ces résines par une solution acide ou basique.
Le nouvel antibiotique est très actif vis-à-vis des trypanosomes,
EMI2.1
tels que le Trypanosoma equiperdum, et des amibes telles que l'Endamoeba histolytica et par suite il est précieux dans le traitement des affections causées par ces microorganismes chez l'homme et les animaux, suivant les quantités et le mode d'administration prescrits par le médecin ou vétérinai- re traitant.
Il est également actif vis-à-vis de diverses bactéries, com- me le montre le tableau suivant dans lequel on illustre son spectre bactérien en utilisant une solution à 200 microgrammes par cm de l'antibiotique dans-du méthanol aqueux à 20%, suivant la méthode courante de diffusion dans l'agar-agar :
EMI2.2
<tb> Organisme <SEP> Largeur <SEP> de <SEP> zone,
<tb>
EMI2.3
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ mmo
EMI2.4
<tb> B. <SEP> cereus <SEP> Waksman <SEP> 8,0
<tb>
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> (Friedlander) <SEP> 2,9
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 7,0
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> pH <SEP> 6,0 <SEP> 6,1
<tb>
<tb> Alcaligenes <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10153 <SEP> insignifiante
<tb>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> (n <SEP> 209) <SEP> 6,0
<tb>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 8,9
<tb>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> pH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 9,4
<tb>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> streptothricine <SEP> 3,0
<tb> M. <SEP> ranae <SEP> 0
<tb>
EMI2.5
M. TUbercu10sis PH 7,8 2,9 M.
Tubeçcalosis pH 6 7,1
EMI2.6
<tb> Staph. <SEP> àlbus <SEP> 8,0
<tb>
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 7,5
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 7,0
<tb>
EMI2.7
Streptococcus haemo1yticus NY 5 16,1
EMI2.8
<tb> Corynebacterium <SEP> xerose <SEP> 7,0
<tb>
Le nouvel antibiotique est produit par une espèce de Streptomyces à laquelle on a attribué le n T 3018 et qui n'a apparemment pas été dé- crite antérieurement. Voici une description générale de cette espèce nou- velle:
Les couleurs affectées d'une majuscule sont celles de Ridgeway.
Mycélium aérien : absent sur de nombreux milieux; présent sur quel- ques milieux, et alors en quantité limitée, blanc à gris (proche de "Pale Gull Gray", jusqu'à "Light Gull Gray").
Mycélium végétatifscroissance dense; blanchâtre à jaune (proche de "Ivory Yellow" jusqu'à "Chamois" et à "Honey Yellow").
Colorât ion à l'envers blanchâtre à jaune (proche de "Ivory Yellow"
<Desc/Clms Page number 3>
jusqu'à "Honey Yellow" et à "Cinnamon-Buff"; sur certains milieux, des ai- res obscurcies (gris proche de "Dab-Grey"), apparaissent mélangées à des aires jaunes.
Pigment soluble: aucun sur la plupart des milieux, jaune clair sur mannitol/agar-agar Czapek-Dox à 32 et à 37 C.
Morphologie : les hyphes aériens sur amidon/agar-agar Waksman sont ramifiés; des hyphes sporifères poussent principalement sous forme d'amas de branches latérales qui se terminent par de courts enroulements de quel- ques tours, Les spores sont à peu près sphériques ou allongées (0,57 à 1,14 sur 0,57 à 1,71 micron).
Les caractéristiques de culture sur les milieux usuels à l'agar- agar dans des boîtes de Petri sont décrites dans le tableau I.
Des caractéristiques supplémentaires de culture sont décrites dans le tableau II.
Evidemment, des variations des caractéristiques ci-dessus, du gen- re de celles observées quand on étudie les cryptogames, apparaîtront avec différentes souches de cette nouvelle espèce et sous l'influence de condi- tions de milieu différentes.
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TABLEAU I Baractéristiques de culture du Streptomyces sp., T-3018, après 14 jours d'incubation dans des plateaux Petri à 28 Co
EMI4.1
<tb> Milieu <SEP> Croissance <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Mycélium <SEP> Végétatif <SEP> Envers <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> Agar-agar <SEP> CzapekDox <SEP> Bonne <SEP> léger <SEP> ;
<SEP> blancjaune("Cream-Buff" <SEP> Jaune(proche <SEP> de <SEP> néant <SEP> croissance
<tb> à <SEP> "Chamois") <SEP> "Chamois") <SEP> extensive
<tb> Mannitol <SEP> agar-agar <SEP> bonne <SEP> très <SEP> léger;blanc <SEP> à <SEP> crème <SEP> léger <SEP> à <SEP> jaune <SEP> Jaune <SEP> ("Chamois" <SEP> à <SEP> néant <SEP> extensif
<tb> Czapek-Dox <SEP> gris <SEP> clair(proche <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "Chamois") <SEP> "Honey <SEP> Yellow")
<tb> de <SEP> "Light <SEP> Minéral
<tb> Gray")
<tb> Asparagine/dextrose/ <SEP> assez <SEP> Gray") <SEP> crème <SEP> blanchâtre <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande/ <SEP> bonne <SEP> néant <SEP> clair <SEP> clair(proche <SEP> de
<tb> agar-agar <SEP> "Cream <SEP> Color")
<tb> Asparagine <SEP> acide/dex- <SEP> assez <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> blanchtre <SEP> crème <SEP> blanchâtre <SEP> néant
<tb> trose/extrait <SEP> de <SEP> vian- <SEP> bonne
<tb> de/agar-agar
<tb> Amidon/agar-agar <SEP> modérée <SEP> rare <SEP> à <SEP> modéré;gris <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant <SEP> croissance <SEP> denWaks-man <SEP> bleuâtre("Pale <SEP> Gull(proche <SEP> de <SEP> "chamois") <SEP> proche <SEP> de <SEP> "cha- <SEP> se;agar-agar,
<tb> Gray"à"Light <SEP> Gull <SEP> mois <SEP> ;aires <SEP> obscurcies, <SEP> pas <SEP> entièrement
<tb> Gray") <SEP> proches <SEP> de <SEP> "Drab-Gray" <SEP> liquidé.
<tb>
Amidon/agar-agar <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris(jus- <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant, <SEP> agar-agar <SEP> pas
<tb> Czapek-Dox <SEP> qu'à <SEP> proximité <SEP> de <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "chamois") <SEP> ("Light <SEP> Buff" <SEP> à <SEP> complètement
<tb> "Pale <SEP> Gull <SEP> Gray"); <SEP> "Cream <SEP> Color") <SEP> liquidé.
<tb> rare <SEP> à <SEP> modéré
<tb> Malate <SEP> de <SEP> calcium/ <SEP> modérée <SEP> néant <SEP> à <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune <SEP> ("Cre-banchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant <SEP> liquidation <SEP> de
<tb> agar-agar <SEP> gris <SEP> am-Buff"à"Honey <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "Honey <SEP> l'agar-agar
<tb> Yellow") <SEP> Yellow").
<tb>
Dextrose <SEP> de <SEP> pomme <SEP> modérée <SEP> nul <SEP> à <SEP> léger;blanc <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant
<tb> de <SEP> terre <SEP> à <SEP> gris(proche <SEP> de <SEP> "Ivory <SEP> Yellow"à <SEP> ("Ivory <SEP> Yellow" <SEP> à
<tb> "Light <SEP> Gull <SEP> Gray") <SEP> "Cream-buff") <SEP> "Cream-buff")
<tb> Agar-agar <SEP> Bennett <SEP> bonne <SEP> rare <SEP> à <SEP> abondant;
<SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> Jaune(proche <SEP> de <SEP> néant
<tb> blanc <SEP> "Cinnamon-buff")
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
TABLEAU I (suite) T-3018
EMI5.1
<tb> Milieu <SEP> Croissance <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Mycélium <SEP> Végétatif <SEP> Envers <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macé- <SEP> modéré <SEP> rare <SEP> à <SEP> modéré <SEP> ;
<SEP> clair <SEP> jaune(proche <SEP> de <SEP> néant <SEP> --ration <SEP> de <SEP> mais/ <SEP> blanc <SEP> terne <SEP> "Chamois" <SEP> à <SEP> "Hoagar-agar <SEP> ney <SEP> Yellow")
<tb> Dextrose/agar- <SEP> assez <SEP> néant <SEP> jaune(proche <SEP> de <SEP> Jaune(Ivory <SEP> Yellow" <SEP> néant <SEP> --agar <SEP> Krainsky <SEP> bonne <SEP> "Ivory <SEP> Yellow") <SEP> à <SEP> "Cream-Buff")
<tb> Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> modérée <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> terne <SEP> Jaune(proche <SEP> de <SEP> néant <SEP> ---
<tb> "Cream-Buff")
<tb> Maltose/agar-agar <SEP> assez <SEP> néant <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant <SEP> --Sabouraud <SEP> bonne <SEP> "Cream-Buff" <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "Honey
<tb> Yellow")
<tb> Glucose/agar-agar <SEP> modérée <SEP> néant <SEP> à <SEP> léger <SEP> ;
<SEP> Jauneblanchâtre <SEP> Jaune <SEP> blanchâtre <SEP> néant <SEP> . <SEP> --blanc <SEP> à <SEP> brun-jaune,clair <SEP> à <SEP> jaune <SEP> ("Chamois"
<tb> terne <SEP> à <SEP> "Yellow <SEP> Honey")
<tb> Agar-agar <SEP> Emerson <SEP> modérée <SEP> léger;blanc <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> terne <SEP> Jaune <SEP> (proche <SEP> de <SEP> néant. <SEP> ----
<tb> "Honey <SEP> Yellow")
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
TABLEAU'II Caractéristiques de culture du Streptomyces sp., 6-3018 après 14 jours d'incubation à 28 C.
EMI6.1
<tb>
Milieu <SEP> croissance <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> .Mycélium <SEP> végétatif <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> dés <SEP> de <SEP> carotte <SEP> médiocre <SEP> néant <SEP> très <SEP> léger;blanchâtre <SEP> -- <SEP> --
<tb> à <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> dés <SEP> de <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> modérée <SEP> léger;
<SEP> blanc <SEP> jaune <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "Pin- <SEP> -- <SEP> dé <SEP> non <SEP> coloré
<tb> kish <SEP> Cinnamon") <SEP> à <SEP> jaune
<tb> olive <SEP> (proche <SEP> de <SEP> "Buffy
<tb> Brown")
<tb> gélatine <SEP> modéré <SEP> néant <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> néant <SEP> liquéfaction
<tb> lait <SEP> de <SEP> tournesol <SEP> légère <SEP> à <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> blanchâtre <SEP> néant <SEP> liquéfaction <SEP>
<tb> bonne <SEP> mille <SEP> à <SEP> complète
<tb> bouillon <SEP> au <SEP> nitrate <SEP> de <SEP> légère <SEP> à <SEP> néant <SEP> blanchâtre <SEP> à <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> néant <SEP> réduction <SEP> du <SEP>
<tb> dextrose <SEP> bonne <SEP> nitrate
<tb> cellulose <SEP> (papier-filtre <SEP> légère <SEP> néant <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> néant <SEP> papier <SEP> non <SEP>
<tb> dans <SEP> solution
<SEP> Czapek) <SEP> décomposé <SEP> au
<tb> bout <SEP> de <SEP> 21
<tb> jours
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
LE PROCESSUS DE FERMENTATION.
Le processus par lequel le nouvel antibiotique se forme est une fermentation aérobie d'un milieu nutritif aqueux inoculé avec l'organisme nouveau décrit plus haut. Les constituants du milieu de fermentation et les conditions de la fermentation sont généralement les mêmes que dans d'autres processus de fermentation dans lesquels on emploie des cryptoga- mes pour produire des antibiotiques.
Les sources de carbone comprennent l'amidon, l'amidon hydrolysé, les sucres tels que le lactose, le maltose, le dextrose, le saccharose, ou les sources de sucre telles que la mélasse; les alcools tels que le gly- cérol et le mannitol; les acides organiques tels que l'acide citrique et l'acide acétique; et divers produits naturels qui peuvent contenir, outre des substances carbonées, diverses autres matières nutritives.
Les sour- ces d'azote comprennent les protéines telles que la caséine, la zéine, la lactalbumine; les hydrolysats de protéines, les protéoses, les peptones, les peptides, et les matières commerciales telles que la "N-Z-amine" qui doit être un hydrolysat de caséine; également, la liqueur de macération de mais, la farine de soja, le gluten, la farine de graine de coton, la fari- ne de poisson, les extraits de viande, les jus de provenance animale, gâ- teau de foie, les extraits de levure, les matières solubles de distillation etc...; les amino-acides, l'urée, les sels d'ammonium et les nitrates, etc..
On utilise avantageusement, pour la fermentation des cations inorganiques tels que le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, etc..; et des anions tels que les anions chlorure, sulfate, phosphate, et diverses combi- naisons de ces anions et cations sous forme de sels minéraux. Les corps dits "oligo-éléments" tels que le bore, le cobalt, le fer, le cuivre, le zinc, le manganèse, le chrome, le molybdène, et d'autres encore, peuvent être utilisés avec avantage. Généralement, le soufre de l'antibiotique et les oligo-éléments se trouvent en quantités suffisantes soit dans les con- stituants carbonés et azotés du milieu, particulièrement s'ils sont tirés de sources naturelles, soit dans l'eau du robinet, et il peut être super- flu d'ajouter des quantités supplémentaires de ces corps.
On aère la fermentation de la façon usuelle en refoulant de l'air stérile à travers le mélange en fermentation, généralement à raison d'envi- ron 1 volume d'air par volume de milieu de fermentation et par minute.
Pour réduire au minimum la contamination par des microorganismes étrangers, il faut fermer les récipients de fermentation et etretenir dans le récipient une pression supérieure de 0,14 à 1,05 Kg/cm à la pression atmosphé- rique. Une agitation mécanique est généralement à conseiller, en plus de l'agitation assurée par aération. On peut ajouter de temps en temps, sui- vant les besoins, des agents antimousses tels que de l'octadécanol à 1% dans l'huile de saindoux, pour empêcher une trop forte production de mousse.
On conduit la fermentation à une température de préférence de l'or- dre de 26-30 C, mais oelle-ci peut aussi descendre jusqu'à 1700 ou monter jusqu'à 42 C.
Le temps nécessaire à une production maxima d'antibiotique varie considérablement suivant les autres conditions de fermentation. Générale- ment, il faut environ 48 heures pour que des quantités appréciables d'anti- biotique soient détectées dans le milieu. La production de l'antibiotique augmente avec le temps, et la fermentation peut durer jusqu'à 120 heures.
Les conditions de pH varient normalement de 6 à 8,0 environ, bien que des écarts par rapport à ces valeurs soient admissibles.
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EXEMPLE I. -
On prépare de la façon suivante un inoculum convenable pour mettre en route une fermentation à grande échelle.
On utilise 5 à 10 cm3 d'eau aseptique pour la mise en suspension de la végétation superficielle d'une culture sur agar-agar en éprouvette inclinée. On utilise la suspension de spores et de fragments de mycélium obtenue pour inoculer deux lots de 100 cm3 de milieu aseptique dans des fla- cons Erlenmeyer de 500 cm3. Après inoculation, on fait incuber les deux flacons sur une secoueuse alternative à environ 28 C pendant environ deux jours, après quoi on utilise les 200 cm3 d'inoculum primaire pour inoculer 6 litres de milieu dans une bonbonne en verre de 9 litres, et on fait incu- ber à nouveau, avec aération, généralement pendant un jour environ, à 28 C environ.
On utilise alors les 6 litres de culture en bonbonne pour inocu- ler 100-200 litres, ou plus, de milieu aseptique, dans un bac de fermenta- tion. Pour des lots plus grands, de 500 litres ou plus, on obtient habi- tuellement des inocula plus grands en réunissant deux ou plusieurs inocula en bonbonnes de 6 litres.
On prépare un milieu de fermentation ayant la composition suivan- te :
EMI8.1
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 12,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mannitol <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (NH4)2 <SEP> HPO4 <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> solution <SEP> d'oligo-éléments <SEP> Winsonsin <SEP> A-Z <SEP> 1,0 <SEP> cm3
<tb>
et on complète à 1000 cm@ avec de l'eau, puis on rajuste à pH 7-7,2 avec de la soude aqueuse.
On place 1500 litres de ce milieu dans un bac à fermentation de 2000 litres, on stérilise environ 60 minutes sous une pression de vapeur de 1,05 Kg/cm2 (120 C) et on inocule avec 12 litres d'une culture en bon- bonne vieille de 23 heures, telle que décrite plus haut. Le pH est de 6,96 avant stérilisation et de 6,68 après stérilisation. On fait fermen- ter le mélange pendant 112,5 heures à 26-29 C (la plupart du temps 27-28 C).
Outre la fermentation ci-dessus, on conduit un certain nombre de fermentations similaires dans des conditions variables, comme le montre le tableau suivant. Les résultats des titrages ont été obtenus en utilisant comme organisme d'essai le Streptoooocus haemolyticus souche C-203, et comme milieu de croissance une infusion cerveau-coeur "Difco-Bacto" recon- stituée avec de l'eau et 1,5% d'agar-agar.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
¯¯¯¯¯¯¯Inoculum¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ i
EMI9.2
<tb> Exem- <SEP> Capacité <SEP> litres <SEP> litres <SEP> de <SEP> Age <SEP> de <SEP> la <SEP> cul- <SEP> Tempéra- <SEP> Rapport <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Titrage,
<tb> ple <SEP> de <SEP> la <SEP> cuve, <SEP> de <SEP> culture <SEP> en <SEP> ture <SEP> en <SEP> bobon- <SEP> ture <SEP> d'aération:
<SEP> fermenta. <SEP> pH <SEP> largeur
<tb> en <SEP> litres <SEP> milieu <SEP> bonhomme <SEP> ries <SEP> heures <SEP> C <SEP> vol.d'air/ <SEP> tion, <SEP> en <SEP> de
<tb> vol.de <SEP> mi- <SEP> heures <SEP> zones
<tb> lieu
<tb>
EMI9.3
1 ! 1900 1.500 12 23 26 - 29 0,85 0 X- 6,96
EMI9.4
<tb> 0 <SEP> 6,68
<tb> 96 <SEP> 6,22 <SEP> 29,0
<tb> 112,5 <SEP> 6,54 <SEP> 31,2
<tb> II <SEP> 380 <SEP> 200 <SEP> 6 <SEP> 28,5 <SEP> 28 <SEP> 0,95 <SEP> 0 <SEP> X- <SEP> 7,02
<tb> 0 <SEP> 6,72
<tb>
EMI9.5
48 6,52 23,3
EMI9.6
<tb> 72 <SEP> 7,13 <SEP> 27,7
<tb> 89 <SEP> 7,22 <SEP> 31,3
<tb> III <SEP> 380 <SEP> 200 <SEP> 6 <SEP> 26 <SEP> 28 <SEP> 0,95 <SEP> 0 <SEP> -- <SEP> 7,26
<tb> 0 <SEP> 6,72
<tb> 74,5 <SEP> 6,43 <SEP> 31,3
<tb> 91,5 <SEP> 6,70 <SEP> 32,7
<tb>
EMI9.7
IV 760 400 6 30,5 27-29 1,00 0 r 7,1 6,55 6,55
EMI9.8
<tb> 72,5 <SEP> 6,80 <SEP> 29,
2
<tb> 89 <SEP> 7,24 <SEP> 30,6
<tb>
(@-) : avant stérilisation. -
EMI9.9
5ais : ltastérique S-) : "0" indique après stérilisation.4
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Opérations d'isolement.-
On a élaboré plusieurs méthodes pour récupérer l'antibiotique dans la liqueur de fermentation, et qui sont basées sur les propriétés physiques et chimiques de l'antibiotique. En général, il est préférable de filtrer la liqueur de fermentation pour enlever le mycélium et les autres constituants insolubles de la fermentation, par filtration à pH de récolte. On utilise un adjuvant de filtration tel que la terre d'infusoires. On peut alors ad- sorber l'antibiotique sur un adsorbant et l'éluer de celui-ci.
Des méthodes d'extraction par solvant, de chromatographie et de relargage sont aussi uti- lisées, comme on le verra dans les exemples précis qui suivent
Une méthode d'isolement préférentielle consiste à adsorber l'anti- biotique de la liqueur de fermentation filtrée, sur du charbon activé, puis à éluer les principes actifs au moyen d'un solvant polaire. On adsorbe les principes actifs sur du charbon à pH normal de la liqueur de fermentation qui peut être de 6,5 à 8,0 environ. L'éluant est de préférence un solvant polaire miscible à l'eau, tel qu'un mélange à 95% d'acétone et 5% d'eau.
Il ne faut aucun ajustement particulier du pH de l'éluant. Au lieu de l'acé- tone aqueuse, on peut utiliser le méthanol acidifié à pH 2 ou 3, ou à un pH supérieur à 9. D'autres alcools, tels que l'alcool éthylique, les propanols, les butanols, etc..., peuvent aussi servir d'éluants. On peut les couper d'eau à raison de 50% ou plus si on le désire. D'autres solvants polaires hydroxylés miscibles à l'eau comprennent les cellosolves tels que l'éthoxy- éthanol, etc.. Les acides dilués tels que l'acide chlorhydrique 0,05 N et l'acide acétique peuvent servir d'éluant pour récupérer l'antibiotique adsor- bé sur le charbon de bois.
D'autres solvants polaires qui peuvent servir à récupérer les principes actifs sur le charbon de bois comprennent la pyridi- ne, les solutions aqueuses de phénol, et d'autres encore, de type similaire.
On peut conduire l'adsorption et l'élution de diverses manières, fa- milières à l'homme de l'art. On peut simplement agiter le charbon de bois et la liqueur de fermentation filtrée, puis la refiltrer et récupérer les principes actifs dans le gâteau en faisant passer l'éluant à travers celui- ci, ou en l'agitant vers l'éluant. ûne autre méthode courante consisterait à faire passer la liqueur de fermentation à travers une colonne garnie de charbon de bois, puis à faire passer l'éluant à travers la colonne. Avant l'élution, on peut laver à l'eau pour éliminer les impuretés solubles dans l'eau qui ne sont pas fortement adsorbées sur le charbon de bois.
Après avoir récupéré les principes actifs adsorbés sur le charbon de bois, il est généralement désirable de concentrer l'éluant. Si on le désire, la concentration peut aller jusqu'à siccité, et on peut conserver la matière jusqu'à ce qu'elle soit prête à une nouvelle purification. Etant donné l'ac- tivité antitrypanosomique très élevée de la matière, elle peut convenir pour le traitement des animaux à ce stade-dû processus. En effet, l'antibiotique est tellement actif que l'on a trouvé que la liqueur de fermentation elle- même était efficace, in vivo, contre le trypanosoma equiperdum.
On peut conduire une nouvelle purification par chromatographie au charbon activé. Dans cette méthode, on prépare une colonne de charbon acti- vé, on dissout l'antibiotique concentré dans un solvant approprié tel qu'un mélange d'acétone et d'eau à 50/50, et on le fait passer à travers la colon- ne. On développe alors la colonne en y faisant passer en continu un solvant similaire jusqu'à ce que les impuretés faiblement adsorbées sur la colonne soient éluées et enlevées. Quand les principes actifs antibiotiques commen- cent à passer à travers la colonne, comme on le détermine par des tests d'activité simples du type décrit plus loin, on fait alors passer à travers
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la oouche de charbon un éluant plus fort du type décrit plus haut, et on ré- cupère ainsi les principes actifs.
L'éluant peut être concentré ou séché par lyophilisation. Fré- quemment, on récupère des cristaux de l'antibiotique à la suite de l'opéra- tion de concentration.
On peut réaliser une nouvelle purification de l'antibiotique par plusieurs méthodes, dont certaines seront illustrées ci-après. üne méthode préférentielle consiste à utiliser du butanol normal et une colonne fraction- née de terre d'infusoires, comme décrit à l'exemple II. On comprendra, bien entendu, que ces méthodes servent simplement d'exemple et n'ont pas pour but de restreindre la présente invention à telle ou telle méthode particu- lière de purificationo
EXEMPLE V.-
Purification préliminaire - Colonne d'adsorption.-
On réunit la liqueur fermentée de plusieurs bacs tels que décrit plus haut, pour avoir un volume de masse fermentée de 1450 litres à pH 7,1.
On filtre la masse à l'aide de "Hyflo Super-Cel" (terre d'infusoires) pour donner 1300 litres de filtrat. Le titrage indique un total de 5,64 gr d'an- tibiotique pur dans la solution de 1300 litres. On ajoute 1950 gr de "Dar- co G-60" (charbon activé), et on agite le mélange pendant 1/2 heure. On ajoute 5850 gr de "Celite 545" (terre d'infusoires), et que le mélange est devenu homogène par agitation, on le filtre. On délaie le gâteau de char- bon et de terre d'infusoires dans 40 litres d'eau pendant 5 minutes et on filtre. On mélange le gâteau lavé avec 20 litres d'eau pour faire une bouil- lie homogène épaisse que l'on verse dans une colonne en verre de 23 cm de diamètre intérieuro La colonne résultante a environ 60 cm de haut.
On dé- veloppe cette colonne avec une solution à 95% d'acétone et 5% d'eau, On utilise au total 68,5 litres de cette solution pour développer la colonne.
On recueille 65 premiers litres de produit de percolation, les dix premiers litres forment une première fraction et les 55 litres suivants une deuxième fraction. Ces fractions contiennent respectivement 17% et 46% des 5,64 g de principes actifs primitifs. On concentre la première fraction sous pression réduite pour donner une solution aqueuse de 2 litres, et on concentre de même la deuxième fraction pour obtenir 3,5 litres de solution aqueuse.
On lyophilise alors séparément chaque concentré, et on obtient ce qui suit Fraction n 1 : 46 g, dont le titrage montre qu'ils contiennent l'équivalent de 0,94 g d'antibiotique cristallin; Fraction n 2 : 59,5 g dont le titrage montre qu'ils contiennent l'équivalent de 1,92 g d'antibiotique cristalline EXEMPLE VI.-
Purification préliminaire - Méthode d'adsorption- élution.-
On prend 350 litres de masse de fermentation à pH 7,4, et on les fil- tre à l'aide de "Hyflo Super-Cel" pour donner 300 litres de filtrat. On ajuste le pH à 6-7, et on ajoute 600 g de "Darco-G-60". On agite le mélan- ge pendant 1/2 heure,on ajoute environ 1200 g de "Hyflo Super-Cel", et on
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agite la bouillie jusqu'à homogénéité et on filtre.
On délaie le gâteau dans 10 litres d'eau pendant 5 minutes et on filtre. On délaie le gâteau lavé dans une solution de 5700 cm3 d'acétone et 300 cm3 pendant 20 minutes, et on filtre. Le volume de ce premier produit d'élution est de 5,5 litres.
On élue encore à deux reprises le gâteau résiduel, de la même manière, et on obtient un deuxième et un troisième produit d'élution de 5,4 litres et 4,6 litres respectivement.
On réduit les trois produits d'élution pour obtenir une solution de 15,5 litres. On ajuste le pH à 6-6,5 et on concentre la solution sous vide jusqu'à obtenir une solution aqueuse de 1,5 litre. On ajuste le pH du concentré à 6,5 et on lyophilise la solution. Le rendement est de 25,5 g.
EXEMPLE VII.- Purification préliminaire - Extraction par solvant.- On traite la masse de fermentation du bac 60 (préparée essentiel- lement comme dans les exemples I-IV) exactement de la façon décrite à l' exemple VI, sauf qu'on ne lyophilise pas le concentré aqueux final. Le volu- me du concentré est de 2 litres, et on ajuste cette solution à pH 2 (à l'ai- de d'acide chlorhydrique) et on l'extrait à deux reprises, chaque fois avec 1 litre de n-butanol. On ajuste le résidu aqueux à pH 7 à l'aide de soude aqueuse, et on sature avec environ 1200 g de sulfate d'ammonium. On extrait à trois reprises le mélange résultant, chaque fois avec 1 litre de butanol.
On élimine une certaine quantité de matière insoluble qui se forme à l'in- terface durant l'extraction. Le tableau suivant indique les résultats de ces extractions :
EMI12.1
<tb> Solution <SEP> Solides <SEP> to- <SEP> Antibiotique
<tb>
<tb> taux <SEP> en <SEP> pur <SEP> total, <SEP> en
<tb>
<tb> grammes <SEP> mg, <SEP> (calculé)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> concentré <SEP> primitif <SEP> 57,4 <SEP> 976
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> premier <SEP> lavage <SEP> au <SEP> butanol <SEP> pH <SEP> 2 <SEP> 29,1 <SEP> 46
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> deuxième <SEP> lavage <SEP> au <SEP> butanol <SEP> pH <SEP> 2 <SEP> 7,5 <SEP> 45
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> résidu <SEP> aqueux <SEP> 23,5 <SEP> 876
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> premier <SEP> extrait <SEP> au <SEP> butanol <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 7,
<SEP> 26 <SEP> 497
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> deuxième <SEP> extrait <SEP> au <SEP> butanol <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 208
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Troisième <SEP> extrait <SEP> au <SEP> butanol <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> 1,43 <SEP> 80
<tb>
On réunit le premier et le deuxième extrait, on élimine le solvant, on concentre et on lyophilise pour obtenir une matière qui titre 60 micro- grammes d'activité.par mg.
EXEMPLE VIII.-
Nouvelle purification Colonne d'adsorption.
On prépare une colonne d'adsorption comme suit : on mélange intimement, dans un malaxeur, 3000 g de "Celite 545" et 1000 g de "Cardo G-60". On y ajoute 2000 cm3 d'une solution à 50% d'acétone et 50% d'eau, et on mélange intimement le tout. On tasse, avec compression, le mélange homogène final dans une bonbonne de 20 litres renversée dont on a découpé le fond pour former une colonne de 28 cm de diamètre et 33-35 cm. de haut.
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On réunit les échantillons préparés par le procédé des exemples V et VI pour donner environ 125 r d'antibiotique bruto Cette matière con- tient au total environ 126 x 106 unités d'activité, soit 1000 unités par mg, et on la dissout dans 1 litre de solution à 50% d'acétone et 50% d'eau, et on ajoute la solution résultante en haut de la colonne. On développe la colonne avec 46 litres de solution à 50% d'acétone et 50% d'eau.
On fractionne le produit de percolation comme suit
EMI13.1
<tb> Fraction <SEP> Volume <SEP> en <SEP> litre <SEP> Solides <SEP> totaux <SEP> Unités <SEP> d'activité
<tb> en <SEP> g <SEP> totale
<tb>
<tb> A <SEP> 8,5 <SEP> 7,56
<tb>
EMI13.2
B 6, 9 po, 6 19, 4 x 106 c la, 2 7, 7 799,8 x 106 D 9, 4 3, 8 31,2 x 1Q6
EMI13.3
<tb> 29,66 <SEP> 130 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
On élimine le solvant des trois dernières fractions sous pression réduite) et on lyophilise avec les résultats suivants :
EMI13.4
<tb> Fraction <SEP> Poids <SEP> en <SEP> grammes <SEP> Unités <SEP> par <SEP> mg
<tb>
<tb> B <SEP> la,3 <SEP> 1500
<tb>
<tb> C <SEP> 7,7 <SEP> 8640
<tb>
<tb> D <SEP> 3,6 <SEP> 8500
<tb>
<tb> 21,6
<tb>
La récupération totale d'unités d'activité dans les trois échan- tillons séchés est d'environ 112 x 106 unitéso (1 microgramme d'antibioti- que cristallin = 45 unités d'activité).
EXEMPLE IX.-
Nouvelle purification - - Colonne fractionnée.-
On agite ensemble du n-butanol et de l'eau dans un entonnoir sépa- rateur et on les sépare pour donner deux solutions mutuellement saturéeso On ajoute environ 500 cm3 de n-butanol à environ 15 litres de butanol sa- turé d'eau, de sorte que la phase solvant utilisée dans cette colonne est formée de butanol incomplètement saturé d'eau.
On mélange intimement 1 Kg de "Celite 545" lavée à l'écide, avec 500 cm3 de phase aqueuse:, et on tasse le mélange pour former une colonne de 42 cm2 de section et d'environ 83 cm de haut.
On met ensemble des échantillons provenant des exemples V et VI, pesant 3,6 g et contenant environ 8850 unités d'activité par mg, soit un total d'environ 14,9 g d'antibiotique partiellement purifié contenant en- viron 129 x 10 unités d'activité, et on ajoute le tout à environ 153 cm3
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de phase aqueuse, puis on agite le mélange constamment à la température am- biante tout en amenant le pH à 2,0. Après une nouvelle agitation, on fil- tre le mélange pour éliminer une petite quantité de matière insoluble.
Sur 3 cm3 du filtrat, on effectue le titrage et la, détermination des soli- des totaux et on mélange les 150 cm3 qui restent avec 300 g de "Celite 545" lavée à l'acide. On tasse le mélange résultant en haut de la colonne, on y ajoute encore 25 cm, pour donner une hauteur totale de 108 cm.
On déve- loppe alors la colonne avec la phase solvant, et on fractionne le produit de percolation comme suit
EMI14.1
<tb> Fraction <SEP> Volume <SEP> en <SEP> cm3 <SEP> Volume <SEP> accumulé <SEP> Solides <SEP> totaux <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> mg/cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F1 <SEP> 1.120 <SEP> 4,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F2 <SEP> 1.070 <SEP> 2.190 <SEP> 0,52
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F3 <SEP> 675 <SEP> 2.865 <SEP> 0,48
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F4 <SEP> 800 <SEP> 3.665 <SEP> 0,38
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F5 <SEP> 900 <SEP> 4. <SEP> 565 <SEP> 0,40
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F6 <SEP> 1.070 <SEP> 5. <SEP> 635 <SEP> 0,22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F7 <SEP> 1.020 <SEP> 6. <SEP> 655 <SEP> 0,23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F8 <SEP> 1.040 <SEP> 7.
<SEP> 695 <SEP> 0,21
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F9 <SEP> 1.200 <SEP> 8. <SEP> 895 <SEP> 0,14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F10 <SEP> 1.060 <SEP> 9.955 <SEP> 0,45
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fil <SEP> 640 <SEP> la <SEP> *595 <SEP> 1, <SEP> 21 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F12 <SEP> 4.000 <SEP> 14.595 <SEP> 0,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F13 <SEP> 0,94
<tb>
On réunit les fractions F10, Fil et F12, on concentre sous pres- sion réduite pour éliminer le solvant, et on lyophilise pour donner 3,34 g de produit.
EXEMPLE X.
Cristallisation du nouvel antibiotique.-
On dissout 3,34 g d'antibiotique partiellement purifié dans 80 cm3 d'eau à 65 C, et on rajuste le pH de la solution à 1,5 avec de l'acide . chlorhydrique diluée On filtre le mélange pour éliminer une certaine quan- tité de gomme insoluble. On rajuste le pH à 4,0 avec de la soude aqueuse diluée, on ajoute un germe cristallin, et on laisse reposer la solution une nuit à 4-5 C. Le lendemain matin, on filtre les cristaux, on les lave à l'eau froide, et on les sèche sous dessiccateur à vide sur de la "Drie- rite" sous une pression inférieure à 1 mm, pendant 24 heures environ ; ren- .dément 1,19 g.
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EXEMPLE XI. -
Cristallisation du nouvel antibiotique après extraction des impuretés au butanol.
On réunit plusieurs échantillons purifiés par la première adsorp- tion, par exemple les échantillons de l'exemple VI, et on leur fait subir une deuxième purification en colonne d'adsorption, comme décrit à l'exem- ple VIII. On concentre sous pression réduite la portion du produit de per- oolation qui est riche en antibiotique, jusqu'à un faible volume aqueux, et on lyophilise comme dans l'exemple VIII. On dissout dans 80 cm3 d'eau un échantillon pesant 1,67 gr et contenant au total environ 12,8 x 106 uni- tés d'activité, et on ajoute de l'acide chlorhydrique jusqu'à ce que la so- lution soit décinormale par rapport à cet acide. On extrait cette solu- tion à deux reprises, chaque fois avec 80 cm3 de n-butanol, on enlève ain- si 1,07 g environ de solides totaux mais seulement 9% environ de l'activi- té.
On rajuste le pH du résidu à 6,5 et on élimine le solvant de la solu- tion résultante, sous pression réduite, puis on concentre jusqu'à 5-10 cm3 et on maintient sous réfrigération. On filtre le produit cristallin, on le reprend par environ 10 cm3 d'eau à pH 3-4 en réchauffant légèrement, et on filtre. On refroidit le filtrat, on filtre les cristaux obtenus, on la- ve à l'eau froide et on sèche; rendement, 145 mg de cristaux blancs.
EXEMPLE XII.- Recristallisation du nouvel antibiotique -- Préparation d'échantillons ana- ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯lytiques.-¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ On'dissout, dans 200 om3 d'eau à 60 C, 4522 g de divers lots réu- nis d'antibiotique cristallin (préparé comme décrit à l'exemple X), et on rajuste le pH de la solution à 2,5. On filtre la solution et on rajuste le filtrat à pH 4, et on laisse reposer une nuit à 4-5 C. On filtre les cristaux et on répète à quatre reprises la même opération de recristalli- sationo La recristallisation finale comprend une étape de décoloration avec une petite quantité de charbon de boiso Le produit final est consti- tué par 1,89 g d'échantillon analytique (après séchage sous une pression de 2 mm).
De cet échantillon, on prend 1,25 g que l'on sèche encore pen- dant 2 heures au pistolet Abderhalden à la température d'ébullition du chlo- roformeo Le produit obtenu est constitué par des enchevêtrements de cris- taux filiformes. Les directions principales de vibration et les indices de réfraction principaux correspondants sont difficiles à déterminer, et ne sont pas donnés, vu la possibilité d'erreur.
<Desc/Clms Page number 16>
EXEMPLE XIII.-
EMI16.1
<tb> Dextrine <SEP> 1%
<tb>
<tb> N-Z <SEP> Amine <SEP> . <SEP> A <SEP> 1%
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 0,2%
<tb>
EMI16.2
(NH 4) 2EPO4 0,
EMI16.3
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,15%
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> 0,025%
<tb> Solution <SEP> Wiso.A-Z <SEP> 0,1% <SEP> (en <SEP> volume)
<tb>
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> : <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 100%
<tb>
On prend 100 cm3 du milieu ci-dessus, on stérilise pendant 20 minutes dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3, sous une pression de vapeur de 1,05 Kg/cm2, et on inocule avec 3 cm3 d'inoculum préparé d'avance. On fait incuber le flacon sur une secouéuse alternative à 28 C pendant 72 heures. On trouve que la liqueur fermentée est active vis-à-vis du Trypanosoma equiperdum.
EXEMPLE XIV. -
On agite ensemble des volumes égaux de n-butanol et de la liqueur fermentée ci-dessus, à pH indiqués, puis on les sépare. Le tableau ci-dessous montre les activités dans les extraits butanoliques et les résidus aqueux, ainsi que les coefficients d'extraction.
EMI16.4
<tb>
Butanol <SEP> Eau <SEP> K
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 135 <SEP> 0,06
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 5 <SEP> 51 <SEP> 100 <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 7 <SEP> 49 <SEP> 88 <SEP> 0,6
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 9 <SEP> 23 <SEP> 123 <SEP> 0,2
<tb>
EXEMPLE XV.-
On sature de sulfate d'ammonium une certaine quantité de la li- queur fermentée ci=dessus. On extrait cinq litres de cette solution, à deux reprises, chaque fois avec 2,5 litres de n-butanol. On prend un autre lot de cinq livres que l'on extrait à deux reprises, chaque fois avec 2,5 litres d'acétone.
On réunit les deux extraits au butanol, et on trouve qu'ils con- tiennent la quasi-totalité de l'activité de la liqueur fermentée. On réu- nit les deux extraits à l'acétone et on trouve aussi qu'ils contiennent tonte l'activité de la liqueur fermentée.
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EXEMPLE XVI.-
On agite, à pH de récolte, Il,9 litres d'une liqueur fermentée similaire avec 55 g de "Darco G-60" pendant 1/2 heure. On filtre la sus- pension à l'aide d'une petite quantité de "Celite" et on lave sur enton- noir Buchner avec 500 cm3 d'eau.
On délaie alors le gâteau lavé, pendant 20 minutes environ, avec
300 cm3 d'acétone, et on filtre. On élue de nouveau à deux reprises le gâteau résiduel, chaque fois par 300 cm3 d'acétone à 95%. On réunit les trois liqueurs d'élution à l'acétone, et on les titre; les résultats mon- trent une récupération de 35% de l'activité de la liqueur fermentée. On concentre la solution globale sous vide jusqu'à obtenir un concentré aqueux que l'on lyophilise en obtenant 3,64 g de solides, dont le titrage détermi- ne qu'ils représentent une matière onze fois plus pure que l'antibiotique de la liqueur fermentée.
On peut remplacer le butanol ou l'acétone, dans l'extraction ci- dessus, par du bêta-méthoxyéthanol ou du bêta-éthoxyéthanol.
EXEMPLE XVII.-
On dissout 50 mg de l'antibiotique, base libre, de l'exemple XII, dans environ 5 cm3 d'eau, en ajoutant de l'acide chlorhydrique 0,1N, puis
5 cm3 d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique. On centrifuge le précipité cristallin résultant et on le lave avec environ 5 cm3 d'eau froi- de.
On recristallise le produit à trois reprises dans l'eau, suivi d'une filtration à chaud (60-75 C) dans l'étape finale, et on sèche pendant 24 heures sous 1 mm, et finalement on sèche pendant 4 heures sur P2O5, à 110 C et sous 1 mmo Rendement :35 mg de cristaux de picrate jaune vif.
.Analyse :
Calculée pour C17H18O15H9S : C 32,9; H 2,91; N 20,3; S 5,17; 0 (par diffé- rence) 38,1;
Effective :C 33,19; H 3,13; N 20,19; s 5,70; 0 (par différence) 37,79.
Point de fusion 143-144 C (non corrigé) avec légère décomposition.
Ultraviolet # max (millimicrons) 253.356 (20 microgrammes cm3 dans l'étha- nol).
EXEMPLE XVIII.-
On dissout 150 mg de l'antibiotique, base libre, dans 5 cm3 d'aci- de acétique glacial et on traite par 5 cm3 d'acide acétique glacial saturé d'acide chlorhydrique.
On enlève par filtration le précipité blanc de chlorhydrate qui se 'forme, on le lave avec 10 cm3 d'acide acétique glacial et 10 cm3 d'éther éthylique anhydre, et on sèche pendant 24 heures sur de la "Drierite", sous 1 mm et à la température ambiante.
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EXEMPLE XIX. -
On prend une solution de 150 mg de la base libre, dans environ 10 cm3 d'éthanol absolu, on traite par un mélange de 5 cm3 d'éthanol abso- lu et environ 4 gouttes d'acide sulfurique concentré. On filtre le préci- pité de sulfate obtenu, on le lave à l'éther éthylique absolu, et on le sè- che sous 1 mm pendant 24 heures. Le produit est amorphe.
EXEMPLE XX.-
On prend une solution aqueuse concentrée contenant environ 150 mg -de la base libre, on la traite par une solution aqueuse saturée d'orangé de méthyle pour obtenir un précipité cristallin coloré d'hémianthate.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de préparation d'un antibiotique, dans lequel on fait fermenter un milieu nutritif aqueux avec un microorganisme de l'espèce Streptomyces T-3018.