AT414211B - Verfahren zur bestimmung der güte bzw. funktionsfähigkeit von surfaktant - Google Patents

Description

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AT 414 211 B

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant.

Aus der WO 86/00707 ist ein Verfahren zur Bestimmung des Zeta-Potentials von Feststoffen 5 bekannt. Weiters sind Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der Feststellung bzw. Messung elektrokinetischer Eigenschaften oder des Zeta-Potentials von unterschiedlichen Suspensionen bekannt, wobei jeweils ein Additiv zur Änderung von Oberflächeneigenschaften einer zu messenden Suspension verwendet wird (siehe beispielsweise http://www.dwi.rwth-aachen.de/lb/87.html, "Zeta-Potential-Messungen nach der Strömungspotentialmethode"; io http://www.colloidal-dynamics.com/ NewZPIntrorev.pdf, "Zeta probe Applications").

Die Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant ist beispielsweise im Zusammenhang mit der Behandlung der sogenannten Schocklunge bzw. dem sogenannten Atemnotsyndrom von wesentlichem Interesse, da es bereits vor einem Auftreten des voll 15 ausgeprägten, klinischen Bilds eines ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome, Atemnotsyndrom) bzw. ALi möglich ist, aus dem Zustand bzw. der Beschaffenheit des pulmonalen Surfaktants therapeutische Maßnahmen zu treffen und somit vor dem vollständigen Auftreten des klinischen Bilds des ARDS eine Therapie zu beginnen. ARDS/ALI bzw. Atemnotsyndrom bezeichnet den rapiden Beginn einer progressiven Funktionsstörung der Lungen und ist im 20 wesentlichen charakterisiert durch eine diffuse, mikrovaskuläre Lungenschädigung, die in einer erhöhten Permeabilität der kleinen Gefäße und Alveolarmembran resultiert und zu einem nichtkardiogenen Lungenödem führt. Es ist derzeit bekannt, mit Hilfe einer sogenannten Broncho Alveolar Lavage (BAL) pulmonalen Surfaktant der Lunge eines Patienten zu entnehmen, worauf beispielsweise in einem aufwendigen Verfahren zur Bestimmung der Oberflächenspannung die 25 Güte bzw. der Zustand des pulmonalen Surfaktants bestimmt wird. Diese derzeit bekannten Verfahren sind nicht nur äußerst zeitaufwendig und erfordern eine komplizierte Apparatur, sondern erfordern zum Teil auch eine vergleichsweise große Menge an zu überprüfendem Surfaktant und bedeuten insbesondere aufgrund ihres Zeitaufwands die Gefahr, daß Therapievorschläge zu spät aus derartigen Messungen abgeleitet werden. Daher werden diese Metho-30 den in der Routine nicht angewendet.

Die vorliegende Erfindung zielt daher darauf ab, ein Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant, insbesondere pulmonalem Surfaktant, zur Verfügung zu stellen, mit welchem eine rasche und genaue Bestimmung des Zustands des Surfaktants mög-35 lieh wird. Im Zusammenhang mit der Untersuchung von pulmonalem Surfaktant soll möglichst frühzeitig eine Therapie insbesondere für die Behandlung eines ARDS und/oder ALi, beispielsweise durch Bestimmung einer Gabe von exogenem Surfaktant ermöglicht werden.

Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Güte 40 bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß das elektrokinetische Potential bzw. Zeta-Potential einer Polymeroberfläche nach einer Adsorption von pulmonalem Surfaktant durch eine Bestimmung des Strömungspotentials bzw. Strömungsstroms, durch ein Verfahren gewählt aus Elektroosmose, Elektrophorese oder Mikroelektrophorese bestimmt wird. Da pulmonaler Surfaktant fähig ist, beispielsweise auf Polymeroberflächen 45 zu absorbieren und damit deren Oberflächeneigenschaften zu verändern, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das elektronkinetische Potential bzw. daraus abgeleitet das Zeta-Potential einer Polymeroberfläche nach Adsorption des Surfaktants zu bestimmen, um daraus Rückschlüsse betreffend den Zustand bzw. die Güte bzw. Funktionsfähigkeit eines zu untersuchenden Surfaktants zu ermöglichen. Es läßt sich somit mit einem einfachen und kurzen Verfahren so selbst bei geringen Mengen von zur Verfügung stehendem Surfaktant dessen Zustand bzw. Eigenschaften bestimmen, so daß beispielsweise bei einer Veränderung des Zustands des pulmonalen Surfaktants unmittelbar entsprechende Maßnahmen bzw. Therapien, beispielsweise durch Verabreichung einer individuell abgestimmten Gabe von exogenem Surfaktant, an einen Patienten bzw. in einer Probe eingeleitet werden können. Neben einer raschen Ermittlung 55 des Zustands bzw. der Güte von Surfaktant ergibt sich durch das erfindungsgemäß vorgeschla- 3

AT 414 211 B gene Verfahren der Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. des Zeta-Potentials auch die Möglichkeit, eine gegebenenfalls benötigte Surfaktantgabe genau abzustimmen, so daß eine Kostenoptimierung bei Einsatz von exogenem Surfaktant möglich wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, daß als pulmonaler Surfaktant natürlicher, synthetischer und/oder rekombinanter Surfaktant eingesetzt wird. Neben den oben bereits angedeuteten Möglichkeiten der Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von natürlichem Surfaktant insbesondere zur Unterstützung von Therapien, beispielsweise zur Behandlung von ARDS und/oder ALI, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch möglich, synthetischen und/oder rekombinanten, pulmonalen Surfaktant auf seine Funktionsfähigkeit und Güte dahingehend zu überprüfen, inwieweit beispielsweise neu entwickelte Surfaktants tatsächlich für bestimmte, vorgegebene Einsatzzwecke verwendbar sind. Es müssen somit nicht teure und aufwendige Untersuchungsverfahren durchgeführt werden, sondern es kann unmittelbar die Qualität bzw. Einsatzfähigkeit eines beispielsweise neu entwickelten, synthetischen Surfaktants durch Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials überprüft bzw. ermittelt werden. Weiters ist es beispielsweise möglich, nach Festlegung bzw. Ermittlung von Kalibrier- bzw. Eichkurven bzw. -meßwerten für das elektrokinetische Potential bzw. Zeta-Potential von gesundem, pulmonalem Surfaktant dadurch das Auslangen zu finden, daß zu überprüfender, natürlicher, synthetischer und/oder rekombinanter, pulmonaler Surfaktant mit derartigen kalibrierten Meßwerten verglichen wird und daß daraus eine relative Güte bzw. Funktionsfähigkeit abgeleitet wird, während gegebenenfalls schwieriger zu ermittelnde, absolute Werte hiefür derart nicht unbedingt erforderlich sind. Die Wiederholung dieser Messungen kann auch zu einer Überprüfung des Therapieerfolges herangezogen werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Verfahrensführung wird vorgeschlagen, daß das elektrokinetische Potential bestimmt wird. In Abhängigkeit von dem Einsatz bzw. Verwendungszweck kann somit das elektrokinetische Potential bzw. daraus abgeleitet das Zeta-Potential des pulmonalen Surfaktants bei einer Adsorption auf einer Polymeroberfläche auf unterschiedliche Arten bestimmt werden.

In diesem Zusammenhang wird gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Surfaktant in eine mit einer makroskopischen Polymeroberfläche und mit zwei Elektroden ausgestattete Meßzelle eingebracht wird und das Strömungspotential bestimmt wird, wobei es dadurch möglich wird, mit einer einfachen Vorrichtung zuverlässige Resultate zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant zu erhalten. Das Strömungspotential einer Flüssigkeit, beispielsweise enthaltend den Surfaktant, gegenüber einer mit einer Polymeroberfläche ausgestatteten Meßzelle wird hiebei durch Anwenden bzw. Aufbringen von unterschiedlichen Drücken auf die Flüssigkeit bei gleichzeitiger Ermittlung des Potentials bzw. des Stroms an den Elektroden der Meßzelle bestimmt. Zur weiteren Verbesserung bzw. Vereinfachung der Verfahrensführung kann das in der Meßzelle aufgenommene Flüssigkeitsvolumen einer oszillierenden bzw. sich periodisch ändernden Druckbeaufschlagung unterworfen werden.

Zur Erzielung eines entsprechend aussagekräftigen Resultats betreffend die Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant, insbesondere pulmonalem Surfaktant, wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgeschlagen, daß die makroskopische Polymeroberfläche von Fasern, Folien bzw. Membranen, insbesondere aus Zelluloseacetat oder Zellulosenitrat, gebildet wird. Eine derartige makroskopische Polymeroberfläche weist genau definierte bzw. definierbare Eigenschaften auf, so daß in Kenntnis der Beschaffenheit der Polymeroberfläche unmittelbar Rückschlüsse auf den Zustand des Surfaktants in Kenntnis des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials möglich sind.

Zur Vermeidung einer Verfälschung des Ergebnisses bei der Ermittlung der Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von natürlichem, pulmonalem Surfaktant wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß natürlicher, pulmonaler Surfaktant vorgerei- 4

AT 414 211 B nigt, insbesondere physikalisch vorgereinigt, wird, wobei beispielsweise Zellen, Zellbestandteile oder dgl., entfernt werden. Eine derartige Vorreinigung, insbesondere physikalische Reinigung, ist mit bekannten Methoden ebenfalls einfach und rasch durchführbar und ermöglicht eine zuverlässigere Ermittlung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials des zu unter-5 suchenden pulmonalen Surfaktants ohne gegebenenfalls erforderliche, aufwendige Korrekturen.

Zur weiteren Erleichterung der Feststellung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß in der io Meßzelle ein Puffer, insbesondere ein Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 7, eingesetzt wird, wobei durch eine derartige Pufferung ebenfalls aufwendige Korrekturverfahren vermieden werden können.

Anstelle der Bestimmung des Strömungspotentials zur Ermittlung des Zeta-Potentials ist es 15 weiters möglich, insbesondere verdünnten Surfaktant in eine Meßzelle einzubringen, welche Latex- oder Pigmentpartikel enthält, wobei in diesen Meßzellen durch zwei Elektroden ein elektrisches Feld erzeugt wird, das die Wanderung der Latex- bzw. Pigmentartikel verursacht. Im Fall der Anwendung dieser Methode der sogenannten Mikroelektrophorese wird die Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel bestimmt und daraus wiederum das Zeta-Potential abgeleitet, 20 um die Güte bzw. Funktionsfähigkeit von insbesondere pulmonalem Surfaktant zu ermitteln. In diesem Zusammenhang wird gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Surfaktant auf Latex- oder Pigmentpartikeln immobilisiert wird und die Wanderung bzw. Bewegung der Latex- oder Pigmentpartikel im elektrischen Feld der Meßzelle bestimmt wird. 25

Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer in der beiliegenden Zeichnung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie daraus ableitbarer Resultate und auf Basis der angeschlossenen Ausführungsbeispiele näher erläutert. In dieser zeigen: 30 Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials von insbesondere pulmonalem Surfaktant;

Fig. 2 ein Diagramm des ermittelten Potentials für einen nichtfunktionsfähigen Surfaktant im Vergleich zu den theoretisch angegebenen Ergebnissen für einen funktionsfähigen, insbeson-35 dere pulmonalen Surfaktant; und

Fig. 3 ein Diagramm des ermittelten Zeta-Potentials in Abhängigkeit vom pH-Wert für unterschiedliche Adsorptionsmaterialien.

In Fig. 1 ist allgemein mit 1 eine Meßzelle bezeichnet, welche beispielsweise aus Plexiglas 40 besteht, wobei darüber hinaus zwei Elektroden 2 und 3 vorgesehen sind, welche das Volumen der Meßzelle 1 begrenzen. Über eine Zuleitung 4 erfolgt eine Zufuhr der zu untersuchenden Flüssigkeit, enthaltend den zu überprüfenden, pulmonalen Surfaktant, in den Bereich der Meßzelle 1, wobei weiters ersichtlich ist, daß die in Fig. 1 dargestellte, untere Elektrode 3 über einen Exzenterantrieb 5 und einen damit verbundenen Kolben 6 zu einer hin- und hergehenden Be-45 wegung antreibbar ist, wodurch das Volumen in der Meßzelle 1 einer oszillierenden bzw. sich periodisch ändernden Druckbeaufschlagung unterworfen wird.

Im Kolben 6 kann unmittelbar ein Drucksensor integriert sein, wie dies mit 7 angedeutet ist, oder es kann aus der bekannten Bewegung des Exzenterantriebs 5 und somit des Kolbens 6 in so Relation zu dem bekannten Volumen der Meßzelle 1 der in der Meßzelle 1 herrschende, sich periodisch ändernde bzw. oszillierende Druck unmittelbar ermittelt werden.

Der vom Drucksensor 7 ermittelte Druck wird über eine schematische Leitung 8 einer Auswerte-und Aufzeichnungseinheit 9 zugeführt, wobei dieser Auswerte- und Aufzeichnungseinheit 9 55 darüber hinaus zumindest das an den Elektroden 2 und 3 vorliegende Potential bzw. der Strom 5

AT 414 211 B über eine Leitung 10 zugeführt wird.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung läßt sich beispielsweise ein sich mit der Zeit änderndes Potential ermitteln, aus welchem sich das Zeta-Potential unmittelbar ableiten läßt, wie dies in 5 Fig. 2 dargestellt ist.

In Fig. 2 ist neben den Ergebnissen für einen nichtfunktionsfähigen, insbesondere pulmonalen Surfaktant auch eine Kurve einer theoretischen Berechnung der erwarteten Änderung des Potentials in Abhängigkeit von pH-Wert dargestellt, wobei ersichtlich ist, daß mit der in Fig. 1 io dargestellten Vorrichtung rasch und in zuverlässiger Weise eine Bestimmung der Güte bzw. der Funktionsfähigkeit von insbesondere pulmonalem Surfaktant möglich ist, da aus dem sich periodisch ändernden Potential unmittelbar das elektrokinetische Potential sowie das Zeta-Potential des pulmonalen Surfaktants ermittelbar ist. 15 Der pulmonale Surfaktant, welcher der in Fig. 2 dargestellten Untersuchung unterzogen wurde, wurde hiebei vorgereinigt, wobei beispielsweise Zellen, Zellbestandteile und dgl. entfernt wurden, um eine Beeinflussung des Meßresultats weitgehend ausschließen zu können. Zur Vereinfachung der Auswertung wird weiters in der Meßzelle 1 ein Puffer, beispielsweise ein Phosphatpuffer, mit einem pH von etwa 7 eingesetzt. 20

Zur Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials des insbesondere pulmonalen Surfaktants weist die Meßzelle 1 darüber hinaus eine makroskopische Polymeroberfläche auf, welche beispielsweise aus Zelluloseacetat oder Zellulosenitrat gebildet wird. 25 Anstelle der Bestimmung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials eines Surfaktants unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung kann das Potential auch unter Durchleitung des zu untersuchenden Surfaktants bei unterschiedlichem Druck durch eine mit der Meßzelle 1 vergleichbare Meßzelle erfolgen, wobei wiederum das Potential bzw. gegebenenfalls der Strom an Elektroden 2 und 3 festgestellt bzw. ermittelt wird und daraus das elektro-30 kinetische Potential sowie das Zeta-Potential abgeleitet wird.

Neben einer derartigen Potentialbestimmung kann der Surfaktant auf Latex- oder Pigmentpartikeln immobilisiert werden, wobei in einer Meßzelle die Wanderung bzw. Bewegung der Latexoder Pigmentartikel in einem elektrischen Feld, beispielsweise wiederum zwischen zwei Elekt-35 roden bestimmt wird, wobei aus der Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel wiederum unter Ermittlung des elektrokinetischen Potentials bzw. Zeta-Potentials die Güte bzw. Funktionsfähigkeit von Surfaktant ermittelbar ist.

Ausführungsbeispiel 1 40

Einem Patienten wird mit Hilfe einer Broncho Alveolar Lavage (BAL) eine Menge von 30 ml unter Einsatz von 50 ml physiologischer Kochsalzlösung aus den Lungen entnommen, wobei in weiterer Folge eine Reinigung durch Filtration durch vier Lagen chirurgischer Gaze und anschließender Zentrifugation (5 min x 200 x g) zur Entfernung von Zellen, Zellbestandteilen und 45 dgl. erfolgt.

Das nach der Reinigung gewonnene Material, welches unter anderem den zu prüfenden, pulmonalen Surfaktant enthält, wird in die Meßzelle eingebracht, worauf in der Vorrichtung gemäß Fig. 1 unter Einsatz einer makroskopischen Polymeroberfläche, bestehend aus Latex, ein Meso ßergebnis erhalten wird, aus welchem das in Fig. 2 dargestellte Zeta-Potential ermittelbar ist.

Aus dem ermittelten Zeta-Potential sowie dem Unterschied gegenüber der in Fig. 2 ebenfalls dargestellten Kalibrier- bzw. Eichkurve läßt sich ableiten, daß die Funktionsfähigkeit des untersuchten, pulmonalen Surfaktants um 70 % reduziert ist. 55

Claims (8)

1. 6 AT 414 211 B In Kenntnis dieser Fehl- bzw. Minderfunktion des pulmonalen Surfaktants wird für eine unmittelbare Behandlung die Gabe von exogenem Surfaktant vorgeschlagen. In Fig. 3 ist ähnlich dem Diagramm von Fig. 2 das Zeta-Potential in Abhängigkeit von dem pH-5 Wert für unterschiedliche Adsorptionsmaterialien dargestellt, woraus insbesondere bei Einsatz von unterschiedlichem Surfaktant ein zur Ermittlung des Zeta-Potentials des jeweils zu untersuchenden Surfaktants entsprechender pH-Wert eingestellt werden kann. Weiters ist aus Fig. 3 ersichtlich, daß bei Verwendung einer kationischen Membran jeweils ein positives Zeta-Potential in einem weiten pH-Bereich erhältlich ist, während bei Verwendung einer anionischen io Membran für unterschiedliche pH-Werte teils ein positives und teils ein negatives Zeta-Potential ermittelt wird, so daß in Kenntnis der Änderung des Zeta-Potentials eines zu untersuchenden Surfaktants jeweils eine entsprechende Membran und ein entsprechender pH-Wert ausgewählt wird, um ein möglichst signifikantes Signal zu erhalten. 15 Es ist davon auszugehen, daß beispielsweise pulmonaler Surfaktant, wie aus Fig. 2 ersichtlich, jeweils ein negatives Zeta-Potential aufweist, während andererseits Surfaktants existieren, welche ein positives Zeta-Potential ergeben, so daß für die Ermittlung der Güte desselben beispielsweise eine kationische Membran zu wählen wäre, um zwischen einem intakten und inhibierten Surfaktant entsprechend unterschiedliche Signale zu erhalten. 20 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung der Güte bzw. Funktionsfähigkeit von pulmonalem Surfaktant, 25 dadurch gekennzeichnet, daß das elektrokinetische Potential bzw. Zeta-Potential einer Po lymeroberfläche nach einer Adsorption von pulmonalem Surfaktant durch eine Bestimmung des Strömungspotentials bzw. Strömungsstroms, durch ein Verfahren gewählt aus Elektro-osmose, Elektrophorese oder Mikroelektrophorese bestimmt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pulmonaler Surfaktant natür licher, synthetischer und/oder rekombinanter Surfaktant eingesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrokinetische Potential bestimmt wird. 35
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Surfaktant in eine mit einer makroskopischen Polymeroberfläche und mit zwei Elektroden ausgestattete Meßzelle eingebracht wird und das Strömungspotential bestimmt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die makroskopische Polymer oberfläche von Fasern, Folien bzw. Membranen, insbesondere aus Zelluloseacetat oder Zellulosenitrat, gebildet wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß natürlicher, pulmonaler Surfak- 45 tant vorgereinigt, insbesondere physikalisch vorgereinigt, wird, wobei beispielsweise Eiweiß, Hämoglobin, Fibrin oder dgl., entfernt werden.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Meßzelle ein Puffer, insbesondere ein Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 7, eingesetzt wird. 50
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Surfaktant auf Latex- oder Pigmentpartikeln immobilisiert wird und die Wanderung bzw. Bewegung der Latex- oder Pigmentpartikel im elektrischen Feld der Meßzelle bestimmt wird. 55 5 7 AT 414 211 B Hiezu 2 Blatt Zeichnungen 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55