Procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine
La présente invention vise un procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine à partir de milieux naturels, à savoir le foie de solipèdes (bovidés, porcins et autres).
On connaît, notamment par les publications de
Rickes et de ses collaborateurs (voir par exemple
Science (N. Y.), 1948, t. 107, p. 396), un groupe de composés appelés vitamines B 12, ou encore cobalamines du fait que leur molécule comporte un atome central de cobalt.
Ces composés ont acquis une importance considérable en thérapeutique, en particulier dans le traitement de la leucémie.
Bien que la nomenclature ne soit pas encore parfaitement fixée, on désigne en général par vitamine
B 12 ou cyanocobalamine un composé dans lequel l'atome de cobalt porte un radical nitrile et comporte donc un groupe cyanure Co-C=N-.
Parmi les dérivés apparentés au précédent, le plus intéressant est l'hydroxocobalamine, généralement appelée vitamine B 12b (parfois aussi B 12a), qui comporte le groupe Co - OH et à laquelle le radical hydroxyle confère des propriétés basiques lui permettant de pénétrer plus facilement dans le métabolisme des individus.
L'hydroxocobalamine peut être obtenue à partir de la cyanocobalamine par différentes méthodes, comportant en général une réduction suivie d'une oxydation.
On a toutefois constaté que l'hydroxocobalamine obtenue à partir de milieux naturels, et notamment du foie, pouvait avoir une plus grande activité thérapeutique que le produit de synthèse. On a donc cherché à extraire l'hydroxocobalamine de divers milieux naturels, tels que les cellules de bacilles propioniques ou mégathériums et les cultures de divers streptomycès.
Cependant les méthodes préconisées ne sont applicables qu'à des poudres sèches. Or, la dessiccation entraîne une perte sensible en vitamine B 12.
La présente invention a pour but de permettre l'extraction de l'hydroxocobalamine native par un procédé s'appliquant notamment à des milieux naturels contenant une très forte proportion d'humidité.
Conformément à la présente invention, le procédé de fabrication de l'hydroxocobalamine est caractérisé en ce que l'on effectue une addition massive de sulfate d'ammonium à l'extrait concentré ce qui assure le relargage et l'adsorption des protéines et des complexes protéines-hydroxocobalamine, le gâteau formé étant remis en solution, après quoi on provoque par addition d'un acide fort la destruction des complexes formés par l'hydroxocobaîamine avec les aminoacides ou protéines du foie traité, et la fixation de l'acide fort sur le groupe hydroxo.
L'addition massive de sulfate d'ammonium assure non seulement le relargage mais encore l'adsorption de l'hydroxocobalamine ainsi que de ses complexes (par relargage on entend l'élimination d'un composé organique d'une solution aqueuse au moyen de l'addition d'un sel). L'invention permet ainsi d'effectuer l'élution de l'hydroxocobalamine à partir de milieux aqueux, alcooliques ou hydro-alcooliques au moyen d'un solvant normalement miscible en toute proportion avec lesdits milieux, tel que l'acétone.
L'utilisation de sulfate d'ammonium dans la technique des vitamines B 12 a été proposée précédemment mais à des doses infiniment plus faibles que celles visées par l'invention, et pour un but tout dif férent, à savoir la stabilisation de solutions desdites
vitamines.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le foie haché est extrait par l'alcool aqueux à pH 4 environ; après agitation, on filtre. L'extrait alcoolique ainsi obtenu est concentré, de préférence sous vide, afin d'en chasser l'alcool.
On laisse reposer à basse température. Si un précipité se forme on l'élimine par centrifugation ou filtration.
La liqueur finalement recueillie contient l'hydroxocobalamine qui en majeure partie existe sous forme de complexe (en effet la fonction basique de l'hydroxocobalamine contenue dans le foie lui permet de se fixer sur la fonction acide aminé des protéines dont le point isoélectrique est inférieur à 7); on en isole cette vitamine, accompagnée de protéines, par la méthode suivante:
On détermine la teneur en extrait sec de cette liqueur, on en déduit par différence la teneur en eau et on ajoute du sulfate d'ammonium à raison de 50 à 70 parties en poids pour 100 parties d'eau. On agite et porte à une température de 50 à 700 C pour dissoudre le sulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est refroidie à 00 C ou un peu au-dessus.
I1 se produit un relargage; le gâteau formé contient, d'une part une quantité importante de sulfate d'ammonium et, d'autre part, divers produits organiques dont, pratiquement, la totalité de l'hydroxocobalamine présente dans la liqueur initiale.
En effet, grâce à l'addition massive de sulfate d'ammonium, les protéines du foie étant relarguées, entraînent les cobalamines liées comme expliqué précédemment, ce qui permet une première concentration de ces cobalamines et une première purification.
Par addition d'acide fort en excès qui abaisse le pH on déplace la liaison faiblement acide des protéines pour bloquer l'hydroxocobalamine, non plus sur l'acide aminé mais sur l'acide fort utilisé. La fixation a lieu sur le groupe hydroxo.
On laisse les réactifs en présence pendant un certain temps, puis on reprend par un solvant organique tel que l'acétone; on agite et on laisse décanter.
Du fait de la haute teneur en sulfate d'ammonium, il se forme deux couches : une couche inférieure aqueuse contenant pratiquement la totalité du sulfate d'ammonium et une couche supérieure acétonique contenant la vitamine recherchée.
La couche inférieure est rejetée, après vérification de l'absence de vitamine. (Si, du fait d'un mauvais réglage, cette couche en contenait encore, une deuxième extraction acétonique serait effectuée.)
On laisse la couche supérieure au repos à basse température pour assurer une séparation complète dc la vitamine d'avec les protéines.
On ajoute alors la quantité d'acétone nécessaire pour porter le titre à environ 80 O/o d'acétone. S'il se produit une précipitation de protéines, on élimine le précipité par filtration ou centrifugation ; ces protéi- nes sont épuisées par un peu d'acétone à 80 o/o environ et on s'assure qu'une solution aqueuse de ces protéines ne contient pratiquement plus d'hydroxo
cobalamine.
La solution acétonique filtrée est ensuite chromatographiée sur une colonne d'alumine tamponnée à un pH voisin de la neutralité. On élue avec de l'acé- tone à 50 /o environ. La fraction contenant la vitamine est amenée à un pH compris entre 3,5 et 4, puis l'acétone est chassée sous vide. On effectue un deuxième relargage au sulfate d'ammonium, puis le gâteau est repris par l'acétone comme indiqué précédemment. On chromatographie une deuxième fois sur alumine; la fraction de coeur de la chromatographie contenant l'hydroxocobalamine, est portée à un pH de 8,5 à 9, de façon à libérer cette vitamine des complexes qu'elle aurait pu former avec les acides contenus dans la liqueur.
Le titre de la solution est alors ajusté à 10 à 12 volumes d'acétone pour 1 volume d'eau. Par repos à froid, l'hydroxocobalamine cristallise.
D'autres particularités de l'invention résulteront encore de la description ci-après, donnée à titre d'exemple.
Exemple. - 1000 kg de foie de boeuf sont haches puis repris, à la température ambiante, par 2000 litres d'alcool éthylique à 50O amené à pH 4 par addition d'acide chlorhydrique. Après agitation et chauffage à 500 C, on filtre (sur filtre-presse ou filtre rotatif) puis on lave le résidu resté sur le filtre par passage de 200 litres d'alcool à 500. On obtient 2200 litres d'un extrait de couleur jaune qui est ramené à 250 litres par concentration sous vide à basse température.
Ce concentré est abandonné au repos pendant 12heures à une température comprise entre 0O et 5" et il est éventuellement clarifié par centrifugation.
A la solution obtenue, on ajoute 125 kg de sulfate d'ammonium, en agitant et en portant la température entre 55 et 600. On laisse refroidir à une température comprise entre 00 et 50. Il se produit un relargage ; on filtre sur filtre-presse ou filtre rotatif. On obtient 40kg de gâteau humide, contenant une forte proportion de sulfate d'ammonium ; le filtrat est rejeté, après contrôle de l'absence d'hydroxocobalamine, effectué par exemple au photomètre d'absorption.
Le gâteau est mis en solution par un volume d'eau sensiblement égal au sien ; la solution est ajustée à pH 3,8 au moyen d'acide chlorhydrique; on ajoute 40 litres d'acétone, on agite puis laisse décanter. On prend alors la densité de la couche supérieure, qui doit être sensiblement 0,910, correspondant à 60 o/o environ d'acétone.
Après contrôle de l'absence d'hydroxocobalamine, la couche inférieure aqueuse est rejetée. La couche supérieure est abandonnée pendant 12 heures à une température de 0O à 5O, puis on y ajoute le volume d'acétone voulu pour porter le degré acétonique à 80 O/o.
On filtre, puis on lave le résidu par 5 litres d'acétone à 80 0/o. On obtient 80 litres d'une solution acétonique (solution A) titrant 1 à 2 o/o d'extrait sec et 15 gamma d'hydroxocobalamine par centimètre cube. On chromatographie la solution précitée sur une colonne d'alumine tamponnée à pH 7, puis on élue avec de l'acétone à 50 /o. La vitamine se retrouve dans une fraction de coeur de 6 litres.
Cette solution est amenée à pH 3,5, puis concentrée sous vide ; on obtient 2 litres de solution aqueuse contenant l'hydroxocobalamine. On ajoute 1,3 kg de sulfate d'ammonium et on fait relarguer comme pré- cédemment. On obtient 0,6 kg d'un gâteau humide qui est repris par son volume d'eau amenée à pH 3,6.
On laisse en contact 2 heures puis on reprend par 600 cm' d'acétone. Après agitation et décantation, on ajuste, par addition d'acétone, la couche supérieure à une teneur de 80 O/o d'acétone.
On obtient 1200 cm3 d'une solution acétonique que l'on chromatographie sur une petite colonne d'alumine; on sépare une fraction de cceur de 250 cm3 que l'on amène à pH 9 par addition de soude. On porte le volume à 1250 cm3 par addition d'acétone et laisse cristalliser. Après filtration et séchage, on obtient 1 gramme d'hydroxocobalamine.
Il est évident que l'invention n'est pas limitée à la réalisation décrite, et qu'on peut apporter à celle-ci diverses variantes ; ainsi, le traitement de la solution acétonique (solution A) peut s'effectuer par toute méthode connue; on peut, d'autre part, selon les résultats des essais relatifs à la présence d'hydroxocobalamine dans les diverses fractions solides ou liquides, supprimer ou au contraire multiplier les extractions complémentaires mentionnées plus haut.