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Die Erfindung bezieht sich auf ein Fluorometer mit mindestens einer Lichtquelle einer Mess- station mit einer Aufnahme für mindestens einen Probenbehälter, insbesondere für die Aufnahme von Mikroplatten und Polymerasekettenreaktionsröhrchen (PCR-Tubes), einen Messkopf sowie einer Auswertestation mit einem Detektor, vorzugsweise einem Photomultiplikator (PMT) für die Auswertung der von einer Probe abgegebenen Emmisionssignale.
Aus der US 6 084 680 ist ein kompaktes Fluorometermesskopfmodul bekannt, welches nur für eine Messmethode (ohne Umbau) verwendbar ist. Es können mit diesem Gerät keine zeitverzögerte Fluorometrie, Photometrie, Luminometrie und Polarisationsfluorometrie gemessen werden.
Die EP 0 886 136 A1 zeigt ein Instrument für Küvetten und misst Durchlichtfluorometrie. Dabei ist das Erblinden des Detektors bei zu starker Blitzenergie gegeben, da die photoempfindliche Schichte des Detektors geschädigt wird. Deshalb werden 2 Blitzlampen mit unterschiedlicher Energie verwendet.
Die WO 01/35079 A1 beschreibt ein Fluorometer mit Thermozylinder, d. h. die Proben werden sehr stark und schnell erhitzt und abgekühlt. Die Lichtquelle ist eine Leuchtdiode mit sehr begrenz- tem optischem Spektrum und Energie. Dieses Gerät ist nur für einen Anwendungsfall konzipiert.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Fluorometer der eingangs erwähnten Art dahingehend zu verbessern, dass es leicht an verschiedene Anforderungen angepasst werden kann.
Die erfindungsgemässe Aufgabe wird dadurch gelöst, dass der Messkopf von mindestens zwei, vorzugsweise drei modular zusammengesetzten Optikblöcken gebildet wird, wobei mit jedem Optikblock eine andere Messmethode durchführbar ist und alle Optikblöcke den gemeinsamen Detektor bedienen.
Durch die modulare Zusammenstellung können Einrichtungen für verschiedene Messmethoden leicht weggelassen oder hinzugefügt werden. Für die Grundeinheit benötigt man lediglich die Teile für die von oben gemessene Fluorometrie (Top-Reading Fluorometrie). Alle anderen Teile können je nach Bedarf modular hinzugefügt werden.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der beiliegenden Zeichnun- gen beschrieben.
Die Fig 1 zeigt eine schematisch gehaltene Frontansicht des erfindungsgemässen Fluoro- meters, die Fig. 2 zeigt eine Draufsicht auf das erfindungsgemässe Fluorometer, die Fig. 3 das Schema für die Fluorometrie von oben und für die Polarisationsfluorometrie, die Fig. 4 zeigt das Schema für die Fluorometrie von unten, die Fig. 5 zeigt das Schema für die verzögerte Messung (Time-resolved Fluorometrie) die Fig 6 zeigt das Schema für die Photometrie, die Fig. 7 zeigt schematisch einen Luminometer, und die Fig 8 zeigt schematisch ein Polarisationsfilterrad.
Die Grundausrüstung für alle Messmethoden besteht aus dem Detektor 15 in der Form eines Photomultiplikators PMT und dem Optikblock (B) sowie zwei Filterschiebern 6,13 und einer Lichtquelle 1.
Der Optikblock B wird für die von oben gemessene Fluorometrie, das heisst für die Top-Reading Fluorometrie und für die zeitverzögerte Fluorometrie (time resolved Fluorometrie) verwendet.
Die Lichtquelle 1 (Fig. 3,4) besteht aus einer Halogenlampe mit sechs Volt und 20 Watt ohne UV-Stop, zwei Linsen 2,3 aus nicht fluoreszierendem Quarzglas und einem Wärmeschutzglas 4 zur Unterdrückung der parasitären Infrarotstrahlung in einem in sich geschlossenen Lampenblock.
Diese Lichtquelle 1 wird für die Fluoreszenzmessung von oben und von unten und für die Photometrie verwendet. Die Lichtquelle 1 ist mit der Lichtleiteraufnahme 33 für die Lichtquelle 29 (Fig 5), die vorzugsweise von einer Xenon-Blitzlampe gebildet wird, starr verbunden und besitzt einen motorischen Antrieb. Die Lichtquelle 1 und die Lichtleiteraufnahme 33 können somit automatisch gewechselt werden.
Der Optikblock B (Fig 5) weist einen Trägerblock aus schwarz eloxiertem Aluminium auf, in dem eine Blende 7 (Fig. 3) zur Randstrahlenbegrenzung angeordnet ist, sowie einen Breitband- strahlenteiler 8, der in einem Winkel von 45 zu den Lichtquellen 1,33 bzw. zur Probe 11 angeord- net ist. Durch diese Anordnung des Breitbandstrahlenteilers 8 wird der Anregedraht zur Proble abgelenkt und das zurück kommende Fluoreszenzlicht von der Probe 11 zum Detektor 15 weiter- geleitet.
Weiters sind eine Ausgangslinse 9 aus nicht fluoreszierendem Quarzglas (SQ 1), die den
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Strahl zu und von der Probe 11 fokussiert, eine Photodiode 16 zur Synchronisierung eines von einer Blitzlampe der Lichtquelle 29 abgegebenen Blitzes und eventuell zur Halogenlampenüber- wachung sowie eine Linse 12 (SQ1), die den Rückstrahl von der Probe 11 durch ein Emissions- Filter 13, das von einem Filterschieber 13 gebildet wird, zum Detektor 15 leitet, vorgesehen.
Im Bereich der Photodiode 16 muss besonders auf Reflexionsfreiheit geachtet werden. Die Photodiode 16 ist schräg zum Lichtstrahl montiert, um eine Rückreflexion zu verhindern. Die Umgebung der Photodiode 16 ist matt schwarz gehalten, da sonst die Empfindlichkeit reduziert wird. Die Optikblöcke A, B, C sind starr miteinander verbunden und können mit einem motorischen Antrieb ausselektiert werden.
Der Optikblock A (Fig. 4) wird für die Fluorometriemessung von unten verwendet. Er weist ebenso wie der Optikblock B einen Trägerblock aus schwarz eloxiertem Aluminium auf, der starr mit dem Trägerblock des Optikblockes B verbunden ist. Die Einkoppeloptik S01 hat wiederum einen Abstand von 18 mm zu S02 bzw. vom oberen Messkopf und dient zur Ein- und Auskopplung des Lichtleiters 19. Die Einkopplung erfolgt jeweils über eine Linse 22,17, 20 (SQ1)zur Fokussie- rung des Strahls auf die Lichtleitereintrittsfläche. Der Abstand von 18 mm wurde deswegen gewählt, um einen einheitlichen Raster zu haben, da das Rastermass für Mikroplatten mit 96 Kavitäten 9 mm beträgt und durch einheitliche Abstände ein besseres Timing für alle unterschied- lichen Messmodis ermöglicht wird. Für viele Messungen ist der Zeitraster sehr wichtig, z.
B. kann von oben gemessene Fluorometrie mit Injektion im selben Zeitraster (Injektion zu Messung) gefahren werden wie die von unten gemessene Fluorometrie. Der geometrische Versatz (18 mm) der beiden Optiken für die Messung von oben und von unten verhindert auch noch eine gegen- seitige Beeinflussung der Optiken.
Die Aluminiumoberflächenspiegel 18,21 dienen zur Ablenkung des Lichtstrahles um 90 , wodurch ein sehr platzsparender Aufbau erreicht wird, der benötigt wird, um in unmittelbarer Nähe Injektionspositionen zu haben, die für die zeitkritischen Messmethoden notwendig sind.
Der Optikblock C (Fig. 6) wird für Photometrie, Glühlumineszenz und Blitzlumineszenz verwen- det. Der Optikblock C weist ebenfalls einen Trägerblock aus schwarz eloxiertem Aluminium auf, der wiederum starr mit dem Trägerblock des Optikblockes B verbunden ist.
Die Einkoppelung des Lichtstrahls für die Photometrie erfolgt gleich wie im Optikblock A über die Linse 23 und den Spiegel 24 in den Lichtleiter 25.
Die Weiterleitung des Lichtstrahls von der Probe 11 erfolgt bei der Lumineszenzmessung und der Photometrie über einen Quarzlichtleitstab 28, um die Verluste für die Luminometrie so klein wie möglich zu halten.
Vom Ausgang des Quarzlichtleitstabes 28 gelangt der Lichtstrahl entweder direkt zum Detektor 15 oder über einen Filterschieber 13 zum Detektor 15. Der Filterschieber 13 ist für wellenlängen- spezifische Lumineszenzmessungen oder Photometermessungen vorgesehen.
Die zweite Lichtquelle 29 (Fig. 5) besteht aus einer Xenonblitzlampe samt Ansteuerung, einem Flüssiglichtleiter 30, der unter anderem zur geometrischen Stabilisierung des Blitzes dient, einer Lichtleiteraufnahme 33 aus schwarz eloxiertem Aluminium und der von einer Linse 31 gebildeten Auskoppeloptik.
Die Lichtquellen 1,29, d. h. die Halogenlampe und die Xenonblitzlampe, müssen je nach Messmethode positioniert werden. Der Abstand der beiden Auskoppeloptiken von der Lichtquelle 1 zu der Lichtleiteraufnahme 33 beträgt 18 mm. Das Positionieren der Lichtquelle 1 und der Lichtleiteraufnahme 33 erfolgt mittels eines Schrittmotors.
Für die Trennung zwischen der Lichtquelle 1 und der Lichtleiteraufnahme 33 einerseits und den Filtern andererseits ist eine Führung aus schwarz eloxiertem Aluminium mit einer 9 mm (10 mm) Optiköffnung vorgesehen.
Im Filterschieber 6 können die EM-Filter (Emissionsfilter Fluorometrie) für TRF und FL, die Polarisationsfilter 5 und die Photometerfilter installiert werden. Der Filterschieber 6 ist leicht herausnehmbar und somit können die Filter auf einfache Art nachbestückt werden (Filtergrössen ca 12,7 mm). Der Antrieb des Filterschiebers 6 erfolgt über einen Schrittmotor. Die Filter sind in einem Rastermass von 18 mm angebracht.
Im Filterschieber 13 können die EM-Filter für TRF und FL, die Photometerfilter und die Lumineszenzfilter installiert werden. Der Filterschieber 13 ist ebenso wie der Filterschieber 6 leicht herausnehmbar, damit die Filter einfach nachbestückt werden können Die Filtergrösse beträgt
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wieder ca. 12,7 mm. Der Antrieb des Filterschiebers 13 erfolgt über einen Schrittmotor und die einzelnen Filter sind in einem Rastermass von 18 mm angeordnet. Die Filterschieber 6,13 sind mechanisch codiert, um eine Verwechslung zu verhindern.
Der Detektor 15 ist ein Hochgeschwindigkeits-Frontfenster-Photonenvervielfacher für Zähl- module (High Speed Front Window Counter) Photomultiplikatormit optionaler Peltier-Kühlung für höhere Empfindlichkeit auch im roten Spektralbereich. Die Kühlung reduziert das Wärmerauschen von rotempfindlichen Photomultiplikatoren. Als Empfangsschaltung wird ein Vorverstärkerzähler (Counter) mit ca. 500 MHz Bandbreite verwendet, der die Blitzlampe direkt mit dem Zähler synchronisieren kann Optional kann auch ein Photonenvervielfacher, der das Prinzip des Kanal- elektronenvervielfachers (KeV) nützt (Channel Photo Multiplyer) zum Einsatz kommen.
Die Irisblende 10 ist motorisch stufenlos verstellbar (typisch 0,6 mm bis 7 mm). Somit können unterschiedliche Probengrössen gemessen werden, ohne dass ein Nachbarkanaleinfluss erfolgt.
Ebenso ist ein geometrisches Scannen der Proben möglich (Mustererkennung), da der Proben- trägertransport eine Schrittauflösung von 0,1 mm im Vollschritt bzw. entsprechend kleiner im - Step-Betrieb sowohl in der X- als der Y-Richtung aufweist.
Die Probeneinkoppeloptik (S01) für von unten gemessene Fluoreszenz ist in einem Block aus mattiertem schwarzen eloxierten Aluminium angeordnet und nimmt den Fluorometerlichtleichter 19 auf. Die Probeneinkoppeloptik (S01) von unten gemessene Fluoreszenz ist 18 mm von der Messposition für von oben gemessene Fluoreszenz entfernt, um eine gegenseitige Beeinflussung zu verhindern. Der Fluorometerlichtleiter 19 ist von der Linse 20 die zweifache Brennweite entfernt.
Der Fluorometerlichtleiter 19 hat zwei Optikarme, und zwar Emissionslichtleitfasern und Exitationslichtleitfasern. Die Emissionslichtleitfasern und die Exitationslichtleitfasern werden in einem statistischen Mischungsverhältnis von 1 :1 Bei der Verarbeitung muss besonders auf maximale Transmission und Unversehrtheit der Lichtleitfasern geachtet werden, da es sonst zu einem erhöhten Durchgriff kommen könnte und dies die Empfindlichkeit des Messsystemes negativ beeinflussen würde. Ausserdem dürfen nur Materialien, die keine Eigenfluoreszenz haben, verwendet werden.
Der gesamte Optikaufbau, der sich über der Probe 11 befindet (d. h. die Optikblöcke A, B, C, die Lichtquellen 1 und 29, die Irisblende 10, der Defektor 15, die Polarisationsfilter 5 und die Filter- schieber 6,13), kann mittels eines motorischen Antriebes der jeweiligen Probenträgerhöhe ange- passt werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit und verringert die gegenseitige Beeinflussung von benachbarten Proben. Dies ist besonders wichtig bei Glühlumineszenzen, da die Proben sehr lange nachleuchten können. Die Höhenanpassung ist zwischen ca. 10 mm und 25 mm Proben- höhe möglich.
Die Photometersekundäroptik S02 (Fig. 6) umfasst einen Lichtleiter 25, der die Aufgabe hat, das Licht unter die Probe 11zu bringen. Die Optik muss einen sehr dünnen Strahl aufbereiten, um auch kleine Proben 11messen zu können. Der Strahl geht durch den Lichtleiter 25, der in einem schwarzen Kunststoffrohr 26 mit Innengewinde angeordnet ist. Das Kunststoffrohr 26 verhindert lästige Randstrahlungen und wirkt wie eine Aneinanderreihung von vielen Blenden. Die Ausgangs- linse 27 bereitet den Strahl derart auf, dass auch bei starker Meniskusbildung in der Probe 11 gute Messergebnisse erzielt werden.
Das System kann mit bis zu vier Injektoren versehen sein (um die Reaktionen zu starten/zu stoppen usw. ). Dabei ist zu beachten, dass sich diese Positionen in unmittelbarer Nähe der Messpositionen befinden. Ein rascher Transport der Probe 11 von der Injektorposition zur Messposi- tion ist bei verschiedenen Messverfahren unbedingt erforderlich. Injektorpositionen sind jeweils 18 mm von der Messposition für das Messen von oben bzw. von der Messposition für das Messen von unten entfernt. An jeder Position können jeweils zwei Injektoren angebracht werden. Bei Geräten, die direkt in der Messposition injizieren, ist die Messoptik sehr verschmutzungsgefährdet.
Für die Fluoreszenzpolarisationsmessung kann optional zwischen dem Filterschieber 13 und dem als Photomultiplikator ausgebildeten Detektor 15 oder zwischen dem Optikblock B und dem Filterschieber 13 ein Polarisationsfilter 14 (Fig. 5) eingebaut werden. Das Polarisationsfilter 14 kann motorisch gedreht werden, und somit kann die Polarisationsverschiebung in der Probe 11 gemessen werden.
Das Polarisationsfilterrad 32 (Fig. 8) hat eine Position für Normalmessungen (9 mm Bohrung) und einen Bogen von 90 + Strahlendurchmesser, wo ein Polarisationsfilter 14 eingesetzt wird, und
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durch die Drehung des Polarisationsfilterrades eine Polarisationsdrehung von 90 erfolgen kann.
Angetrieben wird das Polarisationsfilterrad 32 über einen Schrittmotor. Damit ist leicht eine Rückrechnung der Polarisationsdrehung möglich. Im Filterschieber 6 müssen für die Messungen polarisierende Fluoreszenzfilter bzw. Polarisationsfilter und Interferenzfilter eingebaut werden.
Es folgt eine Beschreibung der einzelnen Messmethoden:
Von oben messende Fluorometrie (Fig. 3)
Für diese Messmethode werden die Lichtquelle 1, der Filterschieber 6, der Optikblock B, die Irisblende 10, der Filterschieber 13 und der als Photomultiplikator ausgebildete Detektor 15 verwendet.
Für diese Messmethode können die entsprechenden Energiewerte für die jeweilige Filterkombi- nation über Referenzproben, die in der Probenträgerplatte integriert sind, eingestellt und überprüft werden (Anfang und Ende der Messung). Dadurch hält man eine bessere Reproduzierbarkeit und kann die Alterung oder den Drift der Lichtquelle 1 oder sonstiger optischer Bauteile wie der Filter oder des Detektors 15 kompensieren.
Zeitverzögernde Fluorometrie (Fig. 5)
Für die Messmethode werden die Lichtquelle 29, ein Flüssiglichtleiter 30, eine Lichtleiterauf- nahme 33, ein Filterschieber 6, der Optikblock B, die Irisblende 10, der Filterschieber 13, eine Referenzdiode 16 und der als Photomultiplikator ausgebildete Detektor 15 verwendet.
Auch für diese Messmethode können die entsprechenden Energiewerte für die jeweilige Filter- kombination über Referenzproben, die in der Probenträgerplatte integriert sind, eingestellt und überprüft werden. Dadurch erhält man ebenso eine bessere Reproduzierbarkeit und kann die Alterung von der Xenonblitzlampe der Lichtquelle 29 oder sonstiger optischer Bauteile, wie Filter und Detektor 15 kompensieren. Die Zündzeitpunkte der Lichtquelle 29 (Blitzlampe) werden mit der Referenzphotodiode gemessen und über ein einstellbares Zeitverzögerungsglied synchronisiert dem als Photomultiplikator ausgebildeten Detektor 15 zugeleitet. Das Messfenster und das Zeitver- zögerungsfenster sind frei programmierbar.
Von unten messende Fluorometrie (Fig. 4)
Für diese Messmethode werden die Lichtquelle 1, der Filterschieber 6, der Optikblock A, der Fluorometerlichtleiter 19, die Bottom-Reading Sekundäroptik S01, der Filterschieber 13 und der Detektor 15verwendet.
Bei dieser Messmethode wird die Probe 11von unten gemessen. Die entsprechenden Energie- werte für die jeweilige Filterkombination können über die Referenzproben, die in der Probenträger- platte integriert sind, eingestellt und überprüft werden. Es handelt sich hier um dasselbe Verfahren, wie es bei der Fluorometriemessung von oben angewandt wird.
Photometne (Fig. 6)
Für diese Messmethode werden die Lichtquelle 1, der Filterschieber 6 oder 13, der Optikblock C, die Photometersekundäroptik S02 mit dem Lichtleiter 25 und der Detektor 15 verwendet. Diese Messung ist ein sogenanntes Durchlichtverfahren, dh die Probe 11wird mit einem Lichtstrahl von unten beleuchtet und von oben gemessen. Für dies Messung muss die Irisblende 10 offen sein, damit das gesamte Licht, das durch die Probe 11geht, aufgefangen wird und keine Verfälschung der Messergebnisse durch unterschiedliche Meniskusbildungen in den Proben 11 erfolgen kann Am Anfang und Ende jeder Reihe (bzw. Spalte) werden Lampenenergiemessungen durchgeführt.
Dadurch kann per Software der Lampendrift zurückgerechnet und die Messergebnisse verbessert werden. Weiters kann auf einen Referenzkanal verzichtet werden.
Luminometrie
Für diese Messmethode werden der Optikblock C, die Irisblende 10, der als Photomultiplikator ausgebildete Detektor 15 und vorzugsweise der Filterschieber 13 verwendet.
Bei dieser Messung wird die Probe 11von oben gemessen. Da bei verschiedenen Methoden die Proben 11 sehr lange Licht abgeben, ist es sehr wichtig, das Übersprechen von anderen Proben zu unterbinden. Dies erfolgt einerseits durch die Höhenanpassung zur Probe 11 und
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andererseits durch Verstellen der variablen Irisblende 10. Für spezielle Anwendungen können im Filterschieber 13 spezielle Lumineszenzfilter verwendet werden.
Polarisationsfluorometrie
Die Polarisationsfluorometrie kann nach zwei Methoden erfolgen.
Methode 1 (Fig. 3):
Für diese Messmethode werden die Lichtquelle 1, der Filterschieber 6, der Optikblock B, die Irisblende 10, der Filterschieber 13, der Polarisationsfilter 5, der Polarisationsfilter 14 und der Detektor 15 verwendet. Auch bei dieser Messmethode können die entsprechenden Energiewerte für die jeweilige Filterkombination über Referenzproben, die in der Probenträgerplatte integriert sind, eingestellt und überprüft werden. Dadurch erhält man eine bessere Reproduzierbarkeit, und es kann die Alterung der Lampe der Lichtquelle 1 oder sonstiger optischer Bauteile, wie Filter oder Photomultiplikator 15 kompensiert werden.
Beim Einbau muss nicht auf die genaue Drehung bzw. Justierung der Polarisationsfilter 5,14 geachtet werden. Durch die Drehbarkeit des Polarisationsfilters 14 kann der 0 Punkt (voller Durchlass) bzw. der 90 Punkt (volle Sperrwirkung) der beiden Polarisationsfilter 5,14 zueinander herausgefunden werden, und somit der Abgleich der Polarisationsfilter automatisch über eine integrierte Referenzprobe in der Aufnahme der Messproben (Plattenschlitten) im Gerät erfolgen.
Während der Messung kann die Polarisation der Empfangsseite verändert werden.
Methode 2:
Für diese Messmethode werden die Lichtquelle 29, der Filterschieber 6, der Optikblock B, die Irisblende 10, der Filterschieber 13, der Polarisationsfilter 5, der Polarisationsfilter 14 und der Detektor 15 verwendet.
Auch bei dieser Messmethode können die entsprechenden Energiewerte für die jeweilige Filter- kombination über Referenzproben, die in der Probenträgerplatte integriert sind, eingestellt und überprüft werden. Ebenso wie bei der vorhergehenden Methode kann während der Messung die Polarisation der Empfangsseite verändert werden
Diese Methode hat den Vorteil, dass auch im UV-Bereich Polarisationsfluoreszenz gemessen werden kann. Jedoch ist die Messung langsamer, da kein Gleichlicht vorhanden ist. Die Lichtquelle 29 wird, wie bereits erwähnt, von einer Xenonblitzlampe mit maximal 1000 Hz gebildet.
Alle Fluoreszenzmethoden und eventuell auch Photometermethoden können auch mit der Lichtquelle 29, d. h. mit einem Blitzlicht durchgeführt werden, was tiefe UV-Messungen ermöglicht, jedoch die Messgeschwindigkeit bzw. Messgenauigkeit beeinflusst (photometrische DNA-Messungen bei z. B. 260/280 N M).
PATENTANSPRÜCHE:
1. Fluorometer mit mindestens einer Lichtquelle einer Messstation mit einer Aufnahme für mindestens einen Probebehälter, insbesondere für die Aufnahme von Mikroplatten und
Polymerasekettenreaktionsröhrchen (PCR-Tubes), einen Messkopf sowie einer Auswerte- station mit einem Detektor, vorzugsweise einem Photomultiplikator (PMT) für die Auswer- tung der von einer Probe abgegebenen Emmisionssignale, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkopf von mindestens zwei. vorzugsweise drei modular zusammengesetzten Optik- blöcken (A, B, C) gebildet wird, wobei mit jedem Optikblock (A, B, C) eine andere Messme- thode durchführbar ist und alle Optikblöcke (A, B, C) den gemeinsamen Detektor (15) bedienen.