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La présente invention a notamment pour objet un nouveau pro- cédé pour la préparation de produits d'oxydation de la série des stéroïdes, en particulier pour la dégradation de la chaîne latérale de composés du prégnane et pour la préparation par voie biochimique de composés non saturés de la série de l'androstane.
Le procédé est caractérisé en ce que l'on fait agir, sur des composés saturés ou non saturés de l'androstane ou du prégnane ayant en position 3 et en position 17 ou 20 un hydroxyle ou un oxo libre ou protégé, la culture d'un eumycète ou les enzymes qu'elle renferme.
Pour la culture des champignons, par exemple des phycomycètes comme des mucoracées (Rhizopus suinus et analogues), des ascomycè- tes ou des Fungi imperfecti comme des tuberculariacées, par exemple des espèces de Fusaria (F.Solani, F. caucasicum et analogues), sont appropriés les milieux connus en soi comme idoines, par exemple ceux qui renferment des sucres tels le glucose ou le lactose, des peptones, de l'eau de gonflement du mais, des produits du soja et analogues, ainsi que les milieux renfermant des sels minéraux ou des solutions nutritives synthétiques. On travaille en particulier dans des conditions aérobies, par exemple dans une culture d'agitation ou dans une culture immergée avec agitation et amenée d'air.
Les eumycètes se distinguent des autres microorganismes, par exemple des bactéries, par une bonne croissance dans des conditions de culture relativement simples. La réaction du procédé selon l'invention s'effectue dans la culture de champignons décrite ou à l'aide des enzymes qu'elle renferme, le cas échéant enrichis ou séparés, ou plus simplement dans une suspension du mycelium séparé du champignon, dans une suspension du mycélium de champignon homogénéisé ou dans des filtrats desdites suspensions ou des extraits aqueux du mycélium.
Les substances de départ du nouveau procédé sont des composés saturés ou non saturés de la série du prégnane et de l'androstane, par exemple la progestérone, la 11-déhydroprogestérone, les 11-, 12-
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ou 14-hyàroxy-progestérones, les A - ou A 4-prégnène-3-ol-20-ones, les -prégnéne-3,20-diols, la 11-désoxy orticostrone, la corticostérone, la 11-déhydrocorticoséronee la 6 - ou 0 -androstène-3el7dione, la testostérone, la A -androstène-3-ol-17-one, l'adrénostérone, la prégnane-3,20-diDne, la prégnane-3-ol-20-one, l'androstane- 3,17-dione, l'alloprégnane-3,20-dione, la 3 ss -acétoxy-alloprégnane- 20-one et les composés correspondants avec des hydroxyles ou des oxo protégés.
Dans les substances de départ, l'hydroxyle protégé se trouve être estérifié, par exemple par un acide carboxylique aliphatique, aromatique ou hétérocyclique comme l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide benzoïque ou l'acide furanne-carboxylique, ou éthérifié, par exemple sous forme de tétrahydropyrannyloxy, de benzyloxy, ou de triphénylméthoxy.
Le groupe oxo protégé est avantageusement un groupe oxo cétalisé, dérivant notamment d'un alcool divalent, comme le groupe éthy- lène-dioxy. En outre, les substances de départ peuvent renfermer des doubles liaisons, par exemple en position 4, 5, 6, 7, 8, 9:11, 11 ou 14, ou porter des substituants supplémentaires, comme des hydroxyles, des oxo ou des carboxyles libres ou protégés, ainsi que des époxy ou des atomes d'halogène, par exemple en position 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15 ou 21. Les substances de départ indiquées ci-dessus sont d'une configuration stérique quelconque et englobent aussi celles appartenant aux séries dites Nor- et/ou Homo-.
Le procédé peuttaussi être effectué
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avec des mélanges qui renferment une ou plusieurs des substances de départ indiquées ci-dessus. Ainsi,par exemple, en partant de la fraction neutre formé lors de l'oxydation de la cholestérine, et après déshydrogénation de l'hydroxyle en position 3 notamment, on obtient
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entre autres la A '-anàrostaàiène-3,17-dione*
L'isolement des produits du procédé peut être entrepris suivant des méthodes connues.
Leur séparation peut par exemple être effectuée par extraction du mélange réactionnel avec un solvant organique, par exemple avec du chlorure de méthylène ou de l'acétate d'é- thyle. Pour une purification plus poussée de l'extrait ainsi obtenu, conviennent particulièrement bien :la chromatographie, par exemple sur de l'oxyde d'aluminium ou sur du gel de silice, l'emploi de méthodes de répartition, par exemple le procédé à contre-courant, ou la séparation à l'aide de réactifs de Girard, tel l'hydrazide de l'acide trimêthylammonium- ou pyridinium-acétique. A la suite de cette purification ou à sa place, on opère de préférence une recristallisation dans des solvants organiques ou des solvants organiques aqueux.
Avec ce nouveau procédé biochimique, on peut.en utilisant
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par exemple des Gunfi imperfecti, transformer en L1 ,4-androstadiène- 3,17-dione, en un seul stade opératoire et avec un rendement élevé, par exemple la progestérone, de même que la #5-prégnène-3 ss -ol-20-
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one, la 11-désoxy-corticostérone ou la â 4-androstène-3,I7-dione.
Cette transformation n'est possible par voie chimique que suivant un procédé en plusieurs stades et d'ailleurs avec un rendement global no-
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tablement plus bas. Le produit "réactionnel indiqué est une matière de départ importante pour la synthèse de l'oestrone en un stade opératoire unique. A partir des composés du prégnana saturés dans les positions 4,5 et 5,6 et portant en position 3 un hydroxyle ou un oxo libre ou protégé, on peut obtenir, suivant la durée d'incubation, les 17-cétones saturées correspondantes¯=ou leurs dérivés déshydrogénés dans le
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cycle A, par exemple les ls l'4- androstadiène-3,I7-diones.
De ma- nière analogue, on obtient à partir de composés de l'androstane saturés correspondants, les dérivés déshydrogénés dans le cycle A. Avec une incubation plus longue, on obtient, à partir de la progestérone, de
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la A le 4-androstadiène-3,17-dione et à partir des autres substances de départ indiquées, un nouveau composé, à savoir la 1,2-déhydro-testolactone, fondant à 219-220 et ayant un pouvoir rotatoire spécifique
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1 L] 2= - 49 ¯+ 3 ( e = 1,025 dans le chloroforme). Ce composé pré- sentedans le spectre ultra-violet, à 242 m , également une forte ban- de (log . = 4,23) et il renferme 75,70 % de carbone et 8,05% d'hy- drogène (calculé pour C19H2 0 ; C = 75,97%; H =. 8,05%).
En utilisant d'autres champignons, pa exemple les phycomycètes, on obtient à la place de ce composé la testolactone déjà connue.
L'invention concerne également à titre de produits indus- triels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini plus haut.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent.
Exemple 1.
On répartit en quantités égales dans 13 fioles coniques de 1 litre de capacité chacune, 4 litres d'une solution nutritive constituée
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par 30 cm3 d'eau de gonflement de mais, 50 grammes de peptone, 200 mg de glucose brut et de l'eau du robinet, puis stériliseo Le pH de ces solutions est de 6,4. On les incube avec une culture du champignon Fusarium solani et agite mécaniquement à 25 . Au bout de 48 heures, le champignon s'est fortement multiplié. Dans des conditions stériles, on répartit entre les 13 fioles coniques, une solution de 1,0 g de progestérone dans 45 cm3 c'acétone. On agite encore 48 heures à 25 et sépare alors le mycélium par filtration.
Le pH du filtrat de culture atteint maintenant 7,90
On agite la solution avec une fois 1500 cm3, à deux reprises avec chaque fois 1000 cm3 et finalement à deux reprises avec chaque fois 500 cm3 de chlorure de méthylène On lave l'extrait à deux reprises avec chaque fois 300 cm3 d'acide chlorhydrique décinormal, à deux reprises avec chaque fois 300 cm3 d'une solution à 1% de bicarbonate de sodium et à trois reprises avec chaque fois 300 cm3 d'eau, le sèche sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide. On chromatographie, suivant la méthode par traversée, le résidu partiellement cristallisé (1,14 g), dissous dans un mélange 6:4 de benzène et d'éther de pétrole, sur une colonne contenant 30 g d'oxyde d'aluminium.
On réunit les éluats obtenus avec le benzène et le mélange d'éther de pétrole et de benzène et opère une cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. On obtient des paillettes rhombiques incolores, appartenant à une seule substance, d'après la
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chromatographie sur papier, et fondant à 145 - 14 ;jdJ D = + 110 + 4 (dans le chloroforme); -n = + 112 ¯+ 4 (dans l'alcool). Ce composé est la A l4-androstadiène-3,,17-dione, substance connue. Le rendement est de 80 % environ.
Si, à la place de la solution de progestérone, on ajoute à une culture identique de Fusarium solani une solution de 1 g de
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11-dêsoxy-corticostérone ou de 1 g de 4 '-androstène-3,17-dione dans 45 cm3 d'acétone, traite la culture de la manière décrite cidessus et isole le produit de réaction, on obtient alors, également
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avec un rendement élevé, la à ' -andros-tène-317-dione.
Si l'on remplace la culture de Fusarium solani par une culture de Fusarium caucasicum ensemencée sur le même fond nutritif, la progestérone est alors transformée, avec un rendement identique , en
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0 l'4-androstadiène-3,7-dioneo Exemple 2.
A 4 litres d'une culture de Fusarium solani préparée comme dans l'exemple 1, on ajoute dans des conditions stériles une solution de 1,0 g de # 5¯prégnène-3 -ol-20-one dans 37 cm3 de méthanol. On agite encore la culture pendant 48 heures à 26 , sépare ensuite le mycélium par filtration et extrait le filtrat de culture avec du chlorure de méthylène, comme décrit dans l'exemple 1.
On chromatographie, suivant la méthode par traversée, le résidu d'extraction, dissous dans un mélange 8 :2 benzène et d'é- ther de pétrole, sur une colonne contenant 30 g d'oxyde d'aluminium.
On réunit les premières fractions (environ 140 mg) obtenues à partir du mélange de benzène et d'éther de pétrole et opère une cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. Les paillettes rhombiques obtenues, fondant à 145 - 146 , sont constituées par de la
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# 1,4-androstadiène-3,17-dione. D'autres fractions du chromatogramme renferment, en plus petite quantité , de la 1 -androstène-3 ss -ol- 17-one.
Exemple 3.
A 40 litres d'une culture de Fusarium solani préparée sui- vant l'exemple 1 dans un récipient de culture usuel, en agitant et en aérant, on ajoute une solution, dans 700 cm3 d'acétone, de 20 g de la fraction neutre obtenue par oxydation à l'acide chromique du dibromure d'acétate de cholestéryle, suivie d'une débromation, d'une hydrolyse puis d'une déshydrogénation selon Oppenauer. Après l'incubation, com- me elle est décrite dans l'exemple 1, puis isolement du produit réactionnel, on obtient 52 g de # @, -androstadiène-3,17-dione.
Exemple 4.
A 4 litres d'une culture de Fusarium caucasicum préparée suivant l'exemple 1, on ajoute une solution de 1 g de # -andro- stadiène-3,17-dione dans 35 cm3 d'acétone. Après une incubation de 7 jours, on poursuit le traitement comme décrit dans l'exemple 1 et purifie l'extrait obtenu suivant la méthode de démixtion. Par re- cristallisation dans l'acétone, on obtient finalement environ 60% d'un nouveau composé, la 1,2-déhydro-testolactone, fondant à 219-220 , de pouvoir rotatoire spécifique [[alpha]]22D = - 49 # 3 (c = 1,025 dans le chloroforme). Spectre ultra-violet: # max. = 242 m ; log # =4,23.
Microanalyse : C = 75.70% ; H = 8,05 %.
On obtientle même composé en travaillant dans les conditions de l'exemple,-!, à partir de progestérone, de -prégnène- 3,20-dione, de 4# 5-prégnène-3ss -ol-20-one, de 11-désoxy-corticostérone ou de # 4-androstène-3,17-dione, lorsqu'on incube pendant six à dix jours au lieu de deux jours.
Exemple 5.
En ensemence de Fusarium solani trois fioles coniques de 200 cm3, renfermant chacune 50 cm3 de la solution nutritive stérile décrite dans l'exemple 1, agite mécaniquement, à 26 ,pendant 48 heu- res. On ajoute alors à chaque culture une solution de 10 mg d'allo- prégnane-3,20-dione dans 0,5 cm3 d'acétone et continue d'agiter à 26 .
Après 24 heures, 48 heures et 7 jours, on filtre chaque fois une des cultures et extrait comme décrit dans l'exemple 1. On examine les trois résidus d'extraction (1-3) par chromatographie sur papier. Les extraits 1 e t2 renferment de l'androstane-3,17-dione et l'extrait 3 de la # 1,4-androstadiène-3,17-dione.
Si, au lieu d'alloprégnane -3,20-dione, on ajoute une so- lution analogue de 3ss -acétoxy-alloprégnane-20-one, on trouve éga- lement dans les extraits, après 24 et 48 heures d'incubation, de l'androstane-3,17-dione, et après 7 jours d'incubation, de la # 1,4- androstadiène-3,17-dione. Si l'on remplace l'alloprégnane-3,20-dione par de l'androstane-3,17-dione, on trouve alors dans les extraits, après 24 heures et 48 heures d'incubation, simplement la matière.de départ inchangée, et après sept jours d'incubation, de la # ,4-an- drostadiène-3,17-dione.
Exemple 6.
Dans deux récipients agitateurs, on répartit en quantités
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égales 4 litres d'une solution nutritive dite de Czapek et Dox, sté- rilise et ensemence avec une culture du champignon Rhizopus suinus.
Après une agitation à 26 pendant deux jours, le champignon s'est bien développé et l'on ajoute dans chaque récipient, dans des conditions stériles, une solution de 500 mg de 11-désoxy-corticostérone dans 15 cm3 d'acétone. On agite encore pendant 4 jours à 26 et sépare alors le mycélium par filtration. Le filtrat de culture est extrait par agi- tation comme déjà décrit et l'extrait est lavé, séché et évaporé, On fractionne le résidu (1,0 g) par le procédé à contre-courant. Pour ce- la, on le dissout dans 50 cm3. d'éthanol absolu et 150 cm3 d'eau et l'extrait avec 200 cm3 de benzène. On sépare la couche inférieure et la fait passer au travers de quatre entonnoirs séparateurs contenant chacun 200 cm3 de benzène saturé d'éthanol à 25%.
On répète cette fa- çon de procéder à quatre reprises, avec chaque fois 200 cm3 d'éthanol à 25% saturé de benzène, de sorte qu'on est finalement en présence de 5 phases benzéniques et de 5 phases alcooliques aqueuses. On les éva- pore sous vide. L'examen chromatographique sur papier indique que les phases alcooliques aqueuses contiennent peu de sous-produits fortement polaires, tandis que les trois premières phases beezéniques renferment 650 mg d'un composé qui est un peu plus fortement polaire que la ma- tière de départ et qui ne possède pas de pouvoir réducteur.
Par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on obtient la testolactone sous forme d'aiguilles fondant à 203 - 206 ; [[alpha]]D = + 40 ( c = 1,065 dans le chloroforme); bandes d'absorption dans l'infrarouge à 5,81 , 5,98 et 6,17 (nujol).
Microanalyse: trouvé C = 75,26%, H = 8,80 %.
Calculé pour : C19H2603 ' C = 75,46%, H = 8,67 %.
REVENDICATIONS.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.