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Procédé de préparation d'hydrochlorure de dihydrostrepto- mycine cristallin.
Cette invention se rapporte à la préparation de substances antibiotiques améliorées et plus particulièrement à la préparation de la dihydrostreptomycine sous la forme pure cristalline.
L'invention concerne la fabrication de l'hydrochlo- rure de dïhydrostreptomycine cristallin par la préparation d'une solution,essentiellement anhydre, d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine dans du méthanol, la réduction de la
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quantité relative de méthanol pour former une solution sur- saturée, la mise en contact de la solution sursaturée avec des traces de cristaux d'ensemencement d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine pendant une période de temps prolongée avec agitation de la solution, provoquant ainsi la cristal- lisation de l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine hors de la solution sursaturée.
La dihydrostreptomycine a été préparée à partir de streptomycine par réduction catalytique en solution aqueuse conformément au procédé décrit dans une publication de Peck, Hoffhine et Folkors dans J.A.C.S. 68 1390 (1946).
La dihydrostreptomycine peut aussi être préparée à partir du complexe Hydrochlorure de streptomycine-chlorure de calcium par réduction catalytique. de celui-ci dans une solution aqueuse de méthanol. Par l'un et l'autre de ces procédés cependant,la dihydrostreptomycine a été récupérée sous la forme amorphe seulement,et,même par purification par les procédés conventionnels ou classiques n'a pas été obtenue complètement pure ou même dans les limites d'une pureté absolue de 5%. On a néanmoins reconnu le besoin d'obtenir la dihydrostreptomycine sous une forme pure pour fournir un étalon exact pour les exterminations de pureté et pour l'évaluation clinique du composé lui-même.
Pendant une longue période de temps de nombreux essais furent faits pour purifier la dihydros treptomycine par cristallisation à partir de différents solvants et de mélanges de solvants variés. On a fait tellement d'essais dece genre sans obtenir aucune dihydrostreptomycine cris- talline qu'il apparut très vraisemblable que ce produit était un de ceux qui ne pouvait pas être obtenu sous forme pratique cristalline . L'avantage/marqué d'obtenir un produit cris- tallin, cependant, stimula de nouvelles investigations, en dépit de ces indications négatives.
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Comme résultat de cette nouvelle investigation on a maintenant découvert que, en suivant un procédé particulier il est possible de produire des petits cristaux de dihydro- streptomycine et que, en utilisant ces cristaux comme ense- mencement il est possible de préparer ladihydrostreptomycine cristalline en grandes quantités.
Le premier cristal d'hydrochlorure de dihydrostrepto- mycine fut obtenu par l'addition d'une solution d'hydro- chlorure de dihydrostreptomycine (40 mg/cc) à environ 15 volumes d'acétone et abandon au repos. Au lieu de la forma- tion habituelle d'un précipité floconneux la solution resta simplement trouble. En laissant reposer cette solution trouble,une nuit, on constata qu'un petit cristal s'était formé. ee cristal fut brisé et utilisé pour ensemencer un certain nombre d'autres solutions d'hydrochlorure de dihydros tre ptomycine dans le méthanol rendues troubles par l'acétone, et on obtint ainsi une quantité substantielle d'hydrochloure de dihydrostreptomycine cristallin.
Dans la préparation de l'hydrochlorure de dihydro- streptomycine cristallin il est avantageux d'obtenir d'abord la substance amorphe sous une forme aussi pure que possible.
Ceci peut être réalisé de différentes façons. Par exemple, l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine peut être converti en sel helianthate cristallin qui est ensuite purifié par recristallisation suivie de la réaction du même avec de l'acide chlorydrique pour récupérer l'hydrochlorure purifié amorphe de dihydrostreptomycine. D'autre part, si l'hydro- chlorure de dihydrostreptomycine est préparé par réduction de l'hydrochlorure de streptomycine,lequel a été purifié préalablement, par la préparation de l'helianthate ou du sel double streptomycine-chlorure de calcium, une nouvelle purification de l'hydrochlorure de dihydr os trep t omyc ine n'est pas nécessaire.
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Pour la cristallisation de la dihydros.treptomycine., conformément à représente invention, on prépare une solution essentiellement anhydre d'hydrochlorure de dihydrostrepto- mycine purifié dans le méthanol. Par ensemencement avec des cristaux du composé et agitation, on obtient de l'hydro- chlorure de dihydrostreptomycine cristallin. La vitesse de cristallisation est notablement accélérée par la réduction de la quantité relative de méthanol dans ladite solution de façon à obtenir une condition de sursaturation.
Ceci peut être réalisé de différentes façons, commepar exemple par addition d'un supplément d'hydrochlorure de dihydr ostrepto- mycine ou évaporation d'une partie du méthanol jusqu' à ce que la quantité d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine soit de 300 à 500 mg/ml.
En traitant des solutions plus diluées, cependant la sursaturation peut être obtenue-,Par addition d'un solvant miscible avec le méthanol dans lequel l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine est relativement insoluble. Un grand nombre de solvants conviennent pour ce but, les plus satis- faisants étant l'acétone, l'isopropanol et l'éthanol.
La quantité de solvant ajoutée dépendra évidemment du sol- vant particulier choisi et de la concentration initiale de dihydrostreptomycine dans le méthanol. On constate, cepen- dant, que lorsque le degré convenable de sursaturation est produit dans le mélange de cristallisation, comme révélé par l'apparition d'un trouble net dans le mélange, on obtient facilement un rendement d'environ 80% de produit cristallin.
Afin de favoriser la formation maximum de cristaux le mélange de cristallisation après ensemencement est laissé au repos avec de fréquentes agitations ou une agitation pendant une période d'environ 15 à 40 heures.
Le produit cristallin ainsi récupéré est essentiel- lement pur à l'exception de traces du solvant qui peuvent
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adhérer aux cristaux. Onnotera également que par concentra- tion de la liqueur mère restant après l'enlèvement de la première récolte de cristaux et en procédant comme précé- demment,u.ne quantité supplémentaire de produit cristallin peut être obtenue, ce qui porte le rendement total d'hydro- chlorure de dihydrostreptomycine jusqu' à 95%.
Les exemples suivants montrent comment le procédé de la présente invention peut être appliqué, mais il doit être entendu que ces exemples sont donnés à titre d'illus- tration et ne sont pas limitatifs.
EXEMPLE 1.
Le complexe Streptomycine-chlorure de calcium (lOOgm) fut dissous dans 500 ce. d'eau et la solution agitée avec de l' hydrogène enprésence d'1 gm. d'oxyde de platine. Après que l'absorption d'hydrogène eut cessé, la solution fut filtrée du catalyseur et versée sous agitation dans 10 L. d'acétone renfermant environ lOOgm. de "Supercel' (un adju- vant de filtration de terre à diatomées) . La boue de "Super- cel" fut filtrée, lavée avec de l'acétone, et la dihydro- streptomycine enlevée par lessivage du gâteau (de filtration) avec deux portions de 200cc. de méthanol et finalement par lavage avec lOOcc de méthanol. L'hydrochlorure de dihydrochlorure de streptomycine amorphe, essentiellement exempt de/calcium, fut obtenu en versant la solution de méthanol dans 5 1. d'i- sopropanol.
Après séchage, 84 gm. du produit amorphe furent obtenus.
Pour la cristallisation, le produit amorphe fut dissous dans 300 ce. de méthanol, la solution ensemencée et agitée. Après 40 heures d'agitation le produit cristallin fut filtré et lavé avec des portions de 100 ce. de méthanol, de 80- 20 méthanol-acétone, de 50-50 méthanol-acétone et
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d'acétone, et séché, donnant ainsi 64 gm (rendement de 76%) de produit cristallin. Dans une opération "de doublure" en suivant le même processus on a obtenu 66 gm de produit cristallin (83%) et 10 gm de matière amorphe .
Les produits cristallins furent recristallisés par dissolution de 5 gm dans 75 ce. de méthanol à l'ébullition, addition d'acétone jusqu'à apparition de trouble- (45-50 ce.), ensemencement et agitation. On obtint des quantités de 3,3 et 3,7 gm. (respectivement 66 et 74%). Les produits ont unerotation spécifique de -Si à -94 et ne renferment pas de cendre.
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EXEMPLE S. De l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine cristal- lin, 56 gm., fut dissous dans du méthanol chaud (1400 ce) et la solution légèrement trouble résultante filtrée et di- luée avec de l'acétone jusqu'à apparition d'un trouble (environ 1400 ce.), ensemencée et agitée pendant environ 40 heures. Le produit fut filtré, lavé, et sché et fournit une première récolte de produit cristallin de 49,0 gm.(80,5%) La liqueur mère et les lavages furent réunis et concentrés à environ 300 cc., on procéda de nouveau à une addition d'acétone et à l'ensemencement. On obtint une quantité de 8,2 gm. (13,5%) de produit cristallin. laprécipitation des lavages et des liqueurs mères dans l'acétone fournit en outre 2 gm. de matière amorphe.
EXEMPLE 3.
Une solution de 1800 gm. du sel double, de atrepto- mycine-chlorure de calcium équivalent à 1600 gm. de produit sec fut dissoute sous agitation énergique dans 600 ce. d'eau et 3 1. de méthanol. La solution visqueuse fut réduite en
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utilisant 1,8 gm. d'oxyde de platine comme catalyseur.
Après réduction complète le mélange fut filtré du catalyseur et distillé sous pression réduite avec addition continue de méthanol dans le vase distillatoire. Après que environ 15 1. de méthanol eurent été distillés du mélange un-dosage d'eau indiqua la présence d'environ 200 gm. d'eau. -Un peu de catalyseur en suspension colloïdalenon éliminé par la première filtration fut enlevé par addition de 10 gm. de charbon (carbone) actif et filtration. Le filtrat, environ S.Len volume, fut dilué avec 1 L. d'acétone. Le mélange fut ensemencé avec 10-gm. d'hydrochlorure de-dihydrostreptomycine cristallin et agité pendant 16 heures.
Le produit fut filtré, lavé avec 1 L. de méthanol, puis avec 50-SO de mé thanol-acé tone et finalement avec de l'acétone et séché.
Le produit sec (770 gm., 60% de rendement) renfermait 0,2% -de cendre sulfate. Par concentration et ensemencement de la liqueur mère on obtint une seconde récolte de 40 gm.
EXEMPLE 4.
Une solution de 5 gm. d'hydrochlorure de dihydrostrep- tomycine cristallin dans 75 ce. de méthanol chaud fut- dilué avec de l'isopropanol jusqu'à léger trouble permanent de la solution (38 cet furent nécessaires), le mélange fut ensemencé axée de l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine cristallin et laissé au repos 72 heures avec agitation occasionnelle. Le produit fut filtré, lavé avec un mélange méthanol-isopropanol puis de l'isopropanol et séché, on ob- tint 2,9 gm. (68%) de produit cristallin.
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Hydrochlorure de dihydrostreptomycine.
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Propriétés <SEP> Amorphe <SEP> Cristallin
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<tb> activité <SEP> (unités <SEP> de
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<tb> streptomycine <SEP> par <SEP> mg.,
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<tb> essai <SEP> tasse <SEP> B. <SEP> Subtilis) <SEP> 500 <SEP> 600
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<tb> Toxicité
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<tb> LD <SEP> 50 <SEP> (mg/20 <SEP> g <SEP> souris) <SEP> 3,8-4,2 <SEP> 4,4-4,7
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<tb> Rotation
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a spécifique (c=l ds. ds .1 eeu) -8.7-88 -S2-94
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<tb> Solubilité <SEP> ds. <SEP> méthanol <SEP> miscible <SEP> lgm.ds.15 <SEP> ce.
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Caractéristiques
<tb> cristallines <SEP> aucune <SEP> x
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<tb> Pureté <SEP> ? <SEP> 97% <SEP> ou <SEP> +
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x Caractéristiques cristallines.
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Les espacements du spectre de diffraction aux..rta.yons X et les intensités relatives mesurée par le spectre-mètre de rayons X compteur de Norelco-Geiger sont donnés dans le
EMI8.6
tableau ci-dessous pour un échantillon de trihydrochlortre de d&hydr# treptomyciIle..
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0 <SEP> ¯
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<tb> espacements <SEP> en <SEP> A <SEP> intensités <SEP> relatives, <SEP> % <SEP>
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<tb> 8.05 <SEP> 33
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<tb> 7:25 <SEP> 33
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<tb> 5.25 <SEP> 67
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<tb> 4.90 <SEP> 67
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<tb> 4.50 <SEP> 100
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<tb> 4.12 <SEP> 33
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<tb> 3. <SEP> 94 <SEP> 33
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<tb> 3 <SEP> .75 <SEP> 75
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<tb> 3.40 <SEP> 45
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<tb> 3.22 <SEP> 40
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<tb> 3.08 <SEP> 40
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<tb> 2.92 <SEP> 47
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D;autres caractéristiques cristallines sont les suivantes:
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<tb> [alpha]= <SEP> 1,522
<tb> Indices <SEP> de <SEP> réfraction <SEP> ss <SEP> = <SEP> 1,548
<tb> # <SEP> = <SEP> 1,566
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<tb> Biréfringence <SEP> -0, <SEP> 008 <SEP>
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<tb> Angle <SEP> ingen <SEP> 2V <SEP> (calculé) <SEP> 800
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<tb> Extinction <SEP> parallèle
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<tb> Signe <SEP> d'élongation <SEP> +
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<tb> Pléochroîsme <SEP> (ou <SEP> Polychroïsme) <SEP> absent
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<tb> Système <SEP> cristallin <SEP> ' <SEP> probablement
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<tb> orthorhombique
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On a constaté que lorsqu'un certain nombre de cris- tallisations d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine ont été effectuées dans un milieu particulier,
la cristallisation de quantités supplémentaires d'hydrochlorure de dihydrostrepto- mycine peuvent parfois être réalisées sans addition effective de cristaux d' ensemencement. Ceci est probablement dû à la présence de petits cristauxd'hydrochlorure de dihydrostrepto- mycine dans l'appareil ou l'atmosphère du milieu..Afin d'assu- rer un contrôle optimum de la cristallisation et d'effectuer cette dernière dans le temps le plus court possible, il est cependant préférable d'ajouter des cristaux d'ensemencement que à la solution sursaturée plutôt/de compter sur l'action d'ense- mencement de petits cristaux présents dans le milieu.
Il doit être entendu que la nouveauté du procédé ici décrit réside non seulement dans les processus pour la cristallisation de l' hydrochlorure de dihydrostreptomycine mais aussi dans l'adaptation préférée du procédé dans lequel le sel complexe hydrochloruredestreptomycine-chlorure de calcium est réduit par catalyse et l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine ainsi obtenu sous fornme amorphe est transformé en produit cristallin par les processus ici décrits.
Dans cette adaptation préférée du procédé, la manière d'enlever le chlorure de calcium du mélange réactionnel après réduction est de première s ignification. Ce stade implique la précipitation de l'hydrochlorure de dihydrostreptomycine du mélange méthanolique de réduction renfermant le chlorure de calcium par l'isopropanol. De préférence, la solution dans
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le méthanol est ajoutée à IJcisop:r:opano1, provoquant ainsi un précipité amorphe d'hydrochlorure de dïhyclrostreptomycïne qui est aisément récupéré par filtration. Cette matière exempte de chlorure de calcium convient bien pour être utilisée dans la préparation de dihydrostreptomycine cristalline et peut être aussi utilisée comme une qualité supérieure du produit amorphe .
Il doit être entendu d'autre part, que partout dans la spécification et les. revendications la référence à l'hydro- chlorure de dihydrostreptomycine indique le composé qui rentes 3 molécules de HCL, c'est-à-dire le trihydrochlorure de dihydrc streptomycine.
REVENDICATIONS.
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1.- Procédé qui comporte la préparation d' une solu- tion essentiellement anhydre dans le méthanol d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine, la réduction de la quantité relative de méthanol pour former une solution sursaturée, la mise en contact de la solution sursaturée avec des traces de cris- taux d'ensemencement d'hydrochlorure de dihydrostreptomycine pendant une période de temps prolongée avec agitation de la
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solution, provoquant ainsi la cristallisation d' hydrochlorure de dihydrostreptomycine de la solution sursaturée.