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"Procédé de préparation et de purification des antibiotiques" basiques
L'invention a trait aux antibiotiques/ou alcalins du type de la streptomycine, c'est-à-dire aux éléments du genre se composant de la streptomycine et de composés ba- siques à action antibiotique, qui (comme la streptomycine) peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides, tels que l'acide sulfurique, et des sels insolubles dans l'eau avec des réactifs organiques précipitant les bases (par exemple les dérivés de streptomycine, tels que la dihydrostreptomyoine et les antibiotiques à action analogue,
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tels que la streptothricine).
En 1944, Schatz, Bogie et Waksman (Proc.Soc.Exp.Biol.
Med. 1944, 57, 244) ont montré qu'un antibiotique puissant appelé "Streptomycine'T se forme au cours de la croissance de l'organisme "Actinomyc6s Grisous", (appelé maintenant "Streptomyces Griseus") et on a constaté depuis que cet an- tibiotique est extrêmement utile en clinique médicale.
On a découvert, ensuite, que plusieurs streptomicines se forment en même temps. La première streptomycine obtenue sous forme cristallisée, pure, (à l'état de reineckate) et complètement caractérisée est appelée maintenant "Streptomy- cine A"; et la seconde streptomycine caractérisée est appe- lée maintenant "Streptomycine B". De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres streptomycines se forment et/ou peuvent se former en même temps en changeant les conditions de la culture; et il doit être bien entendu que chacun de ces antibiotiques et leurs mélanges (sous for- me de bases libres ou de leurs sels solubles dans l'eau) se- ront désignés par le mot "streptomyoine", à moins d'indica- tions contraires.
La streptomycine a été purifiée jusqu'à présent par di- vers procédés, tous compliqués et/ ou inefficaces (et, par conséquent, coûteux). Par exemple, un procédé appliqué dans une large mesure antérieurement à l'invention comporte, en principe, les opérations suivantes : I - On traite un liqui- avec du charbon de bois activé qui absorbe sélectivement la streptomycine de primaire contenant la streptomycine, 2 - On extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élévant légèrement la température (par exemple à environ 30-50 0); 3 - On traite l'extrait avec un réactif de précipitation des bases organi- ques, de préférence l'acide phosphetungstique, et 4 - On décompose le précipité.
(L'expression "liquide primaire con- tenant la strptomyoine" doit être considérée comme désignant
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en particulier : a) le liquide de culture obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseas dans des conditions et dans un milieu de culture convenant à la formation de la streptomycine et en séparant les matières solides du milieu; b) le liquide de culture de pouvoir amélioré, obtenu par acidification de la culture (par exemple par l'acide chlorhy- drique ou sulfurique), le liquide étant neutralisé, et c) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières soli- des séparées de la culture, le liquide étant neutralisé).
Un des objets de l'invention réside en procédés simples, efficaces et avantageux à d'autres points de vue pour purifier des antibiotiques basiques, du type de la streptomycine, et en particulier la streptomycine, et un autre objet de l'inven- tion réside en la formation de certains dérivés du type salin des antibiotiques basiques du type de la streptomycine, pou- vant servir à ces procédés de purification et à d'autres applications et réside aussi dans des procédés de prépara- tion de ces dérivés.
Il a été découvert que des antibiotiques basiques du type de la streptomicyne réagissent avec des agents à aoti- vité superficielle, ou agents de mouillage, du type des aci- des inorganiques, polybasiques, organiquement substitués, en formant certaines combinaisons du type salin, qui sont beau.- coup moins solubles dans l'eau que les antibiotiques et peu- vent être recueillies; et il a encore été découvert que ces dérivés du type salin des antibiotiques peuvent être décom- posés pour recueiller les antibiotiques.
Les procédés suivant l'invention consistent en principe à faire réagir un antibiotique basique, du type de la strep- tomycine,(en particulier la streptomycine) avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, onga- niquement substitué, dans un solvant des réactifs (en parti- culier l'eau). La combinaison du type salin ainsi formé de l'antibiotique et de l'agent de mouillage est relativement
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insoluble dans l'eau. et peut être recueillie par filtration, centrifugation ou autre moyen approprié lorsque l'eau sert de solvant des réactifs.
Lorsque le solvant des réactifs est un solvant (tel que le méthanol) dans lequel la combi- naison du type salin est soluble, on recueille cette combi- naison en éliminant le solvant et en purifiant le résidu, par exemple par lavage avec de l'eau., ou en ajoutant un agent miscible, non solvant, de la combinaison du type sa- lin (tel que l'eau).
Les procédés de purification suivant l'invention consistent en principe à traiter un antibioti- que basique impur du type de la streptomycine avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, or- ganiquement substitué, dans un solvant des réactifs, en par- ticulier à traiter une solution aqueuse de l'antibiotique impur (par exemple un liquide primaire contenant de la strep- tomycine ou une solution aqueuse d'une streptomycine par- tiellement purifiée, telle que l'extrait dont il a été question précédemment) avec l'agent de mouillage, à recueil- lir la combinaison formée du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage et à transformer cette dernière combinaison en un sel soluble dans l'eau, de l'antibiotique.
Cette transformation peut s'effectuer par exemple en dis- solvant la dérivé du type salin dans un de ses solvant (tel que le méthanol), en traitant la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fortsolable dans
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l'eau, (en partiuulidr avoo ano solution r?quoii±;e d'un ici- de minéral relativement fortsoluble dans l'eau), et en recueillant le sel soluble dans l'eau ainsi formé (de l'an- tibiotique basique, du type de la streptomycine), par exemple en ajoutant un agent miscible, non solvant, du. sel soluble dans l'eau, (tel que l'acétone), et en recueillant le précipité. Le produit ainsi obtenu, est beaucoup plus pur que l'antibiotique traité et la récupération de l'ac- tivité antibiotique, réalisée au cours du traitement de
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purification, est d'un ordre élevé.
Dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, il est possible d'obtenir régulièrement des rendements élevés en streptomycine relati- vement pure, possédant (par exemple) un pouvoir antibiotique supérieur à 400 unités/mg environ.
Parmi les agents de mouillage du type des acides inor- ganiques, polybasiques, organiquement substitués, convenant de au procédé/l'invention, on peut citer ceux qui sont représen- leradical tés par la formule R-0-X-0-Y, dans laquelle R désigne d'un composé hydroxyle organique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau,-O-X-O- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique, polybasique, soluble dans l'eau, (par exemple un acide sulfurique ou phosphorique), et Y désigne un élément du groupe formé par H et les sels solubles dans l'eau formant des cations avec l'anion R-0-X-O-.
Parmi les agents de mouillage convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer particulièrement ceux dans lesquels l'acide inorganique polybasique est l'acide sulfurique, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique su- périeur, c'est-à-dire les agents de mouillage du groupe formé par les mono-esters aliphatiques supérieurs d'acide sulfuri- que, et leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents de mouillage pouvant être choisis de préférence du type des acides inorganiques, polybasiques, organiquement substitués, convenant au procédé suivant l'in- vention sont ceux du groupe formé par les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alkyl esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisée dans la mise en oeuvre pra- tique de l'invention, on peut citer : les groupes des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs
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synthétiques, tels que CH9CH(C2H5) CH4CH(304Na)CH4CH(CH
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(par exemple le Tergitol Penetrant 7), C4H9CH(C2H5)C2H4CH (SO4Na(CH2CH)OH3)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 4) et C4H9OH(C2H5)CH2SO4Na, (par exemple le Tergitol Penetrant 08), et la série des esters partiels d'acide sulfurique des alcools aliphatiques supérieurs et leurs sels, tels que le sulfate d'octyl sodium, d'oléyl sodium, de oétyl sodium, de stéaryl sodium et de lauryl sodium (par exemple l'Aurinol, le Weta- nol, les Duponols et les Gardinols).
Parmi les acides sal- foniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer les salfonates de sodium des esters d'acides gras supérieurs et des amides tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyl sal- foné (ou. aatre alkyl oléate) (par exemple l'Igepon AP Extra) et CI7H33CONHC2H4SO3Na (par exemple l'Igepon T); les sul- fonates de sodium des hydrocarbures de pétrole (par exemple l'Ultrawet); le sel de sodium d'un acide polyalkyl benzène sulfonique contenant 10 atomos de carbone (par exemple l'Ultrawet, 40A) et d'autres alkyl aryl salfonates de sodium (par exemple le Nacconol NRSF) et l'haile de rouge turc, (c'est-à-dire l'haile de ricin salfonée).
Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peavent être utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer le phosphate, de dicrésyle, la lécithine et un alcool supérieur phosphoré de représenté par la :formule (capryle) 5Na5P6O2O (par exemple le W.A.58).
Parmi les acides solables dans l'eau, relativement forts, qui peuvent servir à recueillir les antibiotiques dans leurs combinaisons du type salin avec les agents de mouillage, on peut citer les acides sulfurique, chlorhy- drique, phosphorique, oxalique, citrique, sulfamique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent de mouillage soit sensiblement en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité
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de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la pro- portion la plus avantageuse de l'agent de mouillage dépendant par suite de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique. En employant la quantité stoichio- métrique de l'agent de mouillage (par rapport à l'activité antibiotique de la solution traitée), on peut recueillir une proportion pratiquement quantitative de l'antibiotique sous forme de son dérivé du type salin ; etla dérivé du type salin sensiblement par ainsi obtenu permet de recueillir plus faci- lement l'antibiotique sous forme de sel soluble dans l'eau.
Suivant un des modes de mise en oeuvre de l'invention, une solution aqueuse d'un antibiotique impur, du type de la streptomycine, est traitée avec une solution aqueuse de l'a- gent de mouillage, et le précipité formé est recueilli et transformé en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique.
Suivant une variante, l'agent de mouillage peut être ajouté à la solution de l'antibiotique à l'état solide, ou encore l'antibiotique et l'agent de mouillage peuvent être tous deux ajoutés à l'état solide à l'eau (ou autre solvant des réactifs).
La combinaison du type salin de l'antibiotique et de de l'agent/mouillage peut se séparer du solvant des réactifs sous diverses formes ; exemple sous forme de substance huileuse, cireuse ou gélatineuse, ou ne pas se séparer du tout, mais rester à l'état de dispersion dans le solvant, (toutes ces formes insolubles devant être considérées comme désignées par le mot "précipité"); et, suivant sa forme, on sépare le précipité par filtration, centrifugation, traitement à l'aide d'an filtre suivi d'une filtration ou par d'autres moyens ordinaires connus des spécialistes.
La précipitation de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage dépend de la con- centration des réactifs et de la valeur du pH du milieu de la réaction, la précipitation étant maximum lorsque la con-
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oontration est forte et la valeur du pH comprise entre environ 5 et environ 8 et, de préférence, voisine de 7.
Suivant une autre variante, la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage ainsi formée peut aussi servir telle quelle d'agent thérapeutique. Ces dérivés du type salin sont généralement solubles dans l'huile ou. peu- vent s'y disperser et peuvent servir en thérapeutique, par exemple en les administrant par la bouche tels quels ou en milieux huileux pour traiter les maladies intestinales (en ayant recours aux fonctions intestinales pour mettre l'anti- biotique en liberté sous forme soluble dans l'eau) ou en les administrant également en milieux huileux (ou par imprégnation d'une pastille d'une matière solide) pour obtenir une action antibiotique prolongée.
Lorsqu'on se propose de préparer le dérivé du type salin de l'antibiotique au lieu de la purifier, on peut employer une solution aqueuse reconstituée de l'anti- biotique (par exemple une solution aqueuse de l'antibiotique très purifié ou. par.)
La transformation de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique peut s'effectuer, entre autres, par les moyens suivants: on dissout la combinaison du type salin dans un solvant de cette combinaison, (par exemple le méthanol), on traite la solution avec un acide relativement fort, soluble dans l'eau, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique, (par exemple en ajoutant un agent miscible non solvant du sel soluble dans l'eau, tel que l'acétone);
ou bien on amène la combinaison du type salin (en solution) en contact intime avec un adsorbant (par exemple l'alumine), ou une résine à échange d'anion ayant été anté- rieurement traitée avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau, choisi, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique dans la solution traitée,(par
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exemple en éliminant le solvant);
ou bien on dissoat la combinaison du type salin dans an solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau,(par exemple le n-butanol ou. l'alcool amylique obtenu par fermen- tation et raffinage), on amène en contact intime la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, so- luble dans l'eau, on recueille la phase aqueuse et on la sèche, (de préférence par congélation, c'est-à-dire qu'on la congèle et on la soumet à un vide poussé poux chasser l'eau par sublimation);
ou bien on dissout la combinaison du type salin dans un solvant de cette combinaison dans le- quel le sel soluble dans l'eau qu'on désire obtenir est in- soluble, (par exemple un mélange de méthanol et d'acétone), on traite la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau et on recueille le sel, soluble dans l'eau, précipité de l'antibiotique; ou. bien on traite une solution de la combinaison du type salin avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, so- luble dans l'eau, en présence d'une résine à échange d'anion, ou par divers autres moyens permettant de réaliser un contact intime et de faire réagir la combinaison du type salin avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau.
L'invention est plus facile à comprendre d'après les exemples suivants (toutes les solutions dont il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau., à moins que le solvant ou le diluant ne soit spécialement indiqué):
Exemple I a) A 500 cm3 d'un filtrat de culture contenant de la streptomy- cine (obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseus en culture submergée en milieux aqueux contenant de la farine de soja, du dextrose, et du chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en la filtrant) ayant un pouvoir anti- biotique de 259 anités/cm3 et un pH de 6,5, sont ajoutés
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12 OM3 d'une solution à 25 de U4H9UH(G2U2H4UH(S04Na)U2H4 CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 7) en agitant,
et on continue à agiter pendant une demi-heure. L'halle qui se sépare est une combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage et contient environ 94 % de l'ac- tivité du filtrat de culture. b) La combinaison du type salin ainsi obtenue en partant d'une charge de filtrat de culture d'une activité de 1.245.000 unités est dissoute dans le méthanol, puis repré- cipitée encore ane fois en ajoutant un volume égal d'eau; on la redissoat dans le méthanol à 80 % et on la fait pas- ser dans une colonne d'alumine, antérieurement lavée avec l'acide chlorhydrique jusqu'à an pH de 4,1, puis on la sèche.
On recueille le produit de percolation (environ 250 cm3, y compris le méthanol de lavage) et on recueille le chlorhydrate de streptomycine en ajoutant un volume égal d'eau, on chasse le méthanol par distillation dans le vide, on élimine la combinaison du type salin éventuellement non décomposée, on règle le pH de la solution aqueuse restante à une valeur de 5,5 et on la sèche par congélation. On ob- tient environ 1,55 gr de chlorhydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 320 anités/mg (avec un rendement d'environ 40 %).
Exemple 2 On ajoute 0,5 gr d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple de Duponol C) dans 20 cm3 d'eau à 500 cm3 d'un extrait contenant de la strep- tomycine ayant un pouvoir de 300 unités/6m3 et un pH de 6,5 (obtenu en traitant un filtrat de culture contenant de la. streptomycine avec un charbon de bois activé et en extrayant la streptomycine du charbon de bois par l'acide de chlorhydrique, sulfurique ou nitrique dilué), on agite la solution trouble pendant une heure et on sépare par filtration le précipite floculent formé.
La combinaison
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ainsi obtenue du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage contient environ 76 % de l'activité de l'extrait; on peut l'utiliser telle quelle à titre d'agent thérapeutique ou la transformer en un sel soluble dans l'eau de streptomy- cine, par exemple de la manière décrite dans l'exemple 6 ci- après.
Exemple 3 a) 16 cm3 d'une solution à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(SO4Na) C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) sont ajoutés en agitant, en une heure, à 7 litres d'un extrait conè tenant du nitrate de streptomycine, ayant un pouvoir de 195 unités/cm3 et un pH de 7,0; on laisse le précipité formé re- poser pendant 1-2 heures à 5 C environ et on le filtre.
La combinaison du type salin ainsi obtenue de streptomycine et de l'agent de mouillage contient environ 93 % de l'activité de l'extrait. b) On comprime, ou traite de toute autre manière pour éliminer l'eau entrainée, une combinaison ainsi obtenue en partant d'une charge d'extrait d'une activité de 850.000 unités et on la dissout dans une quantité de méthanol à 90-100 % suffisan- te (suivant la teneur en eau de la combinaison du type salin ment ainsi partielle déshydratée) pour former une solution dans 100 cm3 de méthanol à 90 %; puis on fait passer la solution dans une colonne de 2,5 x 25 cm de résine à échange d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B, of. brevet américain n 2. 402.384 du 18 juin 1946), dont le pH a été antérieurement réglé à une valeur de 2,5 par addition d'acide chlorhydrique dilué.
On recueille le produit de percolation dans deux por- tions de 125 cm3 (y compris le méthanol de lavage) et on traite chaque portion en ajoutant un volume d'eau, égal, on chassant le méthanol par distillation dans le vide, en réglant le pH de la solution aqueuse restante à une valeur de 5,5 par un traitement avec une résine à échange d'anion neutre,
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en la filtrant et en la séchant par congélation.
On obtient, avec la première et avec la seconde portion du produit de per- colation respectivement, environ 0,8 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 679 unités/mg et environ
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0,1 gr d'un pouvoir d'environ 425 unités/, mg avec an rendement total d'environ 73,1 %. b:variante) Une combinaison du type salin ainsi obtenue en partant d'une charge d'extrait d'une activité de 860.000 uni- tés (pesant environ 4 gr. ) est dissoute dans 150 om3 de méthanol à 90 %;
et la solution est agitée avec 50 gr. d'une résine à échange d'anion, dont le pH a été antérieurement réglé par addition d'acide chlorhydrique di lué. Après filtration et séchage par congélation du filtrat, on obtient environ 0,8 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 616 unités/mg et on peut obtenir un sppplément d'environ 0,14 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 635 unités/mg dans le méthanol à 90 % de lavage de la résine, avec un rende- ment total de 08 %.
Exemple 4.
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5,5 cm3 d'une solution à 25 y. de C4HgCH(C2H5)C2g4CH(S04Na) C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) sont ajoutés à une solution de 1 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 525 unités/mg dans 100 cm3 d'eau, on agite le mélange pendant une demi-heure dans un agitateur mécanique et on sépare par filtration le précipité cireux formé. La combi- naison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouil- lage ainsi obtenue (pesant environ 2,2 gr) contient environ 96,5 de l'activité de la solution de chlorhydrate de strep-
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Lu 111,Y U 1 Ut:I L.L' tt1 L t:I .
Exemple 5.
Une solution de 10 gr d'un ester partiel d'acide sulfuri- que d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple le Duponol C) dans 50 cm3 d'eau est ajoutée à une solution de 10 gr. de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 580 unités/mg
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dans 20 cm3 d'eau, et le mélange gélatineux épais qui se forme est versé dans 400 cm3 d'eau, froide. Le précipité gé- latineux formé est recueilli par centrifugation, est lavé par une nouvelle suspension dans l'eau, est recueilli par centrifugation et est séché dans le vide.
La combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage ainsi obtenue a un pouvoir d'environ 350 unités/mg, estin- soluble dans l'eau, est soluble dans les solvants organiques des savons ne se mélangeant sensblement pas avec l'eau (par exemple l'alcool amylique obtenu par fermentation effi- nage) et permet d'obtenir des dispersions satisfaisantes dans les milieux huileux (par exemple l'huile d'arachide ou l'oléate d'éthyle) pouvant être utilisées en clinique mé- dicale.
Exemple 6.
I,5 gr d'une combinaison du type salin de streptomycine et d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool alipha- tique supérieur, obtenue par exemple de la manière décrite dans l'exemple 2, (dont la streptomycine a une activité de 376. 000 unités déterminée par un essai chimique) est dissous dans 25 cm3 de méthanol, et on ajoute 25 cm3 d'acétone.
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P-ui-e-- -on--B;-5--cm3--,--e't;--on--a--3 - d'acétone. Puis on ajoute 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (jusqu'à un pH = environ 1,2) et ensuite 50 cm3 de plus d'acétone. On filtre le précipité obtenu (chlorhy- drate de streptomycine) et on le dissout dans l'eau.
On règle la valeur du pH de la solution à 6,8 par addition d'une résine neutre à échange d'anion et on la sèche par congélation. On obtient ainsi environ 0,7 gr de chlcrhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 425 unités/mg. (Rendement environ 79 %).
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Exemple 7.
280 cm3 d'une solution à 25 % d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple de Duponol 0) sont ajoutés lentement à une solution de 50 gr de sulfate de streptomycine partiellement purifiée dans 24 litres d'eau distillée, d'an pouvoir de 1.000 unités/cm3; le précipité floculent blanc, qui s'est formé, est isolé par centrifugation et séché dans le vide (10 mm) à la température ambiante pen- dant 12 heures. La combinaison du type salin ainsi obtenue pesant environ 57 gr. a un pouvoir d'environ 224 anités/mg et convient aux applications cliniques telle quelle ou sous diverses formes de produits pharmaceutiques.
En employant 310 cm3 d'une solution clarifiée (traitée par le carbone) à 25 % de l'agent de mouillage C4H9CH(C2H5) C2H4CH(SO4Na)C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 7) à titre de solution de l'agent de mouillage de l'exemple précédent, on obtient une combinaison du type salin d'un pou- voir d'environ 293 anités/mg avec un rendement d'environ 50 gr.
Exemple 8.
Une solution de 35 gr. d'un ester partiel d'acide sulfuri- que d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple le Duponol 0) dans 350 cm3 d'eau., dont le pH est à 9,7, est ajoutée en agitant à une solution de 30 gr de sulfate de streptomycine d'un pouvoir de 490 unités/mg et de pH de 5,2; le solide qui se précipite est séparé par centrifugation et lavé avec de l'eau par centrifugation. On remet en suspension dans 400 om3 d'eau. la combinalson du type salin ainsi obtenue, on sèche la suspension par congélation et on obtient environ 38,5 gr. d'un solide blanc floconneux d'un pouvoir de 320 unités mg. (On élimine les dernières traces de sel organique en lavant avec de l'eau., remettant en suspension dans l'eau et séchant la suspension par congélation).
La combinaison du type salin ainsi obtenue n'est que légèrement soluble dans l'eau et se disperse parfaitement
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dans l'huile d'arachide, l'oléate d'éthyle et d'autres mi- lieux huileux. Une dispersion fine convenant aux injections intra-mascalaires d'un pouvoir de 200.000 unités/cm3, peut être obtenue, par exemple, en ajoutant lentement, tout en agitant, I cm3 d'huile d'arachide (ou d'oléate d'éthyle) à 666 cm3 de la combinaison du type salin.
Exemple 9.
On ajoute en agitant 2,1 cm3 d'une solution à 25 % de
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04HgOH(CZHS)C2H4UH(S04Na)C2H4CH(02H5)2 (par exemple de Tergitol Penetrant 7) &&Bt#a&é-&-e-&-agi-'e-aRt' à une solution de
0,5 gr de sulfato de dihydrostreptomycine dans 250 cm3 d'eau, ayant un pouvoir de 1210 anités/cm3; et on recueille par fil- tration la combinaison du type salin précitée (contenant plus de 83 o de l'activité de la solution traitée).
En traitant de la même manière une solution aqueuse de chlorhydrate de streptothricine d'un pouvoir de 500 unités/mg, on obtient le dérivé du type salin correspondant de streptothri- cine.
Exemple 10.
60 gr d'une combinaison de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I, ayant un pouvoir de 243 unités/mg sont de méthylamyle (acétate-2 de 4-méthylpentyle); on ajoute 40 cm3 d'acide
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dissous dans 400 em3 d'aoêtatehlorhydrique concentré et on agite vigoureusement le mélange. Puis on ajoute 40 cm3 d'eau et on continue à agiter pendant 10 minutes. On recueille la couche aqueuse qui se forme en se séparant, on la neutralise avec une résine neutre à échange d'anion, (par exemple l'Am- berlite IR-4B) et on la filtre. Le filtrat et le liquide de lavage d'un volume total d'environ 190 cm3 ont un pouvoir d'environ 65.000 unités/cm3 (avec un rendement d'environ 85 %).
En lavant la couche d'acétate de méthylamyle avec 60 cm3 d'oau, en neutralisant le liquide de lavage ot on filtrant, on obtient un filtrat supplémentaire d'un pouvoir de 16.000 unités/cm3 (le rendementtotal étant d'environ 97 %). Le
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chlorhydrate de streptomycine solide, obtenu par séchage par congélation a un pouvoir d'environ 575 unités/mg.
Exemple II.
Un filtrat de culture contenant de la streptomycine d'un pouvoir de 2II unités/cm3 et d'un pH de 1,5, est traité avec 1 gr. de charbon activé (par exemple Darco 3-51) par 20.000 unités et filtré; pais on règle le pH du filtrat à une valeur de 6,5 à 7,0. On ajoute au filtrat une solution
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à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(2H5)2 (par exem- ple le Torgitol Pénétrant 7), en proportion de I em3 de la solution de l'agent de mouillage pour 66. 400 unités de streptomycine ; on laisse reposer le précipité formé pendant 12 à 16 heures et on le filtre. La combinaison du type salin ainsi obtenue par la décomposition, telle qu'elle est décrite dans le paragraphe b) de l'exemple 3, fournit un chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 416 unités/mg avec un rendement d'environ 54 %.
Exemple 12.
Un chlorhydrate de streptomycine contenant 0,I mg d'hista- mine pour 207 unités d'activité de streptomycine est trans- formé en une combinaison du type salin avec un agent de mouil- lage de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple 3 ; et la combinaison du type salin est décomposée de la ma- nière décrite dans le paragraphe b) de cet exemple. La te- neur en histamine du chlorhydrate de streptomycine ainsi ob- tenu est de 0,1 mg pour chaque fois 610 unités d'activité de streptomycine.
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t4é-âlae44é-âe-epee4ae .
Exemple 13.
20 gr. d'une combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I (la streptomycine de cette combinaison ayant une activité de 4.240.000 unités
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sont dissous dans 100 cm3 de méthanol; et on ajoute une bouillie de 40 gr. d'une résine à échange d'anion (par exem- ple d'Amberlite IR-4B) dans 300 cm3 d'eau, avec an pH de 6,5.
Puis, tout en agitant et maintenant le mélange à une tempéra- ture de 50 à 55 C, on y ajoute de l'acide chlorhydrique con- centré goutte à goutte dans des conditions de nature à main- tenir le pH à une valeur de 3,0 à 3,5.
(On peut déterminer le moment où la décomposition est terminée en observant l'augmentation du précurseur de maltol dans la solution aqueuse). Au bout d'une heure, pendant la- quelle on a ajouté environ 3,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, on laisse le pH atteindre une valeur de 5,0 à 5,5, on filtre la solution, on élimine le méthanol du fil- trat par évapora.tion dans le vide et on sèche par congélation la solution résiduelle en obtenant environ 6,5 gr. de chlorhy- drate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 578 unités/mg avec un rendement d'environ 90 %.
Exemple 14.
15 gr. d'une combinaison du type salin de streptomycine et d'un agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I (la streptomycine de la oom- binaison ayant une activité de 2.960.000 unités sont dissous dans 100 om3 de méthanol et on fait passer HCl sec dans la so- lution, jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité. Puis on dilue le mélange avec 500 cm3 d'acétone; et le précipité est séparé par filtration et dissous dans 100 cm3 d'eau. On règle le pH de la solution à une valeur de 5,5 par addition d'une résine neutre à échange d'anion (par exemple d'Amber- lite IR-4B), on filtre la solution et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ 4,96 gr. de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 385 anités/mg avec un rendement de 64,5 %.
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Exemple 15. a) 3785 litres d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine d'un pouvoir de 400 unités/cm3 et dont le pH a une valeur comprise entre 3 et 4 sont chauffés à 20 C et neutralisés à une valeur du pH de 7,5 ¯ 0,2 par addition d'une solution de soude caustique à 10 %, (17,0 litres envi- ron étant nécessaires à cet effet); et on traite la solution neutralisée avec 113,7 kg de charbon activé (par exemple Dar- co G-60) et 9,0 kg de matière filtrante (par exemple Hyflo).
On agite la bouillie pendant une heure et on la filtre. On lave le tourteau de carbone avec au moins 378 litres d'eau et on le sèche par un courant d'air.
950 litres du second extrait provenant d'une extraction antérieure, ainsi qu'il est décrit ci-après, sont amenés à un volume de 2850 litres par addition de l'eau de ville. On ajoate le tourteau de carbone du paragraphe précédent, on maintient la bouillie à une température de 35 à 40 C en l'agitant et on règle le pH de la suspension à une valeur de 2,2 0,2 par l'addition d'acide nitrique à 10 %, (une quan- tité d'environ 6,39 kg étant nécessaire à cet effet). Après avoir agité pendant une heure, on élimine le carbone par fil- tration et séchage par un courant d'air et on recueille le filtrat (ou. premier extrait).
On introduit le carbone ainsi extrait dans 950 litres d'eau fraîche de ville, en vue d'une seconde extraction, que l'on erfectue de la manière décrite dans le paragraphe pré- cédent en ajoutant une faible quantité d'acide nitrique à 10 % (s'il y a lieu) pour régler de nouveau lo pH à une va- laur de 2,2 + 0,2. Le second extrait ainsi obtenu sert à la première extraction décrite dans le paragraphe précédent.
Le rendement total fourni par le filtrat de culture est d'en- viron 82 %.
On règle le pH du premier extrait à une valeur de 7,5 + 0,1 par addition d'une solution de soude caustique à 10 %, (15,9 litres étant nécessaires à cet effet), tout en main-
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tenant la température à IO C ou au-dessous. On ajoute 3,40 kg d'une matière filtrante (par exemple Hyflo) et on filtre la bouillie. On ajoute au filtrat incolore (exempt de fer) à une température de 10 à 15 C, la moitié du volume total d'une
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solution à 25 ;b de CE9CE(C2E5)C2E4CE(S04fla)C2E4CE(C2H5)2 (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) nécessaire à la préci- pitation de la streptomycine (cette quantité étant basée sur l'activité de l'extrait, déterminée par un essai chimique en proportion de Icm3 par 92.400 unités de streptomycine).
Une fois cette portion de l'agent de mouillage ajoutée on commence l'essai de la détermination de la fin de la précipitation.
(On filtre à cet effet un échantillon de la bouillie et on re- cueille environ 2 cm3 du filtrat, puis on ajoute au filtrat une à deux gouttes d'acide phosphotungstique à 50 % qui forme un précipité, si la précipitation par l'agent de mouillage est incomplète). On ajoute alors un complément de la solution de l'agent de mouillage par portions d'un litre, jusqu'à ce que l'essai indique que la précipitation est terminée, (environ 13,0 kg ou 22,8 litres d'une solution à 25 o de l'agent de mouillage étant nécessaire à cet effet). On agite la charge pendant une demi-heure et on recueille la matière solide (qui est de la combinaison du type salin) par centrifugation.
Le rendement fourni par le filtrat de oulture est d'environ 73,8 %, le rendement de la précipitation étant d'environ 90 %. b) La combinaison du type sa.lin à l'état hydraté est dissou- te dans le méthanol à 90 %; à une température de 20 à 25 C, en proportion de 15 gr. pour 100 cm3 de solvant, (plus de 22,7 li- tres de méthanol étant nécessaires à cet effet); on filtre la solution, on ajoute lentement au filtrat une quantité d'acide chlorhydrique concentrée suffisante pour décomposer la combi- naison du type salin et abaisser le pH à une valeur de 0,8 + 0,I, (0,408 kg d'acide étant nécessaire à cet effet); et on verse le mélange dans 87,9 kg d'acétone et on le laisse reposer pendant une heure à une température de 5 à IO C.
Le précipité (chlorhy- drnto de streptomycine) est filtré à l'état aussi sec que par-
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sible, sur un filtre à vide, puis est dissous dans l'eau avec une proportion de 100 cm3 d'eau pour 10 gr. de la combi- naison du type salin traitée, (22,7 litres d'eau environ étant nécessaire à cet effet). On neutralise la solution en l'agitant avec environ 0,49 kg de résine neutre à échange d' d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B) dont le pH est 6,5 pour régler le pH du chlorhydrate de streptomycine à une va- leur comprise dans l'intervalle de 6,0 à 6,5, entre les li- mites duquel il est le plus stable. On filtre le mélange ainsi obtenu.; on distille le filtrat pour le débarrasser du méthanol et de l'acétone sous une pression de 15 à 20 mm et on le filtre, puis on le sèche par congélation.
Le rendement en chlorhydrate de streptomycine ainsi fourni par le filtrat de culture est d'environ 51,8 % et le rendement de la décom- position d'environ 70 %.
La résine neutre à échange d'anion peut être préparée de la manière suivante: on introduit 4,53 kg d'une résine à échange d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B) dans 37,85 litres d'eau de ville. On ajoute une quantité suffisante d'une solution de carbonate de sodium à IO % pour régler le pH à une valeur de IO,5 ¯ 0,2, et on lave la résine alcaline avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH du milieu.'aqueux atteigne 6,5.
On conserve la résine neutre dans le milieu aqueux jusqu'à ce qu'on s'en serve à la neutralisation, c'est- à-dire qu'on la filtre dans le milieu aqueux un. instant avant de s'en servir. kg b : variante) 6,88/de la combinaison du type salin déshy- dratée sont dissous dans le méthanol absolu à une température de 20 à 25 C en proportions de 20 gr. de la combinaison du type salin pour 100 cm3 de méthanol à 100 %, (34 litres au moins de méthenol étant nécessaires à cet effet).
On filtre la solution; on ajoute au filtrat 20,63 kg d'une résine neutre à échange d'anion dont le pH est 6,5 (par exemple d'amberlite IR-4B) et on ajoute une quantité d'eau à la bouillie ainsi
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obtenue, suffisante pour abaisser la concentration du mé- thanol à 25 % (I02,2 litres d'eau environ étant nécessaires à cet effet). La bouillie, dont le volume est d'environ 159 litres, est chauffée à une température de 50 à 55 C et est maintenue à cette température pendant qu'on y ajoute 1,89 litre d'acide chlorhydrique concentré dans des conditions de nature à maintenir le pH du mélange à une valeur comprise entre 3,0 et 3,5.
Puis on agite le mélange jusqu'à ce que le pH atteigne sa valeur maximum comprise entre 5,6 et 6,2, (si le pH est inférieur à 6, on ajoute de faibles quantités de résine neutre à échange d'anion jusqu'à ce que la valeur finale du pH soit comprise entre 6 et 6,5). Puis on filtre 1;:: bouillie et on lave la résine avec une quantité d'eau. suffisante pour éliminer le chlorhydrate de streptomycine qui y adhère éventuellement; le filtrat et l'eau de lavage combinés, dont le volume est d'environ 179,8 litres et le pouvoir d'environ 6.500 unités cm3, sont alors concentrés à un volume d'environ II,35 litres et on recueille le chlorhy- drate de streptomycine par séchage par congélation. Le rende- ment de la décomposition est de 60 à 80 %.
Les agents de mouillage des exemple qui précèdent peuvent être remplacés par des quantités équivalentes d'autres agents de mouillage du type des acides inorganiques polybasiques, organiquement substitués (dont des sous genres et catégories ont été énumérés précédemment à titre d'exemple). Parmi d'autres dérivés du type salin de streptomycine qu'on peut obtenir suivant l'invention et qui conviennent particulière- ment aux applications thérapeutiques telles quelles (et sous diverses formes pharmaceutiques) on peut citer ceux qu'on
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peut obtenir avec le CECE(C?E)CECE(s0Na)CECE(cE) (par exemple le Tergitol Penetrant 4) et avec des esters par- tiels d'acide sulfurique des alcools aliphatiques supérieurs de différents poids moléculaires et leurs sels (par exemple les divers Daponols).
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Parmi d'autres antibiotiques basiques du type de la streptomycine, qui peuvent servir à la préparation de combi- naison du type salin avec les agents de mouillage suivant l'invention, on peut citer la streptomycine A, la streptomy- cine B, la dihydrostreptomycine A, la dihydrostreptomycine B et la streptothricine pures ou. sensiblement pures.
Les antibiotiques basiques du type de la streptomycine pu- rifiés par le procédé suivant l'invention peuvent être purifiés davantage en appliquant de nouveau le même procédé de purifica- tion. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ultérieure par d'autres procédés, en particulier par un des procédés suivants : I) On amène en contact intime une solu- tion aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sen- siblement insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'aci- de carboxylique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande do brevet déposée aux Etats-Unis le 19 juillet 1947 sous le n 762.205);
II) On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxylique sensi- blement insoluble dans l'eau; on recueille la combinaison pré- cipitée du type salin de l'antibiotique et de l'acide carboxy- lique et on la transforme en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir demande de brevet déposée aux Etats-Unis le 19 juillet 1947 sous le n 762.206); et III) On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique organiquement substitué et un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau;
on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (voir la demande de brevet belge déposée par la demanderesse le $ août 1948 sous le n 376. 546).
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L'invention ne doit pas être considérée comme limitée aux formes de réalisation décrites ci-dessus qui n'ont été choissies qu'à titre d'exemple.